Online-Ergänzung
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Online-Ergänzung zum Anwendung zur Bestimmung Bau eines Schülerphotometers der Peroxidase Enzymaktivität und weitere Anwendungsmöglichkeiten G. P. Püschel und A. Pucher Weitere Anwendungen des Photometers: Das Photometer kann auch für eine Reihe weiterer Messungen verwandt werden, die im Zusammenhang mit dem Biologie- oder Chemieunterricht interessant sein könnten. Beispiele zur Chlorophyll Quantifizierung, Proteinbestimmung nach Lowry und zur Bakterien Wachstumskurve sind in der Online-Ergänzung beschrieben. Chlorophyll Quantifizierung Die Wellenlänge des Lasers liegt relativ genau im Absorptionsmaximum von Chlorophyll. Chlorophyll kann man aus Blättern mit einer organischen Phase extrahieren und die Konzentration in den unterschiedlichen Fraktionen photometrisch bestimmen. Proteinbestimmung nach Lowry Im Rahmen der Besprechung von Proteinen wird häufig als eine Unterrichtseinheit der Proteingehalt unterschiedlicher Nahrungsmittel besprochen. Wie wird der Proteingehalt eigentlich bestimmt? Eine gängige Methode ist eine Proteinbestimmung nach Lowry. Der Protein-Kupfer-Komplex hat ein Absorptionsmaximum bei 630 nm und eine Messung ist mit dem selbst gebauten Photometer möglich (Abb. 7). Die für den Versuch benötigten Reagenzien können über den Chemikalienfachhandel problemlos bezogen werden (Tab. 3). Abbildung 7 Proteinbestimmung nach Lowry. Albuminverdünnungen in Wasser mit 0, 6, 12, 18, 24 und 30 µg Protein wurden mit Lowryreagenz umgesetzt und die Stromstärke in Abhängigkeit von der Proteinkonzentration im Photometer ermittelt. Tabelle 3 Materialien für die Proteinbestimmung nach Lowry Produkt K-Na-Tartrat SDS CuSO4 Na2CO3 NaOH Folin Ciocalteu's Reagenz Bezugsquelle Roth 7998.3 500 g Roth 5136.1 1 kg Roth 8175.1 1 kg Roth 8563.1 1 kg Preis ca. € 20,ca. € 36,ca. € 18,ca. € 12,- Sigma-Aldrich F9252-100ML ca. € 30,- Folgende Stammlösungen müssen von der Lehrkraft vorbereitet werden. (1) Lowry A1: In 40 mL dest. H2O 0,1 g CuSO4 x 5 H2O und 0,2 g Kalium-Natrium-Tartrat lösen; in weiteren 40 mL dest. H2O 1 g wasserfreies Na2CO3 lösen. Beide Lösungen mischen und mit dest. H2O auf 100 mL auffüllen. Diese Lösung ist bei 4°C praktisch unbegrenzt haltbar. (2) Lowry A2: 5 g Natrium-Dodecylsulfat (SDS) in 100 mL dest. H2O lösen. Bei Raumtemperatur praktisch unbegrenzt haltbar. Achtung, nicht bei 4°C lagern, SDS fällt in der Kälte aus. (3) Lowry A3: 0,8 M NaOH. Bei Raumtemperatur praktisch unbegrenzt haltbar. (4) Am Versuchstag werden 1 Teil Lowry A1, 2 Teile Lowry A2 und 1 Teil Lowry A3 zum kompletten Lowry A Reagenz gemischt. (5) Lowry B: 3 mL 2n Folin-Ciocalteu's Phenoreagenz mit 15 mL dest. H2O mischen. wird Bei 4°C mindestens 6 Monate haltbar. (6) Für eine Eichreihe Rinderserumalbumin in einer Konzentration von 1 mg/mL in Wasser eingewogen. Von den Schülern wird dann folgendes Experiment durchgeführt: Von der AlbuminstammLösung werden 100 µL mit dest. H2O auf 1 mL aufgefüllt und gemischt. Diese Verdünnung enthält 40 µg/400 µL Protein. Von dieser Verdünnung 400µl in ein neues Reaktionsgefäß überführt, weitere 400 µL werden mit 400 µl Wasser verdünnt. Diese 1:2 Verdünnungen in H2O wird wiederholt und so Verdünnungen mit 20 µg, 10 µg und 5 µg Protein in 400 µL hergestellt. Von der letzen Verdünnung werden 400 µL verworfen, so dass nun in allen Reaktionsgefäßen 400 µL Proteinverdünnung vorliegen. Zu den jeweils 400 µl Proteinverdünnung werden 400 µL Lowry A Reagenz gegeben und das Gemisch für ca. 10 min bei Raumtemperatur belassen. Dann werden 200 µL Lowry B Reagenz zugesetzt und das Gemisch für ca. 20 bis 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach kann die Farbintensität im Photometer bestimmt werden. Der -log(I/Io) ist proportional der Proteinkonzentration im Ansatz. Bakterien Wachstumskurve Das Photometer ist auch geeignet, um eine Wachstumskurve mit einer Bakteriensuspension aufzunehmen (Abb. 8). Hierbei kann man nachweisen, dass sich die Bakterien unter optimalen Wachstumsbedingungen exponentiell vermehren. Allerdings zeigt das Photometer bei hohen Bakteriendichten im Vergleich zur Messung in einem Referenzphotometer bei 550 nm zu niedrige Werte an. Daher können die Kurven nur in frühen Wachstumsphasen gut aufgenommen werden. Der Versuch wird wie folgt durchgeführt: Eine Kolonie eines geeigneten E. coli Stammes (z. B. XL-1, apathogener Laborstamm) wird von einer Kulturplatte in einem 50 mL Erlenmeyerkolben in 5 mL LB Medium überführt und über Nacht unter schütteln bei 37°C inkubiert. Aus dieser Übernachtkultur werden am Versuchstag 0,1 mL in 5 mL LB Medium überführt und die Stromstärke im Photometer gemessen. Der Inhalt der Küvette wird zurück in den Kulturansatz überführt und die Kultur unter Schütteln bei 37°C inkubiert. Die Messung wird alle 30 min wiederholt. Eine genaue Vorschrift zur Bakterienkultur wird vom Erstautor auf Wunsch gerne zur Verfügung gestellt. Abbildung 8 Bestimmung der Proliferationsgeschwindigkeit von Bakterien. Die Zunahme der Dichte einer Bakterienkultur über die Zeit wurde Photometrisch bei 550 nm und im Vergleich dazu mit dem selbst gebauten Photometer ermittelt. Auch wenn sich die Absoluten Werte unterscheiden, kann in beiden Fällen eine Exponentielle Wachstumsrate nachgewiesen werden. Weitere Hilfsmittel Mikroliterpipettenersatz In der Regel stehen in Schulen keine Mikroliterpipetten für die Schüler zur Verfügung. Einen einfachen, hinreichend genauen Ersatz bilden Feindosierungsspritzen (z. B. Omnifix-F von Braun) die mit einer abgeschnittenen Spitze für eine 200 µL Mikroliterpipette bewehrt werden (Abb. 9). Beim Aufziehen der Flüssigkeit markiert jeweils die Stempelunterkante das aspirierte Volumen (nicht komplett mit Flüssigkeit füllen, sondern das Luftpolster unter dem Stempel belassen, Spritze immer mit der Spitze nach unten halten). Auf diese Weise können Volumina von 50 µL bis 1 mL hinreichend genau und reproduzierbar bestimmt werden. Um noch kleiner Volumina reproduzierbar zu pipettieren wird mit einem dünnen Permanentmarker auf die Pipettenspitze ca. 17 mm oberhalb des Auslaufs eine Markierung angebracht. Wird der Flüssigkeitsspiegel bis zu dieser Markierung aufgezogen, entspricht das etwa 20 µL Zwischen den Messungen können die Spritzen mit Wasser ausgespült werden und sollten dann so weit wie möglich von Wasserresten entleert werden. Trotz des Spülens empfiehlt es sich, beim Enzymassay für Reagenzien und Enzympräparation unterschiedliche Pipetten zu verwenden, da es sonst zu einer Kontamination der Reagenzienlösungen mit Enzym kommt, die den Versuch massiv stört. Ebenso sollten Proteinverdünnungen und die Lowry Lösungen mit unterschiedlichen Pipetten gemessen werden. Abbildung 9 Herstellung einfacher Mikroliterpipetten. Anleitung siehe Text.
