ACUE-MB-SKR-C3-UV - Institut für Analytische Chemie

Institut für Analytische Chemie
Analytisch Chemische Übungen
für Molekularbiologen und Genetiker
Beispiel C3
PHOTOMETRIE
Quantitative Bestimmung eines
Proteingehaltes
mittels UV Absorptionsmessung
Quantitative Bestimmung eines Gesamtproteingehaltes
KURZBESCHREIBUNG:
Es sollen 3 unterschiedliche Arten der photometrischen Proteinquantifizierung bezüglich ihrer
Empfindlichkeiten und Nachweisgrenzen (Lowry Methode, Bradford Methode, Biuret
Methode) miteinander verglichen werden.
Die meisten Protein Assays nutzen den Vorteil einer Reaktion zwischen einem Farbstoff und
dem Protein selbst. Diese Reaktion, chemischer Natur, führt zu einer Verschiebung des
Absorptionsmaximums zu höheren oder tieferen Wellenlängen. Die Absorptionsintensität
richtet sich dabei nach der Menge an vorhandenem Protein entsprechend dem LambertBeer'schem Gesetz:
E=ε*c*d
E
ε
c
d
...
...
...
...
Extinktion
molarer Extinktionskoeffizient (cm2 * mol-1)
Konzentration (mol * cm-3)
Schichtdicke der Küvette (cm)
ARBEITSANLEITUNG:
ACHTUNG: Alle Glasgefäße vorher gut reinigen, da Sie nicht wissen wie sauber Ihr Vorgänger
diese gereinigt hat (Proteinspuren).
Weiters ist darauf zu achten, dass die Küvetten für die photometrischen Messungen an den
strahlengängigen Flächen rein und frei von Fingerabdrücken sind, um Interferenzen zu
vermeiden. Die Messlösungen werden direkt in den Küvetten hergestellt. Dabei ist auf eine
gute Durchmischung der Reagenzien zu achten.
Probenvorbereitung:
Herstellen des 50 mM Tris/HCl-Puffers (pH 7,5):
In einem 200 mL Becherglas wird das zuvor entsprechend eingewogene Tris (50 mM,
Endvolumen 100 mL) mit 70 mL H2Odest. versetzt und der pH-Wert mit verdünnter HCl auf
pH 7,5 eingestellt. Die Lösung wird in einen 100 mL Messkolben transferiert und genau auf
100 mL aufgefüllt.
Die ausgegebene Probe unbekannter Konzentration und die BSA-Standards (5 mg/mL) sind in
50 mM Tris/HCl pH 7,5 gelöst.
Aus der BSA – Stammlösung (5 mg/mL) wird durch Verdünnen mit 50 mM Tris/HCl pH 7,5
jeweils folgende Proteinkonzentrationen hergestellt (wobei die niedrigeren Konzentrationen
nicht aus der Stammlösung hergestellt werden sollen):
Standardkonzentrationen:
2,50
1,75
1,00
0,75
0,50
m g/m L
m g/m L
m g/m L
m g/m L
m g/m L
0,25 m g/m L
0,10 m g/m L
0,05 m g/m L
0,01 m g/m L
0,005 m g/m L
Pipettierschema:
500 µl
Proteinstammlösung
5 mg/mL
350 µl
400 µl
Standard
1,0 mg/mL
900 µL
500 µL
Standard
0,5 mg/mL
1600 µL
Standard
1,75 mg/mL
650 µL
Standard
2,5 mg/mL
100 µl
150 µl
100 µl
100 µl
250 µl
100 µl
Standard
0,05 mg/mL
900 µL
Standard
0,25 mg/mL
750 µL
Standard
0,1 mg/mL
900 µL
850 µL
Standard
0,75 mg/mL
100 µl
Standard
0,005 mg/mL
900 µL
900 µL
Standard
0,01 mg/mL
Tris/HCl pH 7.5
Die unbekannte Probe, eine 1:1 Verdünnung der Probe und die 10 Standards sollen nach jeder
der 3 genannten Methoden bestimmt werden. Die daraus resultierenden Kalibirierfunktionen
werden gezeichnet (Absorption vs. Konzentration). Die Konzentration der Probe wird an
Hand der drei Methoden bestimmt.
Allgemeine Vorgangsweise: Die Farbreaktionen werden direkt in Meßküvetten oder
Eppendorfgefäßen durchgeführt. Zuerst werden die Standard- und Probelösungen in die
Gefäße pipettiert, danach wird die Reagenzlösung zügig zugegeben, um einen für alle
Lösungen möglichst gleichen Startzeitpunkt der Reaktion zu erhalten. Eine ausreichende
Durchmischung der Lösungen erfolgt meist schon bei der Zugabe der Reaktionslösung durch
den Flüssigkeitsstrahl der Kolbenhubpipette1.
Quantitative Proteinbestimmung nach Biuret:
Herstellung der Farbreagentien:
Biuret-Reagens
4,5 g K-Na-Tartrat, 0,3 g CuSO4·5 H2O, 0,5 g KJ, mit 0,2 N NaOH auf
100 ml
CuSO4 und KJ können in Eppendorf-Gefäßen eingewogen werden.
Durchführung:
0,5 mL Probe (Protein unbekannter Konzentration, Proteinstandardreihe und auch 50 mM
Tris/HCl pH 7,5 als Blank) werden mit 1,5 mL Biuret-Reagens versetzt und gut durchmischt.
Nach 30 min wird die Probe in den Plastikküvetten bei 546 nm gegen den Blindwert
vermessen.
Bei allen Messungen ist darauf zu achten, dass der Zeitraum zwischen dem Mischen der
Proteinlösung (bzw. für den Blindwert 50 mM Tris/HCl pH 7,5) und der Messung in etwa
gleich groß ist.
Quantitative Proteinbestimmung nach Lowry:
Herstellung der Farbreagentien:
Lösung A:
Lösung B:
Lösung C:
Lösung D:
1 % Kupfersulfat (CuSO4 * 5H2O) in Wasser (im Eppendorf-Gefäß 1 mL)
2 % Na-K-Tartrat in Wasser (im Eppendorf-Gefäß 1,5 mL)
0,1M Natronlauge (NaOH) in einem 25 mL Meßkolben
4 % Natriumcarbonat (Na2CO3 * 10H2O) in Wasser in einem 25 mL
Meßkolben
Lowry Reagens A
(frisch zubereiten !!!)
24,5 mL Lösung D + 24,5 mL Lösung C mischen
0,5 mL Lösung A zugeben
1 mL Lösung B zugeben.
Lowry Reagens B
Folin-Ciocalteu Reagenz (vom Assistenten holen) 1+1 mit Wasser
mischen. In Summe 3 mL herstellen in einem kleinen Becherglas
1
Sollte eine weitere Durchmischung in den Küvetten erforderlich sein, kann dies durch nochmaliges
Aufziehen und Ausstoßen der Lösung erfolgen. Bei der Verwendung von Eppendorfgefäßen wird eine
gute Durchmischung durch Schütteln erreicht.
Durchführung:
0,25 mL Probe (Protein unbekannter Konzentration, Proteinstandardreihe und auch 50 mM
Tris/HCl pH 7,5 als Blank) werden mit 1,25 mL Lowry Reagenz A versetzt, gut geschüttelt
und 10 min bei Raumtemperatur stehengelassen.
Danach gibt man rasch 0,125 mL Lowry Reagenz B zu, schüttelt gut und lässt diese Mischung
30 min bei Raumtemperatur inkubieren.
Die Vermessung erfolgt bei 750 nm in Plastikküvetten gegen den Blindwert.
Bei allen Messungen ist darauf zu achten, dass der Zeitraum zwischen dem Mischen der
Proteinlösung (bzw. für den Blindwert 50 mM Tris/HCl pH 7,5) und der Vermessung in etwa
gleich groß ist.
Quantitative Proteinbestimmung nach Bradford:
Herstellung der Farbreagentien:
Lösung A
0,1 g Coomassie Brilliant Blue G 250 in 50 mL 50 %-igem Ethanol lösen.
100 ml 85 %-ige Phosphorsäure zugeben und mit Aqua bidest. auf 250 mL
auffüllen. (Vom Betreuer bereits hergestellt)
Lösung B
1 Vol. Lsg. A mit 4 Vol. Aqua bidest. mischen und durch Faltenfilter filtrieren
Durchführung:
50 µL Probelösung werden mit 2,5 mL Farbreagenzlösung (Lösung B) gut vermischt und
nach 15-45 min bei 595 nm in Einwegküvetten vermessen.
Als Leerwert dienen 50 µL 50 mM Tris/HCl pH 7,5 mit ebenfalls 2,5 mL Farbreagenz.
Für die Kalibrierfunktion werden jeweils 50 µL Proteinstandardlösung mit 2,5 mL
Farbreagenzlösung versetzt.
Bei allen Messungen ist darauf zu achten, dass der Zeitraum zwischen dem Mischen der
Proteinlösung (bzw. für den Blindwert 50 mM Tris/HCl pH 7,5.) und der Vermessung in etwa
gleich groß ist.
Bestimmung der Assay – Kenndaten
1) Empfindlichkeit
Die Empfindlichkeit wird aus der Kalibrierfunktion berechnet.
2) Nachweisgrenze der Bestimmungsmethoden
Um die Nachweisgrenze berechnen zu können muss das Rauschen des Blindwertes bestimmt
werden. Dafür werden in 4 Küvetten aus reinem Puffer und den entsprechenden Reagenzien
Meßlösungen hergestellt und vermessen2. Der entsprechende Blindwert berechnet sich dann
aus dem Mittelwert der vier Messungen. Das Rauschen des Blindwertes entspricht dabei der
Standardabweichung der vier gemessenen Blankwerte.
2
Es empfiehlt sich folgende Vorgangsweise: Mit dem ersten Blank wird das Photometer auf „Null“ gestellt.
Danach werden die drei anderen Blank-Proben gemessen. Die erste Blank-Probe wird danach nochmals
gemessen, allerdings wird die Küvette um 180° gedreht in das Photometer gestellt.
METHODISCHE GRUNDLAGEN:
Methode nach Biuret:
Der Name diese Methode beruht auf einer Farbreaktion mit gelöstem Biuret
(Carbamoylharnstoff NH2-CO-NH-CO-NH2) und Kupfersulfat in alkalischem, wässrigem
Milieu (Biuret – Reaktion). Es entsteht ein rotvioletter Farbkomplex zwischen den Cu2+ Ionen
und je 2 Biuretmolekülen. Diese Farbreaktion ist typisch für Verbindungen mit mindestens 2
CO-NH-Gruppen (Peptidbindungen) und kann daher für den kolorimetrischen Nachweis von
Peptiden und Proteinen verwendet werden.
Der farbige Protein-Cu2+-Komplex, der bei der Biuret-Reaktion entsteht:
O
R1
N
N
X
N
N
X
R2
O
X ... Polypeptidkette
X
2+
Cu
X
n
Sind Tyrosinreste vorhanden, tragen diese ebenfalls merklich – durch die Komplexierung von
Kupfer-Ionen zur Farbstoffbildung bei.
Störend wirken vor allem Ammonium, schwach reduzierende und stark oxidierende
Substanzen
(Sulfhydrylverbindungen,
Natriumphosphat,
Glucose).
Schwache
Konzentrationen an Sodiumdodecylsulfat (SDS) oder anderen Detergentien sind hingegen
tolerabel. Der Biuret – Assay ist im Vergleich zu anderen Assays der unempfindlichste.
Methode nach Lowry:
Unter alkalischen Bedingungen bindet Cu2+ an den Stickstoff der Amidbindungen der
Proteine (Biuret-Reaktion). Dieser Komplex absorbiert Licht maximal bei 550 nm. Dieser
Komplexreaktion folgt eine Reduktion des Folin-Ciocalteau Reagenzes ebenfalls im
alkalischen Milieu. Das Folin-Ciocalteau Reagenz selbst enthält 6-wertiges Wolfram und
Molybdän in Phosphorwolframsäure und Phosphormolybdänsäure. Die 6-wertigen Ionen
werden durch polare Aminosäuren, Cystein, Tyrosin oder Tryptophan soweit reduziert, dass
farbige Mischoxide von 4- bis 6-wertigen Metallen entstehen. Die resultierende tiefblaue
Färbung wird bei einer Wellenlänge von 750 nm, 650 nm oder 540 nm gemessen. Wobei die
Intensität natürlich vom Vorhandensein dieser Aminosäuren im Protein abhängig ist.
Die Lowry Methode ist eine der höchst sensitivsten und am meisten verwendeten Methoden
für die quantitative Proteinbestimmung. Diese photometrische Methode erlaubt es,
Proteinkonzentrationen bis zu nur 5 µg zu detektieren. Allerdings ist diese Methode einigen
Limitierungen unterworfen. Vor allem EDTA, Guanidin-HCl, Triton X-100, Brij, 1M
Natriumacetat, 1 M Natriumphosphat, Ammonsulfatkonzentrationen >5%, Glycin und auch
reduzierende Agentien stören die Bildung des Farbkomplexes.
Methode nach Bradford:
In Gegenwart von Proteinen verschiebt sich das Absorptionsmaxium von Coomassie
Brillantblue G250 im sauren Milieu von 465nm nach 595nm. Die Zunahme der Absorption
bei 595 nm, die mit einem Farbumschlag von rot nach blau einhergeht, wird gemessen und
korreliert mit der zu bestimmenden Proteinkonzentration. Der Farbstoff bindet unspezifisch
(nonkovalent) an kationische und nichtpolare, hydrophobe Seitenketten der Proteine, wobei er
in seiner Sulfonatform (unten dargestellt) stabilisiert wird. Am wichtigsten ist dabei die
Wechselwirkung mit Arginin, aber auch Lysin, Histidin, Tryptophan, Tyrosin und
Phenylalanin tragen zur Komplexstabilisierung bei.
H3C
+
N
NaO3S
-
SO3
H3C
CH2
N
H3C CH2
C
CH3
HN
OCH2CH3
Coomassie Brillantblau (Sulfonatform)
Diese Methode ist um den Faktor 2-5 sensitiver als die Lowry-Methode und hat den großen
Vorteil, dass nur wenige Substanzen die Komplexbildung stören – die einzig bekannten
Verbindungen sind Natriumdesoxycholat, hohe Konzentrationen an Triton X-100 (> 0,5 %)
und größere Sodiumdodecylsulfat Konzentrationen (> 0,1 %).
Ein Nachteil der Proteinbestimmung nach Bradford ist, dass die Stabilisierung der
Sulfonatform von Coomassie Brillantblue vor allem durch oben erwähnte Aminosäuren
bewirkt wird und die Empfindlichkeit sich somit von Protein zu Protein ändern kann
(abhängig von der Primärstruktur des Proteins).
PROTKOLLIERUNG:
Im Protkollheft soll die Versuchsdurchführung in eigenen Worten kurz und prägnant
wiedergegeben werden.
(1) Angabe der Arbeitsvorschrift mit genauer Angabe der Reagenzien und Lösungen.
(2) Dokumentation der drei Kalibrierfunktionen, umfassend je eine graphische Darstellung
mit allen Kalibrierpunkten,
der dazugehörigen Regressionsgeraden und Angabe der statistische Kenndaten der
Regressionsgeraden und
Angabe von Konzentrations- und Meßergebnissen für Probe und Standard in
Tabellenform.
(3) Dokumentation der Analysenergebnisse mit Angabe der Proteinkonzentration in der
Probe
(4) Angabe der folgenden Kenndaten für jede der drei Bestimmungsmethoden:
Empfindlichkeit (s = Anstieg der Kalibrierfunktion)
Nachweisgrenze ( NWG = Blindwert + 3 * Rauschen)3
Molare Extinktionskoeffizient ε der verschieden Farbkomplexe bei den jeweils
angegebenen
Wellenlängen:
Zur
Berechnung
muß
die
tatsächliche
Proteinkonzentrationen in der Küvette herangezogen werden (durch Zusatz der
Färbereagentien werden die Proteine in der Küvette verdünnt und somit ändert sich die
Konzentration).
Mittleres Molekulargewicht für BSA: 67000
Beispiel:
Proteinstammlösung: 1 mg/mL
Lowry
Proteinlösung
Reagentien
Proteinendkonzentration
3
250 µL
1,25 mL Reagens A
0,125 mL Reagens B
250 µg / 1,625 mL =
153,85 µg / mL
Die Berechnung der Nachweisgrenze erfolgt über die Eichfunktion.
Biuret
200 µL
1,8 mL Biuret – Reagens
200 µg / 2 mL =
100 µg / mL
INVENTARLISTE:
Eppendorf 1,5 mL
Gilson + Spitzen
Messkolben (2x 100 mL, 250 mL, 2x 500 mL)
Reagenzgläser
Spatel
pH-Meter
Küvetten
Spektralphotometer (Beschreibung der Benutzung)