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19, Nov. 1993 Diss. ETH No. 10326 proteins, genome, and in vivo comparison between nuclear replication: and cytoplasmic types of Adoxophyes orana granulosis virus Viral structural A THESIS SUBMITTED TO THE SWISS FEDERAL INSTITUTE OF TECHNOLOGY ZURICH for the degree of Doctor of Natural Sciences presented by Xing Li M.Sc. Huazhong born 20 Normal University November, 1957 Citizen of China Accepted on the recommendation of Prof. Dr. G. Benz, examiner Prof. Dr. T. Roller, co-examiner 1993 '."ft—n 1 Abstract granulosis The (GV) of Adoxophyes virus Tortriddae) isolated from a differs from other GVs. The wild isolate contains nudear type two are (N-type) and compared biochemically and (Switzerland) replicational types, two a the study With this cytoplasmic type (C-type). a (Lep., F.v.R. orana dead larva found in the Valais serologically. SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) showed that nondegraded granulin had a single band with a molecular weight (MW) of 28,000 daltons and the enveloped nudeocapsid (ENC) 16 ranged whose MWs polypeptides, viral polypeptides The pis of the ENC replication types kDa) were by strongly and Anti-Vn from Anti-Vc had healthy host showed no proteins serological hemolymph, replication, antigens, a group of study serological profiles of proteins (31-32 characteristics of viral anti-granulin antibody (Anti-Pc) The it also cross-reacted with one of but they no were also examined by healthy fat replication. differently no a all. The antibodies proteins from the occurred. some host and midgut major tissue one or in GV the anti- body proteins, proteins. reacted with complicated relationship the Although cross-reaction with the fat granulin, but with the none at immunoblot. The antibodies body tissue, interesting phenomena cross-reaction with viral cross-reacted reaction with any of the body proteins implies differences in their no between the three anti-virus but in the some showed N-type) two anti-ENC antisera cross-rearted with during one weak cross-reaction and Anti-Vn granulin antibody showed fat in granulin antigen; with the serological relationships showed 4.5-8.5. The ENC pH similar; only replication types. reactions with the ENC the proteins bands of the ENC, V31. The two anti-ENC antibodies (Anti-Vc C-type granulin. than 40 more with identical MWs separated by 2-D gel electrophoresis. varied from used to was from both major from no high replication places. the different Immunoblot the were The there any differences. This distinction in ENC structure may be determined readed were resolved gel electrophoresis points (pi) proteins both proteins replication types. in the ENC structure. Some but different isoelectric consisted of from 12,000-110,000 daltons, but difference could be found between both resolution 2-dimensional (2-D) structure the That Anti-Vn of the healthy between virus and host 2 Changes in protein synthesis in three host tissues after AoGV infection body, SDS-PAGE showed that one larval protein monitored. In the fat were (L26) disappeared gradually, These two immunoblot other the while two increasing proteins using were new the three antisera. One increased in proteins identified belonging as was quantity. the virus to by granulin (V28) and the the major band of the ENC. Additionally, the synthesis of the low DNA-binding protein of the ENC were also revealed in immunoblot experiments. With immunoblot the viral proteins could be detected early at MW, day 4 after infection in the fat that no viral proteins that the AoGV is not AoGV DNA body and at day could be found in the replicated was analysed 7 in the hemolymph. midgut by The fact immunoblot shows there. with 8 restriction endonucleases. Sal I, Eco RI, Hind III, Bgl I, Kpn I, Bam HI, Xho I, and Sma I cut the AoGV DNA to 19, 18,16,5, 5,4,2,1 fragment(s), respectively. The estimated size of the AoGV genome is 89 kilobase if examine To compare the genomes of two GV pairs. submolar some bands, DNA heterogeneity, exist in the AoGV genome, extracted from single larvae analysed Bgl no infected a representing genotypic large either by types and one number of DNA samples of the two GV types was with the four restriction endonucleases, Sal I, Eco RI, Hind III, and I. The restriction enzyme profiles between two types were such submolar band could be found in the examined genome of AoGV is rather taken from a single homogeneous, probably larva which samples. same by and The viral because the isolate have been infected might the was few virus a partides only. The conclusion is drawn that both GV types have similar genomes. However, the differences properties, as well as breeding" lines, imply 70 sites for cutting in the structural proteins and the ENC the fact that the two types could be that some genetic differences the viral DNA differences at the levels of the genomes. were not separated must exist. enough to antibody into "true Obviously, reveal these 3 Zusammenfassung Das aus einer Granulosisvirus Larve toten (GV) (AoGV) unterscheidet sich schiedlichen mit biochemischen und Untersuchungen mit dass zeigten, serologischen Molekulargewicht von Nukleokapsid (ENC Molekulargewichten konnte natives = von gefunden hohere eine Replikationstypen zeigten verschiedenen Ergebnisse konnte dieser mit kein Gelelektrophorese der in aber von pH 4.5 bis 8.5. sehr ahnlich; nur Charakterisierung wurde das Virus-Antiseren. in einer Proteine mit Werte der ENC- Gruppe der von 31-32 kDa moglicherweise Virustypen auf die zuriickzufuhren. Proteinen den aus Kontrolle beiden eingesetzt. serologische Eigenschaften zur 40 isoelektrischen pi Immunoblot-Verfahren Der als Die ENC-Profile der beiden sich Unterschiede. Diese sind der beiden mehr Einige verschiedenen Antikorper (Anti-Pc) reagierte eindeutig mit Granulin jedoch Methode werden, erzielt offenbarten verschiedene produzierten mit Auflosung Repliktionsorte Replikationstypen Polypeptide 16 12,000 bis 110,000 Dalton enthalt. Zwischen den werden. Mittels 2-dimensionaler waren weiteren Zur des Bande mit einem einzige wurden mit dieser Methode getrennt. Die variierten Proteinen eine enveloped nudeocapsid) Molekulargewichten, (pi), Proteine verglichen. (sogen. Kapselprotein Granulin in der ENC-Struktur sichtbar wurden. Virusproteine Punkten wurden reine Isolate beider Methoden 28,000 Dalton ergibt, wahrend das umhullte Replikationstypen denselben primare einen Kern- SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS- parakristallinen Einschliessungskorpers) Unterschied Das replizierende Typen, vorliegenden Untersudiung entwickeln. In der beiden (Lep., Tortriddae) F.v.R. und einen Zytoplasma-Typ (C-Typ), entsprechend den unterzytologischen Bereichen, in denen sich die beiden Virustypen Typ (N-Typ) PAGE) (Schweiz) isolierte Wallis orana anderen bekannten GV. von AoGV-Isolat enthalt zwei verschiedene Typen dem aus Adoxophyes von verwendete seinem Die der drei Anti- Antigen. Er kann aber auch mit mindestens einem Protein des ENC, namlich V31, reagieren. Sie Antigen: Vn. Die zwei Anti-ENC-Antiseren (Anti-Vc N-Typ) reagieren gleich zeigen jedoch unterschiedliche vom mit den vom ENC-Antigenen C-Typ und Anti-Vn beider Virustypen. Kreuzreaktionen mit dem Granulin- eine schwache Reaktion mit Anti-Vc, dagegen gar keine mit Anti- 4 Verwandtschaft zwischen den drei Virus-Antiseren serologische Die wurde ebenfalls larvalen Geweben gepriift. die drei Hamolymphe zeigten dem Fettkorper jedoch, sich ergaben Antikorper keine Resultate. der Granulosisviren, Wahrend dem und Reaktion. Im serologische aus gesunden Granulin- der Fettkorper zeigt, mit bestimmten Proteinen im ENC-Antikorper positiv die zwei aus Mittleldarm aus Hauptvermehrungsort interessante einige Proteinen Mit keine Kreuzreaktion mit Proteinen Antikorper reagieren ihrer Reaktion mit Proteinen beztiglich Dass Anti-Vn absolut keine Kreuzreaktion mit Granulin hat, Fettkorper. aber mit einem gesunden Fettkorper komplizierte Beziehung Virusvermehrung deutet auf eine reagieren kann, Protein zwischen und Virus wahrend Wirt der hin. Nach einer AoGV-Infektion liess sich in verschiedenen Geweben des Veranderung Wirtes eine mittels SDS-PAGE fur den im Lauf der Infektion in der Proteinsynthese nachweisen. So konnte Fettkorper gezeigt werden, verschwindet, wohingegen dass ein zwei Wirtsprotein synthetisierte neu Proteine auftauchen. Diese zwei Proteine wurden durch Immunoblot als identifiziert: das eine ist identisch mit Granulin (V28), das Virusproteine ein andere ENC-Protein. Molekulargewicht Antikorpern nachgewiesen Bindungsprotein in Fettkorper Tag werden, am 4. in der iiberhaupt Virusprotein weiteres der worden. Dabei handelt ENC-Struktur. aber erst Die am es sich urn Virusproteine Tag. 7. verschiedene andere GV im Mitteldarm nachgewiesen eingesetzten Enzyme (Sal I, im gefunden wurde. Bgl I, Kpn, I, Eco RI, Hind III, Grosse des AoGV Genoms die Genome der beiden grosse Zahl konnen vermehrt, wie fur Sma I) schneiden die DNA in 19, 18, 16, 5, 5, 4, 2, und 1 (Hinweis auf ein DNA- Im Mitteldarm konnten Die AoGV DNA wurde mit 8 Restriktionendonucleasen geschatzte einem werden. Dies ist ein Hinweis Virusproteine nachgewiesen darauf, dass sich das AoGV nicht daraus mit nach der Infektion mittels Immunoblot Hamolymphe keine Ein 16 kDa (V16) ist ebenfalls mit den zwei ENC- von Replikationstypen betragt 89 analysiert. Die Bam HI, Xho I, Fragmente. Die Kilobasenpaare. Um auf submolare DNA-Banden hin zu iiberpriifen, wurde eine Enzymen (Sal I, Eco RI, Hind III, Bgl genotypische Heterogenitat) von DNA-Proben mit vier I) analysiert. Diese DNA-Proben wurden extrahiert, die mit Dosierung infiziert nur einem der beiden worden waren. aus individuellen Replikationstypen Die DNA-Profile beider in Larven geringer Typen sind 5 gleich; submolare DNA-Banden konnten in den gefunden durfte damit einzigen gepriiften werden. Das Genom des AoGV ist also recht zusammenhangen, Larve gewonnen Viruspartikeln dass das Isolat wurde, die moglicherweise durch aus nur Dies einer wenige infiziert wurde. Die Resultate sprechen einerseits ahnliche Genome haben. Anderseits Strukturproteinen der ENC und deren Tatsache, dass die beiden werden konnten, dass Offensichtlich urspriingliche Proben nicht homogen. geniigten Typen genetische dafiir, dass die beide GV-Typen sehr zeigen Antikorper-Eigenschaften, sowie die als "rein-vererbende" Linien separiert Unterschiede vorhanden sein mussen. 70 Schneidestellen der verwendeten Restriktions- enzyme nicht, diese Unterschiede erfassen. Es kann aber kein Zweifel zu dariiber bestehen, dass eine detailliertere Genom der beiden die Unterschiede bei den Virustypen zeigen DNA-Analyse wurde. Unterschiede im
