Expression, Regulation und subzelluläre Lokalisation von Tight

Aus dem Zentrum für Innere Medizin
Klinik für Gastroenterologie und Stoffwechsel
Direktor: Prof. Dr. med. T. M. Gress
des Fachbereichs Medizin der Philipps-Universität Marburg
in Zusammenarbeit mit dem
Universitätsklinikum Gießen und Marburg GmbH,Standort Marburg
Expression, Regulation und subzelluläre
Lokalisation von
Tight Junction -Komponenten
in Metastasierungsmodellen
humaner duktaler Pankreaskarzinomzellen
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der Humanmedizin
(Dr. med.)
dem Fachbereich Medizin
der Philipps-Universität Marburg
vorgelegt von
Nadine Aurbek
aus Nastätten
Marburg 2008
Angenommen vom Fachbereich Medizin
der Philipps-Universität Marburg am 08.Mai 2008
Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereiches
Dekan: Prof. Dr. med. Rothmund
Referentin: Prof. Dr. med. B. Simon
Korreferent: PD Dr. P. Langer
INHALTSVERZEICHNIS
INHALTSVERZEICHNIS
1. EINLEITUNG ..................................................................... 1 1.1. DAS DUKTALE ADENOKARZINOM DES PANKREAS ..................................... 1 1.1.1. Epidemiologie ..................................................................................... 1 1.1.2. Klinik und Diagnose ............................................................................ 1 1.1.3. Pathogenese ....................................................................................... 2 1.1.4. Therapie und Prognose ....................................................................... 4 1.2. MECHANISMEN IM PROZESS DER METASTASIERUNG ................................. 4 1.3. STRUKTUR UND FUNKTION VON ZELLADHÄSIONSPROTEINEN ....................... 6 1.3.1. Der E‐Cadherin‐Catenin‐Komplex ........................................................ 6 1.3.2. Aufbau und Funktion von Tight Junctions ............................................ 8 1.3.2.1. Das integrale Membranprotein Occludin ......................................... 9 1.3.2.2. Die Multigenfamilie der Claudine ................................................... 11 1.3.2.3. Das integrale Membranprotein JAM .............................................. 14 1.3.2.4. Tight Junction‐assoziierte Proteine ................................................ 14 1.4. DIE ROLLE DES MAPK‐SIGNALTRANSDUKTIONSWEGES IM PROZESS DER METASTASIERUNG ......................................................................... 16 1.5. FRAGESTELLUNG ............................................................................ 18 2. MATERIAL UND METHODEN ............................................ 19 2.1. GERÄTE ....................................................................................... 19 2.1.1. Laborgeräte ...................................................................................... 19 INHALTSVERZEICHNIS
2.1.2. Elektrophorese‐Geräte und Zubehör ................................................. 20 2.1.3. Zellkultur .......................................................................................... 21 2.1.4. Analytische Geräte ............................................................................ 21 2.1.5. Kühlgeräte ........................................................................................ 21 2.2. CHEMIKALIEN, ENZYME UND VERBRAUCHSMATERIALIEN .......................... 22 2.2.1. Enzyme ............................................................................................. 22 2.2.2. Sequenzierung und Polymerase‐Kettenreaktion ................................ 22 2.2.3. Elektrophorese .................................................................................. 22 2.2.4. Chemikalien und Puffer ..................................................................... 23 2.2.5. Radioaktive Substanzen .................................................................... 24 2.2.6. Antikörper ........................................................................................ 24 2.2.7. Bakterienkultur ................................................................................. 26 2.2.8. Zellkultur .......................................................................................... 26 2.2.8.1. Pankreastumorzelllinien ................................................................ 26 2.2.9. Verbrauchsmaterialien ..................................................................... 27 2.2.10. Plasmide und kompetente Zellen ....................................................... 27 2.2.11. Oligonukleotide ................................................................................. 28 2.3. SICHERHEITSVORKEHRUNGEN UND ABFALLBESEITIGUNG .......................... 30 2.4. MOLEKULARBIOLOGISCHE METHODEN ................................................ 30 2.4.1. Isolierung von Gesamt‐RNA aus Zellen .............................................. 30 2.4.2. Isolierung von DNA aus Zellen ........................................................... 31 2.4.3. Quantifizierung von DNA und RNA .................................................... 32 2.4.4. Northern‐Blot ‐Analyse ..................................................................... 32 2.4.4.1. Formaldehyd‐Gelelektrophorese ................................................... 33 2.4.4.2. Northern Blotting ........................................................................... 34 2.4.4.3. Synthese von cDNA ........................................................................ 34 2.4.4.4. Herstellung einer radioaktiv markierten cDNA‐Sonde .................... 35 2.4.4.5. Hybridisierung des Northern‐ Blot ................................................. 35 INHALTSVERZEICHNIS
2.4.5. Multiple Tissue Expression Array ....................................................... 36 2.4.6. Polymerase‐Kettenreaktion (PCR) ..................................................... 37 2.4.7. Synthese von cDNA ........................................................................... 38 2.4.8. PCR mit Reverser Transkriptase (RT‐PCR) .......................................... 38 2.4.9. DNA‐Sequenzanalyse ........................................................................ 39 2.4.10. Elektrophoretische Trennung von DNA ............................................. 40 2.4.11. Elution von DNA‐Fragmenten aus Agarosegelen ................................ 41 2.4.12. Klonierung von cDNA‐Fragmenten ..................................................... 41 2.4.12.1. Vektoren und Konstrukte ............................................................... 41 2.4.12.2. Ligation und Transformation .......................................................... 42 2.4.12.3. Restriktion mit HindIII, Eco RI und BamH I ..................................... 43 2.4.12.4. Restriktion PcDNA 3.1/V5 TOPO mit HindIII und Eco RI .................. 43 2.4.12.5. Restriktion PcDNA/TO/myc‐His mit HindIII, Eco RI und BamH I ...... 43 2.4.12.6. Ligation .......................................................................................... 44 2.4.12.7. Transformation .............................................................................. 44 2.4.13. Plasmidgewinnung ............................................................................ 45 2.4.13.1. Analytische Plasmidgewinnung ...................................................... 45 2.4.13.2. Präparative Plasmidgewinnung ...................................................... 46 2.5. PROTEINCHEMISCHE METHODEN ....................................................... 46 2.5.1. Proteinextraktion aus Zellen ............................................................. 46 2.5.2. Proteinkonzentrationsbestimmung ................................................... 47 2.5.3. SDS‐Polyacrylamidgelelektrophorese ................................................ 47 2.5.4. Western Blot Analyse ........................................................................ 49 2.5.5. Strippen von Nitrocellulosemembranen ............................................ 51 2.6. ZELLBIOLOGISCHE METHODEN .......................................................... 51 2.6.1. Zelllinien und Kultivierung ................................................................ 51 2.6.2. Einfrieren und Auftauen von Zellen ................................................... 52 2.6.3. Fixierung von Zellen auf Objektträgern ............................................. 53 2.6.4. Kollagenbeschichtung von Objektträgern ......................................... 53 INHALTSVERZEICHNIS
2.6.5. Transiente Transfektion mit Lipofektamin ........................................ 54 2.6.6. PD98059 Behandlung von Zellen ....................................................... 54 2.6.7. 5‐Aza‐2´‐Deoxycytidin (5‐Aza‐CdR) Behandlung ................................ 55 2.6.8. Immunfluoreszenz und DAPI‐Färbung ............................................... 55 3. ERGEBNISSE ................................................................. 57 3.1. DIFFERENTIELLE EXPRESSION DER TIGHT JUNCTION KOMPONENTEN CLAUDINE‐1, ‐2, ‐4, ‐7 UND ‐12 IM METASTASIERUNGSMODELL DER HUMANEN DUKTALEN PATU8988S/T PANKREASKARZINOM‐ZELLLINIEN ..... 57 3.2. EXPRESSION DER TIGHT JUNCTION KOMPONENTEN CLAUDIN‐4, ‐7 UND –12 IM METASTASIERUNGSMODELL DER HUMANEN DUKTALEN SUIT‐2 PANKREASKARZINOM SUBZELLLINIEN .................................................. 62 3.3. HETEROGENITÄT DER EXPRESSION VON MITGLIEDERN DER CLAUDINFAMILIE IN HUMANEN DUKTALEN PANKREASKARZINOM‐ZELLLINIEN ....................... 67 3.4. METHYLIERUNGSABHÄNGIGE EXPRESSION VON CLAUDIN‐4, CLAUDIN‐5, UND CLAUDIN‐7 IN HUMANEN NEUROENDOKRINEN PANKREASTUMORZELLLINIEN ............................................................ 69 3.5. CHARAKTERISIERUNG DER CLAUDIN‐7 EXPRESSION IN NORMALEN UND PATHOLOGISCHEN HUMANEN GEWEBEN UND ZELLEN .............................. 73 3.5.1. Bestätigung der differentiellen Expression von Claudin‐7 im PaTu8988S/T Metastasierungsmodell anhand der Northern Blot Analyse .............................................................................................. 73 3.5.2. Gewebe‐, tumor‐ und entwicklungsspezifische Expression von ............. Claudin‐7 ........................................................................................... 75 3.5.3. Subzelluläre Lokalisation von Claudin‐7 Fusionsprotein in PaTu8988T Pankreastumorzellen ....................................................... 77 INHALTSVERZEICHNIS
3.6. EXPRESSION UND SUBZELLULÄRE LOKALISATION VON TIGHT JUNCTION‐, TIGHT JUNCTION‐ASSOZIIERTEN UND ADHERENS JUNCTION PROTEINEN NACH ........... INHIBITION DES RAF‐MEK‐ERK‐SIGNALTRANSDUKTIONWEGES IN PANKREASKARZINOM‐ZELLEN ........................................................... 82 3.6.1. Wirkung der Inhibition des Raf‐MEK‐ERK‐Signal‐transduktionsweges auf Tight Junction und ‐assoziierte Proteine im PaTu8988S/T Pankreaskarzinom Metastasierungsmodell ........................................ 83 3.6.2. Wirkung der Inhibition des Raf‐MEK‐ERK‐Signal‐transduktionsweges auf die Expression von Tight Junction und Tight Junction ‐ ..................... assoziierten Proteinen im humanen SUIT‐2 Pankreaskarzinom‐
Metastasierungsmodell ..................................................................... 86 3.6.3. Subzelluläre Lokalisation und Redistribution von Tight Junction, Tight Junction‐assoziierten und Adherens Junction Proteinen nach Inhibition des Raf‐MEK‐ERK‐Signaltransduktionsweges in SUIT‐2 Subzelllinien ....................................................................................... 90 4. DISKUSSION ................................................................ 109 4.1. HETEROGENES EXPRESSIONSPROFIL VON CLAUDINEN IN DUKTALEN UND NEUROENDOKRINEN PANKREASKARZINOM‐ZELLLINIEN UND MÖGLICHE RELEVANZ BEI INVASION UND METASTASIERUNG ................................. 109 4.2. GEWEBE‐ UND ZELLSPEZIFISCHE EXPRESSION DER TIGHT JUNCTION KOMPONENTE CLAUDIN‐7 ............................................................. 122 4.3. METHYLIERUNGSABHÄNGIGE REGULATION VON CLAUDINEN IN NEUROENDOKRINEN PANKREASKARZINOMZELLLINIEN ........................... 126 INHALTSVERZEICHNIS
4.4. REGULATION VON TIGHT JUNCTION UND ADHERENS JUNCTION .................... KOMPONENTEN DURCH MITOGEN‐AKTIVIERTE PROTEINKINASE(MAPK) KASKADE IN PANKREASKARZINOMZELLEN .......................................... 127 5. ZUSAMMENFASSUNG ................................................... 137
6. LITERATURVERZEICHNIS .............................................. 139
7. ANHANG...................................................................... 155 7.1. VERWENDETE ABKÜRZUNGEN ......................................................... 155 7.2. PUBLIKATIONEN .......................................................................... 158 7.3. AKADEMISCHE LEHRER .................................................................. 158 7.4. DANKSAGUNG ............................................................................ 159 1. EINLEITUNG
1.
Einleitung
1.1.
Das duktale Adenokarzinom des Pankreas
1.1.1.
Epidemiologie
Das duktale Adenokarzinom des Pankreas ist die viert- bis fünfthäufigste
krebsbedingte Todesursache in der westlichen Welt. Es handelt sich um eine
Erkrankung des höheren Lebensalters mit einem Altersgipfel zwischen dem 50.
und 70. Lebensjahr, die sich selten vor dem 40. Lebensjahr manifestiert. Ca.
90% der Fälle treten sporadisch auf, während bei 10% der Patienten eine
familiäre Häufung beschrieben wird. Angehörige von betroffenen Patienten
besitzen ein ca. 3-fach erhöhtes Erkrankungsrisiko (Bardeesy et al., 2002). Eine
um das 53-fache erhöhte Erkrankungswahrscheinlichkeit besteht für Patienten
mit der seltenen hereditären Pankreatitis.
1.1.2.
Klinik und Diagnose
Bei Diagnosestellung eines duktalen Adenokarzinoms des Pankreas liegen in
80%
der
Fälle
fortgeschrittene
nicht
mehr
Metastasierung
resektable
vor
(Saif
Primärtumoren
et
al.,
und/oder
2007).
eine
Unspezifische
Beschwerden wie Inappetenz, Gewichtsverlust, abdominelle, oft in den Rücken
ausstrahlende Schmerzen sowie ein Ikterus sind die häufigsten Symptome, die
den Patienten vor der Erstdiagnose zum Arzt führen. Ein Ikterus tritt in der
Regel
bei
Pankreaskopfkarzinomen
auf,
wenn
durch
den
Tumor
im
Pankreasgang der Galleabfluss behindert wird. Bei einer Tumorlokalisation im
Korpus oder Schwanz des Organs kann ein Ikterus fehlen. Laborchemisch tritt
das duktale Adenokarzinom des Pankreas durch unspezifische Veränderung
wie einer Erhöhung der Cholestasemarker oder in 10-15% der Fälle durch eine
Erhöhung der Pankreasenzyme in Erscheinung. Tumormarker wie CEA, CA 199, CA 50 und CA 72-4 sind bei größerer Tumormasse erhöht, aber insgesamt
nicht spezifisch und daher keine geeigneten Screening-Parameter. Zur
bildgebenden
Diagnostik
eignen
sich
die
Sonografie
und
die
Computertomografie sowie die Magnetresonanztomografie, eine invasive
diagnostische Methode stellt die ERCP dar (Zeitz, 1999).
1
1. EINLEITUNG
1.1.3.
Pathogenese
Das
duktale
Adenokarzinom
des
Pankreas
entwickelt
sich
aus
Pankreasgangzellen. Läsionen in Form von Dysplasien im Gangepithel werden
als
Karzinomvorstufen
betrachtet
und
nach
einem
auf
histologischen
Merkmalen basierenden Modell in PanIN 1-3 (pancreatic intraepithelial
neoplasia; Abbildung 1) eingeteilt. Häufige, in duktalen Pankreaskarzinomzellen
identifizierte molekulare Veränderungen sind Mutationen in den Gensequenzen
für KRas, CDKN2A (cyclin dependent kinase 2A), P53, BRCA2 (breast cancer
2) und SMAD4/DPC4, deren Auftreten zeitlich in Zusammenhang mit den
Stadien der Tumorentstehung gesetzt werden kann (Abbildung 1). Das
Auftreten dieser genetischen Veränderungen kann nicht mit dem histologischer
Veränderungen korreliert werden, da die durch die Mutationen hervorgerufenen
biochemischen und zellulären Veränderungen nicht hinreichend bekannt sind.
Mutationen im KRas-Gen werden bereits in histologisch unveränderten
Pankreasgangzellen sowie in 30% der Karzinomvorstufen im Stadium PanIN-1
gefunden. Im manifesten Adenokarzinom treten Veränderungen im KRas-Gen
in bis zu 100% der Fälle auf (Rozenblum et al., 1997; Wilentz et al., 1998). Die
Mutation führt zu einer Aktivierung von KRas und damit auch zur Aktivierung
verschiedener Effektor-Wege in der Zelle. Ein wichtiger Faktor in der
Pathogenese der Tumorentstehung sind hier die durch den EGF (epidermal
growth-factor) vermittelten Signalwege, die durch Mehrexpression der EGFRezeptoren EGFR und ERBB2 aktiviert werden. Eine Überexpression von
EGFR wurde immunhistochemisch bei Patienten mit einem metastasierten
duktalen Pankreaskarzinom in 21% der Fälle nachgewiesen (Safran et al,
2001). Weitere bedeutende Folge der KRas-Mutation ist die Aktivierung des
MAPK (mitogen-activated protein kinase) -Signaltransduktionsweges mit
Auswirkungen auf Zellfunktionen im Bereich von Zellwachstum, -teilung und differenzierung (Abbildung 1). Ein Verlust der CDNK2A-Funktion ist in 80-95%
der
sporadisch
auftretenden
duktalen
Adenokarzinome
des
Pankreas
vorhanden und tritt schon in frühen Stadien der Karzinomentstehung (PanIN-1)
auf. Mit ihm entfällt die Transkription der Tumorsuppressoren INK4A und ARF,
wobei
2
INK4A
eine
größere
Bedeutung
für
die
Entstehung
von
1. EINLEITUNG
Pankreaskarzinomen zugeschrieben wird. Es blockiert den Eintritt der Zelle in
die S-Phase der Mitose, durch Verlust dieses Faktors wird die Zellproliferation
begünstigt. Mutationen im P53-Gen treten bei 50-60% (Ruggeri et al., 1997) der
duktalen Pankreaskarzinome auf. Durch Ausfall der TP53-vermittelten DNAReparationsmechanismen
werden
chromosomale
Veränderungen
insbesondere der Telomeren begünstigt, die zur genetischen Instabilität der
Tumorzellen führen. Da Mutationen im P53-Gen in niedrig- und hochmalignen
Tumoren auftreten, wird der Zeitpunkt der Mutation in einem frühen Stadium der
Karzinompathogenese vermutet.
Abbildung 1. Modell der genetischen Progression des duktalen Adenokarzinom des
Pankreas.
Die PanIN (pancreatic intraepithelial neoplasia) repräsentiert Stadien neoplastischen Wachstums
im Pankreasgang als Vorstufe zum manifesten duktalen Adenokarzinom des Pankreas, die sich
mit dem Auftreten spezifischer Mutationen in Verbindung bringen lassen. Der dadurch
verursachte Funktionsausfall der Proteine ERBB2/EGFR, KRas, INK4A, TP53, SMAD4/DPC4,
BRCA2, und der Telomerase finden sich ab bestimmten Stadien der Tumorentstehung (nach
Bardeesy et al., 2002).
Auch BRCA2 spielt eine Rolle bei der Reparatur der DNA, sein Verlust verstärkt
vermutlich die maligne Progression in bereits vorhandenen Läsionen. Eine
Mutation dieses Gens ist in ca. 17% der duktalen Adenokarzinome des
3
1. EINLEITUNG
Pankreas vorhanden, während ein Funktionsverlust des SMAD4/DPC4-Gens in
bis zu 55% der Fälle zu finden ist (Wilentz et al., 2000). SMAD4/DPC4 vermittelt
die
TGF-α
(tumor
growth
factor-α)
-assoziierte
Inhibition
von
Wachstumsvorgängen bzw. Apoptose. Sein Verlust tritt erst in späten Stadien
der Karzinomentstehung auf (PanIN-3) und verschlechtert die Prognose der
Erkrankung (Bardeesy et al., 2002).
1.1.4.
Therapie und Prognose
Das duktale Adenokarzinoms des Pankreas besitzt mit einer 5 JahresÜberlebensrate von 0,4 – 4% (Saif et al., 2007) und einer medialen
Überlebenszeit von 6 Monaten die bei weitem schlechteste Prognose von allen
Neubildungen des Gastrointestinaltraktes (Bardeesy et al., 2002). Zwischen 75
und 85 % der Patienten weisen bei Diagnosestellung bereits ein Tumorstadium
jenseits der Resektabilität auf (Friess et al., 1999), welches aufgrund des
geringen Ansprechens des Tumors auf Chemo- und/oder Radiotherapie
(Bardeesy et al., 2002) lediglich einen palliativen Therapieansatz erlaubt. Bei
früher Diagnose und damit kurativem Ansatz ist die Therapie der Wahl die
partielle Duodenopankreatektomie nach Whipple (Erstbeschreibung 1935) bzw.
eine totale Duodenopankreatektomie, wodurch für die betroffenen Patienten
jedoch lediglich eine Steigerung der 5 Jahres-Überlebensrate auf 20% erreicht
werden kann (Bardeesy et al., 2002). Experimentelle Therapieansätze wie eine
antihormonale Therapie mit Tamoxifen oder Burserelin oder die systemische
Applikation
von
monoklonalen
anti-Tumorzell-Antikörpern
haben
bisher
ebenfalls nicht zu einem Anstieg der Überlebensrate geführt (Friess et al., 1999;
Saif et al., 2007).
1.2.
Mechanismen im Prozess der Metastasierung
Die Metastasierung des Primärtumors ist im Hinblick auf die Prognose einer
Krebserkrankung
ein
entscheidender
Faktor.
Im
Falle
des
duktalen
Adenokarzinoms des Pankreas sind Metastasen für 90% der Letalität
verantwortlich (Keleg et al., 2003). Die Fernmetastasierung eines Primärtumors
4
1. EINLEITUNG
entsteht durch einen komplexen, vielschrittigen Prozess, der bis heute nicht
vollständig bekannt ist. Er beinhaltet die Loslösung einzelner Zellen bzw.
kleinerer Zellverbände von der primären Tumormasse, deren Bewegung durch
die extrazelluläre Matrix, ihre Intravasation, das Überleben von Tumorzellen in
der Zirkulation des Körperkreislaufs, die Adhäsion und Proliferation in
Endothelien des Zielgewebes, das Eindringen in dasselbe und letztendlich die
Interaktion mit dem lokalen Gewebe einschließlich der Induktion der
Angiogenese zur Eigenversorgung (Stamenkovic 2003).
Viele
Theorien
versuchen,
Erklärungsansätze
zur
Pathogenese
von
Metastasierungsabläufen zu liefern. Ein Erklärungsansatz ist die „homing
theory“, die eine Anziehung von malignen Zellen durch das Zielgewebe der
Metastasierung mithilfe der Expression von Zelladhäsionsproteinen und/oder
der Sekretion löslicher chemotaktischer Faktoren unterstellt. Die „fertil soil
theory“
hingegen
vermutet,
dass
unterschiedliche,
bereits
vorhandene
Wachstumsbedingungen in Zielgeweben die Invasion bestimmter maligner
Zellen begünstigen (Keleg et al., 2003). Beide Theorien berücksichtigen die
Bedeutung von Zell-Zell- bzw. Zell-Matrix-Interaktionen in der Pathogenese der
Metastasierung. Zelladhäsionsproteine an der Zelloberfäche (E-Cadherin,
Integrine,
Tight
Junction-Proteine
und
andere)
spielen
bei
der
Tumorzellmigration eine Rolle und regulieren die Fähigkeit von epithelialen
Tumoren zur Metastasierung, da nur durch Lockerung von Zellkontakten die
hierfür notwendige Zellmobilität erreicht werden kann. Von Tumorzellen oder
Zellen der extrazellulären Matrix exprimierte und sezernierte Proteasen (MatrixMetalloproteinasen, Plasminogen-Aktivator/Plasmin-System, Urokinase und
andere) haben wegen ihrer Fähigkeit zur Matrixdegeneration eine Bedeutung
für die Invasivität des Tumors bzw. die Überlebensfähigkeit von Metastasen in
entfernten Geweben. Sie sind auch in andere Signaltransduktionsprozesse
involviert, die sich auf die Expression von Wachstumsfaktoren, Cytokinen,
Chemokinen bzw. deren Rezeptoren auf der Zelloberfäche in Tumor- und
Stromazellen auswirken. Diese Proteine spielen wiederum bei der Induktion von
Stromazellen durch Tumorzellen, der Tumorzellproliferation sowie in der
Angiogenese eine Rolle. Tumorzellen schaffen so ein Netzwerk der
5
1. EINLEITUNG
Kommunikation, das ihr Überleben im Primärgewebe und insbesondere im
Rahmen der Metastasierung in Fremdgewebe sichern soll (Keleg et al., 2003).
Die Überexpression oder Herunterregulation von Adhaerens Junction, Tight
Junction und Tight Junction-assoziierten Proteinen könnte hierbei eine
entscheidende Rolle spielen. Die vorliegende Arbeit untersucht daher die
Metastasierungsabhängigkeit der Expression von Zelladäsionsproteinen in
Pankreaskarzinomzelllinien.
1.3.
Struktur und Funktion von Zelladhäsionsproteinen
1.3.1.
Der E-Cadherin-Catenin-Komplex
E-Cadherin ist ein Transmembranprotein mit einer Transmembrandomäne und
bindet mit seinem extrazellulär gelegenen N-terminalen Ende, welches aus 5
identischen, aneinandergereihten Einheiten besteht, ein Kalziumion. Das
Protein ist ein Mitglied der Cadherinfamilie, die mehr als 16 Mitglieder umfasst,
und ist epithelial lokalisiert. Interzellulär bildet E-Cadherin Homodimere mit
gleichartigen Proteinen der Nachbarzellen, interagiert aber auch heterophil mit
auf Lymphozyten lokalisierten Integrinen, was zu einer Retention von
Lymphozyten im Epithel führt. E-Cadherin ist in der Zellmembran in Adherens
Junctions lokalisiert und spielt eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung
multimolekularer
Adhäsionsvorgänge
in
der
Zelle.
Seine
Funktion
ist
kalziumabhängig, da dieses Ion als Schutz vor proteolytischer Spaltung durch
Proteasen dient (Harrington et al., 2000).
Die Verankerung der Adherens Junctions durch E-Cadherin am Zytoskelett wird
über eine Interaktion zwischen dem intrazellulär gelegenen C-terminalen Ende
von E-Cadherin mit Cateninen hergestellt, interzellulär bildet E-Cadherin
Homodimere mit gleichartigen Proteinen der Nachbarzellen (Abbildung 2)
(Harrington et al., 2000).
6
1. EINLEITUNG
Abbildung 2. Der E-Cadherin-Catenin-Komplex.
E-Cadherin vermittelt über eine Interaktion mit α-, β- und γ-Catenin die Verankerung der
Adherens Junction am Zytoskelett (α-cat, α-Catenin; β-cat, β-Catenin; γ-cat, γ-Catenin) (nach
Harrington et al., 2000).
Der E-Cadherin-Catenin-Komplex übt durch Zell-Zell- bzw. Zell-MatrixInteraktionen sowie durch Beteiligung an der intrazellulären Signaltransduktion
Einfluss auf die Homöostase des Epithels aus. Er reguliert unter anderem die
durch die Ausbildung von Tight Junctions hervorgerufene Zellpolarität der
Epithelzellen. Weiterhin wurde auch ein Einfluss auf Zellmigration und
-proliferation
beschrieben.
Unregelmäßigkeiten
im
E-Cadherin-Catenin-
Komplex führen zu einer gestörten Permeabilität des betroffenen Epithels. Eine
reduzierte oder abnormale Expression von E-Cadherin ist mit unterschiedlichen
humanen Karzinomen assoziiert und tritt insbesondere bei höhermalignen
Prozessen mit schlechter Überlebensrate auf. In der Pathogenese der
Metastasierung wird die E-Cadherin-Expression während der Intravasation
hochreguliert, während bei Extravasation und Etablierung von Tumorzellen in
7
1. EINLEITUNG
entferntem Gewebe wiederum niedrige E-Cadherin-Level vorliegen (Harrington
et al., 2000).
1.3.2.
Aufbau und Funktion von Tight Junctions
Tight Junctions werden im oberen Bereich der lateralen Membran von
Endothel-, Mesothel- oder Epithelzellen als eine die Zelle in ihrer Gesamtheit
umrundende, strang- bzw. netzartige Struktur ausgebildet. Durch Assoziation
mit Tight Junction-Strängen von Nachbarzellen kommt es hier optisch zu einer
Unterbrechung
des
Interzellularraums,
die
elektronenmikroskopisch
als
sogenannter „kissing point“ in Erscheinung tritt (Tsukita et al., 2001). Es findet
sich bei der Ausbildung von Zell-Zell-Kontakten durch Tight Junctions auch
tatsächlich eine Unterbrechung des parazellulären Flusses, das heißt eine
Obliteration des Interzellularraums, die eine Abgrenzung und Abdichtung
flüssigkeitsgefüllter Kompartimente gegeneinander bewirkt („barrier-function“)
(Tsukita et al., 2001).
Neben ihrer Wirkung auf den Interzellularraum haben Tight Junctions auch für
die Zelle selbst eine entscheidende Bedeutung. Zellen, die als Grenzstruktur
dienen, d.h. Endothel-, Mesothel und Epithelzellen, besitzen für die apikale und
basolaterale Membran spezifische Membranproteine und -lipide, was der
unterschiedlichen Funktion dieser Membranabschnitte als luminale oder
serosale Begrenzung der Zelle Rechnung trägt. Nach dem Flüssig-MosaikModell sind Membranproteine und -lipide jedoch in der Lage, sich innerhalb der
Zellmembran frei zu bewegen. Tight Junctions dienen hier offensichtlich als
Grenzstruktur, die von Membranproteinen bzw. -lipiden nicht überwunden
werden
kann
und
so
die
Ausbildung
spezieller
Funktionen
von
Membranabschnitten innerhalb einer Zelle ermöglicht („fence-function“) (Tsukita
et al., 2001). Tight Junctions werden von 3 verschiedenen integralen
Membranproteinen gebildet: Occludin, den Mitgliedern der Multigenfamilie der
Claudine und JAM (Abbildung 3). Die Proteine polymerisieren zu Tight JunctionSträngen und interagieren mit gleichen Strukturen in Nachbarzellen. Über
MAGUK´s (membranassoziierte Guanylatkinase-homologe Transmembranproteine) stellen sie eine Verbindung zum Zytoskelett her und nehmen über
8
1. EINLEITUNG
Interaktionen mit diesen und anderen Tight Junction-assoziierten Proteinen
Einfluß auf unterschiedliche Zellfunktionen. Die vielfältigen Funktionen der Tight
Junction-Proteine sind heute noch weitgehend unbekannt.
Abbildung 3. Verankerung von Tight Junctions am Zytoskelett.
Claudine und Occludin bilden das Gerüst der Tight Junctions. Beide Proteine interagieren mit der
PDZ-Domäne der membranassoziierten Guanylatkinase -homologen Transmembranproteinen
ZO (Zonula occludens) -1 und –2, die über α-Catenin eine Bindung zu den Aktifilamenten des
Zytoskeletts herstellen. (ZO, Zonula occludens; α-Ct, α-Catenin) (nach Rajasekaran et al., 2003).
1.3.2.1.
Das integrale Membranprotein Occludin
Occludin ist ein ca. 60 kD großes integrales Membranprotein mit 4
Transmembrandomänen und einem langen zytoplasmatisch gelegenen Cterminalen Ende (Abbildung 4). Dieses interagiert mit den PDZ-Domänen Tight
Junction- assoziierter zytoplasmatischer Proteine (s. u.). Occludin war das erste
Protein, für das eine Beteiligung an der Ausbildung von Tight Junctions
beschrieben wurde (Furuse et al., 1993). Die Expression von Occludin korreliert
9
1. EINLEITUNG
mit der Anzahl der vorhandenen Tight Junction -Stränge in verschiedenen
Geweben, sodass davon ausgegangen werden kann, dass Occludin in Tight
Junctions mit relativ konstanter Dichte rekrutiert wird (Saitou et al., 1997).
Abbildung 4. Die Struktur von Occludin.
Das Tight Junction-Protein besitzt 4 Transmembrandomänen und 2 extrazelluläre Loops. Der
erste extrazelluläre Loop ist reich an Glycin und Tyrosin (60%). Mit seinem langen C-terminalen
Ende (C) geht Occludin Bindungen mit den PDZ-Domänen Tight Junction-assoziierter Proteine
ein (nach Tsukita et al., 2001).
Es werden auch in Occludin-defizienten Zellen Tight Junctions ausgebildet, bei
einigen Spezies konnten Occludin-defiziente Zellen in verschiedenen Geweben
nachgewiesen werden. Eine Interaktion von in Tight Junctions lokalisiertem
Occludin mit der entsprechenden Struktur in Nachbarzellen wurde bisher nicht
beschrieben. Tatsächlich scheint Occludin auf die „barrier function“ wenig
Einfluß zu haben. Vielmehr spielt es eine Rolle bei der Verankerung von Tight
Junctions an den Aktinfilamenten des Zytoskeletts (Kuwabara et al., 2001). Die
10
1. EINLEITUNG
vollständige Funktion von Occludin in der Zelle ist jedoch noch weitgehend
unbekannt.
1.3.2.2.
Die Multigenfamilie der Claudine
Claudine sind zwischen 22 und 24 kD große Transmembranproteine, die als
Komponenten von Tight Junctions identifiziert wurden (Furuse et al., 1998). Ihr
Name leitet sich von dem lateinischen Verb „claudere“ (= schließen) ab.
Nachdem zunächst die Proteine Claudin-1 (Abbildung 5) und Claudin-2
beschrieben wurden (Furuse et al., 1998), erfolgte bis heute die Identifikation
von 22 weiteren Mitgliedern dieser Proteinfamilie (Tsukita et al., 2001).
Alle Claudine besitzen 4 Transmembrandomänen mit Seqenzhomologien in der
ersten und vierten Transmembrandomäne sowie im ersten und zweiten
extrazellulären Loop. Bei allen Mitgliedern der Proteinfamilie wird der erste
extrazelluläre Loop im Vergleich zum zweiten als länger und hydrophober
beschrieben. Das intrazellulär gelegene C-terminale Ende der Claudine ist mit
der Aminosäuresequenz Tyrosin-Valin ausgestattet (Morita et al., 1998). Dies
macht eine Bindung an Tight Junction-assoziierte Proteine mit PDZ-Domäne
möglich (Itoh et al., 1999).
11
1. EINLEITUNG
Abbildung 5. Die Struktur von Claudin-1.
Das Protein ist ein Vertreter der Proteinfamilie der Claudine. Die 24 Mitglieder weisen alle 4
Transmembrandomänen und 2 extrazelluläre Loops auf. Der erste extra-zelluläre Loop ist länger
und hydrophober als der zweite und dient wahrscheinlich der Assoziation der Claudine
untereinander. Mit ihrem C-terminalen Ende interagieren die Claudine mit der PDZ -Domäne
Tight Junction -assoziierter Proteine (nach Tsukita et al., 2001).
Neben Interaktionen mit zytoplasmatischen Proteinen ist auch die Ausbildung
der Zell-Zell-Kontakte im Bereich der Tight Junctions mit den Claudinen
assoziiert. Über den bereits erwähnten ersten extrazellulären Loop kommen
Interaktionen zwischen den in Tight Junctions lokalisierten Claudinen zustande,
wobei nicht nur homophile Bindungen zwischen derselben, sondern auch
heterophile Bindungen zwischen unterschiedlichen Claudinspezies auftreten
können. Nicht alle Claudine sind jedoch untereinander zu dieser Art der
Interaktion befähigt (Furuse et al., 1999). Ein weiterer Einflussbereich der
Claudine ist die Regulation des parazellulären Flusses, der durch Tight
Junctions zunächst blockiert wird („barrier function“). Claudine sind an der
Ausbildung von Poren innerhalb der Tight Junctions beteiligt, die einen
12
1. EINLEITUNG
selektiven Fluss bestimmter Ionen ermöglichen. Für Claudin-2 (Amasheh et al.,
2002), Claudin-4 (Van Itallie et al., 2001) und Claudin-16/Paracellin-1 (Simon et
al., 1999) wurde eine Beteiligung an kationenselektiven Kanälen beschrieben
(Abbildung 6). Die Zahl und Dichtigkeit von Tight Junctions variiert in
unterschiedlichen
Geweben
entsprechend
ihrer
Lokalisation
bzw.
physiologischen Funktion erheblich.
Abbildung 6. Poren innerhalb von Tight Junctions beeinflussen den parazellulären Fluß.
Schematische Darstellung der dreidimensionalen Tight Junction-Struktur: Jeder Tight JunctionStrang ist lateral an den „Kissing Points“ mit dem einer benachbarten Zelle assoziiert. An den
„Kissing Points“ ist der Interzellularraum obliteriert. Spezifische Claudine sind an der Bildung von
Poren in Tight Junction-Strängen beteiligt und nehmen damit Einfluss auf den parazellulären Fluß
und die Spezifität von Tight Junctions in bestimmten Geweben (nach Tsukita et al., 2001).
13
1. EINLEITUNG
1.3.2.3.
JAM
Das integrale Membranprotein JAM
(Junctional
adhesion
Transmembranprotein
mit
molecule)
einer
ist
ein
ca.
40
Transmembrandomäne.
kD
großes
Sein
langes
extrazellulär gelegenes N-terminales Ende besitzt zwei immunglobulinähnlich
gefaltete Schleifen, die durch Disulfidbrücken aufrechterhalten werden. JAM ist
in epithelialen Zellen lateral mit den das Tight Junction-Gerüst bildenden
Claudinen assoziiert und am Adhäsionsprozess beteiligt. Diesem Protein wird
auch eine Rolle bei der Extravasation von Monozyten zugeschrieben. Das
Wissen über die vollständige Funktion von JAM ist jedoch begrenzt.
1.3.2.4.
Tight Junction-assoziierte Proteine
Tight Junctions sind zytoplasmatisch mit einem dichten Proteinnetzwerk
assoziiert (Abbildung 7). Dieses vermittelt die Verankerung von Tight JunctionSträngen am Zytoskelett, stellt eine Verbindung zu zytoplasmatischen
Regulationsprozessen her und vermittelt erfolgreichen Vesikeltransport und
Zellpolarität. Sowohl Occludin als auch die Mitglieder der Multigenfamilie der
Claudine binden mit ihrem intrazellulären C-terminalen Ende an ZO-1 (220 kD),
ZO-2 (160 kD) und ZO-3 (130 kD) (Tsukita et al., 2001). Diese Proteine sind
Mitglieder der Superfamilie der MAGUK´s (membrane-assoziated guanylate
kinases) und besitzen jeweils 3 PDZ-Domänen, eine SH3 (sre homology)Domäne und eine GUK (guanylat kinase-like)-Domäne. Claudine binden an die
erste PDZ-Domäne der MAGUK´s, während Occludin mit deren GUK-Domäne
interagiert. ZO-1, -2, und -3 stellen eine Verbindung zu den Aktinfilamenten des
Zytoskeletts her, die unterhalb des junktionalen Komplexes lokalisiert
gemeinsam mit Myosin II eine ringförmige Struktur bilden, und rekrutieren über
ihre freien Domänen weitere Proteine an die Plasmamembran (Mitic et al.,
2000).
Zu diesen gehört Cingulin (140-160 kD), ein Phosphoprotein, das direkt mit ZO1 interagiert und strukturelle Ähnlichkeit zu Myosin besitzt. Auch Symplectin
(150 kD) und 7H6 (155 kD) sind Tight Junction -assoziiert, ebenso rab 3B, rab
13, Sec 6/8 und VAP (VAMP [vesicle-associated membrane protein]
-associated protein) -33 die Funktionen im Vesikeltransport einnehmen. Weitere
14
1. EINLEITUNG
Proteine besitzen PDZ-Domänen und können an die Plasmamembran rekrutiert
werden (Mitic et al., 2000). Über diesen makromolekularen Komplex sind Tight
Junctions in viele funktionelle Prozesse der Zelle und der extrazellulären Matrix
eingebunden.
Abbildung 7. Schematisches Modell der Proteininteraktionen an Tight Junctions.
ZO (Zonula occludens) -1 interagiert mit Mitgliedern der Multigenfamilie der Claudine und
Occudin. ZO-1 rekrutieret weitere Proteine zu einem makromolekularen, Tight Junctionassoziierten Komplex: ZO-2 und –3, Aktin, AF-6, ZAK und ZONAB (ZO-1-associated nucleic
acid-binding protein) sowie BAP-1 (BAI-associated protein), ASIP (atypical PKC [protein kinase
C] isotype-specific interacting protein) VAP (VAMP [vesicle-associated membrane protein]
associated protein) und JAM (junction adhesion molecule) (nach Mitic et al., 2000).
15
1. EINLEITUNG
1.4.
Die Rolle des MAPK-Signaltransduktionsweges im
Prozess der Metastasierung
Der
MAPK
(Mitogen-activated
protein
kinase)
-Signaltransduktionsweg
(Abbildung 8) ist ein bedeutender Faktor bei eukaryontischen Zellregulation. Er
wird durch viele sehr verschiedene Stimuli aktiviert und nimmt Einfluss auf
Zellproliferation, -wachstum, -differenzierung, -migration, -alterung und -tod. Die
Aktivierung von MAPK erfolgt durch die MAPK-Kinasen oder MEKs (MAPK/
ERK [extracellular signal regulated kinase] kinases) die wiederum von MEKKinasen
aktiviert
letztendlich
werden.
zur
Transkriptionsfaktoren,
Der
dreistufige
Signaltransduktionsweg
Phosphorylierung
definierter
Proteinkinasen,
Phospholipasen
Substrate
und
führt
wie
Zytoskelett-
assoziierte Proteine an Serin/Thyronin-Endsequenzen durch MAPK. Die
gesteigerte Expression von Aktivatoren bzw. die dauerhafte Aktivierung des
MEK-ERK-Signaltransduktionsweges
wurde
in
einschließlich
Kolon-,
Pankreas-,
Mamma-,
Lungen-,
humanen
Karzinomen
Prostata-
und
Nierenkarzinom sowie bei akuten Leukämien und malignen Gliomen gefunden
und steht im Zusammenhang mit Tumorprogression und Metastasierung
(Schramek et al., 2002). Während Experimente mit einem oralen MEK-Inhibitor
bei Mäusen zur Suppression von Tumorwachstum führte (Schramek et al.,
2002), konnte in ersten klinischen Studien mit einem oralen MEK-Inhibitor zur
Behandlung des Mamma-, Kolon- und Pankreaskarzinom beim Menschen
lediglich eine Tumorprogression verhindert werden, eine Remission wurde nicht
erreicht (Rinehart et al., 2004).
16
1. EINLEITUNG
Abbildung 8. Der MAPK (Mitogen-activated protein kinase)-Signaltransduktionsweg
Der dreistufige Signaltransduktionsweg beeinflusst über eine Phosphorylierung definierter
Substrate wie Transkriptionsfaktoren, Proteinkinasen, Phospholipasen und Zytoskelettassoziierte Proteine an Serin/Thyronin-Endsequenzen Zellfunktionen wie Zellproliferation,
-wachstum, -differenzierung, -migration, -alterung oder –tod. ERK, extracellular signal regulated
kinase; MEK, MAPK/ ERK kinase; MP1, MEK partner 1; ksr, Kinase suppressor of Ras (nach
O´Neill und Kolch 2003).
17
1. EINLEITUNG
1.5.
Fragestellung
Die infauste Prognose des duktalen Adenokarzinoms des Pankreas wird durch
die relative Symptomfreiheit des Primärtumors sowie eine frühe Metastasierung
verursacht. Verschiedene Theorien zum Prozess der Metastasierung („homing
theory“ und „fertil soil theory“, Keleg et al., 2003) unterstellen eine Interaktion
von
Tumorzellen
und
Zielgewebe
über
Oberflächenproteine
wie
Zelladhäsionsproteine oder chemotaktische Substanzen, die Migration und
Überleben
der
Tumorzellen
Zelladhäsionsproteinen
kann
ermöglichen.
unter
anderem
Die
Expression
durch
den
von
MAPK-
Signaltransduktionsweg reguliert werden. Die vorliegende Arbeit hatte daher
zum Ziel,
1.
die Transkription ausgewählter Tight Junction- und Adherens JunctionProteine in duktalen und neuroendokrinen Pankreaskarzinomzelllinien
zu charakterisieren sowie deren möglicherweise metastasierungsabhänge Expression nachzuweisen.
2.
ein gewebe- und zellspezifisches Expressionsprofil des Tight JunctionProteins Claudin-7 zu erstellen
3.
die subzelluläre Lokalisation von Claudin-7 in Pankreaskazinomzelllinien zu untersuchen.
4.
zu untersuchen, welche Rolle der MAPK-Signaltransduktionsweg bei
der Translation und Lokalisation von Tight Junction- und Adherens
Junction
-Proteinen
Subzelllinien spielt.
18
im
Metastasierungsmodell
der
SUIT
2
2. MATERIAL UND METHODEN
2.
Material und Methoden
2.1.
Geräte
2.1.1.
Laborgeräte
Analysenwaage:
AE 163
Mettler, Gießen
Autoklav:
Laborautoklav Typ GLA 40
Fritz Gössner, Hamburg
Brutschrank:
BK 5060 E
Bunsenbrenner
Heraeus, Hanau
Roth, Karlsruhe
Filmentwickler:
Curix 60
AGFA, Leverkusen
Fluoreszenzmikroskop:
Axioplan 2
Zeiss, Jena
Fotokamera:
MC80 DX
Zeiss, Jena
Heizblock:
DRI-Block DB1 und DB2A
Techne, Princeton, USA
Thermomixer 5436
Eppendorf, Hamburg
Hybridisierungsofen
Bachhofer, Reutlingen
Inkubationshaube Certomat HK
Braun, Melsungen
Magnetrührer:
MR3001
Mikrowelle AVM 434
Heidolph, Gießen
Whirlpool
PCR-Cycler:
Thermo-Dux PHC-3
Techne, Princeton, USA
Progene-05
Techne, Princeton, USA
19
2. MATERIAL UND METHODEN
Pipetten: 10, 20, 100, 200, 1.000
Eppendorf, Hamburg
Pipettierhilfe: Pipetus-Akku
Hirschmann Laborgeräte,
Eberstadt
Radioaktiv-Abfallcontainer
Roth, Karlsruhe
UV Crosslinker 2400
Stratalinker, Kalifornien, USA
Tisch-Rundschüttler Certomat R
Braun, Melsungen
Tischzentrifugen:
Biofuge 13, Sepatech
Heraeus, Hanau
Biofuge 15R, Sepatech
Heraeus, Hanau
MicroCen 13
Herolab, Wiesloch
Labsonic U
Braun, Melsungen
Vortex: REAX 2000
Heidolph, Kelheim
Waage: 572-33
Kern, Albstadt
Wasserbad
Köttermann, Hänigsen
Zentrifugen:
Cryofuge 800
Heraeus, Hanau
Rotixa ROR
Hettich, Tuttlingen
2.1.2.
Elektrophorese-Geräte und Zubehör
Agarose-Gelelektrophorese:
HE 99, HE 33 Minigel
Hoefer, Heidelberg
Blotting-Apparatur:
Mini-Trans-Blot
BioRad, München
Netzgeräte:
PS 500 XT
Hoefer, Heidelberg
3000 Xi
BioRad, München
Röntgenkassetten
20
DuPont, Bad Nauheim
2. MATERIAL UND METHODEN
SDS-Gelelektrophorese:
EC120 Mini-Vertikal Gel System
2.1.3.
EC, New York, USA
Zellkultur
Inkubator:
Cytoperm 8080
Heraeus, Hanau
Series 6000
Heraeus, Hanau
Mikroskop:
Olympus IX 50
Olympus, Hamburg
Olympus IMT-2
Olympus, Hamburg
Neubauer-Kammer
Schreck, Hofheim
Sterile Werkbank: Lamin Air HLB 2448
Heraeus, Hanau
Stickstoff-Tank: 35 VHC
tec-Lab, Königstein
Zentrifuge: Labofuge GL
Heraeus, Hanau
2.1.4.
Analytische Geräte
Sequenziergerät:
Abi-Prism 310 Genetic Analyzer
Perkin-Elmer, Langen
Sequenzierungsauswertung: Hard/Software
Power macintosh G3
Spektralphotometer: Uvikon 860
2.1.5.
Apple, Kalifornien, USA
Kontron, Eching
Kühlgeräte
-80°C: UF 75-45 DS, E80
Colora Messtechnik GmbH,
Lorch
-20°C
Liebherr, Ochsenhausen
+4°C
Liebherr, Ochsenhausen
Eismaschine: 50-35
Ziegra, Isernhagen
21
2. MATERIAL UND METHODEN
2.2.
Chemikalien, Enzyme und Verbrauchsmaterialien
2.2.1.
Enzyme
BamH I Restriktionsendonuclease
New England Biolabs, MA, USA
Benzonase Nuklease
Novagen
Eco RI Restriktionsendonuclease
New England Biolabs, MA, USA
HindIII Restriktionsendonuclease
MBI, Litauen
Klenow
Boehringer, Mannheim
RNAse A
Boehringer, Mannheim
Proteas Arrest
Genotec, Montana, USA
Proteinase K
Qiagen, Hilden
DNAse I
Pharmacia, Freiburg
DNA-Ligase
Gibco, Eggenstein
Superscript II
Gibco, Eggenfelden
Taq-Polymerase
Qiagen, Hilden
2.2.2.
Sequenzierung und Polymerase-Kettenreaktion
DNA-Sequencing Kit
ABI PRISM, Warrington, UK
dNTP Mix
MBI, Litauen
MgCl-Puffer 10fach
Qiagen, Hilden
Oligonukleotide
MWG-Biotech, München
Oligonukleotide
Metabion, Martinsried
Q-Puffer
Qiagen, Hilden
5fach First Strand Puffer
Gibco, Eggenstein
DTT
Gibco, Eggenstein
Oligo(dT)12-18 Primer
Gibco, Eggenstein
2.2.3.
Elektrophorese
Acrylamidlösung
Roth, Karlsruhe
Agarose
Sigma, München
Agarose
Promega WI, USA
APS (Ammoniumpersulfat)
BioRad, München
22
2. MATERIAL UND METHODEN
Ethidiumbromid
Sigma, München
Nitrozellulose-Membran
Schleicher & Schüll, Dassel
Harnstoff
Merck, Darmstadt
Marker III
MBI, Litauen
Marker VIII
MBI, Litauen
MOPS
Sigma, München
Loading Dye
MBI, Litauen
Protein Marker, Broad Range
NEB, New England, USA
TEMED
Sigma, München
2.2.4.
Chemikalien und Puffer
BIO RAD-Reagenz
BIO RAD Laboratories
Kalifornien, USA
Borsäure
Merck, Darmstadt
Bromphenolblau
Sigma, München
BSA
Sigma, München
DAPI
Sigma, München
DEPC
Sigma, München
Digitonin
Merck, Darmstadt
DTT
Sigma, München
ECL
Ammersham, Freiburg
EDTA
Roth, Karlsruhe
EGTA
Serva, Heidelberg
Eisessig
Sigma, München
Essigsäure
Sigma, München
Ethanol
Riedel de Haehn AG, Seelze
Formaldehyd
Sigma, München
Formamid
Sigma, München
Glycerin
Sigma, München
HCl
Merck, Darmstadt
Isopropanol
Sigma, München
Magnesium-Chlorid
Sigma, München
23
2. MATERIAL UND METHODEN
Methylenblau
Sigma, München
Milchpulver
Difco, Detroit, USA
MOPS
Sigma, München
Natrium-Acetat
Merck, Darmstadt
Natrium-Chlorid
Merck, Darmstadt
Natrium-Citrat
Merck, Darmstadt
Natrium-Bisulfat
Sigma, München
NEB 2-Puffer
New England Biolabs, MA, USA
NP-40
Calbiochem, Kalifornien, USA
PCI
Biomol, Hamburg
PMSF
Sigma, München
Protein Assey
Bio-Rad, München
RNA Clean
AGS, Heidelberg
SDS
Serva, Heidelberg
SlimFast Schokolade
Slim-Fast Food Company,
Florida, USA
Tris-Base
USB, Cleveland, USA
Tris/HCl
Sigma, München
Tween 20
Fluka, Neu-Ulm
2.2.5.
Radioaktive Substanzen
α[32P]dCTP (5.000 Ci/mol, 10 mCi/ml)
2.2.6.
Amersham, Braunschweig
Antikörper
Primärantikörper
Anti-Claudin-1
polyklonal Kaninchen IgG
Zymed, Kalofornien USA
Anti-Claudin-2
polyklonal Kaninchen IgG
Zymed, Kalifornien, USA
Anti-Claudin-4
monoklonal Maus IgG
24
Zymed, Kalifornien, USA
2. MATERIAL UND METHODEN
Anti-Claudin-5
polyklonal Kaninchen IgG
Zymed, Kalifornien, USA
Anti-Occludin
polyklonal Kaninchen IgG
Santa Cruz, Kalifornien, USA
Anti-ZO-1
polyklonal Kaninchen IgG,
Santa Cruz, Kalifornien, USA
Anti ZO-2
polyklonal Ziege IgG,
Santa Cruz, Kalifornien, USA
Anti E-Cadherin
polyklonal Ziege IgG,
Santa Cruz, Kalifornien, USA
Anti-actin HRP-konjugiert
polyklonal Ziege IgG
Santa Cruz, Kalifornien, USA
Anti-His(C-term)-FITC-konjugiert
monoklonal Maus IgG
Invitrogen, Karlsruhe
Anti-myc-FITC-konjugiert
monoklonal Maus IgG
Invitrogen, Karlsruhe
Sekundärantikörper:
Esel anti Kaninchen, FITC-konjugiert
Santa Cruz, Kalifornien, USA
Esel anti Maus, FITC-konjugiert
Santa Cruz, Kalifornien, USA
Esel anti Ziege, FITC-konjugiert
Santa Cruz, Kalifornien, USA
Ziege anti Kaninchen, HRP-konjugiert
Cell Signaling, MA, USA
Pferd anti Maus, HRP-konjugiert
Cell Signaling, MA, USA
Esel anti Ziege, HRP-konjugiert
Santa Cruz, Kalifornien, USA
25
2. MATERIAL UND METHODEN
2.2.7.
Bakterienkultur
Agar
Gibco, Eggenstein
Ampicillin
Sigma, München
Glycerol
Sigma, München
Hefeextrakt
Difco, Detroit, USA
Natriumchlorid
Roth, Karlsruhe
Trypton
Difco, Detroit, USA
2.2.8.
Zellkultur
5-Aza-2´-Deoxycytidin
Sigma, München
DMSO
Sigma, München
Feuchte Kammer
Eigenkonstruktion
Fötales Kälberserum
PAA GmbH, Linz, Österreich
Gewebekulturflaschen und -schalen
Greiner, Frickenhausen
HEPES Puffer
Gibco, Eggenstein
Lab-Tec Chamber-slides
Nalge Nunc, Illinoi, USA
Lipofektamin
Invitrogen, Karlsruhe
Medium (RPMI, DMEM)
Gibco, Eggenstein
PD98059 (MEK1 Inhibitor)
Cell Signaling, MA, USA
Penicillin-Streptomycin
Gibco, Eggenstein
Pferdeserum
PAA GmbH, Linz, Österreich
Plus Reagenz
Invitrogen, Karlsruhe
Trypsin-EDTA
Gibco, Eggenstein
2.2.8.1.
Pankreastumorzelllinien
Die duktalen Pankreaskarzinomzelllinien AsPC-1, Capan-2, MIAPaCa-2 und
Panc-1 wurden von der American Type Culture Collection (Rockville, MD)
bezogen, die Zelllinien PC-2, PC-3 und PC-44 waren von M.Bülow, Mainz
freundlicherweise zur Verfügung gestellt, während PaTu 8902, PaTu8988S,
PaTu8988T, HPAF und PaTu-II von H. Kern, Marburg zur Verfügung standen
(Metzgar et al, 1982; Kim et al, 1989; Elsässer et al, 1992). Die duktalen
Pankreaskarzinom SUIT-2 Subklone (SUIT-2 S2-007, SUIT-2 S2-013, SUIT-2
26
2. MATERIAL UND METHODEN
S2-020 und SUIT-2 S2-028) wurden von Iwamura, Miyazaki, Japan (Iwamura et
al.,1987) zur Verfügung gestellt. Die neuroendokrinen Pankreastumorzelllinien
BON I und QGP-1 wurden über Stefan Rosevicz, Berlin bezogen (Evers et al,
1992).
2.2.9.
Verbrauchsmaterialien
Ambion DECAprimeII-Kit
Ambion, Texas, USA
Flouprep
Bio Mérieux, Marcy l´Etoile,
Frankreich
Gel-Blotting-Papier
Schleicher & Schüll
Hybond-Nylon-Membran
Amersham, Braunschweig
Kodak Ektachrome 64T Filme
Kodak, New York State, USA
Liqud Blocker Super Pap Pen
Daido Sangyo, Tokio, Japan
Multiple Tissue Expression Array
Clontech, Kalifornien, USA
Nitrocelulose-Membran
Schleicher & Schuell, Dassel
Nucleobond PC 500-Kit
Marchery-Nagel, Düren
Nucleospin Plasmid-Kit
Marchery-Nagel, Düren
Pipettenspitzen
Eppendorf, Hamburg
Polypropylenröhrchen (15, 50 ml)
Greiner, Frickenhausen
QIAquick Gel Extraction Kit
Qiagen, Hilden
Quarzküvetten
Hellma, MühlheimBaden
Reaktionsgefäße (0,5, 1,5, 2,0 ml)
Eppendorf, Hamburg
Röntgenfilme
Kodak, New York State, USA
Whatmanpapier
Whatman, Maidstone,
Großbritannien
2.2.10.
Plasmide und kompetente Zellen
ElektroMAX E.coli DH10 B
Gibco, Eggenstein
PcDNA 3.1/V5 TOPO TA Expression Kit
Invitrogen, Karlsruhe
PcDNA/TO/myc-His Typ A
Invitrogen, Karlsruhe
27
2. MATERIAL UND METHODEN
2.2.11.
Oligonukleotide
Tabelle 1:
In der PCR und RT-PCR eingesetzte Primer
Name Primer
Genbank
Exon
Sequenz
accession
Fragmentgröße
number
ß-Aktin f
NM_001101 3
5`-ATC TGG CAC CAC ACC
838 bp
TTC TAC AAT GAG CTG CG3`
ß-Aktin r
NM_001101 6
5`-CGT CAT ACT CCT GCT
TGC TGA TCC ACA TCT GC3`
Claudin1f
XM_036434 1
5`-ATG GAT CGG CGC CAT
265 bp
CGT CAG-3´
3
Claudin1r
5´-AGT GAA GAG AGC CTG
AC-3´
T47-5´-Oligo XM_010309
5´-ATG GCC TCT CTT GGC
(Claudin-2)
CTC CAA CTT-3`
T47genR
5´-AGT GGA GTC AGA GTC
(Claudin-2)
CGC TG-3´
Claudin3f
NM_001306 1
5´-CAG CAA CAT CAT CAC
693 bp
555 bp
GTC GCA G-3´
Claudin3r
1
5´-TAG ACG TAG TCC TTG
CGG TCG TAG-3´
Claudin4f
NM_001305 1
5´-GAT GAA CTG CGT GGT
477 bp
GCA GAG CAC-3´
Claudin4r
1
5´-TAC ACG TAG TTG CTG
GCA GC-3´
Claudin5f
XM_009839 1
5´-TGC GCG TCT CGC CTC
TAG CCA TG-3´
Claudin5r
1
5´-TCA GAC GTA GTT CTT
CTT GTC G-3´
28
474 bp
2. MATERIAL UND METHODEN
Name Primer
Genbank
Exon
Sequenz
accession
Fragmentgröße
number
Claudin7f
XM_008338 1
5`-AGT GGC AGA TGA GCT
357 bp
CCT ATG CG-3`
Claudin7r
3
5`-AGT CTG TGA CAA TCT
GAT G-3`
Claudin7f
XM_008338 1
5`-AGT GGC AGA TGA GCT
257 bp
CCT ATG CG-3`
Claudin-7 r
2
TCC-3`
769
Claudin- 7
XM_008338 2
5´-CAT GAA GTG CAC GCG
141 bp
CTG TG-3`
Exon 2 f
Claudin7r
5`-CTT CAC TTT GTC GTC
3
5`-AGT CTG TGA CAA TCT
GAT G-3`
Claudin7
XM_008338 1
5´-GAT GCT TGA TAT GGC
636bp
CAA TTC GGG CCT GCA G-
HindIII f
3`
Claudin7
4
ACT CCT TGG AAG AG-3´
EcoRI r
Claudin7
5`- GAT CGA ATT CCA CAT
XM_008338 1
5´-GAT CGA ATT CGA TAT
636 bp
GGC CAA TTC GGG CCT
EcoRI f
GCA G-3`
Claudin7
4
ACT CCT TGG AAG AG-3`
HindIII r
Claudin12f
5´- GAT CAA GCT TCA CAT
XM_004591 1
5´-ATG TCC ACG CAG CCA
522 bp
CAG TC-3´
Claudin12r
1
5´-TAG TGA CAT ACA CTG
CAT AGT C- 3´
Claudin14f
XM_009753 2
5´-GAG TGT GTG TGG CAC
564 bp
AGC AC- 3´
29
2. MATERIAL UND METHODEN
Name Primer
Genbank
Exon
Sequenz
Fragment-
accession
größe
number
2
Claudin14r
5´-TCA CAC GTA GTC GTT
CAG CCT GTA C- 3´
524 bp
5´-CTC AGT GGA GAG TAT
XM_012979 1
Claudin17f
CAG C- 3´
1
Claudin17r
5´-GTA GCC AGG CAC TGG
ATA TCT GTA C- 3´
2.3.
Sicherheitsvorkehrungen und Abfallbeseitigung
Gentechnische
Arbeiten
Gentechnikgesetzes
und
wurden
der
gemäß
den
Richtlinien
Gentechniksicherheitsverordnung
nur
des
in
zugelassenen Räumen der Sicherheitsstufe S1 durchgeführt. Der Umgang mit
radioaktiven
Substanzen
erfolgte
entsprechend
den
gesetzlichen
Bestimmungen. Zum Schutz gegen Kontamination von Haut und Kleidung
wurden
Einweghandschuhe
und
Laborkittel
getragen.
Die
individuelle
Strahlenbelastung wurde mit einer Dosimeterplakette gemessen. Radioaktiver
Abfall sowie Lösungsmittelreste und giftige Feststoffe wurden getrennt in
entsprechenden Behältern gesammelt und der vorgeschriebenen Beseitigung
zugeführt.
2.4.
Molekularbiologische Methoden
2.4.1.
Isolierung von Gesamt-RNA aus Zellen
Das Nährmedium wurde aus der Zellkulturflasche entfernt und die Zellen mit 1x
PBS gewaschen. Nach Zugabe von 4 ml RNA Clean wurde die Flasche 5 min
bei Raumtemperatur niedrigfrequent geschüttelt und der Inhalt anschließend in
30
2. MATERIAL UND METHODEN
ein Zentrifugenröhrchen überführt. Nach Zugabe von 1/10 Volumen Chloroform
stand die Probe 15 min auf Eis, um anschließend bei 4°C mit 5.000 UpM für 20
min zentrifugiert zu werden. Die obere Phase wurde daraufhin mit einem
gleichen Volumen Isopropanol versetzt und erneut 15 min auf Eis gestellt.
Danach erfolgte eine weitere Zentrifugation bei 4°C mit 14.000 UpM für 15 min.
Nach Abnahme der Flüssigkeit wurde das Pellet in 200 µl DNAse I Puffer
aufgenommen und mit 20 U DNAse I für 30 min bei 37°C inkubiert. Die
Entfernung der Proteine nach der enzymatischen Reaktion erfolgte durch
Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (PCI) (25:24:1) -Extraktion. Die Probe wurde
bei 4°C mit 14.000 UpM 10 min zenrifugiert und die obere Phase anschließend
zur Präzipitation der RNA mit 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat und der 3fachen Menge 100%igen Ethanols versetzt. Nach 2 h Kühlung bei -80°C und
Zentrifugation bei 4°C mit 14.000 UpM für 15 min erfolgte die Abnahme des
Überstandes und ein Waschvorgang
mit 70% Ethanol. Nach kurzer
Zentrifugation und Entfernen des Alkohols folgte die Trocknung des Pellets bei
37°C im Heizblock. Das Pellet wurde anschließend in 400 µl TE-Puffer
aufgenommen. Die Isolation von RNA für die Experimente mit und ohne 5-AzaCdR Behandlung erfolgte durch Verwendung des ”RNeasy Mini Kit” unter
Beachtung des Herstellerprotokolls.
2.4.2.
Isolierung von DNA aus Zellen
Nach Entfernung des Nährmediums aus der Zellkulturflasche wurden die Zellen
mit 1x PBS gewaschen und anschließend 2 ml denaturierende DNAse StopLösung 5x und 8 ml 1x PBS hinzugefügt. Dann wurde die Probe mit 250 µg
RNAse A versetzt und anschließend 1 h bei 37°C inkubiert. Es folgte die
Zugabe von 400 µg Proteinase K. Die Probe wurde über Nacht langsam
geschwenkt und dann in ein Probenröhrchen überführt. Die Entfernung der
Enzyme erfolgte durch einmalige Phenol- und zweimalige PCI-Extraktion. Die
DNA wurde präzipitiert durch Zugabe von 1/10 Volumen Natriumacetat und
einer 3-fachen Menge 100% Ethanols, anschließender Kühlung bei -80° C für 2
h und Zentrifugation bei 4°C mit 14.000 UpM für 15 min. Anschließend erfolgte
ein Waschvorgang mit 70% Ethanol und die Aufnahme des Pellets in 500 µl TEPuffer.
31
2. MATERIAL UND METHODEN
2.4.3.
Quantifizierung von DNA und RNA
Die Bestimmung der Konzentration einer RNA- oder DNA-Lösung erfolgte
photometrisch bei 260 nm. Die Ausgangslösung wurde abhängig von der
vermuteten Konzentration 1:100 auf ein Volumen von 500 µl verdünnt und in
eine Quarzküvette gegeben. Die gemessene optische Dichte sollte im Bereich
von 0,1 bis 1,0 liegen. Der DNA-Gehalt konnte so annähernd errechnet werden:
doppelsträngige DNA:
1 OD260 = 50 µg/ml
einzelsträngige DNA bzw. RNA:
1 OD260 = 40 µg/ml
Die
Bestimmung
der
Reinheit
errechnet
sich
aus
dem
Quotienten
OD260/OD280. Er sollte im Bereich von 1,8 bis 2,0 liegen.
2.4.4.
Northern-Blot -Analyse
Verwendete Lösungen:
DEPC-Wasser:
1 ml DEPC in 1 l Aqua bidest.
Nach Inkubation bei Raumtemperatur über Nacht autoklavieren
10 x MOPS:
1l
41,9 g
MOPS
6,8 g
Natrium-Acetat
3,8 g
EDTA
12 ml
Eisessig
1 ml
DEPC
mit Aqua bidest. auf ein Gesamtvolumen von 1l auffüllen
pH 5,5-7,0
Nach Inkubation bei Raumtemperatur über Nacht mindestens 30 min
autoklavieren, im Dunkeln lagern.
32
2. MATERIAL UND METHODEN
20x SSC:
1l
175,32 g
Natrium-Chlorid
88,23 g
Natrium-Citrat
mit Aqua bidest. auf ein Gesamtvolumen von 1 l auffüllen
Probenpuffer:
250 µl
Formamid
83 µl
Formaldehyd (37%)
50 µl
10x MOPS
0,1%
Bromophenolblau
Methylenblau:
1l
24 ml
Eisessig
65,6 g
Natrium-Acetat
400 mg
Methylenblau
mit DEPC-Wasser auf ein Gesamtvolumen von 1 l auffüllen
Waschlösung 1:
1l
100 ml
20fach SSC
2,5 ml
20% SDS
mit DEPC-Wasser auf ein Gesamtvolumen von 1 l auffüllen
Waschlösung 2:
1l
5 ml
20fach SSC
5 ml
20% SDS
mit DEPC-Wasser auf ein Gesamtvolumen von 1 l auffüllen
2.4.4.1.
Formaldehyd-Gelelektrophorese
Zur elektrophoretischen Auftrennung der RNA wurde ein 1,6 %iges Agarosegel
mit 2% Formaldehyd (37%) in 1x MOPS genutzt. Jeweils 10 ng der aus
PaTu8988S und PaTu8988T Zelllinien isolierte RNA wurden in 25 µl
Probenpuffer und 37,5 µl DEPC-Wasser resuspendiert. 3 µl des RNA-Markers
wurden mit 4 µl DEPC-Wasser und 14 µl Probenpuffer vorbereitet. Nach 5minütiger Denaturierung bei 100oC und anschließender Zugabe von 3 ml
33
2. MATERIAL UND METHODEN
Ladepuffer wurden die Proben aufgetragen. Die RNA wurde bei 80 Volt 2-3 h in
1xMOPS -Laufpuffer aufgetrennt und unter UV-Licht betrachtet, um deren
Integrität und die gleichmäßige Beladung des Gels zu überprüfen.
2.4.4.2.
Northern Blotting
Um die RNA nach elektrophoretischer Auftrennung auf eine Nylonmembran zu
transferieren, wurde ein Kunststoffblock in eine mit 20fach SSC gefüllte Schale
gelegt und mit in 20x SSC getränktem Whatmanpapier bedeckt, sodass dieses
Flüssigkeit aus der Schale nach oben saugen konnte. Das Gel wurde mit der
Oberseite nach unten auf den Block gelegt und mit einer entsprechend
zurechtgeschnittenen Hybond-Nylon-Membran bedeckt. Es war darauf zu
achten, dass sich zwischen Gel und Whatmanpapier bzw. Membran keine
Luftblasen befanden. Nun wurde die Membran von weiteren 4 Lagen
Whatmanpapier und einem ca. 5 cm hohen Stapel Papiertücher bedeckt. Unter
durch ein auf den Papierstapel aufgesetztes Gewicht hervorgerufenem Druck
von oben erfolgte der Transfer der RNA auf die Hybond-Nylon-Membran über
Nacht. Anschließend wurde die Membran 2 min in 2x SSC geschüttelt und
danach auf ein Whatmanpapier gelegt. Nach Fixierung der RNA auf der
Membran
durch
einen
UV-Crosslinker
(120.000
mj/cm2)
wurde
diese
lichtgeschützt in einem Hybridisierungsbeutel gelagert.
2.4.4.3.
Synthese von cDNA
Isolierte Gesamt-RNA wurde mithilfe der reversen Transkriptase Superscript II
in ”komplementäre” DNA (cDNA) umgeschrieben. Dies erfolgte mithilfe des
”SuperScript Choice System for cDNA Synthesis”. 5 µg Total-RNA wurden in
ein Endvolumen von 22 µl gegeben. Nach Zugabe von 1 µl Oligo(dt)12-18
-Primern (50 µM) erfolgte Erhitzen auf 70°C für 10 min. Die Proben wurden
dann für 1 min auf Eis gekühlt, es folgte die Zugabe von 10 µl 5x First Strand
Puffer, 4 µl 0,1 M DTT, 2 µl 10 mM dNTP Mix sowie 1 µl Superscript II, der
reversen Transcriptase. Die Mischung wurde 50 min bei 42°C inkubiert. Die
Synthese wurde durch Erhitzen der Probe auf 70°C für 10 min beendet.
34
2. MATERIAL UND METHODEN
2.4.4.4.
Herstellung einer radioaktiv markierten cDNA-Sonde
Zur Detektion der auf der Membran fixierten RNA wurde eine cDNA-Sonde
mithilfe der RT-PCR hergestellt. Hierzu wurde ein 257 Basenpaar cDNAFragment des Tight Junction-Proteins Claudin-7 radioaktiv markiert. Zu diesem
Zweck wurden ca. 50 ng cDNA, 2,5 µl 10x Decamers und Aqua bidest. bis zu
einem Gesamtvolumen von 13,5 µl in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß gegeben,
5 min bei 95°C denaturiert und dann auf Eis gelegt. Es folgten die Zugabe von 5
µl 5x Puffer-dCTP, 5 µl α[32P]dCTP, 1,5 µl Klenow und eine einstündige
Inkubation bei 37°C. Zur Aufreinigung wurden 70 µl STE-Puffer auf eine „Nuc
Tap Probe Purification“- Säule gegeben und durchgedrückt. Nach Zentrifugation
der Probe erfolgte das Laden von 25 µl derselben auf die Säule. Die Probe
sowie danach nochmals 70 µl STE-Puffer wurden ebenfalls durch den Filter der
Säule gedrückt und aufgefangen. Die Lagerung erfolgte bei 20°C.
2.4.4.5.
Hybridisierung des Northern- Blot
Die Hybridisierung erfolgte mithilfe des Ambion DECAprimeII –Kit. Die UVbestrahlte Membran wurde in eine silikonisierte, verschließbare Glasröhre mit
10
ml
68°C
warme
Prähybridisierungslösung
gegeben
und
im
Hybridisierungsofen bei langsamer Rotation 30 min bei 68°C inkubiert. Die
radioaktiv markierte Sonde wurde auf Eis aufgetaut, 5 min auf 96°C im
Heizblock
denaturiert
und
auf
Eis
gelegt.
Anschließend
wurde
die
Prähybridisierungslösung aus der Flasche entfernt und es erfolgte die Zugabe
von mit 8 µl der radioaktiv markierten cDNA Sonde versetzter 10 ml
Hybridisierungslösung und eine erneute Inkubation für 1 h bei 68°C. Nach
Ablauf der Inkubationszeit wurde die Membran 2x 10 min bei Raumtemperatur
in 100 ml Waschlösung 1 geschüttelt und nachfolgend 2x 20 min bei 50°C im
Hybridisierungsofen
mit
Waschlösung
2
gewaschen.
Die
in
Folie
eingeschweißte Membran wurde autoradiographiert (Exposition 1-2 Tage bei
-80°C).
35
2. MATERIAL UND METHODEN
2.4.5.
Multiple Tissue Expression Array
Der Multiple Tissue Expression Array von Clontech besteht aus einer NylonMembran, auf der 76 unterschiedliche RNA-Proben aus verschiedenen
menschlichen
Geweben
und
Karzinom-Zelllinien
fixiert
wurden.
Nach
Bestätigung der Sequenz-Spezifität der radioaktiv markierten cDNA-Sonde
durch das Ergebnis des Northern-Blots, wurde diese zur Hybridisierung des
Multiple Tissue Expression Array zur Feststellung der Expression in den auf der
Membran berücksichtigten menschlichen Geweben eingesetzt.
Verwendete Lösungen:
DEPC-Wasser:
1 ml DEPC in 1 l Aqua bidest.
nach Inkubation bei Raumtemperatur über Nacht autoklavieren
20x SSC:
1l
175,32 g
Natrium-Chlorid
88,23 g
Natrium-Citrat
mit Aqua bidest. auf ein Gesamtvolumen von 1 l auffüllen
Waschlösung 1:
1l
100 ml
20x SSC
2,5 ml
20% SDS
mit DEPC-Wasser auf ein Gesamtvolumen von 1 l auffüllen
Waschlösung 2:
1l
5 ml
20x SSC
5 ml
20% SDS
mit DEPC-Wasser auf ein Gesamtvolumen von 1 l auffüllen
Zur Hybridisierung wurde zunächst die Hybridisierungslösung hergestellt.
Hierzu erfolgte die Denaturierung von 150 µl Sheared salmon testes DNA
(10mg/ml)
durch
5-minütiges
Erhitzen
im
Heizblock
auf
95°C
und
nachfolgendes Abkühlen auf Eis. Die denaturierte DNA wurde mit 15 ml 65°C
36
2. MATERIAL UND METHODEN
ExpressHyb-Hybridisierungslösung (Multiple Tissue Expression Array-Kit)
gemischt und 10 ml davon mit der Multiple Tissue Expression Array-NylonMembran in eine silikonisierte Hybridisierungs-Glasflasche gegeben. Es folgte
eine
30-minütige
Prähybridisierung
bei
65°C.
Für
die
anschließende
Hybridisierung wurden 25 µl der durch RT-PCR amplifizierten und radioaktiv
markierten cDNA-Sonde (siehe 2.4.4.4.) zuvor 30 µl Cot-1 DNA, 15 µl sheared
salmon testes DNA (10 mg/ml), 50 µl 20x SSC und 80 µl DEPC-Wasser und im
Heizblock 5 min bei 95°C denaturiert und mit den restlichen 5 ml der
Hybridisierungslösung gemischt. Die Prähybridisierungslösung wurde entfernt
und die nun mit der cDNA-Sonde versetzte Hybridisierungslösung in die
silikonisierte
Hybridisierungs-Glasflasche
zugegeben.
Die
Hybridisierung
erfolgte bei 65°C über Nacht. Anschließend wurde die Membran bei 65°C 4x 20
min mit je 100 ml Waschlösung 1 und 2x 20 min mit je 100 ml Waschlösung 2
im Hybridisierungsofen gewaschen. Nach Einschweißen der Membran im
Hybridisierungsbeutel erfolgte die Autoradiographie.
2.4.6.
Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Die Polymerase-Ketten-Reaktion (engl.: Polymerase-Chain-Reaction, PCR)
diente dem Nachweis bekannter DNA-Sequenzen durch Amplifikation sowie in
modifizierter Form der Sequenzierung von DNA-Strängen. Ihr zugrunde liegt
das Prinzip, einzelsträngige DNA als Vorlage für die Synthese eines
komplementären Stranges zu gebrauchen und diesen ebenfalls wieder als
Vorlage zur Herstellung einer Kopie des ersten Einzelstrangs einzusetzen. Dies
gelingt in zyklisch ablaufenden Synthese-Schritten unter Verwendung des
Enzyms DNA-Polymerase, freien Desoxynukleotiden und den sog. Primern, ca.
20 Basenpaare langen Oligonukleotiden mit genspezifischer Sequenz. Der
Ablauf
einer
Amplifikation
gestaltet
sich
mithilfe
eines
Temperaturwechselgerätes (Thermal Cycler) wie folgt: durch Erhitzen des
Reaktionsgemisches
auf
95°C
trennen
sich
DNA-Doppelstränge
in
Einzelstränge. Eine Abkühlung auf Temperaturen zwischen 50° und 70°C je
nach verwendeten Primern ermöglicht ein Anlagern der Oligonukleotide an ihre
genspezifisch komplementären Orte auf der DNA. Das 3`-Ende des
37
2. MATERIAL UND METHODEN
angelagerten Primers stellt den Startpunkt für die Verlängerung des
komplementären Stranges durch die DNA-Polymerase dar, deren TemperaturOptimum bei 72°C liegt. Die so entstehenden DNA-Doppelstränge werden
durch erneutes Erhitzen auf 95°C voneinander getrennt. In der zweiten
Amplifikation entstehen nun die ersten identischen Kopien der Vorlage
hinsichtlich Länge und Sequenz. Da jeder neu synthetisierte DNA-Strang als
Vorlage in der folgenden Amplifikation dienen kann, kommt es optimalerweise
zu einer exponentiellen Vervielfältigung des Ausgangsmaterials. So sind bei
einer Menge von nur 2 doppelsträngigen DNA-Molekülen des gesuchten Gens
im Reaktionsgemisch theoretisch nach 20 Zyklen gut eine Million Kopien
vorhanden. Eine PCR benötigt so je nach eingesetzter Menge DNA und
”Funktion” der Primer etwa 25-35 Amplifikationszyklen, um die Darstellung der
Fragmente in der Gelelektrophorese sicher zu ermöglichen.
2.4.7.
Synthese von cDNA
Isolierte Gesamt-RNA wurde mithilfe der reversen Transkriptase Superscript II
in ”komplementäre” DNA (cDNA) umgeschrieben. Dies erfolgte mithilfe des
”SuperScript Choice System for cDNA Synthesis”. 5 µg Total-RNA wurden in
ein Endvolumen von 22 µl gegeben. Nach Zugabe von 1 µl Oligo(dt)12-18Primern (50 µM) erfolgte Erhitzen auf 70°C für 10 min. Die Proben wurden dann
für 1 min auf Eis gekühlt, es folgte die Zugabe von 10 µl 5x First Strand Puffer,
4 µl 0,1 M DTT, 2 µl 10 mM dNTP Mix sowie 1 µl Superscript II, der reversen
Transcriptase. Die Mischung wurde 50 min bei 42°C inkubiert. Die Synthese
wurde durch Erhitzen der Probe auf 70°C für 10 min beendet.
2.4.8.
PCR mit Reverser Transkriptase (RT-PCR)
Zur Untersuchung der Genexpression verschiedener Tight Junction-Proteine
der Claudin-Familie in den duktalen Pankreaskarzinomzelllinien PaTu8988T,
PaTu8988S, SUIT-2 S2-007, SUIT-2 S2-013, SUIT-2 S2-020, SUIT-2 S2-028,
8902, PC3, PC 44, PC2, MiaPaCa, Panc1, ASPC1, PaTu2, HPAF und CaPan2
wurde 1 µl cDNA-Lösung entsprechend etwa 4.5 ng cDNA in ein auf Eis
gekühltes Reaktionsgefäß gegeben. Bei einem 25 µl Ansatz folgte die Zugabe
38
2. MATERIAL UND METHODEN
von 2,5 µl 10x-Puffer, 2,5 µl dNTPs 2,5 mM, je 1 µl forward und reverse Primer
(10pmol/µl) sowie 0,1 µl Taq-Polymerase (5 U/µl) und 16,9 µl Wasser. Das
Temperatur-Profil des Thermal Cyclers betrug für den Nachweis des ”Housekeeping Gen” ß-Actin 95°C 5 min, anschließend 30 Zyklen mit 95°C 1 min,
65°C 1 min und 72°C 1 min sowie einer 10 minütigen Phase bei 72°C zur
Fertigstellung eventuell vorhandener unvollständig synthetisierter DNA-Stränge.
Die Untersuchung der Tight Junction Gene erfolgte unter gleichen Bedingungen
mit Ausnahme der Anlagerungs-Temperatur von 55°C .
2.4.9.
DNA-Sequenzanalyse
Die Sequenzierung von cDNA-Fragmenten nach PCR-Amplifikation erfolgte zur
Kontrolle der Reaktionsspezifität und erfolgte mithilfe eines automatischen
Sequenzierers (ABI Prism 310 Genetic Analyser, Perkin Elmer) nach
Sequenzierungsreaktion unter Anwendung eines Kits des gleichen Herstellers.
Zum Einsatz in die Sequenzierungsreaktion kommen neben dem forward oder
reverse PCR-Primer u.a. freie Nukleotide, an die ein Fluoreszenzfarbstoff
gebunden ist und die bei Einbau in den neu synthetisierten DNA-Strang eine
weitere Verlängerung desselben verhindern (sog. Kettenabbruch-Reaktion). So
entstehen in der Sequenzierungsreaktion neue DNA-Stränge unterschiedlicher
Längen, deren letzte Base immer an einen Fluoreszenzfarbstoff gebunden ist.
Die
Probengefäße
werden
nach
der
Sequenzierreaktion
mit
Primer-
spezifischem Temperaturprofil im Thermal Cycler in den Sequenzierer gestellt.
Die Probenlösungen werden automatisch nacheinander in Kontakt mit einer
Kathode und einer mit Polymer gefüllten Glaskapillare gebracht, deren Ende mit
der Anode verbunden ist. Nach Anlegen einer Spannung fließt ein Teil der
Probe Richtung Anode durch die Kapillare. Während dieser ”elektrokinetischen
Injektion”
passieren
die
DNA-Stränge
ein
”Detektor”
Fenster
in
der
Glaskapillare, durch das ein Laser den Fluoreszenzfarbstoff erregt. Die dann
emittierte Fluoreszenz wird von einer Digitalkamera erfasst und mithilfe der
Software des angeschlossenen PC ausgewertet.
Für die Sequenzierungsreaktion erfolgte ein 20 µl Reaktionsansatz durch Gabe
von 1 µl Template aus der PCR, 1 µl forward oder reverse Primer (25 pmol/µl),
39
2. MATERIAL UND METHODEN
14 µl Wasser und 4 µl Pre-Mix (enthält fluoreszenzmarkierte Nukleotide sowie
Reaktionshilfsstoffe) in ein Reaktionsgefäß. Dann erfolgte die 25 Zyklen
dauernde Reaktion im Thermal Cycler, bei der ein Zyklus aus 96°C für 10 sec,
der primerspezifischen Annealing-Temperatur für 5 sec und der Elongation bei
60°C für 4 min bestand. Anschließend erfolgte die Fällung durch Gabe von 80
µl Wasser, 10 µl 3 M Natriumacetat pH 4,6 und 250 µl Ethanol zum
Reaktionsgemisch, das nach vorsichtigem Mischen mithilfe der Pipette bei
15.000 UpM für 15 min bei RT zentrifugiert wurde. Nach Abnahme des
Überstands erfolgte ein Waschschritt mit 70%igem Ethanol und erneuter, 5
minütiger Zentrifugation bei 1.000 UpM. Der Entfernung des Überstands folgte
die Trocknung des Pellets bei 50°C im Heizblock für 5 min sowie ein kurzer
Denaturierungsschritt durch Gabe von 25 µl TemplateSuppressionReagent
(TSR) und Erhitzung auf 90°C für 2 min. Nach kurzer Abkühlung auf Eis erfolgte
die Sequenzierung im ABI Prism 310 Genetic Analyser.
2.4.10.
Elektrophoretische Trennung von DNA
Die Trennung von DNA-Fragmenten wurde für analytische und für präparative
Zwecke in Agarosegelen durchgeführt, die mit 0,5fach TBE-Puffer hergestellt
wurden.
TBE (1fach):
90 mM Tris/HCl pH 8,3
90 mM Borsäure
2,5 mM EDTA
Die Herstellung von Agarosegelen in Konzentrationen von 0,7% bis 3% erfolgte
durch Aufkochen der gewünschten Menge Agarose in 0,5fach TBE-Puffer.
Anschließend wurden 0,5 µgl EtBr hinzugefügt. Nach dem Abkühlen auf 50°C
wurde die noch flüssige Agarose in eine Horizontalkammer mit eingesetztem
Kamm gegossen. Zum Anfärben und Erhöhen des spezifischen Gewichtes der
Proben erfolgte deren Versetzung mit Loading-Dye (0,2% Bromophenolblau,
0,2% Xylen-cyanol, 60% Glycerin/60 mM EDTA). Nach Pipettieren der Proben
in die Geltaschen und Anschluss der Kammer an ein Netzgerät trennten sich
die DNA-Fragmente innerhalb von ein bis vier Stunden abhängig von Fragment-
40
2. MATERIAL UND METHODEN
und Kammergröße, Gelkonzentration und angelegter Spannung in Richtung
Kathode
auf.
Unter
UV-Licht-Bestrahlung
konnten
die
DNA-Banden
anschließend mithilfe der Videoanlage betrachtet und photographiert werden.
2.4.11.
Die
Elution von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen
Isolierung
von
DNA-Fragmenten
erfolgte
nach
elektrophoretischer
Auftrennung von PCR-Produkten zur Sequenzierung oder Reamplifikation. Für
die Agarosegel-Elution wurde der ”QIAquick Gel Extraction Kit” verwendet.
Nach Ausschneiden der Fragment-Bande aus dem Agarosegel und Zugabe
eines 3-fachen Volumens des Gelgewichtes an QG-Puffer wurde das Gel durch
Erwärmung auf 50°C für 10 min im Puffer gelöst und die Flüssigkeit nach
Hinzugeben eines gleichen Volumens
Isopropanol in die beigefügten
Zentrifugationssäulchen geladen. Es folgten anschließend drei Zentrifugationen
bei 13.000 UpM für je 1 min, unterbrochen durch die Entnahme des
Durchflusses und die Zugabe von 0,5 ml Puffer QG bzw. 0,75 ml Puffer PE.
Eine weitere Zentrifugation führte zur Trocknung des Eluats im Filter des
Säulchens. Nach Zugabe von 50 µl Wasser und 1 min Inkubation erfolgte die
Entnahme der DNA durch Wechsel des Auffangröhrchens und Zentrifugation
bei 13.000 UpM für 1 min.
2.4.12.
Klonierung von cDNA-Fragmenten
2.4.12.1.
Vektoren und Konstrukte
Zur Expression von Claudin-7 in Pankreastumorzelllinien wurde zunächst ein
Konstrukt hergestellt, bei dem das durch RT-PCR amplifizierte Insert Claudin-7
sense (Nn 1312296 bis 1310640) sowie antisense (Nn 1310640 bis 1312296) in
den Expressionsvektor PcDNA/TO/myc-His Typ A ligiert wurde. Dazu wurden
die beiden Inserts jeweils mithilfe des PcDNA 3.1/V5-His TOPO TA Expression
KIT zunächst in den Vektor PcDNA 3.1/V5-His TOPO ligiert und nach
Transformation im Heat-shock-Verfahren durch die kompetenten Zellen TOP 10
amplifiziert. Unter Nutzung des Nucleospin-Kits wurden das Plasmid aus der
Bakteriensuspension isoliert und die Inserts durch einen Verdau mit Eco RI und
HindIII wieder herausgeschnitten. Nun war es möglich, die DNA Fragmente
41
2. MATERIAL UND METHODEN
Claudin-7 sense und antisense nach Verdau derselben in den Vektor
PcDNA/TO/myc-His Typ A zu ligieren und mittels Elektroporation in die
kompetenten Zellen DH 10B zu transformieren. Das Ergebnis wurde nach
Isolierung mittels Nucleospin-Kit und erneutem Verdau mit Eco RI und HindIII
durch Sequenzanalyse gesichert und das Konstrukt in größerer Menge mithilfe
des Nucleobond-Kits aus Bakteriensuspension isoliert.
2.4.12.2.
Ligation und Transformation
Die in den Vektor PcDNA 3.1/V5 TOPO einzufügenden Fragmente umfassten
jeweils die gesamte cDNA für Claudin-7 mit (sense) und entgegen (antisense)
der Transkriptionsrichtung. Sie wurden durch RT-PCR amplifiziert, durch
Gelelektrophorese isoliert und aus dem Agarosegel eluiert. 4 µl dieses PCRProdukts wurden in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß gegeben. 1 µl Salt-Solution
und 1 µl PcDNA 3.1/V5 TOPO aus dem Kit wurden zugegeben und bei
Raumtemperatur 10 min inkubiert. Es folgte die Transformation nach dem Heatshock-Verfahren. Hierzu wurden zu 2 µl der Plasmid-Lösung 50µl Top-10 Zellen gegeben und 10 min auf Eis inkubiert. Dann erfolgte ein kurzes
Erwärmen im Heizblock auf 42°C für 30 sec und erneutes Abkühlen für 1min
auf
Eis.
Nun
wurden
250
µl
SOC-Medium
beigefügt
und
die
Bakteriensuspension 1 h bei 37°C inkubiert. Auf 2 mit Ampicillin in einer
Endkonzentration von 100 µg/ml versetzte LB-Agar-Platten wurden 100 bzw.
200 µl der Suspension ausgestrichen und über Nacht bei 37°C gelagert. Da der
Vektor den transformierten Bakterienzellen eine Ampicillinresistenz verleiht,
waren nur die Zellen zum Wachstum befähigt, die das Plasmid aufgenommen
hatten. Bei erfolgreichem Versuch hatten sich am nächsten Tag einzelne Klone
auf den Platten vermehrt. Isoliert stehende Klone wurden mit einer
Pipettenspitze aufgenommen, mit der Spitze in ca. 5 ml LB-Nährmedium mit
100 µg/ml Ampicillin gegeben und über Nacht bei 37°C geschüttelt. Mit dem
Nucleospin-Kit wurde der Vektor aus der Bakteriensuspension isoliert und nach
einem Verdau mit Eco RI und HindIII sequenzanalytisch gesichert.
42
2. MATERIAL UND METHODEN
2.4.12.3.
Restriktion mit HindIII, Eco RI und BamH I
Verdaut wurden sowohl der Vektor PcDNA 3.1/V5 TOPO nach Einfügen der
DNA Fragmente aus der RT-PCR, als auch der Vektor PcDNA/TO/myc-His Typ
A vor und nach der Ligation. Der Verdau des Vektors PcDNA 3.1/V5 TOPO
diente dem Herausschneiden der zuvor eingefügten cDNA von Claudin-7 sense
und antisense mit den Restriktionsendonucleasen HindIII und Eco RI, um
enzymspezifische Schnittstellen zu erhalten. Da diese Fragmente in das
Plasmid PcDNA/TO/myc-His Typ A ligiert werden sollten, war der Verdau
dieses Vektors mit HindIII und Eco RI ebenfalls nötig zum Erhalt der
entsprechenden Schnittstellen. Um die Religation des offenen Plasmidrings mit
dem herausgeschnittenen Fragment zu erschweren, wurde zusätzlich eine
Restriktion mit BamH I durchgeführt, der dieses Fragment nochmals zerteilte.
2.4.12.4.
Restriktion PcDNA 3.1/V5 TOPO mit HindIII und Eco RI
In ein 1,5ml Eppendorf-Reaktionsgefäß wurden 3 µl Puffer NEB 2, 0,3 µl BSA, 5
µl der Plasmid-DNA und je 10 U der Restriktionsendonucleasen HindIII und Eco
RI gegeben und mit Aqua bidest. auf ein Gesamtvolumen von 25 µl aufgefüllt.
Es folgte eine Inkubation von 30 min bei 37°C im Heizblock, während der
Verdau stattfand. Die anschließende 10minütige Inkubation bei 65°C diente der
Inaktivierung der Restriktionsendonucleasen. Das Produkt des Verdaus wurde
gelelektrophoretisch aufgetrennt und die herausgeschnittenen Fragmente
mithilfe
des
”QIAquick
Gel
Extraction
Kit”
zur
sequenzanalytischen
Erfolgskontrolle und zur Ligation mit PcDNA/TO/myc-His eluiert.
2.4.12.5.
Restriktion PcDNA/TO/myc-His mit HindIII, Eco RI und BamH I
In ein 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß wurden 6 µl Y+Tango 10x-Puffer, 2 µl
Plasmid-DNA (1 µg/µl) und je 10 U der Restriktionsendonucleasen HindIII und
Eco RI gegeben und mit Aqua bidest. auf ein Gesamtvolumen von 30 µl
aufgefüllt. Es folgte eine Inkubation von 30 min bei 37°C im Heizblock, dann
wurden 10 U der Restriktionsendonuclease BamH I zugegeben und nochmals
10 min bei 37°C inkubiert. Die anschließende 10minütige Inkubation bei 65°C
diente der Inaktivierung der Restriktionsendonucleasen. Beim Kontrollverdau
43
2. MATERIAL UND METHODEN
nach erfolgter Ligation entfiel der Verdau mit BamH I. Das Produkt des Verdaus
wurde gelelektrophoretisch aufgetrennt und der nun offene Plasmidring anhand
der Bandengröße identifiziert und zur Ligation mithilfe des ”QIAquick Gel
Extraction
Kit”
eluiert.
Beim
Kontrollverdau
wurde
das
jeweils
herausgeschnittene DNA-Fragment nach gelelektrophoretischer Auftrennung
des Verdaus und Elution seqenzanalytisch als cDNA von Claudin-7 sense und
antisense identifiziert.
2.4.12.6.
Ligation
Für die Ligation des geschnittenen Plasmids PcDNA/TO/myc-His Typ A mit
dem aus dem Plasmid PcDNA 3.1/V5 TOPO herausgeschnittenen Inserts, der
cDNA von Claudin-7 sense und antisense, wurden 2 µl der Plasmid-DNA, 2
bzw. 5 µl des Inserts sense oder antisense, 2 µl 10fach-Puffer und 1 µl Ligase
in ein 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß gegeben und mit Aqua bidest. auf ein
Gesamtvolumen von 20 µl aufgefüllt. Es folgte eine Inkubation bei 16°C über
Nacht, dann ein 10minütiges Erwärmen auf 37°C. Die Ligation wurde nun durch
Zugabe von 140 µl Ethanol 100%, 20 µl Ammonium-Acetat und 20 µ Aqua
bidest. gefällt und 15 min bei 13000 UpM zentrifugiert. Der Überstand wurde
abgenommen und das Pellet durch Zugabe von 100 µl Ethanol 70% und
Zentrifugation 5 min bei 13000 UpM gewaschen. Nach Abnehmen des
Überstands wurde das Pellet in 5 µl Aqua bidest. gelöst und für die
Transformation mittels Elektroporation weiterverwendet.
2.4.12.7.
Transformation
Verwendete Nährmedien:
LB-Medium:
1l:
10 g
Trypton/Pepton aus Casein
5g
Yeast Extrak
10g
Natrium-Chlorid
mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 1l auffüllen und autoklavieren
LB-Agar-Medium
1l:
44
10 g
Trypton/Pepton aus Casein
2. MATERIAL UND METHODEN
5g
Yeast Extrak
10g
Natrium-Chlorid
15g
Agar
mit Wasser auf ein Gesamtvolumen von 1l auffüllen und autoklavieren,
auf 60°C abkühlen lassen und in Kulturschalen mit einem Durchmesser
von 10 cm gießen und aushärten lassen
Für die Elektroporation wurde der Ligationsansatz auf Eis vorgekühlt und die
kompetenten Zellen DH10B auf Eis aufgetaut. 1µl des Ligationsansatzes und
25 µl kompetente Zellen wurden in eine vorgekühlte Transporations-Küvette
gegeben und 1 min auf Eis inkubiert. Die Transporation fand bei 2,5 kV, 250 µF
und niedrigem Widerstand statt. Danach wurde 1 ml antibiotikafreies LBMedium zugegeben und die Bakteriensuspension 30-60 min bei 37°C inkubiert.
Es folgte das Ausplattieren der Bakterien auf LB-Platten mit 100µg/ml
Ampicillin, wobei 50, 100 und 400 µl der Bakteriensuspension genutzt wurden,
um möglichem dichteren bzw. weniger dichtem Wachstum von Klonen gerecht
zu werden. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C im Brutschrank aufbewahrt.
2.4.13.
Plasmidgewinnung
2.4.13.1.
Analytische Plasmidgewinnung
Die Bakteriensuspension wurde 10 min bei 5.000 UpM zentrifugiert und das
Pellet in 250 µl Puffer A1 gelöst. Nach dem vollständigen Lösen erfolgte die
Zugabe von 250 µl Puffer A2, dem Lysis-Puffer. Die Mischung wurde 5 min bei
Raumtemperatur inkubiert, bevor 300 µl des eiskalten Puffer A3 beigefügt
wurden. Es folgte eine erneute Inkubation von 5 min auf Eis, dann wurde in der
auf 4°C vorgekühlten Zentrifuge 12 min bei 12.000 UpM zentrifugiert. Der
Überstand wurde in eine auf ein 2 ml Reaktionsgefäß aufgesetzte NucleospinSäule überführt und diese 1 min bei 15.000 UpM ebenfalls zentifugiert. Die nun
im Reaktionsgefäß enthaltene Flüssigkeit konnte verworfen werden, da das
Plasmid sich nun in dem in der Säule enthaltenen Filter befand, dann erfolgte
die Zugabe von 700 µl Puffer A4. Die Säule wurde erneut 1 min bei 15.000
UpM und zum Trocknen nochmals 1 min bei 15.000 UpM zentrifugiert. Die im
45
2. MATERIAL UND METHODEN
Reaktionsgefäß enthaltene Flüssigkeit konnte erneut verworfen werden, die
Säule wurde dann auf ein sauberes 1,5 ml Reaktionsgefäß aufgesetzt. Nach
Zugabe von 50 ml Aqua bidest. folgte die abschließende Zentrifugation 1 min
bei 15.000 UpM. Der Vektor befand sich nun in Aqua bidest. gelöst in dem
Reaktionsgefäß. Die Säule wurde entsprechend den Richtlinien entsorgt.
2.4.13.2.
Präparative Plasmidgewinnung
Für die Bakteriensuspension, aus der das Plasmid isoliert werden sollte, wurde
der Klon in 150 ml LB Nährmedium mit 100µg/ml Ampicillin gegeben, bei 37°C
über Nacht geschüttelt und am nächsten Tag 20 min bei 4.000 UpM
zentrifugiert. Nach Abgießen des Überstandes folgte das Lösen des Pellets in
12 ml Puffer S1, bevor 12 ml Puffer S2 zugegeben wurde. Nach einer
5minütigen Inkubation bei Raumtemperatur, folgte die Zugabe von 12 ml
eiskaltem Puffer S3 und eine weitere 5minütige Inkubation auf Eis. Nun wurde
40 min bei 5.000 UpM zentrifugiert der Überstand filtriert und auf die mit 5 ml
Puffer N2 befeuchtete Nucleobond-Säule gegeben. Das Plasmid befand sich
nun in dem in der Säule enthaltenen Filter. Es folgte 2maliges Waschen mit
jeweils 12 ml Puffer N3, und die Elution des Plasmids aus der Säule mit 12 ml
Puffer N5. Nun wurden für die Fällung der DNA 8,4 ml Isopropanol zugegeben
und 30 min bei 5.000 UpM zentrifugiert. Nach Abgießen des Überstandes und
Waschen des Pellets mit 10 ml Ethanol, erfolgte eine 10minütige Zentrifugation
(15.000 UpM) und das Trocknen des Pellets. Dieses wurde abschließend in 200
µl Aqua bidest. gelöst und bei -20°C eingefroren.
2.5.
Proteinchemische Methoden
2.5.1.
Proteinextraktion aus Zellen
Für die Präparation eines Proteinextraktes wurden die adhärent wachsenden
Zellen auf 10 cm Zellkulturplatten in Kultur gehalten. Die Proteinextraktion
erfolgte 48-72 h nach Aussaat der Zellen ohne oder nach Behandlung mit
PD98059 (24 h). Die Zellkulturplatten waren zu diesem Zeitpunkt zwischen 60%
und 80% konfluent bewachsen. Nach Entnahme des Nährmediums erfolgte das
46
2. MATERIAL UND METHODEN
Waschen der Zellen mit 4 ml 1x PBS. Mit 2 ml Trypsin-EDTA-Lösung wurden
die Zellen gelöst und das Trypsin anschließend durch Zugabe von Medium
inaktiviert. Die Zellen wurden zentrifugiert (2000 UpM, 2 min) und in eiskaltem
1x PBS resuspendiert. Das Zellpellet wurde in 400 µl Tris/HCl resuspendiert
und in ein 1,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und auf Eis gehalten.
Nach Zugabe von 5 µl Proteinaseinhibitor wurden die Zellen durch 10-15 über
eine Sonde abgegebene Ultraschallimpulse mittlerer Frequenz lysiert. Die
Suspension wurde bei 4°C und 15.000 UpM 10 min zentrifugiert und der
Überstand in Kryotubes aliquotiert und bei -80°C gelagert. Ein Aliquot von 20 µl
Proteinextrakt wurde in ein 0,5 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß überführt und für
die Proteinkonzentrationsbestimmung verwendet.
2.5.2.
Proteinkonzentrationsbestimmung
Die Konzentration der Proteinextrakte wurde photometrisch bestimmt. Zunächst
wurde auf einer Mikrotiterplatte eine aufsteigende Konzentrationsreihe einer
Standardproteinlösung (BSA) bekannter Konzentrationen inklusive eines
Nullwertes angefertigt. Hierzu wurden 50 µl des Bio-Rad-Reagenz in einer
Verdünnung von 1:5 mit Aqua dest. vorgelegt, 1-10 µg BSA in aufsteigenden
Schritten zugegeben und anschließend 150 µl des Bio-Rad-Reagenz
zugegeben. Mit den Proben wurde ebenso verfahren, wobei 1-2 µl der Extrakte
eingesetzt wurden. Alle Proben wurden in doppeltem Ansatz gemessen, um
danach Mittelwerte der Absorptionen berechnen zu können. Nach Kalibrierung
des Nullwertes wurden die Absorptionen der Standardproteinreihe bei einer
Wellenlänge von 595 nm mit einem digitalen Photometer gemessen und die
Absorptionen
der
Extrakte
festgestellt.
Nach
Erstellen
einer
Standardmessgeraden konnten die Konzentrationen der Extrakte indirekt an
dieser abgelesen werden.
2.5.3.
SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
Da die Wanderungsgeschwindigkeit von Proteinen bei der Gelelektrophorese
sowohl von ihren Reibungskoeffizienten als auch von der jeweiligen
Nettoladung abhängig ist, kann keine Auftrennung ausschließlich aufgrund von
Massenunterschieden erfolgen. Durch Lösung der Proteine in SDS lagern sich
47
2. MATERIAL UND METHODEN
SDS-Anionen proportional zum Molekulargewicht an, die pro gebundenem
Molekül etwa zwei negative Ladungen zur Gesamtladung beitragen. Die so
erworbene Ladung ist wesentlich größer als die ursprüngliche Gesamtladung
der
Proteine,
die
dadurch
vernachlässigbar
wird.
Die
Wanderungsgeschwindigkeit der denaturierten Proteine in einem SDS-Gel ist
dem Logarithmus ihrer Masse direkt proportional.
Verwendete Lösungen:
Trenngel-Puffer:
1,5 M Tris-Base, 0,4% SDS, pH 8,8
Sammelgel-Puffer:
0,5 M Tris-Base, 0,4% SDS, pH 6,8
Elektrophorese-Puffer (10fach):
0,25 M Tris-Base, 1,92 M Glycin, 1%
SDS, pH 8
Trenngel 14%, 10 ml Volumen:
2,0 ml Trenngel-Puffer, 2,25 ml A.
bidest, 75 ml Acrylamidlsg. 30%, 1,8 ml
Glycerol, 25 µl APS 10%, 12,5 µl
TEMED
Sammelgel 10%, 10 ml Volumen:
2,5 ml Sammelgel-Puffer, 5,9 ml A.
bidest, 1,6 ml Acrylamidlsg. 30 %, 60 µl
APS 10%, 30 µl TEMED
Zunächst wurde das Trenngel bis ca. 1,5 cm unter den oberen Rand der
Glasplatten gegossen und vorsichtig mit der Lösung des Sammelgels
überschichtet. Dabei verhindert das Glycerol des Trenngels ein Vermischen der
Phasen. Für die Probentaschen wurde ein Kamm eingesetzt, der nach der
Polymerisation entfernt wurde. Die Elektrophorese wurde bei ca. 120V
durchgeführt.
48
2. MATERIAL UND METHODEN
2.5.4.
Western Blot Analyse
Verwendete Lösungen:
Transfer-Puffer:
25 mM Tris-Base, 192 mM Glycin,
0,1% (W/V) SDS, 20% (V/V) Methanol
Laemmli-Auftragspuffer (4fach): Tris-HCL 2 g, SDS 4 g, A.bidest 30 ml.
Bromophenolblau 25 mg, mit Glycerol auf 50
ml auffüllen
Waschpuffer:
TBS plus 0,1% (VV) Tween 20
(137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 18 mM Na2HPO4
x 2H2O, 1,47 mM KH2PO4)
Blockierungslösung:
TBS Tween plus 5% Trockenmilch bzw. 0,5%
SlimFast und 4,5% Trockenmilch
20 µg Proteinextrakt wurden mit 10 µM Tris/HCl auf 12 µl aufgefüllt, mit 4 µl
Laemmli-Auftragspuffer und 1,6 µl DTT gemischt und 5 min bei 95°C
denaturiert. Danach erfolgte das Beladen der Geltaschen (15µl) und die
elektrophoretische Auftrennung in einem je nach Proteingröße 10%igen oder
14%igen
SDS-Gel,
niedrigprozentigen
wobei
Gelen
Proteine
aufgetrennt
mit
hoher
wurden.
Molekülgröße
Nach
Abtrennen
in
des
Sammelgels erfolgte der Transfer der Proteine vom Trenngel auf die
Nitrozellulosemembran in einer Elektroblot-Apparatur mit Transfer-Puffer bei
4°C und einer Spannung von 300 mA. Die Membran wurde zunächst zwei
Stunden in 5%iger Trockenmilch Blockierungslösung geschwenkt, bei starkem
Hintergrund erfolgte das Blocken mit 0,5%iger SlimFast und 4,5%iger
Trockenmilch
Blockierungslösung.
Anschließend
wurde
der
jeweilige
Primärantikörper in einer Verdünnung zwischen 1:500 und 1:1.000 zugegeben
(Tabelle 2) . Nach Exposition über Nacht bei 4°C erfolgte 3x 10 minütiges
Waschen mit 10 ml Waschpuffer. Anschließend wurde der jeweilige
Sekundärantikörper in einer Verdünnung von 1:2000 in 10 ml 5%iger
Trockenmilch für eine Stunde auf die Membran gegeben und dann erneut
49
2. MATERIAL UND METHODEN
gewaschen. Bei HRP-konjugierten Primärantikörpern entfiel die Exposition mit
einem Sekundärantikörper. Nach Zugabe der ECL-Färbelösungen für 1 min
erfolgte dann das Sichtbarmachen der Banden durch Auflage eines Films für
eine je nach Stärke des Signals variable Zeit (einige Sekunden bis zu 15
Minuten).
Tabelle 2:
Verdünnungen der eingesetzten Antikörper in der Western
Blot Analyse
Primärantikörper
Hersteller
Verdünnung
Anti-Claudin-1, polyklonal KaninchenZymed, Kalofornien USA 1: 500
IgG
Anti-Claudin-2, polyklonal Kaninchen
1: 500
IgG
Anti-Claudin-4, monoklonal Maus IgG
1: 500
Anti-Claudin-5, polyklonal Kaninchen
1: 500
IgG
Anti E-Cadherin, polyklonal Ziege IgG Santa Cruz, Kalifornien,1:1.000
Anti-Occludin, polyklonal Kaninchen
USA
1:1.000
IgG
Anti-ZO-1, polyklonal Kaninchen IgG
1:1.000
Anti ZO-2, polyklonal Ziege IgG
1:1.000
Sekundärantikörper
Ziege
anti
Kaninchen,
Hersteller
HRP- Cell
konjugiert
1:2000
Santa Cruz, Kalifornien, 1:2000
USA
50
MA, 1:2000
USA
Pferd anti Maus, HRP-konjugiert
Esel anti Ziege, HRP-konjugiert
Signaling,
Verdünnung
2. MATERIAL UND METHODEN
2.5.5.
Strippen von Nitrocellulosemembranen
Strippinglösung: 1mM Glycin-Lösung pH 2,9
Die Nitrocellulosemembran wurde 3x10 min in 1xTBS gewaschen und danach
in
die
Strippinglösung
gegeben.
Nach
einstündigem
Schütteln
bei
Raumtemperatur wurde die Membran erneut 3x10 min in 1xTBS gewaschen.
2.6.
Zellbiologische Methoden
2.6.1.
Zelllinien und Kultivierung
Die Zellinien PC-2, PC-3, PC-44, PaTu-II, HPAF, AsPC-1, MiaPaCa-2,
PaTu8902, Capan-2, PaTu8988S und PaTu8988T sind humane duktale
Pankreaskarzinomzelllinien. Für die Zelllinien PC-2, PC-3 und PC-44 wurde als
Nährmedium RPMI 1640 mit 10% FCS und 1% Penicillin/Streptomycin-Lösung
verwendet. Die Zelllinien PaTu-II und HPAF benötigen DMEM-Medium mit 10%
FCS und 1% Penicillin/Streptomycin-Lösung. Die Zelllinien AsPC-1 und
MIAPaCa-2
wurden
in
DMEM-Medium
mit
15%
FCS
und
1%
Penicillin/Streptomycin-Lösung gezüchtet. Für die Zelllinien PaTu 8902 und
Capan-2 wurde DMEM-Medium mit 10% FCS, 10% Horse Serum und 1%
Penicillin/Streptomycin-Lösung benötigt, ebenso für die Zelllinien PaTu8988S
und T, wobei hier noch 1% HEPES-Buffer zugesetzt wurde. Aufgrund des
Expressionsverhaltens von Claudinen wurden die Zelllinien PaTu8988S und
PaTu8988T näher untersucht. Bei diesen handelt es sich um zwei klonale
Pankreaskarzinom-Zelllinien,
die
aus
Lebermetastasen
des
gleichen
Individuums isoliert wurden. Die Zelllinien unterscheiden sich hinsichtlich ihres
Metastasierungsverhaltens und Phänotyps. Die PaTu8988S Zellen bilden nach
intravasaler Injektion pulmonale Metastasen im Nacktmausmodell und zeigen
ein zusammenhängendes Wachstum mit deutlichen Interdigitationen als
Hinweis auf eine junktionale Kommunikation. Im Gegensatz dazu bilden die
PaTu8988T Zellen keine Metastasen und zeigen keine wesentliche junktionale
Kommunikation.
51
2. MATERIAL UND METHODEN
Bei der Zellinie SUIT-2 S2-007 handelt es sich um eine humane duktale
Pankreaskarzinomzellinie, die aus Lebermetastasen gewonnen wurde und nach
subkutaner Injektion im Nacktmausmodell eine spontane Metastasierung in
Lunge und Leber zeigt. Der Zelllinie entstammen 28 klonale Subzelllinien mit
unterschiedlichem Metastasierungs- und Differenzierungsgrad (Iwamura et al.,
1997).
Zur
Untersuchung
des
Zusammenhangs
zwischen
dem
Metastasierungsgrad der Zellen und der Expression verschiedener Tight
Junction-Proteine wurden 4 Subzelllinen ausgewählt, SUIT-2 S2-007, ein mäßig
differenziertes duktales Adenokarzinom mit hohem Metastasierungsgrad, SUIT02 020, ein gering differenziertes duktales Adenokarzinom mit mäßigem
Metastasierungsgrad,
SUIT-02
013,
ein
gut
differenziertes
duktales
Adenokarzinom mit mäßigem Metastasierungsgrad und SUIT-02 028, ein
papillo-duktales Adenokarzinom mit geringem Metastasierungsgrad. Die
Zelllinien wurden in DMEM-Medium mit 10% fetalem Kälberserum und 1%
Penicillin/Steptomycin kultiviert.
Die Zellen wurden routinemäßig in 75cm3 Gewebekulturschalen kultiviert. Die
Kultur erfolgte in wassergesättigter Atmosphäre bei 37°C unter Begasung mit
5% CO2 und 95% Luft in einem Brutschrank. Die Passagierung erfolgte 1-2 x
wöchentlich.
Hierzu
wurden
die
annähernd
konfluent
bewachsenen
Kulturflaschen in der sterilen Werkbank von Medium befreit und anschließend
mit 1x PBS gewaschen. Mit 4 ml Trypsin-EDTA-Lösung wurden die Zellen vom
Boden gelöst, danach bewirkte die Zugabe von Medium die Inaktivierung des
Trypsins. Mit der Neubauer-Zählkammer erfolgte die Ermittlung der Zellzahl/ml
Medium, um in gewünschter Dichte wieder aussähen zu können.
2.6.2.
Einfrieren und Auftauen von Zellen
Zellen, die nicht für Experimente benötigt wurden, lagerten eingefroren in
flüssigem Stickstoff. Hierfür erfolgte zunächst das Ernten der Zellen wie oben
beschrieben. Mit 2000 UpM wurde die Zellsuspension anschließend 5 min
zentrifugiert, danach gewaschen und erneut zentrifugiert. Das Pellet wurde
vorsichtig in 2 ml Medium und 10% DMSO resuspendiert und in ein Kryogefäß
gefüllt. Das Einfrieren erfolgte zunächst in der -80°C Kühltruhe für einige
52
2. MATERIAL UND METHODEN
Stunden, bevor das Kryoröhrchen in Flüssigstickstoff gelagert wurde. Zum
Auftauen wurde warmes Wasser verwendet und der Inhalt des Röhrchens nach
Flüssigwerden sofort in eine Zellkulturflasche gegeben, die vorgewärmtes
Medium enthielt.
2.6.3.
Für
Fixierung von Zellen auf Objektträgern
die
Immunfluoreszenz-Untersuchungen
wurden
Zellen
auf
einem
Objektträger oder Chamber-Slide kultiviert, wobei vor der Fixierung die
Plastikabtrennung und die Silikonstränge des Chamberslides entfernt wurden.
Die Zellen wurden durch dreimaliges Eintauchen der Objektträger in 1x PBS
gewaschen. Es erfolgte nun die Fixierung bei -20°C, zunächst 5 min mit
Methanol, dann 1 min mit Aceton. Es bestand die Möglichkeit, die Zellen nach
diesem Schritt trocknen zu lassen und bei -20°C einzufrieren oder sie erneut 3x
in 1x PBS zu waschen, um sie sofort weiterzuverwenden. Das Auftauen der
Zellen erfolgte durch dreimaliges Waschen der gefrorenen Objektträger in 1x
PBS bei Raumtemperatur.
2.6.4.
Kollagenbeschichtung von Objektträgern
Da nicht alle Zelllinien auf den Glasobjektträgern ein vergleichbar gutes
Wachstumsverhalten zeigten, war insbesondere bei der Zelllinie PaTu8988T die
Aussaat auf kollagenbeschichteten Objektträgern nötig. Für die Beschichtung
wurden 5mg Kollagen zunächst in Ethanol gewaschen, dann eventuell. unter
leichtem Erwärmen in 0,01 M Essigsäure gelöst. Nach vollständigem Lösen des
Kollagens wurden 45 ml 60%iges Ethanol zugegeben und die Lösung über
Nacht bei 4°C inkubiert. Am nächsten Tag wurden auf sterile Öbjektträger je
600 µl der Flüssigkeit gegeben, die Objektträger wurden dann über Nacht in
wasserdampfgesättigter Atmosphäre bei 37°C gelagert. Nach Absaugen der
restlichen Kollagenlösung erfolgte am nächsten Tag die Trocknung der
Objektträger bei 37°C.
53
2. MATERIAL UND METHODEN
2.6.5.
Zellen
Transiente Transfektion mit Lipofektamin
der
Pankreaskarzinomzelllinie
PaTu8988T
wurden
auf
kollagenbeschichteten Objektträgern ausgesät. Nach 24 h wurde zunächst das
Nährmedium abgenommen. Die Zellen wurden mit FCS-freiem Medium
gewaschen, dann wurden 1,6 ml FCS-freies Medium zugegeben. Für die
Transfektionslösung wurden 4 µl der Plasmid-DNA pcDNA/TO/myc-His Typ A
mit der nach der Transformation im Verfahren der Elektroporation enthaltenen
DNA von Claudin-7 sense und antisense (Negativkontrollen: 4 µl reines Plasmid
bzw. 4 µl Aqua dest.), 184 µl FCS-freies Medium und 6 µl Plus-Reagenz in ein
Reaktionsgefäß gegeben und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Danach wurden 8 µl Lipofektamin und weitere 192 µl FCS-freies Medium
zugegeben und die fertige Transfektionslösung auf die Zellen gegeben. Es
folgte eine 3-stündige Inkubationszeit bei 37°C in wasserdampfgesättigter
Atmosphäre,
dann
wurden
2
ml
normales
FCS-haltiges
Nährmedium
zugegeben. Am nächsten Tag erfolgte ein Mediumwechsel und anschließend
die
Behandlung
mit
PD98059
für
24
h,
bevor
die
Zellen
für
die
Immunfluoreszenzfärbung auf den Objektträgern fixiert wurden.
2.6.6.
PD98059 Behandlung von Zellen
Die Behandlung erfolgte an Zellen der Pankreaskarzinomzelllinien PaTu8988S,
PaTu8988T, SUIT-2 S2-007, SUIT-2 S2-013, SUIT-2 S2-020 und SUIT-2 S2028. PD98059 wurde nach Herstellerprotokoll in DMSO gelöst und dem
Nährmedium in einer Endkonzentration von 50 µM zugesetzt. Für die
Behandlung waren die Zellen zu 70-80% konfluent. Beim Mediumwechsel
wurde nach dem Waschen der Zellen mit 1xPBS das entsprechende
Nährmedium mit 50 µM PD98059 auf die Zellen gegeben und für 24 h unter
normalen Wachstumsbedingungen inkubiert. Zur Negativkontrolle erfolgte die
Inkubation der Zellen sowohl mit dem jeweiligen Nährmedium als auch mit 14
mM DMSO Nährmedium entsprechend der Konzentration von DMSO im
Nährmedium der PD98059 -behandelten Zellen. Nach der Behandlung wurden
die Zellen für die Immunfluoreszenzfärbung fixiert oder Proteine zur
Verwendung im Western-Blot extrahiert.
54
2. MATERIAL UND METHODEN
2.6.7.
5-Aza-2´-Deoxycytidin (5-Aza-CdR) Behandlung
Die Identifizierung der durch Methylierung differentiell exprimierten Gene setzte
voraus, dass QGP-1 Zellen mit oder ohne Zugabe des MethyltransferaseHemmstoffs 5-Aza-2´-Deoxycytidin kultiviert wurde. Dafür wurden die Zellen
ausgesät und zunächst 24 h unter Normalbedingungen gezüchtet. Es erfolgte
ein Mediumwechsel und die Zugabe von 5-Aza-2´-Deoxycytidin in einer
Konzentration von 1µM. Im Verlauf von weiteren 72 h wurde alle 24 h das
Medium gewechselt und 5-Aza-2´-Deoxycytidin hinzugefügt. Danach erfolgte
die Isolation von Gesamt-RNA. Als Kontrolle dienten gleichzeitig kultivierte
Zellen der QGP-1 Linie, die nicht mit 5-Aza-2´-Deoxycytidin behandelt wurden.
2.6.8.
Immunfluoreszenz und DAPI-Färbung
Die auf Objektträgern fixierten Zellen wurden in 0,2%iges Triton X-100 in 1x
PBS gegeben und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert, um ein besseres
Eindringen der Antikörper in die Zellen zu ermöglichen. Danach wurde die
Morphologie der Zellen unter dem Mikroskop kontrolliert und die anzufärbenden
Bereiche mit einem Fettstift umrandet. Es folgte dreimaliges 10minütiges
Waschen in 1x PBS, danach wurden die Objektträger zum Blockieren kurz in
1%iges BSA in 1x PBS getaucht, bevor einer der Primärantikörper (Tabelle 3) in
einer
Verdünnung
zwischen
1:100
und
1:200
in
1x
PBS
auf
den
entsprechenden Bereich gegeben wurde. Die Objektträger wurden für 1 Stunde
in eine feuchte Kammer gelegt. Es erfolgte erneut drei mal 10minütiges
Waschen in 1x PBS, dann wurden die entsprechenden Sekundärantikörper in
einer Verdünnung von 1:100 oder 1:200 auf die anzufärbenden Bereiche
gegeben und die Objektträger für weitere 30 Minuten in die feuchte Kammer
gelegt. Mit Zugabe der Sekundärantikörper (Tabelle 3) war darauf zu achten,
dass die Lichtexponation der Objektträger auf ein Minimum beschränkt wurde.
Anschließend wurden die Zellen drei mal 10 Minuten in 1x PBS gewaschen,
darauf folgte die DAPI-Kernfärbung. Die DAPI-Stammlösung wurde hierzu in
einem Verhältnis von 1:1.0000 verdünnt und für 2 Minuten auf die
entsprechenden Abschnitte gegeben. Nach abschließendem Waschen der
Objektträger in 1x PBS wurden die Zellen in Fluopräp eingebettet. Die
55
2. MATERIAL UND METHODEN
Präparate wurden lichtgeschützt bei 4C° gelagert, bis das Ergebnis der Färbung
fotografisch dokumentiert war.
Tabelle 3:
Verdünnungen der eingesetzten Antikörper in der Western
Blot Analyse
Primärantikörper
Hersteller
Verdünnung
Anti-Claudin-1, polyklonal KaninchenZymed, Kalofornien USA 1: 100
IgG
Anti-Claudin-2, polyklonal Kaninchen
1: 100
IgG
Anti-Claudin-4, monoklonal Maus IgG
1: 100
Anti E-Cadherin, polyklonal Ziege IgG Santa Cruz, Kalifornien,1:200
USA
Anti-Occludin, polyklonal KaninchenInvitrogen, Karlsruhe
1:100
IgG
Anti-ZO-1, polyklonal Kaninchen IgG
Anti ZO-2, polyklonal Ziege IgG
1:200
Invitrogen, Karlsruhe
Anti-His(C-term)-FITC-konjugiert,
1:200
1:100
monoklonal Maus IgG
Anti-myc-FITC-konjugiert, monoklonal
1:100
Maus IgG
Sekundärantikörper
Hersteller
Verdünnung
Esel Anti Kaninchen, FITC-konjugiert Santa Cruz, Kalifornien, 1:200
Esel Anti Maus, FITC-konjugiert
Esel Anti Ziege, FITC-konjugiert
56
USA
1:200
1:200
3. ERGEBNISSE
3.
Ergebnisse
3.1.
Differentielle
Expression
der
Tight
Junction
Komponenten Claudine-1, -2, -4, -7 und -12 im
Metastasierungsmodell
der
humanen
duktalen
PaTu8988S/T Pankreaskarzinom-zelllinien
Da die Metastasierung beim Pankreaskarzinom eine hohe prognostische
Bedeutung hat und bei diesem Prozess die Ausbildung von Zell-Zell-Kontakten
eine entscheidende Rolle spielt wurde die Expression verschiedener Mitglieder
der Multigenfamilie der Claudine in dem Metastasierungsmodell der humanen
duktalen Pankreaskarzinomzelllinien PaTu8988S und PaTu8988T untersucht.
Die Zelllinien PaTu8988S und PaTu8988T wurden aus der Lebermetastase
eines nichtresektablen duktalen humanen Adenokarzinoms des Pankreas
etabliert (Elsässer et al., 1992). Die PaTu8988S Zellen sind weniger
differenziert, wachsen in Kultur in Zellhaufen, haben im Vergleich zu
PaTu8988T Zellen die 2-fache Wachstumsgeschwindigkeit und bilden im
Nacktmausmodell Lungenmetastasen. PaTu8988T Zellen zeigen dagegen eine
eher fibroblastenartige Morphologie mit losen Zell-Zell-Kontakten, die Zelllinie
ist
höher
differenziert,
wächst
einschichtig
in
Kultur
und
bildet
im
Nacktmausmodell keine Lungenmetastasen (Elsässer et al., 1992).
Aufgrund der Beobachtung der metastasierungs-assoziierten Expression von
Claudin-2 in den Zelllinien PaTu8988S und PaTu8988T (Hoormann, 2007)
wurden weitere zum Zeitpunkt der Untersuchung hinsichtlich der Gensequenz
bekannte Mitglieder der Multigenfamilie der Claudine, Claudine-1, -3, -4, -7, -12,
-14,
und
–17
anhand
der
RT-PCR
(Reverse
Transkriptase-
Polymerasekettenreaktion) bezüglich ihres Expressionsverhaltens untersucht.
Hierzu wurde aus den Zelllinien PaTu8988S und PaTu8988T Gesamt-RNA
isoliert, mithilfe der reversen Transkription in cDNA umgeschrieben und in der
RT-PCR als Template eingesetzt. Weiterhin wurde in beiden Zelllinien
untersucht, ob eine fehlende Claudin-Expression durch chromosomalen Verlust
57
3.ERGEBNISSE
des Gens verursacht sein könnte. Hierzu wurde aus beiden Zelllinien die
genomische DNA isoliert und in der PCR als Template eingesetzt. Die
Primerpaare sind Tabelle 1 (Material und Methoden 2.2.11.) zu entnehmen. Zur
RT-PCR Analyse von Claudin-7 wurden die Primer Claudin7f und Claudin7r
eingesetzt. Als interner Standard diente die Amplifikation von β-Aktin (Abbildung
9).
Die RT-PCR der Claudin-1 Sequenz zeigte ein Amplifikat in einer erwarteten
Größe von 265 bp in beiden Zelllinien PaTu8988S und PaTu8988T. Ebenso
wurde das Claudin-12 PCR-Amplifikat von 522 bp in beiden Zelllinien
exprimiert, wobei Claudin-12 in der Zelllinie PaTu8988S eine stärkere
Expression aufwies, Claudin-1 dagegen in den PaTu8988T Zellen stärker
exprimiert wurde. Die Amplifikation unter Anwendung der genomischen DNA
der PaTu8988S und PaTu8988T Zellen zeigten für Claudin-1 (1985 bp) und
Claudin-12 (522 bp) hinsichtlich der Amplifikatstärke keine Unterschiede
zwischen den beiden Zelllinien.
Die RT-PCR bestätigte mit einem 265 bp Amplifikat in den PaTu8988S Zellen
bei fehlendem Nachweis in den PaTu8988T Zellen und gleichzeitigem
Nachweis der genomischen Sequenz in beiden Zelllinien die durch cDNA-RDA
(cDNA- Representational Difference Analysis) identifizierte metastasierungsassoziierte Expression von Claudin-2 im vorliegenden Metastasierungsmodell
(Hoormann, 2007). Die Claudine-4 und Claudin-7 zeigten in dem vorliegenden
Zellkulturmodell ebenso eine metastasierungs-assoziierte Expression. Die RTPCR von Caudin-4 führte dabei nur in den PaTu8988S Zellen zu einem
Amplifikat von 477bp, nicht in den PaTu8988T Zellen. Die RT-PCR
Amplifikation von Claudin-7 führte zu einem deutlichen 522 bp Fragment in den
PaTu8988S Zellen, dagegen zu einem schwächeren Amplifikat in den
PaTu8988T Zellen. Die PCR unter Verwendung der genomischen DNA führte in
beiden Zelllinien zu Claudin-4 (477 bp) und Claudin-7 (1293 bp) Amplifikaten
und bestätigte somit die differentielle Expression in der RT-PCR. Bei Claudin-7
fand sich interessanterweise eine geringere Amplifikatstärke der genomischen
PCR in der Zelllinie PaTu8988T im Vergleich zu den PaTu8988S Zellen, wobei
58
3. ERGEBNISSE
die ß-Aktin Amplifikation als interner Standard diente. Insgesamt weisen die
Ergebnisse darauf hin, dass der Verlust der Claudine-2, -4 und -7 Expression in
den PaTu8988T Zellen nicht durch homozygoten Verlust des jeweiligen Gens
bedingt ist.
Die
Claudine-3,
-14
und
–17
zeigten
keine
Transkription
in
dem
Metastasierungsmodell. Wie in Abbildung 9 dargestellt, konnte zwar ein
Claudin-3 DNA-Fragment von 555 bp unter Verwendung der genomischen DNA
sowohl in der Zelllinie PaTu8988S als auch in PaTu8988T Zellen amplifiziert
werden, nicht dagegen die Claudin-3 cDNA anhand der RT-PCR. Die Claudin14 RT-PCR führte ebenso zu keinem Amplifikat in beiden untersuchten
Zelllinien,
dagegen
konnte
anhand
der
PCR
unter
Anwendung
der
genomischen DNA ein 564 bp Amplifikat in beiden Zelllinien generiert werden.
Claudin-17 wurde weder in den PaTu8988T noch PaTu8988S Zellen exprimiert,
war jedoch nach PCR der genomischen DNA beider Zelllinien mit gleicher
Amplifikatstärke nachweisbar. Die Ergebnisse der RT-PCR Analyse und der
genomischen PCR Analyse sind in Abbildung 9 dargestellt.
Zur Bestätigung der differentiellen Transkription der untersuchten Claudine
erfolgte die Untersuchung der Expression der Tight Junction Proteine Claudin1, Claudin-2 und Claudin-4 anhand einer Western Blot Analyse. Hierzu wurden
aus den beiden Zelllinien PaTu8988S und PaTu8988T Proteinextrakte
hergestellt und die entsprechenden Anti-Claudin Antikörper eingesetzt.
Kommerzielle spezifische Antikörper gegen Claudin-7 und Claudin-12 standen
hierzu zum Zeitpunkt der Untersuchungen noch nicht zur Verfügung. Die
Untersuchung des Aktinproteins diente der Ladekontrolle.
59
3.ERGEBNISSE
Abbildung 9. Expression komplementärer und genomischer Claudin DNA Sequenzen im
Metastasierungsmodell der PaTu8988S und PaTu8988T Zellen.
Semiquantitative RT-PCR (Spalten 3 und 4), sowie genomische PCR (Spalten 7 und 8) der
humanen Claudine-1, -2, -3, -4, -7, -12, -14 und -17. (a) Als Template dienten die cDNAs sowie
(b) die genomische DNA der Zelllinien PaTu8988S und PaTu8988T. Die RT-PCR Amplifikate
wurden in einem 1.5 %-igen Agarosegel aufgetrennt und mit Ethidiumbromid visualisiert. Als
interne Kontrolle diente die ß-Aktin Amplifikation. M, λDNA/EcoRI+HindIII Marker 3 (genomische
PCR für Claudin-1, -2, -7) und pUC Mix Marker 8 (bei den übrigen PCR Analysen) (Spalten 1 und
5); bp, Basenpaare; K, Kontroll-PCR ohne Template (Spalten 2 und 5).
60
3. ERGEBNISSE
Anhand der Western Blot Analyse konnte nur eine schwache Claudin-1
Expression in der Zelllinie PaTu8988S nachgewiesen werden, im Gegensatz
dazu war die Claudin-1 Proteinbande in den PaTu8988T Zellen stark
nachweisbar. Interessanterweise war der Expressionsunterschied von Claudin1 auf Proteinebene wesentlich stärker als aus den in der RT-PCR gewonnen
Ergebnissen mit dem Nachweis eines etwas stärkeren Claudin-1 Amplifikates in
PaTu8988T Zellen.
Abbildung 10. Nachweis der Expression der Tight Junction-Proteine Claudine-1, -2 und -4
im Metastasierungsmodell der Pankreaskarzinomzelllinien PaTu8988S und –T durch
Western Blot Analyse.
Nach Proteinextraktion aus den Pankreaskarzinomzelllinien PaTu8988S (1) und -T (2) wurden
diese elektrophoretisch im SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt, auf eine Nylonmembran geblottet
und die verschiedenen Claudinproteine mithilfe der spezifischen primären Claudin-Antikörper
anhand der ECL Methode visualisiert. Aktin diente der Ladungskontrolle. kD, Kilodalton.
61
3.ERGEBNISSE
Das Claudin-2 Protein wurde deutlich in den metastasierenden PaTu8988S
Zellen exprimiert, jedoch nicht in den PaTu8988T Tumorzellen, was die
metastasierungs-assoziierte Claudin-2 Expression auch auf Proteinebene
bestätigte. Das gleiche Expressionsverhalten wie Claudin-2 zeigte Claudin-4,
das jedoch in den PaTu8988S Zellen weniger stark als Claudin-2 exprimiert
wurde. Die Ergebnisse der Western Blot Analyse sind in Abbildung 10
dargestellt.
Zusammenfassend konnte eine metastasierungs-assoziierte Expression von
Claudin-2 und Claudin-4 in dem Metastasierungsmodell der PaTu8988S und –T
Zellen bestätigt werden. Zudem zeigten die Western Blot Analysen eine hierzu
inverse differentielle Expression von Claudin-1. Die Untersuchungen geben
weiterhin einen Hinweis darauf, dass die fehlende Transkription der
untersuchten Claudine nicht durch Verlust der genomischen Sequenzen,
sondern durch andere Mechanismen bedingt sein muss. Die Ergebnisse weisen
darauf
hin,
dass
die
in
die
Lunge
metastasierenden
PaTu8988S
Pankreaskarzinomzellen ein bestimmtes Set von Claudinen exprimieren, das in
den nicht in die Lunge metastasierenden Pankreaskarzinomzellen PaTu8988T
nicht exprimiert wird, mit Ausnahme von Claudin-1 sowie Claudin-12, dessen
Transkript in beiden Zelllinien nachweisbar war.
3.2.
Expression
der
Tight
Junction
Komponenten
Claudin-4, -7 und –12 im Metastasierungsmodell der
humanen
duktalen
SUIT-2
Pankreaskarzinom
Subzelllinien
Um die metastasierungs-assoziierte Expression der Claudine -4, -7 und -12 in
einem weiteren Modell zu untersuchen wurde ihre Expression in dem
Metastasierungsmodell der humanen SUIT-2 Pankreaskarzinom Subzelllinien
untersucht.
62
3. ERGEBNISSE
Die Zelllinie SUIT-2 wurde initial aus der Lebermetastase eines humanen
Pankreaskarzinoms mit spontaner Metastasierung in Lunge und regionale
Lymphknoten im Nacktmausmodell entwickelt (Iwamura et al., 1987). Es
wurden
28
Subzelllinien
isoliert,
die
sich
in
ihren
morphologischen
Eigenschaften und ihrem Metastasierungsverhalten unterscheiden (Iwamura et
al., 1997). In der vorliegenden Arbeit wurden vier der Subzelllinien ausgewählt,
SUIT-2 S2-007 (mäßig differenziert mit hohem Metastasierungsgrad), SUIT-2
S2-020 (gering differenziert mit mäßigem Metastasierungsgrad), SUIT-2 S2-013
(gut differenziert mit mäßigem Metastasierungsgrad) und SUIT-2 S2-028 (gut
differenziert
mit
geringem
Metastasierungsgrad).
Aus
den
kultivierten
Subzelllinien wurde Gesamt-RNA isoliert, durch reverse Transkription in cDNA
umgeschrieben und eine semiquantitative RT-PCR mit Claudin-spezifischen
Primern (siehe Tabelle 1, Materialien und Methoden) durchgeführt.
Nach
RT-PCR
Amplifikation
zeigte
Claudin-4
bei
abnehmendem
Metastasierungsgrad der Zelllinien SUIT-2 S2-007, SUIT-2 S2-020 und SUIT-2
S2-013 eine sinkende Expression, jedoch bei der Subzelllinie SUIT-2 S2-028
mit geringem Metastasierungsgrad wieder eine Zunahme. Claudin-7 zeigte ein
vergleichbares Expressionsmuster. Die RT-PCR Analyse von Claudin-12 zeigte
eine schwächere Expression in den SUIT-2 S2-020 Zellen und eine mittelstarke
in den beiden Subzelllinien SUIT-2 S2-007 und SUIT-2 S2-013, sowie eine
etwas stärkere in den SUIT-2 S2-028 Zellen.
Während
keine
Abhängigkeit
der
Claudin-12
Expression
vom
Metastasierungsgrad der Subzelllinien zu beobachten war, wurde Claudin-12
dagegen mit zunehmendem Differenzierungsgrad der Subzelllinien stärker
exprimiert,
und
zeigte
somit
ein
differenzierungs-abhängiges
Expressionsmuster. Die Ergebnisse der RT-PCR Analyse sind in Abbildung 11
dargestellt. Die RT-PCR Untersuchung mit Nachweis abnehmender Claudin-2
Expression bei abnehmendem Metastasierungsgrad wurde von S. Hoormann
zur Verfügung gestellt und diente dem Vergleich mit den in dieser Arbeit
untersuchten Claudinen und der Claudin-2 Western Blot Analyse.
63
3.ERGEBNISSE
Abbildung
11.
Expression
von
Claudinen
im
humanen
Pankreaskarzinom-
Metastasierungsmodell SUIT-2 nach RT-PCR.
Die semiquantitative RT-PCR Analyse von Claudin-4, -7 und –12 erfolgte nach Isolierung der
Gesamt-RNA aus den verschiedenen SUIT-2 Subzelllinien und Reverser Transkription. Die RTPCR Analyse von Claudin-2 wurde von S. Hoormann zur Verfügung gestellt (Hoormann, 2006).
Der Metastasierungsgrad der SUIT-2 Subzelllinien ist von Spalte 3 bis 6 abnehmend: (3) SUIT-2
S2-007, stark metastasierend, mittelmäßig differenziert, (4) SUIT-2 S2-020, mittelmäßig
metastasierend, wenig differenziert, (5) SUIT-2 S2-013, mittelmäßig metastasierend, gut
differenziert, (6) SUIT-2 S2-028, wenig metastasierend, gut differenziert. Zur Amplifikation von
humanem Claudin-7 wurden die Primer Claudin7f und Claudin7r eingesetzt, ansonsten wie in
Material und Methoden beschrieben. Die RT-PCR Amplifikate wurden im 1,5 %-igen Agarosegel
aufgetrennt und mit Ethidiumbromid visualisiert. Als interne Kontrolle diente die β-Aktin
Amplifikation. K, Kontrolle (RT-PCR ohne Template). M, pUC Mix Marker, 8. bp, Basenpaare.
64
3. ERGEBNISSE
Die Untersuchung der Expression der Tight Junction Proteine Claudin-1,
Claudin-2 und Claudin-4 erfolgte anhand der Western Blot Analyse. Hierzu
wurden aus den vier SUIT-2 Subzelllinien Proteinextrakte hergestellt und
spezifische gegen Claudin-1, -2, und -4 gerichtete Antikörper eingesetzt.
Kommerzielle spezifische Antikörper gegen Claudin-7 und Claudin-12 standen
zum Zeitpunkt der Arbeit noch nicht zur Verfügung. Die Untersuchung des
Aktinproteins diente der Ladekontrolle.
Claudin-1 Protein wurde in allen vier SUIT-2 Subzelllinien exprimiert, wobei die
Zelllinie SUIT-2 S2-028 (wenig metastasierend, gut differenziert) eine deutlich
stärkere Claudin-1 Expression aufwies als die anderen drei Subzelllinien, die
eine weitgehend ähnliche Expressionsstärke im Vergleich zum Aktinprotein
zeigten. Claudin-2 Protein wurde deutlich in den Subzelllinien SUIT-2 S2-007,
und SUIT-2 S2-028,noch stärker in SUIT-2 S020, jedoch nur schwach in den
SUIT-2 S2-013 Zellen exprimiert, sodass die Proteinexpression nicht mit dem
Claudin-2 Expressionsprofil nach RT-PCR korrelierte. Claudin-4 Protein wurde
in allen 4 Subzelllinien mit nur geringeren Unterschieden exprimiert, und wies
daher auch ein zur Claudin-4 RT-PCR nicht konkruentes Expressionsprofil auf.
Die Ergebnisse der Western Blot Analyse sind in Abbildung 12 dargestellt.
Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass sich das in der RT-PCR
nachgewiesene differentielle Expressionsmuster von Claudin-2 und Claudin-4 in
den untersuchten SUIT-2 Subzelllinien anhand der Western Blot Analysen auf
Proteinebene nicht darstellte. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass die
Transkription oder mRNA Stabilität der untersuchten Claudine unterschiedlich
zu deren Translation oder Proteinturnover in diesen Zellen reguliert wird.
Anhand der Western Blot Analysen ergab sich im Unterschied zu den RT-PCR
Analysen kein Hinweis für eine metastasierungs- oder differenzierungsassoziierte
Claudin-2
oder
Claudin-4
Expression
im
SUIT-2
Metastasierungsmodell.
65
3.ERGEBNISSE
Abbildung 12. Nachweis der Proteinexpression der Tight Junction-Proteine Claudine-1, -2
und -4 im Metastasierungsmodell der Pankreaskarzinom SUIT-2 Subzelllinien durch
Western Blot Analyse.
Nach Proteinextraktion aus den SUIT-2 Subzelllinien (1) SUIT-2 S2-007 (stark metastasierend,
mittelmäßig differenziert), (2) SUIT-2 S2-020 (mittelmäßig metastasierend, wenig differenziert),
(3) SUIT-2 S2-013 (mittelmäßig metastasierend, gut differenziert), (4) SUIT-2 S2-028 (wenig
metastasierend, gut differenziert) wurden diese elektrophoretisch im SDS-Polyacrylamidgel
aufgetrennt, auf eine Nylonmembran geblottet und die Claudine mithilfe der spezifischen
primären Claudin-Antikörper anhand der ECL-Methode visualisiert. Aktin diente der
Ladungskontrolle. kD, Kilodalton.
66
3. ERGEBNISSE
3.3.
Heterogenität der Expression von Mitgliedern der
Claudinfamilie
in
humanen
duktalen
Pankreaskarzinom-zelllinien
Aufgrund der Beobachtung der differentiellen Expression der Claudine-4, -7 und
-12 in dem Metastasierungsmodell der PaTu8988S und PaTu8988T Zellen
wurde
das
Expressionsprofil
in
weiteren
10
humanen
Pankreaskarzinomzelllinien untersucht. Dazu wurde aus Gesamt-RNA der
Zelllinien PaTu8902, PC-3, PC-44, PC-2, MIAPaCa, Panc-1, AsPC-1, PaTu-II,
HPAF
und
Capan-2
und
anschließender
reverser
Transkription
in
komplementäre DNA (cDNA) eine Polymerasekettenreaktion von Claudin-4,
Claudin-7 und Claudin-12 durchgeführt. Zur Amplifikation von Claudin-7 wurden
die Primersequenzen Claudin7f und Claudin7r eingesetzt, für Claudin-4 und -12
die in Material und Methoden (Tabelle 1) genannten Primer. Als interne
Kontrolle diente eine β-Aktin Amplifikation unter Anwendung der Primer beta
actin 5´ und beta actin 3´, die zu einem Fragment von 838 bp führte.
Anhand der semiquantitativen RT-PCR war mit Ausnahme der PaTu8988T
Zellen in allen untersuchten Zelllinien ein Claudin-4 Amplifikat von 477 bp in
unterschiedlicher Stärke nachweisbar. Dabei zeigte sich eine starke Claudin-4
Expression in 75% (9 von 12) der Zelllinien, nämlich in PaTu8988S, PC-44, PC2, MIAPaCa, Panc-1, AsPC-1, PaTu-II, Capan-2 und PaTu8902. Eine geringere
Claudin-4 Expression fand sich in den Zelllinien PC-2 und PC-3 (2 von 12;
16%), in der Zelllinie PaTu8988T wurde keine Claudin-4 Expression
nachgewiesen. Ein starkes Claudin-7 PCR-Amplifikat konnte in den Zelllinien
PaTu8988S,
PC-3,
PC-44,
PC-2,
Panc-1,
sowie
in
geringerer
Expressionsstärke auch in den Zelllinien PaTu8902, AsPC-1, PaTuII, HPAF und
Capan-2 nachgewiesen werden (9 von 12; 75%). Die MIAPaCa Tumorzellen
zeigten ein nur sehr schwaches Claudin-7 Amplifikat und in der Zelllinie
PaTu8988T wurde keine Claudin-7 Expression nachgewiesen. Claudin-12
wurde in fast allen untersuchten Pankreaskarzinomzelllinien in unterschiedlicher
Stärke deutlich exprimiert, mit Ausnahme der Zelllinien PC-3 und PaTu8988T
mit etwas schwächerer und der Zelllinie PC-2 mit nur sehr geringer Expression.
67
3.ERGEBNISSE
Abbildung 13. Semiquantitative RT-PCR Analyse der Expression von Claudinen in
humanen Pankreaskarzinomzelllinien.
Die Expression von humanen Claudin-2, Claudin-4, Claudin-7 und Claudin-12 wurde durch RTPCR nach RNA Isolierung aus den Zelllinien PaTu8988S (3), PaTu8902 (4), PaTu8988T (5), PC3 (6), PC-44 (7), PC-2 (8), MIAPaCa (9), Panc-1 (10), AsPC-1 (11), PaTuII (12), HPAF (13) und
Capan-2 (14) untersucht. Es wurde ein Claudin-4 Amplifikat von 477 bp, ein Claudin-7 Amplifikat
von 357 bp und ein Claudin-12 Amplifikat von 522 bp generiert. Als interne Kontrolle diente die βAktin Amplifikation. Die RT-PCR Amplifikate wurden in einem 1,5%-igen Agarosegel aufgetrennt
und mit Ethidiumbromid visualisiert. Die interne Kontrolle durch β-Aktin Amplifikation sowie die
RT-PCR Analyse von Claudin-2 wurde von S. Hoormann durchgeführt und zur Verfügung gestellt
(Hoormann, 2006). M, pUC Mix Marker 8; K, Negativkontrolle (RT-PCR ohne Template); bp,
Basenpaare.
68
3. ERGEBNISSE
Zusammenfassend konnte die Expression der Claudine-4, -7 und –12 in fast
allen untersuchten Pankreaskarzinomzelllinien in unterschiedlicher Stärke
nachgewiesen werden. Ausnahmen bildeten die Zelllinie PaTu8988T, die nur
Claudin-12 exprimierte sowie die Zelllinie MIAPaCa, die kein Claudin-7
exprimierte. Eine metastasierungs-assoziierte Expression von Claudin-4 und
Claudin-7 konnte nur in dem Metastasierungsmodell PaTu8988S und –T
bestätigt werden. Ansonsten fand sich kein sicherer Hinweis für eine Korrelation
zwischen der Claudin-4 oder Claudin-7 Expression und dem soweit bekannten
Metastasierungsverhalten
oder
Differenzierungsgrad
der
Zelllinien.
Die
Ergebnisse der RT-PCR Analyse sind in Abbildung 13 dargestellt.
3.4.
Methylierungsabhängige Expression von Claudin-4,
Claudin-5,
und
Claudin-7
in
humanen
neuroendokrinen Pankreastumorzelllinien
Um
das
Expressionsprofil
der
Claudine
in
neuroendokrinen
Pankreastumorzellen zu bestimmen wurden die Claudine-2, -4, -5, -7 und -12 in
den humanen Pankreaskarzinoidzelllinien BON-I und QGP-1 anhand der
semiquantitativen RT-PCR Analyse untersucht. Dazu wurde Gesamt-RNA
isoliert, mithilfe der reversen Transkription in cDNA umgeschrieben und die
verschiedenen Claudin cDNAs anhand der PCR amplifiziert. In der PCR zur
Amplifikation von Claudin-7 wurden als Primersequenzen Claudin7f und
Claudin7r eingesetzt, für die Claudine-2, -4, -5 und –12 die in Material und
Methoden (Tabelle 1) genannten Primer. Als interne Kontrolle diente die
Amplifikation von β-Aktin unter Anwendung der Primer beta actin 5’ und beta
actin 3´, die zu einem Fragment von 838 bp führte.
Anhand der RT-PCR konnte unter Anwendung spezifischer Primerpaare in den
BON I Zellen (Abbildung 14, Spalte 3) ein 477 bp Claudin-4 und ein 357 bp
Claudin-7 Amplifikat generiert werden, sowie schwächere 474 bp Claudin-5 und
522 bp Claudin–12 Amplifikate. Ein Claudin-2 Amplifikat ließ sich nicht
69
3.ERGEBNISSE
generieren. In den QGP-1 Zellen (Abbildung 14, Spalte 5) wurden Claudin-7
und Claudin-12 mittelstark exprimiert, während Claudin-4 nur sehr schwach und
die Claudine-2 und -5 nicht nachweisbar waren.
Die de novo Methylierung von DNA ist ein molekularer Mechanismus, durch
den es zu einem Transkriptionsverlust bei intaktem Genom kommen kann. Um
zu untersuchen, ob die Expression der Claudine in den neuroendokrinen
Pankreastumorzelllinien BON I und QGP-1 methylierungsabhängig erfolgt, war
aus den kultivierten BON-I und QGP-1 Zellen nativ und nach Zugabe von 1µM
5-AZA CdR (5-AZA-2´-Desoxycytidin) RNA isoliert und mithilfe der reversen
Transkription in cDNA umgeschrieben und die verschiedenen Claudin cDNAs
anhand der PCR amplifiziert worden. Durch das Pyrimidinanalogon 5-AZA CdR
kann die Reexpression bei einem durch de novo Methylierung induzierten
Trankriptionsverlust erreicht werden.
In der Zelllinie BON I zeigten Claudin-4, -5 und -7 nach Zugabe von 5-AZA CdR
zum
Nährmedium
eine
Expressionserhöhungen
im
Vergleich
zu
den
unbehandelten Zellen, was auf eine methylierungsabhängige Regulation der
Transkription dieser Gene hinweist. Keine de novo Expression oder
Expressionsunterschied
konnte
hingegen
für
die
Claudine-2
und
-12
nachgewiesen werden (Abbildung 14, Spalten 3 und 4). In der Zelllinie QGP-1
zeigte Claudin-4 in unbehandelten QGP-1 Zellen eine nur sehr geringe
Expression,
dagegen
nach
Zugabe
von
5-AZA
CdR
eine
deutliche
Herraufregulation der Expression. Dagegen wurden die Claudine-2 und -5
weder vor noch nach 1 µM 5-AZA CdR Behandlung exprimiert, sodass der
Transkriptionsverlust nicht methylierungsabhängig ist. Die unbehandelten QGP1 Zellen mit bereits vorhandener Expression von Claudin-7 und -12 zeigten im
Vergleich
zu
den
5-AZA
CdR
behandelten
Expressionsunterschied (Abbildung 14, Spalten 5 und 6).
70
Zellen
keinen
3. ERGEBNISSE
Abbildung 14. Methylierungsabhängige Regulation von Claudin-4, Claudin-5 und Claudin-7
in humanen neuroendokrinen Pankreastumorzellen.
Semiquantitative RT-PCR Analyse von Claudin -4, -5, -7, und –12 in BON I (Spalten 1 und 2) und
QGP-1 Zellen (Spalten 3 und 4) entweder unbehandelt (Spalten 1 und 3) oder nach Behandlung
mit 1µM 5-AZA CdR (Spalten 2 und 4). Die RT-PCR Amplifikate wurden in einem 1,5 %-igen
Agarosegel aufgetrennt und mit Ethidiumbromid visualisiert. Als interne Kontrolle diente die βAktin Amplifikation. K, Kontrolle (RT-PCR ohne Template). M, pUC Mix Marker, 8. bp,
Basenpaare.
71
3.ERGEBNISSE
Zur Bestätigung der methylierungs-abhängigen Regulation wurde eine Western
Blot Analyse mit den entsprechenden Anti-Claudin Antikörpern durchgeführt.
Dazu wurden aus den in Kultur wachsenden unbehandelten oder mit 1 µM 5AZA CdR behandelten QGP-1 Zellen Proteinextrakte hergestellt und zur
Western Blot Analyse eingesetzt. Die Untersuchung des Aktinproteins diente
der Ladekontrolle.
Abbildung 15. Methylierungsabhängige Expression von Claudin-4 in den neuroendokrinen
Pankreastumorzellen QGP-1.
Western Blot Analyse mit Proteinextrakten aus PaTu8988S Zellen als Positivkontrolle (P, Spalte
1), und den unbehandelten (Spalte 2) und mit 1µM 5-AZA CdR behandelten (Spalte 3) QGP-1
Zellen. Zum Nachweis der Claudin-1, Claudin-2 und Claudin-4 Expression wurden die in
Materialien und Methoden aufgeführten Antikörper eingesetzt. +DAC, nach 1 µM 5-AZA CdR
Behandlung. Rechts, Molekulargewicht des Markerproteins. kD, Kilodalton.
72
3. ERGEBNISSE
Nach Behandlung der QGP-1 Zellen mit 1µM 5-AZA CdR (DAC) war eine
deutliche Zunahme der Claudin-4 Proteinexpression nachzuweisen, während
Claudin-2 weiterhin nicht nachgewiesen werden konnte. Claudin-1 (nicht in der
RT-PCR Analyse untersucht) zeigte nach Behandlung mit 1µM 5-AZA CdR eine
nur minimale Expressionszunahme. Zum Zeitpunkt der Untersuchungen
standen noch keine kommerziellen Antikörper gegen Claudin-5 oder Claudin-7
zur Verfügung, sodass die Bestätigung der RT-PCR Ergebnisse von Claudin-5
und Claudin-7 in der Zelllinie BON I auf Proteinebene nicht möglich war. Die
Ergebnisse der Western Blot Analyse sind in Abbildung 15 dargestellt.
Zusammenfassend zeigen die Ergebnisse, dass die untersuchten Claudine,
wenn auch schwächer, in den humanen neuroendokrinen Pankreastumorzellen
heterogen exprimiert werden. Diese Ergebnisse weisen erstmals darauf hin,
dass Methylierung ein möglicher Regulationsmechanismus für die Expression
von Mitgliedern der Multigenfamilie der Claudine in Tumorzellen darstellt.
3.5.
Charakterisierung
der
Claudin-7
Expression
in
normalen und pathologischen humanen Geweben
und Zellen
3.5.1.
Bestätigung der differentiellen Expression von Claudin-7 im
PaTu8988S/T Metastasierungsmodell anhand der Northern
Blot Analyse
In der vorliegenden Arbeit wurde anhand von semiquantitativen RT-PCR
Analysen ein metastasierungsabhängiges Expressionsprofil von Claudin-7 in
den PaTu8988S und –T Zellen nachgewiesen (Ergebnisse 3.1.1.). Während
Claudin-7 in der metastasierenden Pankreaskarzinomzelllinie PaTu8988S
exprimiert wurde, war Claudin-7 in den PaTu8988T Zellen nicht nachzuweisen.
Da die Zelllinien ein unterschiedliches Metastasierungsverhalten in die Lunge
aufweisen und ein Zusammenhang zwischen der Expression von Tight Junction
Proteinen und dem Metastasierungsverhalten bestehen könnte und über die
73
3.ERGEBNISSE
Claudin-7 Expression oder Funktion weitgehend nichts bekannt war, wurde
seine Expression im Folgenden weiter charakterisiert.
Zur Bestätigung der differentiellen Expression von Claudin-7 diente eine
Northern Blot Analyse. Hierzu wurde aus den beiden Zelllinien PaTu8988T und
PaTu8988S isolierte Gesamt-RNA in einem Formaldehydgel elektrophoretisch
aufgetrennt,
auf
eine
Nylonmembran
geblottet
und
diese
mit
einer
radioaktivmarkierten Claudin-7 cDNA-Sonde hybridisiert. Anschließend wurden
die Banden durch Autoradiographie sichtbar gemacht. Die Sonde, ein 257 bp
Fragment wurde durch RT-PCR Amplifikation mit den Primersequenzen
Claudin7f
und
Claudin7r769
hergestellt.
Nach
gelelektrophoretischer
Auftrennung erfolgte die Elution des Fragmentes aus dem Agarosegel und
anschließend die radioaktive Markierung (siehe Material und Methoden 2.4.4.).
Wie in Abbildung 16 dargestellt zeigte die Northern Blot Analyse ein ca. 2,28 kb
Claudin-7 Transkript in der Zelllinie PaTu8988S, nicht in der Zelllinie
PaTu8988T. Die ribosomale RNA war gleichmäßig nach dem Blotten bei beiden
Zelllinien auf dem Filter unter UV-Licht sichtbar (nicht dargestellt). Damit konnte
die differentielle Expression von Claudin-7 in dem Metastasierungsmodell der
PaTu8988S und -T Zellen bestätigt werden.
Abbildung 16. Northern Blot Analyse von Claudin-7 im Metastasierungsmodell der
Pankreaskarzinomzelllinien PaTu8988S und PaTu8988T.
Im Audiogramm ist das Claudin-7 Transkript (ca 2,28 kb) in den PaTu8988S Zellen (Spalte 1) im
Gegensatz zu den PaTu8988T Zellen (Spalte 2) dargestellt. kb, Kilobase
74
3. ERGEBNISSE
3.5.2.
Gewebe-, tumor- und entwicklungsspezifische Expression
von Claudin-7
Zur Bestimmung der Expressionsqualität und -quantität von Claudin-7 in
verschiedenen humanen Geweben und Karzinomzellen wurde ein Multiple
Tissue Expression (MTE) Array (Clontech) angewandt. Dieser Array ist ein RNA
Dot Blot mit 76 RNA-Proben aus verschiedenen fetalen und adulten humanen
Geweben, Karzinomzelllinien und Kontroll-RNAs. Für die Hybridisierung des
Blots wurde die für den Northern-Blot eingesetzte cDNA-Sonde angewandt.
Die Ergebnisse der Autoradiographie sind in Abbildung 17 dargestellt. Claudin-7
wurde in zahlreichen Organen in unterschiedlicher Stärke transkribiert. Die
Autoradiographie zeigte eine Claudin-7 Expression in fast allen Geweben des
Zentralnervensystems in unterschiedlicher Stärke (Spalten 1 und 2, A bis H,
sowie Spalte 3, A bis E). Claudin-7 wurde prominenter in der Hypophyse
(Spalte 3, D), dagegen schwächer in der Substantia nigra, Nucleus accumbens
und Thalamus exprimiert (Spalte 3, A-C). Auch in den unterschiedlichen
Abschnitten des Herzens fand sich Claudin-7 Expression (Spalte 4). Besonders
deutlich wurde Claudin-7 in den Organen des Gastrointestinaltraktes exprimiert
(Spalten 5 und 6), wobei die Expression von proximal nach distal zunahm und
insbesondere im Bereich des Kolons und Rektums, aber auch in der
kolorektalen Adenokarzinomzelllinie SW480 (Spalte 10, G) prominent war. Eine
ebenso starke Expression von Claudin-7 wurde in Trachea (Spalte 7, H)
beobachtet. Eine mittelstarke Expression von Claudin-7 zeigte fetale und adulte
Niere, fetale und adulte Lunge, fetale und adulte Leber, Schilddrüse, Plazenta
und Prostata. Claudin-7 wurde ebenso mittelstark im normalen Pankreas
exprimiert. Während die Expression in fetaler Lunge und adulter Lunge etwa
gleich stark war, zeigte die Lungenkarzinomzelllinie A549 eine geringe Claudin7 Expression (Spalte 10, H). In fetaler Milz und Thymus schien die Claudin-7
Expression etwas stärker als in den korrespondierenden adulten Organen
(Spalten 7C, 11E und Spalten 7D, 11F). Eine eher geringe Claudin-7
Transkription
zeigten
Gewebe
des
Immunsystems,
Leukämiezellen,
Lymphomzellen sowie Uterus und Ovarien. Die Autoradiographie zeigte ein
75
3.ERGEBNISSE
möglicherweise durch Crosshybridisierung bedingtes minimales Signal in E.coli
DNA und humaner genomischer DNA (Spalte 12D, Spalte 12H).
76
3. ERGEBNISSE
Abbildung 17. Genetisches Expressionsprofil von Claudin-7 in humanen Geweben und
Tumorzelllinien.
(a) Multiple Tissue Expression Array (Clontech) Autoradiographie nach Hybridisierung mit einer
radioaktivmarkierten humanen Claudin-7 Sonde für 2 Tage. Gewebe mit starker Claudin-7
Expression sind mit Pfeilen markiert. (b) Schematische Lokalisation der RNA-Dots der
verschiedenen Gewebe und Zelllinien. P.g.*, parazentraler Gyrus der Großhirnrinde.
Zusammenfassend wurde Claudin-7 in den meisten adulten Geweben des
menschlichen Körpers und in einzelnen Organen während der Fetalzeit in
unterschiedlicher Stärke exprimiert. Die stärkste Claudin-7 Expression wiesen
die adulten Organe des Gastrointestinaltraktes und die Trachea auf. Das
Ergebnis des MTE Arrays ist in Abbildung 17 dargestellt.
3.5.3.
Subzelluläre Lokalisation von Claudin-7 Fusionsprotein in
PaTu8988T Pankreastumorzellen
Aufgrund
der
differentiellen
Expression
von
Claudin-7
im
Pankreaskarzinommodell PaTu8988S/T mit fehlendem Nachweis der Claudin-7
Expression in den nicht metastasierenden PaTu8988T Zellen war von
Interesse, ob Claudin-7 als Tight Junction Komponente einen Einfluss auf die
Zellmorphologie hat. Zudem war die subzelluläre Lokalisation von Claudin-7
von Interesse, die bisher unbekannt war, da kein spezifischer Antikörper zur
Verfügung stand.
Anhand der unter www.pubmed.gov zugänglichen Daten über die Claudin-7
cDNA (Gen-Accession-Number XM_008338) und der genomischen Claudin-7
Sequenz wurden für die weiteren Untersuchnungen Primersequenzen zur
Amplifikation abgeleitet. Wie schematisch dargestellt liegt Claudin-7 auf
Chromosom 17p13 und die kodierende Sequenz mit 3 Exons und 4 Introns
umfasst 636 Basenpaare. Zur Orientierung hinsichtlich der Lokalisation der für
77
3.ERGEBNISSE
die folgenden Untersuchungen angewandten Primersequenzen wurden diese in
Abbildung 18 dargestellt.
Abbildung 18. Claudin-7 Gensequenz und Lokalisation im humanen Genom.
(a) cDNA Sequenz von Claudin-7 mit Lokalisation der angewandten Primersequenzen (blau
markiert). Rot sind Start und Stoppkodon markiert (Genbank-Accession-Number XM_008338).
Die Pfeile geben die Lokalisation der angewandten forward (>) und reversen (<) Primer an. (b)
Übersicht über die Lokalisation der kodierenden Claudin-7 Genabschnitte (blaue Balken) auf
Chromosom 17p13 (Genbank-Accession-Number XM_008338) und der angewandten
Primerpaare (nach unten gerichtete senkrechte Pfeile). Die cDNA Nukleotidposition wird durch
nach obern gerichtete Pfeile, die genomische Nukleotidposition in der untersten Zeile angegeben
(Genbank-Accession_Number XM_008338). Nn, Nukleotide; CH, Chromosom; Start, Startkodon;
Stop, Stoppcodon; blaue Balken, Exon; grüne Balken, Intron
78
3. ERGEBNISSE
Da zum Zeitpunkt der Untersuchungen kein kommerzieller Claudin-7 Antikörper
zur Verfügung stand, wurde der Expressionsvektor pcDNA/TO/myc-HIS zur
Klonierung der humanen Claudin-7 cDNA gewählt. Hierbei wird die Claudin-7
cDNA Sequenz so kloniert, dass ein Fusionsprotein von Claudin-7 mit einem
COOH terminalen Myc Epitop und einer anschließenden Poly-HIS-Sequenz
generiert wird. Dadurch kann ein gegen das Myc-Epitop oder die Poly-HISSequenz gerichteter Antikörper als Hinweis für die Claudin-7 Expression
angewandt werden. (Abbildung 19).
Abbildung 19. Herstellung eines Expressionsvektors zur Claudin-7 Expression in
Pankreaskarzinomzellen PaTu8988T.
Die
Claudin-7
cDNA
Sequenz
wurde
mithilfe
der
RT-PCR
amplifiziert
und
in
Transkriptionsrichtung in den Expressionsvektor pcDNA/TO/myc-HIS Plasmids ligiert (a) Karte
des Cl-7/pcDNA/TO/myc-HIS Expressionsplasmids (Invitrogen). Das myc-Epitop oder poly-HIS
dienen dem immunfluoreszenzmikroskopischen Nachweis der Claudin-7 Expression. (b) Claudin7 cDNA Amplifikat (636 bp, Nn 336 bis 971, durch Sequenzierung bestätigt) nach PCR mit
Primern Claudin7HindIIIf und Claudin7EcoRIr vor Ligation. (c) Restriktionsanalyse mit HindIII und
EcoRI des pcDNA/TO/myc-HIS Plasmids. (d) Restriktionsanalyse des Cl-7/pcDNA/TO/myc-HIS
Plasmids. M3, λDNA/EcoRI+HindIII Marker 3; M8, pUC Mix Marker 8; bp, Basenpaar; HindIII,
EcoRI Restriktionsenzyme; Cl-7, Claudin-7.
79
3.ERGEBNISSE
Hierzu wurde zunächst die Claudin-7 cDNA (Nukleotid 336 bis 971) unter
Einsatz der PaTu8988S cDNA als Template durch RT-PCR mithilfe des
Primerpaars
Claudin-7HindIIIf
und
Claudin-7EcoRIr
amplifiziert.
Interessanterweise wurden bei der Amplifikation immer zwei Amplifikate
generiert: Zum Einen das erwartete Claudin-7 cDNA Fragment mit 636
Basenpaaren und zum Anderen ein cDNA Fragment von etwa 1000
Basenpaaren das bei der bisherigen Amplifikation kürzerer Sequenzabschnitte
nicht nachweisbar war. Das 636 bp Fragment wurde durch Sequenzanalyse als
Claudin-7 identifiziert, das größere Transkript wurde zunächst nicht weiter
charakterisiert. Das 636 bp Claudin-7 Amplifikat wurde nach Restriktion mit
HindIII und EcoRI in den durch Restriktion (HindIII, EcoRI) vorbereiteten
Expressionsvektor pcDNA/TO/myc-HIS ligiert (Abbildung 19). Dieses Plasmid
wurde im Folgenden als Cl-7/pcDNA/TO/myc-HIS bezeichnet und zur
transienten Transfektion mithilfe von Lipofektamin in die kein Claudin-7
exprimierende Zelllinie PaTu8988T eingesetzt.
Mutationen im K-ras Gen liegen in fast allen duktalen Adenokarzinomen des
Pankreas vor und einer der Effektorwege von Ras ist der Raf-MEK-ERKSignaltransduktionsweg. Da die Zelllinie PaTu8988T eine K-ras Genmutation
aufweist (He et al., 2005), sollte im Folgenden auch gleichzeitig der Effekt des
MEK1-Inhibitors PD98059 nach Transfektion von Cl-7/pcDNA/TO/myc-HIS auf
die Claudin-7 Expression und Lokalisation in PaTu8988T Zellen untersucht
werden.
Die PaTu8988T Zellen wurden dazu entweder nicht oder mit dem Plasmid
pcDNA/TO/myc-HIS transfiziert und nach 48 h für weitere 24 h in
Kontrollmedium (Nährmedium mit DMSO, 0,1%, v/v) kultiviert. Mit Cl7/pcDNA/TO/myc-HIS transfizierte PaTu8988T Zellen wurden entweder in
Kontrollmedium (Nährmedium mit DMSO, 0,1 %, v/v) oder in PD98059 (50 µM
in Nährmedium mit DMSO, 0,1 %, v/v) für 24 h kultiviert.
Die Transfektionseffizienz in den PaTu8988T Zellen war wie bekannt und
erwartet sehr gering, sodass sich anhand der Immunfluoreszenz nach
transienter Transfektion mit Cl-7/pcDNA/TO/myc-HIS nur einzelne Claudin-7
80
3. ERGEBNISSE
exprimierende Zellen sowohl in der DMSO-Kontrollgruppe als auch in den mit
PD98059 behandelten PaTu8988T Zellen zeigten (Abbildung 20).
Abbildung 20. Immunfluoreszenzmikroskopischer Nachweis der Claudin-7 Expression
nach transienter Transfektion in PaTu8988T Zellen.
(1) Nichttransfizierte PaTu8988T Zellen in Medium mit DMSO (0,1%,v/v) (2) pcDNA/TO/myc-HIS
transfizierte PaTu8988T Zellen in Medium mit DMSO (0,1%,v/v) (3) Cl-7/pcDNA/TO/myc-HIS
transfizierte PaTu8988T Zellen wurden entweder nur in DMSO (0,1%,v/v) oder (4) mit in DMSO
(0,1%,v/v) gelösten 50 µM PD98059 kultiviert. Obere Reihe: Immunfluoreszenz 24 Stunden nach
Transfektion und 24 Stunden PD98059 Behandlung oder nur DMSO Behandlung nach Poly-His
Antikörper Färbung. Untere Reihe: DAPI-Kernfärbung. Vergrößerung: Okular 10x; Objektiv 40x.
Das Fusionsprotein Claudin-7/myc/PolyHIS erschien in den PaTu8988T Zellen
membranständig aber auch diffus im Zytoplasma mit teilweiser Aussparung des
Nukleus lokalisiert, wobei berücksichtigt werden muss, dass es sich um ein
Fusionsprotein handelt und eine andere subzelluläre Lokalisation des nativen
81
3.ERGEBNISSE
Claudin-7
nicht
auszuschließen
ist.
Im
Gegensatz
zu
den
Claudin-
7/myc/PolyHIS exprimierenden PaTu8988T Zellen wurde keine Claudin-7
Expression in den mit pcDNA/TO/myc-HIS transfizierten PaTu8988T Zellen
nachgewiesen. Aufgrund der vereinzelten Lage der Claudin-7/myc/PolyHIS
exprimierenden Zellen war eine durch Claudin-7 Expression bedingte
Veränderung von Zell-Zell-Kontakten nicht beurteilbar.
Zusammenfassend konnte anhand der transienten Transfektion eines Claudin7/myc/PolyHIS
Konstruktes
erstmals
die
Lokalisation
von
Claudin-7
nachgewiesen werden, wobei jedoch die subzelluläre Lokalisation aufgrund des
Fusionsproteins
und
die
Zellmorphologie
aufgrund
der
geringen
Transfektionseffizienz nur eingeschränkt beurteilbar sind. Zur weiteren Klärung
müsste nun dieses Cl-7/pcDNA/TO/myc-HIS Plasmid stabil transfiziert werden.
3.6.
Expression und subzelluläre Lokalisation von Tight
Junction-, Tight Junction-assoziierten und Adherens
Junction Proteinen nach Inhibition des Raf-MEKERK-Signaltransduktionweges in Pankreaskarzinomzellen
Adhärenzverbindungen spielen im Prozess der Metastasierung eine wichtige
Rolle. Um zu untersuchen, ob die K-ras Mutation in den SUIT-2 und
PaTu8988S/T (He et al., 2005; Kainuma et al., 1997) Metastasierungsmodellen
bei der Expression und subzellulären Lokalisation von Tight Junction und assoziierten Proteinen sowie Adherens Junction Proteinen eine Rolle spielt,
wurde die Wirkung der Inhibition des Raf-MEK-ERK-Signaltransduktionsweges
mithilfe des selektiven MEK-1 Inhibitors PD98059, der zu einer Blockade der
mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) Kaskade führt, untersucht.
82
3. ERGEBNISSE
3.6.1.
Wirkung
der
Inhibition
des
Raf-MEK-ERK-Signal-
transduktionsweges auf Tight Junction und -assoziierte
Proteine
im
PaTu8988S/T
Pankreaskarzinom
Metastasierungsmodell
Im Folgenden wurde die Wirkung der MAPK/ERK Inhibition durch den MEK1Inhibitor PD98059 auf die Proteinexpression der Tight Junction Proteine
Claudin-1, Claudin-2, Claudin-4 und der Tight Junction-assoziierten Proteine
ZO-1 und ZO-2 im PaTu8988S/T Metastasierungsmodell untersucht. Die
Expressionsanalyse von Claudin-7 war aufgrund des zum Zeitpunkt der
Untersuchungen nicht zur Verfügung stehenden kommerziellen Antikörpers
nicht möglich.
Hierzu wurden die Pankreaskarzinomzellen PaTu8988S und PaTu8988T
entweder nur in Nährmedium, mit DMSO (0,1% v/v) oder in DMSO gelöstem
MEK1-Inhibitor PD98059 (Endkonzentration 50µM im Nährmedium) für 24
Stunden kultiviert. In der Literatur ist der Effekt von PD98059 uneinheitlich im
Hinblick auf die Kontrollzellen untersucht worden, indem entweder native oder
in DMSO behandelte Zellen als Kontrollen zur Beurteilung des Effektes von
PD98059 herangezogen wurden (Grände et al., 2002; Medici et al., 2006;
Nguyen et al., 2004; Wheadon and Welham, 2003). Daher erfolgte in der
vorliegenden Arbeit die Kultivierung nativer als auch mit DMSO behandelter
Zellen als Kontrollen. Anschließend wurden Proteinextrakte hergestellt und die
Untersuchung der Expression der Tight Junction Proteine Claudin-1, Claudin-2,
Claudin-4 und Occludin sowie der Tight Junction-assoziierten Proteine ZO-1
und ZO-2 anhand einer Western Blot Analyse durchgeführt. Die Untersuchung
der Expression des Aktinproteins diente der Ladekontrolle.
Die Western Blot Analyse zeigte für Claudin-1 zwischen den mit DMSO und den
mit dem MEK1-Inhibitor PD98059 behandelten PaTu8988S Zellen keinen
Expressionsunterschied, im Vergleich zu den unbehandelten Zellen jedoch eine
stärkere Expression. Die PaTu8988T Zellen zeigten in der nativen Kontrolle, der
DMSO Kontrolle und den PD98059 behandelten Zellen in Anbetracht der AktinKontrolle eine vergleichbar starke Claudin-1 Expression. Claudin-2 wurde in
83
3.ERGEBNISSE
den nativen PaTu8988S Zellen stark und etwas weniger stark in den DMSOKontrollzellen exprimiert, dagegen war es in den mit PD98059 behandelten
Zellen kaum nachweisbar. Die Claudin-4 Expression nahm in den PaTu8988S
Zellen vergleichbar nach DMSO und PD98059 Behandlung leicht zu. Die
fehlende Expression von Claudin-2 und Claudin-4 in den PaTu8988T Zellen
veränderte sich unter DMSO oder PD98059 Behandlung nicht. Die Tight
Junction-assoziierten Proteine ZO-1 und ZO-2 wurden in den PaTu8988S
Zellen nach PD98059 Behandlung schwächer, und noch schwächer nach
DMSO Behandlung im Vergleich zu den unbehandelten Zellen exprimiert.
Dagegen
zeigten
die
PaTu8988T
Zellen
keine
relevanten
ZO-1
Expressionsunterschiede in den unbehandelten, mit DMSO oder PD98059
behandelten Zellen. ZO-2 wurde in den PaTu8988S Zellen kaum exprimiert. In
den nativen PaTu8988T Zellen war ZO-2 schwach, etwas stärker in den DMSO
behandelten und kaum in den mit PD98059 behandelten Zellen nachweisbar.
Occludin wurde in den nativen PaTu8988S Zellen leicht, und nach DMSO und
PD98059 ansteigend vermehrt exprimiert, während die PaTu8988T Zellen eine
unveränderte Occludinexpression aufwiesen.
Zusammenfassend zeigte sich im Western Blot nach Behandlung mit dem
MEK1-Inhibitor PD98059 in der Zelllinie PaTu8988S im Vergleich zu den
DMSO-behandelten Zellen eine deutliche Expressionsabnahme von Claudin-2,
eine
leichte
Zunahme
von
ZO-1,
eine
Zunahme
von
Occludin
bei
unverändertem Expressionsprofil von Claudin-1, Claudin-4 und ZO-2. Nach
Behandlung der Zelllinie PaTu8988T mit PD98059 zeigte sich im Vergleich zu
den mit DMSO behandelten Zellen eine Reduktion der ZO-2 Expression bei
ansonsten unverändertem Expressionsprofil für Claudin-1, Claudin-2, Claudin4, Occludin und ZO-1. Die Ergebnisse zeigen weiter, dass DMSO im Vergleich
zu den nativen PaTu8988S Zellen zu Veränderungen hinsichtlich der
Expression von Claudin-1, Claudin-2, Claudin-4, ZO-1 und Occludin führte und
daher native als auch DMSO Kontrollen zur Interpretation der Wirkung von
PD98059 berücksichtigt
werden müssen. Die Ergebnisse der Western Blot
Analyse sind in Abbildung 21 dargestellt.
84
3. ERGEBNISSE
Abbildung 21. Wirkung der MEK-1 Inhibition auf die Expression von Tight Junction- und
Tight-Junction-assoziierten
Proteinen
im
Metastasierungsmodell
der
Pankreaskarzinomzellen PaTu8988S / -T.
Repräsentative Western Blot Analyse mit Proteinextraken aus den 24 Stunden in Nährmedium
(N), mit DMSO (0,1%, v/v; DMSO) oder 50 µM PD98059 (0,1% DMSO v/v; PD) behandelten
Zellen. Die Proteinextrakte wurden elektrophoretisch im SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt, auf
eine Nylonmembran geblottet und die Tight Junction-Proteine Claudin-1, -2, -4 und Occludin
sowie die Tight Junction-assoziierten Proteine ZO-1 und ZO-2 mithilfe spezifischer primärer
Antikörper anhand der ECL-Methode visualisiert. Aktin diente der Ladungskontrolle
(repräsentativer Blot). kD, Kilodalton
85
3.ERGEBNISSE
3.6.2.
Wirkung
der
Inhibition
des
Raf-MEK-ERK-Signal-
transduktionsweges auf die Expression von Tight Junction
und Tight Junction -assoziierten Proteinen im humanen SUIT2 Pankreaskarzinom-Metastasierungsmodell
Aufgrund der bekannten K-ras Mutation in den SUIT-2 Zellen (Kainuma et al.,
1997) wurde die Inhibition des Raf-MEK-ERK-Signaltransduktionsweges
mithilfe des selektiven MEK-1 Inhibitor PD98059, der zu einer Blockade der
mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) Kaskade führt, zur Behandlung der
SUIT-2 Pankreastumorzellen eingesetzt, um die Wirkung auf Tight Junctionund Tight Junction-assoziierte Proteine mittels Western Blot Analyse zu
untersuchen.
Hierzu wurden die vier SUIT-2 Pankreaskarzinom Subzelllinien SUIT-2 S2-007,
SUIT-2 S2-020, SUIT-2 S2-013 und SUIT-2 S2-028 entweder nur in
Nährmedium, mit DMSO (0,1%,v/v) oder in DMSO gelöstem MEK1-Inhibitor
PD98059 (Endkonzentration 50 µM im Nährmedium) für 24 Stunden kultiviert.
In der vorliegenden Arbeit wurde sowohl die Untersuchung nativer als auch in
DMSO kultivierter Zellen als Kontrollen durchgeführt, um einen möglichen Effekt
durch DMSO, in dem PD98059 gelöst wird, festzustellen. Anschließend wurden
Proteinextrakte hergestellt und die Expression der Tight Junction Proteine
Claudin-1, Claudin-2, Claudin-4 und Occludin sowie der Tight Junctionassoziierten Proteine ZO-1 und ZO-2 anhand einer Western Blot Analyse
analysiert. Die Expressionsanalyse von Claudin-7 war aufgrund des zum
Zeitpunkt der Untersuchungen nicht zur Verfügung stehenden kommerziellen
Antikörpers nicht möglich. Die Untersuchung der Expression des Aktinproteins
diente der Ladekontrolle.
Die Zelllinie SUIT-2 S2-007 (mittelmäßig differenziert, stark metastasierend)
zeigte anhand der Western Blot Analyse keine wesentliche Veränderung der
Claudin-1 und Occludin Expression in den 24-stündig mit dem MEK-1 Inhibitor
PD98059 behandelten Zellen im Vergleich zu den unbehandelten oder den mit
DMSO behandelten Kontrollzellen. ZO-1 zeigte nach PD98059 Behandlung
keine Veränderung zu den DMSO behandelten Zellen, und eine geringe
86
3. ERGEBNISSE
Reduktion der Expression im Vergleich zu den nativen Zellen. In den SUIT-2
S2-007 Zellen führte bereits die 24-stündige DMSO Behandlung alleine zu einer
starken Reduktion der Claudin-2 Proteinexpression, die nach PD98059
Behandlung nur wenig geringer ausfiel, sodass Claudin-2 nur noch schwach
nachweisbar war. Ebenso war die Expression von ZO-2 in den mit DMSO und
mit PD98059 behandelten Zellen im Vergleich zu den unbehandelten Zellen
gleichstark reduziert. Während Claudin-4 in den unbehandelten und den mit
PD98059 behandelten Zellen keinen Expressionsunterschied aufwies, war die
Claudin-4 Proteinexpression in den mit DMSO behandelten Zellen verringert.
Die Ergebnisse der Western Blot Analyse für die Zelllinie SUIT-2 S2-007 sind in
Abbildung 22 dargestellt.
In
der
Zelllinie
SUIT-2
S2-020
(wenig
differenziert
und
mittelmäßig
metastasierend) wurde für die Proteine Claudin-1 und Occludin keine
wesentliche Veränderung der Proteinexpression nach Behandlung der Zellen
mit dem MEK-1 Inhibitor PD98059 im Vergleich zu den nativen oder in DMSO
kultivierten Kontrollzellen beobachtet. Die 24-stündige PD98059 Behandlung
führte dagegen im Vergleich zu den DMSO Kontrollzellen zu einer deutlichen
Reduktion der Claudin-2 und ZO-2 Proteinexpression, wobei die DMSO
behandelten Zellen die gleiche Expressionsstärke aufwiesen wie die nativen
Kontrollzellen. Claudin-4 und ZO-1 waren in den 24-stündig mit DMSO oder
PD98059 behandelten SUIT-2 S2-020 Zellen gleichstark exprimiert und leicht
reduziert im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollzellen, wobei auch Aktin
ein ähnliches Expressionsmuster aufwies. Die Ergebnisse der Western Blot
Analyse für die Zelllinie SUIT-2 S2-020 sind in Abbildung 22 dargestellt.
In
der
Zelllinie
SUIT-2
S2-013
(gut
differenziert
und
mittelmäßig
metastasierend) war für die Proteine Occludin und Aktin keine wesentliche
Veränderung der Proteinexpression nach Behandlung der Zellen mit dem MEK1 Inhibitor PD98059 im Vergleich zu den nativen oder in DMSO kultivierten
Kontrollzellen nachweisbar. Claudin-1 und Claudin-4 waren in den mit dem
MEK-1 Inhibitor behandelten SUIT-2 S2-013 Zellen stärker exprimiert als in den
in DMSO kultivierten Kontrollzellen, aber gleichstark wie in den unbehandelten
87
3.ERGEBNISSE
SUIT-2 S2-013 Zellen. Das Proteinextrakt aus der Zelllinie zeigte bereits
unbehandelt eine schwache Claudin-2 Expression, die nach 24-stündiger Kultur
in PD98059 und in den DMSO kultivierten Kontrollzellen kaum mehr
nachweisbar war. Ein vergleichbares Expressionsprofil wies ZO-2 auf. ZO-1
zeigte nach PD98059 Behandlung keine wesentliche Veränderung zu den
DMSO behandelten Zellen, und eine geringe Reduktion der Expression im
Vergleich zu den nativen Zellen. Die Ergebnisse der Western Blot Analyse für
die Zelllinie SUIT-2 S2-013 sind in Abbildung 22 dargestellt.
In der Zelllinie SUIT-2 S2-028 (gut differenziert, wenig metastasierend) war für
die stark exprimierten Proteine Claudin-1, Occludin und Claudin-4, sowie für
das schwächer exprimierte ZO-1 und für das noch schwächer exprimierte ZO-2
keine wesentliche Veränderung der Expression nach Behandlung der Zellen mit
dem MEK-1 Inhibitor PD98059 im Vergleich zu den nativen und in DMSO
kultivierten Kontrollzellen nachweisbar. Die 24-stündige PD98059 Behandlung
führte dagegen in den SUIT-2 S2-028 Zellen zu einer deutlichen Reduktion der
starken Claudin-2 Expression im Vergleich zu den DMSO behandelten und den
unbehandelten Zellen. Die Ergebnisse der Western Blot Analyse für die Zelllinie
SUIT-2 S2-028 sind in Abbildung 22 dargestellt.
Zusammenfassend zeigte die Western Blot Analyse, dass der MEK-1 Inhibitor
auf die Expression der verschiedenen untersuchten Tight Junction Proteine und
Tight Junction assoziierten Proteine eine heterogene Wirkung hinsichtlich ihrer
Proteinexpression hatte. Zudem zeigte sich für ein bestimmtes Tight Junction
oder –assoziiertes Protein ein unterschiedliches Expressionsverhalten in den 4
SUIT-2 Subzelllinien nach Behandlung mit dem MEK1-Inhibitor PD98059. Die
Ergebnisse
zeigen
weiterhin,
dass
DMSO
Behandlung
in
einer
Endkonzentration, die der der PD98059 behandelten Zellen entsprach, im
Vergleich zu den nativen Zellen subzelllinienspezifisch zu Veränderungen
hinsichtlich der Expression von Claudin-1, Claudin-2, Claudin-4, ZO-1 und ZO-2
führte und daher native als auch DMSO Kontrollen zur Interpretation der
Wirkung von PD98059 berücksichtigt werden müssen.
88
3. ERGEBNISSE
Abbildung 22. Wirkung der MEK-1 Inhibition auf die Expression von Tight Junction und
Tight Junction-assoziierten Proteinen in den Subzelllinien des humanen SUIT-2
Pankreaskarzinom Metastasierungsmodells.
Repräsentative Western Blot Analyse mit Proteinextraken aus den 24 h in Nährmedium (N), mit
DMSO (0,1%, v/v; DMSO) oder 50 µM PD98059 (0,1% DMSO v/v; PD) behandelten 4 SUIT-2
Subzelllinien SUIT-2 S2-007 (mittelmäßig differenziert, stark metastasierend), SUIT-2 S2-020
(wenig differenziert und mittelmäßig metastasierend), SUIT-2 S2-013 (gut differenziert und
mittelmäßig metastasierend), SUIT-2 S2-028 (gut differenziert, wenig metastasierend). Die
Proteinextrakte wurden elektrophoretisch im SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt, auf eine
Nylonmembran geblottet und die Tight Junction-Proteine Claudin-1, -2, -4 und Occludin sowie die
Tight Junction-assoziierten Proteine ZO-1 und ZO-2 mithilfe spezifischer primärer Antikörper
anhand der ECL-Methode visualisiert. Aktin diente der Ladungskontrolle (repräsentativer Blot).
kD, Kilodalton.
89
3.ERGEBNISSE
3.6.3.
Subzelluläre Lokalisation und Redistribution von Tight
Junction, Tight Junction-assoziierten und Adherens Junction
Proteinen
nach
Inhibition
des
Raf-MEK-ERK-
Signaltransduktionsweges in SUIT-2 Subzelllinien
In den folgenden Untersuchungen sollte zum Einen die Expression und
subzelluläre Lokalisation von Tight Junction und Tight Junction-assoziierten
sowie
Adherens
Junction
Proteine
in
den
SUIT-2
Pankreaskarzinom
Subzelllinien mittels Immunfluoreszenzmikroskopie untersucht werden. Zum
Anderen
sollte
die
Wirkung
der
Inhibition
des
Raf-MEK-ERK-
Signaltransduktionsweges mithilfe des selektiven MEK-1 Inhibitor PD98059, der
zu einer Blockade der mitogen-aktivierten Proteinkinase (MAPK) Kaskade führt,
auf die subzelluläre Lokalisation analysiert werden. Immunzytochemische
Untersuchungen hatten zuvor gezeigt, dass Claudin-2 durch Inhibition der
MAPK Kaskade durch den MEK-1 Inhibitor PD98059 in SUIT-2 S2-028
Pankreaskarzinomzellen in Tight Junctions rekrutiert werden kann (Hoormann,
2007).
Für die Untersuchungen wurden die vier SUIT-2 Subzelllinien SUIT-2 S2-007,
SUIT-2 S2-020, SUIT-2 S2-013 und SUIT-2 S2-028 auf 8 KammerObjektträgern ausgesät und für 24 - 72 Stunden kultiviert. Die weitere Kultur
wurde entweder nur in Nährmedium, mit DMSO (0,1%,v/v) oder in DMSO
gelöstem MEK1-Inhibitor PD98059 (Endkonzentration 50 µM im Nährmedium)
für
24
Stunden
fortgesetzt.
Anschließend
erfolgte
die
immunfluoreszenzmikroskopische Untersuchung der Expression der Tight
Junction Proteine Claudin-1, Claudin-2 und Occludin und der Tight Junctionassoziierten Proteine ZO-1 und ZO-2 sowie des Adherens Junction-Proteins ECadherin. Dazu wurden die Zellen auf den Objektträgern fixiert und es folgte die
Immunfluoreszenzfärbung mithilfe eines spezifischen Primärantikörpers und
eines
fluoreszierenden
Sekundärantikörpers.
Das
Sichtbarmachen
der
Zellkerne im Fluoreszenzmikroskop erfolgte mit dem DNA-spezifischen
Fluoreszenzfarbstoff DAPI (4´6´-Diamidino-2-Phenylindol) (siehe Material und
Methoden 2.6.8.). Die Ergebnisse sind in Abbildungen 23 bis 26 dargestellt.
90
3. ERGEBNISSE
In den SUIT-2 S2-007 Zellen (mittelmäßig differenziert, stark metastasierend)
waren Claudin-1 und Claudin-2 immunfluoreszenzmikroskopisch in den
unbehandelten Kontrollzellen nur schwach diffus zytoplasmatisch lokalisiert,
nach 24-stündiger DMSO (0,1%, v/v) Behandlung zytoplasmatisch etwas
stärker
und
Zellkontakten
auch
vereinzelt
exprimiert
fragmentär
nachweisbar.
membrangebunden
Nach
24-stündiger
an
ZellMEK-1
Inhibitorbehandlung (50 µM PD98059) wurde eine deutliche Rekrutierung von
Claudin-1 und Claudin-2 in Tight Junctions verzeichnet, wobei eine Netzstruktur
zur Darstellung kam. Occludin wurde in den nativen Zellen schwach
zytoplasmatisch exprimiert und nach MEK-1 Inhibitorbehandlung (50 µM
PD98059) vermehrt aber schwach membranassoziiert beobachtet. Das Tight
Junction assoziierte Protein ZO-1, das in den unbehandelten Zellen vorwiegend
schwach diffus im Zytoplasma nachweisbar war, wurde durch 24-stündige
DMSO Behandlung bereits etwas vermehrt membrangebunden und nach 24stündiger MEK-1 Inhibitorbehandlung (50 µM PD98059) deutlich wabenartig
membranassoziiert exprimiert. Dagegen zeigte das Tight Junction assoziierte
Protein ZO-2, das in den unbehandelten und mit DMSO behandelten Zellen nur
schwach zytoplasmatisch exprimiert wurde nach MEK-1 Inhibitorbehandlung
(50 µM PD98059) nur eine Zunahme der diffusen zytoplasmatischen
Expression. Das Adherens Junction Protein E-Cadherin war in den nativen
unbehandelten
Zellen
schwach
zytoplasmatisch
und
in
Vesikeln
mit
Aussparung des Zellkerns nachweisbar, nach MEK-1 Inhibitor Behandlung (50
µM PD98059) fragmentär membranassoziiert, möglicherweise im Bereich von
Zell-Zellkontakten lokalisiert.
Zusammenfassend zeigten die SUIT-2 S2-007 Zellen nach 24–stündiger MEK-1
Inhibitorbehandlung mit 50 µM PD98059 eine Veränderung der subzellulären
Lokalisation der untersuchten Tight Junction Proteine Claudin-1, Claudin-2,
Occludin, sowie dem Tight Junction -assoziierten Protein ZO-1 und in geringem
Ausmaß des Adherens Junction Protein E-Cadherin im Vergleich zu den
nativen Tumorzellen und auch teilweise zu den DMSO-behandelten Zellen. Die
Wirkung von PD98059 auf die subzelluläre Lokalisation bestand in der
Rekrutierung zytoplasmatisch lokalisierter Tight Junction Proteine oder
91
3.ERGEBNISSE
-assoziierter Proteine in die Zell-Zellkontakte. Interessanterweise führte auch
die DMSO Behandlung bereits zur diskreten Redistribution der subzellulären
Lokalisation der untersuchten Proteine Claudin-1, Claudin-2 und ZO-1. Die
Ergebnisse sind in Abbildung 23 dargestellt.
92
3. ERGEBNISSE
93
3.ERGEBNISSE
Abbildung 23. MEK-1 abhängige Redistribution subzellulärer Lokalisation von Tight
Junction und –assoziierten sowie Adherens Junction Proteinen in SUIT-2 S2-007
Pankreaskarzinomzellen.
Immunfluoreszenzmikroskopischer Nachweis der Expression der Tight Junction Proteine Claudin1, -2 und Occludin, der Tight Junction-assoziierten Proteine ZO-1 und ZO-2, und des Adherens
Junction Proteins E-Cadherin in SUIT-2 S2-007 Zellen (mittelmäßig differenziert, stark
metastasierend). (A+B) Dargestellt sind in der linken Spalte die für 24h im Nährmedium
inkubierten, unbehandelten Kontrollzellen, in der Mitte die Kontrollzellen nach 24h Kultur in
DMSO (0,1%, v/v), und in der rechten Spalte die 24h mit 50 µM PD98059 (in 0,1%, v/v DMSO)
behandelten Zellen. (C) Die linke Spalte zeigt unbehandelte Kontrollzellen, die rechte Spalte die
mit 50 µM PD98059 (in 0,1%, v/v DMSO) behandelten Zellen. DAPI, Zellkern-Färbung;
Vergrößerung: Okular 10x; Objektiv 63x.
94
3. ERGEBNISSE
In
den
SUIT-2
S2-020
Zellen
(wenig
differenziert
und
mittelmäßig
metastasierend) führte die MEK-1 Inhibitorbehandlung (50 µM PD98059) von
einem eher fibroblastoiden zu einem eher epitheloiden Zellbild. In den
unbehandelten SUIT-2 S2-020 Zellen wurde das Tight Junction Protein Claudin1 diffus zytoplasmatisch und vereinzelt unregelmäßig membranassoziiert
exprimiert, letzteres war etwas vermehrt nach 24 Stunden DMSO Behandlung
(0,1% v/v). MEK-1 Inhibitorbehandlung (50 µM PD98059) führte zur Zunahme
der
Claudin-1
zytoplasmatischen
Membranassoziation
Expression.
bei
Claudin-2
gleichzeitiger
wurde
in
den
Abnahme
der
meisten
der
unbehandelten Zellen sowohl im Zytoplasma als auch membranassoziiert in
den Tight Junctions exprimiert, während die Membranassoziation nach 24stündiger alleiniger DMSO Behandlung geringer war. Nach 24-stündiger 50 µM
PD98059 Behandlung war die zytoplasmatische Claudin-2 Expression reduziert
und Claudin-2 in den Zellzellkontakten vermehrt nachweisbar. Während
Occludin in den unbehandelten Zellen immunfluoreszenzmikroskopisch kaum
zytoplasmatisch nachweisbar war, führte die DMSO (0,1%, v/v) Behandlung zu
einer Zunahme der diffusen zytoplasmatischen Occludinexpression, während
die Behandlung der Zellen mit PD98059 zu einer Verlagerung der Expression in
Tight Junctions führte. Während das Tight Junction-assoziierte Protein ZO-1 in
unbehandelten Zellen vorwiegend schwach diffus im Zytoplasma lokalisiert war,
wurde durch DMSO Behandlung ZO-1 bereits vermehrt und nach PD98059
Behandlung deutlicher membranassoziiert exprimiert. Dagegen zeigte das Tight
Junction-assoziierte Protein ZO-2, das in den unbehandelten und DMSO
behandelten Zellen nur schwach zytoplasmatisch exprimiert wurde nach
PD98059 Behandlung nur eine Zunahme der diffusen zytoplasmatischen
Expression, während DMSO zusätzlich interessanterweise zur fragmentaren
Membranassoziation führte. Das Adherens Junction Protein E-Cadherin war in
den unbehandelten und 24-stündig mit 50 µM PD98059 behandelten Zellen
weitgehend unverändert schwach zytoplasmatisch lokalisiert, wobei die
PD98059 Behandlung zu einer geringen Rekrutierung in die Zell-Zellkontakte
führte.
95
3.ERGEBNISSE
96
3. ERGEBNISSE
97
3.ERGEBNISSE
Abbildung 24. MEK-1 abhängige Redistribution subzellulärer Lokalisation von Tight
Junction und –assoziierten sowie Adherens Junction Proteinen in SUIT-2 S2-020
Pankreaskarzinomzellen.
Immunfluoreszenzmikroskopischer Nachweis der Expression der (A) Tight Junction Proteine
Claudin-1, -2 und Occludin, sowie (B) der Tight Junction-assoziierten Proteine ZO-1 und ZO-2,
und des Adherens Junction Proteins E-Cadherin in SUIT-2 S2-020 Zellen (wenig differenziert,
mittelmäßig metastasierend). Dargestellt sind in der linken Spalte die für 24h im Nährmedium
inkubierten, unbehandelten Kontrollzellen, in der Mitte die Kontrollzellen nach 24h Kultur in
DMSO (0,1%, v/v), und in der rechten Spalte die 24h mit 50 µM PD98059 (in 0,1%, v/v DMSO)
behandelten Zellen. DAPI, Zellkern-Färbung. Vergrößerung: Okular 10x; Objektiv 63x.
Zusammenfassend zeigten die SUIT-2 S2-020 Zellen nach 24–stündiger MEK-1
Inhibitorbehandlung mit 50 µM PD98059 eine Veränderung der subzellulären
Lokalisation der untersuchten Tight Junction Proteine Claudin-1, Claudin-2,
Occludin, sowie des Tight Junction-assoziierten Proteins ZO-1 und sehr
vereinzelt des Adherens Junction Protein E-Cadherin im Vergleich zu den
nativen Tumorzellen und teilweise den DMSO behandelten Zellen. Die Wirkung
von PD98059 auf die subzelluläre Lokalisation bestand in der Rekrutierung
zytoplasmatisch lokalisierter Tight Junction Proteine oder -assoziierter Proteine
in die Zell-Zellkontakte. Interessanterweise führte auch die DMSO Behandlung
bereits zu diskreteren Veränderungen der subzellulären Lokalisation der
untersuchten Proteine Claudin-1, Claudin-2 und ZO-1, sowie zur deutlichen
Rekrutierung von ZO-2 in die Membran. Die Ergebnisse sind in Abbildung 24
dargestellt.
98
3. ERGEBNISSE
Bei
den
SUIT-2
S2-013
Zellen
(gut
differenziert
und
mittelmäßig
metastasierend) führte die 24-stündige MEK-1 Inhibitorbehandlung (50 µM
PD98059) zu einer Veränderung des Wachstumsverhaltens im Vergleich zu
den unbehandelten Zellen mit einem geordneteren Zellbild und deutlich
stärkerer Ausbildung von Zell-Zelladhärenzen. In den unbehandelten und mit
DMSO (0,1%, v/v) behandelten SUIT-2 S2-013 Zellen waren die Tight Junction
Proteine Claudin-1 und Claudin-2 diffus zytoplasmatisch und vesikulär
lokalisiert und nur gelegentlich in Tight Junctions nachweisbar. Nach 24stündiger Behandlung mit dem MEK-1 Inhibitor PD98059 wurde Claudin-1
deutlich Tight Junction assoziiert nachweisbar. Auch Claudin-2 zeigte
Rekrutierung in Tight Junctions, jedoch lediglich in einigen Zellgruppen. Das
Tight Junction-Protein Occludin war in den unbehandelten und in 24-stündig mit
DMSO (0,1%, v/v) behandelten Kontrollzellen weitgehend zytoplasmatisch
lokalisiert, während die MEK-1 Inhibition durch 24-stündige 50 µM PD98059
Behandlung zu einer deutlichen Rekrutierung in Tight Junctions und zur
Ausbildung einer Netzstruktur führte. Die Tight-Junction-assoziierten Proteine
ZO-1 und ZO-2 wurden zwar bei überwiegend schwacher zytoplasmatischer
Expression in den nativen Zellen und mit DMSO (0,1%, v/v) behandelten Zellen
vereinzelt in Adhärenzverbindungen nachgewiesen, zeigten jedoch erst nach
24-stündiger
50
µM
PD98059
Behandlung
eine
deutlich
wabenartige
Netzstruktur. Das Adherens Junction Protein E-Cadherin befand sich in den
nativen Zellen in Vesikeln im Zytoplasma. Nach 24 Stunden DMSO (0,1%, v/v)
Behandlung war die E-Cadherin Expression im Zytoplasma deutlich reduziert
und vereinzelt im Bereich der Zellmembran nachweisbar. Nach 24-stündiger
Behandlung mit 50 µM PD98059 kam es zu einer, jedoch nicht alle Zellen
betreffenden
deutlichen
Verlagerung
in
die
Adhärenzverbindungen
mit
Netzstruktur.
99
3.ERGEBNISSE
100
3. ERGEBNISSE
101
3.ERGEBNISSE
Abbildung 25. MEK-1 abhängige Redistribution subzellulärer Lokalisation von Tight
Junction und –assoziierten sowie Adherens Junction Proteinen in SUIT-2 S2-013
Pankreaskarzinomzellen.
Immunfluoreszenzmikroskopischer Nachweis der Expression der (A) Tight Junction Proteine
Claudin-1, -2 und Occludin, sowie der (B) Tight Junction-assoziierten Proteine ZO-1 und ZO-2,
und des Adherens Junction Proteins E-Cadherin in SUIT-2 S2-013 Zellen (gut differenziert,
mittelmäßig metastasierend). Dargestellt sind in der linken Spalte die für 24h im Nährmedium
inkubierten, unbehandelten Kontrollzellen, in der Mitte die Kontrollzellen nach 24h Kultur in
DMSO (0,1%, v/v), und in der rechten Spalte die 24 h mit 50 µM PD98059 (in 0,1%, v/v DMSO)
behandelten Zellen. DAPI, Zellkern-Färbung; Vergrößerung: Okular 10x; Objektiv 63x.
Zusammenfassend zeigten die SUIT-2 S2-013 Zellen nach 24–stündiger MEK-1
Inhibitorbehandlung mit 50 µM PD98059 eine Rekrutierung der untersuchten
Tight Junction Proteine Claudin-1, Claudin-2, Occludin, sowie der Tight
Junction-assoziierten Proteine ZO-1 und ZO-2 vom Zytoplasma in die Tight
Junctions. Auch wurde das Adherens Junction Protein E-Cadherin im Vergleich
zu
den
nativen
Interessanterweise
Tumorzellen
führte
auch
in
die
die
Adhärensverbindungen
DMSO
Behandlung
zu
rekrutiert.
diskreten
Veränderungen der subzellulären Lokalisation der untersuchten Proteine
Claudin-1, Claudin-2, ZO-1, ZO-2 und E-Cadherin. Die Ergebnisse sind in
Abbildung 25 dargestellt.
Bei den SUIT-2 S2-028 Zellen (gut differenziert, wenig metastasierend) konnte
nach der MEK-1 Inhibitorbehandlung (50 µM PD98059) eine Veränderungen
der Zellmorphologie und des Wachstumverhaltens beobachtet werden. Die
Zellen wuchsen adhärenter und flächiger als die nativen oder die 24-stündig mit
DMSO (0,1%, v/v) behandelten Kontrollzellen. In den unbehandelten SUIT-2
S2-028 Zellen wurde das Tight Junction Protein Claudin-1 in wenigen Zellen
schwach zytoplasmatisch exprimiert. Nach 24 Stunden DMSO Behandlung
(0,1%, v/v) wurde Claudin-1 schwach diffus in Vesikeln im Zytoplasma
102
3. ERGEBNISSE
exprimiert,
jedoch
kaum
in
Tight
Junctions.
Die
24-stündige
MEK-1
Inhibitorbehandlung (50 µM PD98059) führte zur deutlichen Zunahme der
membrangebundenen
Claudin-1
Expression.
Claudin-2
wurde
in
den
unbehandelten Zellen nur schwach vereinzelt vesikulär im Zytoplasma
exprimiert. Nach DMSO (0,1%, v/v) Behandlung nahm die zytoplasmatische
Claudin-2 Expression nur gering zu, während nach 24-stündiger Behandlung
mit dem MEK-1 Inhibitor PD98059 (50 µM) eine deutliche membranständig
netzförmige Expression von Claudin-2 sichtbar wurde. Das Tight Junction
Protein Occludin konnte in den unbehandelten Zellen nur sehr schwach und in
den mit DMSO (0,1%, v/v) behandelten Zellen nur vereinzelt diffus im
Zytoplasma exprimiert nachgewiesen werden. Nach 24-stündiger MEK-1
Inhibitorbehandlung (50 µM PD98059) kam es zu einer membranständigen
Verlagerung
von
Occludin,
wobei
einzelne
Zellen
mit
einer
diffusen
zytoplasmatischen Occludinexpression weiterhin sichtbar waren. Die Tight
Junction assoziierten Proteine ZO-1 und ZO-2 wurden in den unbehandelten
Zellen und in den mit DMSO (0,1%, v/v) behandelten Zellen (dargestellt nur ZO2)
vereinzelt
zytoplasmatisch
(ZO-2)
oder
vereinzelt
inhomogen
membrangebunden (ZO-1) nachgewiesen. Nach 24-stündiger Behandlung mit
dem MEK-1 Inhibitor (50 µM PD98059) waren ZO-1 und ZO-2 an die
Zellmembran
rekrutiert
und
netzförmig
membrangebunden
exprimiert
nachweisbar. Das Adherens Junction Protein E-Cadherin wurde in den
unbehandelten Zellen nur schwach diffus zytoplasmatisch exprimiert. Während
sich nach 24-stündiger DMSO (0,1%, v/v) Behandlung kaum eine Veränderung
zeigte, wurde nach 24-stündiger MEK-1 Inhibitorbehandlung (50 µM PD98059)
in einzelnen Zellansammlungen zusätzlich zu der diffusen zytoplasmatischen
Expression
eine
zarte
membrangebundene
E-Cadherin
Expression
nachgewiesen.
103
3.ERGEBNISSE
104
3. ERGEBNISSE
105
3.ERGEBNISSE
Abbildung 26. MEK-1 abhängige Redistribution subzellulärer Lokalisation von Tight
Junction und –assoziierten sowie Adherens Junction Proteinen in SUIT-2 S2-028
Pankreaskarzinomzellen.
(A) Immunfluoreszenz-mikroskopischer Nachweis der Expression der Tight Junction Proteine
Claudin-1, Claudin-2 und Occludin und (B) der Tight Junction-assoziierten Proteine ZO-1 und ZO2, und des Adherens Junction Proteins E-Cadherin in SUIT-2 S2-028 Zellen (gut differenziert,
wenig metastasierend). Dargestellt sind in der linken Spalte die unbehandelten 24h im
Nährmedium inkubierten Kontrollzellen, in der Mitte die Kontrollzellen nach 24h Kultur in DMSO
(0,1%, v/v), und in der rechten Spalte die 24 h mit 50 µM PD98059 (in 0,1%, v/v DMSO)
behandelten Zellen. DAPI, Zellkern-Färbung; Vergrößerung: Okular 10x; Objektiv 63x.
Zusammenfassend zeigten die SUIT-2 S2-028 Zellen nach 24–stündiger MEK-1
Inhibitorbehandlung mit 50 µM PD98059 eine Rekrutierung der untersuchten
Tight Junction Proteine Claudin-1, Claudin-2, Occludin, sowie der Tight
Junction-assoziierten Proteine ZO-1 und ZO-2 vom Zytoplasma in die Tight
Junctions. Auch das Adherens Junction Protein E-Cadherin wurde im Vergleich
zu
den
nativen
Tumorzellen
in
einzelnen
Zellansammlungen
in
die
Adhärensverbindungen rekrutiert. Interessanterweise führte auch die DMSO
(0,1%, v/v) Behandlung im Vergleich zu den nativen Zellen zu diskreten
Veränderungen
der
Expression
oder
subzellulären
Lokalisation
der
untersuchten Proteine Claudin-1, Claudin-2 und ZO-1. Die Ergebnisse sind in
Abbildung 26 dargestellt.
Die Ergebnisse der immunzytochemischen Untersuchungen weisen darauf hin,
dass die Inaktivierung der MAP/ERK-Kaskade in den K-ras mutierten
Pankreaskarzinom SUIT-2 Subzelllinien durch den MEK-1 Inhibitor PD98059 zu
Veränderungen der Expression und subzellulären Lokalisation der Tight
Junction Proteine Claudin-1, Claudin-2 und Occludin, der Tight Junctionassoziierten Proteine ZO-1 und ZO-2, sowie dem Adherens-Junction Protein ECadherin subzelllinienspezifisch führt. Insgesamt war in Abhängigkeit der
Subzelllinie durch die MEK-1 Inhibition häufig eine Rekrutierung der Proteine
106
3. ERGEBNISSE
vom Zytoplasma zur Zellmembran zu beobachten. Eine Korrelation zum
Metastasierungs- oder Differenzierungsgrad der einzelnen SUIT-2 Subzelllinien
ließ sich nicht sicher nachweisen. Weiterhin zeigten die Untersuchungen, dass
DMSO, in dem PD98059 in der Regel gelöst wird, auch subzelllinienspezifisch
diskrete Effekte auf die Expression oder subzelluläre Lokalisation der
untersuchten Proteine aufweisen kann und dessen Wirkung bei der
Interpretation der PD98059 Wirkung berücksichtigt werden muss.
107
108
4. DISKUSSION
4.
Diskussion
4.1.
Heterogenes Expressionsprofil von Claudinen in
duktalen und neuroendokrinen Pankreaskarzinomzelllinien und mögliche Relevanz bei Invasion und
Metastasierung
Die Zerstörung von Zell-Zell-Verbindungen mit nachfolgenden Veränderungen
der Expression von Adhäsionsproteinen ist ein Kennzeichen der Tumorinvasion
und Metastasierung (Aijaz et al., 2006). Da angenommen wird, dass dies eine
Rolle in der Pathogenese des Pankreaskarzinoms spielt, wurde in der
vorliegenden Arbeit die Expression und Regulation von verschiedenen Tight
Junction Komponenten in humanen Pankreaskarzinommodellen und –zelllinien
untersucht, insbesondere von Claudinen.
Die Ergebnisse zeigten eine heterogene Claudinexpression in den untersuchten
Pankreastumorzellmodellen
und
–zelllinien.
So
war
in
den
duktalen
Pankreaskarzinomzellen die Expression von Claudin-2, Claudin-4 und Claudin7,
nicht
jedoch
von
Claudin-5
nachweisbar.
Dagegen
zeigten
die
neuroendokrinen Pankreastumorzellen Claudin-4, Claudin-5 und Claudin-7
Expression, nicht jedoch von Claudin-2, sodass sich ein Hinweis auf eine
zellspezifische Expression der Claudine zeigte. Auch in der Maus wurde eine
heterogene Expression von Claudinen in Abhängigkeit der subzellulären
Lokalisation beobachtet (Rahner et al., 2001). So wurde im murinen Pankreas
Claudin-2 nur in den Tight Junctions der Gangepithelien, und Claudin-5 nur in
den Tight Junctions der Azinuszellen exprimiert, während Claudin-4 in beiden
lokalisiert wurde. Claudin-2 Proteinexpression wurde auch in der Ratte in
duktalen Epithelien des Pankreas gezeigt (Rahner et al., 2001). Darüber hinaus
wurde Claudin-10 Expression anhand immunfluoreszenz-mikroskopischer
Untersuchungen entlang der lateralen Membranen zusätzlich zu den Tight
Junctions in Azinuszellen nachgewiesen, nicht jedoch im Epithel der
Pankreasgangzellen (Inai et al., 2005).
109
4. DISKUSSION
In der vorliegenden Arbeit gab es Hinweise für eine metastasierungs-assoziierte
Expression von Claudin-4, Claudin-7 und Claudin-12 neben der bereits
bekannten differentiellen Claudin-2 Expression in dem Metastasierungsmodell
der Pankreaskarzinomzellen PaTu8988S und -T, die für Claudin-2 und Claudin4 auch auf Proteinebene bestätigt werden konnte. Im Gegensatz zu dem
vorliegenden
Expressionsprofil
wurde
Expression
Claudin-4
in
der
Pankreaskarzinomzelllinie PaTu8988T beschrieben (Michl et al., 2001). Das
unterschiedliche Expressionsverhalten könnte durch Veränderungen der
Zelllinie durch langjährige Kultur oder unterschiedliche Kulturbedingungen
bedingt sein. Die Claudin-7 und -12 Expression konnte nicht untersucht werden,
da zum Zeitpunkt der Untersuchungen noch kein kommerzieller Antikörper zur
Verfügung stand.
Claudin-1
wies
im
Metastasierungsmodell
der
Pankreaskarzinomzellen
PaTu8988S und -T interessanterweise im Vergleich zu Claudin-2, Claudin-7
und Claudin-12 eine inverse Expression auf und zeigte im Gegensatz zur
mRNA Ebene eine differentielle Expression mit schwacher Expression in den
metastasierenden
PaTu8988S
nichtmetastasierenden
Zellen
PaTu8988T
und
starker
Zellen.
Expression
Alle
vier
in
den
SUIT-2
Pankreaskarzinomzelllinien zeigten Claudin-1 Expression, wobei die nichtmetastasierende gut differenzierte SUIT-2 S2-028 Zellen eine besonders
deutliche Claudin-1 Expression aufwies. Eine überhöhte Claudin-1 Expression
wurde für primäre humane Kolonkarzinome und Metastasen sowie davon
abgeleitete Zelllinien berichtet (Dhawan et al., 2005). Dabei wiesen Claudin-1
überexprimierende Zellen eine Translokation der Claudin-1 Expression ins
Zytoplasma oder den Nukleus sowie eine APC Mutation auf, und es konnte
gezeigt werden, dass Claudin-1 in diesen Zellen Target des APC/ß-Catenin
Signaltransduktionsweges ist, der für Tumorgenese und invasive Eigenschaften
wichtig ist (Dhawan et al., 2005). Anhand von Mikroarray Profiling Studies
wurde kürzlich Claudin-1 als durch K-Ras Onkogenaktivierung heraufreguliertes
Targetgen in Pankreasgangzellen identifiziert (Qian et al., 2005). Inwieweit
dieser
Mechanismus
eine
Rolle
in
den
untersuchten
Pankreaskarzinomzellmodellen gespielt hat bleibt zu untersuchen. Allerdings
110
4. DISKUSSION
scheint
ein
anderer
Mechanismus
der
Claudin-1
Regulation
in
den
Pankreaskarzinomzellen als in den Kolonkarzinomzellen vorzuliegen.
Die in der vorliegenden Arbeit gezeigte differentielle Expression der Claudine-2
-4, -7 und -12 in den Pankreaskarzinomzelllinien PaTu8988S und PaTu8988T
könnte im Zusammenhang mit ihrem unterschiedlichen Metastasierungsverhalten stehen, da nur in der in die Lunge metastasierenden Pankreaskarzinomzelllinie
PaTu8988S
die
Expression
der
genannten
Claudine
nachweisbar war. Es wäre aber auch ein anderer Mechanismus denkbar. Die
Pankreaskarzinomzelllinien PaTu8988S und PaTu8988T (Elsässer et al., 1992)
wurden aus der Lebermetastase eines duktalen Pankreaskarzinoms etabliert.
Durch Injektion beider Pankreaskarzinomzelllinien in die Schwanzvene von
Nacktmäusen wurde ihr Metastasierungsverhalten vergleichend untersucht.
Hierbei konnte nur durch Zellen der Zelllinie PaTu8988S die Bildung von
Lungenmetastasen in der Lungenperipherie induziert werden, durch Zellen der
Zelllinie PaTu8988T gelang die Induktion von Lungenmetastasen dagegen nicht
(Elsässer et al., 1992). Die Autoren schlossen daraus auf eine mögliche
Interaktion zwischen den Pankreaskarzinomzellen PaTu8988S und dem
Alveolarepithel, was diese Metastasierungsbereitschaft bedingen könnte. Die
Methodik
zur
Beurteilung
der
Metastasierungsbereitschaft
der
Pankreaskarzinomzelllinien PaTu8988S und PaTu8988T im Zellkulturmodell
von Elsässer et al. lässt allerdings also auch die Hypothese zu, dass die
aufgrund
der
Claudin-Expression
zur
Adhärenz
neigenden
Pankreaskarzinomzellen PaTu8988S die Gefäße der Lungenperipherie in Form
von kleinen Zellhaufen verstopfen und damit bessere Bedingungen zur
Metastasenbildung haben, was bei den weniger adhärenten Zellen der
Pankreaskarzinomzelllinie PaTu8988T nicht der Fall sein würde.
In der vorliegenden Arbeit zeigte die Expression der untersuchten Claudine im
Pankreaskarzinommodell der SUIT-2 Zellen (Iwamura et al., 1987) keine
sichere Assoziation mit dem Metastasierungsverhalten mit Ausnahme von
Claudin-2, dessen Expression in Voruntersuchungen mit zunehmendem
Metastasierungsgrad der vier SUIT-2 Subzelllinien zunahm (Hoormann, 2007),
111
4. DISKUSSION
jedoch nicht konkruent zur in dieser Arbeit untersuchten Proteinexpression.
Untersuchungen im Hinblick auf einen möglichen Zusammenhang zwischen der
Expression von Claudinen und der Metastasierungsbereitschaft in den Zelllinien
oder primären Pankreaskarzinomen sind nicht bekannt. Um mehr über die
Bedeutung der metastasierungs-assoziierten Expression zu erfahren, müsste
unter Anderem die Lokalisation des Proteins in Pankreaskarzinomzellen
unterschiedlichen
Claudinprotein
Metastasierungsgrades
wie
auch
unter
untersucht
physiologischen
werden.
Liegt
Bedingungen
in
ein
der
Zellmembran, könnte ein Einfluss auf die Kommunikation zwischen den
exprimierenden Zellen und der extrazellulären Matrix oder den Zielgeweben des
Metastasierungsvorganges bestehen. Da die Kenntnisse der subzellulären
Lokalisation derzeit nur fragmentär sind, sind weiterführende Untersuchungen
zur Expression und subzellulären Lokalisation in Primärtumoren des Pankreas
mit unterschiedlichem Metastasierungsverhalten notwendig.
In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression von Claudin-4 in über 90 % der
untersuchten
Pankreaskarzinomzelllinien
nachgewiesen.
Dies
ist
in
Übereinstimmung mit Untersuchungen, die zeigten, dass Claudin-4 schwach im
normalen Pankreas und bei chronischer Pankreatitis exprimiert wird, aber
häufig
in
Pankreaskarzinomen
Kolonkarzinomen
und
anderen
sowie
Tumoren
Pankreaskarzinomzelllinien,
wie
Mammakarzinom
und
Magenkarzinom (Michl et al., 2001). Unsere Ergebnisse divergieren mit den
Ergebnissen von Michl et al. hinsichtlich der Claudin-4 Expression in den
Pankreaskarzinomzelllinien Panc-1 und MiaPaCa, wobei die vorliegende Arbeit
eine deutlich höhere Claudin-4 Expression zeigte. Zudem wurde in der
vorliegenden Arbeit in der Zelllinie PaTu8988T weder nach semiquantitativer
RT-PCR noch nach Wester Blot Analyse Claudin-4 Expression nachgewiesen.
Dies könnte durch methodischen Unterschied oder wahrscheinlicher durch
Veränderungen der PaTu8988T Zelllinie in Kultur bedingt sein. In der
vorliegenden Arbeit fand sich im Pankreaskarzinom-Zellkulturmodell der SUIT-2
Subzelllinien
kein
sicherer
Hinweis
auf
eine
metastasierungs-
oder
differenzierungs-assoziierte Expression von Claudin-4. Nach semiquantitativer
RT-PCR Amplifikation zeigte sich zwar mit abnehmendem Metastasierungsgrad
112
4. DISKUSSION
der Zelllinien SUIT-2 S2-007, SUIT-2 S2-020 und SUIT-2 S2-013 eine sinkende
Claudin-4
Expression,
jedoch
zeigte
die
gering
metastasierende
gut
differenzierte Zelllinie SUIT-2 S2-028 wieder eine Expressionszunahme. Die
Claudin-4 Expression nach RT-PCR Amplifikation korrelierte nicht mit der
Claudin-4
Proteinexpression
nach
Western
Blot
Analyse
mit
relativ
gleichmäßiger Claudin-4 Expression in allen vier untersuchten SUIT-2 Zelllinien.
Michl et al. (2003) zeigte mittels Northern Blot und Western Blot Analysen in der
Zelllinie SUIT-2 S2-007 im Gegensatz zu der vorliegenden Arbeit nur eine
schwache Claudin-4 Expression. Eine Erklärung für die Diskrepanz könnte eine
Veränderung der Subzelllinie SUIT-2 S2-007 durch Kulturbedingungen sein.
Diskrepanzen
zwischen
den
Ergebnissen
der
mRNA
und
den
Proteinexpressionsdaten einzelner Claudine wurde auch von anderen Autoren
beschrieben. So zeigte sich eine nur sehr niedrige Menge an Claudin-10 mRNA
im Jejunum und Pankreas anhand von RT-PCR, während eine starke
Immunfluoreszenzfärbung für das Claudin-10 Protein in diesen Organen
nachweisbar war (Inai et al., 2005). Claudin-15 Protein konnte im Ösophagus
nicht nachgewiesen werden, obwohl die mRNA durch RT-PCR nachgewiesen
werden konnte (Inai et al., 2005). Es gibt verschiedene Möglichkeiten
vermeintliche Diskrepanzen zu erklären: Speziesunterschiede, technische
Probleme wie niedrige Extraktionseffizienz von Claudin-Transkripten oder
Kreuzreaktivität des Antikörpers hinsichtlich anderer Spezies, schneller
Transkript-Turnover, niedrige Translationrate der Claudin mRNAs in Proteine,
rascher Protein-Turnover oder niedrige Menge des Claudin Proteins im
Gewebe.
Untersuchungen mit durch stabile Transfektion Claudin-4 überexprimierenden
SUIT-2 S2-007 Zellen in vitro und in vivo zeigten einen reduzierten invasiven
Phänotypen (Michl et al., 2003). Es wurde vermutet, dass die Claudin-4
Expression mit einem gut-differenzierten Karzinom Phänotypen einhergeht, und
in weniger differenzierten Tumoren weniger stark exprimiert wird. Dies ist nicht
in
Übereinstimmung
mit
den
vorliegenden
Untersuchungen
im
Metastasierungsmodell der PaTu8988S/T Zellen, wobei die nicht in die Lunge
metastasierenden weniger differenzierten PaTu8988S Zellen Claudin-4 deutlich
113
4. DISKUSSION
exprimierten, während in den nicht in die Lunge metastasierenden höher
differenziertenPaTu8988T
Zellen
kein
Claudin-4
nachweisbar
war.
Überexprimiertes Claudin-4 wurde hauptsächlich in den Zell-Zell-Kontakten
lokalisiert
und immunhistochemische
Untersuchungen in Primärtumoren
belegten eine Tight Junction-assoziierte Lokalisation von Claudin-4 in der
Zellmembran (Michl et al., 2003). Interessanterweise führte die Inhibition des
RAS Signaltransduktionsweges zur Reduktion der Transkription und Translation
von Claudin-4, unabhängig davon, ob MEK oder PI3K Inhibitoren angewandt
wurden, was darauf schließen lässt, dass verschiedene Effektoren unterhalb
von RAS die Claudin-4 Expression positiv regulieren. Dies ist überraschend,
denn die vorausgegangenen Untersuchungen hatten darauf hingewiesen, dass
eine hohe Claudin-4 Expression mit guter Differenzierung und einer Reduktion
der Invasivität der Tumorzellen einhergeht (Michl et al., 2003). In der
vorliegenden Arbeit führte in den Pankreaskarzinomzellen PaTu8988S die
MEK-1 Inhibition damit übereinstimmend zu einer wenn auch sehr leichten
Zunahme der Claudin-4 Expression, was allerdings in geringerem Ausmaß
auch nach alleiniger DMSO Behandlung zu beobachten war.
Ein interessanter neuer Aspekt wurde während der Anfertigung dieser Arbeit für
Claudin-4 gezeigt. Anhand des Gebrauchs von Genexpressions-Profilanalysen
wurde gezeigt, dass Claudin-4 in Pankreaskarzinomgewebe und -zelllinien
sowie
in
einigen
gastrointestinalen
Tumoren
überexprimiert
wird
und
intratumorale Injektionen von CPE in Panc-1 Xenografts zu großen Arealen von
Tumorzellnekrose und signifikanter Reduktion von Tumorwachstum führte
(Michl et al., 2001). Claudin-4 konnte als integraler Bestandteil von Tight
Junctions und als Rezeptor des zytotoxischen Clostridium Perfringens
Enterotoxins identifiziert werden und die Ergebnisse ließen damit ein
therapeutisches Target für Claudin-4 exprimierende Pankreaskarzinome und
andere solide Tumoren vermuten (Michl et al., 2003). Die Claudin-4 Expression
wurde auch in Prostata und Uteruskarzinomen (Long et al., 2001; Santin et al.,
2004) erhöht beschrieben. In den primären Ovarialtumoren und fast allen
Metastasen wurde Claudin-4 in der Zellmembran exprimiert, dagegen nur in 6%
der Normalgewebe. Claudin-4 könnte sich daher als Prognosemarker bei der
114
4. DISKUSSION
Diagnose und Therapie von Ovarialkarzinomen eignen. Im Rahmen von
Serienanalysen zur Genexpression (engl. Serial analysis of gene expression,
SAGE)
konnte
ebenfalls
eine
Überexpression
von
Claudin-4
in
Mammakarzinomzelllinien nachgewiesen werden (Kominski et al., 2004), wobei
immunhistochemische
Untersuchungen
Claudin-4
in
die
Zellmembran
lokalisierten. In vitro und in vivo Untersuchungen bestätigten auch in dieser
Tumorentität den Effekt von Clostridium perfringens Enterotoxin (Kominski et
al., 2004). Erst kürzlich wurde eine signifikante Claudin-4 Überexpression in
Gallenwegs- und Gallenblasenkarzinomen gegenüber normalem biliären Epithel
und normalen Hepatozyten und hepatozellulären Karzinomen berichtet, sodass
Claudin-4 als diagnostischer Marker dienen könnte (Lodi et al., 2006).
Was ist die Rolle von Claudin-4 in der Tumorentwicklung? Untersuchungen
weisen darauf hin, dass Claudin-4 Expression die Invasivität erhöht und mit
erhöhter Matrix Metalloproteinase-2 Aktivität assoziiert ist (Agarwal et al., 2005).
Neueste SAGEmap Mining Untersuchungen haben eine Erhöhung der Claudin4 Expression in Ovarial-, Magen- und Pankreastumoren bestätigt, sowie eine
Reduktion in Kolonkarzinomen nachgewiesen, wobei Claudin-4 im normalen
Gewebe stark exprimiert war (Rangel et al., 2006). Im Gegensatz zu diesen
Untersuchungen hatten vorausgegangene Untersuchungen erhöhte Claudin-4
Transkripte in Kolonkarzinomen im Vergleich zu normalem Gewebe nach
Northern Blot Analysen nachgewiesen (Rangel et al., 2003). Es ist
anzunehmen, dass diese Diskrepanz dadurch zustande kommt, dass die RNA
des normalen Gewebes noch andere Zellen des Kolons beinhaltete und daher
das Claudin-4 Transkript im Northern Blot erniedrigt ist, während die SAGE
Daten aus angereicherten epithelialen Zellpopulationen gewonnen wurden.
Daher sind die Expressionsuntersuchungen unter Berücksichtigung der
unterschiedlichen methodischen Ansätze vorsichtig zu interpretieren.
Zum Zeitpunkt der Untersuchungen war die Expression und Lokalisation von
Claudin-7 in Pankreaskarzinomzelllinien, primären Pankreaskarzinomen oder
normalem Pankreas nicht bekannt. In der vorliegenden Arbeit konnte Claudin-7
erstmals
in
83%
der
untersuchten
Pankreaskarzinomzelllinien
anhand
115
4. DISKUSSION
semiquantitativer
RT-PCR
nachgewiesen
werden,
wobei
jedoch
keine
Expression in Normalgewebe zum Vergleich vorlag. Später wurde über die
Herunterregulation der Claudin-7 Expression in Plattenepithelkarzinomzelllinien
aus Tumoren im Kopf-Hals-Bereich im Vergleich zu Zelllinien des normalen
Epithels (Al Moustafa et al., 2002) und in Mammakarzinomzelllinien zunächst
eine Claudin-7 Überexpression im Vergleich zum Normalgewebe berichtet
(Nacht et al.,1999). Aktuellere Untersuchungen haben jedoch anhand von RTPCR, Western Blot Analyse sowie immunfluoreszenzmikroskopischen und
immunhistochemischen
Untersuchungen
an
Karzinomzelllinien,
Primärtumorgewebe, Carcinoma in situ Gewebe sowie Normalgewebe gezeigt,
dass auch bei Mammatumoren mit steigendem Grad der Dysplasie eine
zunehmende Herunterregulation von Claudin-7 zu beobachten ist (Kominski et
al.,
2003).
Ein
Zusammenhang
Differenzierungsgrad
von
der
Claudin-7
Primärtumoren
des
Expression
und
Mammakarzinoms
dem
wurde
mittlerweile berichtet (Kominsky et al., 2003). Neuere Untersuchungen zeigten
eine reduzierte Claudin-7 Expression in Korrelation mit höhergradigen
Tumoren, dem Metastasierungsgrad sowie lokoregionaler Rezidive (Sauer et
al., 2005). Reduzierte Expression von Claudin-7 korrelierte auch mit Invasion
und Metastasierung in Platteneptithelkarzinom des Ösophagus, wobei eine
signifikante Reduktion in den Lymphknotenmetastasen nachzuweisen war
(Usami et al., 2006). Eine Herraufregulation von Claudin-7 wurde dagegen in
Riesenzelltumoren des Knochen beschrieben (Guenther et al., 2005) sowie in
Magenneoplasien, sowohl beim Menschen als auch der Maus (Johnson et al.,
2005).
In Untersuchungen an Prostatakarzinomzelllinien konnte interessanterweise
neben dem bisher bekannten Claudin-7 vorwiegend ein trunkiertes Protein von
nur 158 statt 211 Aminosäuren (engl. truncated Claudin-7, Abk. t-Claudin-7)
identifiziert werden (Zheng et al., 2003). Die Sequenz von t-Claudin-7 wurde
bisher nicht in der Genbank veröffentlicht. Die Autoren berichteten von der
Intraposition einer Sequenz in den offenen Leserahmen von Claudin-7, wodurch
ein Stopcodon zum Kettenabbruch (Position Nukleotid +158) führt. Es handelte
sich bei t-Claudin-7 um ein Transmembranprotein mit drei anstelle von vier
116
4. DISKUSSION
Transmembrandomänen, das aber nicht an der Bildung von Tight-Junctions
beteiligt ist, sodass die genregulatorische Funktion von Claudin-7 unabhängig
von seiner Funktion in der Tight Junction Bildung scheint. In der vorliegenden
Arbeit konnte zum damaligen Zeitpunkt zwischen Claudin-7 und t-Claudin-7
nicht differenziert werden. Betrachtet wurde bedingt durch die Lage der für die
RT-PCR verwendeten Primer die gemeinsame Expression von Claudin-7 und
des möglicherweise auch in den Pankreastumorzellen exprimierten t-Claudin-7,
sodass eine Aussage über die Metastasierungsabhängigkeit der Expression
von
Claudin-7
oder
t-Claudin-7
eigentlich
anhand
der
Expressionsuntersuchungen nicht getroffen werden kann. Es wäre daher von
Interesse, die differentielle Expression von Claudin-7 und t-Claudin-7 in
Pankreasprimärtumoren
mit
unterschiedlichem
Differenzierungsgrad
und
Metastasierungsverhalten zu untersuchen. Da mittlerweile ein kommerzieller
Antikörper gegen Claudin-7 zur Verfügung steht, könnte auch die subzelluläre
Lokalisation von Claudin-7 in primären Pankreskarzinomen in Abhängigkeit von
der Metastasierungsbereitschaft oder dem Differenzierungsgrad auf eine
Varianz der Funktion des Tight Junction Proteins hindeuten.
Die
vorliegende
Arbeit
untersuchte
eine
mögliche
funktionelle
und
morphologische Bedeutung der Expression von Claudin-7. Hierfür erfolgten die
Herstellung eines Claudin-7 Expressionsvektors (pcDNA/TO/myc-HIS) und die
transiente Transfektion von Zellen der Pankreaskarzinomzelllinie PaTu8988T,
für
die
in
der
vorliegenden
Arbeit
keine
Expression
von
Claudin-7
nachgewiesen werden konnte. Da zum Zeitpunkt der Experimente noch kein
kommerzieller Antikörper gegen Claudin-7 zur Verfügung stand, wurde die
Expression von Claudin-7 in den transient transfizierten Zellen der Zelllinie
PaTu8988T mittels eines Antikörpers gegen eine Poly-His-Frequenz indirekt
nachgewiesen.
Eine
repräsentative
Aussage
zu
Veränderungen
der
Zellmorphologie oder den Adhärensverbindungen der Zellen konnte nicht
getroffen werden, da die Transfektionseffizienz dieser Zellen sehr niedrig ist
und Claudin-7 exprimierenden Zellen dadurch nur vereinzelt vorlagen, ohne
dass sie untereinander kommunizieren oder Tight Junctions ausbilden konnten.
Die vorliegende Arbeit zeigte eine geringgradige Verlagerung von Claudin-7 in
117
4. DISKUSSION
die Zytoplasmamembran in mit Claudin-7 transient transfizierten Zellen der
Pankreaskarzinomzelllinie PaTu8988T nach Inhibition des Raf-MEK-ERKSignaltransduktionsweges.
Wegen
der
geringen
Anzahl
der
Claudin-7
exprimierenden Zellen nach transienter Transfektion konnte aber nicht beurteilt
werden, ob sich nach Inhibition des Raf-MEK-ERK-Signaltransduktionsweges
Zell-Zell-Kontakte ausbilden. Mittlerweile steht ein kommerzieller Antikörper
gegen Claudin-7 zur Verfügung, der den direkten Nachweis des Claudin-7
Proteins erlaubt. Mit der Entdeckung des Einflusses von Claudin-7 auf das
Prostataspezifische Antigen (PSA) bei Prostatakarzinomen und der Expression
eines
um
53
Aminosäuren
verkürzten
t-Claudin-7
mit
regulatorischer
Funktionen in Prostata- und Prostatakarzinomzelllinien (Zheng et al., 2003),
stellt sich bezüglich des Pankreaskarzinoms auch die Frage nach weiteren
Funktionen von Claudin-7 im Zellstoffwechsel.
Nach der Identifikation von t-Claudin-7, stellt sich nachträglich die Frage nach
einer Expression von t-Claudin-7 im normalen Pankreasgewebe bzw. in
Pankreaskarzinomzelllinien und -gewebe. In der vorliegenden Arbeit konnte bei
der Claudin-7 Amplifikation für die Klonierungs- und Transfektionsversuche ein
ca. 1000 bp langes Amplifikat generiert werden, das im Gegensatz zu dem 636
bp Claudin-7 Amplifikat zum damaligen Zeitpunkt nicht weiter durch
Sequenzierung
charakterisiert
wurde,
da
die
Herstellung
des
Expressionsvektors im Vordergrund stand. Aufgrund der Amplifikatgröße könnte
es sich jedoch um t-Claudin-7 gehandelt haben. Die fehlende separate
Amplifikation
des
mutmaßlichen
t-Claudin-7
bei
den
Expressionsuntersuchungen durch semiquantitative RT-PCR wäre durch die
unterschiedliche Lokalisation der eingesetzten Claudin-7 Primerpaare zu
erklären, die zwischen Claudin-7 und t-Claudin-7 nicht unterschieden.
Hinsichtlich einer möglichen regulatorischen Funktion von Claudin-7, wie für
Prostatakarzinomzelllinien beschrieben (Zheng et al., 2003), ist für Claudin-7 im
gesunden Pankreasgewebe bzw. beim Pankreaskarzinom bisher nichts
bekannt.
118
4. DISKUSSION
Die
epithelial-mesenchymale
Transition
(EMT)
wird
zunehmend
als
Mechanismus angesehen, durch den Zellen primär nicht invasiver Tumoren
Eigenschaften erwerben, die für Migration und Invasion wichtig sind. HOXB7,
ein
in
metastasierenden
Mammakarzinomzellen
überexprimiertes
Homeodomain Protein, führte im Zellkulturmodell und in vivo zum Verlust
epithelialer Proteine, wie Claudin-1 und Claudin-7, zur Dislokalisation von
Claudin-4 und E-Cadherin, sowie zur Expression von mesenchymalen
Proteinen, Vimentin und alpha glatte Muskulatur Aktin (Wu et al., 2006). MDCKHOCB7 Zellen zeigten Eigenschaften der Migration und Invasion und führten zu
hochvaskularisierten Tumoren in Mäusen. Diese Eigenschaften konnten durch
spezifische
Inhibitoren
von
FGF
Rezeptoren
und
des
Ras-MAPK
Signaltransduktionsweges verhindert werden. Diese Untersuchungen lassen
vermuten, dass HOXB7 Tumorinvasion über die Aktivierung des Ras/Rho
Signalstransduktionsweges
durch
Heraufregulation
von
bFGF,
einem
bekannten Target von HOXB7 vermittelt. Ob Claudin-7 ebenso direkt oder
indirekt durch HOXB7 reguliert wird, bleibt zu untersuchen.
Die
Funktion
von
Claudin-7
bleibt
unklar.
In
einer
Ratten
Pankreaskarzinomzelllinie wurde das direkt mit dem Zell-Zell Adhäsionmolekül
EpCAM interagierende 20 kDa Protein als Tight Junction Protein Claudin-7
identifiziert, wobei beide Proteine hauptsächlich an der basolateralen Membran,
nicht in den Tight Junctions lokalisiert waren (Ladwein et al., 2005). In der Maus
ist Claudin-7 konstitutiv gleich stark im normalen Mammaepithelium, während
der Entwicklung sowie in murinen Tumoren exprimiert. Claudin-7 ist im Epithel
von Mamma, Bronchien und Niere hauptsächlich oder ausschließlich
bestimmten
zytoplasmatischen
Strukturen
zuzuordnen,
oft
nahe
der
basolateralen Membranen und möglicherweise mit diesen assoziiert. Diese
Beobachtungen
ließen
vermuten,
dass
Claudin-7
eine
Rolle
beim
Vesikeltransport zu den basolateralen Memebranen spielt und möglicherweise
zytoplasmatische Vesikel stabilisiert oder an Zell-Matrix Interaktionen teilnimmt
(Blackman et al., 2005). Ein interessanter Aspekt ist der Hinweis, dass Claudin7 auch eine Rolle bei der HIV Infektion von CD4 (-) Zellen spielt (Zheng et al.,
2005). Transmembranproteine, die mit den Tight Junctions assoziiert sind
119
4. DISKUSSION
umfassen möglicherweise auch den Coxsackie- und Adenovirus-assoziierten
Rezeptor (Cohen et al., 2001; Walters et al., 2002).
Zur Regulation von Claudin-7 Expression ist bisher nicht viel bekannt. Es
konnte jedoch gezeigt werden, dass HNF (hepatocyte nuclear factor) -4alpha in
F9 Zellen (embryonale Karzinomzellen der Maus) die Expression von Claudin7, Claudin-6 und Occludin, sowie die Bildung funktioneller Tight Junctions und
polarisierte Epithelmorphologie triggert (Chiba et al., 2005). HNF-4alpha
induziert dabei die transkriptionale Aktivität des p21 Gens und inhibiert F9
Zellwachstum (Chiba et al., 2005). Daher könnte Claudin-7 direkt durch HNF4alpha reguliert werden oder Target des p21 Gens sein.
Die Expression von Claudin-12 in Pankreaskarzinomzellen war bisher
unbekannt. Die vorliegende Arbeit zeigte nach semiquantitativer RT-PCR für
Claudin-12
eine
homogene
Expression
in
den
untersuchten
Pankreaskarzinomzelllinien der beiden Zellkulturmodelle und auch den weiteren
untersuchten Pankreaskarzinomzelllinien mit Ausnahme der Zelllinie PC2, in
der nur eine geringe Claudin-12 Expression nachweisbar war. Da zum
Zeitpunkt der Untersuchungen kein kommerzieller Antikörper zur Verfügung
stand, konnten keine Claudin-12 Proteinuntersuchungen durchgeführt werden.
Weitere Untersuchungen zur Expression von Claudin-12 in Normal- oder
Tumorgewebe des Pankreas wurden bis dato nicht durchgeführt, und eine
Herunter- oder Herraufregulation von Claudin-12 in Pankreaskarzinomzelllinien
kann ohne Vergleich mit normalem Pankreasgewebe nicht hinreichend beurteilt
werden. Hinsichtlich der Claudin-12 Funktion ist wenig bekannt. Neben seiner
Funktion als Bestandteil von Tight Junctions wurde Claudin-12 im Bereich der
Bluthirnschranke
lokalisiert,
die
aus
High
Resistance
Endothelzellen
zusammengesetzt ist (Nitta et al., 2003) und in der Maus in den verhornenden
sowie
den
basalen
und
suprabasalen
Schichten
der
Epidermis
immunfluoreszenzmikroskopisch nachgewiesen (Troy et al., 2005).
Veränderungen
insbesondere
der
der
Expressionshöhe
Claudine
werden
von
Tight
zunehmend
Junction
in
Proteinen,
verschiedenen
Tumorentitäten berichtet. In einer neueren Studie wurden Claudine-1, -2, -3, -4,
120
4. DISKUSSION
-5 und -7 in 116 epithelialen und 92 nichtepithelialen Tumoren untersucht.
Dabei konnte eine tumortyp-spezifische Immunreaktivität für alle Claudine in
verschiedenen Karzinomen nachgewiesen werden. Niedrige Expression von
Claudin-4 and Claudin-5 fand sich in hepatozellulären und renalen Karzinomen.
Im Gegensatz zu den epithelialen Tumoren exprimierten Lymphome und die
meisten Weichteiltumore keine Claudine, oder zeigten schwache Expression
einzelner Claudine, hauptsächlich im Zytoplasma lokalisiert. Unter den
nichtepithelialen Tumoren fand sich Claudin-5 nur in Angiosarkomen und
gutartigen vaskulären Tumoren, die auch Claudin-2, -3 und -7 zeigten.
Claudine-1, -2, -3, -4, -5 und -7 wurden als Marker für epitheliale
Differenzierung und zur Unterscheidung zwischen epithelialen Neoplasien und
Lymphomen postuliert (Soini, 2005). Mittlerweile hat eine Untersuchung unter
Zuhilfenahme der großen öffentlichen SAGE Datenbank 21 humane Claudine
vergleichend untersucht. Wenige waren ubiquitär exprimiert, sondern die
meisten Claudine zeigten ein differenziertes Expressionsmuster. Claudin-14, 16, -17, -19, -20 und -22 finden sich in nur wenigen Bibliotheken, während
beispielsweise Claudin-3, -4, -5, -7, -11, und –12 breiter exprimiert wurden
(Hewitt et al., 2006). Claudin-3, -4- und 7 zeigten anhand RT-PCR Analysen
von 226 Geweben und Tumoren sehr ähnliche Expressionsmuster, was eine
koordinierte Regulation vermuten lässt (Hewitt et al., 2006). Allerdings erfolgte
diese Studie nur anhand von mRNA, sodass es essentiell ist, diese
Expressionsdaten auf Proteinebene zu validieren.
121
4. DISKUSSION
4.2.
Gewebe- und Zellspezifische Expression der Tight
Junction Komponente Claudin-7
Nach den vorliegenden Ergebnissen wird Claudin-7 in vielen Geweben des
menschlichen Körpers exprimiert. Die Expression des Claudin-7 wurde dabei
vorwiegend im Intestinaltrakt, Trachea und Schilddrüse beobachtet. Die
Untersuchung von Tumorzelllinien ergab eine starke Expression von Claudin-7
in einer Zelllinie aus dem Primärtumor eines kolorektalen Adenokarzinoms.
Claudin-7 war in intestinalen Epithelzellen der Ratte (RIE) exprimiert, aber
weniger stark in Lysaten von Kolonkarzinomen oder davon abgeleiteten
Zelllinien (Dhawan et al., 2005). Die vorliegende Arbeit zeigte eine starke
Claudin-7 Expression in der kolorektalen Adenokarzinomzelllinie SW480 und
eine sehr starke Expression im normalen Kolongewebe. Zur Claudin-7
Expression
in
kolorektalen
Karzinomen
sind
bisher
keine
weiteren
Untersuchungen bekannt. Da die eingesetzte cDNA-Sonde nicht zwischen
Claudin-7
und
t-Claudin-7
Transkript
unterschied,
wäre
auch
beim
Kolonkarzinom die Unterscheidung von Claudin-7 und t-Claudin-7 interessant
zu untersuchen. Von den untersuchten Tumorzelllinien HL60 (Breitman et al.,
1981; Leukämie), HeLa (Lo Monaco, 1957) MOLT-4 (Minowada et al., 1972;
Leukämie), K562 (Lozzio et al., 1976; Leukämie), Daudi (Klein et al., 1968;
Burkitt Lymphom), Raji (Pulvertaft 1965;Burkitt Lymphom), A549 (Lieber et al.,
1976; Lungenkarzinom) und SW480 (Kyriazis et al., 1978; kolorektales
Adenokarzinom) waren bisher keine Daten bezüglich der Expression von
Claudin-7 veröffentlicht. Die vorliegende Arbeit zeigte in den untersuchten
Zelllinien eine meist geringe Expression von Claudin-7, mit Ausnahme der
Zelllinie SW480 des kolorektalen Adenokarzinoms, die eine ausgeprägte
Expression von Claudin-7 zeigte. Im Gegensatz zu den übrigen Organen des
Gastrointestinaltraktes wurde Claudin-7 in der vorliegenden Arbeit im Multiple
Tissue Expression Array nur sehr schwach im Magen exprimiert. Spätere
Untersuchungen
haben
gezeigt,
das
Claudin-7
in
Dysplasien
und
Adenokarzinomen des Magens im Tff1-/- Mausmodell und im Menschen
überexprimiert vorgefunden wird, allerdings nicht im umliegenden normalen
Gewebe (Johnson et al., 2005). Der genaue Mechanismus der Claudin-7
122
4. DISKUSSION
Überexpression und die biologische Bedeutung sind bislang unbekannt.
Claudin-7 Expression war im Ösophagus stärker als im Magen anhand des
Multiple
Tissue
Expression
Array
nachweisbar.
Immunhistochemische
Untersuchungen haben gezeigt, dass Claudin-7 minimal im Plattenepithel des
Ösophagus, aber stark im Barrettepithel und niedriggradigen Dysplasien des
Barrettepithels exprimiert wird, während in den hochgradigen Dysplasien,
Adenokarzinomen und Metastasen Claudin-7 wieder weniger stark exprimiert
wird (Montgomery et al., 2006).
Auch in Bereichen des Zentralen Nervensystems sowie in embryonalem und
adulten Geweben von Lunge, Niere und Leber konnte eine stärkere Expression
von Claudin-7 nachgewiesen werden. Die Ergebnisse zur Claudin-7 Expression
in fetalem und adultem Lungengewebe wurde mittlerweile durch Arbeiten zur
Embryonalentwicklung der Lunge bestätigt (Daugherty et al., 2004). Claudin-7
wurde nicht Tight Junction-assoziiert in der basolateralen Membran des
Epithels adulter Bronchi und Bronchioli lokalisiert (Coyne et al., 2003). Claudin7 zeigte ein tumorzellspezifisches Expressionsprofil in der Lunge. So wies die
Lungentumorzelllinie A549 eine deutlich geringere Expression im Multiple
Tissue Expression Array als das normale und fetale Lungengewebe auf. In der
vorliegenden Arbeit wurde die Expression von Claudin-7 in fetalem und adulten
humanen Nierengewebe nachgewiesen. Eine Untersuchung zur Expression von
Tight Junction-Proteinen durch Immunfluoreszenz im adulten und neonatalen
Nierengewebe von Kaninchen (Reyes et al 2002) zeigte eine Hochregulation
von Claudin-7 in proximalen Tubuluszellen der Niere postnatal, während eine
Expression von Claudin-7 in embryonalen Nierengewebe von Kaninchen nicht
gezeigt werden konnte. Claudin-7 zeigte anhand der Immunfluoreszenz in der
Henleschen Schleife des Kaninchen eine zytoplasmatische Expression, im
Sammelrohr eine basolaterale Lokalisation, die vom neugeborenen bis adulten
Tier unverändert nachweisbar war (Gonzalez-Mariscal et al., 2006). Claudin-7
wurde auch im adulten Mausnephrongewebe nachgewiesen, wobei es in der
basolateralen Membran lokalisiert und nur im distalen Tubulus auch eine
Assoziation zu Tight Junctions zeigte (Li et al., 2004). Aktuelle Untersuchungen
geben Hinweise auf eine mögliche Beteiligung von Claudin-7 an der Bildung
123
4. DISKUSSION
von Ionenkanälen in der Nierenepithelzelllinie LLC-PK1 des Schweins, wobei
die Überexpression von Claudin-7 in diesen Zellen zu einem verminderten
Fluss von Chloridionen und einem gesteigerten Fluss von Natriumionen führte
(Alexandre et al., 2005). Im Zentralnervensystem spielen zur Erhaltung der
Gewebearchitektur Gap junctions und Tight Junctions eine Rolle. Die
vorliegende Arbeit zeigte eine unterschiedlich starke Expression von Claudin-7
in den untersuchten Bereichen des zentralen Nervensystems (ZNS), mit
stärkster Expression in der Hypophyse. Dies steht im Gegensatz zur Analyse
der mRNA im ZNS durch Lamas et al., der im Hippokampus, nicht aber im
Cortex eine Expression von Claudin-7 nachwies (Lamas et al., 2002). Die
vorliegenden Arbeit zeigte Claudin-7 Expression in der Mamma, was durch
unabhängige Untersuchungen zwischenzeitlich bestätigt wurde (Kominski et al.,
2003). Auch die Maus zeigte Claudin-7 in murinen Mammaepithelien konstitiv in
der basolateralen Region der Zellen exprimiert (Blackman et al., 2005). Über
eine Claudin-7 Reduktion wurde zudem im Zusammenhang mit der Invasivität
des duktalen Mammakarzinoms berichtet (Kominsjy et al., 2003).
Die Expression von Claudin-7 in humanem Prostatagewebe konnte durch die
vorliegende Arbeit nachgewiesen werden und stimmt mit Ergebnissen von
Zheng et al., 2003 überein. Letzterer identifizierte das um 53 Aminosäuren
verkürzte t-Claudin-7 auch in gesundem Gewebe von Niere und Lunge, wobei
in gesundem Gewebe Claudin-7 Expression überwog (Zheng et al., 2003).
Anhand des Multiple Tissue Expression Array konnte in der vorliegenden Arbeit
allerdings nicht zwischen t-Claudin-7 und Claudin-7 Expression unterschieden
werden. Für Claudin-7 und t-Claudin-7 wurde ein regulatorischer Einfluss auf
das Prostataspezifische Antigen (PSA) und die androgene Stimulation in
Prostatakarzinomzelllinien nachgewiesen (Zheng et al., 2003). Aufgrund der
komplexen Regulation der Expression von PSA durch Claudin-7 wurde
vermutet,
dass
Claudin-7
Mitglied
eines
größeren
Regelkreises
im
Zellstoffwechsel sein könnte. Der Nachweis einer regulatorischen Funktion von
Claudin-7 und t-Claudin-7 in Prostatakarzinomzellen (Zheng et al., 2003) und
der Nachweis der Lokalisation von Claudin-7 in der basolateralen Membran in
Nieren- und Lungengewebe (Li et al., 2004; Coyne et al., 2003; Daugherty et
124
4. DISKUSSION
al., 2004) ohne Assoziation zu Tight Junctions lässt weitere Funktionen von
Claudin-7
vermuten.
Alternatives
Splicing
wurde
auch
für
Claudin-18
beschrieben, wobei durch zwei Promotoren zwei indviduellen Exone-1 an
gemeinsame Exone 2 bis 5 gespleisst werden. Dieses alternative Splicing führt
zu lungen- oder magenspezifischen Isoformen (Niimi et al., 2001).
Untersuchungen haben gezeigt, dass viele der „Tight Junction“ Proteine nicht
nur in Tight Junctions, sondern spezies- und regionabhängig auch entlang von
Zell-Zellkontakten nachgewiesen werden können (Acharya et al., 2004).
Claudin-1
wird
entlang
der
gesamtem
basolateralen
Oberfläche
des
Nebenhodenepithels exprimiert und begrenzt die Plasmamembran aller
Zellschichten
der
Epidermis
und
Claudin-4
entlang
der
basolateralen
Oberfläche von Enterozyten des Dünn- und Dickdarms beschrieben. Schließlich
wird Claudin-7 an der basolateralen Oberfläche des aldosteron-sensitiven
distalen Nephron und im absteigenden Schenkel der Henleschen Schleife
gefunden. Eine mögliche Funktion der Tight Junction Protein Assoziation an
Stellen des Zell-Zellkontaktes wäre es, die Zelladhäsion zu unterstützen. Diese
Interaktionen wären in Geweben, die ständig mechanischen Kräften ausgesetzt
sind, wie Haut, Darm oder Blase wichtig.
Die Claudin-7 Expression wurde zwischenzeitlich auch in verschiedenen
Organen der Maus anhand von RT-PCR untersucht (Inai et al., 2005). Dabei
konnte ein Claudin-7 Amplifikat in Herz, Lunge, Magen, Dünndarm, Leber,
Niere und Testis, nicht jedoch in Gehirn, Aorta oder Skeletttmuskulatur
nachgewiesen werden. Immunfluoreszenzmikroskopisch war Claudin-7 in der
Niere
hauptsächlich
in
der
basolateralen
Membran
der
distalen
Nephronsegmente lokalisiert (Guan et al., 2005) und im Bronchialepithel
entlang der basolateralen Membranen mit nur geringem oder ohne Nachweis in
den apikalen Tight Junctions (Coyne et al., 2003). Zudem zeigte Claudin-7
vesikuläre Immunreaktivität im Zytoplasma von Drüsengewebe der Mamma,
Nebenhoden, Bronchiolen, und einigen renalen Tubuli der Maus, und
kolokalisierte mit ZO-1 in einigen, aber nicht allen Tight Junctions (Blackman et
al., 2005).
125
4. DISKUSSION
Es wurde angenommen, dass die Tight Junctions und Adherens Junctions aus
weitgehend nicht überlappenden Sets von Proteinen bestehen. Dies wurde
jedoch durch neuere Untersuchungen in Frage gestellt, die morphologische und
funktionelle Hinweise dafür lieferten, dass Proteine in einer neuen Kombination
rekrutiert werden können, um spezifische Aufgaben in der Zelle auszuüben
(Nunes et al., 2006). Die Komposition und Regulation der Tight Junction
Expression ist dabei in einem Gewebe möglicherweise ausschlaggebend.
4.3.
Methylierungsabhängige Regulation von Claudinen
in neuroendokrinen Pankreaskarzinomzelllinien
Die de novo Methylierung von DNA ist ein molekularer Mechanismus, durch
den es zu einem Transkriptionsverlust bei intaktem Genom kommen kann. Die
Methylierung der Nukleinsäure Cytosin in der genomischen DNA (häufig
Promotorbereich oder andere an der Transkriptionskontrolle beteiligte DNAAbschnitte) führt zur Anlagerung der Blockadeproteine MeCP1 und MeCP2
(Methyl-CpG-Binding-Proteins) (Nan et al., 1997). Nach Zugabe von 5-AZA
CdR zum Nährmedium wird dieses in der S-Phase wie Cytosin in die DNA der
Zellen eingebaut, jedoch durch einen strukturellen Unterschied nicht durch die
Methyltransferase
methyliert.
Die
Frage
der
methylierungsabhängigen
Expression von Claudinen in Pankreaskarzinomzelllinien oder anderen
Tumorentitäten waren bisher nicht untersucht worden. Interessanterweise
konnte in der vorliegenden Arbeit auf mRNA-Ebene erstmals für Claudin-4 eine
methylierungsabhängige
Expression
in
den
neuroendokrinen
Pankreaskarzinomzelllinien QGP-1 und BON I, sowie für Claudin-7 in der
Zelllinie BON I gezeigt werden. Das Ergebnis für Claudin-4 in der Zelllinie QGP1 konnte auch durch Western Blot Analyse bestätigt werden. Da zum Zeitpunkt
der Untersuchungen zur vorliegenden Arbeit kein kommerzieller Antikörper
gegen Claudin-7 zur Verfügung stand, konnte die Bestätigung des Ergebnisses
im Western Blot nicht erfolgen. Angesichts der methylierungsabhängigen
Expression von Tumor-Antigenen in Hodenkarzinomzelllinien (Karpf et al.,
126
4. DISKUSSION
2004)
und
Nm23-H1,
einem
Suppressor
der
Metastasierung
in
Mammakarzinomzelllinien (Hartsough et al., 2001) sowie einer möglichen
therapeutischen Option (Karpf et al., 2004) erscheinen Untersuchungen zur
methylierungsabhängigen
Expression
in
duktalen
und
neuroendokrinen
Pankreaskarzinomzelllinien sinnvoll. Zwischenzeitlich wurde in einigen der
Mammakarzinomzelllinien mit fehlender Claudin-7 Expression die Inhibition der
Claudin-7
Transkription
nachgewiesen.
Dies
durch
konnte
Hypermethylierung
allerdings
bei
der
Promotorregion
Untersuchungen
von
Primärtumorgeweben nicht bestätigt werden (Kominski et al., 2003). Angesichts
der in der vorliegenden Arbeit gezeigten Ergebnisse zur methylierungsabhängigen
Expression
Pankreaskarzinomzelllinien
von
Claudinen
müssten
die
in
neuroendokrinen
Untersuchungen
daher
auf
Primärtumore ausgedehnt werden.
4.4.
Regulation
Junction
von
Tight
Komponenten
Proteinkinase
Junction
durch
(MAPK)
und
Adherens
mitogen-aktivierte
Kaskade
in
Pankreaskarzinomzellen
Die K-ras Mutation ist eine der frühesten und häufigsten genetischen
Veränderungen in duktalen Pankreaskarzinomzellen, die auch in SUIT-2 Zellen
vorliegt und führt in Pankreaskarzinomzellen zur Aktivierung der MAPK
(Mitogen-aktivierte
Proteinkinase)
/ERK
(Extrazellulär
regulierte
Kinase)
Kaskade (Giehl et al., 2000; Kainuma et al., 1997). Die vorliegende Arbeit
zeigte in den SUIT-2 Pankreaskarzinomzellen den Einfluss des MAPK/ERK
Signaltransduktionsweges auf die Expression von Tight Junction und Adherens
Junction Komponenten. Western Blot Analysen zeigten nach MEK-1 Inhibition
in SUIT-2 Zellen subzellspezifische Veränderungen der Expression und
subzellulären Lokalisation der Tight Junction Proteine Claudin-1, Claudin-2 und
Occludin, der Tight Junction assoziierten Proteine ZO-1 und ZO-2, sowie dem
Adherens-Junction Protein E-Cadherin. In der vorliegenden Arbeit konnte
127
4. DISKUSSION
unabhängig vom Metastasierungsverhalten der einzelnen SUIT-2 Subzelllinie
nach der Inhibition der MAPK/ERK-Kaskade eine Rekrutierung von Occludin
und mindestens eines der Tight Junction Proteine Claudin-1 und -2 in Tight
Junctions nachgewiesen werden.
Claudin-2 Expression wurde im Vergleich zu den mit DMSO behandelten Zellen
in den Subzelllinien SUIT-2 S2-020 und SUIT-2 S2-028 nach MEK-1 Inhibition
deutlich reduziert, und interessanterweise in den SUIT-2 S2-007 und SUIT-2
S2-013 Zelllinien bereits nach DMSO Behandlung ohne weitere Veränderung
nach MEK-1 Inhibition (siehe später). Gleichzeitig zeigten die SUIT-2 Zelllinien
eine Rekrutierung von Claudin-2 in Tight Junctions. Das immunfluoreszenzmikroskopische Expressionsmuster bestätigte die Ergebnisse von Hoormann
2007, wobei in der Arbeit von Hoormann die Claudin-2 Expression in nativen
Zellen
nicht
untersucht
wurde
(Hoormann,
2007).
Unabhängige
Untersuchungen haben auf die Bedeutung der MAPK/ERK-Signaltransduktion
für die Claudin-2 Regulation hingewiesen (Kinugasa et al., 2000; Singh, 2004;
Lipschutz et al., 2004; Murata et al., 2005). In der intestinalen T84 Zelllinie IL-17
wurde über den MAPK/ERK-Signaltransduktionsweg die Transkription und
Translation von Claudin-1 und Claudin-2 induziert und durch MEK-Inhibition
(PD98059)
inhibiert
(Kinugasa
et
al.,
2000).
Im
Gegensatz
zum
Expressionsprofil von Claudin-2 in der vorliegenden Arbeit blieb die Claudin-1
Proteinexpression im Western Blot nach MEK-1 Inhibition in allen SUIT-2 Linien
weitgehend unverändert. Dagegen zeigte Claudin-1 eine MEK-1 Inhibition
abhängige Rekrutierung in die Tight Junctions, sodass zwischen der
Expressionshöhe von Claudin-1 oder auch Claudin-2 nicht auf die Funktion
geschlossen werden kann, und somit die Rekrutierung der Tight Junction
Proteine Claudin-1 und -2 in Tight Junctions nicht mit der Expressionsstärke
korreliert. Die subzelluläre Lokalisation der Tight Junction-Proteine Claudin-1
und -2 wurde in der Arbeit von Kinugasa et al. (2000) zwar nicht untersucht,
jedoch der transepitheliale Widerstand als Funktion der Tight Junctions
gemessen.
Dabei
zeigte
die
Aktivierung
des
MAPK/ERK-
Signaltransduktionsweges eine Zunahme des transepithelialen Widerstandes
128
4. DISKUSSION
(TER), was durch MEK-1 Inhibition verhindert werden konnte und der
Beobachtung der Inkongruenz von Expressionsstärke und Funktion entspricht.
Occludin ist ein integrales Membranprotein und in den Tight Junctions der
meisten Epithelzellen lokalisiert
(Gonzalez-Mariscal et al., 2003). Die
vorliegende Arbeit zeigte in den K-ras-mutierten SUIT-2 Zellen nach Inhibition
des MAPK/ERK-Signaltransduktionsweges eine weitgehend unveränderte
Occludin Expression anhand der Western Blot Analyse. Bei aktiviertem MAPKSignaltransduktionsweg in den unbehandelten SUIT-2 Subzelllinien war
Occludin gering in der Zellmembran nachweisbar, jedoch nach MEK1-Inhibitor
PD98059 Behandlung vermehrt in die Tight Junctions rekrutiert. Die
Antagonisierbarkeit des Effektes der vorhandenen K-ras-Mutation durch
Inhibition
des
Raf-MEK-ERK-Signaltransduktionsweges
wurde
durch
unabhängige Ergebnisse bestätigt. Expression von onkogenem Raf-1 führte in
immortalisierten Maushepatozyten zur Veränderung der Expression und
Funktion von Tight Junction und Tight Junction-assoziierten Proteinen und ECadherin mit Herunterregulation der Expression von Claudin-1 und -2 sowie
Occludin und von ZO-1 und E-Cadherin (Lan et al., 2004). In den nativen Zellen
waren Claudin-1 und -2, ZO-1, Pan-Cadherin und F-Actin in der Zellmembran
lokalisiert, während in den Raf-1 transfizierten Zellen eine punktuelle
Kolokalisation von ZO-1, Pan-Cadherin und F-Actin ohne Claudin-1 und -2
nachweisbar war. In Bestätigung der vorliegenden Arbeit konnte auch in diesem
Mausmodell die Antagonisierbarkeit der durch die Transfektion immortalisierten
Maushepatozyten mit Raf-1 induzierten Veränderungen der Expression und
Lokalisation der untersuchten Proteine aus Adhärenzverbindungen sowie des
transepithelialen Flusses durch den MEK1-Inhibitor PD98059 gezeigt werden
(Lan et al., 2004). Kubawara et al. (2001) zeigte nach Occludin-Transfektion in
nicht-Occludin exprimierende RLE Zellen die Rekrutierung von Occludin in die
Zellmembran ohne Veränderung des transepithelialen Flusses sowie im
Gegensatz zu den Ergebnissen von Li et al. (2000) keine Veränderung der
Expression
und
Depolymerisierung
Lokalisation
von
von
junktional
ZO-1
und
lokalisiertem
E-Cadherin.
und
mit
Nach
Occludin
kolokalisierendem Aktin zeigte sich keine membran-assoziierte Lokalisation von
129
4. DISKUSSION
Aktin, Occludin oder E-Cadherin mehr, wogegen die Expression und
Lokalisation von ZO-1 unbeeinflusst blieb (Kubawara et al., 2001). Die Autoren
schlossen, dass Occludin nicht nur die Ausbildung von Tigh Junctions, sondern
auch des Zytoskeletts reguliert. Da in der vorliegenden Arbeit durch die
Inhibition des MAPK-Signaltransduktionsweges neben der Rekrutierung von
Zelladhärenzproteinen in die Membran auch eine Morphologieänderung der
untersuchten duktalen Pankreaskarzinomzelllinien beobachtet werden konnte,
erscheint eine Untersuchung eines möglichen Zusammenhangs zwischen der
Expression von Occludin und der Ausbildung zytoskelettaler Strukturen in
Pankreaskarzinomzelllinien interessant. Es wurde zudem vermutet, dass die
intrazelluläre Lokalisation von Occludin, insbesondere der Zell-Zell junktionalen
Lokalisation, eng mit dem Dissoziationsstatus der Pankreaskarzionomzellen,
sowohl von Hamster als auch Mensch korreliert (Tan et al., 2004). Ein
Zusammenhang zwischen der Expressionsstärke und Lokalisation zeigte
Occludin in der vorliegenden Arbeit nicht. Die Inhibition des MAPKSignaltransduktionsweges führte ebenfalls zu einer Rekrutierung des Tight
Junction-Proteins Claudin-1 und sowie des Tight Junction-assoziierten Proteins
ZO-1 in die Zellmembran der untersuchten SUIT-2 Subzelllinien, es bleibt aber
zu untersuchen, ob die Inhibition des MAPK-Signaltransduktionsweges selbst
oder die Rekrutierung von Occludin die Ursache hierfür darstellte. Zudem
könnte die Kontrolle der Lokalisation des Tight Junction Proteins Occludin über
die Kontrolle des MAPK/ERK-Signaltransduktionsweg neue Einblicke in die
Entwicklung von therapeutischen Methoden geben, um Tumorinvasion und
Metastasierung zu kontrollieren.
In der vorliegenden Studie war ZO-1 Protein im Western Blot schwach
exprimiert und subzellspezifisch nach MEK-1 Inhibition reduziert, allerdings
vergleichbar mit der DMSO-Behandlung, sodass diese Reduktion nicht sicher
auf MEK-1 Inhibition zurückgeführt werden konnte. In der vorliegenden Arbeit
fand sich immunfluoreszenzmikroskopisch fast keine ZO-1 Expression in den
Zell -Zell -Adhärenzen, sondern diffus im Zytoplasma der SUIT-2 Zellen
lokalisiert. Bis jetzt sind die Kenntnisse über die Relevanz von ZO-1,
insbesondere im Hinblick auf Invasion und Motilität im Prozess der
130
4. DISKUSSION
Karzinogenese gering. Es wurde kürzlich berichtet, dass ZO-1 bei der
Zelldissoziation und Invasion von Pankreaskarzinomzellen eine Rolle spielt
(Takai et al., 2005). Es wurde gezeigt, dass die intrazelluläre Lokalisation und
Expression von ZO-1 mit der EGFR Aktivierung in Pankreaskarzinomzellen
korreliert,
wobei
die
Inhibition
der
EGFR
Aktivierung
zur
selektiven
Anreicherung von ZO-1 in Junctions führte (Takai et al., 2005). In der
vorliegenden Arbeit führte MEK-1 Behandlung zur membranassoziierten
Expression, deren Intensität in den SUIT-2 Subzelllinien variierte (Takai et al.,
2005). Die Tight Junction-assoziierten Proteine ZO-1 und ZO-2 zeigten in der
vorliegenden Arbeit nach Inhibition des MAPK/ERK-Signaltransduktionsweges
vor allem in den besser differenzierten SUIT-2 Subzelllinien, SUIT-2 S2-013
und SUIT-2 S2-028 eine Verlagerung in die Zellmembran. Translokation von
ZO-1 nach Inhibition der MAPK/ERK Kaskade wurde unabhängig kürzlich in
AsPC-1
Pankreaskarzinomzellen
berichtet
(Tan
et
al.,
2005).
Interessanterweise zeigten ZO-1 und ZO-2 in den SUIT-2 Zelllinien sowohl im
Western Blot als auch den immunfluoreszenzmikroskopischen Untersuchungen
ein voneinander unabhängiges Expressionsverhalten, wobei ZO-2 hinsichtlich
der DMSO und der MEK-1 -inhibitorischenn Behandlung in den Western Blot
Analysen im Vergleich zu Claudin-2 ein ähnliches, aber viel schwächeres
Expressionsprofil aufwies.
Die
Tight
Junction
stellt
eine
wichtige
Versiegelung
zwischen
zwei
benachbarten Zellen dar, die auch apikale und basolaterale Membranen
innerhalb der Zellen trennt. Erst kürzlich wurde gezeigt, dass der Verlust von
ZO
Proteinen
die
Bildung
von
Tight
Junctions
verhindert,
aber
überraschenderweise nicht die apiko-basale Polarität zerstört (Umeda et al.,
2006). ZO-1 war das erste Protein, das in Tight Junctions identifiziert wurde.
Spätere Studien haben drei ZO-1 Isoformen sowie ZO-2 und ZO-3 als
Bindungspartner von ZO-1 identifiziert (Stevenson and Keon, 1998). Da ZO
Proteine an Aktin binden, wirken sie als Gerüst, das die Tight Junction Proteine
mit dem Zytoskelett verbinden. Man hat angenommen, dass ZO Proteine für
das Targeting und die Organisation von Claudinen wichtig sind, war aber durch
ZO-1 Knockout Versuche, die zeigten, dass sich Tight Junctions trotzdem,
131
4. DISKUSSION
wenn auch verlangsamt, bilden konnten, verunsichert (McNeil et al., 2006;
Umeda et al., 2006). Umeda et al. (2006) zeigte, dass die SH3/GUK Domäne
von ZO-1 zur Claudin Polymeration an Adherens Junctions durch Ihre
Interaktion mit Afadin/α-Catenin Komplex und zur Bildung von ZO-1/ZO-2
Dimeren wichtig ist. Die ZO-3 Funktion schien für die Tight Junction ohne
Bedeutung. Diese Untersuchungen müssen im Hinblick mit vorausgegangenen
Arbeiten interpretiert werden,
denn
in MDCK Zellen verhinderte der
gemeinsame Knockdown von ZO-1 und ZO-2 die Tight Junction Bildung nicht
(Gao und Macara, 2004). Da auch McNeil et al. (2006) MDKC-Zellen benutzte,
könnte der funktionelle Unterschiede auf die verschiedenen Zelllinien oder
unterschiedliche Level des ZO Protein Knockdown zurückzuführen sein.
Darüber hinaus wurde gezeigt, dass Claudine, welche ZO Protein nicht binden
können immer noch Tight Junctions ausbilden können (Furuse et al., 1998).
Letztere Untersuchungen wurden mit überexprimierten Claudinen durchgeführt,
während in den Untersuchungen von Umeda et al. (2006) endogene Claudine
präsent waren, die ein ZO Gerüst brauchen, um sich dort vor der
Polymerisation zu konzentrieren. ZO-1 und ZO-2 schienen im Hinblick auf die
Bestimmung, ob und wo Claudine in Epithelzellen polymerisiert sind anhand der
Untersuchungen funktionell redundant (Umeda et al., 2006).
In Ras-transfizierten MDCK-Zellen zeigte sich keine Expression von ECadherin, während Occludin, Claudin-1 und ZO-1 nicht membranassoziiert im
Zytoplasma nachgewiesen werden konnten (Chen et al., 2000). Nach MEK1
Inhibition wurden die Tight Junction Proteine Occludin und Claudin-1, sowie das
Tight Junction assoziierte Protein ZO-1 in die Zellmembran rekrutiert und
bildeten Zell-Zell-Kontakte aus. Die Expression des Zonula Adherens-Proteins
E-Cadherin wurde heraufreguliert und das Protein ebenfalls in die Zellmembran
rekrutiert. Der erhöhte transepitheliale Widerstand der neu gebildeten Tight
Junction-Stränge belegte die funktionsfähigen Zell-Zell-Kontakte. Nach MEK-1
Inhibition kam es zur Reorganisation von Aktin-Filamenten, die kortikale Ringe
formten und mit Occludin, E-Cadherin und ZO-1 kolokalisierten. Dies ging mit
Veränderung der fibroblastenartigen zu einer epithelialen Morphologie einher. In
der vorliegenden Arbeit zeigten sich in den K-Ras-mutierten SUIT-2
132
4. DISKUSSION
Pankreaskarzinomzelllinien ähnliche Ergebnisse hinsichtlich der Rekrutierung
von Occludin, Claudin-1 und ZO-1 in die Zellmembran nach Inhibition des
MAPK-Signaltransduktionsweges. Die Reorganisation des Zytoskeletts wurde in
der
vorliegenden
morphologischen
Arbeit
nicht
untersucht,
Veränderungen
nach
ist
jedoch
Inhibition
aufgrund
des
der
MAPK-
Signaltransduktionsweges auch in SUIT-2 Zellen anzunehmen. In der
vorliegenden Arbeit konnte in den untersuchten SUIT-2 Subzelllinien eine
niedrige Expression des Adherens Junction Proteins E-Cadherin unabhängig
vom Metastasierungsgrad nachgewiesen werden. Untersuchungen haben
gezeigt, dass der Verlust der E-Cadherin Expression dort eintritt, wo es
während der Embryonalentwicklung oder in Tumoren zu einem epithelialenmesenchymalen
Übergang
(EMT)
kommt
(Thiery
et
al.,
2002).
Herunterregulation von E-Cadherin konnte unter anderem durch Aktivierung
des MAPK-Signaltransduktionsweges durch das Onkogen Ras bewirkt werden.
Dieser Verlust der E-Cadherin Expression trägt zur Tumorzellinvasion in vitro
bei und fördert den Übergang vom Adenom zum Karzinom im Tiermodell
(Thiery et al., 2002). An jeder Adherens Junction ist das calciumabhängige ECadherin direkt mit dem Zytoskelett über α− und ß-Catenin verbunden. Die
vorliegende Arbeit zeigte nach Inhibition des MAPK-Signaltransduktionsweges
durch den MEK1-Inhibitor PD98059 keine Herraufregulation von E-Cadherin,
jedoch geringe Rekrutierung in die Zellmembran in den Subzelllinien SUIT-2
S2-013 und SUIT-2 S2-028, die beide einen guten Differenzierungsgrad
aufweisen, und fragmentär in SUIT-2 S2-007 Zellen, die mittelmäßig
differenziert sind, nicht jedoch in der Subzelllinie SUIT-2 S2-020, die wenig
differenziert ist. Es ist denkbar, dass die geringe E-Cadherin Expression
möglicherweise
nicht
alleine
auf
eine
Aktivierung
des
MAPK/ERK-
Signaltransduktionsweges zurückzuführen ist und dass das Potential zur
Rekrutierung vom Differenzierungsgrad abhängt. Die Inhibition des MAPK/ERKSignaltransduktionsweges führte in der vorliegenden Arbeit in den SUIT-2
Subzelllinien auch zu flächigerem Wachstum mit vermehrter Ausbildung von
Adhärenzverbindungen. Solche Veränderungen hin zu einer epithelialen
Morphologie und Tight Junctions in K-ras-transformierten Epithelzellen wurden
auch
in
MDCK
Nierenzellen
nach
Inhibition
des
Raf-MEK-ERK133
4. DISKUSSION
Signaltransduktionsweges beobachtet (Chen et al., 2000). Die vorliegende
Arbeit berücksichtigte als Negativkontrolle nicht nur die nativen Zellen, sondern
auch die mit dem Lösungsmittel für den MEK-1-Inhibitor PD98059 DMSO
behandelten Zellen, sodass hierbei vereinzelt ein DMSO-Effekt beobachtet
werden konnte. Chen et al. (2000) berücksichtigten bei ihren Untersuchungen
zur E-Cadherin Expression als Negativkontrolle lediglich unbehandelte Zellen,
sodass ein möglicher DMSO-Effekt unerkannt blieb und daher diese Daten
dementsprechend
interpretiert
Repressionsmechansimen
werden
sind
einer
müssen.
der
zentralen
Transkriptionelle
Prozesse
der
Herunterregulation der E-Cadherin Expression, und mittlerweile wurden eine
Anzahl von transkriptionaler Repressoren identifiziert, die über die proximalen
E-Boxen des E-Cadherin Promotors wirken (Bolos et al., 2003). Jüngste
Untersuchungen zeigten, dass S100A4 Überexpression verbunden mit
reduziertem E-Cadherin eine wichtige Rolle in der Tumorprogression und
Lebermetastasierung beim Pankreaskarzinom spielen (Oida et al., 2006). ECadherin-negative Fälle zeigten eine schlechtere Prognose und hohe Inzidenz
von Lebermetastasen. Weiterhin wurde in Pankreaskarzinomzellen gezeigt,
dass
Kollagen
Typ
I
die
E-Cadherin
Adhäsionskomplexe
in
Pankreaskarzinomzellen zerstören kann. Die gestörte Zusammensetzung der
E-Cadherin Adhäsionskomplexe korrelierte mit der nukleären Translokation von
ß-Catenin, was zur erhöhten Expression von ß-Catenin-Lef/Tcf Targetgenen,
wie Cyclin-D1 oder c-myc führte (Koenig, 2006). Das bedeutet, dass
Komponenten der extrazellulären Matrix, die von Tumorzellen produziert
werden, zur Invasivität und Metastasierung beitragen können (Koenig, 2006).
Reduzierte E-Cadherin und DAP Kinase Expression wurden auch häufiger in
Lymphknotenmetastasen
als
in
den
primären
Pankreaskarzinomen
nachgewiesen, wobei DNA Methylierung des Promotors zur Reduktion führte,
aber auch methylierungsunabhängige Inaktivierungsmechanismen vermutet
wurden (Dansranjavin et al., 2006). Aberante DNA-Methylierung des ECadherin-Gens ist auch in Pankreaskarzinomen des Hamsters Ursache der
reduzierten E-Cadherin Expression (Shimizu et al., 2005).
134
4. DISKUSSION
Die
vorliegende
Arbeit
berücksichtigte
als
Negativkontrollen
für
Immunfluoreszenz und Western Blot Analysen einerseits unbehandelte SUIT-2
Zellen und andererseits die in 0.1% DMSO (Lösungsmittel für den MEK1Inhibitor PD98059) inkubierten SUIT-2 Zellen. Es zeigte sich vereinzelt bereits
durch die Behandlung mit DMSO eine Wirkung auf die Expression und
Lokalisation von Tight Junction Proteinen oder Tight Junction-assoziierten
Proteinen. Dies wurde beispielsweise in der SUIT-2 S2-007 Zelllinie für Claudin2, Claudin-4 und ZO-2 beobachtet, in der SUIT-2 S2-013 für Claudin-2 und ZO2 oder in der SUIT-2 S2-028 Zelllinie für Claudin-2. Untersuchungen zur
Wirkung der MEK-1 Inhibitoren PD98059 oder U1026 wurden bisher entweder
nur mit in DMSO kultivierten Zellen oder nur mit unbehandelten Zellen als
Kontrollen berichtet. Bei den DMSO Kontrollen wurde damit ein PD98059
unabhängiger durch DMSO erzeugter Effekt nicht sichtbar und in der
Vergangenheit dem MEK-1 Inhibitor zugeschrieben (Wheadon and Welham,
2003; Nguyen et al., 2004) .Auf der anderen Seite wurde der in DMSO gelöste
MEK1 Inhibitor eingesetzt und die Wirkung mit unbehandelten Kontrollzellen
verglichen, sodass auch hier eine Unterscheidung zwischen einem DMSO und
MEK1 Inhibitor Effekt nicht möglich sein konnte (Grände et al., 2002; Medici et
al., 2006). Auch in Tierversuchen wurde beispielsweise die Antitumoraktivität
von in DMSO gelösten Crocetin im Vergleich zu unbehandelten Tieren ohne
DMSO Kontrollgruppe untersucht (Magesh et al 2006). Das amphophile DMSO
(Dimethyl Sulfoxide) wird zur Lösung zahlreicher wasserunlöslicher Substanzen
und zur Kryopräservierung von Zellen oder zur Induktion von Zelldifferenzierung
eingesetzt (Santos et al., 2003), wobei DMSO letztere Wirkung durch
Veränderungen der Zellmembranintegrität, Veränderungen der intrazellulären
Signaltransduktionsprozesse (bsp. PhospholipaseC/ Proteinkinase (PLC/PKC)),
und durch alternatives Splicing bewirkt (Sainz et al., 2006; Adler et al., 2006).
DMSO kann abhängig vom zellulären Zusammenhang und wahrscheinlich über
Veränderungen
der
Splice-Seiten
Selektion
Zellprolifieration,
Apoptose
und/oder Differenzierung induzieren oder inhibieren (Bolduc et al., 2001).
DMSO ist auch oral wirksam (Amemori et al., 2006) und es wurde zudem
gezeigt, dass DMSO Wirkung auf das epigenetische Profil mit phänotypischen
Veränderungen hat (Iwatani et al., 2006). Daher hat die vorliegende Arbeit
135
4. DISKUSSION
gezeigt, dass die zurückliegenden Untersuchungen mit MEK-1 Inhibitoren
vorsichtig zu bewerten sind und in Zukunft die intrinsische Wirkung des
Lösungungsmittels DMSO berücksichtigt werden muss.
Der Effekt der K-ras-Aktivierung und seiner Effektoren auf Tight Junctions und
Adherens Junctions wird kontrovers diskutiert. Dabei muss wahrscheinlich
berücksichtigt werden, dass die Bestandteile dieser Strukturen in einer
komplexen Art und Weise reguliert werden, die von dem zellulären Kontext
abhängt. In Epithelzellen sind Tight Junctions und Adherens Junctions für die
Herstellung
der
Kontakte
zwischen
Nachbarzellen
verantwortlich,
ihre
Errichtung und Stabilität ist ein hoch regulierter Prozess. Claudine stellen die
hauptsächliche
Diffusionsbarriere
von
Tight
Junctions
dar
und
bilden
zusammen mit Occludin, Zonula occludens (ZO) Familienmitgliedern und
anderen zytoplasmatischen Proteinen apikale und basolaterale Domänen in der
Plasmamembran, um Zellpolarität zu erhalten. Allerdings haben die aktuellen
Untersuchungen überraschenderweise Hinweise dafür gegeben, dass Tight
Junctions für die Zellpolarität nicht notwendig sind (Umeda et al., 2006).
Cadherine stellen die wichtigsten adhäsiven Komponenten der Adherens
Junctions dar und rekrutieren p120ctn, α- und ß- Catenine und das Zytoskelett
zur Plasmamembran, während homophile und heterophile Interaktionen
zwischen benachbarten Zellen ein strukturelles Netzwerk über die gesamte
Zellschicht bilden (Aijaz et al., 2006). Die Assoziation zwischen Zytoskelettt und
Tight Junctions sowie Adherens Junctions weist auf strukturelle und funktionelle
Zusammenhänge hin, die für den Prozess der Tumorentstehung und progression wichtig erscheinen. Das Verhältnis der einzelnen Komponenten
scheint dabei die Komplexität dieser spezialisierten Strukturen und ihr
Zusammenspiel zu bedingen (Singh et al., 2004; Aijaz et al., 2006).
136
5. ZUSAMMENFASSUNG
5.
Zusammenfassung
In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression, Regulation und subzelluläre
Lokalisation von Tight Junction -Komponenten, die möglicherweise bei der
Tumorinvasion und -progression eine Rolle spielen in zwei Pankreaskarzinom
-Metastasierungsmodellen sowie verschiedenen duktalen und neuroendokrinen
Pankreastumorzelllinien untersucht. Anhand semiquantitativer RT-PCR konnte
eine metastasierungs -assoziierte Expression von Claudinen im Modell der
humanen PaTu8988S und -T Zellen (Claudine-2, -4, -7, -12) nachgewiesen und
für die Claudine-2 und -4 anhand der Westernblot -Analyse bestätigt werden.
Claudin-1 zeigte eine stärkere Expression in den nicht metastasierenden
PaTu8988T Zellen. Die Claudine-3, -14 und –17 wurden, ohne Nachweis eines
homozygoten
Verlustes,
in
beiden
Zelllinien
nicht
exprimiert.
Im
Metastasierungsmodell der humanen SUIT-2 Subzelllinien konnte ebenso eine
diffentielle Expression von Claudinen nachgewiesen werden, wobei Claudin-12
differenzierungsunabhängig und Claudin-1 besonders stark in der am
wenigsten metastasierenden, gut differenzierten Subzelllinie exprimiert wurde.
Mit Ausnahme von Claudin-2 zeigten die untersuchten Claudine keine sichere
Assoziation zum Metastasierungsverhalten. Bei erstmaliger Charakterisierung
der Claudine-7 und -12 in Pankreaskarzinomzellen zeigte sich für die Claudine4, -7 und -12 ein vergleichbares und damit möglicherweise koordiniert
reguliertes Expressionsmuster. Anhand eines Multiple Tissue Expression
Arrays konnte für Claudin-7 eine unterschiedlich starke Expression in den
meisten adulten humanen Geweben, am stärksten in Gastrointestinaltrakt und
Trachea, mittelstark im Pankreas und Teilen des zentralen Nervensystems und
sehr gering in Geweben des Immunsystems, Leukämie- und Lymphomzellen
gezeigt werden. Als Regulationsmechanismus für die Expression von Claudinen
konnte in humanen neuroendokrinen Pankreastumorzelllinien die DNA
-Methylierung nachgewiesen werden, wobei BON I Zellen Claudin-4, -5 und
-7 methylierungsabhängig exprimieren, und in QGP-1 Tumorzellen die Zugabe
von 5-AZA-2´-Desoxycytidin zur deutlichen Claudin-4 Heraufregulation führte.
Weiterhin konnte ein von der Ras-MEK-ERK Signaltransduktionskaskade
abhängig verändertes Expressionsprofil der Tight Junction und Adhesion
137
5. ZUSAMMENFASSUNG
Junction -Komponenten Claudin-1, Claudin-2, Occludin, ZO-1, ZO-2 sowie ECadherin in den untersuchten Pankreaskarzinomsubzelllinien identifiziert
werden. In den K-Ras-mutierten SUIT-2 Pankreaskarzinomsubzelllinien wurden
nach Inhibition des Raf-MEK-ERK-Sidnaltransduktionsweges anhand von
Westernblot
und
subzelltypspezifische
immunfluoreszenzmikroskopischen
Veränderungen
sowohl
der
Untersuchungen
Expression
als
auch
subzellulären Lokalisation mit Redistribution von Tight Junction und Tight
Junction -assoziierten Proteinen sowie des Adherens Junction Proteins ECadherin vom Zytoplasma zur Zellmembran nachgewiesen. Daher könnte die
Ras-MEK-ERK-Signaltransduktionskaskade
die
Tight
Zusammensetzung in Pankreaskarzinomzellen mitregulieren,
Junctionwobei das
Verhältnis der einzelnen Komponenten die Komplexität dieser spezialisierten
Strukturen und ihr Zusammenspiel mit benachbarten Zellen bedingen und damit
im Prozess der Tumorentstehung bzw. -progression eine wichtige Roll spielen
können.
138
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154
7. ANHANG
7.
Anhang
7.1.
Verwendete Abkürzungen
Aa.
Aminosäuren
Abb.
Abbildung
A, C, G, T
Adenin, Cytosin, Guanin, Thymin
AK
Antikörper
APS
Ammoniumpersulfat
bp
Basenpaare
BSA
bovines Serumalbumin
bzw.
beziehungsweise
C
Celsius
cAMP
zyklisches Adenosinmonophosphat
Cldn
Claudin
cm
Zentimeter
cm3
Kubikzentimeter
CPE
Clostridium Perfringens Enterotoxin
CPE-R
Clostridium Perfringens Enterotoxin-Rezeptor
D
Dalton
DAPI
4´-6´-Diamidino-2-Phenylindol
DEPC
Diethylpyrocarbonat
d.h.
das heißt
DMEM
Dulbecco’s Modified Eagle Medium
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
Desoxyribonukleinsäure
DNAse
Desoxyribonuklease
dNTP
Desoxynukleotidtriphosphat
DTT
Dithiothreitol
ECM
extracellular matrix
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
EGF
Epidermal growth factor
Egr-1
Early growth response gene 1
155
7. ANHANG
ERCP
Endoskopische retrograde
Cholangiopankreatikografie
EtBr
Ethidiumbromid
EtOH
Ethanol
FCS
fötales Kälberserum
FITC
Flourescein Isothiocyanate
g
Gramm
h
Stunde
HCl
Chlorwasserstoff = Salzsäure
HEPES
N-2-Hydroxyehtylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid
HRP
Horseradish peroxidase
Ig
Immunglobulin
JAM
Junctional adhesion molecule
kb
Kilobasen
kD
Kilodalton
l
Liter
M
Molar
mA
Milliampere
MAGUK
membrane-assoziated guanylate kinase
MAPK
mitogen-activated proteinkinase
MeCP
Methyl-CpG-Binding-Protein
min
Minute
mg
Milligramm
ml
Milliliter
mM
Millimolar
MMP
Matrix-Metalloproteinase
ms
Millisekunde
MTE-Array
Multiple Tissue Expression-Array
µg
Mikrogramm
µl
Mikroliter
µM
Mikromolar
MOPS
3-(N-morpholino)propansulfonsäure
mRNA
messenger RNA
156
7. ANHANG
ng
Nanogramm
Nn
Nukleotide
NTP
Nukleotidtriphosphat
OD
optische Dichte
PAA
Polyacrylamid
PanIN
pancreatic intraepithelial neoplasia
PBS
Phophat-buffered Saline
PCI
Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol
PCR
Polymerase Kettenreaktion
PEG
Polyethylenglykol
P/S
Penicillin/Streptomycin
RNA
Ribonukleinsäure
RNAse
Ribonuklease
rpm
rounds per minute = Umdrehungen/Min
RPMI
Roswell Park Memorial Institute
RT
Raumtemperatur
RT-PCR
Reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion
s.
siehe
SAGE
Serial analysis of gene expression
SDS
Natriumdodecylsulfat
sec
Sekunde
s.o.
siehe oben
s.u.
siehe unten
TBE
Tris-Bor-EDTA-Puffer
TE
Tris-EDTA-Puffer
TEMED
N,N,N‘,N‘,Tetramethylethylendiamin
TJ
Tight Junction
Tris-HCl
Tris-Hydroxymethyl-Aminomethan/HCl
TSR
Template Suppression Reagent
U
Unit = Einheit enzymatischer Aktivität
UpM
Umdrehungen pro Minute
UV
Ultraviolett
V
Volt
157
7. ANHANG
VAMP
vesicle-associated membrane protein
z.B.
zum Beispiel
ZO
Zonula occludens
7.2.
Publikationen
Abstracts
Bert, T., Hoormann, S., Aurbek, N., Iwamura, T., Kalff-Suske, M., Simon, B.
2002. Progression-dependent disturbance of junctional communication in ductal
pancreatic carcinoma cells. Pancreatology 2: 217–361 A125
7.3.
Akademische Lehrer
Meine akademischen Lehrer waren die Damen und Herren:
Arnold, Aumüller, Basler, Bach, Barth, Baum, Becker, Bien, Christiansen,
Czubayko, Daut, Eilers, Feuser, Geus, Gotzen, Griss, Gudermann, Happle,
Hellinger, Hertel, Hesse, Hofmann, Jungclas, Kern, Klenk, Klose, König,
Koolmann, Krause, Kretschmer, Krieg, Kroll, Kuhlmann, Lammel, Lang, Lemke,
Lohoff, Maisch, Moll, Müller, Mutters, Oertel, Printz, Remschmidt, Renz,
Rothmund, Schädel-Höpfner, Schäfer, Schmidt, Seitz, Simon, Steiniger, Suske,
von Garrel, Weihe, Werner, Westermann, Wulf
158
7. ANHANG
7.4.
Danksagung
An erster Stelle möchte ich mich bei Frau Prof. Dr. med. Babette Simon für den
Vorschlag des Themas, die gute Betreuung während der Durchführung sowie
ihre Hilfe und Unterstützung bei der Erstellung der vorliegenden Arbeit
bedanken.
Ich danke Herrn Prof. Dr. R. Arnold für die Überlassung des Laborplatzes und
die freundliche Aufnahme in die Abteilung für Gastroenterologie. Weiterhin
danke ich den Mitgliedern der Forschungsgruppe für ihre Unterstützung und die
gute Zusammenarbeit.
Mein besonderer Dank gilt Frau Karin Münch die mich in die Techniken der
molekularbiologischen Arbeit einwies und mit hoher fachlicher Kompetenz bei
der Durchführung der Experimente begleitete sowie Herrn Dr. med. Tillmann
Bert für seine Unterstützung bei allen auftretenden Schwierigkeiten während
der experimentellen Arbeit.
Herrn Dr. Anskar Schmidt aus der Abteilung für Pathologie danke ich für seine
große Hilfsbereitschaft beim Erlernen der Techniken zur Immunfluoreszenzfärbung und seine Geduld beim Erstellen und Auswerten der Aufnahmen.
Frau Dr. med. Stephanie Hoormann danke ich für die gute Zusammenarbeit
und ihr Einverständnis zur Verwendung von Abbildungen aus ihrer Arbeit
„Klonierung
und
Charakterisierung
von
Claudin-2,
einem
in
Pankreaskarzinomzellen metastastierungs-assoziiert exprimierten integralen
Tight Junction -Membranprotein“, die ich zu Vergleichszwecken benötigte.
Ich danke meinem Mann René Lippert für seine unermüdliche Geduld, seine
Hilfe bei der Bewältigung aller auftretenden Probleme und seine persönliche
Unterstützung.
Dank gilt auch meinen Eltern, deren steter Zuspruch mich motiviert und zum
Gelingen der Arbeit beigetragen hat.
159