PROTEINEXTRAKTION, PROTEINBESTIMMUNG (Protein extraction

PROTEINEXTRAKTION, PROTEINBESTIMMUNG
(Protein extraction and quantification)
Während die Nukleinsäuren in erster Linie die Informationsträger in der Zelle sind, können
Proteine vor allem als Struktur- und Funktionsträger betrachtet werden. So wie die Nukleotide
die Bausteine der Nukleinsäuren sind, werden Proteine aus Aminosäuren aufgebaut, die über
Peptidbindungen miteinander verknüpft sind. Der Zusammenhang zwischen der Abfolge der
Nukleotide in einem Gen und der Abfolge der Aminosäuren in dem durch dieses Gen kodierten
Protein wird durch den genetischen Code hergestellt. Die Kolinearität zwischen Proteinen und
Nukleinsäuren ergibt sich durch Übersetzung (Translation) einer mRNA in 5‘- → 3‘-Richtung
während der Proteinbiosynthese am Ribosom. Anfang und Ende von Proteinen werden durch
den Aminoterminus bzw. Carboxylterminus mit den endständigen Aminosäuren bestimmt, die
jeweils nur eine Peptidbindung ausbilden.
Die 20 natürlichen proteinogenen α-L-Aminosäuren (Abb. XI, 1) haben eine viel größere
chemische Diversität als die Nukleotide und folgerichtig weisen auch Proteine eine viel höhere
chemische Variabilität auf. Man unterscheidet aliphatische, aromatische Aminosäuren und
solche mit sauren oder basischen Seitenketten. Die Abfolge der Aminosäuren (Primärstruktur)
ist eine entscheidende Determinante für die Sekundärstrukturen eines Proteins, also lokale
räumliche Auffaltungen wie α-Helices und ß-Faltblattstrukturen. In der Tertiärstruktur, der
räumlichen Gesamtanordnung einer Polypeptidkette, können Aminosäuren nahe beieinander
liegen, die in der Primärstrukltur weit entfernt sind. Werden aus einzelnen Polypeptidketten
funktionale Proteineinheiten, sog. supramolekulare Komplexe, zusammengesetzt, spricht man
von Quartärstruktur.
An der Festlegung der Tertiärstruktur können neben hydrophoben und hydrophilen
Interaktionen auch kovalente Bindungen, insbesondere Disulfidbrücken, zwischen Cysteinen
entscheidend beteiligt sein (Abb. XI, 1). Nicht jedes Protein faltet sich allerdings immer von
selbst in eine spezifische native Struktur. Proteine, die als Faltungshelfer (z. B.
Hitzeschockproteine; engl.: chaperone) dienen, können z. B. nach dem Transport eines Proteins
durch eine Membran für dessen Rückfaltung in den nativen Zustand erforderlich sein. In
Gegenwart von Harnstoff oder Detergenzien wie Natriumdodecylsulfat (SDS) werden Proteine
denaturiert. Bei der Entfernung des denaturierenden Agens kann eine solche Denaturierung für
manche Proteine reversibel sein.
Abb. XI, 1: Proteinogene Aminosäuren und ihre Einteilung. Die vier Gruppen I – IV repräsentieren hydrophobe
(I), polare (II), saure (III) und basische (IV) Aminosäuren. Zwei Cysteinreste können durch
Disulfidbrückenbindung kovalent zu einem Cystinrest verknüpft werden (rechts unten). Angegeben sind auch die
Ein- und Dreibuchstaben-Abkürzungen der Aminosäuren.
In einigen Fällen treten in Proteinen auch modifizierte Aminosäuren auf. So ist der
aminoterminale Rest eubakterieller Proteine ein N-Formyl-Methionin, mit dem die
Proteinbiosynthese beginnt. In Proteinen der pflanzlichen Zellwand oder im Kollagen treten
beispielsweise hydroxylierte Proline und Lysine auf. Das seltene Selenocystein wird sogar als
21. Aminosäure bezeichnet, weil es durch spezifische tRNAs während der Proteinbiosynthese,
also kotranslational, eingebaut wird. Vielfach werden die Aminosäurereste erst durch sekundäre
Modifikationen wie Glykosilierung, Phosphorylierungen oder Sulfurylierungen posttranlational
verändert. Insbesondere Phosphorylierungen von Proteinen werden von der Zelle als wichtige
regulatorische Engriffsmöglichkeiten genutzt.
Von essentieller Bedeutung sind Proteine insbesondere als Enzyme, d. h. wenn sie katalytische
Funktionen besitzen. Andere Proteine haben Strukturfunktion (z. B. im Cytoskelett der Zelle),
Transport- oder Speicherfunktion für Metaboliten (z. B. für Metallionen, wie das Hämoglobin
oder Ferritin), oder sind als Rezeptoren (z. B. Steroidhormonrezeptoren) an der
Signaltransduktion, beteiligt. Die Energiespeicherung wird in Organismen häufig von
Reservestoffen, meist Kohlenhydrate oder Fette, übernommen. Insbesondere in den ruhenden
Samen von Pflanzen können aber auch Proteine diese Funktion übernehmen und sind
gleichzeitig Stickstoffspeicher. Die Speicherproteine der Samen sind in membranbegrenzten
Partikeln, den Proteinkörpern (,,protein bodies‘‘) lokalisiert oder nach Wasserentzug quasi
kristallin als sogenannte Aleuronkörner deponiert. Alternativ können sie kolloidal im
Cytoplasma gespeichert sein. Speicherproteine werden klassisch nach ihrer Löslichkeit im
Wasser (Albumine), in Salzlösungen (Globuline), in schwachen Säuren oder Laugen (Gluteline)
oder in Alkohol (Prolamine) klassifiziert. Samen können bis zu 30% des Trockengewichts
Speicherproteine enthalten. Während der Samenkeimung wird die Synthese von Proteasen
stimuliert, die Speicherproteine mobilisieren, d. h. abbauen. Freigesetzte Aminosäuren können
entweder neu in die Proteinbiosynthese eingehen oder werden dem Aminosäuremetabolismus
zugeführt.
Methodisch sind für den Umgang mit Proteinen natürlich Techniken für Ihre Auftrennung,
Reinigung und implizit für ihren Nachweis und für ihre Messung von Bedeutung. Zur
Anfärbung von Proteinen, aber auch zur Messung ihrer Konzentration wird oft der Farbstoff
Coomassie Brilliant Blue G eingesetzt. Mit der nach Bradford benannten kolorimetrischen
Methode (Bradford, 1976) lassen sich damit in der Regel Proteinmengen im Bereich von 1 – 10
µg/ml gut bestimmen. Das Absorptionsmaximum des Protein-Farbstoffkomplexes liegt bei 595
nm. Diese Methode soll zur Bestimmung des Proteingehaltes in Erbsenkeimlingen im Versuch
angewendet werden. Weitere gängige Verfahren wurden von Lowry beschrieben (Lowry et al.
1951), bzw. werden nach der Biuret-Methode (Robinson und Hodgen, 1940) durchgeführt.
Einfachere photometrische Abschätzungen der Proteinkonzentration nutzen die Eigenabsorption
der aromatischen Aminosäuren (Tryptophan und Tyrosin) bei 280 nm oder die
Trübungsmessung (Nephelometrie) von mit Trichloressigsäure gefällten Proteinen.
Extraction of Drosophila proteins
Do 1 set of extractions per group:
1. Begin with 6 tubes (A, B, C, D, E, F). Each tube contains 5 knocked-out male flies of the
same age. Proteins can be denatured at high temperatures, so keep your flies/proteins on ice as
much as possible.
2. Add 150 ul cold Buffer A to each tube. Thoroughly grind the flies. Add an additional 150 ul
of cold Buffer A. Mix by tapping with your finger. Incubate on ice for at least 20 min.
3. Centrifuge at 12,000 g for 15 min.
4. Transfer supernatant to a new tube and keep on ice. Discard old tube.
Determining Protein Concentration (Lowry Method)
1. Prepare 6 microcentrifuge tubes with the following BSA (Bovine Serum Albumin) dilutions:
tube label
0
5
10
15
20
25
water (ul)
200
195
190
185
180
175
0.5 mg/ml BSA (ul)
0
5
10
15
20
25
2. Prepare 6 tubes with 190 ul water and 10 ul from each of your sample tubes (A, B, C, D, E, F)
3. Add 200 ul CTC working solution to each tube, mix and store at room temp. for 10 min
4. Add 100 ul of 20% Folin Phenol, immediately mix. Store at room temp. for 30 min.
5. Determine absorbance of each sample at 750nm. Make a standard curve, then estimate the
protein concentration (in mg/ml) in your sample tubes. Proteins will be stored at -80 C for next
week. Remember to label your tubes!
Buffer A
0.1 M tris-HCl
1mM EDTA
7mM 2-mercaptoethanol
pH = 8.5
CTC Working Solution
0.025 % (wt/vol) copper sulfate
0.025 % (wt/vol) potassium tartrate
2.5% (wt/vol) sodium carbonate
0.2 N NaOH
2.5% SDS
Literatur:
Bradford MM (1976): A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding Anal. Biochem. 72,
248 – 254
Robinson HW, Hodgen CG (1940) The biuret reaction in the determination of serum proteins.
J. Biol. Chem. 135, 707 – 725
Lowry OH, Rosebrough NJ, Farr AL, Randall RJ (1951): Protein measurement with the Folin
phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, 265 – 275