Untersuchungen zur Freisetzung der Ektodomänen von Cadherin

Untersuchungen zur Freisetzung der Ektodomänen
von Cadherin-17 und E-Cadherin
und deren Nachweis im Serum von Patienten
mit kolorektalem Karzinom
Dissertation
zur Erlangung des akademischen Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften
vorgelegt der
Fakultät für Chemie und Biochemie
der
Ruhr-Universität Bochum
von
Jakob Valentin Weiß, M.Sc.
Bochum 2011
Die
vorliegende
Arbeit
wurde
im
Immunologisch-
Molekularbiologischen Labor, Medizinische Universitätsklinik,
Knappschaftskrankenhaus Bochum angefertigt
Erstgutachter:
PD. Dr. rer. nat. I. Schwarte-Waldhoff
Zweitgutachter:
Prof. Dr. rer. nat. R. Heumann
Tag der Abgabe der Dissertation: 29. Juni 2011
Tag der mündlichen Prüfung: 11. August 2011
Eidesstattliche Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertations-Arbeit
selbstständig und ohne unerlaubte fremde Hilfe ausgeführt und verfasst
habe und dass die Arbeit in dieser oder ähnlicher Form noch bei keiner
anderen Fakultät eingereicht worden ist.
Bochum, den 29.06.2011
_______________________
Jakob Weiß
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis ......................................................................................................................................
1
Einleitung.................................................................................................................................. 1
1.1
Das kolorektale Karzinom ........................................................................................................ 1
1.1.1 Pathogenese und Tumorstadien .............................................................................................. 2
1.1.2 Früherkennung ......................................................................................................................... 4
1.1.3 Smad4 in der kolorektalen Karzinogenese .............................................................................. 4
1.2
Sekretom-Analysen .................................................................................................................. 6
1.2.1 Differentielle Sekretomstudien zur Funktionsanalyse des Tumorsuppressors Smad4 ........... 6
1.2.2 Das Sekretom als Quelle für Serummarker ............................................................................. 7
1.3
Tumormarker ............................................................................................................................ 7
1.3.1 CEA .......................................................................................................................................... 9
1.4
Cadherine ............................................................................................................................... 10
1.4.1 E-Cadherin ............................................................................................................................. 11
1.4.2 Cadherin-17 ........................................................................................................................... 13
1.4.3 Cadherin-17-Expression in Tumoren ..................................................................................... 15
1.4.4 Transkriptionsregulation von Cadherin-17 ............................................................................. 17
1.5
Ektodomänen-Shedding......................................................................................................... 18
1.5.1 ADAM10 ................................................................................................................................. 18
1.5.2 Veränderung der interzellulären Adhäsion durch Ektodomänen-Shedding ........................... 19
1.5.3 Lösliches E-Cadherin ............................................................................................................. 20
1.6
2
Ziele der Arbeit ....................................................................................................................... 21
Material und Methoden .......................................................................................................... 23
2.1
Material................................................................................................................................... 23
2.1.1 Software ................................................................................................................................. 23
2.1.2 Arbeitsgeräte .......................................................................................................................... 23
2.1.3 Gebrauchsmaterialen ............................................................................................................. 24
2.1.4 Kitsysteme .............................................................................................................................. 25
2.1.5 Puffer und Lösungen .............................................................................................................. 25
2.1.6 Zellkulturmedien ..................................................................................................................... 28
Inhaltsverzeichnis
2.1.7 Chemikalien ........................................................................................................................... 29
2.1.8 siRNA-Sequenzen .................................................................................................................. 30
2.1.9 Verwendete humane Zelllinien ............................................................................................... 30
2.1.10 Antikörper ............................................................................................................................... 31
2.1.11 Oligonukleotide ...................................................................................................................... 32
2.2
Methoden ............................................................................................................................... 33
2.2.1 Zellbiologische Methoden ...................................................................................................... 33
2.2.2 Molekularbiologische Methoden ............................................................................................ 36
3
Ergebnisse ............................................................................................................................. 50
3.1
Die Freisetzung von E-Cadherin ist Smad4-abhängig ........................................................... 50
3.1.1 Die Smad4-abhängigen Unterschiede im Shedding von E-Cadherin korrelieren mit der
Freisetzung von Kallikrein-6 ................................................................................................... 53
3.1.2 ADAM10 wird über Exosomen freigesetzt ............................................................................. 56
3.1.3 Die Smad4-abhängigen Unterschiede in der Freisetzung von E-Cadherin und Kallikrein-6
korrelieren mit der Menge an aktivem ADAM10 in Sekretom und Lysat ............................... 57
3.1.4 In Zellklonen später Passagen mit einer reduzierter Smad4-Expression kommt es zu
erhöhter Freisetzung von Kallikrein-6 und sE-Cadherin ........................................................ 58
3.1.5 Knockdown von Kallikrein-6 verringert sE-Cadherin-Freisetzung ......................................... 61
3.2
sE-Cadherin als Serummarker ............................................................................................... 64
3.2.1 Lösliches E-Cadherin ist in Gewebe stabil ............................................................................. 64
3.2.2 Lösliches E-Cadherin in Serum ............................................................................................. 65
3.2.3 Lösliches E-Cadherin als Verlaufsmarker .............................................................................. 70
3.3
Smad4-Abhängigkeit der Expression von Cadherin-17 ......................................................... 74
3.4
Lösliches Cadherin-17 als möglicher Serummarker .............................................................. 76
3.4.1 Freisetzung von Cadherin-17 durch Ektodomänen-Shedding ............................................... 76
3.4.2 ADAM10 ist die verantwortliche Protease für das Cadherin-17-Shedding ............................ 76
3.4.3 Gerichtete Freisetzung von Cadherin-17 ............................................................................... 81
3.4.4 Cadherin-17 in Gewebe ......................................................................................................... 83
3.4.5 Entwicklung eines ELISAs für Cadherin-17 ........................................................................... 84
3.4.6 Lösliches Cadherin-17 ist erhöht in Seren von Patienten mit kolorektalen Karzinomen der
Stadien UICC III und IV .......................................................................................................... 89
Inhaltsverzeichnis
4
Diskussion .............................................................................................................................. 94
4.1
Mechanismen und mögliche funktionelle Aspekte des Ektodomänen-Sheddings von
Cadherinen ............................................................................................................................. 94
4.1.1 E-Cadherin-Shedding als Smad4 regulierter Mechanismus .................................................. 94
4.1.2 Beteiligung von ADAM10 und Kallikrein-6 am Smad4-abhängigen Shedding ...................... 98
4.1.3 Lösliches Cadherin-17 wird durch ADAM10 freigesetzt ...................................................... 102
4.2
Mögliche Verwendung von Ektodomänen als Serummarker ............................................... 104
4.2.1 Lösliches E-Cadherin in Serum ........................................................................................... 106
4.2.2 Der potentielle Biomarker Cadherin-17 ................................................................................ 110
5
Zusammenfassung ............................................................................................................... 114
Literaturverzeichnis ............................................................................................................................. 116
Anhang ................................................................................................................................................ 129
Abkürzungsverzeichnis ........................................................................................................................ 136
Danksagung......................................................................................................................................... 139
Publikationen und Konferenzbeiträge ................................................................................................. 141
Einleitung
1
1
Einleitung
1.1
Das kolorektale Karzinom
Kolorektale Karzinome (CRC, colorectal cancer) sind mit ca. 663.000 Fällen pro Jahr
weltweit die dritthäufigste Krebsart bei Männern und mit ca. 571.000 Fällen pro Jahr
die zweithäufigste Krebsart bei Frauen. Die Inzidenz ist dabei in Industrienationen
höher als in Entwicklungsländern. Die höchsten Inzidenzraten findet man in
Westeuropa, die niedrigsten in Afrika und Zentralasien. Man schätzt, dass jährlich gut
600.000 Menschen an kolorektalen Karzinomen sterben. Das kolorektale Karzinom
ist damit die vierthäufigste Krebstodesursache. Die höchsten Mortalitätsraten findet
man in Ost- und Mitteleuropa, die niedrigsten in Zentralafrika (Ferlay et al. 2010). In
den meisten Industrienationen sind die Inzidenz und die Mortalität in den letzten
Jahren rückläufig (Center et al. 2009). Aufgrund von demografischen Effekten wird
jedoch erwartet, dass Inzidenz und Mortalität wieder ansteigen werden (Ferlay et al.
2010).
In
Deutschland
und
den
USA
betragen
die
altersstandardisierten
Neuerkrankungsraten pro Jahr ca. 60 für Männer und 40 für Frauen (pro 100.000
Einwohner) (Jemal et al. 2010; www.gekid.de). Als Risikofaktoren für Darmkrebs
gelten Übergewicht, geringe körperliche Aktivität, eine ballaststoffarme Ernährung,
der Verzehr von rotem, verarbeitetem Fleisch, Alkoholkonsum und Rauchen.
Ein erhöhtes Darmkrebsrisiko besteht bei einer chronischen, entzündlichen
Darmerkrankung, bei Patienten mit kolorektalen Adenomen, bei Verwandten von
Patienten mit kolorektalem Karzinom und bei erblichen Darmkrebserkrankungen.
Weniger als 5% der kolorektalen Karzinome sind erblichen Ursprungs. Die familiäre
adenomatöse Polyposis (FAP) und das hereditäre kolorektale Karzinom ohne
Polyposis (HNPCC, Hereditary nonpolyposis colorectal cancer) sind die häufigsten
erblichen Erkrankungen. Patienten mit unbehandelter FAP entwickeln nahezu
ausnahmslos kolorektale Karzinome. Ursache ist hier eine Keimbahnmutation des
APC-Gens,
die
zu
zahlreichen
Dickdarmpolypen
bereits
vor
dem
vierten
Lebensjahrzehnt führt. HNPCC-Patienten haben ein stark erhöhtes Risiko (bis 80%)
kolorektale Karzinome zu entwickeln. Die Ursache sind hier Mutationen in DNAMismatch-Reparaturgenen.
Einleitung
1.1.1
2
Pathogenese und Tumorstadien
Kolorektale
Adenokarzinome
machen
90-95%
der
Darmtumore
aus.
Die
Karzinogenese des kolorektalen Adenokarzinoms gilt als Modell für die mehrstufige
Tumorprogression, bei der sich das Karzinom über mehrere definierte Vorstufen
durch eine Akkumulation genetischer und epigenetischer Veränderungen entwickelt.
Die Ausbildung der ersten Vorstufe, der Polypen, ist oft mit einer Mutation im APCGen assoziiert. Weitere häufige genetische Veränderungen in Genen wie KRAS, p53
und Smad4 führen über die Zwischenstufen der frühen und späten Adenome
schließlich zu malignen Tumoren (vgl. Abbildung 1).
normales
Epithel
Hyperplasie
Mutation/Verlust
APC
kleines
Adenom
Überexpression
COX-2
großes
Adenom
Karzinom
Mutation Mutation/Verlust
KRAS
TP53
Verlust
Smad4
Abbildung 1: Die dargestellte Adenom-Karzinom-Sequenz bildet die Grundlage für die
Entwicklung des kolorektalen Karzinoms. Dabei korreliert das Auftreten von bestimmten
Mutationen mit definierten Stadien der Karzinogenese (Schwarte-Waldhoff 2003).
Man schätzt, dass dieser Verlauf von frühen Hyperplasien bis zum Karzinom bis zu
15 Jahre dauert (Kozuka et al. 1975). Jedoch entwickelt sich nur ein Teil der
Adenome zum Karzinom, wobei derzeit keine eindeutigen Möglichkeiten bestehen
die Adenome zu identifizieren, die maligne werden.
Das am weitesten verbreitete Einstufungssystem für kolorektale Karzinome ist das
TNM-System der UICC (Union internationale contre le cancer, Internationale
Vereinigung gegen Krebs). Dabei bezieht sich „T“ auf die lokale Ausbreitung des
Primärtumors, „N“ auf den Status regionaler Lymphknotenmetastasen und „M“ auf
das Vorhandensein von Fernmetastasen. Abbildung 2 zeigt schematisch die
Ausbreitung der Stadien T1 bis T3 in der Darmwand. Das Stadium T4 ist definiert als
ein Primärtumor, der in andere Organe eindringt oder das Bauchfell perforiert.
Einleitung
3
intestinales Lumen
villi
tunica mucosa
T1
T3
T2
tunica submucosa
tunica muscularis propia
tunica serosa
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Darmwand mit Primärtumoren der Stadien T1 T3.
Tabelle 1 gibt eine Übersicht über die Einteilung der Tumore nach dem TNM-System.
Die Stadien I und II umfassen Tumore, die noch keine Lymphknoten- oder
Fernmetastasen (N0 bzw. M0) haben. Stadium II kann abhängig von der Ausbreitung
des Primärtumors in zwei Stadien unterteilt werden. Das Stadium III umfasst Tumore
mit Lymphknotenmetastasen. Dieses Stadium wird unterteilt in Tumore mit 1-3 (N1)
und 4 oder mehr (N2) Lymphknotenmetastasen. In Stadium IV werden alle Tumore
mit Fernmetastasen (M1) zusammengefasst.
Tabelle 1: Übersicht über die verschiedenen Stadien, die die UICC für das kolorektale
Karzinom definiert hat, und deren Einordnung in das TNM-System. Dabei bezeichnet T die
Ausbreitung des Primärtumors und N und M das Fehlen oder Vorkommen von Lymphknotenbzw. Fernmetastasen. Die letzte Spalte zeigt den Zusammenhang zwischen Tumorstadium
und Überlebensrate (Weitz et al. 2005).
Stadium
T
N
M
5-JahresÜberlebensrate
I
T1, T2
N0
M0
80-95%
IIA
T3
N0
M0
72-75%
IIB
T4
N0
M0
65-66%
IIIA
T1, T2
N1
M0
55-60%
IIIB
T3, T4
N1
M0
35-42%
IIIC
jedes T
N2
M0
25-27%
IV
jedes T
jedes N
M1
0-7%
Einleitung
4
1.1.2
Früherkennung
In
Deutschland
besteht
im
Rahmen
des
gesetzlichen
Krebsfrüherkennungsprogramms bei einem Alter von 50-54 Jahren Anspruch auf
jährliche Tests auf okkultes Blut im Stuhl (FOBT, fecal occult blood test). Ein
entscheidender Nachteil des FOBT ist die geringe Sensitivität und Spezifität. Ein
negativer Test schließt das Vorliegen eines kolorektalen Karzinoms nicht aus, da
einige Tumore insbesondere in frühen Stadien kein Blut in das Darmlumen abgeben.
Ebenso kann ein positiver Test durch andere Faktoren wie Nahrungsmittel oder
Medikamente auch falsch-positiv sein. Ein positiver FOBT erfordert daher immer eine
anschließende Koloskopie (Schmiegel et al. 2008).
Ab einem Alter von 55 Jahren wird eine Koloskopie angeboten, die bei einem
unauffälligen Befund nach zehn Jahren wiederholt werden kann. Die Koloskopie ist
eine sensitive Methode für die Entdeckung auch von frühen Krebsvorstufen (van Rijn
et al. 2006). Nachteile der Koloskopie sind hohe Kosten, die Gefahr von
Komplikationen und das für den Patienten unangenehme Verfahren (Mansmann et
al. 2008; Zauber et al. 2008). Für Personen mit erhöhtem Darmkrebsrisiko werden
die Untersuchungen häufiger und früher durchgeführt.
1.1.3
Smad4 in der kolorektalen Karzinogenese
Smad4 ist ein wichtiger Tumorsuppressor, der zuerst beim Pankreaskarzinom
entdeckt wurde, wo Smad4 in 50% der Tumore inaktiviert ist (Hahn et al. 1996). Bei
invasiven kolorektalen Karzinomen ist Smad4 in ca. 30 % der Fälle inaktiviert. In den
Vorstufen tritt ein Smad4-Verlust deutlich seltener auf (Miyaki et al. 1999; Maitra et
al. 2000). Fehlende Smad4-Expression in kolorektalen Karzinomen korreliert mit dem
Auftreten von Lebermetastasen (Losi et al. 2007), Lymphknotenmetastasen und
einem kürzeren Überleben (Xie et al. 2003). Mutationen im Smad4-Gen spielen eine
wichtige
Rolle
bei Entwicklung
von
malignen
Tumoren.
Die
heterozygote
Inaktivierung von Smad4 führte in APC-defizienten Mäusen zu einer beschleunigten
Entwicklung der intestinalen Polypen zu Karzinomen (Takaku et al. 1998).
Mutationen von Smad4 werden häufig bei der Juvenilen Polyposis beobachtet, einer
autosomal dominanten Erkrankung, die eine Prädisposition für gastrointestinale
Karzinome bedeutet (Howe et al. 1998).
Smad4 ist das einzige bekannte co(common mediator)-Smad in Vertebraten und
nimmt damit eine zentrale Stelle in der Vermittlung von Signalen der TGF-β-
Einleitung
5
Superfamilie von Zytokinen ein. Die bioaktiven Zytokine sind Dimere, die den
Signalweg aktivieren, indem sie zwei Paare von Rezeptor-Serin/Threonin-Kinasen,
die als Typ I- und Typ II-Rezeptoren bezeichnet werden, binden. Die Typ IIRezeptoren phosphorylieren dann die Typ I-Rezeptoren, die wiederum die
Rezeptor(R)-Smads phosphorylieren. Die so gebildeten Komplexe wandern in den
Zellkern, wo sie gemeinsam mit anderen Transkriptionsfaktoren die Transkription
unterschiedlicher Zielgene modulieren (vgl. Abbildung 3). Die humane TGF-β-Familie
umfasst mehr als 30 Mitglieder, die in den TGF-β- und den BMP (bone
morphogenetic protein)-Zweig unterteilt werden können (Massagué 2008). Die RSmads Smad2 und -3 vermitteln die Signale der Zytokine des TGF-β-Zweigs,
während die R-Smads Smad1, -5 und -8 die Signale des BMP-Zweiges weiterleiten.
Smad6 und -7 bilden die Gruppe der Inhibitor(I)-Smads. Smad6 wirkt als Antagonist,
indem es mit Smad4 um die Bindung an das aktivierte Smad1 konkurriert und Smad7
vermittelt eine Inaktivierung der TGF-β- und BMP-Rezeptoren.
Abbildung 3: Grundmuster des linearen Smad Signalweges. Ligandenbindung an die
Rezeptoren führt zur Phosphorylierung der R-Smads, die dann mit Smad4 interagieren.
Dieser Komplex kann mit anderen Kofaktoren die Expression hunderter unterschiedlicher
Zielgene beeinflussen (Schwarte-Waldhoff 2003).
Smad4 besitzt die Fähigkeit selbst an die DNA zu binden, benötigt jedoch weitere
Kofaktoren um mit ausreichender Affinität und Spezifität an spezifische Zielgene zu
binden. Die Interaktion mit anderen Kofaktoren führt zu der großen Variabilität der
Einleitung
6
TGF-β-Signale. Smad4 vermittelt viele der transkriptionellen Antworten der TGF-βFamilie, es wurden jedoch auch verschiedene Wege beschrieben, die eine Smad4
unabhängige Weiterleitung von TGF-β-Signalen beschreiben (Massagué 2008).
1.2
Sekretom-Analysen
Unsere Arbeitsgruppe verfolgt seit einigen Jahren den Ansatz, Biomarker aus dem
konditionierten Medium von kultivierten Karzinom- oder Adenomzelllinien zu
identifizieren. Die Gesamtheit der in das Medium abgegebenen Proteine bezeichnen
wir als Sekretom (Volmer et al. 2005). Die Grundlage dieses Ansatzes ist die
Annahme, dass die von kultivierten Tumorzellen in vitro freigesetzten Proteine zu
einem gewissen Grad den in vivo freigesetzten Proteinen entsprechen. Damit stellt
das Sekretom eine umfangreiche, leicht zugängliche und standardisierbare Quelle an
Proteinen dar. Diese kann wertvolle Informationen über wichtige Eigenschaften eines
Tumors liefern, wie zum Beispiel Tumor-Stroma-Interaktionen. Außerdem enthält sie
viele Proteine, die als potentielle Tumorbiomarker-Kandidaten in Frage kommen. Die
Charakterisierung der Proteine, die in das konditionierte Medium von kultivierten
Tumorzellen
gelangen,
zeigte,
dass
verschiedene
Mechanismen
zur
Zusammensetzung des Sekretoms beitragen. Neben der Freisetzung durch
klassische Sekretion und unspezifische Freisetzung durch Zelltod gelangen viele
Proteine durch vesikuläre Freisetzung und durch Ektodomänen-Shedding in das
konditionierte Medium (Volmer et al. 2005; Diehl et al. 2007).
1.2.1
Differentielle Sekretomstudien zur Funktionsanalyse des
Tumorsuppressors Smad4
Seit vielen Jahren erforscht unsere Arbeitsgruppe die tumorsupprimierende Wirkung
von Smad4. Zu diesem Zweck wurden Zellkultur-Modellsysteme entwickelt, indem in
Smad4-negativen Pankreas- und Kolonkarzinomzellen Smad4 stabil reexprimiert
wurde. Dies ermöglicht die alleinige Untersuchung von Smad4-Effekten zwischen
ansonsten genetisch identischen Zellen in einem tumorbiologisch relevanten Kontext.
Mit diesen Modellen konnte gezeigt werden, dass Smad4-negative Zellen nach
subkutaner Injektion in Nacktmäusen Tumore ausbilden. Die Reexpression von
Smad4 verhindert jedoch, dass die Tumore über eine Größe von 2 – 5 mm
weiterwachsen (Schwarte-Waldhoff et al. 2000). Es stellte sich heraus, dass Smad4
überraschenderweise nicht als direkter Regulator der wachstumshemmenden
TGF-β-Signale (Müller et al. 2002), sondern vielmehr auf die Regulation von Tumor-
Einleitung
7
Stroma-Interaktionen wie z. B. Angiogenese wirkt (Schwarte-Waldhoff et al. 2000).
Dies zeigte, dass der Smad4-Status der Zellen offenbar einen Einfluss auf die
freigesetzten Proteine hat. Um diesen Aspekt der Funktion von Smad4 besser zu
verstehen wurden mit Hilfe von differentiellen Sekretomanalysen die Smad4abhängig freigesetzten Proteine analysiert. Dazu wurden in vorangegangenen
Doktorarbeiten von Hanna Diehl und Martin Volmer die Sekretome von Smad4negativen und Smad4-reexprimierenden Klonen der Zelllinien SW480 (Volmer et al.
2005) und SW620 (Diehl 2008) differentiell analysiert. Die Sekretome wurden mit
zweidimensionaler Gelelektrophorese aufgetrennt und die differentiellen Proteinspots
mit massenspektrometrischen Methoden identifiziert. Auf diese Weise wurden einige
Proteine gefunden, deren Freisetzung Smad4-abhängig reguliert wird. So wurde
beispielsweise weniger Kallikrein-6 im Sekretom Smad4-positiver SW620-Zellen
gefunden.
1.2.2
Das Sekretom als Quelle für Serummarker
Neben den oben beschriebenen differentiellen Analysen wurden Sekretome der
Zelllinien SW620 und LT97 analysiert um potentielle Tumormarker zu identifizieren,
die in Serum nachgewiesen werden können. Bei der Analyse des Sekretoms wurde
unter anderem E-Cadherin als abundante Komponente des Sekretoms der Zelllinie
SW620 identifiziert. Dabei konnte gezeigt werden, dass E-Cadherin durch
Ektodomänen-Shedding freigesetzt wird (Diehl et al. 2007). Die Zelllinie SW620 ist
aus einer Lymphknotenmetastase gewonnen worden (Leibovitz et al. 1976), und sie
ist eine stark dedifferenzierte Zelllinie, die die spezifischen Expressionsmuster des
intestinalen Epithels weitestgehend verloren hat. Für die Identifizierung von
potentiellen Biomarkern, die auch in frühen Stadien schon erhöht sind, erschien
deshalb die Analyse des Sekretoms der Adenomzelllinie LT97 vielversprechender.
Dabei wurde unter anderem Cadherin-17 entdeckt, ein Protein, welches als Marker
für das intestinale Epithel gilt und dessen Freisetzung bisher noch nicht beschrieben
wurde.
1.3
Tumormarker
Die Entdeckung von frühen, präsymptomatischen Krebsstadien stellt die beste
Möglichkeit zur Reduktion der Mortalität dar (Etzioni et al. 2003). Während die
5-Jahres-Rate für krankheitsfreies Überleben von Patienten mit einem kolorektalen
Tumor des UICC-Stadiums I bei über 90% liegt, reduziert sich diese Zahl auf 60% bei
Einleitung
8
Patienten im UICC-Stadium III und auf ca. 10% für Tumore des UICC-Stadiums IV
(Gondos et al. 2007).
Die derzeit angewendeten Screening-Verfahren, FOBT und Koloskopie, haben
bereits zu einer verbesserten Früherkennung von kolorektalen Tumoren und damit
Reduktion der Mortalität beigetragen. Dennoch liegt die 5-Jahres-Überlebensrate in
Ländern mit guter medizinischer Versorgung, wie Deutschland und den USA,
lediglich bei 60%, da viele kolorektale Karzinome immer noch zu spät erkannt
werden. Dies wird zum einen auf die geringe Sensitivtät des FOBT und zum anderen
auf die mangelnde Beteiligung an der Koloskopie zurückgeführt, die in Deutschland
acht Jahre nach Einführung jährlich lediglich 2,6 % der berechtigten Personen
beträgt (Brenner et al. 2010).
Serummarker sind einfach und kostengünstig mit etablierten Diagnosetechniken zu
analysieren. Die Abnahme einer Serumprobe ist für den Patienten kaum belastend
und schnell durchzuführen. Daher bieten solche Marker das Potential für ein
allgemein akzeptiertes Screening. Serummarker können entweder vom Tumor selbst
oder aus dem umgebenden Stroma stammen.
Serummarker
können
potentiell für
ein
bevölkerungsweites
Screening,
die
differentielle Diagnose von symptomatischen Patienten oder die Einstufung des
Tumors verwendet werden. Weitere Einsatzmöglichkeiten sind die Verwendung als
Verlaufsmarker
um
das
Therapieansprechen
zu
kontrollieren
oder
zur
Nachbeobachtung für die Detektion von Rezidiven. Trotz potentiell kurativer
Operation treten bei vier von zehn Patienten mit kolorektalem Karzinom Rezidive auf
(Kievit 2002). Das Ziel der Nachbeobachtung von Patienten mit therapierten
kolorektalen Tumoren ist die Entdeckung von resektierbaren Metastasen oder
Rezidiven.
Weitere Biomarker werden benötigt, da die derzeitigen klinischen Angaben wie z. B.
TNM-Stadium oft nur eingeschränkte Informationen über Therapieansprechen und
Prognose liefern können. Außerdem bietet die individuelle Bestimmung von
Biomarkern potentiell die Möglichkeit, die Therapieauswahl nicht auf der Basis von
Statistiken, sondern aufgrund spezifischer Charakteristiken eines Tumors und
Patienten zu treffen. So ist beispielweise die Bestimmung der individuellen
Expression des Östrogenrezeptors und von Her2/neu (human epidermal growth
factor receptor 2) im Tumorgewebe klinischer Standard zur Therapieplanung beim
Einleitung
9
Brustkrebs. Prädiktive Serummarker sind bisher jedoch noch nicht in der klinischen
Anwendung.
1.3.1
CEA
Das carcinoembryonic antigen (CEA) ist der einzige Serummarker für das kolorektale
Karzinom, der für eine klinische Anwendung empfohlen wird (Sturgeon et al. 2008).
CEA wurde bei seiner Entdeckung zunächst als onkofetales Antigen beschrieben
(Gold und Freedman 1965), welches im Fötus, aber nicht in adultem Gewebe
exprimiert und in Tumoren reexprimiert wird. Mittlerweile ist zwar bekannt, dass CEA
auch in gesunden Geweben exprimiert wird (Hammarström 1999), es ist jedoch
bereits vor Jahrzehnten gezeigt worden, dass Patienten mit kolorektalen Karzinomen
erhöhte CEA-Konzentrationen im Serum aufweisen und dass diese mit dem
Tumorstadium korrelieren (Bivins et al. 1975). Dies wird darauf zurückgeführt, dass
CEA in gesundem Darmgewebe apikal exprimiert ist und in das Darmlumen
abgegeben wird. In Tumoren kann CEA aufgrund des Verlustes der Polarität der
Epithelzellen in das Serum gelangen.
Aufgrund der zu geringen Sensitivität und Spezifität für die Diagnose von Darmkrebs
ist CEA als Marker für ein bevölkerungsweites Screening nicht geeignet (Duffy 2001).
Anwendung findet die Messung des CEA-Wertes als unabhängiger prognostischer
präoperativer Marker bei der Nachbeobachtung von Patienten mit resektierten
Tumoren und für die Überwachung des Behandlungsverlaufes bei fortgeschrittenen
Erkrankungen (Sturgeon et al. 2008). Es konnte gezeigt werden, dass diese
intensive Überwachung kosteneffizient ist (Graham et al. 1998; Renehan et al. 2004)
und das Überleben verbessert.
Die Serumkonzentration von CEA ist jedoch nicht nur bei Patienten mit kolorektalen
Karzinomen erhöht, sondern auch bei anderen Tumorerkrankungen wie Magen- und
Pankreaskarzinom (Nazli et al. 2000; Takahashi et al. 2003). Eine weitere
Einschränkung bei der Messung von CEA bei der Verlaufskontrolle ist, dass zwar ein
Anstieg der CEA-Konzentration im Blut mit hoher Wahrscheinlichkeit mit einem
Rezidiv einhergeht, gleichbleibende Werte jedoch nicht geeignet sind um ein Rezidiv
auszuschließen (Hara et al. 2008). Eine Meta-Analyse mit 20 Studien ergab eine
Spezifität von 90 % und eine Sensitivität von 64 % für die Diagnose von Rezidiven
(Tan et al. 2009).
Einleitung
10
Trotz intensiver Forschung in mehr als vier Jahrzehnten ist seit der Entdeckung von
CEA im Jahr 1965 kein Serumbiomarker entdeckt worden, der CEA als
Verlaufsmarker ersetzen oder gar als Screening Marker verwendet werden könnte.
Die Entwicklung moderner Proteomics-Methoden, die eine vergleichsweise schnelle
und einfache Identifizierung vieler unbekannter Proteine ermöglichen, bietet eine
vielversprechende Möglichkeit neue Biomarker zu identifizieren. Trotz zahlreicher
publizierter Kandidaten sind bisher jedoch mit dieser Methode keine Biomarker
entdeckt worden, die für die Anwendung im klinischen Alltag empfohlen werden
(Roessler et al. 2005; Roessler et al. 2006; Thierolf et al. 2008). Aufgrund der oben
erwähnten Ergebnisse unserer Sekretomanalysen betrachten wir lösliche Formen
von Cadherinen als vielversprechende Kandidaten für neue Serummarker.
1.4
Cadherine
Cadherine
sind
eine
heterogene
Superfamilie
von
glykosylierten
Transmembranproteinen, von denen viele eine kalziumabhängige Zelladhäsion
vermitteln. Die Superfamilie der Cadherine wird üblicherweise in mindestens vier
Unterfamilien
unterteilt:
klassische
Cadherine,
desmosomale
Cadherine,
Protocadherine und sonstige/unkonventionelle Cadherine. Die letzte Gruppe kann
noch weiter aufgeteilt werden z.B. in 7-Transmembran-Cadherine, trunkierte
(T-)Cadherine und 7-Domänen (7D)-Cadherine (Angst et al. 2001; Wendeler et al.
2007). Am besten untersucht ist die Unterfamilie der klassischen Cadherine, die aus
fünf jeweils ca. 110 Aminosäuren großen EC-Domänen (extrazelluläre CadherinDomänen)
und
einem
hochkonservierten
150-160
Aminosäuren
großen
zytoplasmatischen C-Terminus bestehen. Wie fast alle Cadherine sind sie Typ Isinglepass-Transmembranproteine. Das bedeutet, dass sie einmal die Membran
durchqueren, wobei der N-Terminus extrazellulär liegt. Man geht davon aus, dass die
klassischen Cadherine bei der Zell-Zell-Adhäsion zunächst parallele cis-Dimere
ausbilden, die dann mit anderen cis-Dimeren auf einer benachbarten Zelle
interagieren (Gumbiner 2005). Bei dieser so genannten trans-Interaktion binden die
gegenüberliegenden Cadherine mit ihrer jeweiligen N-terminalen EC1 Domäne
aneinander (Zhang et al. 2009). Alternierende tis- und trans-interaktionen können
dann reißverschlussartige Superstrukturen bilden (Pertz et al. 1999). Es gibt jedoch
auch neuere Veröffentlichungen, die einer cis-Dimerisierung widersprechen und
beschreiben, dass Cadherin-Monomere die Transinteraktion ausbilden (Zhang et al.
2009).
Einleitung
11
In der Embryonalentwicklung kontrollieren
Cadherine Trennung oder Verbindung von
Geweben und sind für die Ausbildung von
Gewebegrenzen verantwortlich. Im gesunden,
reifen Gewebe sind die klassischen Cadherine
unter anderem an einem geregelten Umsatz
schnell
wachsender
physiologischen
Gewebe,
an
Regulation
Zellverbindungen
von
der
der
Epithel-
und
Endothelzellen und an der Aufrechterhaltung
einer
stabilen
Gewebestruktur
beteiligt
EC1
(Gumbiner 2005).
Ca2+
Das intestinale Epithel erfüllt eine Vielzahl an
Funktionen wie die selektive Aufnahme von
EC2
EC3
Nährstoffen und Ionen, die Resorption von
Wasser
und
die
Abwehr
von
Krankheitserregern. Das Epithel unterliegt
dabei
einer
ständigen
Erneuerung,
EC4
EC5
was
verschiedene und genau regulierte Zell-ZellAdhäsionsmechanismen
erfordert.
Im
intestinalen Epithel sind
E-Cadherin und
Cadherin-17 stark exprimiert.
1.4.1
α-Catenin
E-Cadherin
E-Cadherin (Epitheliales-Cadherin) gilt als der
Prototyp der klassischen Cadherine und ist
das am meisten untersuchte Cadherin. Es
handelt
sich
um
ein
120
β-Catenin
kDa
großes
Transmembranprotein, welches die Adherens
Junctions zwischen Epithelzellen ausbildet.
Niedrige Ca2+-Konzentrationen (50-100 µM)
stabilisieren die stabförmige Struktur der
Einzelmoleküle. Bei höheren Konzentrationen
kommt es zunächst zu cis-Interaktionen und
Abbildung 4: Schematische Darstellung
der E-Cadherin Interaktionen. Die
extrazelluläre Region von E-Cadherin
besteht aus fünf EC-Domänen. Diese
werden durch Kalzium-Ionen stabilisiert,
bilden ein stäbchenförmiges Protein und
können
auf
derselben
Membran
parallele cis-Dimere ausbilden. Über die
EC1-Domäne interagieren diese mit
Cadherinen auf benachbarten Zellen.
Intrazellulär bindet E-Cadherin an βCatenin, welches an α-Catenin bindet.
Auf einem noch nicht vollständig
geklärten Weg bindet α-Catenin dann an
Aktin und Aktin-bindende Proteine wie
z. B. Vinculin oder Actinin.
Einleitung
12
bei Ca2+-Konzentrationen über 1 mM bilden sich die für die adhäsive Funktion der
Cadherine essentiellen trans-Interaktionen aus (Pertz et al. 1999). Dabei bindet die
zytoplasmatische Domäne von E-Cadherin an β-Catenin, welches über α-Catenin mit
den Zytoskelett interagiert.
E-Cadherin wird in nahezu allen Epithelien exprimiert und ist ein zentraler Regulator
der epithelialen Morphologie und des polarisierten Phänotyps. Ein Funktionsverlust
oder eine Herunterregulation der E-Cadherin-Expression ist mit der epithelialmesenchymalen Transition (EMT) assoziiert. Dabei verlieren die Zellen ihre
epithelialen Eigenschaften und erlangen ein erhöhtes invasives und metastatisches
Potential. Epithelzellen zeichnen sich unter anderem durch dichte Zell-Zell-Kontakte
und eine apikal-basolaterale Polarisierung aus. Mesenchymale Zellen hingegen
bilden keine dichte Zellschicht und haben nur schwache Zell-Zell-Kontakte.
Außerdem weisen sie keine Polarisierung auf und haben in vitro eine spindelförmige,
fibroblastenartige Morphologie. Die EMT nimmt bei der Tumorprogression eine
zentrale Rolle ein; so zeigen Tumorzellen beim Erwerb invasiver Eigenschaften
mesenchymale Expressionsmuster. Während mesenchymale Zellen kein E-Cadherin
exprimieren, ist die E-Cadherin-Expression in Epithelzellen weit verbreitet (Peinado
et al. 2004). Folglich ist der Verlust der E-Cadherin-Expression ein Endpunkt vieler
EMT-induzierender Signalwege (Reinacher-Schick et al. 2004; Thiery und Sleeman
2006). Die Mechanismen, die einen Verlust der E-Cadherin-vermittelten Adhäsion in
der Karzinogenese verursachen können, umfassen: inaktivierende Mutationen,
epigenetisches Gen-Silencing, proteolytische Spaltung, Endozytose, proteosomalen
Abbau und die erhöhte Expression nicht-epithelialer Cadherine wie N-Cadherin (de
Wever et al. 2007; van Roy und Berx 2008).
Entsprechend ist die E-Cadherin-Expression häufig in dedifferenzierten Tumoren und
Krebszelllinien herunterreguliert und korreliert invers mit einem dedifferenzierten
Phänotyp und erhöhter Invasivität in in vitro Modellen (Tsanou et al. 2008).
Außerdem
konnte
gezeigt
werden,
dass
eine
reduzierte
Expression
in
dedifferenzierten kolorektalen Karzinomen mit einer niedrigeren Überlebensrate
korreliert (Ngan et al. 2007).
Ebenso führt auch die Blockierung der E-Cadherin-Funktion durch monoklonale
Antikörper zu einer Induktion der Invasivität. Eine E-Cadherin-Reexpression in
Einleitung
13
E-Cadherin-negativen Zellen hingegen führt zu einer Reduktion der Invasivität
(Behrens 1999).
1.4.2
Cadherin-17
Cadherin-17 wird gemeinsam mit Cadherin-16 (kidney specific, Ksp-Cadherin) als
7D-Cadherin
klassifiziert.
Diese
Unterfamilie
zeichnet
sich
durch
sieben
extrazelluläre Cadherin-Domänen (EC1-EC7) und eine kurze cytoplasmatische
Domäne von circa 20 Aminosäuren aus. Die Gene für beide Proteine besitzen 18
Exons (Wendeler et al. 2004). Es wird vermutet, dass sich diese 7D-Cadherine aus
einem Cadherin mit fünf Cadherin-Domänen entwickelt haben. Sowohl die äußeren
beiden Cadherin-Domänen EC1 und EC2, als auch die Domänen EC3 und EC4 sind
jeweils zu den Domänen EC1 und EC2 der klassischen Cadherine homolog (Jung et
al. 2004). Außerdem fehlt bei Cadherin-17 zwischen EC2 und EC3 die übliche
Kalziumbindestelle.
Dies
weist
auf
eine
Duplikation
der
beiden
äußeren
Cadherindomänen hin, da der N-terminalen Cadherindomäne (EC1) üblicherweise
das für die Kalziumbindung notwendige Sequenzmotiv fehlt.
Die circa 3,7 kb große mRNA kodiert für ein Protein mit einer berechneten Masse
von circa 92 kDa. Die im Western Blot beobachtete Masse von Cadherin-17 liegt
jedoch bei circa 120 kDa. Dieser Unterschied ist auf eine starke Glykolisierung des
Proteins zurückzuführen (Berndorff et al. 1994).
Cadherin-17 ist bei seiner Entdeckung aus Rattenleber kloniert worden (Berndorff et
al. 1994). In der Ratte wird Cadherin-17 unter physiologischen Bedingungen nicht
nur im Darm, sondern auch in der Leber exprimiert. Daher wurde Cadherin-17
ursprünglich auch LI-(liver-intestine) Cadherin genannt. Bei Mäusen und Menschen
ist die Expression physiologisch auf den Darm beschränkt (Angres et al. 2001), (vgl.
Abbildung 5).
14
Cadherin-17 Expression
Einleitung
Abbildung 5: Gezeigt ist die mRNA-Expression von Cadherin-17 in verschiedenen humanen
Geweben. Die Daten wurden von Deszo et al. mit dem ABI Human Genome Survey
Microarray Version 2 bestimmt (Dezso et al. 2008) und über den GEO Dataset Browser
bezogen (geo). UHR: Universale humane Referenz-RNA; PBL: Periphere Blutlymphozyten.
Im intestinalen Epithel ist Cadherin-17 wie E-Cadherin an der basolateralen
Membran lokalisiert. E-Cadherin ist in den Adherens Junctions akkumuliert, während
Cadherin-17 über die gesamte basolaterale Membran verteilt zu sein scheint
(Berndorff
et
al.
cholesterinreichen
1994).
Es
gibt
jedoch
Membranbereichen
Hinweise,
(Caveolae,
dass
Rafts)
Cadherin-17
angereichert
in
ist
(Baumgartner et al. 2008).
In der Embryogenese der Maus kann Cadherin-17 erstmals an Tag E12,5 detektiert
werden und fällt somit mit der Ausbildung der intestinalen Villi zusammen (Angres et
al. 2001).
Cadherin-17 kann homotypische Interaktionen mit anderen Cadherinen auf
benachbarten Zellen ausbilden (Wendeler et al. 2007). Wie bei den klassischen
Cadherinen
ist
auch
die
Cadherin-17-Interaktion
abhängig
von
der
Ca2+-
Konzentration. Während die klassischen Cadherine für die Ausbildung von
extrazellulären Interaktionen im Komplex mit α- und β-Catenin vorliegen müssen, ist
die adhäsive Funktion von Cadherin-17 offenbar unabhängig von Interaktionen mit
Komponenten des Zytoplasmas (Kreft et al. 1997). Die 25 Aminosäuren kurze
intrazelluläre Domäne weist keine Homologien mit den intrazellulären Domänen der
Einleitung
15
anderen Cadherine auf. Durch Expression von Cadherin-17 in S2-Zellen aus
Drosophila und murinen L-Zellen konnte gezeigt werden, dass Cadherin-17 als Ca2+abhängiges Adhäsionsmolekül wirken kann (Berndorff et al. 1994; Kreft et al. 1997).
Die genaue Funktion von Cadherin-17 ist jedoch noch nicht verstanden. Experimente
auf Einzelmolekülebene und in vitro-Experimente haben gezeigt, dass E-Cadherin
und Cadherin-17 auch heterotypische trans-Interaktionen ausbilden können, die sich
ähnlich wie die homotypischen trans-Interaktionen der jeweiligen Cadherine
verhalten. Es ist jedoch aufgrund der unterschiedlichen subzellulären Lokalisation
eher unwahrscheinlich, dass diese heterotypische Transinteraktion im gesunden,
ausgereiften Gewebe physiologische Relevanz besitzt. Vermutet wird vielmehr eine
Funktion bei der Ausbildung des intestinalen Epithels während der Embryogenese
(Baumgartner et al. 2008).
In Mäusen wurde ein BILL-Cadherin genanntes Cadherin beschrieben, welches
identisch mit Cadherin-17 sein soll (Ohnishi et al. 2000; Angres et al. 2001; Ohnishi
et al. 2005; Mundt et al. 2006). Dieser Aspekt ist jedoch bisher kaum untersucht und
auch nur in Mäusen beschrieben worden und damit noch weitestgehend unklar.
Von Dantzig et al. wurde 1994 eine mit Cadherin-17 identische mRNA kloniert, die für
einen Peptidtransporter kodieren soll. Auch dieser Aspekt ist jedoch nicht weiter
untersucht worden und somit ebenfalls noch unklar (Dantzig et al. 1994).
1.4.3
Cadherin-17-Expression in Tumoren
Die Cadherin-17-Expression ist unter physiologischen Bedingungen auf das
intestinale Epithel beschränkt. Die Arbeitsgruppen, die die Expression von Cadherin17 beim kolorektalen Karzinom untersucht haben, kommen zu unterschiedlichen
Schlussfolgerungen. Während einige Gruppen eine reduzierte Expression in
dedifferenzierten kolorektalen Karzinomen beschreiben (Takamura et al. 2004; Kwak
et al. 2007), wurde in einer neueren umfangreichen Studie eine erhaltene Expression
beschrieben (Su et al. 2008). Auch Luque-Garcia et al. beschreiben, dass 80 von 90
Tumoren der Stadien T1 bis T4 Cadherin-17-positiv sind (Luque-García et al. 2010).
Cadherin-17-Expression findet man auch in Peritoneal- und Lebermetastasen von
kolorektalen Karzinomen (Varghese et al. 2007; Reinhard Geßner, persönliche
Mitteilung).
Für fast alle Tumorentitäten des Gastrointestinaltraktes wurde eine ektope
Cadherin-17-Expression
beschrieben.
In
Tumoren
außerhalb
des
Einleitung
16
Gastrointestinaltraktes wurde keine ektope Cadherin-17-Expression gefunden (Su et
al. 2008).
Umfangreich beschrieben ist die ektope Cadherin-17-Expression im Magenkarzinom.
Aufgrund der hohen Inzidenz für das Magenkarzinom in ostasiatischen Ländern
stammen die Studien überwiegend aus den betroffenen Ländern. Eine ektope
Cadherin-17-Expression wurde in 30-65% der Tumore beschrieben, wobei die
Expression in Magenkarzinomen des intestinalen Typs signifikant höher ist
(Grötzinger et al. 2001; Yasui et al. 2004; Ito et al. 2005; Ko et al. 2005; Motoshita et
al. 2006; Tian et al. 2007; Ge et al. 2008; Su et al. 2008; Lee et al. 2010). Die
Cadherin-17-Expression ist in Magenkarzinomen später Stadien höher als in frühen
Stadien (Oue et al. 2004; Yasui et al. 2004; Ito et al. 2005; Ge et al. 2008). Die
E-Cadherin-Expression in späteren Stadien nimmt dagegen ab (Motoshita et al.
2006). Außerdem wurde beschrieben, dass die
Cadherin-17-Expression in
Magenkarzinomen ein prädiktiver Marker für Lymphknotenmetastasen (Dong et al.
2007) und eine schlechtere Prognose (Ito et al. 2005; Ge et al. 2008) sein könnte.
Lee et al. schlagen hingegen nach immunhistochemischer Analyse von über 900
Magenkarzinomen vor, dass Cadherin-17 als Marker für eine bessere Prognose von
Stadium I bzw. N0 Tumoren verwendet werden könnte (Lee et al. 2010).
Cadherin-17-Expression
konnte
auch
in
Lymphknotenmetastasen
des
Magenkarzinoms (Ko et al. 2004), sowie beim Barrett-Ösophagus und in
verschiedenen Stadien des Speiseröhrenkrebses nachgewiesen werden (Weimann
et al. 2010).
Eine ektope Cadherin-17-Expression wurde auch für das Leberzellkarzinom
(hepatocellular carcinoma, HCC) beschrieben (Wong et al. 2003). Ding et al.
berichten, dass 47% der HBV (Hepatitis-B-Virus)-positiven Tumore Cadherin-17positiv waren (Ding et al. 2009). Die Cadherin-17-Expression war dabei ein
prognostischer Marker für Rekurrenz und kürzere Überlebensraten. In der Studie von
Su et al. hingegen zeigte keiner der 57 untersuchten HCC-Fälle eine Cadherin-17Färbung (Su et al. 2008). Beim Pankreaskarzinom wurde eine Cadherin-17Expression in über 50% der untersuchten Tumore gezeigt (Takamura et al. 2003; Su
et
al.
2008).
Ebenso
wurde
eine
ektope
Cadherin-17-Expression
Gallengangskarzinom beschrieben (Su et al. 2008; Takamura et al. 2010).
beim
Einleitung
17
Durch siRNA-vermittelten Knockdown von Cadherin-17 in Cadherin-17-positiven
HCC-Zelllinien konnten Proliferation, Migration, Adhäsion an die extrazelluläre Matrix
und Matrigelinvasivität signifikant reduziert werden (Ding et al. 2009; Liu et al. 2009;
Zhang et al. 2010). In einem Xenograft-Modell in Nacktmäusen zeigten diese
Zelllinien mit Cadherin-17-Knockdown ein geringeres Tumorwachstum und ein
niedrigeres metastatisches Potential (Liu et al. 2009). In einem anderen Mausmodell
führte die Überexpression von Cadherin-17 in embryonalen Vorläuferzellen der
Mäuseleber nach subkutaner Injektion zum Wachstum von Tumoren (Liu et al. 2009).
Ähnlich wie bei Cadherin-17-positiven HCC-Zelllinien führte auch hier ein siRNAvermittelter
Knockdown
von
Cadherin-17
in
Cadherin-17-positiven
Magenkarzinomzelllinien zu einer verringerten Proliferation, Adhäsivität, Invasivität
und zu einem verzögerten Wachstum im Xenograft-Nacktmausmodell (Liu et al.
2010; Zhang et al. 2010).
In einem Zellkulturmodell mit Kolonkarzinomzelllinien wurde gezeigt, dass Cadherin17 in einer Zelllinie mit höherem metastatischem Potential stärker exprimiert wird
(Luque-García et al. 2010). Im Unterschied zu in vitro-Versuchen mit Leber- und
Magenkarzinomzelllinien, bei denen nach Cadherin-17-Knockdown eine verringerte
Migrationsfähigkeit und Invasivität beobachtet wurde, führte ein Cadherin-17Knockdown in der kolorektalen Karzinomzelllinie Lovo zu einer verstärkten Migration
und Matrigelinvasivität (Yu et al. 2010). Fang et al. zeigten mit Massenspektrometrie
eine Anreicherung von Cadherin-17 in CD133-positiven Kolonkarzinomzellen (Fang
et
al.
2010).
Es gibt
Hinweise,
dass
CD133-positive
Zellen
sogenannte
Tumorstammzellen sein könnten, eine Subpopulation von Zellen, die für das
Tumorwachstum verantwortlich sind (O‟Brien et al. 2007; Ricci-Vitiani et al. 2007) .
1.4.4
Transkriptionsregulation von Cadherin-17
Cdx2 reguliert im Intestinaltrakt die Expression vieler intestinaler Proteine, unter
anderem auch Cadherin-17. Das Homöobox-Gen cdx2 ist ein entscheidender
Transkriptionsfaktor für die intestinale Differenzierung und fungiert im intestinalen
Epithel möglicherweise als Tumorsuppressor (Tamai et al. 1999). Nach cdx2Reexpression in der Kolonkarzinomzelllinie HT-29 war Cadherin-17 das am stärksten
aktivierte Gen (Hinoi et al. 2002). Cdx2 bindet direkt an den cdh17 Promoter (Hinoi et
al. 2002; Zhu et al. 2010). Der Verlust von cdx2 in Polypen von cdx2 (+/-)-Mäusen
führt auch zu einem Verlust der Cadherin-17-Expression (Hinoi et al. 2002). Cdx2-
Einleitung
18
Expression findet man auch in Magenkarzinomen des intestinalen Typs (Ge et al.
2008), oft gemeinsam mit Cadherin-17-Expression (Ko et al. 2005).
1.5
Ektodomänen-Shedding
Als Ektodomänen-Shedding bezeichnet man die proteolytische Abspaltung des
extrazellulären
Abschnitts
von
Membranproteinen
wie
Rezeptoren,
Wachstumsfaktoren oder Zelladhäsionsproteinen. Insbesondere die Freisetzung
membrangebundener Wachstumsfaktoren wie epidermal growth factor (EGF) oder
tumor necrosis factor (TNF) durch Ektodomänen-Shedding ist umfangreich
untersucht. Shedding ermöglicht eine schnelle Veränderung der Proteinexpression
an der Zelloberfläche und kann lösliche Mediatoren freisetzen, die auf andere Zellen
einwirken können. Die wichtigsten Proteasen, die für das Ektodomänen-Shedding
verantwortlich sind, stammen aus den Familien der Matrixmetalloproteasen (MMP)
und der ADAMs (a disintegrin and metalloprotease).
Ein Anstieg der Metalloprotease-Aktivität ist bei invasiven Tumoren zu beobachten.
In einem frühen Modell wurde dies darauf zurückgeführt, dass von Tumorzellen
freigesetzte Metalloproteasen die extrazelluläre Matrix abbauen, die eine natürliche
Barriere für Invasivität und Metastasierung darstellt. Metalloproteasen können jedoch
nicht nur von Tumorzellen selbst freigesetzt werden, sondern auch vom umliegenden
Stromagewebe wie z.B. Fibroblasten und inflammatorische Zellen. Darüber hinaus
können Metalloproteasen auch Wachstum, Apoptose und Signaltransduktion
beeinflussen, indem sie die Ektodomänen von Transmembranproteinen abspalten
(Chambers und Matrisian 1997). Die Vorstellung, dass extrazelluläre Proteasen
Tumorwachstum
und
Metastasierung
fördern,
führte
dazu,
dass
Metalloproteaseinhibitoren in klinischen Studien getestet wurden. Diese waren
jedoch unspezifisch und führten in manchen Fällen sogar zu einem verstärkten
Tumorwachstum (López-Otín und Matrisian 2007). Dies zeigt, dass einige der
extrazellulären Proteasen auch tumorsupprimierende Eigenschaften haben können
und dass ein genaues Verständnis der Proteasen und ihrer Zielproteine für eine
potentielle klinische Anwendung nötig ist.
1.5.1
ADAM10
ADAM10
gehört
zur
Familie
der
ADAMs,
einer
Familie
Zink-abhängiger
Metalloproteasen. Von den circa 40 bekannten ADAMs weisen jedoch nur zwölf die
funktionell notwendige Metalloprotease-Sequenz HExxH auf (ADAM8, -9, -10, -12, -
Einleitung
19
15, -17, -19, -20, -21, -28, -30 und -33)(Mochizuki und Okada 2007). Die
proteolytisch aktiven ADAMs sind wesentlich am Ektodomänen-Shedding einer
Vielzahl membrangebundener Proteine beteiligt, weshalb sie auch als „Sheddasen“
bezeichnet werden. Das humane ADAM10 ist ein 748 Aminosäuren großes Typ ITransmembranprotein, welches als inaktive Proform synthetisiert wird. Die
Aktivierung geschieht durch proteolytische Abspaltung der Prodomäne (Crawford et
al. 2009). Bisher wurden mehr als 40 Substrate für das katalytisch aktive ADAM10
beschrieben, wie z. B. E-Cadherin, N-Cadherin und VE-Cadherin (Reiss et al. 2005;
Schulz et al. 2008). Versuche mit Inhibitoren von ADAM10 und mit siRNAvermitteltem Knockdown von ADAM10 haben gezeigt, dass ADAM10 am
konstitutiven und regulierten Shedding von E-Cadherin beteiligt ist und Zelladhäsion
und –migration beeinflusst. (Maretzky et al. 2005). ADAM10 ist in allen Geweben
exprimiert und spielt eine wichtige Rolle bei der Neuronalentwicklung, der
Morphogenese und bei Umbauprozessen von Epithelien. Eine Überexpression wurde
für viele Tumore beschrieben, unter anderem für das kolorektale Karzinom. Dabei
wurde eine Anreicherung von ADAM10 an der invasiven Front gefunden (Gavert et
al. 2005). Außerdem wurde gezeigt, dass eine erhöhte Expression mit dem
Tumorstadium korreliert (Knösel et al. 2005). Die vitale Bedeutung von ADAM10 wird
dadurch belegt, dass Embryonen von ADAM10-/--Knockout-Mäusen vor dem Tag
E9,5 sterben.
Für einige Zelladhäsionsmoleküle, wie E-Cadherin oder L1, die von ADAM10
gespalten werden können, wurden erhöhte Serumkonzentrationen der löslichen
Ektodomänen bei Krebspatienten beschrieben (Altevogt und Fogel 2004).
1.5.2
Veränderung der interzellulären Adhäsion durch EktodomänenShedding
Durch Ektodomänen-Shedding freigesetzte Fragmente von Transmembranproteinen
können eine veränderte funktionelle Aktivität besitzen. So können z. B. lösliche
Ektodomänen von Cadherinen als para- oder autokrine Kompetitoren der CadherinCadherin-Bindung dienen oder, an die extrazellulare Matrix gebunden, als Anker für
Migration fungieren (de Wever et al. 2007).
Eine wichtige Eigenschaft von Karzinomzellen ist die Fähigkeit sich vom Primärtumor
zu lösen und Metastasen zu bilden (Hanahan und Weinberg 2000). Für eine
erfolgreiche Metastasierung müssen die Tumorzellen mehrere aufeinanderfolgende
Einleitung
20
Schritte durchlaufen. Zunächst müssen die Tumorzellen in die Blut- oder
Lymphgefäße einwandern, an anderer Stelle das Gefäß wieder verlassen und dort
schließlich wieder proliferieren. Die Tumorzellen durchdringen dabei umgebendes
Gewebe und die extrazelluläre Matrix und müssen dazu unter anderem ihre
adhäsiven Eigenschaften ständig anpassen. Eine Möglichkeit die interzelluläre
Adhäsion
zu
modifizieren
ist
das
Ektodomänen-Shedding
von
Zelladhäsionsproteinen.
1.5.3
Lösliches E-Cadherin
Damsky et al. beschrieben zuerst ein 80kDa großes lösliches E-Cadherin-Fragment,
welches im Überstand einer Brustkrebszelllinie gefunden wurde (Damsky et al.
1983). Mittlerweile wurden mehrere Proteasen beschrieben, die in der Lage sind
E-Cadherin an der Zelloberfläche zu schneiden und so die 80 kDa große, lösliche
Form von E-Cadherin freizusetzen. Neben den Matrixmetalloproteasen MMP-3,
MMP-7, MMP-9 und MT1(membrane-type)-MMP können auch ADAM10 sowie
Kallikrein-7 und Plasmin E-Cadherin schneiden (Noë et al. 2001; de Wever et al.
2007; van Kilsdonk et al. 2010). Lösliches E-Cadherin kann in vitro die Streuung von
Karzinomzellen stimulieren und Zell-Zell-Kontakte auflösen (Symowicz et al. 2007; de
Wever et al. 2007).
Mehrere Arbeitsgruppen haben sE-Cadherin in Blut von Patienten verschiedener
Tumorentitäten nachgewiesen. Häufig wurde dabei eine Korrelation mit dem
Tumorstadium beschrieben (de Wever et al. 2007). Erhöhte Serumkonzentrationen
wurden auch bei entzündlichen Erkrankungen gefunden (Pittard et al. 1996).
Zwei Arbeiten beschreiben lösliches E-Cadherin im Serum von Patienten mit
kolorektalem Karzinom, kommen jedoch zu unterschiedlichen Schlußfolgerungen.
(Velikova et al. 1998; Wilmanns et al. 2004). Während Velikova et al. keinen
signifikanten Anstieg der sE-Cadherin-Serumlevel bei Patienten mit kolorektalem
Karzinom
finden,
schlagen
Tumorprogression vor.
Wilmanns
et
al.
sE-Cadherin
als
Marker
für
Einleitung
1.6
21
Ziele der Arbeit
In der vorliegenden Arbeit soll zum einen ein Beitrag geleistet werden, die
Mechanismen des Sheddings der beiden am stärksten exprimierten Cadherine im
Darm, E-Cadherin und Cadherin-17, besser zu verstehen. Zum anderen soll
untersucht werden, ob die löslichen Formen dieser Cadherine im Serum von
Karzinompatienten
vermehrt
vorkommen
und
damit
möglicherweise
als
diagnostische Serummarker dienen können.
Ein Verlust der E-Cadherin-Expression geht bei kolorektalen Karzinomen häufig mit
einem
Verlust
der
Smad4-Expression
einher.
Smad4
ist
bekannt
als
Tumorsuppressor, der beim Übergang zu invasiven und metastatischen Tumoren
inaktiviert
wird.
E-Cadherin
gilt
ebenfalls
als
Tumorsuppressor,
dessen
Funktionsverlust mit einem erhöhten invasiven und metastatischen Potential
einhergeht. Ektodomänen-Shedding ist ein möglicher Mechanismus um die Funktion
des Zelladhäsionsproteins E-Cadherin zu verändern. In vorangegangenen Arbeiten
konnte gezeigt werden, dass lösliches E-Cadherin im Sekretom von Smad4negativen Klonen eher reduziert zu sein scheint. Dieser Befund war überraschend,
da Smad4 als positiver Regulator der E-Cadherin-Expression charakterisiert wurde.
In dieser Arbeit sollte untersucht werden, welche Proteine am Smad4-abhängigen
Shedding von E-Cadherin beteiligt sind.
Lösliches E-Cadherin ist sehr abundant im Sekretom von Kolonkarzinomzelllinien.
Für einige Cadherine, wie auch sE-Cadherin, wurde beschrieben, dass die
Konzentration dieser löslichen Formen im Serum von Karzinompatienten erhöht sein
kann und damit möglicherweise diagnostische Relevanz besitzen kann. Die bisher
publizierten Daten zu löslichem E-Cadherin in Seren von Patienten mit kolorektalem
Karzinom sind widersprüchlich. In dieser Arbeit sollte geklärt werden, ob lösliches
E-Cadherin ein diagnostischer Marker sein könnte. Dazu wurde mit einem
kommerziell erhältlichen ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) die Menge
an sE-Cadherin in Serum von Patienten mit kolorektalem Karzinom und
verschiedenen Kontrollgruppen bestimmt.
Cadherin-17, ein Cadherin, dessen Expression sich physiologisch auf den Darm
beschränkt, ist ebenfalls in großen Mengen im Sekretom nachweisbar. Shedding von
Cadherin-17 ist bisher noch nicht beschrieben. Daher sollte hier nach Proteasen
gesucht werden, die am Shedding von Cadherin-17 beteiligt sind. Außerdem sollte
Einleitung
22
untersucht werden, ob die Freisetzung bei Patienten mit kolorektalem Karzinom
erhöht ist. Für sCadherin-17 musste dafür zunächst ein ELISA etabliert werden. In
der Arbeitsgruppe steht eine umfangreiche Serensammlung zur Verfügung. Aus
dieser wurde eine Auswahl an Patientenseren aus verschiedenen Tumorstadien in
den ELISAs gemessen.
Material und Methoden
2
Material und Methoden
2.1
Material
2.1.1
Software
23
Genesis
Life Sciences
Odyssey 2.1
Li-Cor Biosciences
GraphPad Prism 4
GraphPad Software
Microsoft Office 2007
Microsoft
GelPro
Media Cybernetics
Glomax
Turner Biosystems
Optiquant 3.0
Packard Instrument
2.1.2
Arbeitsgeräte
Analysewaage
Sartorius
Autoflow CO2 water-Jacketed Incubator
Nuair
Autoklav
H+P Labortechnik
Biofuge Pico
Heraeus Instruments
Casy Cell Counter
Schärfe System
Cyclone
Packard Bioscience
Elektrophoreseapparatur vor SDS-PAGE
Bio-Rad
Geltrockner
Biotec-Fischer
GloMax 96 Microplate Luminometer
Promega
Heizblock
UniEquio
Horizontale Elektrophoreseapparatur
Gibco BRL
Hybridisierungsflaschen
Schott
Hybridisierungsofen
UniEquip
KL2-Schüttler
Edmund Bühler
Megafuge 1.0R
Heraeus Instruments
Mikroskop Axiovert 25
Zeiss
Mikrowelle
Bosch
MultiLabel Tester
Hidex
Multipette
Eppendorf
Multiskan RC Plate Reader
Labsystems
Material und Methoden
24
NanoDrop 2000 Spektrometer
Thermo Scientific
Odyssey Infrarot-Imaging System
Li-Cor
Optima MAX-XP
Beckmann Coulter
PCR-Cycler Trio Thermoblock
Biometra
pH-Meter
WTW
Phosphorimager Screens
Packard Bioscience
Pipetten
Labsystems
Pipetus-akku
Hirschmann
SemiDry Blotter Pegasus
Phase
Spannungsgeber Elektrophoresis Power Supply
Consort
Spannungsgeber Elektrophoresis Power Supply
Pharmacia
SpeedVac SC110
Savant
Sterilbank
Nuair
Szintillisationszähler LB122
Berthold
Taumelschüttler
Heidolph
Thermomixer
Eppendorf
Ultrazentrifugenröhrchen Discovery 905E
Sorvall
UV-Kammer Multimage Light Cabinet
Alpha Innotech Corporation
Vortex Genie 2
Scientific Industries
Waage
Sartorius
Wasserbad
GFL
X-Cell Sure Lock Elekrophorese-Apparatur
Invitrogen
Zentrifuge 5415C
Eppendorf
Zentrifuge 5417C
Eppendorf
Zentrifuge 5417R
Eppendorf
Zentrifuge 905E
Sorvall
2.1.3
Gebrauchsmaterialen
Alle nicht einzeln aufgeführten Verbrauchsmarialien wurden von Nunc, Eppendorf,
Greiner Bio One, Costar, Falcon, Becton Dickinson, Braun oder Sarstedt bezogen.
Amicon Ultra Zentrifuge filters Ultracell 3k
Millipore
Chromaspin-Säulen
Clontech
MaxiSorp flat bottom 96 well Plate
Nunc
Nylonmembran Hybond N
Amersham
Material und Methoden
25
Porenmembraneinsatz 1µm BD Bioscience
BD Bioscience
PVDF-Membran Immobilion FL
Millipore
Sterilfilter (Porengröße 0,2 μm)
Pall Medical
Vivaspin 15R
Sartorius
Whatman-Papier
Schleicher & Schuell
2.1.4
Kitsysteme
DharmaFECT 1
Thermo Fisher Scientific
E-Cadherin-ELISA
Takara
High Capacity cDNA Reverse Transkription Kit
Applied Biosystems
Megaprime DNA Labeling System
Amersham
Proteome Lab Spin Column Ig-12 HC
Beckman Coulter
QIAex Gel Extraction Kit (150)
Qiagen
SuperSignal ELISA Femto Substrat
Thermo Fisher Scientific
2.1.5
Puffer und Lösungen
Alle Puffer und Lösungen wurden mit H2O dest. angesetzt
Anode-I-Puffer pH 10,4
30 mM Tris
20 % Isopropanol
Anode-II-Puffer pH 10,4
300 mM Tris
20 % Isopropanol
Carbonatpuffer
1,59 g/l Na2CO3
2,93 g/l NaHCO3
auf pH 9,6
50x Denhardt
5 g/l Ficoll (Typ 400)
5 g/l Polyvinylpyrrolidon (PVP 360K)
5 g/l BSA
Sterilfiltrieren
DEPC-H2O
0,1% (v/v) Diethylpyrocarbonat (0,1%)
Material und Methoden
Kathodenpuffer pH 9,4
26
25 mM Tris
40 mM 6-Aminohexansaure
20 % Isopropanol
10x Laufpuffer für die SDS-PAGE
250 mM Tris, pH 8,3
1,92 M Glycin
1% SDS
Lösung A für die Silberfärbung
50% (v/v) Ethanol
10% (v/v) Essigsäure
Lösung B für die Silberfärbung
30% (v/v) Ethanol
0,5 M Natriumacetat (wasserfrei)
0,5% Glutardialdehyd
0,1% Natriumthiosulfat
Lösung C für die Silberfärbung
0,01% (v/v) Formaldehyd (37%ig)
0,1% (w/v) Silbernitrat
Lösung D für die Silberfärbung
2,5% (w/v) Natriumcarbonat
Lösung E für die Silberfärbung
2,5% (w/v) Natriumcarbonat
0,01% (v/v) Formaldehyd (37%ig)
Lösung F für die Silberfärbung
0,05 M EDTA
Lysepuffer für die Proteinextraktion
0,5% NP-40
100 mM NaCl
25 mM Tris
1 mM EDTA
vor der Verwendung werden zu 10 ml:
400 µL Proteaseinhibitorcocktail (Roche)
200 µL PMSF
Material und Methoden
10x MOPS-Puffer
27
0,2 M MOPS
50 mM Natriumacetat
10 mM EDTA
10x PBS
80 g/l NaCl
2 g/l KCl
14,4 g/l Na2HPO4
2,4 g/l KH2PO4
auf pH 7,4
Proteinprobenpuffer 5x
250 mM Tris/HCl, pH 6,8
10% SDS
500 mM DTT
50% Glycerin
0,5% Bromphenolblau
RNA-Probenpuffer 5x
50% Glycerin
1mM EDTA
0,2% Bromphenolblau
in DEPC-H2O
Solution D
4 M Guadiniumthiocyanat
25 mM Natriumcitrat
0,5% N-Lauroyl-Sarcosine
7,2 μl/ml β-Mecaptoethanol
20x SSC-Puffer 3 M NaCl
0,3 M tri-Natriumcitrat
pH 7,0
20x SSC-Puffer
3 M NaCl
0,3 M tri-Natriumcitrat
Material und Methoden
50x TAE-Puffer
28
2 M Tris
1 M Essigsäure
50 mM Na2EDTA × 2 H2O
10x TBS
1,5 M NaCl
0,5 M Tris/HCl pH 7,5
2.1.6
Zellkulturmedien
Alle Materialien für die Zellkultur wurden, wenn nicht anders angegeben, von life
technologies (Gibco) bezogen.
D10-Medium
100 U/ml Penicillin
100 mg/ml Streptomycin
2 mM L-Glutamin
1 mM Natrium-Pyruvat
10 % (v/v) fötales Kälberserum (FCS)
in DMEM
serumfreies Medium
100 U/ml Penicillin
100 mg/ml Streptomycin
2 mM L-Glutamin
1 mM Natrium-Pyruvat
in DMEM
Medium für transduzierte Zellklone
100 U/ml Penicillin
100 mg/ml Streptomycin
2 mM L-Glutamin
1 mM Natrium-Pyruvat
10 % (v/v) fötales Kälberserum (FCS)
400 µg/ml Geneticin 418
in DMEM
Material und Methoden
LT97-Medium
29
100 U/ml Penicillin
100 mg/ml Streptomycin
2 mM L-Glutamin
1 mM Natrium-Pyruvat
2 % FCS
30 ng/ml EGF
10 µg/ml Insulin
5×10-9 M Selenit
2 mg/ml Transferrin
1 µg/ml Hydrocortison
2×10-10 M 3,3′,5-Triiodo-L-Thyronine Na-Salz
(Sigma-Aldrich)
In Hams„s F-12-Medium
Zu diesem Medium werden direkt vor
Verwendung 1/3 Volumen Fibroblastenkonditioniertes Medium gegeben
Einfriermedium
10 % DMSO
In FCS
2.1.7
Chemikalien
Alle verwendeten Chemikalien wurden, sofern nicht gesondert angegeben, von den
Firmen Applichem, J.T. Baker, Merck, Sigma-Aldrich und Roth bezogen.
1-Step Ultra TMB-ELISA
Pierce
α-32P-dATP (3000 Ci/mmol)
Hartmann Analytics
Batimastat
Tocris Bioscience
Bradford Reagenz
Bio-Rad
DNA Größenstandard 1kB Ladder
NEB
DNA-Polymerase I Klenow-Fragment
Invitrogen
dNTPs
Promega
Ethidiumbromid
Fluka
FCS
Biochrom
GI254023X
Freundlicherweise zur Verfügung
gestellt von Andreas Ludwig, Aachen
Material und Methoden
30
Odyssey Blocking Buffer
Li-Cor
Precision Plus Protein Standard Dual Color
Bio-Rad
Protease-Inhibitor Cocktail
Roche
Taq-Polymerase
NEB
Superscript II RnaseH-Reverse Transcriptase Invitrogen
2.1.8
siRNA-Sequenzen
Kallikrein-6 siRNA
ugacauacauggaauagca
ADAM10 siRNA
caucugacccuaaaccaaa
2.1.9
Verwendete humane Zelllinien
Name
Ursprung
Bezugsquelle
LT97
Kolonadenom
Zur Verfügung gestellt von
B. Marian, Wien
LS513
kolorektales Karzinom
ATCC
SW948
kolorektales Karzinom
ATCC
SW620
Lymphknotenmetastase
eines kolorektalen
Adenokarzinoms
ATCC
SW620 DTJ
Smad4-reexprimierende
Klone von SW620
Von M. Böckmann im
IMBL hergestellt
SW620 TJM
Kontrollklone mit Leervektor
von SW620
Von M. Böckmann im
IMBL hergestellt
HT-29
kolorektales Adenokarzinom
ATCC
HT-29 DTJ
Smad4-reexprimierende
Klone von HT-29
Von M. Böckmann im
IMBL hergestellt
HT-29 TJM
Kontrollklone mit Leervektor
von HT-29
Von M. Böckmann im
IMBL hergestellt
Material und Methoden
31
2.1.10 Antikörper
Primäre Antikörper:
Verdünnung
Antigen
Bezeichnung
Spezies
Hersteller
Cadherin-17
EP777
Maus
Zur Verfügung
gestellt von
R. Geßner, Leipzig
1:1000
Cadherin-17
intra
sc-6978
Ziege
Santa-Cruz
1:500
Cadherin-17
141713
Maus IgG1
R&D Systems
1:500
Cadherin-17
GW22817
Huhn IgY
Sigma-Aldrich
1:1000
E-Cadherin
13-1700
Maus
life technologies
1:2000
Transferrin
109-4134
Kaninchen
Rockland
1:20000
β-Tubulin
T4026
Maus
Sigma-Aldrich
1:2000
GAPDH
sc-20357
Ziege
polyklonal
Santa-Cruz
1:500
ADAM10
735-749
Kaninchen
polyklonal
Calbiochem
1:500
Kallikrein-6
sc-20624
Kaninchen
polyklonal
Santa-Cruz
1:500
Smad4
sc-7966
Maus IgG1
Santa-Cruz
1:500
Maus
Zur Verfügung
gestellt von Joan K.
Heath, Melbourne
1:10000
A33
Western Blot
Lamp3
sc-5275
Maus
Santa-Cruz
1:500
Synthenin
133-033
Kaninchen
Synaptic Systems
1:1000
Material und Methoden
32
Sekundäre Antikörper:
Antigen
Bezeichnung
Spezies
Hersteller
Verdünnung
anti-Ziege IgG
IRDye 800
Esel
Biomol
1:5000
anti-Kaninchen IgG
IRDye 800
Esel
Biomol
1:5000
anti-Maus IgG
IRDye 800
Esel
Biomol
1:5000
anti-Huhn IgG
IRDye 800
Ziege
Biomol
1:5000
anti-Kaninchen IgG
AF680
Ziege
life
technologies
1:5000
anti-Maus IgG
AF680
Ziege
life
technologies
1:5000
anti-Ziege IgG
AF680
Kaninchen
life
technologies
1:5000
2.1.11 Oligonukleotide
Cadherin-17 sense
cagatccccataccaacacc
Cadherin-17 antisense
cctcttgtgtctcccctcag
E-Cadherin sense
ggctcaagctatccttgcac
E-Cadherin antisense
cttgagccccagagtttgag
ADAM10 sense
caaatgggacacatgagacg
ADAM10 antisense
aacgaagaacagggaacacg
Kallikrein-6 sense
tctgaactcatccagccccttc
Kallikrein-6 antisense
ttggtgtagactcctggcttctcc
Smad4 sense
gtggcttctcgacaagttgg
Smad4 antisense
ctaggggagagcaggaagg
Material und Methoden
2.2
Methoden
2.2.1
Zellbiologische Methoden
2.2.1.1
33
Kultivierung von humanen Karzinomzelllinien
Alle verwendeten Zelllinien wurden bei 37 °C und unter 10 % CO 2 in einem
wasserdampfgesättigten Inkubator kultiviert. Die Kultivierung erfolgte in 10 ml des für
die Zelllinie spezifischen Mediums auf Zellkulturschalen mit einem Durchmesser von
10 cm. Die Konfluenz der Zellen wurde täglich im Mikroskop analysiert. Bei einer
Konfluenz von 80 – 90 % wurde das Medium abgesaugt und die Zellen wurden mit
10 ml PBS gewaschen. Anschließend wurden die Zellen mit 2 ml Trypsin/EDTALösung versetzt und für 5 - 10 Minuten bis zur Ablösung der Zellen im Brutschrank
inkubiert. Durch Zugabe von 8 ml D10-Medium wurde die Reaktion abgestoppt. Die
Zellen wurden anschließend suspendiert, in ein 15 ml Röhrchen überführt und bei
150 g pelletiert. Das Zellpellet wurde in frischem Medium resuspendiert und die
Zellen wurden in der gewünschten Konfluenz ausgesät. Wurden die Zellen nicht
direkt für Experimente benötigt, wurden sie üblicherweise mit einer Konfluenz von
10 % ausgesät.
2.2.1.2
Kultivierung der humanen Adenomzelllinie LT97
Die Zellen der Adenomzelllinie LT97 benötigen ein spezielles Medium und dürfen
beim Passagieren nicht vereinzelt werden. Die Adenomzelllinie LT97 wurde daher
mit 5 mM EDTA in PBS abgelöst. Nach 10 Minuten wurden die abgelösten
Zellaggregate durch die Zugabe von wenigen Tropfen Trypsin/EDTA-Lösung
aufgelöst. Ansonsten erfolgte die Handhabung wie bei den anderen Zelllinien. Die
Adenomzelllinie LT97 wurde stets mit einer Konfluenz von mindestens 25 %
ausgesät.
2.2.1.3
Auftauen und Einfrieren von humanen Karzinomzelllinien
Die humanen Karzinomzelllinien wurden für eine langfristige Konservierung in
flüssigem Stickstoff gelagert. Kurz vor der Verwendung wurden sie in einem 37 °C
warmen Wasserbad aufgetaut und anschließend in 10 ml 37 °C warmes D10Medium gegeben. Die Zellsuspension wurde für 5 Minuten bei 150 g zentrifugiert.
Anschließend wurde der Überstand abgesaugt und das Pellet in 10 ml des jeweiligen
Mediums resuspendiert.
Material und Methoden
34
Um die Zellen wieder einzufrieren, wurden sie wie für das Passagieren abgelöst und
pelletiert. Das Zellpellet wurde in 2 - 4 ml Einfriermedium aufgenommen, so dass
1 ml Einfriermedium einer Konfluenz von circa 25 % entspricht. Je 1 ml dieser
Zellsuspension wurde in Einfrierampullen bei -80 °C langsam eingefroren und am
nächsten Tag für die langfristige Konservierung in flüssigem Stickstoff eingelagert.
2.2.1.4
Zellzählung
Für die Bestimmung der Zellzahl wurden die Zellen wie beim Passagieren von der
Kulturschale abgelöst. Das Zellpellet wurde in 2 ml des jeweiligen Mediums
aufgenommen. Von dieser Zellsuspension wurden 50 µl in 10 ml CASYton-Lösung
gegeben und die Zellzahl mit dem CASY Cell Counter ermittelt. Da es für jede
Zelllinie ein spezifisches Messprogramm gibt, konnte gleichzeitig der Anteil toter
Zellen ermittelt werden.
2.2.1.5
Einsatz von Metalloproteaseinhibitoren
Die in dieser Arbeit eingesetzten Inhibitoren Batimastat und GI254023X sind
Hydroxamat-basierende Metalloproteaseinhibitoren (vgl. Abbildung 6). Während
Batimastat ein unspezifischer Inhibitor ist, inhibiert GI254023X spezifisch ADAM10
(Hundhausen et al. 2003). Der Inhibitor GI254023X wurde von GlaxoSmithKline
synthetisiert
und
uns
freundlicherweise
von
Prof.
Dr.
Andreas
Ludwig
(Universitätsklinikum Aachen) zur Verfügung gestellt.
Für Versuche mit den Inhibitoren wurden die Zellen auf Zellkulturschalen mit einem
Durchmesser von 6 cm ausgesät. Batimastat wurde in einer Konzentration von
20 µM und der spezifische ADAM10-Inhibitor GI254023X in einer Konzentration von
5 µM eingesetzt. Zu jeweils 3 ml serumfreien D10-Medium wurden die
entsprechenden Inhibitoren oder DMSO als Lösungsmittelkontrolle hinzugegeben.
Anschließend wurde das Medium auf die Zellen gegeben. Die Sekretom- und
Zelllysaternte erfolgte nach 40 Stunden.
Material und Methoden
35
Batimastat
GI254023X
Abbildung 6: Strukturen der in dieser Arbeit eingesetzten Metalloproteaseinhibitoren
2.2.1.6
Die
siRNA-vermittelter Knockdown
Knockdown-Experimente
wurden
mit
kommerziell
verfügbaren
siRNAs
(Dharmacon) durchgeführt. Die siRNAs wurden dabei nach Herstellerangaben über
eine transiente Transfektion in die Zellen gebracht. Als Kontrolle für die spezifischen
siRNAs wurde eine nicht kodierende Kontroll siRNA eingesetzt. Für die Experimente
mit siRNA wurden die Zellen auf Zellkulturschalen mit einem Durchmesser von 6 cm
ausgesät. Die Zellen wurden bis zu einer Konfluenz von circa 30% kultiviert. Am Tag
vor der Transfektion wurde ein Mediumwechsel durchgeführt, wobei die Zellen mit
ihrem Standardmedium ohne Antibiotika weiter kultiviert wurden. Am nächsten Tag
wurden 200 µl einer 2 µM siRNA-Lösung mit demselben Volumen an serum- und
antibiotikafreiem Medium vermischt. Als Transfektionsreagenz wurden 12 µl
DharmaFECT 1 pro Schale verwendet. Zu dem Transfektionsreagenz wurden 388 µl
serum- und antibiotikafreies Medium gegeben. Die beiden Lösungen wurden 5
Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend vermischt. Nach weiteren
20 Minuten Inkubation bei Raumtemperatur wurden 3,2 ml antibiotikafreies Medium
hinzugegeben. Die Zellen wurden für 48 Stunden mit diesem Transfektionsmedium
inkubiert. Anschließend wurde das Transfektionsmedium entfernt und die Zellen
wurden in serumfreiem Medium weiterkultiviert.
2.2.1.7
Kultivierung
von
humanen
Karzinomzellen
auf
wurden
auf
Porenmembraneinsätzen
Um
eine
polarisierte
Zell-Monolayer
zu
erhalten,
die
Zellen
Porenmembraneinsätze mit 1 µm Porengröße ausgesät und kultiviert. Die
Porenmembraneinsätze wurden in die Vertiefungen von 12-well-Zellkulturschalen
eingehängt. Unter konfluenten Bedingungen erhält man auf diese Weise zwei
getrennte Kompartimente. Das Medium im well enthält die Proteine, die basolateral
Material und Methoden
36
freigesetzt werden. Das Medium in dem Porenmembraneinsatz repräsentiert die
apikale Seite. Für diesen Versuch wurde die Adenomzelllinie LT97 verwendet, die in
der Lage ist, in vitro zu polarisieren (Leuhuber et al. 2006). Als Kontrolle wurde die
Kolonkarzinomzelllinie SW948 verwendet, die stark dreidimensional wächst und nicht
polarisiert. 5×105 Zellen wurden in einem Milliliter des jeweiligen Mediums auf den
Porenmembraneinsatz ausgesät. In das well wurden 1,5 Milliliter des jeweiligen
Mediums gegeben. Nachdem die Zellen auf dem Porenmembraneinsatz konfluent
geworden waren, wurden sie für zwei Tage serumfrei kultiviert. Anschließend wurden
die Medien der beiden Kompartimente gesammelt und getrennt analysiert.
2.2.1.8
Gewinnung von Sekretom
Die Zellen wurden bis zu einer Konfluenz von circa 60% in ihrem Standardmedium
kultiviert. Um die Serumbestandteile zu entfernen, wurden die Zellen dreimal mit
zusatzfreiem Medium gewaschen. Anschließend wurden 10 ml serumfreies Medium
hinzugegeben. Nach vier Stunden wurde dieses abgesaugt und durch frisches,
serumfreies Medium ersetzt. Nach zwei Tagen wurden die Überstände abgenommen
und 10 Minuten bei 200 g und 4 °C zentrifugiert, um abgelöste Zellen und größere
Zelltrümmer zu entfernen. Das Pellet wurde verworfen und die Überstände
sterilfiltriert (Porengröße 0,2 µm) und mit Proteaseinhibitoren (Endkonzentrationen:
7 nM Pepstatin A, 85 µg/ml PMSF, 16 µl/ml Protease-Inhibitor Cocktail) versetzt.
Durch Zentrifugal-Ultrafiltration wurden die Proben auf ein Volumen von 150 bis 200
µl aufkonzentriert (3000 g, 4 °C) und aliquotiert. Das Sekretom wurde bis zu seiner
Verwendung bei -80 °C gelagert.
2.2.2
2.2.2.1
Molekularbiologische Methoden
Exosomenpräparation
Für die Präparation der Exosomen wurden 70 ml des konditionierten Mediums der
Zellen
durch
Ultrafiltration
(Centricon
Plus-70,
100
kDa)
aufkonzentriert.
Anschließend erfolgte eine Ultrazentrifugation bei 3500 g und 4 °C. Der Überstand
wurde abgenommen und für weitere Analysen aufbewahrt. Die Pellets wurden in
PBS gelöst. Die so erhaltenen Exosomenpräparationen wurden bei -80 °C gelagert.
2.2.2.2
Proteinextraktion aus humanen Karzinomzelllinien
Zur Herstellung von Zelllysaten wurden die Zellen bis zu einer Konfluenz von circa
80% kultiviert. Anschließend wurde das Medium abgesaugt und die Zellen zweimal
Material und Methoden
37
mit kaltem PBS gewaschen. Die Kulturschale wurde sorgfältig durch Klopfen
getrocknet und anschließend auf Eis mit 500 µl kaltem Lysepuffer versetzt. Das
Zellsuspension wurde mit einem Gummiwischer vom der Schale gekratzt und
anschließend in ein Eppendorf Gefäß überführt. Um eine vollständige Lyse zu
gewährleisten, wurde die Suspension 30 Minuten bei 4 °C im Überkopfschüttler
inkubiert und anschließend 10 Minuten bei 17.900 g und 4 °C zentrifugiert. Die
pelletierten Zelltrümmer wurden verworfen. Der Überstand wurde abgenommen,
aliquotiert und bei -80 °C gelagert.
2.2.2.3
Proteinextraktion aus kryokonserviertem Gewebe
Die Gewebeproben wurden von der Medizinischen Klinik Knappschaftskrankenhaus
der Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum bezogen. Von allen Patienten
wurde vor der Operation ein Übereignungsvertrag unterzeichnet. Tumorgewebe und
angrenzendes Normalgewebe wurden direkt nach der Resektion in flüssigem
Stickstoff eingefroren und bei -80 °C gelagert. Circa 500 mg gefrorenes Gewebe
wurden in einem mit flüssigem Stickstoff gekühlten Mörser zu einem feinen Pulver
zermahlen. Das Pulver wurde in ein Eppendorf Gefäß überführt, mit Lysepuffer
versetzt, gründlich durchmischt und 30 Minuten bei 4 °C im Überkopfschüttler
inkubiert. Bei 17.900 g und 4 °C wurden nicht-lösliche Bestandteile abzentrifugiert.
Diese wurden verworfen. Der Überstand wurde abgenommen, aliqoutiert und bei
-80 °C gelagert.
2.2.2.4
Depletion von Serumproben
Vor der Analyse von Serumproben im Western Blot wurden die zwölf häufigsten
Serumproteine
α2-Macroglobulin,
depletiert
(Albumin,
IgM,
α1-Antitrypsin,
IgG,
Transferrin,
Haptoglobin,
Fibrinogen,
IgA,
α1-saures-Glykoprotein,
Apolipoprotein A-I und Apolipoprotein A-II). Diese 12 Proteine machen über 90% der
Masse des Serumproteoms aus. Daher kann durch ihre Depletion eine Anreicherung
der verbleibenden Proteine um den Faktor 10 erreicht werden. Für die Depletion
wurde das Proteome Lab IgY-12 Spin Column Kit (Beckmann Coulter) nach
Herstellerangaben verwendet. Dieses Kit basiert darauf, dass die 12 häufigsten
Serumproteine jeweils an spezifische, an beads gekoppelte IgY-Antikörper binden
und somit auf der Säule zurückgehalten werden. Die depletierte Probe wird vor ihrer
Verwendung
durch
Zentrifugal-Ultrafiltration
Konzentratoren aufkonzentriert
in
Centricon
Ultracel
YM3-
Material und Methoden
2.2.2.5
38
Proteinkonzentrationsbestimmung nach Bradford
Die Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgte nach der Methode von Bradford
(Bradford 1976), die auf der Bindung des Farbstoffes Brilliant Blue G250 an Proteine
in saurer Lösung basiert. Durch die Bindung verschiebt sich das Extinktionsmaximum
von einer Wellenlänge von 465 nm zu 595 nm. Die Extinktion der Lösung bei 595 nm
ist direkt proportional zur Proteinkonzentration, die so über eine Eichreihe mit
bekannter Proteinkonzentration bestimmt werden kann. Für die Eichreihe wurde BSA
(Bovines Serumalbumin) verwendet Die Proteinbestimmung erfolgte mit einer
Dreifachmessung in Mikrotiterplatten. Aliquots der zu bestimmenden Probe wurden in
H2O dest. zu einem Gesamtvolumen von 160 µl verdünnt. Zu den Proben wurden 40
ml Bradford Reagenz gegeben und sorgfältig durchmischt. Anschließend wurde die
Extinktion im Fotometer bei einer Wellenlänge von 595 nm bestimmt. Die
Auswertung erfolgte mit dem Programm Genesis.
2.2.2.6
Die
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Proteinproben
wurden
mit
der
diskontinuierlichen
SDS-Polyacrylamid-
Gelelektrophorese aufgetrennt. Zur Vorbereitung auf die Gelelektrophorese wurden
die Proben mit 5-fach konzentriertem Probenpuffer versetzt und für 5 Minuten bei
95 °C im Heizblock denaturiert. Je nach Größe der Proteine, die analysiert werden
sollten, wurden 8 bis 12-prozentige Trenngele verwendet. Das Trenngel wurde zuerst
angesetzt, in die Apparatur gegossen und für 30 Minuten mit 500 µl Isopropanol
überschichtet. Nachdem das Trenngel auspolymerisiert war, wurde das Isopropanol
entfernt und das Sammelgel eingefüllt. Der Ansatz für je vier Gele ist in Tabelle 2
dargestellt.
Material und Methoden
39
Tabelle 2: Zusammensetzung für die Polyacrylamid Gele
Trenngel
Trenngel
Trenngel
Sammelgel
12%
10%
8%
5%
Wasser dest. [ml]
6,6
8
9,4
2,825
1,5 M Tris-Puffer pH 8,8 [ml]
5
5
5
-
0,5 M Tris-Puffer pH 6,8 [ml]
-
-
-
1,25
Acrylamid/Bisacrylamid [ml]
8,1
6,7
5,4
0,825
SDS (10%) [µl]
200
200
200
50
TEMED [µl]
30
30
30
75
APS (10%) [µl]
300
300
300
75
Die aufbereiteten Proteinproben wurden in die Geltaschen eingefüllt. Für den
Größenabgleich wurde der Precision Plus Protein Dual Color-Marker (Bio-Rad)
aufgetragen. Für den Gellauf wurde 1x Laufpuffer verwendet. Die Gelelektrophorese
erfolgte für 20 Minuten bei 55 V und anschließend bei 120 V für circa 80 Minuten bis
zu der gewünschten Auftrennung. Für einige Analysen wurden 3-8%ige Tris-AcetatGele (Invitrogen) verwendet. Der Gellauf erfolgte für 1,5 Stunden bei 150 V in TrisAcetat-Laufpuffer (Invitrogen).
2.2.2.7
Western Blot
Für die weitere Detektion der Proteine über Immundetektion wurden die Proteine
nach der SDS-Gelelektrophorese mit einem Semi-Dry Blot System auf eine PVDFMembran übertragen. Die Membran wurde in Isopropanol aktiviert und dann in
Anode-I-Puffer äquilibriert. Für den Aufbau des Blots wurden zwei Kathoden-Puffergetränkte Whatman-Papiere auf die Kathodenplatte der Blotkammer aufgelegt.
Darauf wurden das Gel, die äquilibrierte PVDF-Membran und je ein dickes mit
Anode-I- bzw. Anode-II-Puffer getränktes Whatman-Papier in dieser Reihenfolge
luftblasenfrei aufgelegt. Abschließend wurde die Anode der Blotkammer mit Anode-IIPuffer befeuchtet, die Kammer geschlossen und mit einer gefüllten 1 l Flasche
beschwert. Der Proteintransfer erfolgte bei einer Stromstärke von 2 mA pro cm2 Gel
für 45 bis 60 Minuten. Nach dem Transfer wurde die Membran kurz in 1x PBS-Puffer
gespült und konnte anschließend für die Immundetektion verwendet werden.
Material und Methoden
2.2.2.8
40
Immundetektion
Vor der Immundetektion wurde die Membran in circa 20 ml Blockierungspuffer (5 %
Magermilchpulver in PBS) über Nacht bei 4 °C inkubiert, um unspezifische
Bindungen der Antikörper an die Membran bei der nachfolgenden Immundetektion zu
verhindern. Anschließend wurde die Membran in PBS gespült und mit dem in einem
Gemisch aus PBS und Odyssey® Blocking Buffer (1:1) verdünnten Primärantikörper
inkubiert. Die Inkubation erfolgt entweder über Nacht bei 4 °C oder für zwei Stunden
bei Raumtemperatur. Nach der Inkubationszeit wurde die Membran dreimal für 15
Minuten mit PBS-T (PBS mit 0,05% Tween 20) gewaschen und anschließend für
eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln mit einem fluoreszenzmarkierten
Sekundärantikörper (1:20.000 in PBS) inkubiert. Anschließend wurde die Membran
erneut dreimal für 15 Minuten mit PBST gewaschen.
Die Detektion der Signale erfolgte mit dem Odyssey® Infrarotscanner der Firma
Li-Cor. Damit können Signale bei zwei unterschiedlichen Wellenlängen (700 nm und
800 nm) detektiert werden. Durch die Verwendung von zwei unterschiedlichen
Sekundärantikörpern können daher zwei Proteine auf derselben Membran zeitgleich
detektiert werden, sofern die Primärantikörper aus unterschiedlichen Spezies
stammen. Die zugehörige Software ermöglicht die Quantifizierung der gemessenen
Signalintensitäten, so dass sich die Proteinmengen auf einer Western Blot-Membran
relativ zueinander bestimmen lassen. Um die Messwerte zu normalisieren, wurden
die Intensitäten von Proteinen im Sekretom mit Transferrin beziehungsweise mit
Tubulin oder GAPDH im Lysat abgeglichen.
2.2.2.9
Silberfärbung nach Heukeshoven
Die Silberfärbung nach Heukeshoven (Heukeshoven und Dernick 1988) ist eine sehr
sensitive Methode zur Entfernung von Proteinen. Sie basiert auf der selektiven
Reduktion der von Proteinen komplexierten Silberionen durch Formaldehyd. Die
dabei entstehenden Silberkeime katalysieren die weitere Reduktion von Silberionen
während
der
Entwicklung
des
Gels.
Die
Gele
wurden
unmittelbar
nach
Gelelektrophorese beziehungsweise nach dem Western Blot in Fixierlösung A
gegeben und mindestens eine Stunde inkubiert. Anschließend wurden sie zwei
Stunden in Lösung B inkubiert, für zweimal 20 Minuten mit H 20 dest gewaschen und
für 30 Minuten in der silbernitrathaltigen Lösung C inkubiert. Nach einem
einminütigen
Waschschritt
mit
Lösung
D
wurden
die
Gele
mit
der
Material und Methoden
41
formaldehydhaltigen Entwicklungslösung E bis zur gewünschten Färbung entwickelt.
Durch Inkubation in Lösung F für mindestens 20 Minuten wurde die Entwicklung
gestoppt. Anschließend wurden die Gele in destilliertem Wasser gelagert. Für die
langfristige Aufbewahrung wurden die Gele auf einem Geltrockner in Cellophan bei
80 °C und Vakuum für ca. 60 Minuten getrocknet.
2.2.2.10 ELISA für sE-Cadherin
Die für den sE-Cadherin-ELISA verwendeten Seren waren von Patienten der
Medizinischen Klinik des Knappschaftskrankenhauses der Universitätsklinik Bochum
gewonnen worden. Die Serumsammlung war von Salwa Kübler im Rahmen ihrer
Doktorarbeit aufgebaut worden (Kübler). Die klinischen Daten der Patienten sind in
einer Access-Datenbank zusammengefasst. Die Seren sind auf -80 °C in Aliquots
gelagert. Für den ELISA wurde jeweils ein frisches Aliquot direkt vor der Verwendung
aufgetaut.
Für die Bestimmung von löslichem E-Cadherin in Serum wurde ein kommerziell
erhältlicher Sandwich-ELISA nach Herstellerangaben verwendet. Die Proben wurden
dabei in Duplikaten gemessen. Die Serumproben wurden zehnfach in dem Sample
Diluent
verdünnt.
100
µl
dieser
zehnprozentigen
Serumproben
oder
der
Standardlösung wurden in je ein well gegeben und zwei Stunden bei 37 °C inkubiert.
Anschließend wurde dreimal mit ca. 400 µl Waschpuffer (1x TBS mit 0,1% Tween 20
und 5 mM CaCl2, pH 7,6) gewaschen und die Platte durch Klopfen getrocknet. 100 µl
der Lösung des Konjugats aus Sekundärantikörper und Meerrettichperoxidase
wurden für eine Stunde bei 37 °C inkubiert. Nach vier Waschschritten wurden 100 µl
Substrat hinzugegeben und für fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die
Reaktion wurde durch die Zugabe von 100 µl 1N H2SO4 gestoppt. Anschließend
wurde die Absorption bei 450 nm bestimmt. Die Auswertung erfolgte mit dem
Programm Genesis.
2.2.2.11 Entwicklung eines ELISA für Cadherin-17
Der ELISA für Cadherin-17 wurde als Sandwich ELISA entwickelt. Dabei wird eine
96-well-Platte mit einem Fänger-Antikörper beschichtet. Dieser bindet das Antigen,
an das anschließend ein Detektionsantikörper bindet. Dieser wiederum wird durch
einen HRP-gekoppelt Antikörper gebunden, der dann eine Farbreaktion katalysiert.
Das dabei entstehende Signal ist proportional zur Menge an gebundenem Antigen.
Um die optimale Konzentration des Fänger- und des Detektionsantikörpers zu
Material und Methoden
bestimmen,
wurden
42
verschiedene
Verdünnungen
der
Antikörper
bei
unterschiedlichen Sekretomkonzentrationen vergleichend überprüft. Abbildung 7
zeigt ein typisches Schema, das bei der Entwicklung des ELISAs eingesetzt wurde.
Der ELISA wurde zunächst auf der Basis von Cadherin-17-positivem Sekretom im
Vergleich zu Cadherin-17-negativem Sekretom entwickelt. Als Cadherin-17-positives
Sekretom wurde Sekretom der Zelllinien LS513, SW948 und LT97 eingesetzt.
Negative Sekretome wurden von den Zelllinien SW620 und HT-29 gewonnen.
200 µg/ml Sekretom 50 µg/ml Sekretom 12,5 µg/ml Sekretom
Detektions Detektions Detektions Detektions Detektions Detektions
antikörper antikörper antikörper antikörper antikörper antikörper
1:1000
1:5000
1:1000
1:5000
1:1000
1:5000
Cadherin-17 positives
Sekretom
Cadherin-17 negatives
Sekretom
Cadherin-17 positives
Sekretom
Cadherin-17 negatives
Sekretom
FängerAntikörper
1:800
FängerAntikörper
1:200
Abbildung 7: Exemplarisches Pipettierschema für die Entwicklung des Cadherin-17-ELISAs
zur Bestimmung der Detektions- und Fängerantikörperkonzentrationen.
Im nächsten Schritt wurden Sekretome in Serum unterschiedlicher Konzentrationen
verdünnt. Auch hierbei wurde Cadherin-17-positives mit Cadherin-17-negativem
Sekretom verglichen und getestet, bei welcher Serumkonzentration der Nachweis die
größte
Sensitivität
Verdünnungen
der
zeigt.
Außerdem
Proben
wurden
verwendet,
um
verschiedene
Puffer
herauszufinden,
unter
für
die
welchen
Pufferbedingungen die Matrixeffekte am geringsten sind. Zusätzlich wurden die
Inkubationstemperaturen
(4
°C,
Raumtemperatur
und
37
°C)
und
die
Inkubationszeiten (1, 2, 4 und 16 Stunden) der Proben variiert. Um unspezifische
Bindungen zu minimieren, wurden unterschiedliche Blockierungsreagenzien (BSA,
Magermilchpulver, Odyssey Blocking Buffer (Li-Cor) und Gelatine) in verschiedenen
Konzentrationen in PBS verdünnt und getestet. Die jeweiligen Blockierungslösungen
wurden
ohne
Detergenz
oder
mit
0,1
%
Tween
eingesetzt.
Bei
allen
Optimierungsschritten wurden auch jeweils die Negativkontrollen (ohne FängerAntikörper, Analyt, Detektionsantikörper oder HRP-Antikörper) überprüft. Als Substrat
war zunächst 1-Step Ultra TMB-ELISA Substrate (Thermo Fisher Scientific) nach
Herstellerangaben verwendet worden. Dazu wurde eine klare ELISA-Platte
verwendet und die Absorption bei einer Wellenlänge von 450 nm im Fotometer
Material und Methoden
43
gemessen. Für die Messung der Seren wurde das SuperSignal ELISA Femto
Maximum Sensitivity Substrat (Thermo Fisher Scientific) verwendet. Dieses Substrat
emittiert nach der durch HRP katalysierten Reaktion Licht. Dieser Vorgang wird als
Chemilumineszenz bezeichnet und ermöglicht einen sensitiveren Nachweis.
2.2.2.12 ELISA für Cadherin-17
Der ELISA wurde in weißen MaxiSorp® flat-bottom 96 well-Platten (Nunc)
durchgeführt. Diese sind nach Herstellerangaben für Antikörperbeschichtungen
besonders geeignet. Als Fänger-Antikörper wurde der anti-Cadherin-17-Antikörper
EP777
(Reinhard
Geßner,
Leipzig)
verwendet.
Dieser
wurde
1:100
in
Carbonat/Bicarbonatpuffer verdünnt. Jeweils 100 µl dieser Verdünnung wurden mit
einer Mehrkanalpipettte in jedes well gegeben und für 16 Stunden bei 4 °C auf einem
Taumelschüttler inkubiert. Die ELISA-Platte wurde dazu mit Parafilm verschlossen.
Anschließend wurde dreimal mit PBST (0,1 % Tween) gespült. Dazu wurde jedes
well
mit
einer
Spritzflasche
ausgespült,
anschließend
wurde
die
Platte
ausgeschlagen und nach dem letzten Waschschritt kurz zentrifugiert, um den
restlichen Puffer komplett zu entfernen. Bei allen weiteren Schritten erfolgten die
Inkubationen bei Raumtemperatur auf einem Taumelschüttler. Als Blockierungspuffer
wurden 350 µl 10 % Magermilchpulver in PBST (0,1% Tween) pro well für 2 Stunden
inkubiert. Anschließend wurde dreimal wie oben beschrieben gewaschen. Die
Serumproben wurden 1:10 in 1% Chaps-PBS verdünnt. In jedes well wurden 100 µl
dieser Probe gegeben und für zwei Stunden inkubiert. Nach drei weiteren
Waschschritten wurden jeweils 100 µl der Verdünnung des Zweitantikörpers (antiCadherin-17 IgY, Sigma-Aldrich; 1:1000 in PBST) hinzugegeben. Dieser wurde für
eine
Stunde
inkubiert.
Anschließend
wurde
viermal
gewaschen
und
ein
präadsorbierter, HRP-gekoppelter anti-IgY-Antikörper (Jackson ImmunoResearch,
1:50000 in PBS) für eine Stunde inkubiert. Nach weiteren vier Waschschritten
wurden 50 µl der Substratlösung in jedes well gegeben. Als Substrat wurde das
SuperSignal ELISA Femto Maximum Sensitivity Substrat (Thermo Scientific)
verwendet. Die ELISA-Platte wurde für eine Minute geschüttelt und anschließend im
Luminometer gemessen.
Material und Methoden
44
2.2.2.13 Statistische Auswertung
Als statistischer Test zur Überprüfung der Signifikanz wurde der Mann-Whitney-UTest verwendet, da dieser auch bei nicht-normalverteilten Daten angewendet werden
darf (Lorenz 1992).
Korrelationen
wurden
mit
Spearmans
Rangkorrelationskoeffizienten-Methode
bestimmt. Alle statistischen Berechnungen und Auswertungen wurden mit dem
Programm Graph-Pad Prism 4 (GraphPad Software) durchgeführt.
2.2.2.14 RNA-Präparation
RNA wurde mithilfe der Phenol-Chloroform-Präzipitation isoliert. Dazu wurden
kultivierte Zellen bei einer Konfluenz von 60 bis 90 % mit 2 ml Solution D abgelöst
und lysiert. Das Lysat wurde in ein 15 ml Röhrchen überführt. Dem Lysat wurden
anschließend nacheinander 200 µl 2M Natriumacetat, 2 ml H 2O-gesättigtes Phenol
und 400 µl Chloroform Isoamylalkohol zugegeben. Nach jeder Zugabe wurde
gründlich, aber vorsichtig gemischt. Die Suspension wurde 15 Minuten auf Eis
gestellt und anschließend bei 4 °C und 2500 g für 20 Minuten zentrifugiert. Bei
Raumtemperatur kommt es danach zu einer Phasentrennung, wobei die obere,
wässrige Phase die RNA enthält. Diese Phase wurde in ein frisches 15 ml Röhrchen
überführt und zur Präzipitation der RNA mit demselben Volumen Isopropanol
versetzt. Nach einer einstündigen Inkubation bei -20 °C wurde wieder 20 Minuten bei
4 °C und 2500 g zentrifugiert. Der Überstand wurde vorsichtig abgesaugt, das
Sediment in 500 µl Solution D gelöst und in ein 1,5 ml Eppendorf Reaktionsgefäß
überführt. Erneut wurde dasselbe Volumen Isopropanol hinzugeben und eine Stunde
bei -20° inkubiert. Nach einer zehnminütigen Zentrifugation bei 4 °C und 20.000 g
wurde der Überstand vorsichtig abgenommen. Das Pellet wurde in 400 µl DEPCH2O gelöst, mit 40 µl 3M Natriumacetat und 800 µl Ethanol versetzt und 10 Minuten
bei 4 °C und 20.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde erneut abgesaugt, das
Pellet in 70 µl DEPC- H2O gelöst, 5 Minuten auf 65 °C erwärmt und dann auf Eis
gestellt. Die Konzentrationsbestimmung erfolgte mit dem Nano Drop 2000 (Thermo
Fischer). Für die langfristige Lagerung wurde die RNA auf -80 °C eingefroren.
2.2.2.15 Agarose-Gelelektrophorese von RNA
Die Auftrennung der RNA erfolgte über Gelelektrophorese in 1%igen Agarosegelen.
Dabei wird die negativ geladene RNA nach ihrem Molekulargewicht aufgetrennt. Zur
Material und Methoden
45
Herstellung eines 1%igen denaturierenden Agarose-Gels wurde 1 g Agarose in 87,5
ml DEPC- H2O gegeben und in der Mikrowelle gelöst. Nach Abkühlen der Lösung auf
circa 60 °C wurden 2,5 ml Formaldehyd und 10 ml 10x MOPS-Puffer hinzugegeben.
Anschließend wurde die Lösung in ein horizontales Gelektrophorese-System
gegossen. 6 µg der mRNA wurden mit einer Lösung aus 5 µl Formamid, 2 µl
Formaldehyd und 1 µl 10x MOPS-Puffer 10 Minuten bei 65 °C inkubiert.
Anschließend wurden 0,7 µl einer 4%igen Ethidiumbromid-Lösung und 1 µl RNA
Ladepuffer zu jeder Probe hinzugegeben. Als Laufpuffer wurde 1x MOPS verwendet.
Der Gellauf erfolgte für 90 Minuten bei 75 V. Anschließend wurde das Gel zweimal in
DEPC- H2O gespült und unter Bestrahlung mit UV-Licht fotografiert. Über die Banden
der 18S- und 28S-rRNA wurde die gleichmäßige Beladung der RNA kontrolliert.
2.2.2.16 Northern Blot
Der Transfer der in einem Agarosegel aufgetrennten RNA auf eine feste Membran
wird als Northern Blot bezeichnet. In dieser Arbeit wurde die RNA mit Hilfe des
Kapillarblot-Verfahrens auf eine Nylonmembran übertragen. Das Agarosegel und die
Nylonmembran wurden dazu zunächst in 20x SSC-Puffer für 20 Minuten äquilibriert.
Für den Aufbau des Blots wurde eine Glasplatte auf eine mit 20x SSC-Puffer gefüllte
Schale gelegt. Auf diese Platte wurde ein großes Whatman-Papier gelegt, so dass
beide Enden des Papieres in die Schale mit dem 20x SSC-Puffer eintauchen. Auf
dieses Papier wurden von unten nach oben das Gel, die Nylonmembran, weitere fünf
Whatman-Papiere, ein Stapel Papierhandtücher und ein Gewicht zum Beschweren
gelegt. Der Blot erfolgte über Nacht bei Raumtemperatur. Die RNA-Moleküle werden
dabei durch Kapillarkräfte auf die Membran übertragen. Anschließend wurde die
RNA durch Bestrahlung mit UV-Licht fest an die Nylonmembran gebunden. Die
Membran wurde 5 Minuten in 2x SSC-Puffer gewaschen und konnte anschließend
für die Hybridisierung verwendet werden.
2.2.2.17 cDNA-Synthese
Zur Herstellung von cDNA-Sonden für die Hybridisierung von Northern Blots wurde
zunächst eine cDNA-Synthese aus Gesamt-RNA durchgeführt. Dazu wurden 4 µl
eines 50µM Oligo-dT-Primers mit 4 µl eines 10 mM dNTP-Mixes und 20 µg der
gewünschten mRNA versetzt und mit H2O dest. auf 52 µl aufgefüllt. Die Mischung
wurde 5 Minuten bei 65 °C im Heizblock inkubiert und anschließend auf Eis
abgekühlt. 16 µl des 5-fach konzentrierten Firststrand Buffers und 8 µl 0,1 M DTT
Material und Methoden
46
wurden hinzugegeben und gemischt. Nach 2 Minuten bei 42 °C wurde die Reverse
Transkriptase SuperScript II RNase H- (Invitrogen) hinzugegeben. Nach weiteren 50
Minuten bei 42 °C wurde die Lösung noch für 15 Minuten bei 72 °C inkubiert,
anschließend auf Eis abgekühlt und bei -20 °C gelagert. Die Konzentration der cDNA
wurde anschließend mit dem Nano Drop 2000 (Thermo Fischer) bestimmt.
2.2.2.18 Herstellung von cDNA-Sonden
Für die Hybridisierung des Northern Blots wurden cDNA-Sonden mit einer Länge von
200 bis 400 Nukleotide verwendet. Für die Applikationen dieser Sonden wurden
Primerpaare mit jeweils 20 Nukleotiden verwendet. Mithilfe des Programms Primer3
(http://frodo.wi.mit.edu/primer3/) wurden Primer ausgewählt, die einen G/C-Gehalt
von circa 50%, ähnliche Schmelzpunkte im Bereich von 60 °C und eine GC-Klammer
am 3„-Ende aufweisen. Die Spezifität der Primer wurde im Anschluss durch das
Programm Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) durch einen Abgleich mit der
humanen genomischen Sequenz überprüft.
Die so ausgewählten Primer Paare wurden anschließend für die Herstellung der
spezifischen DNA-Sonde eingesetzt. Der dafür verwendete PCR-Ansatz ist in Tabelle
3 dargestellt, das zugehörige PCR Programm in Tabelle 4.
Tabelle 3: PCR-Ansatz für die Herstellung von cDNA-Sonden
10-fach PCR-Puffer
50 mM MgCl2
5 µl
1,5 µl
dNTP-Mix (jeweils 10 mM)
1 µl
5‟ genspezifischer Primer (10 µM)
1 µl
3‟ genspezifischer Primer (10 µM)
1 µl
cDNA (aus 2.2.2.17)
2 µl
Taq-DNA Polymerase 10 (U/µl)
0,4 µl
H2O dest.
38,1 µl
Material und Methoden
47
Tabelle 4: PCR-Programm für die Herstellung von cDNA-Sonden
1
94 °C
1 Minute
2
45 °C
1 Minute
3
72 °C
1 Minute
4
94 °C
30 Sekunden
5
35x zu Schritt 2
6
45 °C
3 Minuten
7
72 °C
10 Minuten
8
4 °C
∞
2.2.2.19 Gelelution der cDNA-Sonden
Zur Aufreinigung der cDNA-Sonde wurde der jeweilige PCR Ansatz mit 1x DNAProbenpuffer versetzt und in einem 2%igen Agarosegel aufgetrennt. Zur Herstellung
des Agarosegels wurden 2 g Agarose in 100 ml 1x TAE-Puffer bis zur vollständigen
Auflösung in der Mikrowelle erhitzt. Nach Abkühlen der Agaroselösung auf 60 °C
wurden 5 µl Ethidiumbromid hinzugegeben und die Lösung in eine horizontale
Gelkammer gegossen. Für die präparative Gelelektrophorese wurden die 50 µl der
PCR Ansätze aus 2.2.2.18 mit 12 µl DNA-Probenpuffer versetzt. Die Elektrophorese
erfolgte in 1x TAE-Puffer bei Raumtemperatur bis zur gewünschten Auftrennung. Die
spezifischen
Produktbanden
wurden
unter
UV
Licht
mit
einem
Skalpell
ausgeschnitten und in ein Eppendorfgefäß überführt. Die Gelelution der DNA erfolgte
mit Hilfe des QIAEX II Gel Extraktion Kit (Qiagen). Dazu wurde das ausgeschnittene
Gelstückchen gewogen und mit 10 µl QIAEX II Lösung pro 100 µg Gel versetzt. Die
weitere Extraktion erfolgte nach Herstellerangaben. Von dem Eluat wurde 1 µl in
einem 2%iges Agarosegel aufgetrennt, um die Fragmentgröße und die Konzentration
der Sonde zu bestimmen. Die Konzentrationsbestimmung erfolgte durch die
Quantifizierung von Markerbanden mit bekannter DNA-Menge mit dem Programm
GelPro.
2.2.2.20 Herstellung radioaktiv markierter cDNA-Sonden
In dieser Arbeit wurden die mittels Northern Blot auf eine Nylonmembran
aufgebrachten mRNA Transkriptase mithilfe von
32
P-markierten DNA-Sonden
Material und Methoden
48
radioaktiv nachgewiesen. Die Herstellung der radioaktiv markierten Sonde erfolgte
mit dem Megaprime DNA Labeling System (Amersham). Für die Markierungsreaktion
wurden 25 ng der jeweiligen DNA Sonde in 8 µl DEPC- H2O eingesetzt. Die Sonde
wurde mit 2,5 µl einer Primer-Lösung aus zufälligen Hexanukleotiden und 2,5 µl
High-TE-Puffer für 5 Minuten aufgekocht und anschließend auf Raumtemperatur
abgekühlt. Zu dem abgekühlten Mix wurden die unmarkierten Nukleotide (dCTP,
dGTP, dTTP, je 2 µl), der Reaktionspuffer (2,5 µl), das Klenow-Enzym (1 µl) und 2,5
µl [α32P]-dATP (3000 mCi/ mmol) hinzugegeben. Die Markierungsreaktion erfolgte für
30 Minuten bei 37 °C im Heizblock und wurde anschließend durch die Zugabe von
2,5 µl EDTA gestoppt. Die radioaktiv markierte Sonde wurde durch Gelfiltration in
Chromaspin-Säulen (Clontech) durch eine fünfminütige Zentrifugation bei 700 g
aufgereinigt. 1 µl der Sonde wurde mit 200 µl H2O versetzt, um die spezifische
Aktivität der markierten Sonde in einem Szintillisationszähler zu bestimmen. Die
übrige Sonde wurde 5 Minuten aufgekocht, auf Eis abgekühlt und für die
Hybridisierung verwendet.
2.2.2.21 Northern Blot Hybridisierung
Vor der Hybridisierung der mRNA mit der radioaktiv markierten DNA Sonde wurde
die
Nylonmembran
mit
einer
Vorhybridisierungslösung
inkubiert.
Die
Vorhybridisierung verhindert bei der anschließenden Hybridisierung die unspezifische
Bindung zwischen Sonde und Nylonmembran. Die Northern Blots wurden dazu mit
der RNA-Seite nach innen in eine Hybridisierungsflasche gegeben und für 1,5
Stunden bei 50 °C mit 10 ml der Vorhybridisierungslösung inkubiert. Der Ansatz für
die Vorhybridisierungslösung ist in Tabelle 5 dargestellt. Die Heringsperma-DNA
wurde vor der Verwendung für 5 Minuten aufgekocht und anschließend auf Eis
abgekühlt.
Material und Methoden
49
Tabelle 5: Ansatz für die Vorhybridisierungslösung
Formamid
5,5 ml
50x Denhardt
1 ml
50x Dextransulfat
1 ml
20% SDS
1 ml
Heringsperma-DNA
160 µl
5M NaCl
Die
radioaktiv
markierte
1 ml
Sonde
wurde
zum
Northern
Blot
in
die
Vorhybridisierungslösung gegeben und über Nacht bei 50 °C im Hybridisierungsofen
inkubiert. Am nächsten Tag wurde die Membran für jeweils 30 Minuten dreimal mit
2x SSC-Puffer mit 0,5 % SDS und zweimal mit 0,5x SSC-Puffer mit 0,5 % SDS
gewaschen. Die Membranen wurden getrocknet und eingeschweißt und auf einen
Phosphoimager Screen gelegt. Die Expositionsdauer lag je nach Signalstärke der
radioaktiv markierten Sonde zwischen einem und sieben Tagen. Die Screens wurden
mit einem Phosphoimager (Cyclone, Packard) eingescannt. Die quantitative
Expressionsanalyse wurde mit dem Programm Optiquant 2.0 durchgeführt.
Ergebnisse
50
3
Ergebnisse
3.1
Die Freisetzung von E-Cadherin ist Smad4-abhängig
Vorangegangene Arbeiten der Arbeitsgruppe zeigten, dass Smad4 ein positiver
Transkriptionsregulator von E-Cadherin ist und dass ein Smad4-Verlust häufig mit
einem Verlust der E-Cadherin-Expression einhergeht (Müller et al. 2002; ReinacherSchick et al. 2004). In der Annahme, dass die Menge an löslichem E-Cadherin mit
der Gesamtproteinmenge von E-Cadherin korreliert, hätte man in den differentiellen
Sekretomanalysen einen Anstieg der Menge an sE-Cadherin in den Smad4-positiven
Klonen erwartet. Dies war nicht der Fall; stattdessen gab es sogar Hinweise, dass die
Menge an sE-Cadherin in den Smad4-negativen Klonen erhöht war. Weil
sE-Cadherin auf Grund seines sauren isoelektrischen Punktes in den verwendeten
2D-Gelen nicht reproduzierbar nachzuweisen war (Hanna Diehl, persönliche
Mitteilung), konnte der Unterschied nicht statistisch signifikant belegt werden. Diese
Hinweise aus den differentiellen DIGE-Gelen sollten mittels Western Blot überprüft
und die Auswirkung des Smad4-Status auf die sE-Cadherin-Mengen im Sekretom
analysiert werden. Dafür wurden die Sekretome der verschiedenen Klone der
Zelllinie SW620 verwendet, die auch in der differentiellen Sekretomstudie getestet
worden waren. In den DTJ-Klonen dieser Zelllinie war über retrovirale Transduktion
Smad4 reexprimiert worden. Die TJM-Klone waren mit dem leeren Vektor
transduziert worden und sind somit wie die Ausgangszelllinie Smad4-negativ
(Zboralski et al. 2010). Abbildung 8A zeigt die Western Blots mit den Proben aus den
Sekretomen und zum Vergleich aus den korrespondierenden Lysaten. Die Zelllinie
SW620 exprimiert im Unterschied zu der Zelllinie SW480 E-Cadherin, obwohl sie wie
die Zelllinie SW480 Smad4-negativ ist. SW620 wurde aus einer Metastase des
Tumors gewonnen, aus dem die Zelllinie SW480 etabliert wurde. In einigen (DTJ 2,
20, 21) Klonen führte die Smad4-Reexpression zu einer stärkeren E-CadherinExpression im Lysat; dies ging jedoch nicht mit einer gleichermaßen ausgeprägten
Erhöhung
des
Levels
an
löslichem
E-Cadherin
in
den
Sekretomen
der
entsprechenden Klone einher. Um ein Maß für das Shedding von E-Cadherin zu
erhalten wurden die abgeglichenen Mengen an sE-Cadherin im Sekretom (normiert
über den Gehalt an Transferrin) durch die abgeglichenen Mengen an E-Cadherin im
Lysat (normiert über β-Tubulin) geteilt (Abbildung 8B). Sowohl die Smad4-negativen
als auch die Smad4-positiven Klone weisen eine beträchtliche Variabilität des
Ergebnisse
51
Shedding-Faktors auf. Der Mittelwert des Sheddings ist in den Smad4-negativen
Klonen um einen Faktor von fast 7 erhöht (TJ-Klone: 0,54; DTJ-Klone 0,08). Dieses
stärkere Shedding war im Vergleich zu allen Smad4-positiven Klonen zu beobachten,
unabhängig davon, ob die E-Cadherin-Expression durch die Smad4-Reexpression
erhöht war oder nicht. Ähnliche Ergebnisse wurden in mehrfachen Wiederholungen
des Experiments erhalten, sodass der Smad4 Einfluss auf das Shedding von
E-Cadherin trotz der Variabilität zwischen den Klonen beider Gruppen zweifelsfrei
nachgewiesen werden konnte.
Ergebnisse
52
A
Sekretom
150 kDa
100 kDa
75 kDa
sE-Cadherin
50 kDa
Transferrin
Smad4 negativ
TJM
3
9
10
Smad4 positiv
DTJ
2
20
21
5
8
16
Lysat
150 kDa
100 kDa
75 kDa
E-Cadherin
β-Tubulin
50 kDa
B
1
normalisierter
Shedding-Wert
"Shedding"
0,8
0,6
0,4
0,2
0
TJM3 TJM9 TJM10 DTJ2 DTJ20 DTJ21 DTJ5
Smad4 negativ
DTJ8 DTJ16
Smad4 positiv
Abbildung 8: E-Cadherin-Shedding ist in den Smad4-reexprimierenden Klonen der Zelllinie
SW620 reduziert. A) Western Blots von drei Smad4-negativen und sechs Smad4-positiven
SW620-Klonen. Beim oberen Blot wurden 8 µg Sekretom aufgetragen, beim unteren 30 µg
Lysat. Beide Blots wurden mit einem E-Cadherin-Antikörper detektiert. B) Dargestellt ist die
Auswertung der obigen Western Blots, dazu wurden die Signale quantifiziert, abgeglichen
und normalisiert. Der „Shedding“-Wert wurde ermittelt, indem der Wert für sE-Cadherin durch
den E-Cadherin-Wert geteilt wurde.
Dieser Befund wurde in einem weiteren Zellsystem überprüft. Wie für die Zelllinie
SW620, waren in der Arbeitsgruppe auch für die Zelllinie HT-29 Klone hergestellt
worden, die Smad4 reexprimieren. In Abbildung 9 ist gezeigt, dass auch in den
Ergebnisse
53
Smad4-negativen Klonen der Zelllinie HT-29 mehr E-Cadherin-Shedding stattfindet
als in den Smad4-positiven Klonen. Im Mittel ist der Wert für das Shedding hier um
den Faktor 2,5 erhöht. Auch in diesem Modell ist dieser Smad4-abhängige
Unterschied unabhängig von klonalen Unterschieden in der E-Cadherin-Expression.
Insgesamt konnte somit gezeigt werden, dass die Smad4-Reexpression eine
Reduktion des E-Cadherin-Sheddings bewirkt.
"Shedding"
normalisiertes
Westernblot-Signal
1
E-Cadherin
0,8
sE-Cadherin
0,6
0,4
0,2
0
TJM2
TJM6
Smad4 negativ
DTJ11
DTJ12
DTJ13
Smad4 positiv
Abbildung 9: Das E-Cadherin-Shedding ist auch in den Smad4-reexprimierenden Klonen der
Zelllinie HT-29 reduziert. Dargestellt ist die quantitative Auswertung von Western Blots mit
zwei Smad4-negativen und drei Smad4-positiven Klonen der Zelllinie SW620. Die Signale
wurden quantifiziert, abgeglichen und normalisiert. Der „Shedding“-Wert wurde ermittelt,
indem der Wert für sE-Cadherin durch den E-Cadherin-Wert geteilt wurde. Die zugehörigen
Western Blots sind im Anhang in Abbildung 41 gezeigt.
3.1.1
Die Smad4-abhängigen Unterschiede im Shedding von E-Cadherin
korrelieren mit der Freisetzung von Kallikrein-6
Klucky et al. zeigten in der transformierten humanen embryonalen Nierenzelllinie
HEK293, dass die Serin-Protease Kallikrein-6 die Freisetzung von E-Cadherin
induzieren kann (Klucky et al. 2007). Sie beschreiben, dass Kallikrein-6 nicht direkt
auf das Shedding von E-Cadherin wirkt und schlagen vor, dass Kallikrein-6 die
Sheddase ADAM10 aktiviert, die dann aufgrund ihrer erhöhten Aktivität mehr
sE-Cadherin freisetzt (Klucky et al. 2007). ADAM10 ist ein Transmembranprotein,
welches als Zymogen synthetisiert und durch proteolytische Abspaltung der
Prodomäne aktiviert wird. Hanna Diehl hatte in den differentiellen Sekretomanalysen
eine größere Menge an Kallikrein-6 im Überstand von Smad4-negativen Klonen
Ergebnisse
54
gefunden. In den oben verwendeten Zellkulturmodellen wollten wir den von Klucky et
al. vorgeschlagenen Zusammenhang nachvollziehen und überprüfen, ob die Menge
an aktivem ADAM10 mit der Kallikrein-6-Freisetzung und dem erhöhten E-CadherinShedding in Smad4-negativen Klonen korreliert. Wir wollen damit einen Teil des
Mechanismus aufklären, wie Smad4 die extrazelluläre Shedding-Aktivität regulieren
kann.
In Abbildung 10A ist gezeigt, dass in den Smad4-negativen Klonen der Zelllinie
SW620 mehr Kallikrein-6 freigesetzt wird als in den Smad4-reexprimierenden
Klonen. Der Western Blot bestätigt somit die Ergebnisse der differentiellen
Sekretomstudie mit 2D-DIGE-Gelen. In Abbildung 10B ist zum Vergleich die
Kallikrein-6-mRNA
derselben
Klone
gezeigt.
Auf
mRNA-Ebene
sind
die
Expressionsunterschiede zwischen den einzelnen Klonen relativ hoch, eine Smad4Abhängigkeit ist jedoch nicht zu beobachten. Die oben bereits erwähnte MicroarrayAnalyse mit cDNA der SW620-Klone konnte bestätigen, dass die Expression von
Kallikrein-6 selbst nicht Smad4-abhängig ist (Heiko Becker, persönliche Mitteilung).
Dies zeigt, dass die Freisetzung von Kallikrein-6 offenbar abhängig vom Smad4Status der Zellen ist, die Expression selbst jedoch nicht. Im Zelllysat der SW620Klone war Kallikrein-6 mit Western Blot nicht nachweisbar, was wahrscheinlich daran
liegt, dass das Protein effizient sezerniert wird.
Ergebnisse
55
A
normalisiertes
Western Blot-Signal
1
Kallikrein-6
0,8
0,6
0,4
0,2
0
TJM3
TJM9 TJM10 DTJ2
Smad4 negativ
B
DTJ20 DTJ21
DTJ5
DTJ8
DTJ16
Smad4 positiv
1
normalisierte netto DLU
Kallikrein-6 mRNA
0,8
0,6
0,4
0,2
0
TJM 3 TJM 9 TJM 10 DTJ 2 DTJ 20 DTJ 21 DTJ 5
Smad4 negativ
DTJ 8 DTJ 16
Smad4 positiv
Abbildung 10: Die Serinprotease Kallikrein-6 wird in Smad4-negativen Klonen der Zelllinie
SW620 stärker freigesetzt als in Smad4-positiven Klonen. A) Auswertung eines Western
Blots mit jeweils 8 µg Sekretom von drei Smad4-negaiven und 6 Smad4-positiven Klonen der
Zelllinie SW620. Der Western Blot ist im Anhang gezeigt. B) Auswertung eines Northern
Blots mit mRNA derselben Klone, der mit einer Kallikrein-6-Sonde detektiert wurde. Der
Northern Blot ist im Anhang in Abbildung 42 gezeigt
Die Korrelation zwischen Smad4 Status und Kallikrein6 Freisetzung wurde in den
Klonen der Zelllinie HT-29 überprüft. Abbildung 11 zeigt einen Western Blot mit dem
Sekretom und Lysat von jeweils zwei Smad4-negativen und Smad4-positiven Klonen.
Die Kallikrein-6-Menge im Sekretom der Smad4-negativen Klone ist circa um den
Faktor zwei erhöht. Gleichzeitig nimmt die Menge im Lysat der Smad4-negativen
Klone ungefähr um den Faktor 3 ab. Dies bestätigt, dass die erhöhten Kallikrein-6Mengen, die im Sekretom von Smad4-negativen Zellklonen verschiedener
Kolonkarzinomzelllinien gefunden werden, nicht auf eine Expressionsregulation,
sondern auf eine Regulation der Sekretion von Kallikrein-6 zurückzuführen sind.
Ergebnisse
56
Sekretom
TJM
50 kDa
2
6
50 kDa
37 kDa
37 kDa
25 kDa
20 kDa
25 kDa
20 kDa
Sekretom Lysat
DTJ TJM
TJMDTJ
Lysat
DTJTJM
12 2 13 6 2 12 6 1312 2 13 6
Kallikrein-6
Transferrin
DTJ
12
13
Kallikrein-6
Kallikrein-6
Kallikrein-6
GAPDH
Abbildung 11: Kallikrein-6 wird auch in den Smad4-negativen Klonen der
Kolonkarzinomzelllinie HT-29 stärker freigesetzt. Jeweils 30 µg Lysat und 8 µg Sekretom
wurden von zwei Smad4-negativen (TJM) und zwei Smad4-positiven (DTJ) Klonen
aufgetragen. Transferrin dient zum Abgleich der Kallikrein-6-Mengen in Sekretom, GAPDH
zum Abgleich der Kallikrein-6-Mengen im Lysat.
3.1.2
ADAM10 wird über Exosomen freigesetzt
ADAM10 ist ein Transmembranprotein, wird als membranständiges Protein aktiviert
und kann dann als Protease wirken. ADAM10 kann jedoch auch im Sekretom
nachgewiesen werden. In einer Katalogisierung der Proteine des Sekretoms und von
Exosomen der Zelllinie LT97 mit massenspektrometrischen Methoden hatte Hanna
Diehl in unserer Arbeitsgruppe gezeigt, dass ADAM10 in Exosomen angereichert ist
(Diehl 2008). Exosomen sind Membranvesikel, die durch die Fusion von
multivesicular bodies (MVB) mit der Plasmamembran freigesetzt werden. Auch eine
andere Gruppe hatte ADAM10 in Exosomen beschrieben und zeigen können, dass
ADAM10 in Exosomen proteolytisch aktiv ist (Stoeck et al. 2006). Diese Verteilung
von Adam10 zwischen sub- und extrazellulären Fraktionen wurde mit Western Blots
überprüft. In Abbildung 12 ist gezeigt, dass ADAM10 in den Exosomenfraktionen der
Zelllinien LT97 und SW620 stark angereichert ist. Die Bande für ADAM10 im
Sekretom und Lysat ist in dieser Darstellung kaum zu sehen, da der Western Blot
aufgrund der starken Bande für ADAM10 in Exosomen in einer niedrigeren Intensität
eingelesen werden musste. ADAM10 wird also in großen Mengen über die
Exosomen freigesetzt. Für die folgenden Analysen haben wir ADAM10 daher sowohl
im Sekretom als auch im Lysat untersucht.
100 kDa
75 kDa
50 kDa
SW620
100 kDa
75 kDa
50 kDa
Lysat
nach UZ
LT97
Exosomen
57
Sekretom
Ergebnisse
aktives ADAM10
Kreuzreaktion
aktives ADAM10
Kreuzreaktion
Abbildung 12: ADAM10 wird über Exosomen freigesetzt. Western Blots mit Sekretom,
Exosom und Gesamtproteinlysat. „Nach UZ“ bezeichnet die Probe, aus der die Exosomen
mit Ultrazentrifugation depletiert worden waren. Es wurden jeweils 8 µg Sekretom und 8 µg
der „nach UZ“-Probe, 3 µg LT97-Exosomen und 1 µg SW620-Exosomen, sowie 50 µg LT97Lysat und 30 µg SW620-Lysat aufgetragen
3.1.3
Die Smad4-abhängigen Unterschiede in der Freisetzung von E-Cadherin
und Kallikrein-6 korrelieren mit der Menge an aktivem ADAM10 in
Sekretom und Lysat
In den oben verwendeten Zellkulturmodellen wollten wir überprüfen, ob die Menge an
aktivem ADAM10 mit der Kallikrein-6-Freisetzung und dem E-Cadherin-Shedding
korreliert. Abbildung 13A zeigt eine grafische Darstellung von quantifizierten Western
Blots. Dabei wurde das Signal für aktives ADAM10 bei 60 kDa im Sekretom und
Lysat quantifiziert und mit Transferrin (Sekretom) bzw. β-Tubulin (Lysat) abgeglichen.
Im Sekretom der Smad4-negativen SW620-Zellen wird mehr ADAM10 detektiert, als
in den Smad4-positiven Klonen. Im Lysat weisen nur drei der sechs Smad4-positiven
SW620-Klone ein reduziertes Signal auf (DTJ 5, 8, 16). Interessanterweise sind das
die Klone, die reduzierte Level an sE-Cadherin im Sekretom aufweisen (vgl
Abbildung 8). Die Ergebnisse konnten in der Zelllinie HT-29 bestätigt werden. Hier
zeigen alle Smad4-positiven Klone sowohl im Sekretom als auch im Lysat reduzierte
Level an ADAM10 (vgl. Abbildung 13B).
Ergebnisse
58
A
SW620
ADAM10 Lysat
ADAM10 Sekretom
normalisiertes
Western Blot Signal
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
TJM3 TJM9 TJM10 DTJ2 DTJ20 DTJ21 DTJ5 DTJ8 DTJ16
Smad4 positiv
Smad4 negativ
B
HT-29
ADAM10 Lysat
ADAM10 Sekretom
normalisiertes
Western Blot-Signal
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
TJM2
TJM6
Smad4 negativ
DTJ11
DTJ12
DTJ13
Smad4 positiv
Abbildung 13: In Smad4-negativen Klonen ist mehr aktives ADAM10 in Lysat und Sekretom
nachweisbar. Grafische Darstellung der quantifizierten und abgeglichenen Western Blot
Signale für aktives ADAM10 (60 kDa). Die Western Blots für A) sind im Anhang in Abbildung
43 und für B) in Abbildung 41 dargestellt.
3.1.4
In Zellklonen später Passagen mit einer reduzierter Smad4-Expression
kommt es zu erhöhter Freisetzung von Kallikrein-6 und sE-Cadherin
Bei den Smad4-reexprimierenden SW620-Klonen verringert sich in späteren
Passagen die Smad4-Expression wieder. Diesen Effekt wollten wir uns zu Nutze
machen, um die Smad4-Abhängigkeit in der Freisetzung von Kallikrein-6, ADAM10
und sE-Cadherin zu überprüfen. Dazu wurden drei Smad4-reexprimierende Klone
Ergebnisse
59
ausgewählt und über acht bis neun Passagen kultiviert, bis eine deutliche Reduktion
der Smad4 Menge erreicht war. Abbildung 14 zeigt die ausgewerteten Western Blots
für die drei Klone (DTJ2, 8 und 21). In allen drei Klonen nimmt die Smad4-Menge
während der acht bis neun Passagen auf circa 20% ab. Parallel dazu steigt die
Menge an sE-Cadherin, Kallikrein-6 und aktivem ADAM10 im Sekretom. Ebenso
steigt der Shedding-Wert (der Quotient aus den Werten für sE-Cadherin und
E-Cadherin) mit der Smad4-Reduktion an. Die E-Cadherin-Expression steigt
tendenziell
an.
Dies
steht
im
Widerspruch
zu
der
bekannten
positiven
Expressionsregulation durch Smad4. Der Anstieg kann nicht auf Unterschiede in der
Konfluenz zurückgeführt werden, da diese in diesem Versuch streng kontrolliert
wurde und immer bei ca. 80% lag.
Ergebnisse
60
DTJ2
sE-Cadherin
Kallikrein6
"Shedding"
ADAM10
Smad4
E-Cadherin
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
p8
p11
p14
p17
DTJ8
sE-Cadherin
Kallikrein6
"Shedding"
ADAM10
Smad4
E-Cadherin
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
p7
p10
p13
p16
DTJ21
sE-Cadherin
Kallikrein6
"Shedding"
ADAM10
Smad4
E-Cadherin
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
p7
p10
p10 p12 p12
p15
p15
Abbildung 14: Mit dem Smad4-Verlust geht eine verstärkte Freisetzung an Kallikrein-6 und
löslichem E-Cadherin und eine größere Menge von aktivem ADAM10 im Sekretom einher.
Drei Smad4-reexprimierende Klone der Zelllinie SW620 wurden über acht bis neun
Passagen kultiviert. Dargestellt sind die Werte aus quantifizierten Western Blots. Proteine im
Lysat sind mit gestrichelten Linien dargestellt, Proteine im Sekretom mit durchgezogenen
Linien. Die zugehörigen Western Blots sind im Anhang in Abbildung 44 und Abbildung 45
dargestellt.
Ergebnisse
3.1.5
61
Knockdown von Kallikrein-6 verringert sE-Cadherin-Freisetzung
Wir konnten zeigen, dass in Smad4-negativen Klonen der Zelllinien SW620 und
HT-29 mehr Kallikrein-6 freigesetzt wird als in den Smad4-positiven und dass dies
mit einem erhöhten E-Cadherin-Shedding korreliert. Außerdem wird in den Smad4negativen Klonen mehr aktives ADAM10 im Sekretom detektiert. Um zu überprüfen,
ob es sich dabei um zufällige Korrelationen oder um tatsächliche, funktionelle
Zusammenhänge handelt, haben wir einen Knockdown von Kallikrein-6 durchgeführt.
Dazu habe ich die Klone der Zelllinie SW620 mit kommerziell verfügbarer siRNA
gegen die Kallikrein-6-mRNA transient transfiziert. Als Kontrolle diente siRNA mit
einer nicht-kodierenden Sequenz. Zunächst wurde die Effizienz des Knockdowns
überprüft. Mit Northern Blot wurde die Menge an Kallikrein-6-mRNA in den
unterschiedlich behandelten Klonen bestimmt. Abbildung 15 zeigt einen Northern
Blot mit mRNAs von zwei Klonen der Zelllinie SW620. Die mRNAs waren nach zwei,
drei, vier oder sechs Tagen nach Beginn der Transfektion geerntet worden. Die
mRNA-Menge für Kallikrein-6 ist in beiden Klonen zu allen Zeitpunkten in den siRNAProben deutlich reduziert. Die größte Reduktion ist nach 72 und 96 Stunden zu
beobachten. In der siRNA-Probe werden nach 96 Stunden beim TJM9-Klon ca. 23 %
der Kallikrein-6-mRNA der Kontrollprobe bzw. 3 % beim DTJ2-Klon gemessen. Die
entsprechenden Werte nach 72 Stunden sind mit 27 % bzw. 4 % nur minimal
schlechter. Die relative Reduktion ist also in dem TJM9-Klon geringer, dieser Klon
hat jedoch in den Kontrollproben circa dreimal mehr Kallikrein-6-mRNA als der DTJ2Klon.
TJM9
48 h
K
si
DTJ2
72 h
96 h
144 h
K si
K si
K
si
48 h
K
si
72 h
K
96 h
si K
si
144 h
K
si
Kallikrein-6 mRNA
Abbildung 15: Der siRNA-vermittelte Knockdown der Kallikrein-6-mRNA ist effizient und über
mindestens sechs Tage stabil. Gezeigt ist ein Northern Blot, der mit einer Kallikrein-6-Sonde
detektiert wurde. Aufgetragen wurde mRNA der beiden SW620-Klone TJM9 und DTJ2 die
mit siRNA gegen Kallikrein-6 (si) oder nicht-kodierender siRNA (K) transfiziert wurden. Die
Zeitangaben geben an, wie viele Stunden nach Transfektion die RNA geerntet wurde.
Ergebnisse
62
Die Kallikrein-6-Reduktion konnte auch im Überstand der Zellen nachgewiesen
werden. Dies war entscheidend, da wir davon ausgehen, dass die Smad4abhängigen
Unterschiede
im
E-Cadherin-Shedding
auf
Unterschieden
der
freigesetzten Menge an Kallikrein-6 basieren. Der Effekt auf das Shedding war nur
gering, dieser geringe Effekt war allerdings reproduzierbar. Abbildung 16 zeigt die
Auswertung eines Versuches mit vier Klonen der Zelllinie SW620. Das Kallikrein-6Signal im Sekretom ist in den Proben mit Kallikrein-6-Knockdown auf 12 – 27 %
reduziert. In allen diesen Proben ist auch eine Reduktion des Signals für sE-Cadherin
und aktives ADAM10 im Sekretom zu beobachten. Ebenso ist in allen Proben mit
Kallikrein-6-Knockdown
der
Shedding-Wert
(Quotient
aus
den
Werten
für
sE-Cadherin und E-Cadherin) reduziert. Im Lysat dieser Proben waren für ADAM10
und E-Cadherin keine Unterschiede für die Proben mit Kallikrein-6-Knockdown zu
beobachten (nicht gezeigt).
Ergebnisse
63
A
normalisiertes
Western Blot-Signal
1
0,8
0,6
Kallikrein-6
sE-Cadherin
0,4
0,2
0
si
B
K
si
K
si
K
si
K
normalisiertes
Western Blot-Signal
1
0,8
0,6
"Shedding"
ADAM10
0,4
0,2
0
si
K
si
K
si
K
si
K
Abbildung 16: Der Knockdown von Kallikrein-6 reduziert das Shedding von E-Cadherin und
die Menge an aktivem ADAM10 im Sekretom. Dargestellt sind die normierten Signale von
aktivem ADAM10, sE-Cadherin und Kallikrein-6 im Sekretom, sowie der Shedding-Wert, der
aus dem Quotienten aus den Werten für sE-Cadherin im Sekretom und E-Cadherin im Lysat
gebildet wird. Die Zellen von vier Klonen der Zelllinie SW620 wurden entweder mit siRNA
gegen Kallikrein-6 (si) oder nicht kodierender siRNA (K) behandelt. Die Western Blots sind
im Anhang in Abbildung 46 dargestellt.
Ergebnisse
3.2
64
sE-Cadherin als Serummarker
Lösliches E-Cadherin wird in großen Mengen von kultivierten Karzinomzelllinien
freigesetzt. Wir gehen davon aus, dass die in vitro freigesetzten Proteine den in vivo
freigesetzten Proteinen zu einem gewissen Grad entsprechen. Lösliches E-Cadherin
wurde bereits in Serum von Patienten mit Tumoren verschiedener Entitäten
beschrieben (de Wever et al. 2007). Zu löslichem E-Cadherin in Seren von Patienten
mit kolorektalem Karzinom liegen nur wenige Daten vor, die sich außerdem
widersprechen (Velikova et al. 1998; Wilmanns et al. 2004). Wir wollen daher
lösliches E-Cadherin auf eine mögliche Verwendung als Serummarker untersuchen.
3.2.1
Lösliches E-Cadherin ist in Gewebe stabil
Zunächst haben wir die Expression von E-Cadherin in Gewebe untersucht. Wir
wollten dabei herausfinden, ob der potentielle Biomarker sE-Cadherin in Gewebe
nachweisbar ist, um eine mögliche Erhöhung bei Patienten mit kolorektalem
Karzinom
bereits
Tumorgewebe
in
und
Gewebe
zeigen
angrenzendem
zu
können.
Normalgewebe
Aus
kryokonserviertem
wurden
Proteinextrakte
hergestellt, die anschließend per Western Blot analysiert wurden. Abbildung 17 zeigt,
dass die Mengen an löslichem E-Cadherin in Tumor- und Normalgewebe eines
Patienten
relativ
ähnlich
sind,
jedoch
zwischen
den
Probenpaaren
von
verschiedenen Patienten stark schwanken. Dies deutete darauf hin, dass
möglicherweise Unterschiede in der Konservierung der Gewebe Variationen in den
Mengen an transmembranärem und löslichem E-Cadherin verursacht haben. Um die
Stabilität von E-Cadherin in Gewebe experimentell zu überprüfen, haben wir einzelne
Gewebeproben in drei Stücke geteilt, die entweder direkt oder nach einer bzw. sechs
Stunden bei Raumtemperatur lysiert wurden. Wie Abbildung 17 zeigt, ist bereits nach
einer Stunde kein transmembranäres E-Cadherin mehr detektierbar, wohingegen das
Signal für lösliches E-Cadherin nach einer Stunde deutlich stärker geworden war.
Das Signal für das lösliche E-Cadherin bei 80 kDa ist auch nach sechs Stunden
Inkubation bei Raumtemperatur nicht reduziert. Damit konnte gezeigt werden, dass
die transmembranäre Form von E-Cadherin relativ instabil ist und schnell abgebaut
wird. Ein Abbauprodukt ist das 80 kDa große sE-Cadherin, welches aber sehr stabil
gegenüber weiterem proteolytischem Abbau zu sein scheint. Gewebe ist damit
jedoch als Material für die Analyse von sE-Cadherin ungeeignet.
Ergebnisse
65
A
N
T
N
T
N
T
Ly
S
150 kDa
100 kDa
75 kDa
B
Normal
Tumor
0h 1h 6h 0h 1h 6h Ly S
150 kDa
100 kDa
75 kDa
Normal
Tumor
0h 1h 6h 0h 1h 6h
Ly
S
150 kDa
100 kDa
75 kDa
Abbildung 17: sE-Cadherin ist in Gewebe stabil. A) sE-Cadherin ist im Western Blot in
Gewebe von kolorektalen Tumoren (T) und korrespondierendem Normalgewebe (N)
nachweisbar. Es wurden jeweils 50 µg Lysat aus kryokonserviertem Gewebe aufgetragen.
Zum Vergleich wurden noch Zelllysat (Ly, 30 µg) und Sekretom (S, 8 µg) der
Kolonkarzinomzelllinie LS513 aufgetragen. B) Zwei Paare von kolorektalem Tumorgewebe
und korrespondierendem Normalgewebe wurden entweder sofort lysiert oder nach
Inkubationszeit von einer bzw. sechs Stunden bei Raumtemperatur. Je 50 µg der jeweiligen
Lysate wurden aufgetragen.
3.2.2
Lösliches E-Cadherin in Serum
Lösliches E-Cadherin ist laut mehreren Publikationen im Serum von gesunden
Probanden und verschiedenen Tumorpatienten im Mikrogramm pro Milliliter-Bereich
nachweisbar (Velikova et al. 1998; Wilmanns et al. 2004; de Wever et al. 2007). Um
dies zu überprüfen wollten wir zunächst lösliches E-Cadherin per Western Blot aus
Serum nachweisen. Dazu wurden zunächst die zwölf häufigsten Plasmaproteine
entfernt (ProteomeLab IgY-12 Partitioning Kit, Beckmann Coulter). Wie in Abbildung
18 gezeigt ist ein deutliches Signal für lösliches E-Cadherin in allen Serumproben
Ergebnisse
66
detektierbar. Zwei der vier Proben von Patienten mit kolorektalem Karzinom zeigen
dabei deutlich erhöhte Level.
CRC
Kontrolle
Abbildung 18: Lösliches E-Cadherin kann mit Western Blot im Serum nachgewiesen werden.
Aus den Seren wurden die zwölf häufigsten Plasmaproteine entfernt. 15 µg dieser
depletierten Seren wurden aufgetragen. Zwei Patienten mit kolorektalem Karzinom zeigen
erhöhte sE-Cadherin-Level. Die Tumore der Patienten mit kolorektalem Karzinom hatten die
Stadien UICC II, III, III und IV (von links nach rechts).
Dieser starke Anstieg in zwei der vier Seren von Patienten mit kolorektalem
Karzinom veranlasste uns die Bestimmung von löslichem E-Cadherin auf eine
größere Anzahl Seren aus unserer Sammlung auszuweiten. Dazu verwendeten wir
einen kommerziell erhältlichen ELISA (Takara, Japan), der eine Quantifizierung von
löslichem E-Cadherin ermöglicht. Tabelle 6 gibt eine Übersicht über die Personen,
deren sE-Cadherin-Menge im Serum mit Hilfe des ELISAs bestimmt wurde. Neben
den 59 Patienten mit kolorektalen Karzinomen verschiedener Stadien wurden noch
36 Patienten mit FAP und 20 Patienten mit kolorektalen Polypen in die Analyse mit
eingeschlossen. Außerdem wurden noch die Seren von 18 Patienten mit
entzündlichen Darmerkrankungen (EDE) einbezogen, da erhöhte sE-CadherinMengen zuvor bei Patienten mit entzündlichen Prozessen beschrieben wurden
(Pittard et al. 1996). Es wurden zwei verschiedene Kontrollgruppen verwendet. Eine
Gruppe mit jungen gesunden Probanden wurde als „gesunde Kontrollen“ bezeichnet,
die andere Gruppe mit Patienten, die eine negative Koloskopie aufwiesen, wurde als
„klinische Kontrollen“ bezeichnet.
Ergebnisse
67
Tabelle 6: Daten der Patienten, deren sE-Cadherin-Menge im Serum mit ELISA bestimmt
wurde
Anzahl
Durchschnittliches Alter
Spanne
männlich
weiblich
gesunde Kontrollen
10
35
24-44
5
5
klinische Kontrollen
35
58
17-87
17
18
entzündliche Darmerkrankungen
18
60
44-73
7
11
kolorektale Polypen
20
62
39-77
15
5
kolorektale Karzinome
59
68
37-87
44
15
UICC II
15
65
47-84
12
3
UICC III
18
71
52-87
14
4
UICC IV
26
67
37-84
18
8
36
35
10-56
16
20
Kategorie
familiäre adenomatöse Polyposis
Abbildung 19 fasst die Daten der ELISA-Messungen zusammen und zeigt die
wichtigen Ergebnisse:
-
In den Kontrollseren sind mit 4,3 µg/ml (arithmetisches Mittel der gesunden
und klinischen Kontrollgruppe) bereits große Mengen an löslichem E-Cadherin
nachweisbar. Diese Konzentration entspricht einer Gesamtmenge von circa
20 - 25 mg löslichem E-Cadherin im gesamten Blutvolumen.
-
In prämalignen oder frühen Tumorstadien ist die Menge an löslichem
E-Cadherin im Mittel nicht erhöht.
-
Bei Patienten mit metastasierten kolorektalen Karzinomen (UICC III und IV) ist
die Menge an sE-Cadherin im Serum signifikant erhöht (5,4 µg/ml).
-
Die Patienten mit entzündlichen Darmerkrankungen weisen keine erhöhten
sE-Cadherin-Level auf.
-
Eine statistisch signifikante Erhöhung der sE-Cadherin-Level wurde auch bei
Patienten mit der familiären adenomatösen Polyposis gemessen.
Ergebnisse
68
p < 0,005
p < 0,05
23000
21000
19000
17000
15000
13000
sE-Cadherin [ng/ml]
12000
11000
10000
9000
8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
n
n
lle
lle
o
o
r
r
nt
nt
Ko
Ko
e
e
h
nd
isc
su
n
i
e
l
g
k
E
ED
I
n
V
CI
pe
&I
C
y
I
I
l
I
U
Po
CI
C
CR
UIC
C
CR
P
FA
Abbildung 19: Die Konzentrationen an löslichem E-Cadherin in Seren von Patienten mit
einem kolorektalen Karzinom der Stadien III oder IV ist statistisch signifikant erhöht.
Dargestellt sind die mit einem ELISA bestimmten Konzentrationen an löslichem E-Cadherin.
Der Median ist mit horizontalen Strichen markiert.
Die Erhöhung bei einzelnen Patienten mit FAP war unabhängig vom KolektomieStatus und der Menge an Polypen zum Zeitpunkt der Blutabnahme. Ebenso konnten
wir auch für die große Variabilität in der Gruppe der Patienten mit Tumoren der
Stadien UICC III und IV keine Korrelation mit klinischen Parametern, wie z. B.
Tumorstadium, Alter und sonstigen Erkrankungen, finden. Um zu überprüfen, ob die
Serummenge
an
sE-Cadherin
mit
dem
E-Cadherin-Expressionslevel
im
Tumorgewebe korreliert, wurde in der Pathologie des Universitätsklinikums
Bergmannsheil die E-Cadherin-Expression mit Immunhistochemie analysiert. Dazu
wurde eine Auswahl an Tumorgeweben analysiert, von denen wir zeitnah
gesammelte Serumproben im ELISA gemessen hatten. In Tabelle 7 sind die
Ergebnisse dieser Analyse zusammengefasst.
Ergebnisse
69
Tabelle 7: Vergleich der Membranfärbung von E-Cadherin in kolorektalen Tumoren mit der
Konzentration an löslichem E-Cadherin im Serum desselben Patienten. Angegeben ist die
Intensität der Membranfärbung des Tumors in Prozent im Vergleich mit der gemessenen
Konzentration an löslichem E-Cadherin in Serum.
sE-Cadherin (ng/ml)
E-Cadherin-Membranfärbung
+++
++
+
-
100%
3325
100%
4137
100%
4199
100%
4341
30%
70%
4883
100%
5180
100%
5303
70%
30%
5461
70%
30%
5535
100%
5870
20%
6425
80%
100%
20%
80%
7543
7546
100%
100%
10268
21900
Es konnte kein Zusammenhang zwischen der Membranexpression von E-Cadherin
und der Menge an löslichem E-Cadherin gefunden werden. In Abbildung 20 sind
exemplarisch vier immunhistochemische Färbungen dargestellt, die zeigen, dass
sowohl starke als auch schwache Membranfärbungen mit erhöhten und auch mit
normalen sE-Cadherin-Level einhergehen können.
Ergebnisse
70
sE-Cadherin
erhöht
schwache
Membranfärbung
a
starke
Membranfärbung
b
sE-Cadherin
normal
100 µm
c
100 µm
d
100 µm
100 µm
Abbildung 20: Die immunhistochemische Färbung von E-Cadherin in kolorektalen Tumoren
ergab, dass die Menge an löslichem E-Cadherin in Serum nicht mit der E-CadherinMembranfärbung im Primärtumor korreliert. Die Konzentrationen an löslichem sE-Cadherin
in den korrespondierenden Seren waren: (a) 7543 ng/ml; (b) 21900 ng/ml; (c) 4883 ng/ml; (d)
3325 ng/ml. (Dr. Ingo Stricker, Universitätsklinikum Bergmannsheil, Institut für Pathologie)
3.2.3
Lösliches E-Cadherin als Verlaufsmarker
Die signifikante Erhöhung der sE-Cadherin-Level bei Patienten mit metastasierenden
kolorektalen Karzinomen warf die Frage auf, ob lösliches E-Cadherin als Biomarker
für klinische Anwendungen in Frage kommt. In Seren von Patienten mit kolorektalen
Tumoren findet man im Mittel 1 µg/ml mehr sE-Cadherin als in den Seren der
Kontroll-Patienten. Wie Abbildung 19 zeigt, wird in einzelnen Patienten sogar noch
deutlich mehr sE-Cadherin freigesetzt. Trotz dieser enormen tumorabhängigen
Freisetzung von sE-Cadherin ist sE-Cadherin als diagnostischer Marker nicht
geeignet, da bereits in gesunden Personen mit 5 µg/ml sehr hohe sE-CadherinKonzentrationen im Blut gemessen werden. Als Cut-off-Wert für die Berechnung der
Sensitivität und Spezifität wurde 4,75 µg/ml festgelegt, da hier die Summe aus
Sensitivität und Spezifität maximal ist. Bei diesem Wert liegt die Sensitivität für die
Diagnose eines kolorektalen Karzinoms (UICC II-IV) in unserer Patientenauswahl bei
52 %. Zum Vergleich wurden Sensitivität und Spezifität auch für CEA bestimmt. Der
CEA-Wert wird in der Regel bei der klinischen Diagnose routinemäßig bestimmt. Für
eine klinische Anwendung wird dabei üblicherweise ein Cut-off-Wert von 5 ng/ml
verwendet. Für CEA lag die Sensitivität für die Diagnose eines kolorektalen
Karzinoms in unserer Patientenauswahl bei 60 %. Durch Kombination der beiden
Ergebnisse
71
Marker kann die Sensitivität auf 79 % gesteigert werden, wenn die Erhöhung eines
der beiden Marker für die Diagnose eines kolorektalen Karzinoms verwendet wird.
Wie in Tabelle 8 gezeigt sinkt dadurch allerdings die Spezifität.
Tabelle 8: Die Sensitivität, Spezifität und Likelihood Ratio wurden mit GraphPad Prism
(GraphPad Software Inc., La Jolla, CA) für sE-Cadherin, CEA und Kombinationen der beiden
Marker berechnet.
sE-Cadherin
erhöht
CEA
erhöht
CEA oder sE-Cadherin CEA und sE-Cadherin
erhöht
erhöht
Sensitivität
0.52
0.6
0.79
0.34
Spezifität
0.81
0.94
0.81
0.97
Likelihood Ratio
2.7
9.4
4.1
11
In Abbildung 21 sind die Werte für CEA und sE-Cadherin der einzelnen Patienten mit
kolorektalem Karzinom gegeneinander aufgetragen. Bei 22 Patienten liegt der CEAWert unterhalb des Cut-off von 5 ng/ml. Von diesen 22 Patienten wiesen zwölf einen
erhöhten Wert für sE-Cadherin auf. 19 von 35 Patienten mit erhöhtem CEA-Wert
hatten auch erhöhte sE-Cadherin-Level im Serum. Von zwei Patienten lag kein CEAWert vor.
log CEA [ng/ml]
1000
100
10
Cut-off
1
0.1
25
20
15
10
50
0
00
00
00
00
00
0
0
0
0
sE-Cadherin [ng/ml]
Abbildung 21: Die Punkte repräsentieren die CEA- und E-Cadherin-Werte jeweils eines
Patienten mit kolorektalem Karzinom.
Ergebnisse
72
Von zwei Patienten mit erhöhtem CEA und sE-Cadherin-Level waren auch während
der Nachbeobachtung noch Serumproben gesammelt worden, sodass hier eine
Bestimmung
der
sE-Cadherin-Level
zu
verschiedenen
Zeitpunkten
des
Krankheitsverlaufes möglich war. In Abbildung 22 sind die Veränderungen der CEA
und sE-Cadherin-Werte dieser beiden Patienten zu verschiedenen Zeitpunkten
dargestellt. Der Verlauf des sE-Cadherin-Wertes spiegelt den Status der Krankheit
ähnlich gut wider wie der etablierte Verlaufsmarker CEA. Von dem unter A) gezeigten
Patienten wurde zu Beginn der Chemotherapie eine Serumprobe entnommen. 63
Tage später war bei diesem Patienten eine Regression der Lebermetastasen zu
beobachten,
was
sich
in
einem
reduzierten
CEA-
und
sE-Cadherin-Wert
widerspiegelt. Anschließend kam es jedoch zu einem Fortschreiten der Erkrankung,
was zu einer hohen Tumorlast und erhöhten CEA- und sE-Cadherin-Level nach
knapp zwei Jahren führte. Vier Monate später ist dieser Patient verstorben. Dem
unter B) gezeigten Patienten wurde vor einer erfolgreichen Hemikolektomie die erste
Serumproben entnommen. Diese wies deutlich erhöhte CEA und sE-Cadherin-Werte
auf. In der Folge blieb dieser Patient frei von Tumoren, was durch konstante und
reduzierte Level der Serummarker widergespiegelt wird.
Ergebnisse
73
Fortschreitende Erkrankung
sE-Cadherin palliative Chemotherapie
CEA
30000
25000
20000
Chemotherapie
697
100
75
63
0
5000
50
10000
Regression der
Lebermetastasen
25
15000
450
400
350
300
250
200
150
100
50
0
CEA [ng/ml]
sE-Cadherin [ng/ml]
A
Zeit (Tage)
B
25000
sE-Cadherin
CEA
22500
120
100
20000
80
17500
15000
60
12500
kein Rezidiv
40
10000
20
0
950
918
900
100
112
71
0
50
7500
5000
CEA [ng/ml]
sE-Cadherin [ng/ml]
Hemikolektomie
Zeit (Tage)
Abbildung 22: Die Mengen an löslichem E-Cadherin und CEA spiegeln bei zwei Patienten
den Verlauf der Krankheit wider. Dargestellt ist die Nachbeobachtung von zwei Patienten mit
kolorektalem Karzinom.
Ergebnisse
3.3
74
Smad4-Abhängigkeit der Expression von Cadherin-17
E-Cadherin und Cadherin-17 sind die beiden am stärksten exprimierten Cadherine im
Darmepithel. Für E-Cadherin wurde gezeigt, dass der Verlust der Expression des
Tumorsuppressors Smad4 mit einem Verlust der Expression von E-Cadherin
assoziiert ist (Reinacher-Schick et al. 2004). Reexpression von Smad4 in der
Kolonkarzinomzelllinie SW480 führte zu einer erhöhten E-Cadherin-Expression,
stärkeren Zell-Zell-Kontakten und einer morphologischen Reversion der Zellen
(Müller et al. 2002). Zur Transkriptionsregulation von Cadherin-17 ist bekannt, dass
cdx2 ist ein wichtiger Regulator der Cadherin-17-Expression ist, aber alleine nicht
ausreicht um die Cadherin-17-Expression zu induzieren. Eine Cdx2-Überexpression
in Hela- oder HEK293-Zellen führt nicht zur Cadherin-17-Expression (Hinoi et al.
2002). Um weitere Einblicke in die Expressionsregulation von Cadherin-17 zu
gewinnen und um mögliche Unterschiede und Gemeinsamkeiten mit E-Cadherin in
der Expressionsregulation zu überprüfen, haben wir in unseren etablierten
Zellkulturmodellen nach einer möglichen Expressionsregulation von Cadherin-17
durch Smad4 gesucht. Zunächst haben wir dazu in einem größeren Set an
Kolonkarzinomzelllinien die Expression von Cadherin-17-mRNA überprüft. Abbildung
23 zeigt, dass die vier Smad4-negativen Kolonkarzinomzelllinien alle auch Cadherin17-negativ sind. Neun von zwölf der Smad4-positiven Zelllinien exprimieren auch
Cadherin-17-mRNA. Zur Ergänzung sind noch neun Pankreaskarzinomzelllinien
dargestellt. Die eine Pankreaskarzinomzelllinie, die Cadherin-17-mRNA exprimiert,
ist auch Smad4-positiv.
Pankreaskarzinomzelllinien
ASPC1
CFPA1-1
Panc1
BxPC3BL
MiaPaca
Panc98
PancTuI
Capan2
HS766T
SW480
SW620
HT29
WIDR
HT115
DLD-1
LS174T
SW831
Colo320DM
LS411
CaCo2
Colo320HSR
SW948
Lovo
LS513
Lisp-1
Kolonkarzinomzelllinien
Cadherin-17
18S-RNA
Smad4
Abbildung 23: Cadherin-17 wird in den Smad4-negativen Kolonkarzinomzelllinien nicht
exprimiert. Gezeigt sind zwei Northern Blots mit 16 Kolonkarzinomzelllinien und neun
Pankreaskarzinomlinien, die mit Sonden für Cadherin-17- und Smad4-mRNA markiert
wurden. Als Abgleich dient das Signal der 18S-RNA des Ethidiumbromid-gefärbten Geles.
Ergebnisse
75
Die Beobachtung, dass Smad4-negative Zelllinien auch Cadherin-17-negativ sind,
ließ uns vermuten, dass Cadherin-17, ähnlich wie E-Cadherin, Smad4-abhängig
reguliert sein könnte. Dazu analysierten wir die Expression der Cadherin-17-mRNA in
unseren Smad4-reexprimierenden Kolonkarzinomzelllinien. Zusätzlich überprüften
wir noch die Expression von cdx2, da bekannt ist, dass dieses die Cadherin-17Expression reguliert (Hinoi et al. 2002). Wie Abbildung 24 zeigt, kann die Cadherin17-Expression
nicht
durch
Smad4-Reexpression
wiederhergestellt
werden.
Interessanterweise wird aber der wichtige Cadherin-17-Regulator cdx2 Smad4abhängig
exprimiert.
Die
Beobachtung,
dass
cdx2-mRNA
Smad4-abhängig
exprimiert wird, Cadherin-17-mRNA jedoch nicht, wird durch Mikroarray-Analysen mit
cDNA derselben Zelllinien bestätigt (Heiko Becker, persönliche Mitteilung). In den
Klonen der Kolonkarzinomzelllinie HT-29 konnte keine Induktion von cdx2 nach
Smad4-Reexpression beobachtet werden (nicht gezeigt). Diese Befunde wurden im
Rahmen dieser Arbeit nicht weiter verfolgt.
TJM
3
9
Smad4 negativ
DTJ
10
2
20 21
5
8
16
Smad4 positiv
DTJ
TJM
2
5
6
5
9
13
SW948
Smad4 positiv
LT97
Smad4 negativ
SW480
LT97
SW620
Cadherin-17
cdx2
GAPDH
Abbildung 24:Smad4 Reexpression führt zu einer Induktion der cdx-2 Expression, jedoch
nicht zu einer Expression von Cadherin-17. Gezeigt sind Northern Blots mit Smad4negativen und Smad4-reexprimierenden Klonen der Kolonkarzinomzelllinien SW480 und
SW620, die mit Sonden für Cadherin-17- und cdx2-mRNA markiert wurden. Als
Beladungskontrolle wurde eine Detektion mit einer GAPDH-Sonde durchgeführt. LT97mRNA diente als positiv-Kontrolle.
Ergebnisse
76
3.4
Lösliches Cadherin-17 als möglicher Serummarker
3.4.1
Freisetzung von Cadherin-17 durch Ektodomänen-Shedding
Bereits im Rahmen meiner Masterarbeit konnte ich zeigen, dass Cadherin-17 durch
Ektodomänen-Shedding freigesetzt wird. Abbildung 25 zeigt, dass der Antikörper
gegen die intrazelluläre Domäne von Cadherin-17 im Sekretom kein Signal zeigt. Der
Antikörper gegen die extrazelluläre Domäne von Cadherin-17 hingegen detektiert im
Sekretom ein Protein, was etwas kleiner ist als das im Lysat nachgewiesene
Cadherin-17. Der Größenunterschied des intakten, transmembranären Cadherin-17
zum löslichen Cadherin-17 (soluble Cadherin-17, sCadherin-17) beträgt nur ca.
5 kDa. Zum Vergleich ist die Detektion mit einem Antikörper gegen die extrazelluläre
Domäne von E-Cadherin dargestellt. Der Größenunterschied des transmembranären
E-Cadherins zum löslichen E-Cadherin (soluble E-Cadherin, sE-Cadherin) beträgt ca.
40 kDa.
S
L
E-Cadherin
extrazellulär
kDa
S
L
kDa
250
S
L
kDa
250
250
150
100
150
150
100
100
75
75
75
Cadherin-17
extrazellulär
Cadherin-17
intrazellulär
Abbildung 25: Cadherin-17 wird durch Ektodomänen-Shedding freigesetzt. Dargestellt sind
Western Blots mit Sekretom (S, 8 µg) und Lysat (L, 30 µg), die mit den angegebenen
Primärantikörpern inkubiert wurden.
3.4.2
ADAM10 ist die verantwortliche Protease für das Cadherin-17-Shedding
Die Freisetzung von Cadherin-17 ist bisher noch nicht beschrieben worden. Wie
oben dargestellt, kommt lösliches Cadherin-17 jedoch in großen Mengen im
Überstand von Kolonkarzinomzelllinien vor. Cadherin-17 wird, wie E-Cadherin, durch
Ektodomänen-Shedding freigesetzt. Während für E-Cadherin schon mehrere
Proteasen beschrieben wurden, die für das Ektodomänen-Shedding verantwortlich
sind, war die verantwortliche Protease für das Ektodomänen-Shedding von Cadherin17 noch unbekannt. Die wichtigsten Proteasen, die das Ektodomänen-Shedding
Ergebnisse
77
vermitteln, sind zinkabhängige Metalloproteasen der Familien der ADAMs und der
MMPs. Aus diesem Grund testeten wir, ob der Breitband-Metalloproteaseinhibitor
Batimastat das Shedding von Cadherin-17 reduziert. ADAM10 ist eine wichtige
Protease für das Shedding der Cadherine N- und E-Cadherin (Maretzky et al. 2005;
Reiss et al. 2005). Aufgrund der Bedeutung von ADAM10 für das Shedding dieser
Cadherine entschlossen wir uns zusätzlich den spezifischen ADAM10-Inhibitor
GI254023X (Hundhausen et al. 2003) zu testen, der uns freundlicherweise von Prof.
Dr. Andreas Ludwig (RWTH Aachen) zur Verfügung gestellt wurde. Diese beiden
Inhibitoren wurden dem Medium von kultivierten Karzinomzellen zugesetzt.
Anschließend wurde die Menge an sCadherin-17 im Sekretom der so behandelten
Zelllinien per Western Blot bestimmt. Bekannterweise hemmen beide Inhibitoren das
Shedding von E-Cadherin, aus diesem Grund wurde zum Vergleich auch
sE-Cadherin im Sekretom bestimmt. Die Experimente zur Identifizierung der
Sheddase für Cadherin-17 wurden in enger Zusammenarbeit mit Nathalie
Wojtalewicz im Rahmen ihrer von mir betreuten Masterarbeit durchgeführt. Abbildung
26A zeigt die Western Blots von zwei repräsentativen Versuchen mit den
Kolonkarzinomzelllinien CaCo-2 und SW948. Durch die Zugabe der Inhibitoren
Batimastat und GI254023X wird die Menge an sCadherin-17 und sE-Cadherin im
Sekretom dieser beiden Kolonkarzinomzelllinen reduziert. Für den Vergleichswert
wurde dem Sekretom nur das Lösungsmittel der Inhibitoren (DMSO) zugegeben.
Abbildung 26B zeigt die Auswertung der Western Blots aus Abbildung 26A. Dazu
wurden die Intensitäten der Banden mit dem Programm Odyssey (LI-COR
Biosciences) quantifiziert, mit dem Wert der Transferrin-Banden abgeglichen und
anschließend normalisiert. Die Menge an sCadherin-17 wird durch beide Inhibitoren
stärker reduziert als die Menge an sE-Cadherin. In der Zelllinie CaCo-2 ist
sCadherin-17 auf unter 10% der DMSO-Kontrolle reduziert, in der Zelllinie SW948
beträgt die Reduktion circa 20%. Beide Inhibitoren wirken in der eingesetzten
Konzentration ungefähr gleich stark.
Ergebnisse
Batimastat
DMSO
GI254023X
Batimastat
DMSO
SW948
CaCo-2
GI254023X
A
78
sCadherin-17
sE-Cadherin
Transferrin
B
CaCo-2
SW948
CaCo-2
sCadherin-17
sCadherin-17
sE-cadherin
sE-Cadherin
sCadherin-17
sE-Cadherin
Batimastat
GI254023X
DMSO
Batimastat
Batimastat
GI254023X
GI254023X
DMSO
DMSO
Abbildung 26: Die Inhibitoren Batimastat und GI254023 reduzieren die Menge an sCadherin17 und sE-Cadherin im Sekretom der Kolonkarzinomzelllinien CaCo-2 und SW948. A) Dem
Zellkulturmedium wurden entweder 20 µM Batimastat, 5 µM GI254023X oder DMSO
zugesetzt. Gezeigt sind Ausschnitte der Western Blots, die mit Antikörpern gegen die
angegebenen Proteine inkubiert wurden. B) Auswertung der Western Blots aus A nach
Abgleich der Mengen mit Transferrin und Normalisierung pro Protein und Zelllinie auf den
jeweils höchsten Wert.
Die Metalloproteaseinhibitoren Batimastat und GI254023X wirken, indem sie das
Zink-Ion im katalytischen Zentrum der Protease binden und so deren Aktivität
inhibieren. Die detektierbare Menge an ADAM10 sollte also durch Zugabe der
Inhibitoren nicht abnehmen. In Abbildung 27 ist gezeigt, dass nach Zugabe der
Inhibitoren Batimastat und GI254023X die Menge an detektierbarem ADAM10 in
Sekretom und Lysat sogar zunimmt. Die Zunahme ist sowohl beim inaktiven
ADAM10-Vorläufer-Protein zu sehen, als auch bei der aktiven Form, die nach
Abspaltung der Prodomäne ca. 20 kDa kleiner ist und in diesem Fall durch die
Bindung der Inhibitoren inaktiviert wurde. Die Bande, die im Lysat knapp unterhalb
der aktiven Form liegt, ist eine Kreuzreaktion des Antikörpers, wie sie auch von
anderen Autoren beschrieben wurde.
Ergebnisse
79
DMSO
unbehandelt
GI254023X
Batimastat
Marker
Lysat
DMSO
unbehandelt
GI254023X
Batimastat
Sekretom
ADAM10 Vorläufer
aktives ADAM10
Kreuzreaktion
Transferrin
Abbildung 27: Auswirkung der Inhibitoren Batimastat und GI254023X auf die Menge an
ADAM10 im Sekretom und Lysat der Zelllinie CaCo-2. Es wurden 8 µg Sekretom und 30 µg
Lysat aufgetragen.
Der
eingesetzte
Konzentration
ADAM10-Inhibitor
auch
einige
MMPs
GI254023X
kann
inhibieren
(Ludwig
in
et
der
al.
eingesetzten
2005).
Um
herauszufinden, ob die Auswirkungen der Inhibitoren auf eine Inhibition von ADAM10
zurückzuführen sind, wurde ein siRNA-vermittelter transienter Knockdown von
ADAM10 durchgeführt. Dazu wurden kommerziell verfügbare siRNA-Sequenzen
gegen ADAM10 transient in die Zelllinien SW948 und CaCo-2 transfiziert. Auch hier
wurde anschließend in den jeweiligen Sekretomen die Menge an sCadherin-17 und
sE-Cadherin bestimmt. Als Kontrolle wurde eine nicht-kodierende siRNA-Sequenz
transfiziert. In Abbildung 28 ist zunächst die Überprüfung des Knockdowns im Lysat
der behandelten Proben gezeigt. Sowohl der inaktive ADAM10-Vorläufer bei circa 85
kDa, als auch das aktive ADAM10 bei circa 65 kDa sind in den „si“-Proben mit
ADAM10-Knockdown reduziert. Bei der Zelllinie CaCo2 ist das Signal für aktives
ADAM10 auf 20% reduziert, bei der Zelllinie SW948 nur moderat auf 75%. Die
zusätzliche Bande knapp unterhalb des Signales für ADAM10 ist eine Kreuzreaktion.
Ergebnisse
80
CaCo-2
si
SW948
K
si
K
150 kDa
100 kDa
75 kDa
ADAM10 Vorläufer
aktives ADAM10
50 kDa
β-Tubulin
Abbildung 28: Western Blot mit 50 µg der Zelllysate von CaCo-2 und SW948. Die Zellen
wurden entweder mit siRNA gegen ADAM10 (si) oder nicht kodierender siRNA (K) inkubiert.
Der ADAM10-Antikörper detektiert das inaktive Vorläufer-Protein bei ca. 85 kDa und das
aktive Protein bei ca. 65 kDa. Bei ca. 60 kDa tritt eine Kreuzreaktion auf. Gezeigt ist
außerdem die Detektion mit β-Tubulin zur Beladungskontrolle.
Abbildung 29A zeigt die Western Blot-Signale der Sekretome der mit siRNA
behandelten Zellen. Die Menge an sCadherin-17 und sE-Cadherin im Sekretom der
Zellen, die mit siRNA gegen ADAM10 behandelt wurden, ist reduziert. Abbildung 29B
zeigt die Auswertung der mit Transferrin abgeglichenen und normalisierten Signale.
Sowohl sCadherin-17 als auch sE-Cadherin sind auf circa 30% der Kontrolle
reduziert. Die Reduktion der löslichen Cadherine ist damit weniger stark als bei dem
Versuch mit den Inhibitoren, was möglicherweise auf den unvollständigen
Knockdown zurückzuführen ist. Insgesamt konnte jedoch gezeigt werden, dass
ADAM10 eine wichtige Protease für das Shedding von Cadherin-17 ist.
Ergebnisse
81
ADAM10-siRNA
nich-kodierende
siRNA
SW948
nicht-kodierende
siRNA
CaCo-2
ADAM10-siRNA
A
sCadherin-17
sE-Cadherin
Transferrin
B
CaCo-2
SW948
sCadherin-17
sCadherin-17
sE-Cadherin
sE-Cadherin
ADAM10-siRNA
nicht-kodierende siRNA
ADAM10-siRNA
nicht-kodierende siRNA
Abbildung 29: Der siRNA-vermittelte ADAM10-Knockdown reduziert die Menge an
sCadherin-17 und sE-Cadherin im Sekretom der Kolonkarzinomzelllinien CaCo-2 und
SW948. A) Gezeigt sind Ausschnitte der Western Blots, die mit Antikörpern gegen die
angegebenen Proteine inkubiert wurden. B) Auswertung der Western Blots aus A nach
Abgleich der Mengen mit Transferrin und Normalisierung pro Protein und Zelllinie auf den
jeweils höchsten Wert.
3.4.3
Gerichtete Freisetzung von Cadherin-17
Lösliches Cadherin-17 wird von polarisierten Zellen basolateral freigesetzt. In meiner
Masterarbeit hatte ich die Adenomzelllinie LT97, die bekannterweise in vitro
polarisieren kann, auf Porenmembraneinsätzen kultiviert. Die Kultivierung gut
differenzierter Tumorzellen auf Porenmembraneinsätzen ist ein etabliertes Modell für
die Untersuchung polarisierter Zellen. In diesem Modell wollten wir nun auch die
zuvor
identifizierte
Cadherin-17-Sheddase
ADAM10
analysieren.
Die
gut
differenzierte Adenomzelllinie LT97 bildet einen gleichmäßigen Zellmonolayer aus,
Ergebnisse
82
so dass man zwei getrennte Kompartimente erhält und eine gerichtete Freisetzung
untersuchen kann. Als Vergleich hierzu wurde die Zelllinie SW948 verwendet, die
stark dreidimensional wächst, so dass sich die freigesetzten Proteine eher zufällig
verteilen sollten. Für die Analyse wurden die Sekretome der beiden Kompartimente
(vgl. Abbildung 30B) getrennt gewonnen und mit Western Blot analysiert. Abbildung
30A zeigt die Auswertung der Western Blots nach Abgleich der Beladungsmengen
mit Transferrin und nach Normalisierung. Man sieht, dass bei der Zelllinie LT97 die
Proteine ADAM10, sCadherin-17 und sE-Cadherin im unteren Kompartiment (well)
angereichert sind, während bei der Zelllinie SW948 diese Proteine im oberen
Kompartiment (insert) in größeren Mengen vorkommen.
A
1
ADAM10
sCadherin-17
normalisiertes
Western Blot-SIgnal
0,8
sE-Cadherin
0,6
0,4
B
0,2
Insert
well
0
SW948 well
SW948 insert
LT97 well
LT97 insert
Abbildung 30: Die Proteine ADAM10, sCadherin-17 und sE-Cadherin werden überwiegend
basolateral freigesetzt. A) Auswertung der Western Blots des Freisetzungstests für die
Proteine ADAM10, sCadherin-17 und sE-Cadherin nach Abgleich mit Transferrin und nach
Normalisierung auf den höchsten Wert für jedes Protein und jede Zelllinie. Die Originale sind
in Anhang gezeigt B) Zur Erläuterung ist der Versuchsaufbau schematisch dargestellt.
Wie oben gezeigt wird die Protease ADAM10 über Exosomen freigesetzt. In
Abbildung 31 ist gezeigt, dass die Signale für typische Markerproteine für Exosomen
wie Synthenin, A33 und Lamp3 mit ADAM10 korrelieren. Damit konnte gezeigt
werden, dass auch die Exosomen von polarisierten Zellen basolateral abgegeben
werden. Die basolaterale Freisetzung von sCadherin-17 und ADAM10 ist ein
wichtiges Indiz dafür, dass Cadherin-17 auch in vivo von ADAM10 gespalten werden
könnte und in den Blutkreislauf gelangen kann.
LT97 insert
LT97 well
Sw948 insert
83
SW948 well
Ergebnisse
Synthenin
A33
Lamp3
ADAM10
Abbildung 31: Die Freisetzung von ADAM10 korreliert mit den Exosomenmarkern Synthenin,
A33 und Lamp3. Western Blots des Freisetzungstests nach Immundetektion für ADAM10,
Synthenin, A33 und Lamp3. Es wurden jeweils 16 µg Sekretom aufgetragen.
3.4.4
Cadherin-17 in Gewebe
Im Rahmen der Bachelorarbeit von Jan Albrecht konnten wir zeigen, dass die
Expression von Cadherin-17 im Verlauf der Tumorgenese des kolorektalen
Karzinoms eher erhalten zu sein scheint. In einem Pilotprojekt mit 15 kolorektalen
Karzinomen konnte Jan Albrecht mit immunhistochemischen Analysen zunächst
unseren früheren Befund bestätigen, dass die E-Cadherin-Expression in späten
Tumorstadien eher abnimmt. Die in konsekutiven Schnitten durchgeführte Färbung
für Cadherin-17 zeigte dagegen, dass die Cadherin-17-Expression auch in Tumoren
fortgeschrittener Stadien nicht reduziert war. Wie Abbildung 32 zeigt, konnte dies
auch mit den Proteinextrakten aus kryokonserviertem Gewebe bestätigt werden.
Auch in diesen Proben war keine Reduktion des Signals für Cadherin-17 in den
Tumorproben zu beobachten. Aufgrund des geringen Größenunterschiedes von
löslichem und transmembranärem Cadherin-17 war es nicht möglich zwischen
diesen beiden Formen zu unterscheiden. Interessanterweise war jedoch deutlich
mehr ADAM10 in den Proteinextrakten aus Tumorgewebe nachweisbar als im
korrespondierenden Normalgewebe. Die höhere Expression von ADAM10 in
Tumorgewebe konnte in einer Kooperation mit der Pathologie der Universitätsklinik
Ergebnisse
84
Bergmannsheil bestätigt werden (Johanna Mundig und Ingo Stricker, persönliche
Mitteilung).
T
N
T
N
T
N
T
N
S
Ly
Cadherin-17
E-Cadherin
ADAM10
GAPDH
Abbildung 32: Cadherin-17 ist im Western Blot in Gewebe von kolorektalen Tumoren (T) und
korrespondierendem Normalgewebe (N) nachweisbar. In Tumorgewebe ist mehr ADAM10
nachweisbar als in Normalgewebe. Es wurden jeweils 80 µg Lysat aus kryokonserviertem
Gewebe aufgetragen. Zum Vergleich wurden noch Zelllysat (Ly, 30 µg) und Sekretom (S, 8
µg) der Kolonadenomzelllinie LT97 aufgetragen.
3.4.5
Entwicklung eines ELISAs für Cadherin-17
Wir vermuteten, dass lösliches Cadherin-17 ein geeigneterer Biomarker als
sE-Cadherin sein könnte. Trotz der enormen tumorabhängigen Freisetzung von
sE-Cadherin ist sE-Cadherin als diagnostischer Marker nicht geeignet, da bereits in
gesunden Personen mit 5 µg/ml sehr hohe sE-Cadherin-Konzentrationen im Blut
gemessen werden. Die Expression von Cadherin-17 beschränkt sich jedoch auf das
intestinale Epithel, was vermutlich bedeutet, dass deutlich geringere Mengen an
löslichem Cadherin-17 bei Gesunden gefunden werden. Diese Vermutung wird
dadurch unterstützt, dass wir lösliches Cadherin-17 im Serum nicht mit Western Blot
nachweisen konnten. Die Sensitivität des Cadherin-17-Nachweises per se war nach
Ergebnissen von Verdünnungsreihen mit Zellkulturmaterial ähnlich hoch wie die für
E-Cadherin. Analog zum Nachweis von sE-Cadherin mit Western Blot in Serum (vgl.
Abbildung 18) wurden auch hier Serumproben verwendet, aus denen die zwölf
häufigsten Serumproteine entfernt worden waren. Wir gehen dennoch davon aus,
dass lösliches Cadherin-17 genauso wie lösliches E-Cadherin in den Blutkreislauf
gelangen kann, da wir zeigen konnten, dass lösliches Cadherin-17 in vitro
basolateral freigesetzt wird.
Ergebnisse
Wir
wollten
85
daher
in
einem
größeren
Set
an
Serumproben
von
Kolonkarzinompatienten die Menge an löslichem Cadherin-17 bestimmen. Dazu
habe ich zunächst einen ELISA entwickelt, da lösliches Cadherin-17 mit Western Blot
nicht nachweisbar ist. Der ELISA wurde mit Sekretomen von Zelllinien entwickelt, von
denen die Cadherin-17-Expression aus Northern und Western Blot-Ergebnissen
bekannt war. Durch den Vergleich von Cadherin-17-negativen und -positiven
Sekretomen konnte so die Spezifität des ELISAs bestimmt werden. Wir entschieden
uns für die Verwendung von Sekretom bei der Entwicklung des ELISAs, da wir davon
ausgingen, dass durch die Verwendung eines komplexeren Proteingemisches die
Ergebnisse besser auf die Anwendbarkeit in Serum übertragbar sind als bei der
Verwendung von rekombinantem Protein. Der ELISA wurde als Sandwich ELISA
entwickelt, da dieser eine höhere Spezifität ermöglichen sollte. Abbildung 33 zeigt
erste
Ergebnisse
des
ELISAs
mit
Sekretom.
Es
wurden
verschiedene
Konzentrationen des Fänger-Antikörpers, des Analyten und des DetektionsAntikörpers ausgetestet. Wurde Sekretom von Cadherin-17-negativen Zelllinien
gemessen, hatten Änderungen dieser drei Parameter nahezu keinen Einfluss auf das
im ELISA gemessene Signal. In den Cadherin-17-positiven Sekretomen steigt das
Signal mit der Erhöhung jeder dieser drei Parameter an. Dies zeigt, dass der ELISA
lösliches Cadherin-17 im Sekretom sehr spezifisch nachweisen kann.
Ergebnisse
1:1000
86
1:5000
200 µg/ml Sekretom
1:1000
1:5000
50 µg/ml Sekretom
1:1000
+ Fänger-Antikörper
1:800
+ Fänger-Antikörper
1:200
1:5000
12,5 µg/ml Sekretom
Abbildung 33: Cadherin-17 im Sekretom ist mit dem ELISA nachweisbar. 100 µl Cadherin17-positive (+) und Cadherin-17-negative (-) Sekretome wurden in den Konzentrationen 200
µg/ml, 50 µg/ml, 12,5 µg/ml eingesetzt. Der Fänger-Antikörper wurde in zwei verschiedenen
Konzentrationen 1:200 und 1:800 eingesetzt. Auf der x-Achse sind abwechselnd zwei
verschiedene Konzentrationen des Detektions-Antikörpers (1:1000 und 1:5000) aufgetragen.
Im nächsten Schritt wurden den Sekretomen verschiedene Mengen an Serum
zugegeben.
Hierzu
wurden
unterschiedliche
Sekretomkonzentrationen
in
serumhaltigen Detektionspuffern verdünnt. Bei dem in Abbildung 34 dargestellten
Test war die Analytlösung serumfrei (0 % Serum) oder das Sekretom war in reinem
Serum verdünnt worden (100 % Serum). Außerdem waren Analytlösungen mit einem
Anteil von 10 % und 50 % Serum gemessen worden. Die rechte Hälfte von Abbildung
34 zeigt, dass bei der Verdünnung von Cadherin-17-negativem Sekretom in Serum
das Signal zunächst ansteigt und bei steigender Serummenge wieder abnimmt. Für
die Verdünnungen wurde ein Serum einer jungen, gesunden Person verwendet. Es
ist unklar, ob der Anstieg beim Einsatz von 10 % Serum auf Kreuzreaktionen oder
lösliches Cadherin-17 im Serum dieser Person zurückzuführen ist. Die Messung von
Cadherin-17-positiven Sekretomen in Serum zeigte, dass das Signal durch den
Einsatz von Serum reduziert wird. Bereits bei der Verdünnung in 10 % Serum ist bei
allen drei Sekretomkonzentrationen eine Signalreduktion auf 50 – 75 % zu sehen.
Bei der Verdünnung in reinem Serum ist das Signal des Cadherin-17-positiven
Sekretoms nur noch minimal größer als das des Cadherin-17-negativen Sekretoms.
Ergebnisse
87
10 µg/ml Sekretom
25 µg/ml Sekretom
Signalstärke ELISA
100 µg/ml Sekretom
100 %
Serum
50 %
Serum
10 %
Serum
0%
Serum
Cadherin-17-positives Sekretom
100 %
Serum
50 %
Serum
10 %
Serum
0%
Serum
Cadherin-17-negatives Sekretom
Abbildung 34: Unterschiedliche Konzentrationen an Cadherin-17-positivem und -negativem
Sekretom wurden in verschiedenen Anteilen Serum verdünnt.
Bei der Detektion der in Abbildung 33 und Abbildung 34 gezeigten ELISAs wurde
TMB als Substrat verwendet und der ELISA durch Absorptionsmessung ausgewertet.
Um die Sensitivität des ELISAs zu erhöhen hatte ich im Folgenden ein
Chemilumineszenz Substrat verwendet. Durch dieses sensitivere Substrat und durch
Optimierung
der
Pufferbedingungen,
Antikörperkonzentrationen
und
Inkubationszeiten konnte eine Verbesserung der Nachweisgrenze des ELISAs
erreicht werden. Abbildung 35 zeigt Verdünnungsreihen mit Cadherin-17-positiven
und -negativen Sekretomen. Man sieht, dass sich das Signal des Cadherin-17positiven Sekretoms bei einer Konzentration von 1 µg/ml Sekretom dem des
Cadherin-17-negativen Sekretoms annähert.
Ergebnisse
88
SignalstärkeELISA
Cadherin-17
negatives Sekretom
in 10 % Serum
Cadherin-17
positives Sekretom
in 10 % Serum
20 µg/ml 10 µg/ml
4 µg/ml
1 µg/ml
0.5 µg/ml
Abbildung 35: Mit dem Cadherin-17-ELISA gemessene Verdünnungsreihen von Cadherin17-positivem und -negativem Sekretom in Analytlösung mit 10 % Serum.
Als sehr grobe Abschätzung gehen wir davon aus, dass circa ein tausendstel des
Gesamtsekretoms lösliches Cadherin-17 ist. Diese Abschätzung basiert auf dem
Spotmuster von DIGE-gefärbten 2D-Gelen mit Cadherin-17-positivem Sekretom. Die
Nachweisgrenze für sCadherin-17 liegt bei 100-400 ng Sekretom pro well. Die
Nachweisgrenze des ELISAs für lösliches Cadherin-17 in Serum läge damit bei circa
0,1-0,4 ng pro well. Da pro well 10 µl Serum eingesetzt werden, kann Cadherin-17
also ungefähr bis zu einer Serumkonzentration von circa 10-40 ng/ml nachgewiesen
werden. Dies erschien uns als ausreichend um lösliches Cadherin-17 in einer
größeren Anzahl Seren aus unserer Serumsammlung zu bestimmen. In einem ersten
Test wurde die Reproduzierbarkeit der Messwerte von zwei unabhängigen ELISAs
mit denselben Seren verglichen. Abbildung 36 zeigt die Ergebnisse zweier ELISAs
von aufeinanderfolgenden Tagen. Man sieht eine statistisch hoch signifikante
Korrelation der Messungen. Der durchschnittliche Variationskoeffizient betrug 4,1 %.
Die folgenden Messungen wurden daher wie in diesem Test in zwei unabhängigen
ELISAs jeweils als Triplikate durchgeführt. Für die Normalisierung der Messwerte
hatte sich ein Abgleich über die durchschnittliche Signalstärke der gesamten Platte
als am zuverlässigsten für eine gute Reproduzierbarkeit erwiesen. Um mögliche
Verzerrungen beim Vergleich mehrerer ELISAs zu minimieren wurden die Seren
mehrerer verschiedener Patientengruppen gemeinsam in einem ELISA gemessen.
Ergebnisse
89
Dadurch sollte verhindert werden, dass natürlicherweise hohe Messwerte einer
Patientengruppe durch die Normalisierung wieder reduziert werden.
2.75
Messung 2
normalisierte Werte
2.50
2.25
2.00
1.75
1.50
1.25
1.00
0.75
0.50
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
2.00
2.25
2.50
Messung 1
normalisierte Werte
Abbildung 36: Vergleich zweier unabhängiger ELISA-Messungen mit denselben Proben.
R2 = 0,92
3.4.6
Lösliches
Cadherin-17
ist
erhöht
in
Seren
von
Patienten
mit
kolorektalen Karzinomen der Stadien UICC III und IV
Mit dem zuvor entwickelten ELISA wurde in Seren von 205 Patienten die Menge an
löslichem Cadherin-17 bestimmt. Die Seren von 67 Patienten mit negativer
Koloskopie wurden als Kontrolle in die Analyse aufgenommen. Die Gruppe mit
kolorektalen Karzinomen umfasste 62 Patienten der UICC-Stadien I bis IV. Um zu
überprüfen, ob entzündliche Darmerkrankungen (EDE) die sCadherin-17-Level im
Serum beeinflussen, wurden die Seren von 21 Patienten mit EDE ebenfalls im ELISA
gemessen. Bei Patienten mit FAP hatten wir zuvor erhöhte Mengen an sE-Cadherin
gefunden. Daher wurden auch in diese Analyse von sCadherin-17 in Serum 18
Patienten mit FAP einbezogen. Eine ektope Cadherin-17-Expression war unter
anderem bei Patienten mit Pankreas- und Magenkarzinomen beschrieben worden.
Ergebnisse
90
Aus diesem Grund wurden auch Seren von Patienten mit diesen Tumorentitäten
gemessen. In Tabelle 9 sind die Daten der einzelnen Patientengruppen
zusammengefasst.
Tabelle 9: Daten der Patienten, deren Seren im sCadherin-17-ELISA gemessen wurden. Die
Patienten mit kolorektalem Karzinom sind in Abhängigkeit von ihrem Tumorstadium noch
weiter unterteilt. Bei einer Patientin war das Tumorstadium unbekannt.
EDE: Entzündliche Darmerkranken; FAP: Familiäre adenomatöse Polyposis
Kategorie
Anzahl
Durchschnittliches Alter
Spanne
männlich
weiblich
Kontrolle
67
58
16-87
36
31
kolorektales Karzinom
62
69
45-89
40
22
UICC I
7
73
59-87
6
1
UICC II
12
65
45-86
8
4
UICC III
21
70
51-83
13
8
UICC IV
21
68
54-84
13
8
Magenkarzinom
19
64
38-83
10
9
Pankreaskarzinom
18
62
42-81
13
5
EDE
21
60
44-73
7
14
FAP
18
33
10-55
12
6
Abbildung 37 zeigt die Ergebnisse des ELISAs für Cadherin-17 mit den
verschiedenen Patientenseren. In den Seren der Patienten mit kolorektalem
Karzinom (colorectal Cancer, CRC) ist lösliches Cadherin-17 im Vergleich zur
Kontrollgruppe statistisch signifikant erhöht. Die Auftrennung der CRC-Gruppe in die
einzelnen UICC-Stadien zeigt, dass in höheren Stadien mehr lösliches Cadherin-17
in den Seren der Patienten gefunden werden kann. Statistisch signifikant ist der
Anstieg im Vergleich zu den Kontrollgruppen in den Stadien UICC III und IV. Bei
Patienten mit Magen- oder Pankreaskarzinom kann kein Anstieg der sCadherin-17Menge beobachtet werden. Auch die Patienten mit entzündlichen Darmerkrankungen
zeigen keinen Anstieg der sCadherin-17-Menge. In der Gruppe der Patienten mit
FAP ist der Median des sCadherin-17-Signales leicht erhöht. Dies ist auf zwei
Patienten mit sehr stark erhöhtem sCadherin-17-Level zurückzuführen. Von einem
dieser Patienten konnten wir noch eine weitere Serumprobe messen, die 14 Monate
nach der hier verwendeten Probe abgenommen wurde. Auch diese weist ein
Ergebnisse
91
sCadherin-17-Signal in derselben Höhe auf. Die erhöhten Werte scheinen also eine
Eigenschaft dieses Patienten zu sein, die mit den zur Verfügung stehenden
Informationen jedoch nicht erklärt werden konnte.
*
*
**
4
sCadherin-17
(relative Lumineszenz)
3
2
1
P
FA
E
ED
no
m
zi
ka
r
Pa
nk
re
as
en
M
ag
R
C
om
in
rz
ka
U
C
C
R
C
IV
IC
IC
U
U
C
R
C
C
C
C
IC
IC
U
C
R
III
II
I
C
C
R
C
C
K
on
tr
o
lle
0.5
Abbildung 37:Lösliches Cadherin-17 ist in Seren von Patienten mit kolorektalen Tumoren der
Stadien III und IV erhöht. Angegeben ist die relative Lumineszenz, die mit dem ELISA
ermittelt und anschließend normalisiert worden war. Die Gruppe mit kolorektalen Karzinomen
(colorectal cancer, CRC) ist einmal zusammengefasst dargestellt und einmal aufgeteilt nach
Tumorstadium. EDE: entzündliche Darmerkrankungen, FAP: familiäre adenomatöse
Polyposis. * p < 0,05; ** p < 0,005 jeweils in Bezug auf die Kontrollgruppe
Wir wollten überprüfen, ob durch eine Kombination der Biomarker eine Verbesserung
der Sensitivität oder Spezifität erreicht werden kann. Bei einem ELISA-Wert für
sCadherin-17 von 0,89 (relative Lumineszenz) war die Summe aus Sensitivität und
Spezifität für den Nachweis von kolorektalen Karzinomen maximal. Daher wurde
dieser Wert als cut-off für sCadherin-17 festgelegt. Der Vergleich von löslichem
Cadherin-17 und CEA zeigte, dass 15 der 25 CEA-negativen Patienten erhöhte
sCadherin-17-Level aufwiesen (vgl. Abbildung 38A). Durch die gemeinsame
Ergebnisse
92
Verwendung von sCadherin-17 und CEA kann die Sensitivität des Nachweises daher
auf 83 % gesteigert werden, wie bei sE-Cadherin reduziert sich dadurch jedoch die
Spezifität (vgl. Tabelle 10).
Tabelle 10: Die Sensitivität, Spezifität und Likelihood Ratio wurden mit GraphPad Prism
(GraphPad Software Inc., La Jolla, CA) für sCadherin-17, CEA und Kombinationen der
beiden Marker berechnet.
sCadherin-17
erhöht
CEA
erhöht
CEA oder sCadherin-17 CEA und sCadherin-17
erhöht
erhöht
Sensitivität
0,59
0,57
0,83
0,36
Spezifität
0,67
0,95
0,63
0,97
Likelihood Ratio
1,8
10,5
2,2
12,7
Abbildung 38B zeigt, dass die Serummengen an sE-Cadherin und sCadherin-17
nicht korrelieren. Zehn der 16 Patienten mit negativem sE-Cadherin-Wert weisen
einen erhöhten Wert für Cadherin-17 auf. Lösliches E-Cadherin ist in 7 von 13
sCadherin-17-negativen Seren erhöht. Die Kombination der drei Biomarker CEA,
sCadherin-17 und sE-Cadherin führte zu einer hohen Sensitivität von 97 % für den
Nachweis eines kolorektalen Karzinoms, wenn für die Diagnose nur einer der drei
Marker erhöhte Werte aufweisen muss. Dies führt allerdings zu einer reduzierten
Spezifität von 36 %.
Ergebnisse
93
A
10000
CEA [ng/ml]
1000
100
10
1
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
2.00
2.25
2.50
sCadherin-17
(relative Lumineszenz)
B
sE-Cadherin [ng/ml]
20000
15000
10000
5000
0
0.7
0.8
0.9
1.0
1.1
1.2
1.3
1.4
sCadherin-17
(relative Lumineszenz)
Abbildung 38: Vergleich der in den verschiedenen Seren gemessenen Werte für sCadherin17 mit den jeweiligen Konzentrationen an CEA und sE-Cadherin. Die Punkte repräsentieren
die CEA- und sCadherin-17-Werte (A) bzw. die sE-Cadherin- und sCadherin-17-Werte (B)
jeweils eines Patienten mit kolorektalem Karzinom.
Diskussion
4
94
Diskussion
In dieser Arbeit wurden die freigesetzten Ektodomänen der Transmembranproteine
E-Cadherin und Cadherin-17 untersucht. Dabei wurde zum einen untersucht, durch
welche Proteine das Ektodomänen-Shedding vermittelt und reguliert werden kann.
Ich beschreibe hier, dass das E-Cadherin-Shedding durch Smad4 reguliert wird und
zeige, dass die Proteasen Kallikrein-6 und ADAM10 am Smad4-abhängigen
Shedding von E-Cadherin beteiligt sind. Die Freisetzung von Cadherin-17 ist bisher
noch nicht beschrieben. Ich zeige hier, dass ADAM10 eine wichtige Protease für das
Ektodomänen-Shedding von Cadherin-17 ist. Zum anderen wurden die löslichen
Ektodomänen auf eine mögliche Verwendung als Serummarker hin untersucht. Dazu
wurden umfangreiche Serumsammlungen verwendet, in denen sE-Cadherin mit
einem kommerziell verfügbaren ELISA gemessen wurde. Für die Bestimmung von
sCadherin-17 wurde ein Sandwich-ELISA neu entwickelt.
4.1
Mechanismen und mögliche funktionelle Aspekte des EktodomänenSheddings von Cadherinen
4.1.1
E-Cadherin-Shedding als Smad4 regulierter Mechanismus
Ich konnte zeigen, dass die Freisetzung der Ektodomäne von E-Cadherin durch den
Tumorsuppressor Smad4 reguliert wird. Die Reexpression von Smad4 führt dabei zu
einer Reduktion des Sheddings von E-Cadherin. Dies erklärt, wie es zu erhöhten
Mengen an sE-Cadherin im Sekretom von Smad4-negativen Klonen kommen kann,
obwohl Smad4 als positiver Transkriptions-Regulator der E-Cadherin-Expression
wirken kann (Müller et al. 2002; Reinacher-Schick et al. 2004). Ich konnte zeigen,
dass die Proteasen Kallikrein-6 und ADAM10 an der Vermittlung des Smad4abhängigen E-Cadherin-Sheddings beteiligt sind.
Die Regulation der Zell-Adhäsion ist ein wichtiger Mechanismus der Embryogenese,
in der Zellen zum Teil weite Strecken wandern müssen, um sich schließlich zu
Organen und Geweben zu verbinden. Auch im erwachsenen Organismus ist die
dynamische Regulation von Epithelien wichtig. Unter physiologischen Bedingungen
erhalten Adhäsionsmoleküle die epitheliale Struktur aufrecht. Die Anpassung der
adhäsiven Eigenschaften kann beispielsweise auf Ebene der Transkription oder
Translation der beteiligten Proteine erfolgen. Weitere Möglichkeiten sind eine
veränderte Verteilung auf der Plasmamembran, Endocytose und Degradierung.
Diskussion
95
Darüber hinaus hat man festgestellt, dass viele Zelladhäsionsproteine auch in einer
löslichen Form vorkommen. Diese löslichen Formen können durch EktodomänenShedding freigesetzt werden.
Viele Karzinome zeigen einen reduzierten interzellulären Zusammenhalt aufgrund
reduzierter Cadherin-Expression (van Aken et al. 2001). Dorudi et al. zeigten
beispielsweise, dass 36 von 44 gut differenzierten Tumoren, aber nur 4 von 28
schlecht differenzierten Tumoren E-Cadherin positiv waren. Bei einer Einordnung
nach Dukes-Stadium waren 89% der Tumore der Stadien Dukes A und B und 19%
der Dukes C-Tumore positiv (Dorudi et al. 1993). Der Befund, dass ein Rückgang der
E-Cadherin-Expression mit einer reduzierten Tumordifferenzierung korreliert, wird
von weiteren Studien bestätigt (Birchmeier und Behrens 1994). Die E-CadherinExpression korreliert invers mit dem Differenzierungsgrad der Tumore. Ein Verlust
der E-Cadherin-Expression wirkt sich negativ auf die Prognose von Patienten mit
einem kolorektalen Karzinom aus (Ngan et al. 2007). Eine erhöhte Invasivität von
Tumorzellen ist mit einem Verlust der E-Cadherin-Funktion assoziiert. Die
E-Cadherin-Funktion kann auf verschiedenen Wegen inaktiviert werden. Die
möglichen Mechanismen umfassen: Mutation, epigenetisches Silencing, Endozytose
und die verstärkte Expression nicht epithelialer Cadherine (van Roy und Berx 2008).
Der Verlust des Tumorsuppressors E-Cadherin fällt mit dem Übergang vom gut
differenzierten Adenom zum invasiven Karzinom zusammen und wurde als der
geschwindigkeitsbestimmende Schritt bei der Progression vom Adenom zum
Karzinom beschrieben (Perl et al. 1998). Auch der Verlust des Tumorsuppressors
Smad4 ist ein spätes Ereignis im Prozess der Karzinogenese (Wilentz et al. 2000;
Lüttges et al. 2001). In guter Übereinstimmung damit wurde herausgefunden, dass
ein Smad4-Verlust häufig mit einem E-Cadherin-Verlust einhergeht und dass Smad4
als positiver Regulator der E-Cadherin-Expression fungiert (Müller et al. 2002;
Reinacher-Schick et al. 2004). Ich beschreibe hier, dass Smad4 die E-CadherinFunktion nicht nur über eine Expressionsregulation beeinflusst, sondern auch die
Abspaltung der extrazellulären Domänen regulieren kann. Dabei konnte ich zeigen,
dass in Smad4-negativen Klonen von Kolonkarzinomzelllinien mehr E-CadherinShedding stattfindet als in Smad4-reexprimierenden Klonen. Die Reexpression von
Smad4 in Smad4-negativen Karzinomzellen gilt als Modell für eine Reversion der
Karzinogenese. So führte beispielsweise die Reexpression von Smad4 in der
Kolonkarzinomzelllinie SW480 zu einer erhöhten E-Cadherin-Expression, stärkeren
Diskussion
96
Zell-Zell-Kontakten und einer morphologischen Reversion der Zellen (Müller et al.
2002). Im Unterschied zu den SW480-Zellen exprimieren die in dieser Arbeit
verwendeten Zelllinien (SW620, HT-29) E-Cadherin, obwohl sie wie die Zelllinie
SW480 Smad4-negativ sind. Entsprechend führte auch die Reexpression von Smad4
nicht in allen Fällen zu einer Induktion der E-Cadherin-Expression. Bei der Zelllinie
SW620 wurden in den Smad4-reexprimierenden Klonen zwei Untergruppen definiert,
die eine zeigt eine Induktion der E-Cadherin-Expression (Klone DTJ 2, 20, 21), die
andere jedoch nicht (Klone DTJ 5, 8, 16). Hanna Diehl konnte in ihrer Doktorarbeit
zeigen, dass die höhere E-Cadherin-Expression mit einer epithelialeren Morphologie
der Zellen korreliert. In der vorliegenden Arbeit zeige ich, dass unabhängig vom
Level der E-Cadherin-Expression in den Smad4-negativen Klonen mehr E-CadherinShedding stattfindet. Dieser Effekt konnte in den untersuchten Klonen der Zelllinien
HT-29 und SW620 beobachtet werden. Die Smad4-Abhängigkeit des E-CadherinSheddings wurde dadurch weiter unterstützt, dass mit einer Reduktion der Menge an
Smad4, die bei Kultivierung der Klone der Zelllinie SW620 über mehrere Passagen
auftritt, das E-Cadherin-Shedding ansteigt.
Unklar ist, ob das durch den Smad4-Verlust verstärkte Ektodomänen-Shedding nur
zur direkten Regulation der E-Cadherin-vermittelten Adhäsion dient, oder ob die
löslichen Domänen möglicherweise auch eine Funktion erfüllen können. Lösliche
Cadherin-Fragmente können als Pseudoliganden an andere, membrangebundene
Cadherine binden und so die Cadherin-Interaktionen zur Ausbildung von Zell-ZellKontakten verhindern (vgl. Abbildung 39). Damit könnte die Invasion von
Tumorzellen in umliegendes Gewebe erleichtert werden. In in vitro Modellen konnte
gezeigt werden, dass lösliches E-Cadherin die Invasion von Karzinomzelllinien
tatsächlich erhöht (Nawrocki-Raby et al. 2003; Johnson et al. 2007). Dabei ist es die
lösliche Ektodomäne, die über ihre Wirkung als Pseudoligand oder als Stimulator von
Signalwegen die invasiven Eigenschaften der Zellen erhöht (Noë et al. 2001). Naji et
al. beschreiben, dass lösliches E-Cadherin an die Rezeptoren Her2 und Her3 binden
kann. Dadurch wird die Heterodimerisierung von Her2 mit Her3 stabilisiert und der
ERK-Signalweg stimuliert (Najy et al. 2008). Das würde bedeuten, dass lösliches
E-Cadherin direkt die Proliferation und Migration von Karzinomzellen beeinflussen
kann und nicht nur die Zellverbindungen im umliegenden Gewebe auflöst.
Ektodomänen-Shedding
wäre
somit
ein
Mechanismus,
mit
dem
der
Tumorsuppressor E-Cadherin in ein onkogenes Protein sE-Cadherin umgewandelt
Diskussion
97
wird. Dass Smad4 wiederum diesen transformierenden Effekt unterdrückt, passt mit
seinem Status als Tumorsuppressor überein.
I1
D
I1
2
2
3
3
Abbildung 39: Schematische Übersicht über die möglichen Wirkungen und Ursprünge von
löslichen Adhäsionsproteinen. A) Die funktionellen transmembranären Proteine binden an
andere Zelladhäsionsproteine auf benachbarten Zellen. B) Eine Möglichkeit der Freisetzung
von löslichen Domänen ist alternatives Spleißen, was jedoch bei den in dieser Arbeit
untersuchten Cadherinen E-Cadherin und Cadherin-17 keine Rolle zu spielen scheint. C)
Das Shedding der Adhäsionsproteine kann entweder durch lösliche oder membranständige
Proteasen vermittelt werden. D) Die löslichen Ektodomänen können entweder an andere
lösliche Ektodomänen binden oder an Zelladhäsionsproteine auf derselben (autokrin) oder
benachbarten (parakrin) Zelle binden. Diese Kompetition zwischen membrangebundenen
und löslichen Cadherinen kann die Zell-Adhäsion reduzieren (1-3). Reduzierte Darstellung
aus van Kilsdonk et al. (2010) mit der Erlaubnis von Elsevier.
Eine weitere Auswirkung des Ektodomänen-Sheddings ist die Freisetzung von
β-Catenin
aus
den
Adherens
Junctions.
β-Catenin
ist
sowohl
an
der
kalziumabhängigen interzellulären Adhäsion beteiligt, als auch an der über den wntSignalweg vermittelten Genexpression. In Tumoren sind diese Funktionen häufig
dereguliert. Bei der E-Cadherin-vermittelten Zelladhäsion bindet β-Catenin an den
zytoplasmatischen Teil von E-Cadherin. Anschließend bindet β-Catenin über
α-Catenin an das Aktin-Zytoskelett. Zusätzlich ist β-Catenin ein wichtiger Regulator
der Proliferation. Ungebundenes zytosolisches β-Catenin kann in den Zellkern
Diskussion
98
gelangen und dort mit Proteinen der TCF/LEF (T cell factor/ lymphocyte enhancerbinding factor) Familie die Genexpression beeinflussen. Freies zytosolisches βCatenin wird durch einen APC enthaltenden Proteinkomplex abgebaut, der über den
wnt-Signalweg reguliert ist.
Während lange Zeit davon ausgegangen wurde, dass E-Cadherin-gebundenes und
freies β-Catenin im wnt-Signalweg separate Pools darstellen, zeigen neuere
Ergebnisse, dass doch ein Austausch stattfindet (Kam und Quaranta 2009). Offenbar
ist das E-Cadherin-Shedding ein Mechanismus, mit dem gebundenes β-Catenin in
freies überführt wird (Zheng et al. 2009) und somit die Expression nachgeschalteter
Gene beeinflusst (Maretzky et al. 2005). Dass auch der Verlust von Smad4 in der
Karzinogenese sich auf diese Art auswirkt, erscheint wahrscheinlich, muss aber in
weiteren Experimenten untersucht werden. Somit kann man spekulieren, dass der
Verlust des Tumorsuppressors Smad4 nicht nur eine reduzierte interzelluläre
Adhäsivität über den Verlust der E-Cadherin-Funktion vermittelt, sondern damit
gleichzeitig auch eine verstärkte Proliferation über die Akkumulation von freiem
β-Catenin verursacht. Eine Hochregulation der β-Catenin-abhängigen Transkription
findet man in vielen kolorektalen Tumoren, so findet man beispielsweise bei 57 % der
Patienten eine Mutation im APC-Gen (Traverso et al. 2002), wodurch der Abbau von
β-Catenin
inhibiert
wird.
Eine
Verstärkung
der
β-Catenin-vermittelten,
proliferierenden Effekte ist also ein verbreiteter Mechanismus in kolorektalen
Karzinomen und könnte durch das erhöhte E-Cadherin-Shedding noch verstärkt
werden.
4.1.2
Beteiligung von ADAM10 und Kallikrein-6 am Smad4-abhängigen
Shedding
Die Mechanismen der Smad4-abhängigen Regulation des E-Cadherin-Sheddings
sind nicht vollständig geklärt. Vermutlich ist eine Vielzahl an Proteinen beteiligt, über
die der Tumorsuppressor Smad4 das Ektodomänen-Shedding reguliert. Ein Protein,
dessen Mitwirkung uns wahrscheinlich erschien, ist das Kallikrein-6. In den
vorangegangenen Dissertationen von Martin Volmer und Hanna Diehl konnte gezeigt
werden, dass Kallikrein-6 in den Sekretomen Smad4-positiver Zellklone reduziert ist.
Außerdem beschreiben Klucky et al., dass Kallikrein-6 das E-Cadherin-Shedding
induziert (Klucky et al. 2007). Ich konnte in den Klonen der Zelllinien SW620 und
HT-29 bestätigen, dass Kallikrein-6 in den Sekretomen Smad4-positiver Klone
Diskussion
99
reduziert ist, während kein Smad4-Effekt auf die Transkription gefunden wurde. Es
scheint also einen Smad4-abhängigen Unterschied in der Freisetzung von Kallikrein6 zu geben. Kallikreine sind Serinproteasen, die an vielen physiologischen und
pathologischen Prozessen beteiligt sind. Sie wirken entweder allein oder als Teil von
Proteasekaskaden. Sie werden als inaktive Zymogene sekretiert. Es konnte gezeigt
werden, dass Kallikreine an der Tumorprogression beteiligt sind und als Biomarker
für verschiedene Tumore verwendet werden können (Borgoño und Diamandis 2004).
Der bekannteste Vertreter der Kallikrein-Familie ist das Kallikrein-3, welches unter
dem Namen prostate specific antigen (PSA) als Marker für Prostatakarzinome
klinisch
genutzt
wird.
Kallikrein-6
wurde
insbesondere
als
Marker
für
Ovarialkarzinome beschrieben (Diamandis et al. 2003).
Kallikrein-6 scheint nicht direkt das E-Cadherin-Shedding zu vermitteln, sondern
andere Proteasen zu aktivieren. Eine Hypothese lautete, dass Kallikrein-6 ADAM10
aktiviert, welches dann in der Lage ist, die Ektodomäne von E-Cadherin abzuspalten
(Klucky et al. 2007). ADAM10 ist als wichtige Protease für das E-Cadherin-Shedding
umfangreich untersucht (Maretzky et al. 2005). Auch diesen Zusammenhang wollte
ich in unseren Zellmodellen überprüfen. ADAM10 ist ein Transmembranprotein, das
andere Zelloberflächenproteine spaltet. Wir konnten jedoch auch große Mengen von
ADAM10 im Sekretom nachweisen. Hanna Diehl konnte bei einem Vergleich von
Sekretom und Exosomen der Zelllinie LT97 zeigen, dass ADAM10 in Exosomen
angereichert ist. Diesen Befund konnte ich mit Western Blot bestätigen und zeigen,
dass auch von SW620-Zellen ADAM10 über Exosomen freigesetzt wird. Die
exosomale Freisetzung von ADAM10 wurde bereits von anderen Arbeitsgruppen
beschrieben (Keller et al. 2009). Exosomen sind circa 40 – 100 nm große
Membranvesikel. Sie bilden sich durch Einstülpung der Membran später Endosomen
und reichern sich in multivesikular bodies (MVB) an. Wenn diese mit der
Plasmamembran fusionieren, werden die Exosomen freigesetzt. Dass Exosomen als
Plattform für das Shedding von Transmembranproteinen dienen können, ist bekannt
(Stoeck et al. 2006). Wir konnten jedoch keine direkten Hinweise dafür finden, dass
das E-Cadherin-Shedding auf den Exosomen stattfindet, da das intrazelluläre
Fragment von E-Cadherin in den Exosomen nicht nachweisbar war (Daten nicht
gezeigt).
Wir konnten zeigen, dass Smad4-negative Klone mehr aktives ADAM10 enthalten
und zwar in Sekretom und Lysat. Um zu klären, ob ein Zusammenhang zwischen der
Diskussion
100
erhöhten Menge aktivem ADAM10 und Kallikrein-6 im Sekretom besteht, habe ich
einen Kallikrein-6-Knockdown durchgeführt. Dieser führte tendenziell zu einer
Reduktion der Menge von aktivem ADAM10 und auch von sE-Cadherin im Sekretom.
Es erscheint uns daher wahrscheinlich, dass auch in unseren Modellen der von
Klucky et al. vorgeschlagene Mechanismus der ADAM10-Aktivierung durch
Kallikrein-6 bei der Vermittlung des Smad4-abhängigen E-Cadherin-Sheddings eine
Rolle spielt. Unklar ist noch, wo die beteiligten Proteine zusammentreffen und
–wirken können. Außer der extrazellulären Aktivität könnte man als Wirkort die MVBs
vermuten. Kallikreine sind bislang jedoch noch nicht in MVBs oder endosomalen
Kompartimenten nachgewiesen worden.
E-Cadherin wird wie andere Transmembranproteine endozytiert (D'Souza-Schorey
2005; Yap et al. 2007) und kann anschließend entweder abgebaut oder über den
endosomalen Weg recycelt werden (Yap et al. 2007). Dieses Recycling von
E-Cadherin könnte einen Mechanismus für die dynamische Regulation der
E-Cadherin-Expression an der Zelloberfläche und damit der Zell-Zelladhäsion
darstellen (van Roy und Berx 2008). Ektodomänen-Shedding kann auch in späten
Endosomen, in MVBs stattfinden (vgl. Abbildung 40). Für die Transmembranproteine
L1 und CD44 wurde ein Shedding durch ADAM10 in MVBs gezeigt (Gutwein et al.
2003; Stoeck et al. 2006). Dass die Sekretion von Exosomen und das ADAMvermittelte Shedding zusammenhängende Mechanismen sind, wird auch dadurch
unterstützt, dass Stimuli, die Ektodomänen-Shedding vermitteln (wie z.B. KalziumEinstrom und Metallprotease-Aktivatoren) auch als Stimulatoren der Exosomen
Freisetzung wirken (Stoeck et al. 2006).
Diskussion
101
Abbildung 40: Exosomen können eine Plattform für das ADAM10 vermittelte EktodomänenShedding sein. A) Die Spaltung von Transmembranproteinen wie E-Cadherin kann an der
Zelloberfläche stattfinden. Nach Endozytose können die Transmembranproteine in
Endosomen gelangen. Ebenso können Proteine aus dem Golgi-Apparat oder dem
Transgolgi-Netzwerk (TGN) in die Endosomen gelangen. B) In späten Endosomen bilden
sich durch Einstülpung der Membran die MVBs. Dort kann ein Shedding der
Transmembranproteine stattfinden. Durch Fusion mit der Plasmamembran wird der Inhalt
der MVBs freigesetzt. Darstellung aus Keller et al. (2006) mit der Erlaubnis von Elsevier.
Der Smad4-Verlust führt zu einer verstärkten Freisetzung von Kallikrein-6, beeinflusst
jedoch offenbar nicht die Expression. Es müssen also noch weitere Proteine beteiligt
sein, die die Smad4-abhängige Freisetzung von Kallikrein-6 vermitteln. Über welche
weiteren Mechanismen Smad4 das verstärkte E-Cadherin-Shedding reguliert, ist
noch nicht verstanden. Eine Caveolin-1-vermittelte Freisetzung von Kallikrein-6 ist
von Henkhaus et al. in Kolonkarzinomzelllinien beschrieben worden. Wir haben die
Beteiligung von Caveolin-1 untersucht, konnten jedoch keine Hinweise auf eine
Beteiligung dieses Proteins finden. In unseren Zellen führte ein siRNA-vermittelterKnockdown von Caveolin-1 nicht zu Unterschieden in der Kallikrein-6-Freisetzung
(Daten nicht gezeigt). Möglicherweise war der Knockdown mit den von uns
verwendeten siRNAs nicht ausreichend, so dass das verbleibende Caveolin-1 für
eine effiziente Kallikrein-6-Freisetzung ausreichte.
Diskussion
102
Die verstärkte Freisetzung der Proteasen Kallikrein-6 und ADAM10, die wir in
unseren in vitro Modellen gefunden haben, steht in Übereinstimmung mit der
allgemeinen Beobachtung, dass Tumore eine erhöhte proteolytische Aktivität
aufweisen. Wie oben schon beschrieben, sind Kallikreine an der Tumorprogression
beteiligt und werden aufgrund ihrer verstärkten Freisetzung auch als Tumormarker
vorgeschlagen und eingesetzt. Auch den ADAMs wird aufgrund ihrer Fähigkeit,
Signalwege
und
Zelladhäsion
schnell
zu
verändern,
eine
Beteiligung
an
Tumorprogression und Metastasierung zugesprochen (Murphy 2008; Saftig und
Reiss 2010). Das Ergebnis, dass Smad4 bei der Regulation der Freisetzung dieser
Proteasen
eine
Rolle
spielt,
bestätigt
auch
die früheren Ergebnisse
der
Arbeitsgruppe, dass Smad4 seine tumorsupprimierende Wirkung insbesondere auch
über freigesetzte Proteine vermittelt.
4.1.3
Lösliches Cadherin-17 wird durch ADAM10 freigesetzt
Unter physiologischen Bedingungen wird Cadherin-17 nur im Darmepithel exprimiert.
Cadherin-17 kann wie E-Cadherin an der basolateralen Membran des intestinalen
Epithels Zell-Zell-Kontakte vermitteln. Die Regulation und die physiologische
Relevanz dieser Kontakte sind jedoch noch nicht verstanden. Cadherin-17 ist nicht in
Adherens Junctions akkumuliert, sondern offenbar frei über die basolaterale
Membran verteilt. Interaktionspartner von Cadherin-17 sind nicht bekannt, Cadherin17 kann jedoch heterotypische trans-Interaktionen mit E-Cadherin ausbilden
(Wendeler et al. 2007; Baumgartner et al. 2008). Cadherin-17 interagiert offenbar
nicht mit Cateninen (Kreft et al. 1997).
Für fast alle Tumorentitäten des Gastrointestinaltraktes wurde eine ektope
Cadherin-17-Expression beschrieben. Auch die Funktion von Cadherin-17 in
Tumoren ist unklar. Die ektope Expression lässt vermuten, dass Cadherin-17 dort
onkogene Eigenschaften haben könnte, was durch in vitro Versuche und Xenograft
Modelle in Nacktmäusen bestätigt werden konnte (Liu et al. 2009; Liu et al. 2010;
Zhang et al. 2010). In kolorektalen Tumoren wurde von zwei Gruppen eine reduzierte
Expression von Cadherin-17 beschrieben. Bei diesen Arbeiten wurde jedoch eine
positive Färbung von weniger als 90 % der Tumorzellen bereits als „negativ“ gewertet
(Takamura et al. 2004; Kwak et al. 2007). Eigene Arbeiten der Arbeitsgruppe sowie
umfangreiche Analysen anderer Gruppen mit einer detaillierteren Auswertung der
Expression zeigen hingegen, dass die Expression von Cadherin-17 in fast allen
Diskussion
103
kolorektalen Karzinomen und deren Metastasen erhalten bleibt (Reinhard Gessner,
persönliche Mitteilung; Hinoi et al. 2002; Su et al. 2008).
Hanna Diehl hat in ihrer Doktorarbeit Cadherin-17 als abundantes Protein im
Sekretom beschrieben. Ich konnte in meiner Masterarbeit zeigen, dass Cadherin-17
durch Ektodomänen-Shedding freigesetzt wird. Die Freisetzung von sCadherin-17 ist
bisher noch nicht beschrieben worden. Wir konnten zeigen, dass ADAM10 eine
wichtige Protease für das Shedding von Cadherin-17 ist. Dazu haben wir ADAM10
mit chemischen Inhibitoren gehemmt und konnten dabei eine deutliche Reduktion
der Menge an löslichem Cadherin-17 im Sekretom finden. Zusätzlich haben wir in
einem weiteren Experiment einen siRNA-vermittelten Knockdown von ADAM10
durchgeführt und konnten bestätigen, dass die Effekte tatsächlich auf ADAM10
zurückzuführen sind.
Die Expression von ADAM10 in kolorektalen Karzinomen ist bisher nur wenig
untersucht. Gavert et al. beschreiben eine verstärkte Expression von ADAM10 an der
invasiven Front von kolorektalen Karzinomen (Gavert et al. 2005). Unsere
Ergebnisse zeigen, dass ADAM10 in kolorektalen Tumoren höher exprimiert ist. Die
Western Blot-Analyse aus kryokonservierten Gewebeproben ergab ein deutlicheres
Signal für ADAM10 in den Tumorproben im Vergleich zum korrespondierenden
Normalgewebe. Dieses Ergebnis konnte mit immunhistochemischen Färbungen von
Tumoren bestätigt werden.
Cadherin-17 wird an der basolateralen Membran des intestinalen Epithels exprimiert.
Unter der Annahme, dass die Freisetzung von löslichem Cadherin-17 durch
extrazelluläres Shedding von Cadherin-17 geschieht, würde man auch eine
basolaterale Freisetzung von sCadherin-17 erwarten. Durch die Barriere der Tight
junctions sollten basolateral gespaltene Proteine nicht in das apikale Kompartiment
gelangen können. Dies konnte ich mit Hilfe eines in vitro Assays bestätigen. Dabei
konnte ich zeigen, dass die löslichen Formen der basolateral exprimierten Cadherine
E-Cadherin und Cadherin-17 von der in vitro polarisierenden Zelllinie LT97
basolateral freigesetzt werden. ADAM10 wird auch zur basolateralen Membran
sortiert (Wild-Bode et al. 2006). Wir konnten zeigen, dass ADAM10 in großen
Mengen über Exosomen freigesetzt wird. Auch diesen Befund haben wir in diesem
Assay überprüft und konnten zeigen, dass auch ADAM10 basolateral freigesetzt
wird. Diese Freisetzung korreliert mit etablierten Exosomenmarkern, so dass man
Diskussion
104
auch hier von einer exosomalen Freisetzung von ADAM10 ausgehen kann.
Möglicherweise wird auch Cadherin-17 zum Teil über Exosomen freigesetzt. Wir
konnten Cadherin-17 in Exosomen mit Massenspektrometrie und Western Blot
nachweisen (Diehl 2008 und eigene, nicht gezeigte Daten). Cadherin-17 ist jedoch
nicht in Exosomen angereichert, der größere Anteil an sCadherin-17 im Sekretom ist
außerhalb von Exosomen nachzuweisen. Mathivanan et al. haben Cadherin-17 in
Exosomen nachgewiesen, die über den etablierten Exosomenmarker A33 mit
Immunaffinität angereichert worden waren (Mathivanan et al. 2010). Dies könnte
darauf hindeuten, dass auch Cadherin-17 über den in Abbildung 40 gezeigten Weg
in MVBs gelangen kann. ADAM10 wird basolateral wahrscheinlich über Exosomen
freigesetzt. Auch lösliches Cadherin-17 wird basolateral freigesetzt. Cadherin-17
könnte daher wie E-Cadherin endozytiert werden und analog zu Abbildung 40 in
MVBs gesheddet werden. Das dabei abgespaltene sCadherin-17 wird dann bei der
Fusion der MVBs mit der Plasmamembran freigesetzt, wobei noch ein geringer Anteil
intaktes Cadherin-17 über Exosomen freigesetzt wird.
4.2
Mögliche Verwendung von Ektodomänen als Serummarker
Die Möglichkeit, einen Tumor durch einen einfachen Bluttest nachweisen zu können,
ist
schon
lange
das
Ziel
medizinischer
Forschung.
Die
Diagnose
von
Tumorerkrankungen, idealerweise im Rahmen von umfangreichen ScreeningProgrammen, erfordert eine sehr hohe Sensitivität und Spezifität. Serummarker sind
für diese Anwendung noch nicht in der klinischen Anwendung, da diese
Anforderungen bisher nicht erfüllt werden können. Die Koloskopie bietet die
Möglichkeit, Darmtumore sicher zu erkennen. Sie wird daher als Screening- Methode
in Deutschland ab einem Alter von 55 Jahren angeboten. Koloskopie hat eine
Sensitivität von 97 % und eine Spezifität von 98 % (Davies et al. 2005). Die
Koloskopie ist jedoch vergleichsweise teuer, benötigt hochqualifiziertes Personal, ist
außerdem invasiv und es besteht eine geringe Gefahr von Komplikationen (Davies et
al. 2005). Aufgrund der von Vielen als unangenehm empfundenen Prozedur ist die
Teilnahme an den Screeningprogrammen gering (Ang et al. 2011). Da jedoch mit
Hilfe der Koloskopie frühe Stadien der kolorektalen Karzinogenese eindeutig
nachweisbar und chirurgisch effektiv zu entfernen sind, bietet sie die Möglichkeit über
alternative, zum Beispiel Serum-basierte, Screening-Ansätze angezeigte Adenome
oder Karzinome nachzuweisen und gegebenenfalls zu entfernen. Daher ist die
Diskussion
Suche
nach
105
Serummarkern
für
das
kolorektale
Karzinom
ein
besonders
vielversprechender Ansatz.
Der Nachweis von Serummarkern ist vergleichsweise kostengünstig, in der klinischen
Routine leicht durchzuführen und nur minimal invasiv. Jedoch sind bisher keine
Marker gefunden worden, die eine ausreichende Sensitivität und Spezifität
aufweisen. Möglicherweise bietet sich die Möglichkeit, die Vorteile der beiden
Verfahren zu kombinieren. So könnte ein Nachweis von Serummarkern mit hoher
Sensitivität die Möglichkeit bieten, die untersuchten Personen in eine sicher
tumorfreie Gruppe und eine Gruppe mit erhöhtem Risiko zu unterteilen. Der RisikoGruppe müsste eine Folgekoloskopie nachhaltig empfohlen werden. Die lange
weitgehend erfolglose Suche nach einzelnen Serummarkern mit hoher Sensitivität
und Spezifität hat zu der Einschätzung geführt, dass ein einzelner Marker
wahrscheinlich nicht in der Lage ist die Anforderungen für einen diagnostischen
Nachweis zu erfüllen. Ursache und Erklärung hierfür können die Heterogenität der
Patienten und der Tumore sein. Aus diesem Grund werden zunehmend
Kombinationen von Markern untersucht, die bessere Ergebnisse liefern als dies
bisher von einzelnen Marker berichtet wurde (Wild et al. 2010).
Zur Identifizierung von neuen Serummarker-Kandidaten werden üblicherweise zwei
Ansätze verfolgt. Die modernen Proteomics-Methoden bieten die Möglichkeit,
potentielle Marker direkt aus Serum nachzuweisen. Man schätzt, dass das
menschliche
Blut
circa
100.000
unterschiedliche
Proteine
enthält,
deren
Konzentrationsbereich sich über 10 – 12 Größenordnungen erstreckt. Die 20
häufigsten Serumproteine machen dabei circa 99 % der gesamten Proteinmasse aus
und erschweren damit den Nachweis der gering konzentrierten Proteine (Anderson
und Anderson 2002). Aufgrund dieser technischen Einschränkung können potentielle
Biomarker-Kandidaten, die unter den gering konzentrierten Proteinen erwartet
werden, möglicherweise nicht detektiert werden. Aus diesem Grund haben wir und
andere Arbeitsgruppen eine weniger komplexe Quelle für die erste Phase der
Identifizierung von potentiellen Biomarkern ausgewählt, nämlich konditionierte
Medien von kultivierten Karzinomzelllinien. Diese gelten als ein vielversprechendes
Modell für die Identifizierung von Serummarkern. Die Grundlage des SekretomAnsatzes zur Identifizierung von potentiellen Biomarkern ist, dass wir davon
ausgehen, dass in vitro freigesetzte Proteine zumindest zum Teil den in vivo
freigesetzten Proteinen entsprechen und in Serum nachweisbar sein könnten.
Diskussion
106
Wie wir und Andere zeigen konnten, enthält das Sekretom Proteine, die auf
verschiedenen Wegen freigesetzt werden. Neben der klassischen Sekretion, über die
zum Beispiel die Kallikreine freigesetzt werden, enthält das Sekretom auch die
abgespaltenen Ektodomänen von Transmembranproteinen wie den Cadherinen.
Dabei wurden erstaunlich große Mengen an löslichen Cadherinen gefunden. Wir
vermuten, dass die abgespaltenen Ektodomänen zu den meistversprechenden
Markern gehören. Sie sind offenbar sehr stabil und könnten sich als Indikatoren einer
erhöhten tumorspezifischen proteolytischen Aktivität im Serum anreichern.
4.2.1
Lösliches E-Cadherin in Serum
Wir konnten zeigen, dass lösliches E-Cadherin in großen Mengen von kultivierten
Karzinomzellen freigesetzt wird (Diehl et al. 2007). Um die Verwendbarkeit von
löslichem
E-Cadherin
als
Biomarker
zu
überprüfen,
habe
ich
E-Cadherin in Gewebe und Serum nachgewiesen und untersucht. Wir konnten
zeigen, dass das Transmembranprotein E-Cadherin in Zellkultur und isoliertem
Gewebe zu einer offenbar sehr stabilen 80 kDa großen löslichen Form prozessiert
wird. Lösliches E-Cadherin ist in frisch konserviertem Tumorgewebe nur in sehr
geringen Mengen nachweisbar. Dies könnte darauf hin deuten, dass lösliches
E-Cadherin über den Blutkreislauf rasch abtransportiert wird.
Die Konzentrationen an löslichem E-Cadherin sind mit im Mittel 5 µg/ml bereits in
Serumproben der Kontrollgruppen sehr hoch. Dies zeigt, dass E-Cadherin schon
unter physiologischen Bedingungen in großen Mengen in den Blutkreislauf gelangt.
Ursachen dafür könnten die ubiquitäre Expression von E-Cadherin in praktisch allen
Epithelien und der schnelle Umsatz von Epithelien sein, der eine häufige Auflösung
von Zell-Zell-Kontakten erfordert. Die mittleren Konzentrationen von 5 µg/ml in den
Kontrollgruppen entsprechen einer Gesamtproteinmenge von ca. 25 mg sE-Cadherin
im Blut einer Person. Dies verdeutlich, dass große Mengen sE-Cadherin zusätzlich
freigesetzt werden müssen, um einen signifikanten Anstieg bei Tumorpatienten
messen zu können. Daher ist es nicht überraschend, dass bei Patienten mit
prämalignen
Vorstufen
und
Karzinomen
früher
Stadien
kein
Anstieg
der
Konzentration an löslichem E-Cadherin zu beobachten ist, da es sich hierbei jeweils
um lokal begrenzte Erkrankungen handelt. Bei Patienten mit fortgeschrittenen
kolorektalen Karzinomen der Stadien UICC III und IV ist die Menge an löslichem ECadherin statistisch signifikant erhöht. In den Kontroll-Gruppen sowie den Patienten
Diskussion
107
mit entzündlichen Darmerkrankungen, Polypen oder Tumoren des Stadiums UICC II
konnte keine Erhöhung der Menge an löslichem E-Cadherin gefunden werden.
Erhöhte
proteolytische
Aktivität
und
der
E-Cadherin-Funktionsverlust
sind
Eigenschaften von invasiven und metastasierenden Tumoren. Die erhöhten
sE-Cadherin Serumlevel bei Patienten mit fortgeschrittenem kolorektalem Karzinom
könnten daher das Shedding von E-Cadherin als Inaktivierungsmechanismus
widerspiegeln. In dem Fall sind die erhöhten Serumlevel von sE-Cadherin ein
Indikator für erhöhte proteolytische Aktivität der Tumore. Die Beobachtung, dass die
sE-Cadherin-Level bei Patienten mit metastasierten Tumoren erhöht sind, lässt
vermuten, dass möglicherweise auch Shedding in den Metastasen zu einem
erhöhtem Serumlevel führt, oder dass erhöhtes Shedding im Primärtumor die
Metastasierung begünstigen könnte. Der Verlust der E-Cadherin-vermittelten
Zelladhäsion ist vielfach mit einem erhöhten metastatischen Potential in Verbindung
gebracht worden. So konnte zum Beispiel gezeigt werden, dass der Verlust der
E-Cadherin-Expression
in
Primärtumoren
mit
dem
Auftreten
von
Lymphknotenmetastasen korreliert (Karamitopoulou et al. 2011).
Lösliches E-Cadherin ist als Marker für Screening-Anwendungen nicht geeignet.
Meine Daten zeigen jedoch, dass lösliches E-Cadherin möglicherweise als Marker für
die Überwachung von Patienten in Frage kommen kann. Die Bestimmung eines
Serummarkers ermöglicht zum einen, das Ansprechen von Tumoren auf eine
Therapie zu beurteilen. Zum anderen könnten hierüber in der Nachbeobachtung von
Patienten nach erfolgreicher Therapie mögliche Rezidive frühzeitig erkannt werden.
Die Nachbeobachtung und die Detektion von Rezidiven und Metastasen sind die
Anwendungsmöglichkeiten, für die Serummarker bereits eingesetzt werden. Beim
kolorektalen Karzinom sind umfangreiche Erfahrungen mit der Messung von CEA in
der Nachbeobachtung gesammelt worden. Es konnte gezeigt werden, dass die
intensive Nachbeobachtung von Patienten mit kolorektalem Karzinom die Prognose
der Patienten verbessert und gesundheitsökonomisch gesehen kosteneffizient ist
(Graham et al. 1998; Renehan et al. 2004). Während ein Anstieg der CEA-Level in
der Nachbeobachtung mit hoher Wahrscheinlichkeit ein Rezidiv anzeigt, sind
normale CEA-Level nicht geeignet, ein Rezidiv auszuschließen (Hara et al. 2008).
Die Messung von CEA allein reicht also für die Nachbeobachtung nicht aus.
Diskussion
108
In dieser Arbeit konnte ich zeigen, dass auch der Serumlevel des Markers
sE-Cadherin den individuellen Krankheitsverlauf widerspiegelt. Möglicherweise kann
die zusätzliche Bestimmung von löslichem E-Cadherin also die Sensitivität für die
Detektion von Rezidiven während der Nachbeobachtung erhöhen. Außerdem ist ein
signifikanter Anteil der Patienten mit kolorektalem Karzinom bei Diagnose CEA
negativ und damit für eine Nachbeobachtung mit diesem Marker nicht geeignet. In
dem in dieser Arbeit verwendeten Kollektiv an Patienten mit kolorektalem Karzinom
wiesen 37,5 % CEA-Level auf, die unter dem Cut-off-Wert von 5 ng/ml liegen. Ich
habe in einem Vergleich der Konzentrationen von CEA und sE-Cadherin bei den
Patienten mit kolorektalem Karzinom herausgefunden, dass circa die Hälfte dieser
CEA-negativen Patienten über die Bestimmung von sE-Cadherin überwacht werden
könnte. Diese Ergebnisse müssen an einer größeren Anzahl von Patienten überprüft
werden.
Lösliches E-Cadherin im Serum von Patienten mit kolorektalem Karzinom wurde
bisher von zwei Arbeitsgruppen bestimmt. Velikova et al. beschreiben auch einen
Anstieg der Serumlevel bei Patienten mit metastasierten Tumoren (Dukes C und D),
der jedoch im Unterschied zu unseren Ergebnissen nicht statistisch signifikant war.
Dies ist vermutlich auf die deutlich geringere Anzahl an Patienten im Vergleich zu
unserer Studie zurückzuführen. In Übereinstimmung mit unseren Ergebnissen
beschreiben die Autoren, dass die Serumlevel von lokal begrenzten Tumoren nicht
erhöht sind (Velikova et al. 1998). Wilmanns et al. beschreiben einen Anstieg des
Serumlevels bei Patienten mit kolorektalen Tumoren und schlagen die Verwendung
von löslichem E-Cadherin als Marker für Tumorprogression vor (Wilmanns et al.
2004).
Wie oben bereits beschrieben, kommt es bei kolorektalen Karzinomen wie bei vielen
anderen Karzinomen zu einem Verlust der Membranexpression von E-Cadherin.
Gleichzeitig finden wir und andere erhöhte Serumlevel von sE-Cadherin bei
Patienten mit kolorektalen und anderen Tumoren. Welche Mechanismen die
unterschiedlichen Serumlevel vermitteln, ist unklar. Um zu überprüfen, ob erhöhte
Serumlevel der löslichen Form von E-Cadherin mit erhaltener oder reduzierter
Membranexpression von E-Cadherin im Tumor assoziiert sind, haben wir eine
immunhistochemische Färbung von E-Cadherin in Tumorgewebe von Patienten mit
bekanntem sE-Cadherin-Level im Serum durchgeführt. Insgesamt waren 15 Gewebe
verfügbar. In dieser Auswahl konnte keine Korrelation der E-Cadherin-Expression in
Diskussion
109
Tumoren und den sE-Cadherin Serumlevel festgestellt werden. Dies zeigt, dass eine
starke Membranexpression von E-Cadherin im Primärtumor keine Voraussetzung für
erhöhte Serumlevel ist. Stark reduzierte Proteinlevel in Primärtumoren bei
gleichzeitig erhöhten Serumlevel könnten jedoch auf ein effizientes EktodomänenShedding zurückzuführen sein.
Überraschenderweise waren auch die Mengen an löslichem E-Cadherin in Serum
von Patienten mit FAP erhöht. Hinweise für ein erhöhtes Ektodomänen-Shedding bei
Patienten
mit
FAP
immunhistochemischen
sind
von
Berkhout
Färbungen
von
et
al.
beschrieben
Normalgewebe
und
worden.
Mit
Adenomen
von
Patienten mit FAP konnten die Autoren zeigen, dass die extrazelluläre Domäne von
E-Cadherin in der normalen Mucosa des Duodenums und Kolons im Vergleich zur
intrazellulären Domäne reduziert ist. Dazu führten sie die Färbungen sowohl mit
einem Antikörper gegen die extrazelluläre Domäne, als auch gegen die intrazelluläre
Domäne durch (Berkhout et al. 2006). Dieser von Berkhout et al. beschriebene
Verlust des extrazellulären Anteils von E-Cadherin im Gewebe und die von mir
gezeigten erhöhten Level an sE-Cadherin in Serum bei Patienten mit FAP könnten
beide auf dieselben Mechanismen zurückzuführen sein. Keimbahnmutationen im
APC Gen führen zu der autosomal dominant vererbten Erkrankung FAP. Durch die
Mutation im APC-Gen kann β-Catenin nicht abgebaut werden und akkumuliert in der
Zelle. β-Catenin kann im Zellkern an Proteine der TCF/LEF-Familie binden und die
Expression von Zielgenen beeinflussen. So wurde unter anderem MMP7 als Zielgen
von β-Catenin identifiziert (Brabletz et al. 1999). Ebenso findet man auch eine
stärkere Expression von MMP-7 bei Patienten mit FAP (Humar et al. 2001).
E-Cadherin-Shedding durch MMP-7 ist mehrfach beschrieben worden (Ii et al. 2006;
Lynch et al. 2010), so dass dies ein Mechanismus sein könnte, der die erhöhten
sE-Cadherin-Serumlevel bei Patienten mit FAP erklärt. Es ist jedoch fraglich, ob in
einer morphologisch normalen Mukosa eine erhöhte extrazelluläre proteolytische
Aktivität zu finden ist, die zu verstärktem Ektodomänen-Shedding von E-Cadherin
führen kann. MMP-7 spaltet eine Vielzahl anderer Proteine und ist insbesondere an
der Degradierung der extrazellulären Matrix beteiligt.
Die konstitutive Endocytose von E-Cadherin und das Recycling über den
endosomalen Weg sind wichtig für die dynamische Regulation von Epithelien. So
könnte alternativ auch das oben bereits beschriebene Shedding in MVBs hier eine
Rolle spielen. Ein wichtiges Protein des E-Cadherin Adhäsionskomplexes ist das
Diskussion
110
p120 Catenin, welches als Inhibitor der Endozytose gilt und den gesamten
Zelladhäsionskomplex stabilisiert (Mosesson et al. 2008). Durch die Akkumulation
von β-Catenin wird dieser Komplex möglicherweise gestört und es kommt zu einer
deregulierten Endozytose und einem gestörten intrazelluären Trafficking. Letzteres
könnte auch durch die Beteiligung von APC an der Ausbildung von Mikrotubuli
erreicht werden (Munemitsu et al. 1994). Trotz der verschiedenen Erklärungsansätze
für die erhöhten Serumlevel von sE-Cadherin bei Patienten mit FAP ist dieser Aspekt
noch nicht vollständig verstanden und müsste in experimentellen Ansätzen weiter
untersucht werden.
4.2.2
Der potentielle Biomarker Cadherin-17
Die gewebespezifische Expression von Cadherin-17 und die Beobachtung, dass die
Cadherin-17-Expression in Tumoren erhalten bleibt, ließ uns vermuten, dass
sCadherin-17 ein geeigneterer Biomarker als sE-Cadherin sein könnte. Bei Patienten
mit metastasiertem kolorektalen Karzinom wird im Mittel 1 µg/ml mehr lösliches
E-Cadherin freigesetzt als in der Kontrollgruppe. Trotz dieser großen Menge an
zusätzlichem sE-Cadherin ist dieser Marker nicht als diagnostischer Marker geeignet,
da bereits in der Kontrollgruppe 5 µg/ml lösliches E-Cadherin gemessen werden. Wir
gehen davon aus, dass sCadherin-17 aufgrund seiner deutlich begrenzteren
Expression im Blut gesunder Probanden niedriger konzentriert ist. Ein Hinweis, dass
dies tatsächlich der Fall ist, war die Tatsache, dass sCadherin-17 mit Western Blot
nicht in Serum nachweisbar war, während sE-Cadherin in denselben Proben ein
deutliches Signal zeigte. Die Sensitivität der Nachweise per se war dabei
vergleichbar, was durch Verdünnungsreihen von Sekretomen in Serum ausgetestet
worden war. Die Beobachtung, dass Cadherin-17 basolateral freigesetzt wird, war
eine wichtige Voraussetzung für die Annahme, dass sCadherin-17 auch schon in
frühen Tumorstadien in den Blutkreislauf gelangen kann, bevor die Zellen ihre
Polarität und epithelialen Eigenschaften verlieren. Damit erfüllt lösliches Cadherin-17
alle wichtigen Kriterien, die an einen Biomarker-Kandidaten gestellt werden.
Aufgrund all dieser vielversprechenden Argumente für den Biomarker sCadherin-17
haben wir uns entschlossen, einen Nachweis für sCadherin-17 in Patientenseren zu
entwickeln. Außerdem haben wir aufgrund des großen Potentials des Biomarkers
sCadherin-17 die Verwendung von löslichem Cadherin-17 als Serummarker zum
Patent angemeldet. Das Patent wurde inzwischen erteilt (Meyer et al. 2009).
Diskussion
111
Für den Nachweis von sCadherin-17 aus Serum habe ich einen Sandwich-ELISA
entwickelt. Das Serumproteom ist sehr komplex und umfasst zahlreiche Proteine mit
einer große Bandbreite unterschiedlicher Konzentrationen, die sich um bis zu zehn
Größenordnungen unterscheiden (Anderson und Anderson 2002). Das abundanteste
Protein ist Albumin mit einer Konzentration von ca. 35 - 50 mg/ml. Typische
Biomarker wie PSA oder CEA liegen im ng/ml-Bereich, sE-Cadherin im
µg/ml-Bereich vor. Um dennoch einen sensitiven und spezifischen Nachweis von
Cadherin-17 aus Serum zu ermöglichen, habe ich den ELISA umfangreich getestet
und optimiert, bevor ich sCadherin-17 in einer größeren Anzahl an Patientenseren
mit diesem ELISA bestimmt habe. Es ist mir gelungen, einen Test zu entwickeln, der
sCadherin-17 reproduzierbar und mit einer Nachweisgrenze im niedrigen ng/mlBereich nachweisen kann. Wie sE-Cadherin ist auch sCadherin-17 in Seren von
Patienten mit kolorektalen Tumoren statistisch signifikant erhöht. Auch lösliches
Cadherin-17 ist als alleiniger diagnostischer Marker nicht geeignet, da eine klare
Trennung der Patienten mit kolorektalem Karzinom von der Kontrollgruppe nicht
möglich ist. Trennt man die Gruppe der Patienten mit kolorektalem Karzinom nach
den vier UICC Stadien I bis IV auf, fällt auf, dass die Menge an sCadherin-17 im
Serum mit höherem Tumorstadium ansteigt. Dies könnte auf ein größeres
Tumorvolumen und/oder auf verstärktes Shedding zurückzuführen sein. Das
Ergebnis, dass lösliches Cadherin-17 in kolorektalen Tumoren erhöht ist, ist
konsistent mit der Beobachtung, dass die wichtige Protease für das Shedding von
ADAM10
in
kolorektalen
Tumoren
hochexprimiert
ist.
Der
Verlust
der
Basalmembranbarriere und des physiologischen Gewebeaufbaus könnten auch zu
dem Anstieg der sCadherin-17 Serumlevel bei Patienten mit kolorektalem Karzinom
beitragen.
Aufgrund der beschriebenen ektopen Expression von Cadherin-17 in Pankreas- und
Magentumoren habe ich auch jeweils ein kleines Kollektiv an Seren von Patienten
mit diesen Erkrankungen gemessen. Insbesondere in der Gruppe der Patienten mit
Pankreaskarzinom weisen einzelne Patienten erhöhte Serumlevel auf. Ob diese
Patienten eine ektope Expression von Cadherin-17 im Tumor zeigen bleibt zu
bestätigen. Die Bestimmung der Level an löslichem Cadherin-17 in Serum könnte
auch für die weiteren Tumore des Gastrointestinaltraktes mit ektoper Cadherin-17Expression relevant sein. Bei Tumoren mit bekannter Cadherin-17-Expression
könnte sCadherin-17 potentiell als Verlaufsmarker in Frage kommen, der das
Diskussion
112
Ansprechen auf die Therapie oder das Auftreten von Rezidiven und Metastasen
anzeigen kann. Diese Aspekte lagen nicht im Fokus dieser Arbeit, jedoch könnten
die erstmalige Beschreibung von sCadherin-17 in Serum und der Anstieg der
Serumlevel in Abhängigkeit vom Tumorstadium nachfolgende Studien motivieren, die
die
Freisetzung
von
sCadherin-17
bei
ektoper
Expression
untersuchen.
Interessanterweise wurden beim Magenkarzinom erhöhte Level an ADAM10-mRNA
gemessen (Yoshimura et al. 2002), was möglicherweise ein Hinweis ist, dass
Cadherin-17 auch bei ektoper Expression effektiv freigesetzt wird.
Die Beobachtung, dass die Menge an löslichem Cadherin-17 mit höherem
Tumorstadium ansteigt, lässt vermuten, dass sich auch die Serumlevel von löslichem
Cadherin-17 in Abhängigkeit vom Tumorvolumen ändern. Wir konnten jedoch in den
wenigen uns zur Verfügung stehenden Patientenseren, die zu mehreren relevanten
Zeitpunkten der Behandlung eines Patienten abgenommen wurden, keinen
Zusammenhang zwischen der Menge an sCadherin-17 und dem Behandlungsverlauf
feststellen. Auch dieser Aspekt sollte jedoch noch in einer größeren Anzahl von
Seren überprüft werden.
Im Rahmen des Verbundprojektes PURE (Protein Research Unit Ruhr within Europe)
werden derzeit die Daten über den weiteren Krankheitsverlauf der Patienten
aktualisiert, deren Seren der in dieser Arbeit verwendet wurden. Nach den bisher zur
Verfügung stehenden Daten haben Patienten mit erhöhten Mengen an sCadherin-17
in Serum eine schlechtere Prognose als Patienten mit normalen sCadherin-17-Level.
Dabei ist noch unklar, ob dies lediglich die Tatsache widerspiegelt, dass sCadherin17 in späten Tumorstadien mit schlechterer Prognose eher erhöht ist, oder ob
sCadherin-17 als unabhängiger prognostischer Marker eingesetzt werden könnte.
Serummarker, die eine Aussage über die Prognose von Patienten ermöglichen,
könnten dafür eingesetzt werden, die Therapie spezifisch anzupassen.
Ob die löslichen Cadherine sE-Cadherin und sCadherin-17 möglicherweise als
einzelne Marker in Biomarker-Panels angewendet werden könnten, ist derzeit noch
unklar und müsste in umfangreichen Studien getestet werden. Obwohl die in dieser
Arbeit untersuchten Biomarker CEA, sE-Cadherin und sCaherin-17 alle durch
Ektodomänen-Shedding freigesetzt werden, korrelieren die Serumlevel nicht. Es
handelt sich also um unabhängige Marker, so dass eine kombinierte Verwendung in
größeren Biomarker-Panels sinnvoll erscheint. Nach dem von uns festgelegten Cut-
Diskussion
113
off-Wert weisen bereits 3 von 7 Patienten mit dem UICC-Stadium I und 5 von 11
Patienten mit dem UICC Stadium II erhöhte Serumlevel von sCadherin-17 auf. Durch
die gemeinsame Verwendung von sCadherin-17 und CEA werden bereits 9 von 11
Patienten mit UICC-Stadium II als positiv erkannt. Insbesondere sCadherin-17 bietet
also das Potential, in einer Kombination von Biomarkern eingesetzt zu werden, die
kolorektale Karzinome auch schon in frühen Stadien anzeigen könnten.
Lösliches Cadherin-17 bietet eine Vielzahl von Anwendungsmöglichkeiten als
Serummarker. Diese sollten in weiteren Studien mit größeren Patientenzahlen
überprüft werden. Die erstmalige Beschreibung von löslichem Cadherin-17 und der
Nachweis der erhöhten Serumlevel von sCadherin-17 bei Patienten mit kolorektalem
Karzinom bietet somit die Basis für vielversprechende weitere Arbeiten.
Zusammenfassung
5
114
Zusammenfassung
Neue Tumormarker sind nötig für die serumbasierte Diagnose von kolorektalen
Karzinomen und für die Verlaufskontrolle von Patienten. In Sekretomanalysen
kultivierter Tumorzellen wurden die löslichen Formen von E-Cadherin und von
Cadherin-17, die in großen Mengen durch Ektodomänen-Shedding freigesetzt
werden, als Serummarker-Kandidaten für das kolorektale Karzinom identifiziert. In
dieser Arbeit zeige ich, dass die Serumkonzentrationen dieser beiden BiomarkerKandidaten tatsächlich in Seren von Patienten mit einem kolorektalen Karzinom
erhöht sind. Weiterhin habe ich Arbeiten zum Mechanismus des Sheddings beider
Cadherine durchgeführt.
Obwohl eine Vielzahl an Proteasen beschrieben wurden, die E-Cadherin spalten
können, ist die vorgeschaltete Regulation dieser Proteasen relativ wenig untersucht.
Ich zeige hier, dass das Shedding von E-Cadherin durch Smad4 reguliert wird.
Smad4 reduziert die Freisetzung von Kallikrein-6, dies wiederum korreliert mit einer
geringeren proteolytischen Aktivierung von Adam10. Diese Untersuchungen wurden
in
in
vitro-Modellen
mit
Smad4-reexprimierenden
Kolonkarzinomzelllinien
durchgeführt. In ähnlichen Modellen wurde zuvor gezeigt, dass Smad4 ein positiver
Regulator der E-Cadherin-Expression ist. Reduziertes Shedding kann somit ein
weiterer Mechanismus sein, mit dem der Tumorsuppressor Smad4 einem Verlust der
E-Cadherin-Funktion entgegenwirkt.
Da kultivierte Karzinomzellen große Mengen an sE-Cadherin freisetzen, fragten wir
uns, ob lösliches E-Cadherin ein Serummarker für kolorektale Karzinome sein
könnte. Ich zeige in dieser Arbeit umfangreiche Ergebnisse der Analyse von
E-Cadherin in Gewebe und Serum von gesunden Personen, Patienten mit
kolorektalem Karzinom und Patienten mit FAP. Lösliches E-Cadherin ist bei
Patienten mit metastasierten kolorektalen Karzinomen und Patienten mit FAP im
Mittel signifikant erhöht. Die Bestimmung von löslichem E-Cadherin in Serum könnte
in der Nachbeobachtung von Patienten eingesetzt werden, da der Serumlevel
ähnlich wie CEA den Krankheitsverlauf widerspiegelt.
Cadherin-17 wird ebenfalls in großen Mengen von kultivierten kolorektalen Karzinomund Adenomzelllinien freigesetzt und wurde hier ebenfalls auf seine Eignung als
Biomarker überprüft. Cadherin-17 ist bisher wenig untersucht und lösliches
Cadherin-17 wird in dieser Arbeit erstmalig beschrieben. Ich zeige, dass ADAM10
Zusammenfassung
115
eine wichtige Protease für das Shedding von Cadherin-17 ist und dass ADAM10 in
kolorektalen Tumoren überexprimiert ist. Der potentielle Biomarker sCadherin-17
erfüllt alle wichtigen Eigenschaften, die an einen Serummarker-Kandidaten gestellt
werden. Er wird von Tumorzellen produziert und die gewebespezifische Expression
lässt niedrige Serumlevel in gesunden Personen erwarten. Die Verwandtschaft zu
E-Cadherin und die basolaterale Freisetzung in in vitro-Modellen ließen es sehr
wahrscheinlich erscheinen, dass lösliches Cadherin-17 in den Blutkreislauf gelangen
kann. Wir haben daher die Verwendung von sCadherin-17 als Serummarker zur
Patentierung angemeldet; das Patent wurde inzwischen erteilt. Mit einem selbst
entwickelten Sandwich ELISA konnte ich sCadherin-17 mit hoher Sensitivität in
Seren nachweisen und zeigen, dass der Level von sCadherin-17 in Seren von
Patienten mit kolorektalem Karzinom erhöht ist.
Generell erscheinen die abgespaltenen Ektodomänen von Transmembranproteinen
als sehr vielversprechende Biomarker. Sie können sich offenbar aufgrund ihrer
Stabilität gegenüber weiterem proteolytischen Abbau im Serum anreichern und dort
als
Indikator
und
Marker
der
tumorabgeleiteten
proteolytischen
Aktivität
nachgewiesen werden.
Diese Arbeit leistet somit einen Beitrag, die klinische Anwendbarkeit von
experimentell gefundenen Biomarker-Kandidaten zu überprüfen. Die in dieser Arbeit
vorgeschlagenen Anwendungsmöglichkeiten für die beiden Biomarker sE-Cadherin
und sCadherin-17 müssen zunächst an größeren Patientenkollektiven überprüft
werden. Sollte sich eine dieser Anwendungsmöglichkeiten als erfolgreich erweisen,
ist der mögliche klinische Nutzen enorm und kann zu einer reduzierten Mortalität
beim kolorektalen Karzinom beitragen.
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Zhu, R.; Wong, K.-F.; Lee, N. P. Y.; Lee, K.-F. u. Luk, J. M. C. (2010): HNF1alpha
and CDX2 transcriptional factors bind to cadherin-17 (CDH17) gene promoter
and modulate its expression in hepatocellular carcinoma. Journal of cellular
biochemistry 111 (3): 618–626.
Anhang
129
Anhang
In den folgenden Abbildungen sind die originalen Western Blots gezeigt, denen die
Auswertungen der im Ergebnisteil gezeigten Grafiken zugrunde liegen.
DTJ13
DTJ12
DTJ11
TJM 6
TJM 5
TJM 2
HT-29-Sekretom
sE-Cadherin
Transferrin-Kreuzreaktion
ADAM10 60 kDA
Transferrin
DTJ13
DTJ12
DTJ11
TJM 6
TJM 2
HT-29-Lysat
E-Cadherin
ADAM10 80 kDA
ADAM10 60kDa
GAPDH
Abbildung 41: Originaldaten zu den in Abbildung 9 und Abbildung 13B gezeigten
Auswertungen.
Anhang
130
SW620-Sekretom
Kallikrein-6
Transferrin
3
9
10 2
TJM
Smad4-negativ
5
8
16 20
DTJ
Smad4-positiv
21
SW620-mRNA
Kallikrein-6
GAPDH
3
9 10 2
TJM
Smad4-negativ
20
21
5
8
DTJ
Smad4-positiv
16
Abbildung 42: Originaldaten zu den in Abbildung 10 gezeigten Auswertungen.
Anhang
131
SW620-Sekretom
ADAM10
Transferrin
3
9 10 2
TJM
Smad4-negativ
20
21
5
8
DTJ
Smad4-positiv
16
SW620-Lysat
ADAM10
GAPDH
3
9 10 2
TJM
Smad4-negativ
20
21
5
8
DTJ
Smad4-positiv
16
Abbildung 43: Originaldaten zu den in Abbildung 13A gezeigten Auswertungen.
Anhang
132
p16
p13
p10
SW620 DTJ8-Sekretom
p7
p17
p14
p11
p8
SW620 DTJ2-Sekretom
sE-Cadherin
Kallikrein-6
ADAM10
Transferrin
p16
p13
p10
p7
SW620 DTJ8-Lysat
p17
p14
p11
p8
SW620 DTJ2-Lysat
E-Cadherin
Smad4
GAPDH
Abbildung 44: Originaldaten zu den in Abbildung 14 für die SW620-Klone DTJ2 und DTJ8
gezeigten Auswertungen.
Anhang
133
SW620 DTJ21-Lysat
p15
p12
p7
sE-Cadherin
p10
p15
p12
p10
SW620 DTJ21-Sekretom
E-Cadherin
Kallikrein-6
Smad4
ADAM10
GAPDH
Transferrin
Abbildung 45: Originaldaten zu den in Abbildung 14 für den SW620-Klon DTJ21 gezeigten
Auswertungen.
Anhang
134
Sekretom
sE-Cadherin
ADAM10
Kallikrein-6
Transferrin
si K
si K
si K
si K
Lysat
E-Cadherin
ADAM10 Vorläufer
aktives ADAM10
beta-Tubulin
si K
si K
si K
si K
Abbildung 46: Originaldaten zu den in Abbildung 16 gezeigten Auswertungen.
Anhang
135
insert
SW948Sekretom
well
insert
well
LT97Sekretom
sCadherin-17
sE-Cadherin
Transferrin
Abbildung 47: Originaldaten zu den in Abbildung 30 gezeigten Auswertungen.
Abkürzungsverzeichnis
136
Abkürzungsverzeichnis
2D
zweidimensional
A
Adenin
Abb.
Abbildung
ADAM
A disintegrin and metalloproteinase
APC
Adenomatosis polyposis coli
APS
Ammoniumperoxodisulfat
AS
Aminosäure
ATCC
American Type Culture Collection
ATP
Adenosintriphosphat
bp
Basenpaare
cDNA
complementary DNA
CEA
Carcino-Embryonales Antigen
CHAPS
(3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylamino]-propansulfate)
Co-Smad
common mediator Smad
CRC
colorectal Carcinoma (kolorektales Karzinom)
C-terminal
Carboxyterminal
DEPC
Diethylpyrocarbonat
DIGE
Differentielle Gelelektrophorese
DMEM
Dulbeccos modified Eagles medium
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
Desoxyribonukleinsäure (Deoxyribonucleic acid)
dNTP
2'-Desoxyribonukleotid-5'-Triphosphat
EDTA
Ethylendiamintetraacetat
ELISA
Enzyme-linked Immunosorbent Assay
EGF
Epidermal growth factor
Abkürzungsverzeichnis
137
FAP
familiäre adenomatöse Polyposis
FCS
Fetal calf serum
FOBT
fecal occult blood test
G
Guanin
GAPDH
Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase
I-Smad
Inhibitor-Smad
Kb
Kilobasenpaare
kDa
Kilodalton
LEF-1
lymphoid enhancer factor-1
MMP
Matrix-Metalloproteinase
MOPS
3-(N-Morpholino)-Propansulfonsäure
mRNA
messenger RNA
MVB
multivesicular bodies
NCBI
National Center for Biotechnology Information
N-terminal
Aminoterminal
NTP
Nukleosidtriphosphat
p
Passage
PAGE
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PBS
Phosphate buffered saline
PBST
Phosphate buffered saline + Tween-20
PCR
polymerase chain reaction
PMSF
Phenylmethylsulfonylfluorid
PSA
prostate specific antigen
Ras
Rat sarcoma
RLU
relative Lichteinheit (relative light unit)
RNA
Ribonukleinsäure (Ribonucleic acid)
R-Smad
Rezeptor-assoziiertes Smad
Abkürzungsverzeichnis
138
sCadherin-17
lösliches (soluble) Cadherin-17
sE-Cadherin
lösliches (soluble) E-Cadherin
siRNA
small interfering RNA
SDS
Sodium dodecyl sulfate
SSC
Standard Saline Citrate
T
Thymin
TCF
T-cell binding factor
TEA
Tris-Acetat-EDTA-Puffer
TEMED
Tetramethylethylendiamin
TGF-β
transforming growth factor-
UICC
Union internationale contre le cancer
ÜS
Überstand
UV
Ultraviolett
UZ
Ultrazentrifugation
V
Volt
v/v
Volumenanteil (volume per volume)
w/v
Gewichtsanteil (weight per volume)
Wnt
Wingless type protein
Danksagung
139
Danksagung
Besonders herzlich möchte ich mich bei Frau PD Dr. Irmgard Schwarte-Waldhoff für
die Möglichkeit bedanken, die Arbeit in ihrer Arbeitsgruppe durchzuführen und für
ihre hervorragende Betreuung der Arbeit. Sie hat mir die Freiheit zu einer
selbstständigen und eigenverantwortlichen Durchführung der Arbeit gegeben und
war jederzeit bereit, Fragen und Probleme zu diskutieren.
Herrn Prof. Dr. Rolf Heumann danke ich für die freundliche Bereitschaft, das
Zweitgutachten zu übernehmen.
Allen aktuellen und ehemaligen Mitarbeitern des IMBL möchte ich für die besonders
angenehme Arbeitsatmosphäre und die ständige Hilfs- und Diskussionsbereitschaft
danken. Mein besonderer Dank gilt „meiner“ Masterstudentin Nathalie Wojtalewicz
für die sehr angenehme und erfolgreiche Zusammenarbeit. Danken möchte ich auch
Dr. Susanne Klein-Scory für viele hilfreiche und konstruktive Ratschläge. Dr. Dirk
Zboralski, Bassel Malas, Heiko Becker, Dr. Hanna Diehl und Kamila Adamczyk
danke ich für die ständige Hilfs- und Diskussionsbereitschaft und die hervorragende
Zusammenarbeit. Anna Schöneck, Sabine Hoppe und Christina Eilert-Micus danke
ich dafür, dass sie stets bereit waren mich mit Rat und Tat zu unterstützen.
Herrn Prof. Dr. Schmiegel danke ich für die finanzielle Unterstützung und sein
Interesse an meiner Arbeit.
Herzlich danken möchte ich auch PD Dr. Reinhard Geßner für die großzügige
Bereitstellung des Cadherin-17-Antikörpers, Einblicke in seine umfangreichen Daten
zur Expression von Cadherin-17 und die vielen Hinweise zur Entwicklung des
Cadherin-17-ELISA.
Herrn Prof. Dr. Frank W. Falkenberg sei ebenfalls für seine Bereitschaft gedankt,
hilfreiche Hinweise zur ELISA-Entwicklung zu geben.
Danken möchte ich auch Herrn Prof. Dr. Andreas Ludwig für die Bereitstellung des
ADAM10-Inhibitors.
Herrn Dr. Ingo Stricker und Frau Dr. Johanna Mundig danke ich für die Durchführung
und Auswertung der Immunhistochemie.
Danksagung
140
Meiner Mutter und Dorothea Türk danke ich ganz herzlich für die sorgfältige und
schnelle Korrektur dieser Arbeit.
Meinen Eltern und Geschwistern danke ich von Herzen für ihre Unterstützung und ihr
Interesse an meiner Arbeit.
Mein besonderer Dank gilt Veronika Türk dafür, dass sie immer für mich da war und
mich unterstützt hat.
Publikationen und Konferenzbeiträge
141
Publikationen und Konferenzbeiträge
Publikationen:
Weiß, Jakob V; Klein-Scory, Susanne; Kübler, Salwa; Reinacher-Schick, Anke;
Stricker, Ingo; Schmiegel, Wolff; Schwarte-Waldhoff, Irmgard (2011): Soluble Ecadherin as a serum biomarker candidate: Elevated levels in patients with latestage colorectal carcinoma and FAP. Int. J. Cancer 128 (6), S. 1384–1392.
Weiß JV, Klein-Scory S, Wojtalewicz N, Diehl H, Stricker I, Munding J, Schmiegel W,
Ludwig A, Gessner R, Schwarte-Waldhoff I: Adam10 mediated ectodomainshedding of the intestine-specific cadherin-17 is associated with increased
serum levels of sCad-17 in colorectal cancer patients. (in preparation)
Weiß JV, Becker H, Böckmann M, Klein-Scory S, Diehl H, Schmiegel W, SchwarteWaldhoff I. Smad4-dependent suppression of E-cadherin ectodomain shedding
in Smad4-reexpressing human colorectal cancer cells (in preparation)
Konferenzbeiträge:
Weiß JV, Klein-Scory S, Kübler S, Diehl H, Reinacher-Schick A, Schmiegel W,
Schwarte-Waldhoff I (2009) The serum level of soluble E−Cadherin is increased
in Stage III and IV CRC patients and may serve as an independent follow-up
marker
15th International AEK Cancer Congress, Berlin
Weiß JV, Klein-Scory S, Wojtalewicz N, Reinacher-Schick A, Stricker I, Schmiegel W,
Ludwig A, Gessner R, Schwarte-Waldhoff I (2010) Serum levels of soluble Ecadherin and soluble Cadherin-17 are elevated in patients with late stage CRC
38th Meeting of the International Society of Oncology and BioMarkers, München
Publikationen und Konferenzbeiträge
142
Weiß JV, Klein-Scory S, Kübler S, Diehl H, Reinacher-Schick A, Schmiegel W,
Schwarte-Waldhoff I (2008) Lösliches E-Cadherin im Serum von Patienten mit
einem kolorektalen Karzinom als möglicher Marker zur Verlaufskontrolle
FoRUM Tagung 2008, Bochum
Patent:
Meyer, H. E.; Diehl, H.; Klein-Scory, S.; Schmiegel, W.; Schwarte-Waldhoff, I.;
Stühler, K.; Weiss, J. (2009): Soluble Cadherin-17 for the diagnosis and risk
stratification
of
(WO/2009/012773)
cancer
and
tumour
of
the
gastrointestinal
tract