Expression antimikrobiell wirksamer Peptide in HPV

Aus der
Klinik für Dermatologie und Allergologie
des St. Josef-Hospital Bochum
- Universitätsklinik der Ruhr-Universität Bochum
Direktor: Prof. Dr. med. P. Altmeyer
Expression antimikrobiell wirksamer Peptide in HPV-induzierter analer intraepithelialer
Neoplasie bei HIV-positiven Männern
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer Hohen Medizinischen Fakultät
Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Claudia Herzler
aus Münster/Westfalen
2009
Dekan:
Prof. Dr. med. G. Muhr
Referent:
Prof. Dr. med. A. Kreuter
Koreferent:
Jun.-Prof. PD Dr. med. L. Steinsträßer
Tag der mündlichen Prüfung:
20.05.2010
Meiner ehemaligen Chefärztin Dr. med. Gisela Albrecht
und den Menschen, die ich liebe,
in Dankbarkeit gewidmet
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung
1.1
Einführung
7
1.2
Humane Papillomviren (HPV)
8
1.2.1
Struktur und Taxonomie
1.2.2
HPV-Infektion und Zervixkarzinom
10
1.2.3
Natürlicher Verlauf der HPV-Infektion und virale Onkogenität
10
1.2.4
HPV-Infektion und Immunantwort
13
1.2.5
Klinik
14
1.3
Anale intraepitheliale Neoplasie (AIN)
8
15
1.3.1
Zytologische, histologische und klinische Einteilung der AIN
15
1.3.2
AIN und HPV
16
1.3.3
HPV-Infektion und AIN bei HIV-infizierten MSM
17
1.4
Analkarzinom bei HIV-infizierten MSM
1.5
Penile und oropharyngeale HPV-assoziierte Tumoren bei
1.6
2
7
22
HIV-positiven MSM
24
Antimikrobiell wirksame Peptide (AMP)
25
1.6.1
AMP in der menschlichen Haut
25
1.6.2
AMP bei Pflanzen und Tieren
28
1.6.3
Humane Alpha-Defensine (hAD)
28
1.6.4
Humane Beta-Defensine (hBD)
29
1.6.4.1
Humanes Beta-Defensin 1 (hBD-1)
29
1.6.4.2
Humanes Beta-Defensin 2 (hBD-2)
30
1.6.4.3
Humanes Beta-Defensin 3 (hBD-3)
31
1.6.5
Cathelicidin LL-37
32
1.6.6
RNase 7
33
1.6.7
AMP in chronisch-entzündlichen Dermatosen
35
1.6.8
Nachweis von AMP in Neoplasien der Haut
36
1.6.9
AMP bei Virusinfektionen
37
Methoden
39
2.1
Hautproben und Patientencharakteristika
39
2.2
HPV-Typisierung und Bestimmung der HPV-DNA-Viruslast
40
1
3
2.3
Quantitative Real-Time-PCR der antimikrobiellen Peptide
40
2.4
Immunhistochemie
42
2.5
Immunhistochemische Evaluation
43
2.6
Statistische Analyse
43
Ergebnisse
3.1
45
Expression antimikrobieller Peptide in analen intraepithelialen Neoplasien und
Condylomata acuminata von HIV-positiven Männern, die Sex mit Männern
haben
3.2
HPV-Analyse von analen Läsionen bei HIV-positiven und HIV-negativen
Männern, die Sex mit Männern haben
4
5
45
Diskussion
50
52
4.1
Der Nachweis von AMP in analen intraepithelialen Neoplasien
52
4.2
Die Funktion der Defensine
53
4.3
Die Interaktion der AMP mit Zellen der lokalen Abwehr
54
4.4
Beta-Defensine in chronisch-entzündlichen Dermatosen
55
4.5
AMP und HPV
56
4.6
AMP und HIV
57
4.7
Beta-Defensine unter HAART
59
4.8
Lokalisation der Beta-Defensin-Expression
61
4.9
p16ink4a- ein indirekter Proliferationsmarker für HPV-Onkoproteine
62
4.10
Effekt und antivirale Aktivität der hochregulierten Peptide
63
4.11
Risikofaktoren, Co-Faktoren
65
4.12
Schlussfolgerung
67
Zusammenfassung
Literaturverzeichnis
70
73
2
Verzeichnis der Abkürzungen
AD
Atopische Dermatitis
ADCs
AIDS-defining cancers (Aids-definierende Malignome)
AIN
Anal intraepithlial neoplasia (anale intraepitheliale Neoplasie)
AM
Alveoläre Makrophagen
AMP
Antimikrobiell wirksame Peptide
ASCUS
Atypical squamous cells of undetermined significance
ASC-H
Atypical squamous cells, cannot exclude HSIL
BCC
Basal cell carcinoma (Basalzellkarzinom)
CAMP
Cathelicidin antimikrobiell aktives Peptid
CCA
Cervix carcinoma (Zervixkarzinom)
CIN
Cervical intraepithelial neoplasia (zervikale intraepitheliale Neoplasie)
DCD
Dermcidin
DNA
Desoxiribonucleic acid
EGRF
Epidermal growth factor (epidermaler Wachstumsfaktor)
GAS
Streptokokken der Gruppe A
HAART
Hochaktive antiretrovirale Therapie
hAD
Humanes Alpha-Defensin
hBD
Humanes Beta-Defensin
hCAP
Humanes C-terminales antimikrobielles Peptid
hNP
Humanes Neutrophiles Peptid
HPV
Humanes Papillomvirus/Humane Papillomviren
HSIL
High-grade squamous intraepithelial lesion
HRA
High resolution anoscopy (hochauflösende Anoskopie)
iDCs
Immature dendritic cells
IEZ
Intestinale epitheliale Zellen
IEN
Intraepitheliale Neoplasien
IL
Interleukin
IGF-I
Insulin-like growth factor (Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor)
kb
Kilobase
kDa
Kilodalton
KS
Kaposi Sarkom
LPS
Lipopolysaccharide
3
LSA
Lichen sclerosus et atrophicus
LSIL
Low-grade squamous intraepithelial lesion
MC
Memory-T-cells
MRSA
Methicillin-resistenter Staphylokokkus aureus
MSM
Männer, die Sex mit Männern haben
mRNA
Messenger ribonucleic acid
NADCs
Non-AIDS-defining cancers (nicht-AIDS-definierende Malignome)
NMHT
Nicht-melanozytäre Hauttumoren
NHL
Non-Hodgkin-Lymphom
NK
Natural killer cells
PAMP
Pathogen associated molecular pattern (Pathogen-assoziierte molekulare
Pattern)
PBMC
Periphere mononukleäre Blutzellen
PCR
Polymerase chain reaction
PKC
Proteinkinase C
PDZ
Plasmazytoide dendritische Zellen
PsV
Pseudovirus
PV
Psoriasis vulgaris
RR
Relatives Risiko
S. aureus
Staphylococcus aureus
SCC
Squamous cell carcinoma
STD
Sexually transmitted disease
THZ
T-Helfer-Zelle
TLR
Toll-like receptor
T reg
Regulierende T-Zellen
VLP
Virus-like particle(s) (virusartige(r) Partikel)
VRE
Vancomycin-resistenter Enterococcus faecium
4
Verzeichnis der Tabellen
Seite
Tabelle 1:
Histologische Stadien der analen intraepithelialen Neoplasie (AIN)
16
Tabelle 2:
Primer der antimikrobiellen Peptide (AMP) und für das Housekeeping Gen RPL-38,
die in der Real-time-PCR- Studie verwendet wurden
41
Tabelle 3:
Mittelwert und Bereich der mRNA-Expression der antimikrobiellen Peptide und
Proteine (AMP) in analen intraepithelialen Neoplasien (AIN), Condylomata
acuminata und nicht-läsionaler analer Mukosa von HIV-positiven Männern, die Sex
mit Männern haben (MSM), und Condylomata acuminata von HIV-negativen MSM
46
Tabelle 4:
Immunhistochemische Analyse von humaner Beta-Defensin (hBD)-2 und hBD-3Proteinexpression in analer intraepithelialer Neoplasie (AIN), Condylomata acuminata und nicht-läsionaler Mukosa von HIV-positiven Männern, die Sex mit Männern
haben (MSM), und Condylomata acuminata von HIV-negativen MSM
47
Tabelle 5:
Virologische Analyse bei 12 HIV-positiven MSM mit unterschiedlichen Graden von
analen intraepithelialen Neoplasien
51
5
Verzeichnis der Abbildungen
Seite
Abbildung 1:
Stammbaum der Humanen Papillomviren (de Villiers et al., 2004)
9
Abbildung 2:
Immunhistochemische Färbung von hBD-2 in HPV-assoziierten Hautläsionen bei
HIV-infizierten MSM. (a) HBD-2-Färbung in einer AIN-3-Probe. HBD-2 findet sich
vom Stratum corneum bis zum Stratum granulosum; (b) HBD-2-Nachweis vom
Stratum corneum bis ins Stratum spinosum reichend; (c) Schnitte von psoriatischen
Läsionen dienen als Positiv-Kontrolle; die Psoriasis ist eine Erkrankung, bei der
bekanntermaßen HBD-2 ausgeprägt nachweisbar ist; (d) Hautbiopsien von analer
Mukosa ohne klinische Zeichen von HPV-assoziierter Erkrankung zeigten keine
hBD-2-Expression. Diese histologischen Bilder sind repräsentativ für die gesamten
immunhistologischen Ergebnisse der Studie. Maßstab 50 µm.
48
Abbildung 3:
Immunhistochemische Färbung von hBD-3 in analen intraepithelialen Neoplasien
und Condylomata acuminata bei HIV-infizierten MSM. (a) HBD-3-Färbung in einer
AIN-3-Probe. HBD-3 reicht vom Stratum corneum bis zum Stratum granulosum; (b)
HBD-3-Nachweis vom Stratum corneum bis ins Stratum spinosum; (c) Schnitte von
psoriatischen Läsionen dienen als Positiv-Kontrolle. Die Psoriasis ist eine Erkrankung, bei der bekanntermaßen HBD-3 ausgeprägt nachweisbar ist; (d) Hautbiopsien
von analer Mukosa ohne klinische Zeichen von HPV-assoziierter Erkrankung
zeigten keine hBD-3-Expression. Diese histologischen Bilder sind repräsentativ für
die gesamten immunhistologischen Ergebnisse der Studie. Maßstab 50 µm.
49
6
1
1.1
Einleitung
Einführung
Viren können als ursächliche oder Co-Faktoren im Rahmen der Onkogenese maligner
Tumoren eine wichtige ätiologische Rolle spielen. Die häufigsten kanzerogenen Erreger
sind DNA-Viren wie humane Papillomviren, Epstein-Barr-, Herpes-simplex- und
Hepatitis-B-Viren. Diese Viren dringen in lebende Zellen eines Wirtsorganismus ein und
nutzen zelleigene Synthesesysteme für DNA und Proteine, um Kopien von diesen
herzustellen. Dadurch können sie eine direkte Rolle bei der Karzinogenese spielen, zum
Beispiel durch Expression von Onkogenen oder Inaktivierung von Suppressorgenen, oder
eine indirekte Rolle in der Interaktion von humoraler und zellulärer Abwehr. Zur Zeit wird
vermutet, dass ca. 20 % aller Karzinome auf Infektionen zurückgeführt werden kann (zur
Hausen, 2007).
Seit der Klassifizierung der humanen Papillomviren 16 und 18 als humane Kanzerogene
im Jahre 1995 durch die International Agency for Research on Cancer (IARC) gilt die
pathogene Rolle und onkogene Potenz der HPV als gesichert (WHO, 1995). So ist
beispielsweise das Zervixkarzinom zu 100 % HPV-positiv und weist eine circa 70prozentige Assoziation zu den sogenannten High-Risk(HR)-HPV-Typen 16 und 18 auf.
Die Forschungsergebnisse zur viralen Genese des Zervixkarzinoms lassen sich nach
heutigen Erkenntnissen auf andere Regionen des Anogenitaltraktes, insbesondere auf
Perianalregion und Analkanal übertragen. Eine höhere Inzidenz dieser HPV-assoziierten
Neoplasien zeigen bestimmte Risikogruppen, hierunter immundefiziente Patienten wie
organtransplantierte und HIV-infizierte Männer und Frauen, die das höchste Risiko für die
Entwicklung einer HPV-assoziierten Neoplasie aufweisen. In den letzten 10 Jahren hat sich
klar gezeigt, dass HIV ein Risikofaktor für die Entstehung einer HPV-Infektion und HPVassoziierter Tumoren darstellt. Beispielsweise haben HIV-positive Frauen ein 5-fach
erhöhtes Risiko, zervikale (Ferency et al., 2003) und ein deutlich erhöhtes Risiko anale
Neoplasien zu entwickeln (Frisch et al., 2000; Holly et al., 2001; Klencke und Palefsky,
2003).
HPV-Infektionen des Anogenitaltraktes zählen zu den häufigsten sexuell übertragbaren
Erkankungen weltweit. Aufgrund der onkogenen Potenz einer großen Anzahl von HPVTypen steigt ihre Bedeutung im Rahmen der präventiven und therapeutischen Medizin.
Während bei Immunkompetenten die Infektion mit HPV in der Regel in einer Zeitspanne
7
von 7-15 Monaten durch das körpereigene Immunsystem eliminiert werden kann (Ho et
al., 1998), sind insbesondere Immunsupprimierte (HIV-Infizierte, Organtransplantierte)
von persistierenden HPV-Infektionen betroffen, mit dem Risiko der Ausbildung von
Karzinomvorläuferstufen und HPV-induzierten invasiven Neoplasien. Ungeklärt ist
bislang, wie hier die Interaktion von natürlicher und erworbener Immunabwehr genau
funktioniert. Gesichert ist in diesem Zusammenhang, dass im Rahmen der natürlichen
Abwehr von Mikroorganismen antimikrobiell aktive Peptide in Oberflächenepithelien eine
entscheidende Rolle spielen.
Ziel dieser Studie war es, die Expression einer Auswahl von antimikrobiell wirksamen
Peptiden (AMP) in analen intraepithelialen Neoplasien (AIN) bei HIV-positiven Männern,
die Sex mit Männern haben (MSM), einer Hochrisikopopulation für persistierende HPVInfektionen, nachzuweisen, die Ergebnisse mit denen von HIV-negativen MSM zu
vergleichen und eine mögliche Korrelation zwischen AMP-Expression und läsionalem
HPV-Typ, Art der Läsion oder HIV-Serostatus zu evaluieren. Hierzu wurden
Gewebeproben von analen intraepithelialen Neoplasien HIV-positiver und HIV-negativer
Männer auf das Vorhandensein der antimikrobiell wirksamen Peptide Beta-Defensin 1-3
(hBD 1-3), Cathelicidin LL-37 und des antimikrobiellen Proteins RNase 7 mittels Realtime-PCR untersucht und diese Ergebnisse in Korrelation zu vorhandenen HR-HPV-Typen
und dem Grad der analen intraepithelialen Neoplasie gesetzt.
1.2
Humane Papillomviren (HPV)
1.2.1 Struktur und Taxonomie
Das humane Papillomvirus (HPV) ist ein doppelsträngiges unbehülltes 55-nm
durchmessendes DNA-Virus bestehend aus 8000 Basenpaaren. Das Kapsid ohne
Lipoproteinhülle beinhaltet ein zirkuläres 8-kb-DNA-Genom, das in 3 Regionen unterteilt
werden kann: die nicht-kodierende "long control region" (LCR) mit DNA-Elementen, die
für die Regulation der viralen Transkription und Replikation zuständig ist und Regionen
für sechs frühe („early“) zellregulatorische Gene (E1, E2, E3, E4, E5, E6 und E7) und zwei
späte („late“) strukturelle Proteine (L1, L2) kodiert (Duensing und Münger, 2002;
Abbasakoor und Boulos, 2005).
Über 150 unterschiedliche Genotypen wurden bereits entdeckt, über 110 sind vollständig
klassifiziert. Phylogenetisch werden sie unterteilt in die Genera α-, β-, γ-, µ- und ν-Typ,
und jährlich werden neue Genotypen identifiziert (de Villiers et al., 2004). Alpha-HPV8
Typen infizieren überwiegend Schleimhäute, zur Zeit sind etwa 40 Typen mit
unterschiedlichem karzinogenem Risiko bekannt, während die anderen Genera
überwiegend die Haut infizieren. Genitale HPV-Typen werden aufgrund ihres
unterschiedlichen onkogenen Potenzials in sogenannte Low-Risk(LR)- und HighRisk(HR)-Typen unterteilt. LR-HPV-Typen verursachen beispielweise genitale Warzen
(HPV 6, 11), wohingegen HR-HPV-Typen, insbesondere bei Immunschwäche, ebenfalls in
Warzen, jedoch vor allem in intraepithelialen Neoplasien (IEN) und invasiven Tumoren
nachgewiesen werden. Zu den Low-Risk-Typen zählen HPV 6, 11, 40, 42, 43, 44, 54, 61,
70, 72, 81, CP6 108, als High-Risk-Typen sind 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 55, 56,
58, 59, 68, 73, 82 klassifiziert. HPV 26, 53, 66, 73 und 82 sind als "wahrscheinlich HighRisk" einzustufen (Munoz et.al., 2003). Abbildung 1 zeigt die Einteilung der
unterschiedlichen HPV in die Genera α-, β-, γ-, µ- und ν (de Villiers et al., 2004).
Abbildung 1: Stammbaum der Humanen Papillomviren (de Villiers et al., 2004)
9
1.2.2 HPV-Infektion und Zervixkarzinom
Bereits im 19. Jahrhundert wurden Zusammenhänge zwischen der Entstehung des Zervixkarzinoms und sexuellen Kontakten vermutet (Rigoni-Stern, 1842). In den 1970er Jahren
begann die Forschung über die mögliche onkogene Potenz der humanen Papillomviren (s.
Review zur Hausen, 2009). 1971 wurden humane Papillomviren erstmals elektronenmikroskopisch bei Patienten mit analen Condylomata identifiziert (Oriel et al., 1971; Kovi et al.,
1974), 1972 begannen erste Experimente über den Zusammenhang von Papillomvirusinfektionen und dem Zervixkarzinom (zur Hausen, 2009). 1983 hat die Arbeitsgruppe um
zur Hausen das onkogene HPV 16 aus einem Zervixabstrich isolieren und HPV 16 und 18
in Läsionen des Zervixkarzinoms nachweisen können (Durst et al., 1983; Boshart et al.,
1984; zur Hausen und Schneider, 1987). Es folgte die Isolierung der HPV-Genome aus
nahezu sämtlichen Zervixkarzinompräparaten sowie Vorläuferstufen des Zervixkarzinoms
(Durst et al., 1983; Gillison und Shah, 2003). Diese Forschungen und zahlreiche
darauffolgende Veröffentlichungen konnten bestätigen, dass bei annähernd 100 Prozent
aller Frauen mit Zervixkarzinom HR-HPV-DNA (16, 18, 31, 33, 35, 45, 52, 58)
nachgewiesen werden kann (Lowy et al., 1994; Munoz et al., 2003). HR-HPV 16 stellt den
häufigsten HPV-Typ dar, der 50 % aller Zervixkarzinome ausmacht, bis zu 20 % werden
HR-HPV-Typ 18 zugeschrieben (Glastetter und Kaufmann, 2007). So ist in zahlreichen
epidemiologischen und molekularbiologischen Studien die ätiologische Bedeutung von
Infektionen mit HR-HPV-Typen für die Entwicklung des Zervixkarzinoms eindeutig
belegt (siehe Reviews: zur Hausen, 2000; zur Hausen, 2002; Howley und Lowy, 2007;
Wieland, 2008; zur Hausen, 2009).
1.2.3 Natürlicher Verlauf der HPV-Infektion und virale Onkogenität
Immunkompetente Individuen sind in der Lage, HR-HPV-Infektionen innerhalb von
Monaten und Jahren (Median 8-18 Monate) durch das körpereigene Immunsystem zu
eliminieren (Schneider und Koutzky, 1992). Von 80 Prozent der Frauen wird HPV 16 an
der Zervix in den ersten 2 Jahren eradiziert (Fox und Tung, 2005), in etwa 20 Prozent der
Fälle führt eine persistierende HPV-Infektion zu zytologisch nachweisbaren Veränderungen an der Zervix, nur 1-2 Prozent dieser intraepithelialen Neoplasien gehen über in ein
invasives Karzinom (Koutzky, 1997; Schiffmann et al., 2007).
Die Onkogenität der humanen Papillomviren basiert auf der Fähigkeit, in die Zellteilung
einzugreifen, wobei Mikrotraumata und Abrasionen ihr Vordringen in tiefere Epithellagen
10
vereinfachen, wo sie sich den Zellen der Basalmembran präsentieren (Longworth und
Laimins, 2004). Bis heute ist unklar, ob Papillomviren auch intakte Haut penetrieren
können (Fox und Tung, 2005). Die onkogenen Viren interagieren mit ZellzyklusKontrollmechanismen, was zu erhöhter Zellproliferation in der Latenzphase führt.
Papillomviren replizieren sich im Genom von undifferenzierten Keratinozytenstammzellen
des Epithels. Im Verlauf einer HPV-Infektion kommt es in den Basalzellen von Haut und
Schleimhaut zu einer Überexpression der HPV-Onkoproteine E6 und E7, die in der Folge
wichtige zelluläre Regulationsproteine neutralisieren. Unter anderem durch die
Unterdrückung der Tumorsuppressorgene p53 (E6) und pRB (E7) sowie von
interferonvermittelten Immunantworten führen sie zu Unterbrechung von DNA-Reparaturmechanismen und chromosomaler Instabilität und kurbeln somit die Karzinogenese durch
Akkumulation von onkogenen Mutationen an (Vernon et al., 1993; Palefsky und Holly,
1995; Galloway et al., 1996; Gagne et al., 2005; Wieland, 2008). Die Lebensphase der sich
differenzierenden Keratinozyten, die das Reservoir der humanen Papillomviren darstellen,
wird somit verlängert, wodurch eine verstärkte Virusreifung ermöglicht wird und mit
Zunahme des Grades der intraepithelialen Neoplasie sich virale DNA sukzessive in das
Genom der Wirtszelle einbaut (Duensing und Münger, 2002; Glastetter und Kaufmann,
2007). Ohne die genetische Information von E6 und E7, die in der Basalschicht exprimiert
werden und mit einer großen Anzahl von Wirtszellproteinen interagieren (vgl. Howley und
Lowy, 2007), kann sich ein Karzinom nicht ausbilden. Eine wichtige Rolle spielt hier das
Suppressorgen p53, dessen Funktion darin besteht, die Apoptose anzukurbeln und
Zellwachstum zu bremsen, damit DNA repariert werden kann. Das HPV-Onkoprotein E6
stimuliert Wachstum und Transformation der Wirtszelle, indem es an das OnkosuppressorProtein p53 bindet, das dadurch langsam deaktiviert wird und seine normale onkosupprimierende Funktion verliert (Werness et al., 1990; Duensing und Münger, 2002;
Gonzales Intxaurraga et al., 2002). Das HPV-Onkoprotein E7 induziert zelluläre
Proliferation, indem es das Retinoblastomprotein pRB blockiert, ein Tumorsuppressorgen,
das normalerweise die Transkription der DNA verhindert (Dyson et al., 1992; Fox und
Tung, 2005). In Kombination mit anderen Triggerfaktoren kommt es so über viele Jahre zu
genetischen Veränderungen und chromosomalen Instabilitäten, die letztlich in die
Karzinomentstehung führen (Berry et al., 2004; Welton, 2004). E6- und E7-Co-Expression
führt zusätzlich zu einer erhöhten Anzahl von Zellen, die Zentrosomen-Aberrationen und
multipolare Mitosen aufweisen, im Gegensatz zu Zellen, die nur eines der beiden HPVOnkoproteine exprimieren (Duensing et al., 2000). Andere Early-Gene, wie beispielsweise
11
E2, ein wichtiges Protein im Rahmen der Regulation der viralen Replikation und
Transkription, sind in der Lage, die Level der E6/E7-Gen-Expression maßgeblich zu
beinflussen; der Verlust seiner Repressor-Funktion gegenüber HR-HPV-E6/E7 kann zu
höheren E6/E7-Leveln und somit zu einer Stabilisierung von HR-HPV-DNA und maligner
Transformation führen (Palefsky und Holly, 1995; Longworth und Laimins, 2004; Münger
et al., 2004; Howley und Lowy, 2007). Die Arbeitsgruppe um von Knebel-Döberitz stellt
die Hypothese auf, dass die Inaktivierung von HR-HPV-E2-Gen-Funktionen einen
wesentlichen Schritt für von HR-HPV-E6/E7 induzierte chromosomale Instabilität und
neoplastische Transformation darstellt, deren Konsequenz, nicht Ursache, die Integration
von onkogenen HPV-Genomen in zervikale Läsionen ist (Vinokurova et al., 2008). Auch
E5 wird in der Interaktion mit epidermalen Wachstumsfaktoren eine pathogenetische
Relevanz im Rahmen der onkogenen Transformation zugeschrieben (Howley und Lowy,
2007).
Die Rolle von HPV bei UV-abhängigen, nicht melanozytären Hauttumoren (NMHT) wie
Plattenepithelkarzinomen (SCC) und Basalzellkarzinomen (BCC) ist noch nicht ganz
geklärt, wahrscheinlich kommt es hier zu einer β-HPV-vermittelten Hemmung der UVinduzierten Apoptose. So können Keratinozyten mit kritischen Mutationen in Onkogenen
und Tumorsuppressorgenen überleben und proliferieren. E6-HPV-Proteine interagieren
neben p53 zusätzlich mit dem Apoptose-induzierenden zellulären Protein Bax und
inhibieren so einen entscheidenden Schenkel des zellulären Apoptoseprogramms (Jackson
et al., 2000; Pfister, 2008). Anscheinend sind bereits wenige HPV-positive Keratinozyten,
wie sie bisher in NMHTs nachgewiesen wurden, in der Lage, blockierende Effekte auf
DNA-Reparatursysteme auszuüben und Wachstum und Invasion von Hauttumoren zu
beeinflussen. Pfister vermutet, dass die in der Haut lagernden Papillomviren neben
Immunsuppression
wahrscheinlich
auch
durch
UV-Exposition,
hyperproliferative
Erkankungen (Psoriasis) und spezifischem genetischen Background (Epidermodysplasia
verruciformis) aktiviert werden können (Pfister, 2003; Pfister, 2008).
Bei der Eliminierung von viralen Infektionen spielt neben der körpereigenen auch die
erworbene zellvermittelte Immunabwehr mit intakten T-Lymphozyten und natürlichen
Killerzellen (NK) und den von ihnen freigesetzten Interferonen eine entscheidende Rolle.
Interferone können Zelldifferenzierung, Aktivität der natürlichen Killerzellen (NK), TZell-Zytotoxizität, Makrophagen-Aktivität und mRNA-Expression von Suppressorgenen
fördern. Höchstwahrscheinlich kommt es bei Immunsupprimierten aufgrund einer noch
nicht genau geklärten Störung des komplexen Zusammenspiels von angeborener und
12
adapierter Immunität und von virusspezifischen Charakteristika nicht zu einer adäquaten
interferonvermittelten Immunantwort (Zbar et al., 2002).
Während im Allgemeinen von 20-40 Jahren für den Übergang einer HPV-Infektion in ein
manifestes Zervix- oder Analkarzinom ausgegangen wird, ist die Latenz bei schwerem
Immundefekt oft auf circa 5-10 Jahre verkürzt. Das lange Intervall zwischen Infektion und
onkogener Transformation zeigt, dass nicht allein die persistierende Infektion mit HPV,
sondern andere Wirtsfaktoren wie unter anderem die verminderte zelluläre Aktivität bei
Immundefizienz, ursächlich sind (Howley und Lowy, 2007; Wieland, 2008). Iatrogene
Immunsuppression kann ebenso zu HPV-induzierten intraepithelialen Neoplasien führen
wie die HIV-Infektion, die genauen Mechanismen hierfür sind noch nicht bekannt (Le
Poole et al., 2008). Verlängerte HPV-Genexpression per se erhöht das Risiko der prokarzinogen wirksamen Akkumulation von genetischen Veränderungen (Duensing und
Münger, 2002). Da virale Infektionen im Rahmen der Karzinogenese einer eigenen
Dynamik unterliegen mit großer Variabilität, ist die Darstellung eindeutiger ätiologischer
Zusammenhänge erschwert (Butel, 2000). Auch wenn die Erkenntnisse zur onkogenen
Potenz von HPV stetig wachsen, sind viele Zusammenhänge noch nicht geklärt, wie
beispielsweise die Funktion der LR-E6/E7-Proteine und der anderen, in HR-HPV-DNAAmplifikation und Replikation involvierten, Early-Gene E1, E2, E4 und E5 (Longworth
und Laimins, 2004).
1.2.4 HPV-Infektion und Immunantwort
Humane Papillomviren kommen ubiquitär bei allen Primaten vor, sind extrem
speziesspezifisch und epitheliotrop für mehrschichtiges Plattenepithel von Haut und
Schleimhaut. HPV haben sich im Laufe der Entwicklungsgeschichte an die Spezies
Mensch erfolgreich angepasst und sind in der Lage, sich über lange Zeit in den sich
reproduzierenden Keratinozyten dem Zugriff der angeborenen Immunabwehr zu entziehen
(Immunevasion). Im Rahmen einer HPV-Infektion kommt es charakteristischerweise
weder zu einer stärkeren begleitenden Entzündungsreaktion mit Lyse von Epithelzellen
noch zu einer Virämie oder Langerhanszell-Aktivierung (Frazer et al., 1999; Fausch et al.,
2005; Glastetter und Kaufmann, 2007).
Die primäre HPV-Infektion ist in der Lage, am Ort der Infektion einen Zustand chronischer
Immunsuppression herzustellen. Eine Ursache hierfür scheint die Augmentation der
Interleukin (IL-10)-Expression zu sein, wodurch dendritische Zellen in ihrer Funktion
13
gemindert und vermehrt regulierende T-Zellen (Tregs) aktiviert werden. Diese
unterdrücken die zytotoxische Aktivität von CD4+- und CD8+-Zellen und werden
wahrscheinlich durch immunsuppressive Zytokine wie IL-10 und TGF-β aktiviert. Hinzu
kommt die Blockierung verschiedener Transportmechanismen für die Antigenpräsentation.
Dies erklärt unter anderem die Schwierigkeit des Organismus, HPV- induzierte Läsionen
zu eliminieren, und auch die mangelnde Effizienz neu entwickelter Vakzine auf bereits
bestehenden HPV-Läsionen (Le Poole et al., 2008).
Eine HPV-Infektion verläuft streng intraepithelial und ist hierdurch auch für das adaptive
Immunsystem kaum zugänglich; DNA-Replikation, Genomvermehrung und Expression
viraler Proteine sind auf Stratum granulosum und Stratum spinosum des Plattenepithels
beschränkt (Glastetter und Kaufmann, 2007; Howley und Lowy, 2007). Zellen der
Transformationszonen wie an der Cervix uteri und Linea dentata im Analkanal sind
aufgrund des dort vorhandenen erhöhten Proliferationsgrades der Zellen besonders anfällig
für eine HPV-Infektion, wahrscheinlich aufgrund einer reduzierten Immunabwehr in
diesem Bereich (zur Hausen, 1976; von Knebel-Döberitz et al., 1988).
HPV-Infektionen mit HR-Typen des Genus α und die daraus resultierenden Läsionen
erlangen immer größere Bedeutung in Hochrisikogruppen wie HIV-infizierten Männern,
die Sex mit Männern haben (MSM). Bei mehr als 90 % aller HIV-positiven MSM ist eine
anale HPV-Infektion nachweisbar sowie hohe Raten an analen intraepithelialen Neoplasien
(AIN) (Palefsky et al., 1998a).
1.2.5 Klinik
Humane Papillomviren sind in der Lage, beim Menschen ein weites Spektrum an
Erkrankungen hervorzurufen, von asymptomatischen Infektionen über unterschiedliche
Warzentypen, benigne und maligne epitheliale Tumoren und präkanzeröse Veränderungen
bis hin zu invasiven Plattenepithelkarzinomen (Kreuter et al., 2005). Die Inkubationszeit
kann Wochen bis Monate dauern, die meisten Infektionen verlaufen subklinisch, in 80 %
der Fälle gelingt eine Immunantwort des menschlichen Organismus innerhalb der ersten 12
Monate (Handisurya et al., 2009). Genitale HPV-Infektionen sind für eine Vielzahl
unterschiedlicher Erkrankungen ursächlich: Verrucae vulgares, Condylomata acuminata,
Condylomata gigantea (Buschke-Löwenstein-Tumor), Bowenoide Papulose, Morbus
Bowen der Haut (Carcinoma in situ), hochgradige intraepitheliale genitoanale Neoplasien,
Morbus Bowen der Schleimhaut (Erythroplasie de Queyrat) sowie Plattenepithelkarzinome
14
an Zervix, Vulva, Vagina, Penis und Anus. Neuerdings wurden auch α-HPV-Typen in
periungualen SCC nachgewiesen (Kreuter et al., 2009). Klinisch kommt es entweder zu
kaum sichtbaren Läsionen, meistens bilden sich jedoch erythematöse, papulöse und
verruköse Effloreszenzen. Histologisch findet sich eine Epithelproliferation mit Verlust der
epithelialen Architektur, Hyperkeratose, Dyskeratose, Mitosen und Kernatypien. Als
klinisches Korrelat manifestiert sich exophytisches oder endophytisches Wachstum (Fox
und Tung, 2005).
1.3
Anale intraepitheliale Neoplasie (AIN)
1.3.1 Zytologische, histologische und klinische Einteilung der AIN
Die anale intraepitheliale Neoplasie (AIN) wurde 1981 erstmals von Fenger und Nielsen,
die ersten möglichen Analogien von zervikaler intraepithelialer Neoplasie (CIN) und AIN
1989 von Scholefield et al. beschrieben und in den folgenden Jahren von verschiedenen
Autoren das Grading der AIN dem der CIN gleichgesetzt (Fenger und Nielsen, 1981;
Scholefield et al., 1989; Abbasakoor und Boulos, 2005; Herat et al., 2007). Vergleichbar
der Klassifikation der zervikalen Zytologie kann man anale Zytologien entsprechend der
Bethesda-Klassifikation einteilen in „normal“ (N), „atypical squamous cells of
undetermined significance“ (ASCUS), „low-grade squamous intraepithelial lesion“ (LSIL),
„high-grade intraepithelial lesion“ (HSIL), „atypical squamous cells, cannot exclude
HSIL“ (ASC-H), und das invasive Karzinom (revidierte Bethesda-Klassifikation)
(Solomon et al., 2002; Crothers, 2005).
Histologisch gibt es in Analogie zur CIN drei Stadien der AIN: AIN 1 bleibt auf das untere
Drittel des Epithels beschränkt, AIN 2 weist höhergradige Epithelveränderungen bis in die
oberen zwei Drittel der Epidermis auf, und AIN 3 erfasst die gesamte Epidermis (Tabelle
1). Im Rahmen der Entwicklung von AIN 1 zu AIN 3 kommt es zum Schichtverlust in der
Epidermis mit Kernpolymorphie, Hyperchromasie und abnormalen Mitosen. AIN 3 weist
im Vergleich zu AIN 1 und 2 eine höhere Angiogeneserate und eine geringere
Apoptoseaktivität auf.
Klinisch wird die AIN in 4 Subtypen: bowenoide, erythroplakische, leukoplakische und
verruköse AIN eingeteilt. Kreuter et al. konnten zeigen, dass verruköse AIN meist HighGrade-Läsionen mit 100-prozentigem HPV-16-Nachweis waren, wohingegen leukoplakische AIN zu 55 % Low-Grade-Läsionen waren. Wahrscheinlich ist eine besondere
epitheliale Proliferationsinduktion durch HPV hierfür ursächlich (Kreuter et al., 2005).
15
Tabelle 1: Histologische Stadien der analen intraepithelialen Neoplasie (AIN)1
Grad
Dysplasie Grad der
Krebsvorstufe
Histologie
epithelialen
Läsion
AIN 1 Milde
Low-Grade =
Unwahrscheinlich Geringe Zellkernatypie,
Dysplasie unteres Drittel
Koilozytose möglich,
betroffen
Zellen mit vergrösertem
irregulären Kern, Anzeichen des zytopathischen
Effektes von HPV
AIN 2 Moderate
High-Grade =
Möglich
Dysplasie untere und
Die Hälfte des Epithels
durch kleine basaloide
mittlere Epidermis
Zellen mit erhöhter
betroffen
Kern/Zytoplasma-Ratio
ersetzt
AIN 3 Schwere
High-Grade =
Dysplasie gesamte
Wahrscheinlich
Fast alle Zellen des
Epithels durch basaloide
Epidermis
Zellen mit erhöhter
betroffen
Kern/Zytoplasma-Ratio
ersetzt
1
Quelle: Kreuter et al., 2003
1.3.2 AIN und HPV
Bestimmte Epithelien sind leichter durch HPV infizierbar als andere; hierzu zählt das
Epithel von Zervix, Anus, Vulva, Penis, Vagina und Oropharynx. Entsprechend der
histologischen Einteilung der CIN werden je nach Lokalisation folgende Läsionen
differenziert: vulväre (VIN), vaginale (VAIN), penile (PEIN), perianale (PAIN) und anale
intraepitheliale Neoplasien (AIN). Anale intraepitheliale Neoplasien sind die Folge einer
chronischen Infektion der perianalen Haut, des Analkanals und der Transformationszone
mit humanen Papillomviren (HPV) und gehen meist mit hoher Viruslast für HPV einher
16
(Fox, 2006). Zahlreiche Untersuchungen konnten nachweisen, dass im Analkanal und
perianal ebenso wie an der Zervix Infektionen mit HR-HPV einen Hochrisikofaktor für die
Entstehung intraepithelialer Neoplasien darstellen und HSILs als potentielle Vorläuferläsionen des Analkarzinoms einzustufen sind (Holly et al., 2001; Chang et al., 2004). Eine
unbekannte Zahl von HSIL (AIN 2/3) geht mit der Zeit in ein invasives squamöses
Analkarzinom über, wohingegen LSIL(AIN 1)-Läsionen sich spontan zurückbilden können
(Scholefield et al., 1989). Die genauen Mechanismen für diese Regression bzw. die
fortschreitende Entwicklung in ein invasives Karzinom des Analrandes und des Analkanals
sind bis heute noch nicht ganz verstanden. Immundefizienz scheint ein wesentlicher Faktor
in der Pathogenese von AIN und Progression in ein Analkarzinom zu sein.
1.3.3 HPV-Infektion und AIN bei HIV-infizierten MSM
Anale HPV-Infektionen sind sehr häufig bei MSM und HIV-positiven Männern,
unabhängig von sexuellen Vorlieben und sexueller Orientierung (Wilkins et al., 2006;
Palefsky et al., 2007). Im Rahmen von Untersuchungen zu Co-Faktoren wurde zunächst
vermutet, dass anale intraepitheliale Neoplasien lediglich bei Analverkehr praktizierenden
Männern und Frauen aufgrund der höheren mechanischen Belastung im Analbereich
auftreten (Daling et al., 1982; Daling et al., 1987). Die Arbeitsgruppe um Palefsky
untersuchte in diesem Zusammenhang die Prävalenz von AIN bei HIV-positiven i.v.-DrugUsern und HIV-positiven MSM. In beiden Gruppen wurden ähnliche Raten an HSIL
gefunden, ohne dass anamnestisch Analverkehr praktiziert wurde, so dass die Autoren trotz
verschiedener Schwächen der Studie spekulieren, dass vor allem eine zugrundeliegende
Immunsuppression Hauptrisikofaktor für die Entstehung HPV-assozierter genitoanaler
intraepithelialer Neoplasien ist (Piketty et al., 2003).
Die Prävalenz anogenitaler HPV-Infektionen, insbesondere derjenigen, die mit multiplen
onkogenen HPV-Typen einhergehen, und das damit verbundene Risiko, ein Analkarzinom
zu entwickeln ist bei HIV-infizierten MSM deutlich erhöht (Palefsky und Holly, 2003;
gambichler). Die fortwährende hohe HPV-Exposition mit immer wieder neuen HR-HPVTypen bei ausgeprägter sexueller Aktivität über Jahrzehnte bei HIV-positiven MSM ist
nach heutigen Erkenntnissen einer der Hauptrisikofaktoren für die Ausbildung von analen
intraepithelialen Läsionen und nachfolgender persistierender High-Grade-AIN und
Ausbildung eines Analkarzinoms in dieser Hochrisikopopulation (Chin-Hong et al., 2005).
17
Palefsky et al. fanden in einer Untersuchung HR-HPV-DNA in 85 % der AIN- und
Analkarzinom-Biopsien von HIV-Infizierten (Palefsky et al., 1991); die Arbeitsgruppe um
Kreuter konnte bei 19,4 % von 103 untersuchten HIV-infizierten Männern unter
hochaktiver antiretroviraler Therapie (HAART) eine AIN und bei 86 % HPV-DNA
nachweisen, der häufigste Subtyp war HPV 16 mit 56 % und trat oft neben anderen HRHPV-Typen auf (Kreuter et al., 2005). Die Interims-Analyse der Daten des Deutschen
Kompetenznetzwerks HIV/AIDS (12/2003 bis 08/2008, Bochumer Kohorte) ergab 90 %
HPV-Positivität in 1612 Abstrichen von insgesamt 489 HIV-positiven MSM. HPV 16, 18
und 58 waren die am häufigsten nachgewiesenen HPV-Typen, in 80 % der Fälle fanden
sich durchschnittlich 4,5 HPV-Typen (maximal 18). Kreuter et al. fanden bei 263 HIVpositiven MSM eine AIN-Prävalenz von 59,3 % (156/263), davon bei 28 % eine LGDysplasie (AIN 1/LSIL) und bei 31 % (82/263) eine HG-Dysplasie (AIN 2, AIN 3/HSIL);
2,8 % hatten ein Analkarzinom, davon 5 Plattenepithelkarzinome (SCC) und 1
Adenokarzinom (Kreuter et al., 2008a). Diese Daten decken sich mit weiteren Daten von
Palefsky et al.: 81 % von 357 HIV-positiven MSM wiesen eine AIN auf, davon 52 % eine
hochgradige AIN II und IIII, ohne dass die Einnahme der HAART assoziiert mit einer
erniedrigten AIN-Prävalenz war (Palefsky et al., 2005). Nach Vermutung der Arbeitsgruppe vollzieht sich die Progression von normalem Epithel zu einer HG-AIN nach HPVInfektion bei HIV-positiven MSM wahrscheinlich schneller als bei HIV-negativen
Individuen (Palefsky et al., 2005).
In einer 1995 veröffentlichten Studie von Chritchlow aus Seattle (USA) wurde bei 15 %
von 158 HIV-positiven MSM und bei 7 % der 147 HIV-negativen MSM innerhalb von 2
Jahren die Entwicklung einer AIN entdeckt, bei einer CD4+-Zellzahl unter 500/µl und
persistierenden Infektionen mit HPV 16 und 18 (Chritchlow et al., 1995). Die
Arbeitsgruppe um Palefsky und Holly verglichen in einer ihrer Untersuchungen in San
Francisco (USA) das Auftreten von HPV-Infektionen bei 346 HIV-positiven und 262 HIVnegativen MSM und konnten feststellen, dass 269 (93%) der HIV-positiven MSM im
Vergleich zu 122 (61 %) der HIV-negativen MSM eine Infektion mit HPV in Anus und
Analkanal aufwiesen. Zwei Drittel der HIV-positiven MSM hatten deutlich häufiger
multiple HPV-Typen im Vergleich zu den HIV-negativen MSM (Palefsky et al., 1998c).
Bei 52 % von 346 HIV-positiven MSM wurde eine AIN festgestellt im Vergleich zu 17 %
der 262 HIV-negativen MSM (Palefsky et al., 1998c), und innerhalb von 2 Jahren vollzog
sich bei 62 % der HIV-positiven Patienten sich eine Progression von LG-AIN zu HG-AIN
vollzog (Palefsky et al. 1998b; Palefsky, 2007).
18
In einer retrospektiven Studie zur Inzidenz von perianalen und intraanalen epithelialen
Neoplasien in exzidierten Condylomata acuminata von 115 Männern und 38 Frauen, HIVinfiziert und nicht-HIV-infiziert, in dem Zeitraum Dezember 1995 bis Dezember 2004,
wurden die höchsten Raten intraepithelialer Neoplasien bei HIV-positiven Männern
festgestellt (McCloskey et al., 2007). Bei 52 % der HIV-infizierten Männer wurde eine
peri- oder intraanale HG-AIN festgestellt, im Gegensatz zu einer Rate von 20 % bei nichtHIV-infizierten Männern. Von 19 HIV-positiven Rauchern hatten 11 eine AIN 3, im
Gegensatz zu 43 nicht-HIV-infizierten Rauchern, von denen lediglich 3 eine AIN 3 in den
untersuchten Condylomata aufwiesen. Ein hoher Anteil der Condylomata wiesen LR-HPVTypen neben HR-HPV-Typen auf, und bei den HIV-infizierten Männern zeigte sich eine
höhere Viruslast der vorhandenen LR-HPV-Typen. In der Regel gelten Condylomata
acuminata als benigne Hautläsionen, über maligne Konversionen wurde jedoch vereinzelt
berichtet (Siegel et al., 1962; Smedley, 1988). Bezugnehmend auf eine Arbeit von
Gissmann et al. konstatieren McCloskey et al., dass manche LR-HPV-Typen das Potenzial
haben, diese maligne Transformation zu fördern, wie beispielsweise HPV 11 das
Entartungsrisiko durch HR-HPV-Typ potenzieren kann, und implizieren, dass dies
möglicherweise bei Immunsupprimierten häufiger in Gang gesetzt wird (Gissmann et al.,
1983; Unger et al., 1997; McCloskey et al., 2007).
Seit Einführung der hochaktiven antiretroviralen Therapie (HAART) zur Therapie der
HIV-Infektion Mitte der 1990er-Jahre beobachtet man einen deutlichen Rückgang HIVassoziierter opportunistischer Infektionen und AIDS-definierender Neoplasien. AIDS ist
nach wie vor nicht heilbar, Mortalität und Morbidität sind jedoch unter HAART signifikant
rückläufig. Viele Erkrankungen wie beispielsweise das Kaposi-Sarkom, Epstein-BarrVirus-assoziierte Lymphome, generalisierte Herpes-Infektionen, Zyto-megalievirusassoziierte Retinitis werden heute viel seltener beobachtet, allerdings haben HIV-Infizierte
nach wie vor ein 1,5 bis 2,0-faches Risiko, diese opportunistischen Infektionen zu
entwickeln (Wilkens et al., 2006). Der Einfluss der HAART auf HPV-induzierte anale
Neoplasien, die als Präkursorläsionen des Analkarzinoms einzustufen sind, scheint zum
heutigen Zeitpunkt eher gegenläufig zu sein. Die Beobachtung dieses Trends zieht sich
durch viele Publikationen der letzten 10 Jahre (s.u.a. Goedert et al., 1998; Grulich et al.,
2002; Bower et al., 2004; Hessol et al., 2007; Patel et al., 2008). Man beobachtet, dass
generell Erkrankungen mit langer Latenzzeit bei HIV-Infizierten häufiger auftreten,
aufgrund wesentlich verlängerter Überlebenszeiten unter HAART. So zeigt sich seit
Beginn der HAART-Ära eine zunehmende Inzidenz HPV-induzierter anogenitaler
19
Infektionen und Neoplasien bei HIV-infizierten MSM, vereinzelt existieren auch Daten
über HIV-infizierte Frauen, bei denen ebenfalls eine erhöhte Inzidenz von AIN und
Analkarzinom beobachtet wurde (Frisch et al., 2000; Palefsky und Holly, 2003; Durante et
al., 2003; Schlecht et al., 2005; Strickler et al., 2005; Palefsky, 2006). Zusätzlich wurden
hohe Raten von Condylomata acuminata bei HIV-positiven MSM seit Beginn der
HAART-Ära registriert (Abramowitz et al., 2007).
Frisch et al. bestätigten in ihrer Analyse von mehr als 300000 Patientendaten (Datenbank
der Multicenter AIDS Cancer Match Studie U.S.), dass HIV-Infizierte ein stark erhöhtes
Risiko haben, verschiedenste Typen anogenitaler HPV-assoziierter Karzinome und deren
Vorstufen zu entwickeln. Laut Autoren ist dieses Risiko 5 Jahre vor und 5 Jahre nach dem
Übergang der HIV-Infektion in das Stadium AIDS erhöht und bezieht sich auf beide
Geschlechter. Zurückzuführen ist dieses erhöhte Risiko wahrscheinlich auf eine
verminderte Fähigkeit des HIV-infizierten Organismus, eine bestehende HPV-Infektion zu
beseitigen. Die Autoren gingen insbesondere der Frage nach, inwieweit die Entwicklung
anogenitaler HPV-induzierter Tumoren vom Stadium der Immundefizienz beeinflußt ist
(Frisch et al., 2000). Das verkürzte Intervall der Progression eines Carcinoma in situ in ein
invasives Analkarzinom und das junge Alter der Patienten bei Auftreten des Karzinoms im
Stadium AIDS ist möglicherweise auf zwei Faktoren zurückzuführen: zum einen kommt es
in schnell proliferierenden Zellen zu einem erhöhten genetischen Schaden, da ihre
Fähigkeit
zu
Apoptose
und
Zellteilungsstopp
durch
die
HPV-E6-mediierte
Herunterregulierung von p53 verhindert wird; zum anderen spielen wahrscheinlich andere
Co-Faktoren im späteren Stadium im Übergang von AIN zum Analkarzinom bei HIVInfizierten eine Rolle (Werness et al., 1990; Frisch et al., 2000). Wie in vorangegangenen
Studien konnte in dieser Analyse eine Korrelation zwischen dem erhöhten Risiko, eine
HSIL zu entwickeln, und der CD4+-Zellzahl festgestellt werden. HIV-infizierte Patienten
mit niedriger CD4+-Zellzahl wiesen eine höhere Inzidenz von Carcinomata in situ und
invasiven anogenitalen Karzinomen auf, wobei keine Unterschiede zwischen sehr niedriger
CD4+-Zellzahl (unter 100/µl) und niedriger CD4+-Zellzahl (unter 200/µl) festgestellt
wurden. Chritchlow, 1995, und Palefsky, 1998, berichten über ein 3-fach erhöhtes relatives
Risiko (RR) für HSIL bei HIV-infizierten MSM mit einer CD4+-Zellzahl bereits unter
500/µl und vor allem bei CD4+-Zellen unter 200/µl im Vergleich zu HIV-negativen MSM
(Chritchlow et al., 1995; Palefsky et al., 1998b).
In vielen Studien konnte nachgewiesen werden, dass die Entwicklung eines Anal- oder
Zervixkarzinoms bei HIV-infizierten Männern und Frauen nicht von CD4+-Level oder
20
HIV-DNA-Level abhängt, sondern unter anderem die Dauer der HIV-Infektion der
signifikante Faktor ist (Fagan et al., 2005; Palefsky, 2006). Es scheint, dass erniedrigte
CD4+-Level für die Entwicklung einer AIN 3 und CIN 3 entscheidender sind als im
Stadium der Progression zum invasiven Karzinom. Hierfür wird die E6/E7-vermittelte
chromosomale Instabilität verantwortlich gemacht, die zu genetischen Schäden im
Wirtsorganismus führt, die mit der Amplifikation von Tumor-Promotor-Genen und der
Verminderung von Tumor-Suppressor-Genen einhergehen (Palefsky, 2006). Das HIV-TatGen scheint die E2-abhängige Expression von E6 und E7 in infizierten Keratinozyten zu
steigern und somit eine der Ursachen für die hohe Inzidenz von AIN bei vorliegender HIVInfektion zu sein (Vernon et al., 1993). Die Frage, ob in Anwesenheit einer erhöhten HPVBesiedlung die HIV-induzierte Immundefizienz lediglich Co-Faktor bei der Progression
einer HSIL zum Analkarzinom, oder ob die Immundefizienz durch HIV das direkt
auslösende Agens ist, kann noch nicht eindeutig beantwortet werden. Es ist nach heutigen
Daten jedoch hochwahrscheinlich, dass diese Progression auf einen vermehrten genetischen Schaden in schnell proliferierenden Zellen aufgrund einer entgleisten Zellzykluskontrolle zurückzuführen ist (Frisch et al., 2000; Palefsky und Holly, 2003). Es wird
vermutet, dass es HIV-assoziiert zu einer früheren Ausbildung von intraepithelialen
Neoplasien kommt, die eigentliche Entwicklung hin zum manifesten Karzinom ist jedoch
wahrscheinlich nicht direkt auf die Immunsuppression zurückzuführen (Palefsky und
Holly, 2003). Möglicherweise gibt es bei HIV-Infizierten eine Art "antigenspezifische
Nicht-Immunantwort" der zytotoxischen T-Zellen auf vorhandene onkogene HPV-PeptidSequenzen, die vom Grad der zugrundeliegenden Immundefizienz abhängt (Zbar et al.,
2002).
Der Verlust der zellvermittelten Kontrolle über HPV-infizierte Keratinozyten scheint
jedoch bereits bei CD4+-Leveln weit über 200/µl zu beginnen. Dies deckt sich auch mit
Daten zu anogenitalen Tumoren bei iatrogen immundefizienten Organtransplantierten
(Penn et al., 1986; Chritchlow et al., 1995; Frisch et al., 2000). Neben der CD4+-Zellzahl
sind onkogene HR-HPV-Typen und die Infektion mit multiplen HR-HPV-Typen weitere
Risikofaktoren für die Entwicklung einer AIN bei zugrundeliegender HIV-Infektion
(Frisch et al., 2000; Wilkins et al., 2006). Unklar ist auch, welche Rolle es spielt, dass bei
immunsupprimierten Männern und Frauen oft mehrere HR-HPV-Typen in gleicher Läsion
nachgewiesen werden können und inwieweit unterschiedliches Alter und Co-Faktoren wie
Rauchen und Medikation zusätzlich die Inzidenz analer Dysplasien beeinflussen. Rauchen
als Co-Faktor für die Entstehung eines HPV-assoziierten Analkarzinoms bei Männern und
21
Frauen wurde unter anderem von Daling et al. in ihrer Arbeit zur Genese des
Analkarzinoms und von Bendell et al. thematisiert (Holly et al., 1989; Bendell und Ryan,
2003; Daling et al., 2004).
1.4
Analkarzinom bei HIV-infizierten MSM
Das Analkarzinom ist eine eher seltene Entität, es macht weniger als 1 % aller Karzinome
des Gastrointestinaltraktes aus. Die Prävalenz in der Gesamtbevölkerung liegt zwischen
1,5-1,7 pro 100000 Einwohnerzahl (USA 2,0 pro 200000), mit geringgradig höherer
Prävalenz bei Frauen als bei Männern und ist bei beiden Geschlechtern in den letzten 30
Jahren stark angestiegen mit weiterhin steigender Tendenz (Abbasakoor und Boulos,
2005). Der Altersmedian liegt bei etwa 65 Jahren, bei HIV-infizierten Männern liegt der
Altersgipfel noch vor dem 45. Lebensjahr. Während lange vermutet wurde, dass das
Analkarzinom aufgrund eines chronischen Entzündungsgeschehens im Analbereich
entsteht, weiß man inzwischen aus vielen klinischen und epidemiologischen Studien der
letzten 30 Jahre, dass es in fast allen Fällen mit chronisch-persistierender HPV-Infektion
assoziiert ist (Bendell und Ryan, 2003).
Vor der AIDS-Ära lag die Prävalenz des Analkarzinoms bei Männern, die Sex mit
Männern haben (MSM) bei 35 per 100000, vergleichbar der Prävalenz des
Zervixkarzinoms bei Frauen vor der Einführung der routinemäßig durchgeführten
Abstriche nach Papanicolaou (Pap) (Daling et al., 1987). Bei HIV-positiven MSM ist die
Prävalenz mehr als doppelt so hoch (Goedert et al., 1998), und auch HIV-infizierte Frauen
weisen eine deutlich höhere Analkarzinomrate auf (Durante et al., 2003; Palefski und
Holly, 2003). In den USA ist die Prävalenz des Analkarzinoms bei HIV-infizierten MSM
höher als die des Zervixkarzinoms bei Frauen (Chin-Hong et al., 2005). Bei HIVinfizierten MSM ist das relative Risiko (RR) für die Entwicklung einer AIN um das 60fache, das eines Analkarzinoms um das 38-fache im Vergleich zur Normalbevölkerung
erhöht (Frisch et al., 2000). In einer Kohorte in den USA von 14210 Erwachsenen mit
AIDS
wurde
das
Analkarzinom
als
zweithäufigste
nicht-AIDS-definierende
Tumorerkrankung herauskristallisiert (San Francisco AIDS Surveillance Register) (Hessol
et al., 2007).
Für HIV-positive MSM unter 30 Jahren steigt das RR, eine AIN bzw. ein Analkarzinom zu
entwickeln im Vergleich zum Normalkollektiv auf das 130- bzw. das 162-fache (Frisch et
al., 2000). Bei HIV-negativen MSM liegt die Analkarzinom-Rate bei 35 von 100000, die
22
Prävalenz bei HIV-positiven Männern liegt wahrscheinlich höher noch als bei den in der
Literatur angegebenen 70 von 100000, Diamond et al. berichten von 224 Fällen pro
100000 Einwohnerzahl (Diamond et al., 2005).
In unterschiedlichen Publikationen wurden Hochrisikopopulationen für die Entwicklung
von analen intraepithelialen Neoplasien und eines Analkarzinoms beschrieben, hierzu
zählen Organtransplantierte, Frauen mit zervikalen intraepithelialen Neoplasien, Menschen
mit multiplen Sexualkontakten und häufig wechselnden Sexualpartnern, Analverkehrpraktizierende MSM und HIV-infizierte Männer und Frauen (Palefsky et al., 1998b;
Diamond et al., 2005). Organtransplantierte haben beispielsweise ein 10-bis 100-fach
höheres Risiko für eine HG-AIN bzw. ein Analkarzinom als die Normalbevölkerung,
wobei Frauen doppelt so häufig betroffen sind (Penn et al., 1986). Es scheint eine gewissse
Heterogenität hinsichtlich der Genese des Analkarzinoms vorzuliegen: das HPV-negative,
nicht AIN-assoziierte, gut keratinisierte Anal(rand)karzinom findet sich eher bei älteren
Männern, während bei jüngeren homosexuell aktiven Männern AIN-Assoziation und
häufig die HPV-Typen 16, 18, 31 und 33 nachgewiesen werden können und das
(plattenepitheliale) Analkarzinom eher im Analkanal lokalisiert ist (Frisch et al., 1999).
Unklar sind bislang die genauen Faktoren, die die Progression einer AIN 3 in ein invasiv
wachsendes Analkarzinom anstoßen. Es wird spekuliert, dass die Transformation von HGAIN in ein invasives Karzinom unter anderem auf die höhere Angiogeneserate und einen
Verlust der Langerhanszellfunktion im Anoderm zurückzuführen ist. Auch das TumorSuppressorgen p53 spielt als möglicher Progressionsmarker eine Rolle (Sobhani et al.,
2002; Mullerat et al., 2003). Die Progression hängt auch von zusätzlichen, noch nicht in
allen Einzelheiten geklärten Co-Faktoren (Rauchen, immunsuppressive Therapien mit
Glukosteroiden und anderen Immunsuppressiva), der klinischen Ausprägung und
zugrundeliegender Schwere und Dauer einer Immunsuppression ab (Bendell und Ryan,
2003; Scholefield et al., 2005). Eine entscheidende Rolle in der Pathogenese des HPVassoziierten Analkarzinoms vergleichbar dem Zervixkarzinom wird den onkogenen HRHPV-Typen zugeschrieben. Beide Tumorerkrankungen werden fast ausschließlich durch
HPV verursacht (Frazer et al., 1986; Palmer et al., 1998; Ho et al., 1998; Sobhani et al.,
2004).
In einer Studie, die Inzidenzen verschiedener Karzinomtypen bei 54780 HIV-positiven
Individuen in zwei großen prospektiven Kohorten in den USA untersuchte, zeigten sich
unter den nicht-AIDS-definierenden Malignomen die höchsten Inzidenzraten für das
Analkarzinom, kontinuierlich ansteigend von 1992 bis 2003 (Patel et al., 2008). Es ist
23
davon auszugehen, dass es zukünftig aufgrund der HIV/HPV-Co-Infektion und die durch
HAART verlängerten Überlebensraten zu einem noch stärkeren Anstieg der Inzidenz des
Analkarzinoms kommen wird.
1.5
Penile und oropharyngeale HPV-assoziierte Tumoren bei HIV-positiven MSM
HIV-positive MSM haben neben dem stark erhöhten Risiko für das Entstehen einer AIN
auch ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung anderer HPV-induzierter Tumoren und deren
Vorläufer. Kreuter et al. konnten in ihrer prospektiven Studie an HIV-positiven MSM
(n=263) neben dem Auftreten einer AIN bei 156 Patienten (entsprechend 59,3 %) bei 10
Patienten auch eine penile intraepitheliale Neoplasie (PEIN) feststellen, bei 8 Patienten
eine HG-PEIN, bei einem Patienten fand sich eine PEIN ohne AIN (Kreuter et al., 2008c).
In sämtlichen PEIN-Läsionen fanden sich α-HR-HPV-Typen, meistens HPV 16, und in der
Regel mehrere HR-HPV-Typen in einer Läsion. Bislang ist die penile HPV-Prävalenz
niedriger bei HIV-positiven MSM als die anale und es gibt noch nicht viele
Untersuchungen zu dem Thema. Es scheint jedoch so zu sein, dass in der Regel eine PEIN
bei niedriger CD4+-Zellzahl auftritt und bei HIV-Infizierten auch der Übergang einer PEIN
in ein Peniskarzinom häufiger ist und sich schneller vollzieht. Eindeutige Daten liegen
hierzu bislang nicht vor. Die Autoren postulieren, bei HIV-positiven MSM neben dem
AIN-Screening auch ein Screening auf das Vorliegen einer PEIN durchzuführen.
Verschiedenen
Untersuchungen
zufolge
stellen
HIV-positive
MSM
auch
eine
Hochrisikogruppe für die Entstehung oropharyngealer Tumore dar. Frisch et al. konnten in
ihren Publikationen von 1999 und 2000 herauskristallisieren, dass HIV-infizierte Individuen und Individuen mit anogenitaler HPV-assoziierter Neoplasie ein 2- bis 6-fach höheres
Risiko haben, ein oropharyngeales oder Tonsillenkarzinom zu entwickeln (Frisch et al.,
1999; Frisch et al., 2000). Es gibt wenig Daten zu oraler HPV-Infektion bei HIV-positiven
MSM. Kreuter et al. analysierten die Daten von 306 HIV-positiven Patienten (Bochumer
Kohorte), von denen 24 % eine HPV-Infektion aufwiesen mit HPV 16 als häufigstem
Subtyp (26 %). Nur 5 % hatten klinische Läsionen. Kreimer et al. untersuchten 190 HIVpositive Männer und Frauen, von denen 25 % eine orale HPV-Infektion hatten, 13,7 % mit
HR-HPV (Kreimer et al., 2004).
In den meisten oropharyngealen Tumoren wurden bislang die HR-HPV-Typen 16, 31 und
33 nachgewiesen. Wenn man davon ausgeht, dass diese HR-HPV-Typen in verstärkter
Prävalenz bei HIV-positiven MSM auftreten, ist zu vermuten, dass diese Population
24
ähnlich
dem
Analkarzinom
zukünftig
auch
häufiger
Karzinome
des
oberen
Respirationstraktes ausbilden wird. Allerdings gibt es hier zur Zeit noch viele ungeklärte
Faktoren, zum Beispiel die Bedeutung der Unterschiedlichkeit von oraler und genitaler
Mukosa sowie anderer Einflussfaktoren (Sexualverhalten, Alkohol, Rauchen, Alter,
Lebensstil u.a.). Yochim et al. gehen in ihrer Untersuchung oraler Epithelzellen von einem
kombinierten Effekt von HR-HPV und HIV-Tat-Gen zur malignen Zelltransformation aus;
sie konnte eine Verstärkung der HR-HPV-Expression durch HIV-Tat nachweisen (Yochim
et al., 2005). Die ätiologische Bedeutung der HPV-Infektion für die Onkogenese
bestimmter Tumoren bei vorhandener HIV-Infektion muss weiter untersucht werden, um
hier differenzierte Aussagen auch hinsichtlich möglicher Risikofaktoren treffen zu können.
1.6
Antimikrobiell wirksame Peptide (AMP)
1.6.1 AMP in der menschlichen Haut
Für den menschlichen Körper ist die Abwehr verschiedener Mikroorganismen wie Viren,
Bakterien und Pilze überlebenswichtig. Für dieses Überleben ist eine ständige
Koordination zwischen angeborener und adaptierter Immunabwehr essenziell, um das
Entstehen von Infektionen zu verhindern. Die Haut fungiert als Grenzflächenorgan
zwischen Organismus und Umwelt und ist dicht besiedelt mit Mikroorganismen, die bei
intakter Abwehr die physikalische Barriere nicht durchdringen können. Stratum corneum
und Stratum granulosum der Haut bestehen aus Schichten von terminal differenzierten
Keratinozyten, die neben anderen Komponenten die physikalische Hautbarriere darstellen.
Eine Strategie der gesunden Haut bzw. Schleimhaut ist es, mittels fortwährender
Desquamation bzw. Schleimbildung die große Anzahl von Mikroorganismen (102-107/cm2)
konsequent in Schach zu halten und zu eliminieren (Boman, 1998; Schröder und Harder,
2006). Es wird zunehmend beschrieben, dass die Haut neben physikalischer Barriere und
damit verbundener Funktion, Mikroorganismen direkt über die Lipidschicht und durch
aktive Phagozytose abzuwehren, auch über eine sogenannte chemische Barriere verfügt,
deren Hauptwirkort wahrscheinlich im Stratum corneum der Epithelzellen liegt (Schröder
und Harder, 2006).
Man geht heute davon aus, dass sich die Immunantwort von Haut und Schleimhaut in drei
Kompartimenten abspielt: 1. der epithelialen Abwehr mit antimikrobiellen Peptiden und
Proteinen, 2. der angeborenen, antientzündlichen Immunabwehr, mit der, vermittelt über
sogenannte Toll-like Rezeptoren, mikrobielle Komponenten erkannt und Signalpfade
25
aktiviert werden können, um sowohl proinflammatorische Zytokine als auch Gene der
adaptiven Immunabwehr zu aktivieren, und 3. der adaptiven Immunabwehr, deren Aktion
auf Antigen präsentierenden Zellen sowie T- und B-Zellen basiert (Meyer et al., 2007).
Kommt es zu einer Verletzung im Stratum corneum der Haut oder der Lamina epithelialis
der Mukosa, bildet sich eine Eintrittspforte für pathogene Mikroorganismen; bei
Epithelkontakt wird die angeborene Immunabwehr mit sofortiger Immunantwort aktiv
durch Interaktion verschiedener zellulärer Bestandteile wie neutrophiler Granulozyten,
Makrophagen, natürlichen Killer-, Mast-, Epithel- und Endothelzellen, und dendritische
Zellen werden angeregt, primäre (IL-1, TNF-α, IL-6) und sekundäre Zytokine (IL-8 und
andere) zu synthetisieren (Wehkamp et al., 2007). Parallel kommt es in den Keratinozyten
zur Induktion von antimikrobiellen Peptiden und Proteinen (AMP), die ihrerseits Zellen
der erworbenen Immunabwehr aktivieren wie Langerhanszellen, dendritische und
Memory-T-Zellen und die Immunantwort initiieren (Schröder, 2003). Unausgereifte
dendritische Zellen können dann durch den Defensin-Antigen-Komplex angeregt werden,
sich zu entwickeln und das mikrobielle Agens aufnehmen (Yang et al., 1999). Bei der
Neutralisation eindringender Mikroorganismen kommt somit wahrscheinlich diesen AMP
eine Schlüsselrolle zu, sie werden in den obersten Hautschichten produziert und dort
freigesetzt. Insgesamt wurden bisher über 500 AMP in Pflanzen, Insekten, Amphibien und
Säugetieren beschrieben (Schröder, 1999; Ganz, 1999; Schröder, 2002). Es handelt sich
um kleinere (Peptide) oder größere Proteine, die entweder konstitutiv sind oder aber erst
durch die Präsenz der Mikroorganismen oder durch endogene proinflammatorische
Zytokine im Rahmen der angeborenen Immunabwehr induziert werden. AMP stellen weit
verbreitete
essenzielle
Effektormoleküle
der
angeborenen
Immunabwehr
gegen
grampositive und gramnegative Bakterien, Pilze und umhüllte Viren dar (Ganz, 1999;
Nizet, 2001), ihre Schlüsselrolle konnte am Mausmodell dargestellt werden: Mäuse mit
zerstörten AMP neigten zu erhöhter Infektanfälligkeit der Epithelien (Izadpanath und
Gallo, 2005; Schröder und Harder, 2006).
Die Defensine werden in 3 Klassen unterteilt: Alpha-, Beta- und Theta-Defensine (Yang et
al., 1999). Das wichtigste Unterscheidungsmerkmal zwischen ihnen ist die variable
Verknüpfung der intermolekularen Disulfidbrücken, sie wirken an der Zytoplasmamembran der Wirtsorganismen und entfalten hier ihre selektiv für die jeweils vorhandene
Mikroflora mikrozide Wirkung. Die exakten Mechanismen, auf welchem Weg die
Defensine Membranen durchdringen, sind noch nicht vollständig erforscht.
26
Es wird vermutet, dass manche entzündlichen Erkrankungen der Haut, der Lunge, des
Darms und des Urogenitaltraktes durch eine defekte angeborene Immunabwehr entstehen
aufgrund von Abnormitäten in den Genen, die Defensine oder andere AMP kodieren
(Harder et al., 1997). Auch wenn der Nachweis einer Vielzahl von AMP in den Epithelien
unterschiedlicher Organe in vielen Studien gelungen ist, sind jedoch die molekularen
Grundlagen, die zu einer erhöhten Expression von AMP im Rahmen einer Immunantwort
führen, bis heute nicht hinreichend bekannt (Gambichler et al., 2008). Ebenso wenig ist
ihre Rolle bei der Interaktion von angeborenem und erworbenem Immunsystem sowie im
Rahmen der Onkogenese einer Vielzahl maligner Tumoren ausreichend verstanden.
Scheinbar ist es für Mikroorganismen schwer, Resistenzen gegenüber AMP zu entwickeln,
was diese attraktiv für die Entwicklung neuer therapeutischer antibiotischer Strategien
gegen Infektionen macht. So ist es denkbar, dass zukünftig Medikamente entwickelt
werden können, die spezifisch die epitheliale Produktion von AMP über spezifische
Rezeptoren anregen (Schröder, 1999).
Das erste AMP, das in menschlicher Haut gefunden wurde, ist das Lysozym, das im
Zytoplasma von Epithelzellen vorkommt und gegen grampostive und gramnegative
Bakterien aktiv ist. Seine Rolle im Rahmen der Hautabwehr ist noch nicht vollständig
geklärt, da es sich nur im Zytoplasma befindet (Klenha und Krs, 1967; Schröder und
Harder, 2006). 2001 konnten Schittek et al. in den ekkrinen Schweißdrüsen des Menschen
das AMP Dermcidin nachweisen, das antimikrobielle Aktivität gegen S. aureus, E. faecalis
und C. albicans entwickelt und in atopischer Haut eine sehr viel geringere Konzentration
aufweist als in gesunder Haut (Schittek et al., 2001). Diese Peptide werden von den
Keratinozyten produziert, zerstören und penetrieren die Membran der Mikrobe und
interagieren in Folge mit interzellulären Funktionen. Die Expression von AMP in
Keratinozyten ist vermutlich direkt durch Bakterien oder indirekt durch zelleigene proinflammatorische Zytokine geregelt. Bando et al. vermuten, dass das autonome
Keratinozyten-Zytokin IL-1α die Expression von AMP hochreguliert und damit die
angeborene Immunabwehr des Epithels von Haut und Schleimhaut moduliert (Bando et al.,
2007). Wahrscheinlich führt die Abwesenheit spezifischer AMP, insbesondere der BetaDefensine, zu einer erhöhten Infektanfälligkeit der Haut (Ong et al., 2002). Auch im
unteren Respirationstrakt scheint eine hohe Konzentration der antimikrobiell aktiven
Peptide für eine effektive Abwehr zu sorgen. Geht man davon aus, das eine chronische
mikrobielle Besiedlung der respiratorischen Mukosa ihre Ursache in einem Defekt der
27
antimikrobiellen Signal- und Effektormoleküle hat, sind neue therapeutische Optionen
beispielsweise mit inhalierbaren synthetischen AMP denkbar (Ganz, 2004).
1.6.2 AMP bei Pflanzen und Tieren
Auch bei Pflanzen konnte ein derartiges angeborenes Immunsystem nachgewiesen werden,
das durch die Produktion verschiedener Defensine und Thionine mikrobielles Wachstum
von Bakterien und Pilzen auf ihren Oberflächen kontrolliert (Schröder, 1999). Bei Insekten
wurde seit den 1980er Jahren eine Vielzahl von antimikrobiell wirksamen Peptiden isoliert,
die eine Spezifität in ihrer Reaktion auf Pilze oder Bakterien besitzen (Steiner et al., 1981;
Casteels et al., 1990; Bulet et al., 1993; Fehlbaum et al., 1994; u. a. vgl. Review Schröder,
1999). In Epithelzellen verschiedener Frosch-Spezies fand man Peptide, die Ähnlichkeit zu
Peptiden des Gastrointestinaltraktes und des Gehirns von Säugetieren aufweisen (Bevins
und Zasloff, 1990). Wirbeltiere verfügen im Vergleich zu Wirbellosen über eine
ausgeprägte zelluläre Immunabwehr, die direkte Abwehr erfolgt über Phagozytose durch
Makrophagen und polymorphkernige Leukozyten, die ihrerseits eine Reihe von AMP
produzieren (Schröder, 1999).
In Zusammenhang mit der Fragestellung, warum sich Säugetier-Mukosa trotz Anwesenheit
multipler Mikroorganismen nicht infiziert, wurde das erste epitheliale Beta-Defensin in
trachealen Zellen des Rindes entdeckt. Dieses Trachea-antimikrobielle Peptid (TAP) wies
in den Untersuchungen von Diamond et al., 1991 antibakterielle Aktivität in vitro gegen
E.coli, K. pneumoniae, S. aureus und P. aeruginosa auf, die im Gegensatz zu derjenigen
der Alpha-Defensine induzierbar war (Diamond et al., 1991). Ein zweites Beta-Defensin,
das dem TAP strukturell ähnliche linguale antimikrobielle Peptid (LAP) mit ebenfalls
hoher antimikrobieller Aktivität, wurde 1995 von Schonwetter et al. von der Rinderzunge
isoliert (Schonwetter et al., 1995). In Epithelzellen von Kolon und Jejunumkrypten der
Kuh wurde von Stolzenberg et al. und Tarver die antimikrobielle Aktivität eines enteralen
Beta-Defensins nachgewiesen (Stolzenberg et al., 1997; Tarver et al., 1998).
1.6.3 Humane Alpha-Defensine (hAD)
Alpha-Defensine werden als 10-kDa-Pro-Defensine in den neutrophilen Granulozyten
(hAD-1-4) und als Enterodefensine hAD 5 und 6 (Kryptidine) in den eosinophilen
sekretorischen Granula der Panethzellen der Dünndarmkrypten produziert (Territo et al.,
1989; Schröder, 1999). Alle sechs bekannten Gene finden sich auf dem Chromosom 8.
28
HAD-5 wurde in vielen Studien ebenfalls in unterschiedlicher Konzentration in
epithelialem Gewebe von Ureter, Testis und weiblichem Genitaltrakt korrelierend mit dem
Entzündungsgrad erhöht nachgewiesen (Selsted et al., 1992; Selsted und Ouellette, 1995;
Lencer et al., 1997; Buck et al., 2006). Auch im Knochenmark wird während der Reifung
der polymorphkernigen Leukozyten eine große Menge an Alpha-Defensinen gebildet
(Nagaoka et al., 1992). Um ihre Wächterfunktion gegenüber eindringenden Mikroben
auszuüben, werden hAD in epithelialem Gewebe und Leukozyten exprimiert (Territo et al.;
Martin et al., 1995). HAD-1-3, auch als humane neutrophile Peptide (hNP) bezeichnet,
sind auch in extrazellulären Fluiden wie dem zervikovaginalen Schleim nachweisbar, wo
teilweise effektive mikrobizide Konzentrationen erreicht werden (Panyutich et al., 1993;
Valore et al., 2002; Hein et al, 2002). Es wird vermutet, dass Alpha-Defensine die
Produktion von Lymphokinen induzieren, die T-Zell-abhängige zelluläre Immunität und
antigen-spezifische IgG-Produktion anregen (Tani et al., 2000)
1.6.4 Humane Beta-Defensine (hBD)
Beta-Defensine sind kleine (4-5-kDa) kationische antimikrobielle Peptide, reich an Cystein
und Arginin, und befinden sich nach heutigen Erkenntnissen in den Granula der
neutrophilen Granulozyten auf dem Chromosom 8p22-23. In diversen Forschungsarbeiten
konnte der Nachweis erbracht werden, dass hBD ein Teil der chemischen Abwehr der
menschlichen Haut und Schleimhaut sind. Seo et al. konnten eine erhöhte hBD-Expression
in Keratinozyten-Zelllinien nachweisen (Seo et al., 2001). Yang et al. vermuten, dass hBD
nicht nur antimikrobielle Aktivität, sondern als "Mikrochemokine" auch immunregulatorische Funktion entfalten, indem hBD-1-3 beispielsweise am Zytokin-Rezeptor CCR6
andocken und so chemotaktisch auf dendritische Zellen (DCs), Monozyten (MCs) und TZellen wirken und diese an den Ort der dermalen oder mukosalen Infektion rekrutieren
(Yang et al., 1999; Yang et al., 2001). Nagy et al. konnten in ihrer Arbeit die Induktion von
hBD-2 durch den Toll-like Rezeptor 4 (TLR 4) darstellen (Nagy et al., 2005), wahrscheinlich handelt es sich jedoch um bislang noch unbekannte Rezeptoren des angeborenen
Immunsystems, die mit den antimikrobiellen Peptiden interagieren (Sörensen et al., 2005).
1.6.4.1 Humanes Beta-Defensin 1 (hBD-1)
Das erste hBD, ein basisches 3,9-kDa-Basispeptid mit einer 36-Aminosäuresequenz, wurde
von Bensch et al., 1995 in Hämofiltraten von Patienten mit terminaler Niereninsuffizienz
29
nachgewiesen (Bensch et al., 1995). Sie konnten hier erstmals hBD-1 an epithelialen
Oberflächen nach mikrobieller Kolonisation nachweisen. In Folgearbeiten gelang es
mehreren Arbeitsgruppen, hBD-1-mRNA in epithelialen Geweben von Tier und Mensch
zu lokalisieren. Während hBD-1-mRNA in Niere, submandibulären Speicheldrüsen,
nasaler Mukosa, Gingiva, Prostata, Plazenta und Trachea des Menschen stark exprimiert
wurden, war der Nachweis in Hoden, Thymus und Dünndarm eher schwach (Zhao et al.,
1996; Goldmann et al., 1997; Valore et al., 1998; Krisanaprakornkit et al., 1998; Mathews
et al., 1999; Lee et al., 2000). Diese Forschungsergebnisse wurden in vielen nachfolgenden
Publikationen bestätigt und im Hinblick auf die angenommene antimikrobielle Aktivität
von hBD-1 ständig erweitert. So wird beispielsweise angenommen, dass bei der zystischen
Fibrose ein Defekt in Produktion oder Aktivität von hBD-1 zu einer chronischen
Lungeninfektion führt (Smith et al., 1996). Harder und Schröder konnten mRNA von
hBD-1 in diversen Epithelien und suprabasalen Keratinozyten von normaler gesunder Haut
und an den Schweißdrüsen nachweisen (Fulton et al., 1997; Harder und Schröder, 2002).
HBD-1 wurde in dendritischen Zellen (Duits et al., 2002) und in Monozyten, alveolären
Makrophagen und peripheren mononukleären Zellen nachgewiesen (Ryan et al., 2003).
Die Tatsache, dass hBD-1 vorwiegend in den differenzierteren Arealen der Haut
vorkommt, lässt darauf schließen, dass der Differenzierungsgrad der Keratinozyten für die
Expression entscheidend ist (Abiko et al., 2003). Es wird als konstitutiv exprimiertes
Defensin humaner Epithelien angesehen (Schröder, 1999). Im Gegensatz zu anderen
Defensinen ist hBD-1 nicht induzierbar durch proinflammatorische Zytokine wie z. B.
IFN-γ, TNF-α, IL-1ß oder durch Bakterien wie Pseudomonas aeruginosa.
1.6.4.2 Humanes Beta-Defensin 2 (hBD-2)
Harder et al. identifizierten 1997 erstmals das zweite Defensin der Beta-Defensinfamilie
aus der Haut (Harder et al., 1997). HBD-2, ein basisches 4-kDa-Protein mit 41
Aminosäuresequenzen, wurde zuvor bereits aus Vorhaut, Lunge und Trachea isoliert
(Diamond et al., 1991; Diamond et al., 1993). Es ist lokalisiert in den lamellären Granula
der stimulierten Keratinozyten im Stratum spinosum und entfaltet hier immunogene
Reaktivität. Es ist durch Bakterien und proinflammatorische Zytokine wie TNF-α in
Keratinozyten (Harder und Schröder, 2002) und in Monozyten und Makrophagen,
stimuliert durch IFN-γ (Duits et al., 2002) induzierbar. HBD-2 wurde an den Epithelien
vieler Organe und in den serösen Zellen der submukösen Drüsen nachgewiesen. Da
30
chemotaktische Eigenschaften für Memory-T-Zellen (MCs) und dendritische Zellen (DCs)
dargestellt werden konnten, vermutete man, dass hBD-2 und andere Beta-Defensine die
Immunabwehr in Gang setzen, indem sie unter anderem DCs und TCs rekrutieren und mit
anderen Chemokinen und ihren Liganden interagieren (Bals et al., 1998).
Von anderen AMP unterscheidet sich hBD-2 durch seine hohe Wirksamkeit gegenüber
gramnegativen Erregern, wie E. coli, Fusobacterium nucleatum und P. aeruginosa,
während seine Wirkung auf S. aureus eher gering zu sein scheint (Harder et al., 1997;
Schröder, 1999; Wehkamp et al., 2004). Diverse Forschungsarbeiten konnten hochreguliertes hBD-2 in läsionaler Haut bei entzündlichen Dermatosen nachweisen, in gesunder
Haut kommt es kaum vor (Liu et al., 1998; Harder und Schröder, 2002). In chronischen
Wunden wurde eine verstärkte hBD-2-Expression nachgewiesen (Butmarc et al., 2004), im
oberen Respirationstrakt konnte das durch Rhinovirus induzierte hBD-2 in vitro und in
vivo dargestellt werden (Proud et al., 2004). HBD-2 ist ein endogenes AMP, das die
Darmmukosa gegen eine Invasion von Mikroorganismen schützt. Man vermutet, dass ein
Außerkraftsetzen insbesondere seiner Aktivität in Kombination mit verminderter Induktion
der hAD-5 und -6 den Morbus Crohn verursachen könnte (Wehkamp et al., 2002). HBD-2
ist ein potentes, bakterizides AMP mit hoher Aktivität gegenüber gramnegativen
Bakterien. Da hBD-2 in den Keratinozyten produziert wird, liegt die Vermutung nahe, dass
auch in chronischen Wunden wie beispielsweise Ulcera oder verbrannter Haut ein Mangel
von Keratinozyten zu einem Mangel von hBD-2 führt (Milner und Ortega, 1999). Viele
jüngere Studien konnten die Abhängigkeit der Induzierbarkeit von hBD-2 von Toll-likeRezeptoren (TLR), IL-1 und direkter bakterieller Stimulation nachweisen (Biragyn et al.,
2002; Schröder und Harder, 2006).
1.6.4.3 Humanes Beta-Defensin 3 (hBD-3)
Die Arbeitsgruppen um Jia et al. und Harder et al. identifizierten 2001 erstmals das dritte
Beta-Defensin (hBD-3), ein 5,12 kDa großes Peptid, in Zellen des erwachsenen Herzens,
Skelettmuskels, der Plazenta sowie in fetalem Thymus und Lunge. HBD-3-mRNA wurde
ebenfalls nachgewiesen in Haut, Tonsillen, Keratinozyten der Gingiva, Zunge, Ösophagus,
Trachea, Plazenta, Herz von Erwachsenen, Skelettmuskel und fetalem Thymus (Jia et al.,
2000; Jia et al., 2001; Harder et al., 2001; Garcia et al., 2001). Shnitsar et al. fanden eine
erhöhte Expression von hBD-3 in humanem Vulvaepithel (Shnitsar et al., 2004). HBD-3 ist
wie hBD-2 durch Bakterien und proinflammatorische Zytokine hochregulierbar (Harder
und Schröder, 2002).
31
Im Vergleich zu hBD-2 ist hBD-3 ein Peptid mit breitem antimikrobiellen Spektrum
gegenüber grampositiven (S. aureus, S. pyogenes) und gramnegativen Bakterien (P.
aeruginosa und E. coli.) und Pilzen (Candida albicans) sowie auch Methicillin-resistenten
S. aureus-Stämmen (MRSA) und Vancomycin-resistentem E. faeceum (VRE) (Harder et
al., 2001). Bei In-vitro-Untersuchungen in Kombination mit Antibiotika (Lysozym,
Metronidazol, Amoxicillin) zeigte sich eine hohe antimikrobielle Aktivität von hBD-3
(Maisetta et al., 2003). Im Gegensatz zu hBD-2 erfolgt die Regulation von hBD-3 neben
IFN-γ vorwiegend durch Wachstumsfaktoren wie Insulin-like-Growth-Faktor (IGF-1) und
Transforming-Growth-Faktor (TGF-α) (Nomura et al., 2003), beide sind durch direkten
Epithel-Bakterienkontakt induzierbar (Harder et al., 2001). In gesunder Mundschleimhaut
(Bissel et al., 2004) und in Leukoplakien im Stratum granulosum (Nishimura et al., 2003)
konnte eine erhöhte Expression von hBD-3 nachgewiesen werden.
1.6.5 Cathelicidin LL-37
Gensequenzen verschiedener Cathelicidine wurden bereits in den Jahren 1995/96 im
Tiermodell und auch menschlichem Gewebe durch unterschiedliche Arbeitsgruppen
nachgewiesen (Agerberth et al., 1995; Gudmundsson et al., 1996; Frohm et al., 1997;
Johannson et al., 1998). Beim Menschen ist bislang nur ein Cathelicidin-Gen bekannt, das
humane C-terminale-antimikrobielle Peptid (hCAP-18), das sich in spezifischen lamellären
Granula der neutrophilen Granulozyten befindet und von dort aus das Cathelicidin LL-37
produziert. HCAP-18 wird auch in natürlichen Killerzellen (NC), B-Lymphozyten und
Monozyten exprimiert und ist weit verbreitet in der Haut und in Epithelien von Luftwegen,
Mund, Zunge, Ösophagus, Dünndarm, Zervix und Vagina (Braff et al., 2005; Zanetti et al.,
2005; Schröder und Harder, 2006). Die Arbeitsgruppe um Gudmundsson konnten erstmals
Cathelicidin FALL-39/LL-37 (CAMP LL-37) in Hoden und Knochenmark nachweisen
(Agerberth et al., 1995).
Cathelicidin LL-37 ist ein 16-kDa großes AMP und wird durch Verletzung oder
Entzündung der Haut getriggert (Ong et al., 2002). In vitro inhibiert es gramnegative (P.
aeruginosa, E.coli, S. typhimurium) und grampositive (L. monocytogenes, S. aureus, S.
epidermidis, Vancomycin-resistenten Enterococcus faecium) Bakterien und teilweise auch
die Hefe Candida albicans (Turner et. al., 1998; Lopez-Garcia et al., 2005). In ekkrinen
Schweißdrüsen und Ausführungsgängen der menschlichen Haut konnte eine antimikrobielle Aktivität von Cathelicidin LL-37 gegen S. aureus und C. albicans festgestellt werden
32
(Frohm et al., 1997; Murakami et al., 2002). Im Gegensatz zu anderen AMP ist es in stark
salzhaltigem Milieu wirksam (Turner et al., 1998). Frohm et al. konnten 1997 darstellen,
dass es im Rahmen von entzündlichen Hautzuständen im Gegensatz zu gesunder Haut zu
einer Hochregulation des antimikrobiellen Peptids Cathelicidin LL-37 kommt (Frohm et
al., 1997). Neueren Untersuchungen zufolge handelt es sich um ein protektives SignalPeptid mit multiplen Funktionen (Zanetti, 2005), das die systemische Ausbreitung einer
Infektion verhindern kann. Neben proinflammatorischen Zytokinen (IL-1ß, IL-6, TNF-α)
und Wachstumsfaktoren (TGF-α, TGF-β1, βFGF) scheint insbesondere der Insulin-likegrowth-factor (IGF-I), ein wichtiges Molekül im Rahmen der Gewebereparatur von
Wunden, die LL-37-Produktion zu induzieren (Sörensen et al., 2003; Zanetti, 2005).
Verschiedene Autoren konnten nachweisen, dass Keratinozyten über ein enzymatisches
System verfügen, das in der Lage ist, C-terminale Peptide aus dem HCAP-18-Gen zu
generieren (Conner et al., 2002; Murakami et al., 2002; Braff et al., 2005); in Analysen des
Stratum corneum von viral infizierter Haut ergaben sich Hinweise auf in diesem
Kompartiment umgewandeltes reifes Cathelicidin LL-37 (Conner et al., 2002). LL-37
wirkt chemotaktisch auf Monozyten, Neutrophile, Mastzellen und T-Lymphozyten,
induziert Mastzelldegranulation, beeinflusst Transkriptionsvorgänge in Makrophagen und
ist, wie die hBD, in der Lage, verschiedenste Zelltypen wie phagozytierende Leukozyten
und Lymphozyten im Rahmen der Immunabwehr zu mobilisieren (Yang et al., 2001; di
Nardo et al., 2003; Zanetti, 2004). In einer aktuellen Studie konnten Lande et al. zeigen,
dass aus läsionaler Haut isoliertes LL-37 mit humaner DNA Komplexe bildet und im
Rahmen der Antigenpräsentation plasmazytoide dendritische Zellen über die Stimulation
von Toll-like-Rezeptor 9 (TLR 9) aktiviert (Lande et al., 2007).
Man schreibt ihm eine potente Mediatorfunktion im Rahmen der Re-Epithelisierung sowie
Neo-Vaskularisation von chronischen Wunden zu (Dorschner et al., 2001; Bals und
Wilson, 2003; Heilborn et al., 2003). Am Maus-Modell konnte in vitro die wichtige
Funktion der Cathelicidine im Rahmen der Abwehr dargestellt werden: Mäuse ohne das
Cathelicidin CRAMP, das dem menschlichen LL-37 gleichzusetzen ist, waren wesentlich
anfälliger für Infektionen mit Streptokokken der Gruppe A (Schröder und Harder, 2006).
1.6.6 RNase 7
RNase 7 ist ein potentes antimikrobielles 14,5-kDa-Protein, das in hoher Konzentration in
der gesunden Haut nachweisbar ist und durch Bakterienkontakt induzierbare antimikro33
bielle Aktivität gegen sowohl grampositive (Staphylococcus aureus) und gramnegative
(Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa) Erreger als auch Candida albicans entwickelt.
Insbesondere die starke Affinität zur Familie der Enterokokken erklärt seine Rolle bei
Infektionen der Haut mit grampositiven Bakterien. Sehr potent wirkt es gegen den
Vancomycin-resistenten Enterococcus faecium (VRE) (Schröder und Harder, 2006).
RNase 7-mRNA wird in verschiedenen epithelialen Strukturen der Haut, des Respirationstraktes, der ableitenden Harnwege sowie des Genitaltraktes und Darmes exprimiert
(Harder und Schröder, 2002).
Harder
und
Schröder
konnten
mit
ihren
Untersuchungen
zeigen,
dass
in
Keratinozytenkulturen RNase 7 sowohl im Kontakt mit Bakterienkulturen als auch durch
Interleukin (IL)-1β und Interferon (IFN)-γ induzierbar war. Die basale Gen-Expression von
RNase 7 stieg nach Behandlung mit IFN-γ um das 7-fache, mit IL-1ß um das 8,5-fache und
bei Kontakt mit P. aeruginosa- Kulturen um das 9-fache an, wohingegen TNFα nur zu
einem 2,5-fachen Anstieg führte. Sie konnten antimikrobielle Aktivität von RNase 7 gegen
verschiedenste grampositive (S. aureus, P. acnes) und gramnegative Erreger (P.
aeruginosa, E. coli) und sehr hohe Aktivität gegenüber dem Vancomycin-resistenten E.
faecium nachweisen. Eine hohe Expression von RNase 7-mRNA fand sich in nasalen,
trachealen und bronchialen Epithelzellen, was ihre entscheidende Rolle in der lokalen
angeborenen Immunabwehr des Respirationstraktes unterstreicht (Harder und Schröder,
2002). Insbesondere die hohe Effizienz von RNase 7 gegenüber multiresistenten Bakterien
wie z. B. dem Vancomycin-resistenten E. faecium könnte eine Möglichkeit darstellen, sie
im Rahmen der Therapie von Infektionen mit Antibiotika-resistenten Keimen einzusetzen
(Harder und Schröder, 2002).
Die acht bisher bekannten Gene der sogenannten RNaseA-Superfamilie befinden sich
sämtlich auf dem Chromosom 14. RNase 2, 3, 5 und 7 werden Immunabwehrfunktionen
zugeschrieben (Dyer und Rosenberg, 2006). Viele neue Ribonukleasen wurden
insbesondere bei Wirbeltieren entdeckt und in vitro an verschiedenen Geweben (Leber,
Muskel, Niere, Herz) nachgewiesen. Sie gehören zu den sekretorischen Proteinen, und die
einzelnen "Mitglieder" unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Proteinsequenzen und
insbesondere ihrer Funktion, in vivo unterschiedliche Zielstrukturen im Rahmen der
angeborenen Immunantwort anzusteuern (Zhang et al., 2003; Dyer und Rosenberg, 2006).
Ihre antipathogene Aktivität scheint jedoch nicht in jedem Fall von ihrer RibonukleaseAktivität abzuhängen (Dyer und Rosenberg, 2006). Bisher fehlen exakte Kenntnisse,
34
welche Rolle genau die RNase-A-Ribonukleasen im Rahmen der Immunabwehr in vivo
spielen.
1.6.7 AMP in chronisch-entzündlichen Dermatosen
Am Beispiel zweier chronisch inflammatorischer Hauterkrankungen, der atopischen
Dermatitis (AD) und der Psoriasis vulgaris (PV), konnten Unterschiede in der Expression
der AMP herausgearbeitet werden. Patienten mit AD neigen wesentlich häufiger zu einer
Kolonisation der gesunden Haut mit S. aureus als Patienten mit PV oder Hautgesunde.
Man führt dies zurück auf eine latent zugrunde liegende Entzündung, vermittelt durch
vermehrt aktivierte TH2-Zellen (Cho et al., 2001; Ong et al., 2002). Christophers und
Henseler fanden heraus, dass Psoriatiker im Vergleich zu Atopikern eine größere Resistenz
gegenüber bakteriellen und viralen Infektionen aufweisen (Christophers und Henseler,
1987). Die verstärkte Aktivität des S. aureus spielt sich vorwiegend im Stratum corneum
zwischen den Keratinozyten ab, von denen AMP wie beispielsweise hBD und LL-37 bei
akuter und chronischer Entzündung sowie Verletzung der Epidermis freigesetzt werden. Es
wird vermutet, dass bei der AD die Keratinozyten bestimmte AMP exprimieren, die
wiederum den Einfluss von Eosinophilen und TH2- Zellen anregen, wohingegen bei der PV
neutrophile Granulozyten und TH1-Zellen durch die Keratinozyten angeregt werden, die
wiederum von anderen AMP getriggert werden (Giustizieri et al., 2001; Cho et al., 2001;
Ong et al., 2002). Ong et al. konnten in ihrer Studie zeigen, dass atopische Hautläsionen
signifikant niedrigere Konzentrationen an hBD-2 und LL-37-mRNA aufwiesen als
psoriatische Läsionen. Diese niedrigen Konzentrationen waren nicht in der Lage, eine
Infektion mit S. aureus abzuwehren. Möglicherweise sind für die Hemmung der AMP die
TH2-Zytokine IL-4 und IL-13 verantwortlich (Cho et al., 2001; Ong et al., 2002; de Jongh
et al., 2005). Untersuchungen an psoriatischem Schuppenmaterial konnten zeigen, dass die
psoriatische Haut in der Lage ist, ein breites Spektrum an Defensinen zu generieren, die als
Schutzschild gegenüber mikrobiellen Infektionen fungieren (Harder und Schröder, 2005).
Neuere Studien an größerer Patientenzahl bestätigen, dass hBD-2 das Psoriasisspezifischste AMP ist, bei Psoriatikern signifikant höher als bei Atopikern oder
Hautgesunden, bei der AD wird es allerdings signifikant erhöht exprimiert im Vergleich
zur gesunden Haut (Gambichler et al., 2006b). Bei beiden Erkrankungen ist eine
Überexpression von hBD-1- und hBD-3-mRNA nachweisbar. Die erhöhte Aktivität von
LL-37-mRNA bei AD und PV wird kontrovers diskutiert und konnte von Gambichler et al.
35
nicht bestätigt werden, ebensowenig wie die Upregulation von hBD-3 durch TH2-Zytokine
(Gambichler et al. 2008). Wahrscheinlich gibt es Unterschiede im Zytokinmilieu in
Abhängigkeit von der Akuität der AD-Läsionen (Nomura et al., 2003; Howell et al., 2006).
Zumindest scheint eine gestörte Expression und Funktion von LL-37 zur Pathogenese des
atopischen Ekzems, der Psoriasis und auch der Rosazea durch die Induktion
proinflammatorischer Zytokine beizutragen (Schauber et al., 2008).
Weitere AMP wurden in AD- und PV-Läsionen nachgewiesen, wie beispielsweise
RNase 7. RNase 7 scheint hochspezifisch für die atopische Dermatitis und wird
wahrscheinlich durch bakterielle Kolonisation induziert. In AD-Läsionen fanden sich
signifikant höhere RNase 7-Level. RNase 7 weist hohe Aktivität gegenüber gramnegativen
(P. aeruginosa, E. coli) und grampositiven Bakterien (S. aureus, P. acnes) sowie der Hefe
C. albicans auf und ist wahrscheinlich das potenteste heute bekannte AMP. Allerdings
scheint die Downregulation von hBD-2 die Hauptursache für die erhöhte Infektanfälligkeit
der Patienten mit AD zu sein (Harder und Schröder, 2002). In gesunder Haut wurden die
AMP Psoriasin, RNase 7 und Lysozym in signifikanten Leveln, hBD-2 in kleineren
Mengen und hBD-3 gar nicht nachgewiesen. LL-37 ließ sich nur mit hochsensitiven
Methoden in kleinen Spuren darstellen (Gambichler et al., 2008).
Neuere Aspekte bezüglich der vielfältigen Funktionen von hBD konnten jüngst von
Kreuter et al. bei zirkumscripter Sklerodermie dargestellt werden. In Morphea-Läsionen
konnten im Vergleich zu gesunder und unbefallener Haut erhöhte Level von hBD-1-3 und
der Zytokine IL-6 und IL-8 nachgewiesen werden. Nach UVA1-Exposition kam es zu
einer Downregulation der hBD sowie der Zytokine IL-6 und IL-8 in läsionaler Haut
(Kreuter et al., 2006a).
1.6.8 Nachweis von AMP in Neoplasien der Haut
HAD und hBD spielen möglicherweise auch eine wichtige Rolle in der Entstehung
bestimmter maligner Tumoren. Sie konnten in einzelnen Publikationen auch in kanzerösen
Läsionen, zum Beispiel in oralen Plattenepithelkarzinomen (SCC) und Basalzellkarzinomen (BCC), nachgewiesen werden. BCC und SCC werden vermehrt bei Organtransplantierten beobachtet, ursächlich werden virale Co-Faktoren wie bestimmte HPV-Typen
vermutet (Iftner et al., 2002). HAD wurden unter anderem in Tumoren der Lunge, des
Kolons, in submandibulären Drüsen bei oralen Karzinomen, bei Nierenzellkarzinomen und
Leukämie nachgewiesen, und es konnte gezeigt werden, dass hAD malignes Wachstum
36
fördern können (Mizukawa et al., 2000; Muller et al., 2002; Albrethsen et al., 2005). Eine
erhöhte Expression von hBD konnte auch im Gewebe diverser Tumoren, zum Beispiel in
oralen SCCs, Lungen-, Nieren-, Prostata- und Vulvakarzinomen, nachgewiesen werden
(Abiko et al., 1999; Donald et al., 2003; Shnitsar et al., 2004; Arimura et al., 2004).
Gambichler et al. konnten erstmals eine veränderte Expression der AMP hBD-1 und hBD2 in nicht ulzerierenden BCC darstellen. Im Gegensatz zu der unveränderten Expression
von hBD-1 bei entzündlichen Reaktionen fand sich hier eine signifikant erniedrigte
Expression von hBD-1 in BCC. Die Autoren spekulieren, dass hBD-1 über ein starkes
zytotoxisches Potenzial verfügt, das initial eine Art "Antitumor-Immunität" des Wirtes
induziert, sich bei Progression des Tumors erschöpft und danach nicht mehr exprimiert
wird. HBD-1 wurde in der negativen Kontrollgruppe nicht nachgewiesen (Gambichler et
al., 2006a). Dies bestätigt vorhergehende Studien, dass hBD-1 wahrscheinlich nur unter
pathologischen Konditionen produziert wird, wie im Rahmen von Entzündungsreaktionen,
z. B. psoriatischen und atopischen Läsionen, bakteriellen Infektionen und malignen
Prozessen. Die veränderte Expression von hBD-1 und hBD-2 in BCC legt nahe, dass sie
eine Rolle in der Tumor-Pathogenese spielen könnten und möglicherweise zu einem
Defensin-vermittelten Untergang der Keratinozyten führen, wodurch letztlich das
Tumorzellwachstum gefördert wird. Eine signifikante Expression von hBD-3 in BCC
konnte in dieser Studie nicht beobachtet werden. In BCC konnte eine signifikante HochRegulation von hBD-2 nachgewiesen werden. Yoshimoto et al. konnten ebenfalls
darstellen, dass hBD-2 nicht nur in entzündlichen Läsionen, sondern auch in oralen
Karzinomen exprimiert wird (Yoshimoto et al., 2003).
1.6.9 AMP bei Virusinfektionen
Die Fähigkeit der AMP, Zellmembranen zu durchdringen, wird unter anderem zurückgeführt auf Interaktionen zwischen ihrem kationischen Potenzial und den anionischen
Lipid-Fraktionen. Es wird vermutet, dass sie mit der Rezeptor-Virion-Bindung interagieren
(Selsted und Ouellette, 2005). Dies scheint sich auch im Rahmen der natürlichen Abwehr
viraler Infektionen abzuspielen, beispielsweise der Infektion mit HPV. Buck et al. konnten
anhand eines Pseudovirus-Vektor-Modells zeigen, dass insbesondere Alpha-Defensinen als
Teil der natürlichen Abwehr in unterschiedlicher Ausprägung vor allem im weiblichen
Genitaltrakt eine Schlüsselfunktion zukommt. Hier stellen sie möglicherweise eine
effektive mikrobiozide Abwehr der sexuellen Transmission einer HPV-Infektion dar.
37
Anhand von neueren Techniken der HPV-Pseudovirus(PsV)-Herstellung konnten die
Autoren in vitro anti-HPV-Aktivitäten von hAD-1-3 und hAD-5 und -6 darstellen und
mikroskopisch zeigen, dass sie die Ausschleusung von Virionen aus den endozytischen
Vesikeln blockieren. HBD-1 und 2 zeigten im Rahmen dieser Untersuchungen keine bzw.
nur geringe Anti-HPV-Aktivität (Buck et al., 2006).
Auch anderen AMP wird eine antivirale Aktivität zugeschrieben; beispielsweise legt die
Expression von LL-37 in Keratinozyten von Patienten mit Condylomata acuminata oder
Verrucae vulgares seine Bedeutung im Rahmen von HPV- Infektionen nahe, und es scheint
auch in der Lage zu sein, andere Viren wie beispielsweise das Vaccinia-Virus zu
inaktivieren (Conner et al., 2002; Howell et al., 2004; Schröder und Harder, 2006). Bislang
gibt es kaum Erkenntnisse über die antivirale Kompetenz der Beta-Defensine.
Feng et al. fanden heraus, dass hBD-3 nicht nur die Replikation von HIV-1 durch
Modulation des Co-Rezeptors CXCR4 blockiert, sondern dass es kompetitiv vermutlich
mit dem CXCR4 Liganden direkt agiert und somit möglicherweise ein Potenzial im
Rahmen der HAART darstellt könnte (Feng et al., 2006).
38
2
2.1
Methoden
Hautproben und Patientencharakteristika
Von insgesamt 45 HIV-positiven MSM wurden jeweils 3-mm-Stanzbiopsien von analer
Haut bzw. Mukosa entnommen. Es ergaben sich 12 Proben von analen intraepithelialen
Neoplasien unterschiedlichen histopathologischen Grades, 24 Proben von analen
Condylomata acuminata sowie neun Proben von analer Mukosa ohne klinische Anzeichen
einer HPV-assoziierten Erkrankung. Zusätzlich wurden Proben von analen Condylomata
acuminata von 8 HIV-negativen MSM untersucht. Sämtliche Patienten wurden
entsprechend einem publizierten Vorsorgeprogramm auf anale intraepitheliale Neoplasien
gescreent (Palefsky et al., 2000; Kreuter et al., 2008b).
Das AIN-Screening erfolgte in Steinschnitt- oder Linksseitenlage. Zunächst wurde die
Perianalregion klinisch inspiziert und auf pathologische Auffälligkeiten untersucht. Mit
einem NaCl-befeuchteten Tupfer wurde die Analregion gereinigt, mit einem ebenfalls
feuchten dünnen Wattestieltupfer zirkumferent das Zellmaterial entnommen und auf einem
Objektträger ausgestrichen. Zur Anfertigung des Zellmaterials wurde ebenfalls ein
Wattestäbchen in den Analkanal eingeführt bis zum Widerstand an der distalen
Rektumwand; dies wurde dann entsprechend zirkulär bewegt, anschließend herausgezogen,
ebenfalls auf einem Objektträger ausgestrichen und mit Fixierlösung besprüht. Das
Zellmaterial wurden von Dr. Jochen Swoboda beurteilt, waren jedoch nicht Gegenstand
der Untersuchung dieser Studie. Nach der Gewinnung des Zellmaterials wurde ein in 3 %iger Essigsäurelösung getränkter dicker Watteträger für drei Minuten in den Analkanal
eingelegt. Danach erfolgte das Einbringen eines Einmal-Anoskops aus Plastik (Cooper
Surgical, Trumbull, CT, USA), um so mit Hilfe eines konventionellen Kolposkops
(Kolposkop FC 150, Zeiss, Oberkochen) mit einem Abstand von 30 cm die gesamte
Zirkumferenz des distalen Rektums, Transformationszone (Linea dentata), Analkanal und
Perianalregion zu untersuchen (hochauflösende Anoskopie). Bei klinischen Anzeichen für
eine AIN wie Leukoplakie, Mosaik, Neovaskularisation, Gefäßabbrüche u.a. wurden
Stanzbiopsien entnommen (Kreuter et al., 2008a). Die histopathologische Aufarbeitung
und Diagnose der entnommenen Biopsien erfolgte durch die zwei spezialisierten
Histopathologen Prof. Dr. P. Altmeyer, Bochum, und Prof. Dr. M. Stücker, Bochum. Es
wurden nur Patienten mit ausgedehnter AIN bzw. mehr als drei analen Condylomata
eingeschlossen.
39
Die
Studie
war
eine
Substudie
des
Deutschen
Kompetenznetzes
HIV/AIDS
(Fördernummer 01KI0501). Das Protokoll der Studie wurde an den Prinzipien der
Deklaration von Helsinki ausgerichtet und von der Ethikkommission der Ruhr-Universität
Bochum anerkannt. Sämtliche Patienten wurden ausführlich über die Studie aufgeklärt und
gaben ihr schriftliches Einverständnis.
2.2
HPV-Typisierung und Bestimmung der HPV-DNA-Viruslast
DNA-Isolierung und HPV-DNA-Analyse erfolgten nach einem etablierten Schema
(Kreuter et al., 2005; de Koning et al., 2006). DNA wurde mit Hilfe des QIAampDNA
Mini Kit (Qiagen, Hilden, Germany) isoliert, die komplette zelluläre DNA wurde mit
250 µL eines AE-Puffers (Qiagen) ausgewaschen und 5 µL von dieser Lösung für die
jeweilige Polymerase-Chain-Reaction (PCR) verwendet. Negativ-Kontrollen mit Wasser
und humaner Plazenta-DNA wurden in jede Amplifikationsserie eingeschlossen. BetaGlobin-Gen-PCR diente zur Kontrolle, ob die Proben adäquate DNA enthielten, und zur
Prüfung auf störende, die PCR inhibierende Fremdsubstanzen (268 bp PCO4/GH20 PCRProdukt) (Bauer et al., 1991). In den anogenitalen Abstrichen wurde α-HPV-DNA mittels
hochsensitiver gruppenspezifischer A5/A10-nested-PCR detektiert (Wieland et al., 2000;
Kreuter et al., 2005; de Koning et al., 2006). Die PCR-Produkte (5 µL) wurden auf 2 %igen Agarosegelen separiert und dem PCR-Ansatz ein fluoreszierender Farbstoff zugesetzt
(Ethidiumbromid). Zur HPV-Typisierung wurden interne, biotinisierte A6/A8-PCRProdukte (270 bp) mit 36 typenspezifischen, Digoxigenin gelabelten OligonukleotidGensonden in einem Enzymimmunoassay hybridisiert (Jacobs et al., 1997, Kreuter et al.,
2005). Die HPV-DNA-Viruslastbestimmung erfolgte mittels Real-Time-PCR mit
typenspezifischen Primern (Tabelle 1) und Gensonden der HR-α-HPV-Typen 16, 18, 31
und 33 (Weissenborn et al., 2003). Die HPV-DNA-Viruslast wurde als Anzahl der HPVDNA-Kopien pro Beta-Globin-Genkopie ausgedrückt (Tabelle 2). Bei Nachweis von mehr
als einem der sechs quantifizierten HPV-Typen in einem Abstrich wurden kumulative
Werte für HR- und LR-α-HPV-DNA-Viruslast bestimmt.
2.3
Quantitative Real-Time-PCR der antimikrobiellen Peptide
Von den antimikrobiellen Peptiden hBD-1, hBD-2, hBD-3, LL-37 und RNase 7 wurde eine
AMP-mRNA-Analyse durchgeführt (vgl. Gambichler et al., 2008). Die Isolierung der
40
kompletten zellulären RNA aus den Hautbiopsien erfolgte mit dem RNeasy® Lipid Tissue
Kit, dem Versuchsprotokoll der Firma folgend (Qiagen, Chatsworth, CA, USA). Vor der
cDNA-Synthese wurde RNA mit RNase-freier DNase aufgelöst (Roche, Mannheim,
Germany). Die Synthese der cDNA erfolgte durch reverse Transkription DNAse-Ibehandelter RNA unter Verwendung von MultiScribeTM Reverser Transkriptase und
Hexamerprimern (TagMan® Reverse Transkriptase Reagenzien; Applied Biosystems,
Foster City, CA, USA). Die Real-time-PCR wurde mittels Power SYBR® Green PCR
Master Mix und GeneAmp@ Sequence Detection System durchgeführt (Applied
Biosystems). Die PCR-Primer für die entsprechenden AMP und das Housekeeping Gen
(RPL-38) wurden mit Hilfe des Computerprogramms Primer Express entwickelt (PE
Biosystems) und durch den Oligonukleotid Synthese Service TIB Molbiol, Berlin,
Germany, hergestellt. RPL-38 wurde als Housekeeping Gen verwendet, da deutlich
niedrigere Unterschiede (mittlere Ct-Werte) in der mRNA-Synthese von RPL-38 (Range
von 0,08 bis 0,72) im Vergleich zu GAPDH (Range von 0,02 bis 1,3) nachgewiesen
werden konnten. In sämtlichen untersuchten Proben erfolgte eine stabile, nicht regulierte
mRNA-Synthese von RPL-38. Die verwendeten Primer sind in Tabelle 2 aufgelistet.
Tabelle 2: Primer der antimikrobiellen Peptide (AMP) und für das Housekeeping Gen RPL-38, die
in der Real-time- PCR- Studie verwendet wurden
Primer
Sequenz
hBD-1
F 5´-GATGGCCTCAGGTGGTAACTTT-3´;
R 5´-GGGCAGGCAGAATAGAGACATT-3´
hBD-2
F 5´-GATGCCTCTTCCAGGTGTTT-3´;
R 5´-GGATGACATATGGCTCCACTCTT-3´
hBD-3
F 5´-TCCATTATCTTCTGTTTGCTTTGC-3´;
R 5´-TTCTGTAATGTGTTTATGATTCCTCCAT-3´
LL-37
F 5´-AGGATTGTGACTTCAAGAAGGACG-3´;
R 5´-GTTTATTTCTCAGAGCCCAGAAGC-3´
RNase 7
F 5´-GAAGACCAAGCGCAAAGC-3´;
R 5´-CAGCAGAAGCAGCAGAAGG- 3´
RPL-38
F 5´-TCACTGACAAAGAGAAGGCAGAGA-3´;
R 5´-TCAGTGTGTCTGGTTCATTTCAGTT-3´
41
Sämtliche Primer wurden hinsichtlich ihrer cDNA-Spezifität mit dem BLAST-Programm
abgeglichen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). PCR-Amplifikationen wurden in
einem Gesamtvolumen von 25 µl durchgeführt, das 5 µl cDNA-Probe, 5 µM von jedem
Primer und 12,5 µl Power SYBR® Green PCR Master Mix enthielt. Die PCR begann mit 2
Minuten bei 50 °C, gefolgt von 10 Minuten bei einer Denaturierungstemperatur von 95 °C,
gefolgt von 40 Zyklen aus je 15 Sekunden Denaturierung und einer Minute Hybridisierung
und Elongation bei 60 °C. Da SYBR® Green sowohl an spezifischen als auch an unspezifischen DNA-Doppelstrang bindet, wurden die PCR-Produkte nach diesen 40 Zyklen
geschmolzen. Dabei sinkt die Fluoreszenzintensität des Farbstoffes linear, bis sie die für
die DNA-Sequenz spezifische Schmelztemperatur erreicht hat (z. B. für die BetaDefensine 1, 2 und 3 liegt diese bei 81 °C, 76 °C und 77 °C). Zur Identifizierung
sämtlicher PCR-Produkte wurde eine Schmelzkurven-Analyse durchgeführt. Wie in einer
früheren Arbeit von Livak und Schmittgen vorgeschlagen, wurde der Level der mRNAGenexpression mit der vergleichenden Δ-ΔCt-Methode berechnet (Livak und Schmittgen,
2001). Der ΔCt-Wert zeigt, um wie viele Zyklen die Expression des untersuchten Gens die
Expression des Housekeeping Gens übersteigt. Die quantitative Bestimmung der relativen
Mengen der einzelnen AMP erfolgte hier in Relation zum Housekeeping Gen RPL-38
(Pfaffl, 2001). Aus allen einzeln berechneten ΔCt-Werten wurden Mittelwerte ermittelt.
Die Höhe der mRNA-Level wurde durch Median-Log-Transformation der Genexpression
bestimmt.
2.4
Immunhistochemie
In Paraffin eingebettete 3-µm-Schnitte wurden auf silanisierte Objektträger gegeben und
für eine Stunde bei 60 °C in einer Feuchtkammer gelagert. Die einzelnen Schnitte wurden
mittels Xylen von Paraffin befreit, mit 100 %-, 96 %-, 70 %- und 50 %-igem Ethanol für
jeweils 5 Minuten gewaschen und mit demineralisiertem Wasser gespült. Nach Waschung
mit Target Retrieval Lösung (Dako, Hamburg) wurden die Schnitte für 20 Minuten in ein
Dampfbad bei 96 °C gelegt. Für die Färbung von hBD-2 und hBD-3 kamen Anti-hBD-2Antikörper der Ziege und Anti-hBD-3-Antikörper vom Kaninchen zur Anwendung (Peprotech Cell Concepts, Rocky Hill, NJ, USA) (Meyer-Hoffert et al., 2008). Anschließend wurden die Schnittpräparate mit jeweils 200 µl der hBD-2- und hBD3-Antikörper in einer Verdünnung von 1:250 bedeckt und für 30 Minuten bei 25 °C in einen Dako Autostainer ge42
stellt. Zusätzliche sekundäre Antikörper wurden verwendet: für hBD-2 das Anti-IgG der
Ziege (15 Minuten in einer Verdünnung von 1:500; Vector Laboratories Inc., Burlingame,
CA, USA) und für hBD-3 das Anti-IgG vom Kaninchen (15 Minuten in einer Verdünnung
von 1:300; Dako). Nach 10-maligem Auswaschen mit Pufferlösung für je zwei Minuten
wurde Streptavidin-Alkalische Phosphatase (Dako) für 30 Minuten zugesetzt. Schließlich
wurden die Schnittpräparate mit Chromogen-Red gefärbt (Dako), mit Hämatoxylin gegengefärbt und das Reagenz Mowiol aufgebracht (Roche Molecular Biochemicals,
Mannheim).
2.5
Immunhistochemische Evaluation
Die histopathologische Diagnostik wurde von zwei Histopathologen mit langjähriger
Erfahrung in der Beurteilung und Interpretation analer und intraanaler Biopsien durchgeführt. Die analen intraepithelialen Neoplasien wurden nach etablierter Klassifikation von
Fenger und Nielsen in drei unterschiedliche Grade eingeteilt, die sich an der Ausdehnung
atypischer Zellen in verschiedenen Zellschichten des Epithels orientierten. AIN 1 bedeutet
Ausdehnung im unteren Epitheldrittel, AIN 2 in den unteren zwei Dritteln, und bei der
AIN 3 ist das komplette Epithel von dysplastischen Zellen durchsetzt (Fenger und Nielsen,
1981). Die Biopsien der HIV-positiven Patienten mit AIN, Condylomata acuminata und
normaler Mukosa ohne Hinweise auf HPV-assoziierte Erkrankung wurden hinsichtlich
ihres Grades der Anfärbung von hBD-2 und hBD-3 verglichen. Zusätzlich erfolgte die
Evaluierung der läsionalen Biopsien der Condylomata acuminata der HIV-negativen
Männer. Als Positiv-Kontrolle wurden Biopsien von psoriatischen Läsionen HIV-negativer
Individuen verwendet vor dem Hintergrund, dass die Psoriasis eine Erkrankung darstellt,
bei der hohe Level von Beta-Defensinen in der Epidermis exprimiert werden. Immunpositivität von hBD-2 und hBD-3 wurde in unterschiedlichen Kompartimenten der Epidermis evaluiert (Stratum corneum, Stratum granulosum, Stratum spinosum, Stratum basale).
Wie bereits zuvor beschrieben (Meyer-Hoffert et al., 2008), wurde die tiefste Epidermisschicht gezählt, in der hBD-2- und hBD-3-mRNA noch nachgewiesen werden konnten.
2.6
Statistische Analyse
Die Datenanalyse erfolgte mit dem Statistik-Softwarepaket MedCalc (MedCalc Software,
Mariakerke, Belgien). Aufgrund der Tatsache, dass es sich teilweise um nicht normalver43
teilte Daten handelte, wurden nicht-parametrische Analysen der Real-Time-PCR-Ergebnisse verwendet (D’Agostino-Pearson-Test). Für die Analyse statistisch signifikanter Unterschiede zwischen den Gruppen kam der Kruskal-Wallis-Test zur Anwendung. Wenn sich
statistisch relevante Unterschiede zeigten, erfolgte die Post-hoc-Analyse mit dem MannWhitney-Test (unpaarige Daten). Zur Ermittlung der Rangkorrelationen zwischen den
Gruppen wurde der Spearman-Koeffizient bestimmt. Als signifikant wurden Werte von
p < 0,05 gewertet.
44
3
3.1
Ergebnisse
Expression antimikrobieller Peptide in analen intraepithelialen Neoplasien und
Condylomata acuminata von HIV-positiven Männern, die Sex mit Männern
haben
Ziel der Arbeit war der Nachweis antimikrobieller Peptide (AMP) in analen
intraepithelialen Neoplasien und Condylomata acuminata sowie der Nachweis einer
mögliche Korrelation von AMP-Expression und Höhe der HPV-DNA-Viruslast bei HIVinfizierten MSM, die eine Hochrisikogruppe für persistierende HPV-Infektionen und
analen intraepithelialen Neoplasien darstellen. Es wurde die mRNA-Expression der
antimikrobiellen Peptide hBD-1, hBD-2, hBD-3, LL-37 and RNase 7 in 12 Biopsien von
AIN, 24 Biopsien von Condylomata acuminata und neun Proben von klinisch unauffälliger
analer Mukosa untersucht. Zusätzlich wurden 8 Biopsien von Condylomata acuminata von
HIV-negativen MSM analysiert.
Die Resultate der mRNA-Expression sind in Tabelle 3 zusammengefasst. Es konnte eine
signifikante Erhöhung der mRNA von hBD-2 und hBD-3 in analen intraepithelialen
Neoplasien und Condylomata acuminata von HIV-positiven MSM nachgewiesen werden
(hBD-2: p=0,02 und p=0,03; hBD-3: p=0,03 und p=0,04). AIN und Condylomata
acuminata von HIV-positiven MSM zeigten vergleichbare mRNA-Level von hBD-2 und
hBD-3.
Im Gegensatz zu anderen Publikationen fanden sich weder signifikante Unterschiede der
mRNA-Expression der AMP hBD-1, LL-37 und RNase 7 in AIN-Läsionen und
Condylomata acuminata im Vergleich zu nicht befallener Mukosa, noch fanden sich
signifikante Unterschiede dieser AMP zwischen AIN-Läsionen und Condylomata
acuminata. Im Vergleich der Expression der AMP-mRNA in den Condylomata acuminata
der HIV-positiven und denen der 8 HIV-negativen MSM zeigten sich keinerlei Unterschiede im Grad der Expression der AMP (Tabelle 3).
45
Tabelle 3: Mittelwert und Bereich der mRNA-Expression der antimikrobiellen Peptide und
Proteine (AMP) in analen intraepithelialen Neoplasien (AIN), Condylomata acuminata und nichtläsionaler analer Mukosa von HIV-positiven Männern, die Sex mit Männern haben (MSM), und
Condylomata acuminata von HIV-negativen MSM 1
HIV-positive MSM
AIN
hBD-1
hBD-2
hBD-3
LL-37
HIV- negative MSM
Condylomata
Nicht-läsionale
Condylomata
acuminata
anale Mukosa
acuminata
(n= 12)
(n= 24)
(n= 9)
(n= 8)
2,63
2,04
1,72
1,73
(1,33–9,27)
(0,68 - 17,29)
(1,17 - 3,08)
(0,98 - 2,83)
3,81
4,04
1,26
5,99
(0,07-9,72)
(0,03 - 45,32)
(0,01 - 7,22)
(0,05 - 25,32)
3,33
1,86
0,85
2,95
(0,32-10,21)
(0,01 - 30,95)
(0,10 - 2,06)
(0,40 - 14,04)
0,0033
0,0023
0,0021
0,0028
(0,00-0,01)
(0,00 - 0,04)
(0,00 - 0,0082)
(0,00 - 0,03)
6,88
5,07
5,25
(0,33 - 12,31)
(2,61 - 9,93)
(0,20 - 20,9)
RNase 7 5,53
(1,83-10,07)
1
Die Mengenangaben der AMP-mRNA-Level wurden mittels Median Log Transformation der
Gen-Expression dargestellt. Relative mRNA-Level-Expression wurde mit der vergleichenden 2- CTMethode berechnet (Livak und Schmittgen, 2001). Die Quantifizierung sämtlicher AMP erfolgte in
Relation zum Housekeeping-Gen RPL-38.
ΔΔ
Zum Nachweis der hBD-2- und hBD-3-Proteinexpression in AIN, Condylomata acuminata
und nicht befallener Mukosa erfolgte eine immunhistochemische Färbung. Die Ergebnisse
sowie die Anzahl der evaluierten Proben und Pattern der immunologischen Reaktivität sind
in Tabelle 4 dargestellt. Da keine Unterschiede in der Genexpression von hBD-1, LL-37
und RNase 7 feststellbar waren, wurde bei diesen drei AMP keine immunhistochemische
Analyse durchgeführt.
46
Tabelle 4: Immunhistochemische Analyse von humaner Beta-Defensin (hBD)-2- und hBD-3Proteinexpression in analer intraepithelialer Neoplasie (AIN), Condylomata acuminata und nichtläsionaler Mukosa von HIV-positiven Männern, die Sex mit Männern haben (MSM), und
Condylomata acuminata von HIV-negativen MSM 1
HIV-positive MSM
AIN
(n=10)
HIV-negative MSM
Condylomata
Nicht-läsionale Condylomata
acuminata
Mukosa
acuminata
(n=23)
(n=4)
(n=8)
hBD-2 Proteinexpression
Negativ
1 (10 %)
3 (13 %)
4 (100 %)
1 (12 %)
Stratum corneum
1 (10 %)
4 (17 %)
-
2 (25 %)
Stratum
4 (40 %)
10 (43 %)
-
4 (50 %)
Stratum spinosum 2 (20 %)
6 (26 %)
-
1 (12 %)
Stratum basale
-
-
-
granulosum
-
hBD-3-Proteinexpression
Negativ
1 (10 %)
5 (21 %)
4 (100 %)
2 (25 %)
Stratum corneum
4 (40 %)
7 (30 %)
-
1 (12 %)
Stratum
5 (50 %)
6 (26 %)
-
4 (50 %)
Stratum spinosum -
5 (21 %)
-
1 (12 %)
Stratum basale
-
-
-
granulosum
-
1
Es wurde das tiefste Kompartiment der Epidermis gezählt, das Immunopositivität zeigte
(modifiziert nach Meyer-Hoffert et al., 2008). Die in dieser Tabelle aufgeführten Zahlen stellen die
Anzahl der Schnittpräparate mit Nachweis der entsprechenden Resultate dar.
Es zeigte sich eine starke hBD-2-Expression sowohl in den AIN als auch in den
Condylomata aller HIV-positiven Patienten. In den meisten Proben reichte die hBD-2Proteinexpression vom Stratum corneum bis ins Stratum spinosum (Abbildung 2).
47
Abbildung 2: Immunhistochemische Darstellung von hBD-2 in HPV-assoziierten Hautläsionen bei
HIV-infizierten MSM. (a) HBD-2-Färbung in einer AIN-3-Probe. HBD-2 findet sich vom Stratum
corneum bis zum Stratum granulosum; (b) HBD-2-Nachweis vom Stratum corneum bis ins Stratum
spinosum reichend; (c) Schnitte von psoriatischen Läsionen dienen als Positiv-Kontrolle; die
Psoriasis ist eine Erkrankung, bei der bekanntermaßen HBD-2 ausgeprägt nachweisbar ist; (d)
Hautbiopsien von analer Mukosa ohne klinische Zeichen von HPV-assoziierter Erkrankung zeigten
keine hBD-2-Expression. Diese histologischen Bilder sind repräsentativ für die gesamten
immunhistologischen Ergebnisse der Studie. Maßstab 50 µm.
Ebenso konnte hBD-3-Expression in AIN und Condylomata der HIV-positiven MSM
nachgewiesen werden. In AIN-Läsionen fand sich die hBD-3-Expression lediglich im
Stratum corneum, in den Condylomata reichte sie vom Stratum corneum bis ins Stratum
spinosum (Abbildung 3).
48
Abbildung 3: Immunhistochemische Darstellung von hBD-3 in analen intraepithelialen Neoplasien
und Condylomata acuminata bei HIV-infizierten MSM. (a) HBD-3-Färbung in einer AIN-3-Probe.
HBD-3 reicht vom Stratum corneum bis zum Stratum granulosum; (b) HBD-3-Nachweis vom
Stratum corneum bis ins Stratum spinosum; (c) Schnitte von psoriatischen Läsionen dienen als
Positiv-Kontrolle. Die Psoriasis ist eine Erkrankung, bei der bekanntermaßen HBD-3 ausgeprägt
nachweisbar ist; (d) Hautbiopsien von analer Mukosa ohne klinische Zeichen von HPV-assoziierter
Erkrankung zeigten keine hBD-3-Expression. Diese histologischen Bilder sind repräsentativ für die
gesamten immunhistologischen Ergebnisse der Studie. Maßstab 50 µm.
Die Basalmembran war in allen Proben der AIN und Condylomata acuminata frei von
hBD-2- oder hBD-3-Expression. Keines der von unbefallener Mukosa gewonnenen
Schnittpräparate wies eine hBD-2- oder hBD-3-Expression auf. Ähnlich dem mRNANachweis fand sich eine vergleichbare Expression der Beta-Defensine in Condylomata
acuminata von HIV-positiven und HIV-negativen MSM.
49
3.2
HPV-Analyse von analen Läsionen bei HIV-positiven und HIV-negativen
Männern, die Sex mit Männern haben
Bei allen 12 HIV-positiven MSM mit AIN konnte eine Infektion mit multiplen highrisk (HR)- und low-risk (LR)-α-HPV-Typen nachgewiesen werden. HPV-Spektrum, HRα-HPV-DNA-Viruslast sowie die unterschiedlichen AIN-Grade sind in Tabelle 5
aufgeführt. Das HR-α-HPV-Spektrum reichte von 16, 18, 26, 31, 33, 35, 45, 51, 52, 53
über 56, 58, 59, 66, 68, 73 und 83; das LR-α-HPV-Spektrum von 6, 11, 34, 40, 42, 44 über
54, 57, 61, 70, 72, 81, 83, 84 sowie 89. Alle zwölf Patienten mit AIN wiesen läsional HRHPV-DNA auf und zehn von ihnen (entsprechend 83 %) zusätzlich LR-HPV-DNA. Im
Durchschnitt fanden sich 2,58 HR-α-HPV-Typen (Range von 1-6 Typen), HPV 16 wurde
in 67 % der Fälle nachgewiesen, gefolgt von HPV 58 und HPV 73 in 33 % der Fälle sowie
HPV 18 (25 %). HR-HPV-DNA-Viruslast rangierte zwischen 0,3 bis 715 HPV-Kopien pro
Beta-Globin-Genkopie. LR-HPV-Typen fanden sich durchschnittlich 1,58 (Range von 1-9)
HPV-Typen, HPV 61 lag hier mit 33 % vorn.
Bei 23 von 24 HIV-positiven MSM mit Condylomata acuminata konnten Condylomspezifische LR-HPV-Typen festgestellt werden; die häufigsten waren HPV 6 mit 35 %,
HPV 42 mit 35 % sowie HPV 11 mit 26 %. Zusätzlich zeigten Abstriche vom Oberflächenepithel des Analkanals bzw. der Perianalregion dieser Patienten Infektionen mit multiplen HR-α-HPV-Typen, mit einem Range von 1 bis 9 HPV-Typen (Mittelwert bei 2,46).
Bei 6 der 7 HIV-negativen MSM mit Condylomata acuminata wurde nur ein LR-HPVTyp, HPV 6, festgestellt, lediglich einer war Träger von HPV 6 und HPV 81. Bei keinem
dieser Patienten fanden sich HR-α-HPV-Typen. HIV-positive MSM mit AIN hatten
deutlich niedrigere CD4-Zellzahlen als diejenigen, die nur Condylomata acuminata
aufwiesen, im Mittel 232 versus 450 (p= 0,02) (Tabelle 4).
Der Nachweis der verschieden hohen Mengen von AMP korrelierte weder mit der Anzahl
der
läsionalen
HPV-Typen,
noch
mit
HR-
oder
LR-HPV-DNA-Viruslast
der
quantifizierten α-HPV-Typen, die in dieser Studie untersucht wurden (HPV 6, HPV 11,
HPV 16, HPV 18, HPV 31, HPV 33). Auch die Höhe der CD4+-Zellzahl und der HI-Viruslast als Marker für den Immunstatus ließ sich nicht signifikant der nachgewiesenen HRHPV-DNA beziehungsweise dem jeweiligen AIN-Grad zuordnen.
50
Tabelle 5: Virologische Analyse bei 12 HIV-positiven MSM mit unterschiedlichen Graden von
analen epithelialen Neoplasien 1
Patient
CD4,
HIV-
Grad
High-
Low-risk
HR-
hBD-2
hBD-3
Nr.
µl-1
RNA
der
risk
HPV
HPV-
mRNA 3
mRNA 3
Kopien,
AIN
HPV
DNA-
(HR-
Virus-
HPV)
last 2
35
2,45
0,53
ml
-1
1
567
< 40
1
16/73
61
2
318
< 40
1
16/52
2
1,58
0,59
3
214
< 40
3
16/45
715
19,19
7,27
4
176
< 40
2
33/58/ 11/70/71/81/ 3
2,68
2,87
15
6,83
10,21
19
4,38
4,35
73
82/84/89
61
5
245
< 40
2
16/58
6
1618
< 40
3
16/18/
31
7
142
< 40
2
16/18
54
437
0,07
0,32
8
127
< 40
2
52
54
-
5,07
5,66
9
357
< 40
1
16/58/ 61/70
182
1,14
1,50
0,3
19,72
3,87
-
3,25
1,11
20
5,03
3,79
73
10
64
224
2
18
61
11
405
8900
1
53/56/ 6/42/43
58/68
12
220
67800
2
16/31/ 11
33/35/
45/73
1
AIN ist in Abhängigkeit von der Ausdehnung der dysplastischen Zellen im Epithel in 3
unterschiedliche Grade unterteilt: AIN 1: unteres Epitheldrittel; AIN 2: untere 2/3 des Epithels;
AIN 3: komplettes Epithel (Einteilung nach Fenger und Nielsen, 1981). 2 High-risk Humanes
Papillomavirus (HPV)-DNA-Load ist die kumulative Viruslast von HPV 16, 18, 31 und 33, sofern
einer dieser Subtypen vorhanden ist. HPV-DNA-Load ist definiert als HPV-DNA Kopien per BetaGlobin-Genkopie. HPV 16, 18, 26, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 53, 56, 58, 59, 66, 68, 73 und 82
wurden als High-risk HPV-Typen und HPV 6, 11, 34, 40, 42, 43, 44, 54, 57, 61, 70, 72, 81, 83, 84,
89 als Low-risk-HPV-Typen eingestuft. 3 Nachgewiesene Level der mRNA von antimikrobiellen
Peptiden und Proteinen (AMP) wurden mittels Median-log-Transformation der Gen-Expression
festgelegt. Alle AMP wurden mit dem Housekeeping Gen RPL-38 normalisiert. HBD, humanes
Beta-Defensin.
51
4
4.1
Diskussion
Der Nachweis von AMP in analen intraepithelialen Neoplasien
Ziel dieser Studie war es, antimikrobielle Peptide (AMP) in analen HPV-assoziierten
Läsionen von HIV-positiven und HIV-negativen MSM nachzuweisen und mögliche
Korrelationen zwischen AMP-Expression einerseits und dem Grad der analen
intraepithelialen Neoplasie, immunologischen Parametern wie CD4+- Zellzahl und HIVViruslast sowie vorhandener high-risk oder low-risk HPV-Typen andererseits zu
untersuchen. Es konnte gezeigt werden, dass die Expression der antimikrobiellen Peptide
hBD-2 und hBD-3 sowohl in AIN-Läsionen von HIV-positiven MSM, als auch in
Condylomta acuminata von sowohl HIV-positiven als auch HIV-negativen MSM
signifikant erhöht nachweisbar war. Die mRNA-Expression von LL-37, RNase 7 und
hBD-1 war hingegen in den in der vorliegenden Arbeit untersuchten Läsionen im
Vergleich zu gesunder Schleimhaut nicht signifikant erhöht.
Dies deckt sich mit den Ergebnissen einer jüngst veröffentlichten immunhistochemischen
Studie von Meyer-Hoffert et al., in der hBD-2 und hBD-3 in Verrucae vulgares und
Condylomata acuminata von HIV-negativen Individuen deutlich erhöht exprimiert waren.
Die Autoren vermuten in diesem Zusammenhang, dass die Spontanregression HPVinduzierter Läsionen durch antivirale, antimikrobielle Peptide unterstützt oder induziert
werden und diese beiden Beta-Defensine durch mikrobielle Faktoren und lokale Zytokine
reguliert bzw. hochreguliert werden könnten (Meyer-Hoffert et al., 2008). Es ist bekannt,
dass hBD-2 von Zytokinen wie TNF-α, IL-2 Beta und bakteriellen Komponenten wie z. B.
Pseudomonas aeruginosa stimuliert wird und dass hBD-3 zusätzlich durch Interferon-γ
(IFN-γ) und epidermalen Wachstumsfaktor (EGFR) aktiviert wird (Harder et al., 2000;
Sörensen et al., 2003). Diese Aktivierung erfolgt sehr wahrscheinlich während der beschleunigten Keratinozytendifferenzierung (Harder et al., 2004), so dass eine Interaktion
der Beta-Defensine auch mit viralen Anteilen von HPV plausibel ist. Es existieren
verschiedene Untersuchungen zu der Frage, wo genau die Ansatzpunkte dieser Interaktion
zwischen Virusbestandteilen und Defensinen liegen könnten. Es wurde beispielsweise
nachgewiesen, dass das virale Onkogen E6 von HPV 16 in vitro die Calcium induzierte
Differenzierung der Keratinozyten über eine Inaktivierung von p53 hemmen kann
(Sherman et al., 2004); hierdurch könnte eine hBD-Stimulation induziert werden. Auch
eine direkte Induktion von hBD durch HPV ist denkbar, da wiederum das virale Protein E5
den EGRF stimuliert, der seinerseits ein starker Aktivator von hBD-3 ist (Pim et al., 1992).
52
Da der von aktivierten Makrophagen sezernierte TNF-α im Rahmen der Kontrolle der
Transkription wirksam ist, könnte seine Hochregulierung neben der hohen Expression
viraler Onkoproteine (zur Hausen, 2007) ebenfalls zu einer erhöhten hBD-2-Expression
führen. Die Untersuchungen von Meyer-Hoffert et al. zeigen unterschiedliche Level von
hBD-2- und hBD-3 in Verrucae vulgares und Condylomata acuminata. Die Arbeitsgruppe
spekuliert, dass möglicherweise unterschiedliche HPV-Typen zu unterschiedlicher
Defensin-Expression führen und die höhere Spontanregressionsrate von vulgären Warzen
im Vergleich zu Condylomata acuminata auf höhere hBD-Level zurückzuführen sein
könnte (Meyer-Hoffert et al., 2008).
In der vorliegenden Studie konnte weder eine Korrelation zwischen der hBD-mRNA- und
Protein-Expression und der Anzahl der jeweiligen HPV-Typen nachgewiesen werden,
noch korrelierten die HPV-DNA-Loads (bestimmt für HR-HPV-Typen 16, 18, 31 und 33
und die LR-HPV-Typen 6 und 11) mit der AMP-Expression. Dies unterstützt die Vermutung, dass es sich bei der Hochregulierung der AMP eher um einen indirekten Mechanismus handelt, der über zahlreiche proinflammatorische Zytokine wie TNF-α und IFN-γ angestoßen wird (s. a. Abschnitt 1.6.3). Dies deckt sich mit den Erkenntnissen von Chong et
al., die in ihrer Arbeit einen Anstieg von hBD-2- und hBD-3-mRNA in vivo in rezidivierenden Schleimhautpapillomen feststellen konnten, der ebenfalls nicht mit den unterschiedlichen HPV-Typen oder dem Schweregrad der Läsionen korrelierte (Chong et al.,
2006). Auch sie folgern, dass die Expression von hBD-2 und hBD-3 eher indirekt durch
noch nicht bekannte Faktoren stimuliert zu werden scheint und nicht direkt durch HPV.
4.2
Die Funktion der Defensine
Ebenso wie in der Haut findet man auch in der normalen Mukosa eine deutliche
Expression von Beta-Defensinen, die wahrscheinlich als Schlüssel-Mediatoren der
angeborenen Immunabwehr agieren und dem Wirt neben der Abwehr von Pilzen und
Bakterien auch die der Papillomviren erleichtern. Als wichtig sei hier erwähnt, dass Chong
et al. zwar extrem erhöhte Level von hBD nachweisen, parallel dazu jedoch eine
Krankheitsprogression, d.h. Wachstum und Vermehrung der Viruspapillome feststellen
konnten (Chong et al., 2006). Dies deutet auf ein multifaktorielles Geschehen, an dem
unterschiedliche Komponenten der angeborenen und erworbenen Immunabwehr beteiligt
sind. Möglicherweise kommt es hier aufgrund von spezifischen Gegebenheiten der
Mundschleimhaut zu einer frustranen Hochregulierung der Beta-Defensine, die nicht zur
53
HPV-Eradikation führt. Es gibt Hinweise, dass epitheliale Beta-Defensine in der Lage sind,
auch andere Virusinfektionen in Schach zu halten, dass sie zum Beispiel die Replikation
von HIV-1 oder von Adenoviren, Herpes- und Influenzaviren hemmen können. Die erste
Erwähnung einer antiviralen Aktivität findet sich in einer Arbeit von Daher et al. (Daher et
al., 1986). Nach heutigen Erkenntnissen sind Defensine in der Lage, direkt mit dem Virion
oder der Zielzelle zu interagieren oder indirekt in ein virales Infektionsgeschehen
einzugreifen (Gropp et al. 1999; Zhang et al., 2002; Quinones-Mateu et al., 2003; Duits et
al, 2003; Yasin et al., 2004; Proud et al., 2004; Chang et al., 2005; Klotmann und Chang,
2006).
4.3
Die Interaktion der AMP mit Zellen der lokalen Abwehr
In diesem Zusammenhang sind epitheliale dendritische Zellen und Langerhanszellen in
ihrer Funktion als Antigen präsentierende Zellen essenziell für die Iniziierung der Immunantwort der nativen Immunabwehr. Im dynamischen Abwehrprozess des mukosalen
Umfelds reagieren sie auf sezernierte Produkte der Oberflächenepithelien und organisieren
die Interaktion von nativer und adaptiver Immunabwehr (Schröder et al., 2006). Es konnte
in verschiedenen Arbeiten dargestellt werden, dass insbesondere die dendritischen Zellen
mit HPV-Virionen und Virus-like Particles (VLP) interagieren und auch sie eine entscheidende Rolle bei der Abwehr der primären HPV-Infektion übernehmen (Lenz et al., 2001;
Offringa et al., 2003; Yang et al., 2005; Chong et al., 2006, Kandler et al., 2006). Gemeinsam mit den dendritischen Zellen sind hBD in der Lage, im Rahmen der Abwehr von
Papillomvirusinfektionen die native und adaptive Immunantwort zu koordinieren. So
besitzt beispielsweise hBD-2 die Fähigkeit, über den Zytokin-Rezeptor CCR6 dendritische
Zellen zu rekrutieren und Memory-T-Zellen chemotaktisch anzulocken (Yang et al., 2005;
Chong et al., 2006). Keratinozyten exprimieren funktionelle Toll-like-Rezeptoren (TLR)
und sind so in der Lage, über unterschiedliche Zytokin-Pattern eine adäquate Immunantwort zu iniziieren (Lebre et al., 2004). Man vermutet, dass die Aktivität der Beta-Defensine durch Toll-like-Rezeptoren mediiert wird: proinflammatorische Zytokine werden
TLR-vermittelt produziert, dies wiederum induziert eine verstärkte Expression von BetaDefensinen, die dann als Effektor-Moleküle fungieren (Boman et al., 2003; Nagy et al.,
2005; Selsted und Ouellette, 2005; Klotmann und Chang, 2006).
54
4.4
Beta-Defensine in chronisch-entzündlichen Dermatosen
Psoriatische Läsionen weisen hohe Level von Beta-Defensinen auf und sind selten
superinfiziert, während die hBD-2-, hBD-3- und LL-37-Expression in atopischer Haut
signifikant vermindert ist und diese häufig mit Pilzen, Bakterien oder Viren superinfiziert
ist. Es wird vermutet, dass diese erhöhte Empfindlichkeit für mikrobielle Superinfektion
auf die verstärkte Aktivität der TH2-Lymphozyten zurückzuführen ist, welche die Hochregulierung der Beta-Defensine hBD-2 und -3 unterdrückt (Ong et al., 2002; Nomura et al.,
2003). Das erklärt wahrscheinlich auch die Häufigkeit von vulgären und genitalen Warzen
bei Atopikern im Vergleich zu Nicht-Atopikern. Die Suszeptibilität für HPV-Infektionen
mit klinisch verruköser Ausprägung ist bei Atopikern erhöht, allerdings wohl nicht die
Infektion mit HR-Varianten und somit intraepithelialen Neoplasien. Interessant wäre eine
Untersuchung, ob Atopiker aufgrund der verstärkten TH2-Aktivität und Aktivierung BetaDefensin-unterdrückender Zytokine eher intraepitheliale Neoplasien an Haut und Mukosa
entwickeln. Harder und Schröder konnten nachweisen, dass in anderen Dermatosen wie
beispielsweise der Psoriasis vulgaris die Hochregulierung der Beta-Defensine bakterieller
Superinfektion vorbeugt (Harder und Schröder, 2005). Ein mit der atopischen Dermatitis
vergleichbares Expressionsmuster der Beta-Defensine hBD 1-3 konnte auch in Mycosis
fungoides-Läsionen beobachtet werden. Gambichler et al. vermuten hier einen ähnlichen
TH2-gesteuerten Regulationsmechanismus (Gambichler et al., 2007).
In einer jüngst publizierten Studie der Bochumer Arbeitsgruppe wurden 29 Frauen mit
Lichen sclerosus et atrophicus (LSA) und 10 erscheinungsfreie Frauen auf das Vorhandensein von hBD-1 bis -3 untersucht. Die mittleren hBD-2-mRNA-Level waren bei vorliegendem LSA signifikant erhöht nachweisbar; immunhistochemisch konnte dies ebenfalls
bestätigt werden. Die Protein-Level von hBD-1 und -3, LL-37 und RNase 7 differierten
nicht signifikant zwischen LSA-positiven und LSA-negativen Frauen (Gambichler et al.,
2009). Möglicherweise wird hBD-2 lediglich durch die Antwort der angeborenen Immunabwehr auf erhöhte Infektionsanfälligkeit der LSA-läsionalen Haut hochreguliert, oder diese Ergebnisse sind ein weiteres Indiz für die direkte pathogenetische Rolle von antimikrobiell aktiven Peptiden, in diesem Fall im Rahmen des (chronifizierenden) LSA. In jedem
Fall scheint die angeborene Immunabwehr signifikant durch die anwesenden AMP beeinflusst bzw. bestimmt zu sein.
55
4.5
AMP und HPV
Die Arbeitsgruppe um Chong et al., die als erste deutlich hochregulierte hBD in oralen
Papillomvirusinfektionen beim Menschen nachgewiesen hat, konnte trotz hoher Level an
Beta-Defensinen keine expliziten umgebenden Entzündungsreaktionen feststellen (Chong
et al., 2006). Dies ließ sich auch in der vorliegenden Studie bestätigen, interessanterweise
zeigte hier keiner der Patienten mit AIN oder Condylomata acuminata Zeichen einer
bakteriellen Super- oder Co-Infektion, obwohl 58 % der AIN-Patienten eine deutliche
Immunreduktion von weniger als 250 CD4+-Zellen/µl aufwiesen und die AIN-Läsionen
oberflächliche Erosionen zeigten. Auch wenn in der hier beschriebenen Studie keine
eindeutigen Korrelationen von HPV-Typ und Beta-Defensin-Expression darstellbar waren,
so kann man doch spekulieren, dass hier, vergleichbar mit psoriatischen Läsionen, durch
andere Mediatoren antimikrobielle Peptide im Rahmen der Keratinozytendifferenzierung
induziert und hochreguliert werden. Dies scheint sich vor allem bei einer mittleren CD4+Zellzahl abzuspielen (250-500 CD4+/µl), hier zeigte sich bei den Patienten eine hohe hBD2- und hBD-3-Expression. Höhere Level fanden sich in der Regel bei AIN Grad 2 und 3,
immer assoziiert mit HR-HPV-DNA-Nachweis. Es liegt somit nahe, dass es im Rahmen
des Zusammenspiels von angeborener und erworbener Immunabwehr zwar zu einer
Hochregulierung von epithelialen Defensinen kommt, diese jedoch nicht so effektiv zu sein
scheint beziehungsweise weitere Faktoren für eine effektive Immunabwehr hinzukommen
müssen.
Zur antibakteriellen Aktivität von RNase 7, einem Mitglied der humanen RNase-ASuperfamily, gibt es Studien, jedoch fehlt bislang der Nachweis einer antiviralen Aktivität
in der Haut (Harder und Schröder, 2002). RNase 7 wird regulär in normaler Haut exprimiert. In den hier wiedergegebenen Untersuchungen zeigten sich keine signifikanten
Unterschiede in der RNase 7-Expression in läsionaler und nicht-läsionaler Haut.
Möglicherweise deutet dies auf ihre geringe Bedeutung im Rahmen der viralen Abwehr,
insbesondere bei der Bekämpfung HPV-assoziierter epithelialer Läsionen. In der
vorliegenden Studie konnte keine relevante RNase 7-mRNA-Expression nachgewiesen
werden.
Im Gegensatz zu den Ergebnissen der Arbeitsgruppe um Conner, die eine erhöhte LL-37Expression bei Patienten mit Condylomata acuminata und Verrucae vulgares aufzeigen
konnte (Conner et al., 2002), war in der vorliegenden Studie in sämtlichen analysierten
HPV-assoziierten Läsionen keine erhöhte LL-37-Expression nachweisbar. LL-37, das
einzige humane Cathelicidin, wird vorwiegend von Keratinozyten und Neutrophilen in
56
entzündlich veränderten Arealen exprimiert (Zanetti, 2004), wie hBD-2 zeigt es eine
ausgeprägte antibakterielle Aktivität und ist im Epithel psoriatischer Läsionen signifikant
erhöht nachweisbar (Agerberth et al., 1995; Frohm et al., 1997; Harder et al., 1997). Da es
bisher nur in entzündlichen Läsionen nachgewiesen wurde, wäre zukünftig interessant, ob
die fehlende Entzündungsaktivität in HPV-induzierten Läsionen die Expression von LL-37
verhindert. Das multifunktionale LL-37 wird in entzündlichem Milieu dauerhaft exprimiert, wie Untersuchungen von Harder et al. an der Gingiva zeigen, während andere Defensine wahrscheinlich nur in Abhängigkeit von dem die Entzündung auslösenden Agens,
beispielsweise von bestimmten Bakterienkulturen, reguliert werden (Harder et al., 1997;
Weinberg et al., 1998). Auf der anderen Seite ist ebenfalls denkbar, dass LL-37 in der Lage
ist, tumorsuppressive Zytokine zu beeinflussen, so dass es zu einem Fortschreiten einer
malignen Transformation kommt. So zeigt eine Studie von Scott et al., dass es in
Makrophagen zu einer Reduktion von TNF-α-Leveln kommen kann, die zuvor von LPS
hochreguliert wurden (Scott et al., 2002).
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass hBD-2 und -3 selektiv in HPVLäsionen induziert werden, andere AMP hingegen nicht. Es sind weitere Untersuchungen
notwendig, auch diese Selektivität zu untersuchen, um insbesondere die Rolle von LL-37
und RNase 7 in der Abwehr von HPV-Infektionen und in HPV-assoziierten Hautläsionen
zu klären. Meyer-Hoffert et al. spekulieren hier, dass humane Papillomviren
möglicherweise in der Lage sind, verschiedene Defensine zu generieren, die eine
entzündliche (bakterielle) Co-Infektion verhindern, wodurch auf der anderen Seite die
zellvermittelte Immunität verzögert wird (Meyer-Hoffert et al., 2008).
4.6
AMP und HIV
Schonwetter et al. konnten erstmals die Anwesenheit von Beta-Defensinen in der oralen
Mukosa eines Säugetieres nachweisen (Schonwetter et al., 1995). Zuvor wurden von
Diamond et al. Beta-Defensine im mukosalen Epithel der Trachea entdeckt (Diamond et
al., 1991). Es folgten diverse Studien, in denen unterschiedliche Level an Beta-Defensinen
in verschiedenen Bereichen der Mundhöhle nachgewiesen werden konnten. Die Arbeitsgruppe um Weinberg et al. konnte in ihren Daten von 2003 bis 2006 zeigen, dass die HIVX4- und HIV–RA-Phänotypen hBD-2 und hBD-3-mRNA in humanen oralen epithelialen
Zellen induzieren und hBD-2 und hBD-3 die HIV-1-Replikation in direkter Interaktion mit
Virionen und durch die Modulation des CXCR4 Co-Rezeptors blockieren können und
57
somit möglicherweise entscheidend an der Abwehr der mukosalen Transmission von
HIV-1 beteiligt sind (Weinberg et al., 2006). In dieser Studie konnte mRNA von BetaDefensinen durch Kontakt der oralen Mukosa mit HIV-1 induziert werden, und auf der
anderen Seite konnte die Suszeptibilität für eine HIV-Infektion durch Beta-Defensine
blockiert werden. Weinbergs Untersuchungen zur antiviralen Aktivität der mukosalen
Beta-Defensine gehen zum einen von der epidemiologischen Beobachtung aus, dass eine
Infektion mit HIV-1 über die orale Mukosa sehr selten vorkommt (Transmissionsrate unter
1 %), wohingegen über 90 % der HIV-Infektionen über die anogenitale Mukosa erfolgen
(Quinones-Mateu et al., 2003). Ein bestimmender Faktor hierfür mag die geringe, bis heute
noch nicht vollständig geklärte Konzentration von HIV-1-RNA, proviraler DNA oder
HIV-infizierter Zellen in der Saliva sein, ein anderer Faktor die unterschiedlichsten antimikrobiellen Peptide der lokalen Immunabwehr im Bereich der Mundhöhle oder eine
Interaktion der Beta-Defensine mit gp120, einem wesentlichen Oberflächenrezeptor des
HI-Virus. Die Arbeitsgruppe um Weinberg stützt sich hier auf fremde und eigene vorangegangene Untersuchungen, in denen Beta-Defensine als konstitutiver (hBD-1) oder induzierbarer (hBD-2 und hBD-3) wesentlicher Bestandteil der angeborenen Immunabwehr
gegen Bakterien, Pilze und Viren nachgewiesen werden konnten (Quinones-Mateu et al.,
2003). In einer Arbeit von 1998 wird von der Arbeitsgruppe um Weinberg festgestellt, dass
AMP die natürliche Flora an Mikroorganismen der Luftwege, des Intestinums, des Urogenitaltraktes und der Mundhöhle in Balance halten (Weinberg et al., 1998).
Nach wie vor sind sowohl die Mechanismen der oralen mukosalen Transmission von HIV1, als auch die der mukosalen Abwehr von HIV-1 unverstanden und erfordern
weitergehende Untersuchungen, um gegebenenfalls neue Therapiestrategien auf der Ebene
möglicher Rezeptorblockaden entwickeln zu könnnen. Auch können orale Mukosa und
ihre Abwehrmechanismen nicht unbedingt denen der genitalen Mukosa gleichgesetzt
werden. In normalen humanen oralen Epithelzellen (NHOEC) finden sich bereits große
Mengen von hBD-2 und hBD-3. Die Ursache hierfür liegt wahrscheinlich in der Anwesenheit der regulären oralen Bakterienflora, die für eine kontinuierliche Auseinandersetzung
("Cross-Talking") der angeborenen Immunabwehr mit mikrobieller Flora und spezifischen
Zellen des adaptiven Immunsystems sorgt (Quinones-Mateu et al., 2003; Weinberg et al.,
2006). Dies deckt sich auch mit Erfahrungen aus dem klinischen Alltag; im Vergleich zu
ausgeprägten therapierefraktären anogenitalen HPV-Infektionen bei HIV-infizierten Individuen werden auch hier deutlich seltener (zusätzliche) schwerwiegende HPV-induzierte
orale Papillome beobachtet. Es ist denkbar, dass die Abwehrstrategien gegen Viren in
58
Abhängigkeit vom Ort der Infektion variieren. Möglicherweise unterliegt die genitale
Mukosa anderen Gesetzen als die orale Mukosa bzw. sind Titer von HIV-1 oder HPV im
Speichel oder Genitalsekreten unterschiedlich und induzieren infolgedessen auch unterschiedliche Level an hBD-mRNA-Expression und unterschiedliche Typen antimikrobieller
Peptide (Ho et al., 1995; Ho et al., 1998; Dale und Krisanaprakornkit, 2001). Zunehmend
wird auch HR-HPV in erscheinungsfreier Mukosa und oralen Läsionen wie z. B. oralen
Leukoplakien und Lichen planus der Mundschleimhaut nachgewiesen; die HPV- Prävalenz
variiert hier stark (Campisi et al., 2007). Screeninguntersuchungen an der Mukosa im
Rahmen des AIN-Screenings bei HIV-positiven MSM sind notwendig, um hier genauere
Erkenntnisse bezüglich des oralen onkogenen Potentials von HPV bei HIV-Infektion zu
gewinnen.
Die in der hier berichteten Studie erhöht nachgewiesenen hBD-2 und hBD-3-Level in AIN
und Condylomata acuminata könnten also allein durch HIV-1 induziert worden sein. Da
die Expression der AMP jedoch in Condylomata acuminata von HIV-positiven und HIVnegativen MSM gleichermaßen erhöht nachweisbar war, ist davon auszugehen, dass die
erhöhten Level von hBD-2 und hBD-3 als HIV-unabhängig zu bewerten und eher auf die
HPV-Infektion als solche zurückzuführen sind. Es existieren bislang zu wenige Erkenntnisse über die Rolle von HIV und seinen Einfluss auf sowohl direkt das Fortschreiten einer
HPV-Infektion als auch auf eine mögliche indirekte AMP-Induktion. Denkbar ist, dass der
Einfluss von HIV im Rahmen der beschleunigten und häufigeren Entwicklung von Karzinomvorläuferläsionen (AIN, CIN, PEIN, VIN, VAIN) und Karzinomen des Anogenitaltraktes zum Tragen kommt, in Interaktion mit lokaler adaptiver Immunabwehr durch
Freisetzung bestimmter Apoptose blockierender Zytokine. Hier werden Interaktionen HIVinfizierter Zellen mit HPV-infizierten Keratinozyten vermutet, mit Freisetzung bestimmter
Zytokine (IL-6, TNF-α), die wiederum die HPV-Gen-Expression fördern (Arany et al.,
2001). Wie in der Einleitung erwähnt, fungiert das HIV-Tat-Gen in HPV-infizierten Keratinozyten zusätzlich als Aktivator der HPV-Onkogene E6 und E7 (Vernon et al., 1993; Yochim et al., 2005), durch die eine Vielzahl von Inaktivierungsprozessen angestoßen wird,
die letztlich die körpereigenen Mechanismen der Tumorsuppression außer Kraft setzen.
4.7
Beta-Defensine unter HAART
Ebenso spekulativ ist in diesem Zusammenhang, welche Rolle die hochaktive antiretrovirale Therapie (HAART) spielt und ob sie einen Anteil an der Hochregulierung der Beta59
Defensine hat. Die klinische Beobachtung, dass trotz HAART ausgeprägte genitale und
orale HPV-Infektionen und HPV-induzierte Karzinome entstehen, muss dem nicht widersprechen. Man vermutet, dass es unter der HAART zu einer frustranen beziehungsweise
ineffizienten Hochregulation insbesondere der Beta-Defensine kommt. Dass eine Hochregulierung von hBD-2 und -3 auch in HPV-induzierten Condylomata acuminata von HIVnegativen MSM nachgewiesen werden kann, lässt allerdings vermuten, dass es sich sowohl
bei der HPV- als auch der HIV-Infektion und möglicherweise auch der HAART eher um
indirekte Mobilisatoren der angeborenen Immunabwehr handelt (Meyer-Hoffert et al.,
2008).
In einer retrospektiven Analyse von Crum-Cianflone et al. von Daten zum Erkrankungsverlauf von 4498 HIV-infizierten US-Army-Angehörigen (Tri-Service-AIDS Clinical
Consortium, TACC) wurden Inzidenzraten von AIDS-definierenden Karzinomen (ADCs)
untersucht, um Trends in der Karzinomentwicklung in dieser Risikopopulation abzuschätzen und den Stellenwert der HAART herauszukristallisieren (Crum-Cianflone et al.,
2009). Die Arbeitsgruppe stellte im Vergleich der Zeiträume vor HAART (frühe Zeit 1984
bis 1990 und späte Zeit 1991 bis 1995) und nach Einführung der HAART (frühe Zeit 1996
bis 2000 und späte Zeit 2001 bis 2006) fest, dass bei insgesamt sinkender Häufigkeit der
ADCs, die Anzahl der nicht-AIDS-definierenden Karzinome (NADC) im Verlauf deutlich
angestiegen ist. Dieser Anstieg korrelierte mit steigendem Alter der HIV-Infizierten. Die
Autoren folgern, dass der protektive Effekt der HAART lediglich in Bezug auf die ADCs
nicht aber auf die NADCs gilt. Aufgrund des langen Follow-ups in der späten HAART-Ära
konnte in der Studie ein signifikantes Abnehmen in der Inzidenz der ADCs festgestellt
werden, wohingegen die der NADCs deutlich anstieg. Die häufigsten ADCs waren das
Kaposi Sarkom sowie das Non-Hodgkin-Lymphom; die häufigsten NADCs waren
Hauttumoren (außer Kaposi Sarkom) und das Analkarzinom. In der frühen Post-HAARTÄra hielten sich die Raten relativ stabil, während in der Zeit von 2000-2006 ein deutlicher
Anstieg zu verzeichnen war. Die Anstiegsrate des Analkarzinoms war mit 13-facher Rate
im Verlauf der Studie statistisch signifikant erhöht. Die Ursache für die Zunahme der
NADCs sehen die Autoren zum einen in der langen Latenzzeit, bis HPV seine onkogene
Potenz entwickelt, sowie in erhöhtem Risikoverhalten (z. B. Rauchen) und einem
möglichen direkten onkogenen Effekt des HIV selbst (HIV-Tat-Gen). Die Arbeitsgruppe
um Crum-Cianflone konnte weder eine Assoziation zwischen HAART-Einnahme und
Entwicklung eines NADCs feststellen noch in Bezug auf eine niedrige CD4+-Zellzahl.
Auch wurden viele Co-Faktoren (Lifestyle, positive Familienanamnese, Co-Infektionen
60
u.a.) nicht erfasst, und Trends hinsichtlich des Analkarzinoms bei MSM ließen sich in
dieser Kohorte ebenfalls nicht herauskristallisieren (Crum-Cianflone et al., 2009).
Risikofaktoren für die erhöhte Inzidenz von Analkarzinomen bei HIV-positiven und HIVnegativen MSM (n=6972) wurden in einer Multicenter AIDS Cohort Study für die Periode
von 1984-2006 von D’Souza et al. untersucht. Das erhöhte Risiko für HIV-positive MSM,
ein Analkarzinom zu entwickeln, war in der HAART-Ära (1996 bis 2006) siginifikant
erhöht im Vergleich zur Prä-HAART-Ära. Dies wurde von der Arbeitsgruppe zum einen
auf eine verlängerte HAART-bedingte Überlebenszeit zurückgeführt, die HPV-bedingten
analen Neoplasien die Umwandlung in ein Malignom ermöglicht, zum anderen auch auf
sexuelles Risikoverhalten, wie etwa eine hohe Anzahl Sexualpartner und häufiger
rezeptiver Analverkehr. Sämtliche MSM mit Analkarzinom in dieser Studie waren unter
HAART, hatten eine niedrige Viruslast und CD4+-Zellzahl über 200/µl, so dass naheliegt,
dass trotz Immunrekonstitution die antiretrovirale Theapie nicht effektiv ist, eine
Progression von analen intraepithelialen Neoplasien zum invasiven Analkarzinom zu
verhindern (Abramowitz et al., 2007; D’Souza et al., 2008). Der mangelnde Effekt der
HAART auf Inzidenz bzw. Rückbildung einer AIN 3 oder CIN 3 bei HIV-positiven
Männern und Frauen deutet darauf hin, dass die Immunrekonstitution nicht HPV-spezifisch ist und das Ansteigen der CD4+-Zellzahl nicht die HPV-spezifische Immunrekonstitution widerspiegelt. Dies hat seine Ursache möglicherweise in limitierten Effekten
der HAART auf infizierte Epithelzellen (Palefsky und Holly, 2003). Auf der anderen Seite
ist es auch unwahrscheinlich, dass HAART einen direkten prädisponierenden Effekt auf
das Epithel hat, da hohe AIN-Prävalenzen auch in der Prä-HAART-Ära auftraten (Palefsky
et al., 2001; Palefsky, 2006); wahrscheinlicher ist jedoch, dass die antiretrovirale Therapie
nicht das Epithel, und dort die epitheliotropen Viren, erreicht bzw. hier keine Interaktion
stattfindet. Um den genauen immunrekonstituierenden Effekt der HAART bestimmen zu
können, fehlt es zur Zeit noch an spezifischen Biomarkern, die die systemische und lokale
spezifische HPV-Immunantwort messen und darstellen können. HPV-Typ, HIV-RNALevel und CD4+-Level sind bislang nicht erwiesenermaßen signifikant assoziiert mit dem
erhöhten Risiko einer AIN 3 oder CIN 3 (Palefsky, 2006).
4.8
Lokalisation der Beta-Defensin-Expression
Ein Manko der vorliegenden Studie könnte die Tatsache sein, dass für die PCR eine 3 mm
tiefe Stanzbiopsie verwendet wurde, so dass die gesamte Epidermis und Dermis erfasst
61
wurde. So können störende Effekte von Zellen anderer, nicht-epidermaler Hautstrukturen
wie z. B. von Schweißdrüsen, Haarfollikeln, Fibroblasten und weiteren nicht ausgeschlossen werden. Auch dort vorhandene Mastzellen und andere inflammatorische Zellen können
AMP produzieren. Es konnten jedoch hBD-2 und hBD-3 immunhistochemisch vorwiegend
im Stratum corneum und Stratum granulosum nachgewiesen werden, so dass davon
auszugehen ist, dass das subepidermale Kompartiment mit seinen Hautanhangsgebilden
nicht das relevante Korrelat für die Ausbildung von AMP darstellt. Eine weitere
Problematik besteht darin, dass die Anzahl der Biopsien in der vorliegenden Studie recht
gering war, so dass lediglich Trends aufgezeigt werden können. Wünschenswert wäre
auch, diese Trends im Follow-up zu beobachten, um zu evaluieren, ob unter Umständen im
zeitlichen Verlauf die AMP-mRNA nach wie vor signifikant exprimiert wird bzw. andere
Korrelationen zum Grad der AIN oder immunologischen Parametern nachgewiesen
werden können. So könnten neue interessante Fragestellungen untersucht werden,
beispielsweise, ob sich die AMP-Expression je nach Dauer der HIV- oder HPV-Infektion
bzw. der HAART verändert und ob die frustrane Hochregulation der Beta-Defensine hBD1 und -2 in AIN persistiert oder es zu einem Abbau kommt.
4.9
p16ink4a- ein indirekter Proliferationsmarker für HPV-Onkoproteine
In Zusammenhang mit der AMP-Bestimmung ist die Korrelation der hBD-Expression zu
anderen regulatorischen Proteinen interessant, wie beispielsweise dem Tumorsuppressorgen p53 und dem regulatorischen Protein p16ink4a. Der zyklin-abhängige Kinaseinhibitor
p16ink4a wird durch die Aktivität der Onkogene E6 und E7 in seiner Funktion ausgeschaltet,
so dass es zu einer massiven Überexpression kommt und Regulation und Kontrolle der
Proliferationsaktivität außer Kraft gesetzt wird (zur Hausen, 2007). Damit ist p16ink4a ein
indirekter Marker für HPV-Onkoproteine. In einer Arbeit von Kreuter et al. konnte ein
Abfall von p16ink4a nach immunmodulatorischer Therapie analer intraepithelialer
Dysplasien mit Imiquimod festgestellt werden, der signifikant mit dem Rückgang der HRHPV-DNA korrelierte. In einer neueren Untersuchung korrelierten p16ink4a-Nachweis und
HR-DNA-Load in untersuchten penilen intraepithelialen Neoplasien (PEIN). P16ink4a ist
stark exprimiert in HPV-induzierten Karzinomen und Vorläuferläsionen und wird zum
Grading der CIN verwendet (Kreuter et al., 2007; Kreuter et al., 2008a). Hier sind Studien
mit größeren Kohorten im Verlauf über Jahre notwendig, um eine Korrelation der
hochregulierten Beta-Defensine mit verstärkter p16ink4a-Expression in HR-HPV-Läsionen
62
herauszuarbeiten. Hieraus könnten sich möglicherweise Optionen für neue Therapieansätze
ergeben. P16ink4a ist als Biomarker für die zelluläre Antwort auf transformierende HRHPV-Infektionen ein guter Prädiktor für intraepitheliale Neoplasien. Dies wurde für
zervikale Dysplasien vielfach beschrieben und ist möglicherweise auch an anderen
Transitionszonen ein valider Proliferationsmarker zur Detektion von hochgradigen
intraepithelialen Neoplasien (Nakao et al., 1997).
4.10 Effekt und antivirale Aktivität der hochregulierten Peptide
In der vorliegenden Studie hatten 7 von den 12 AIN-Patienten rezidivierende d.h. mehr als
eine histologisch nachgewiesene AIN-Manifestation, und weder AIN noch Condylomata
acuminata bei HIV-positiven MSM waren im Verlauf rückläufig. Auch bei den HIVnegativen MSM waren die Genitalwarzen nicht rückläufig. Es scheint, dass stark
hochregulierte hBD nicht in der Lage sind, eine HPV-Infektion insbesondere bei Patienten
mit deutlicher Immunsuppression und chronischer Erkrankung abzuwehren. Eher ist es
wahrscheinlich, dass den im Falle einer Infektion schnell freigesetzten Beta-Defensinen als
potente Immunmodulatoren eine Signalwirkung zur Induktion des angeborenen und
adaptiven Immunsystems zukommt (Oppenheim und Yang, 2005). Hierdurch ließe sich
auch der Nachweis stark hochregulierter Defensine nicht nur in AIN von HIV-positiven
MSM, sondern auch in Condylomata acuminata von HIV-negativen MSM in der
vorliegenden Studie erklären: im Falle einer HPV-Infektion kommt es lokal zur
Mobilisation von Defensinen, die ihrerseits in Interaktion zu Mediatoren, Zytokinen und
auch antigenpräsentierenden Zellen sowie T-Helfer- und T-Suppressorzellen treten.
Defensine können auch durch Mediatoren und Aktivierung von Toll-like-Rezeptoren
induziert werden und Immunantworten des adaptiven Immunsystems modulieren und sind
so direkt am Infektionsschutz der Schleimhaut beteiligt. Ob die jeweiligen Aktionen dann
erfolgreich sind, hängt ab von der Grundstruktur des Wirtsorganismus, ob dieser in der
Lage ist, eine immunologische Balance zu halten, oder aber, ob es durch andere Faktoren
wie Immunsuppression durch HIV oder Arzneimittelwirkungen bei Organtransplantierten
auf Dauer zu einer Art Redundanz der Aktion kommt und das onkogene Potential
bestimmter HPV-Typen Oberhand gewinnt. Wahrscheinlich muss man die Defensine in
unterschiedlicher Ausprägung als Effektoren der angeborenen Immunabwehr und als
Regulatoren der adaptiven Immunabwehr betrachten (Boman, 2003). TLR fungieren hier
als Initiatoren der angeborenen Immunabwehr, indem sie den Wirtsorganismus mit der
63
Fähigkeit ausstatten, pathogen-assoziierte molekulare Pattern (PAMP) der mikrobiellen
Organismen zu erkennen (Klotman und Chang, 2006). Eine immunmodulatorische
Funktion der Beta-Defensine scheint unbestritten, sie aktivieren unreife dendritische Zellen
(iDCs), Monozyten und T-Zellen und sind beteiligt an der Maturation von iDCs (Yang et
al., 1999; Biragyn et al., 2002; Wu et al., 2003; Weinberg et al., 2006).
Buck et al. konnten in ihrer Studie zeigen, dass α-Defensine, die vorwiegend von
neutrophilen Granulozyten sowie in Epithelzellen, NKCs und Makrophagen produziert
werden, potente Antagonisten gegen HPV-Infektionen an Haut und Schleimhaut darstellen.
Sie konnten anhand eines Vektormodells für HPV aufzeigen (s. Abschnitt 1.6.3 dieser
Arbeit), dass Alpha-Defensine eine inhibierende Aktivität in frühen Stadien der HPVReplikation aufwiesen, während hingegen hBD-2 und hBD-3 nur eine geringe Anti-HPVAktivität zeigten (Buck et al., 2006). Die Komplexität der antiviralen Immunantwort des
angeborenen Immunsystems zeigt sich auch in Untersuchungen der Arbeitsgruppe um
Chang et al., die eine Anti-HIV-1-Aktivität von hAD-1 feststellen konnte. In Abwesenheit
von Serum konnten sie diese als direkt gegen HIV-1 gerichtet darstellen sowie in
Anwesenheit von Serum eine hAD-1-Aktivität in bestimmten Target-Zellen, die zu einer
Blockierung der HIV-Infektion in primären CD4+-T-Zellen auf der Ebene der Transkription führte. Hier scheint die Interaktion von hAD-1 und der Proteinkinase C (PKC) entscheidend. PKC spielt eine Schlüsselrolle in der Kontrolle der HIV-Infektion, und Chang
et al. konnten nachweisen, dass die hAD-1-mediierte HIV-1-Inhibition in primären CD4+Zellen durch die Blockierung von PKC-vermittelten Signalschritten entsteht (Chang et al.,
2003; Chang et al., 2005). Es gibt vielfache Hinweise, dass verschiedenste antimikrobielle
Peptide nicht nur potente HIV-1-Blocker in vitro sind, sondern ebenfalls in vivo anti-HIV1-Aktivität entfalten (Cole und Lehrer, 2003). 1986 konnten bereits Daher et al. eine
antivirale inaktivierende Aktivität von humanen neutrophilen Peptiden (hNP, später hAD)
gegen HSV-1, Zytomegalie und Influenza in vitro nachweisen (Daher et al., 1986), Hazrati
et al. konnten später die Inaktivierung von HSV in vitro auch durch Beta-Defensine zeigen
(Hazrati et al., 2006). Weiterführende Untersuchungen der anti-HIV-Aktivität von
Defensinen werden zukünftig zu einem erweiterten Verständnis des natürlichen Verlaufs
der HIV-Infektion führen. Hier spielen auch veränderte Zellen und Zellfunktionen im
Rahmen der HIV-Infektion eine wesentliche Rolle für die Kapazität, auf Infektionen
adäquat zu reagieren. Als Beispiel sei hier die im Rahmen der HIV-Infektion zumeist
bestehende Neutropenie und Dysfunktion der neutrophilen Granulozyten genannt, die
möglicherweise eine Alteration in der hAD-Produktion bewirkt (Chang et al., 2005).
64
In der vorliegenden Arbeit konnte die Expression von hAD in AIN-Läsionen und
Condylomata acuminata der Patienten aufgrund der Komplexität des Themas leider nicht
untersucht werden. Insbesondere im Hinblick auf das gemeinsame Auftreten von HIV- und
HPV-Infektion und zukünftiger Erklärungsmodelle für Persistenz und Aggravierung der
klinischen Ausprägung von HPV-Infektionen bei HIV-infizierten Individuen sind größere
Studien hinsichtlich des Ineinandergreifens von hAD- und hBD-Aktivität im Rahmen der
angeborenen Immunabwehr wichtig. In-vivo-Studien zur α-Defensin-Expression in HPVassoziierten Haut- und Schleimhautläsionen werden in der Zukunft von großem Interesse
sein. Auch sind weitere Untersuchungen notwendig zum Zusammenhang zwischen HPVInfektion und hBD-Hochregulierung einerseits und dem Ausbleiben bakterieller
Superinfektion bzw. der Hochregulierung anderer AMP wie z. B. LL-37 oder Psoriasin
und entzündlicher Reaktion andererseits, um möglicherweise neue Therapiestrategien zu
entwickeln. Auch die Evaluierung anderer immunologischer Parameter wie z. B. der Level
unterschiedlicher T-regulatorischer Zellen (Tregs), die (in unterschiedlichem Ausmaß) das
Tumorwachstum in Schach halten können, sind zukünftig von großer Bedeutung (BaecherAllan und Anderson, 2006; Winters et al., 2008). So wurde beispielsweise in einer Studie
festgestellt, dass hohe Level an zytotoxischen CD8+-T-Zellen bei Patientinnen mit
Zervixkarzinom eine Metastasierung in die drainierenden Lymphknotenstationen
verhindern konnten (Piersma et al., 2007; Winters et al., 2008).
4.11 Risikofaktoren, Co-Faktoren
In diesem Zusammenhang stellt sich die Frage, welche Parameter den Grad der
Immundefizienz adäquat messen können; heute weiß man, dass bei HIV/AIDS neben der
CD4+-Zellzahl und der Viruslast viele Faktoren eine Rolle spielen, unter anderem auch der
Beginn der HAART. Es handelt sich um ein komplexes Zusammenspiel multipler
Faktoren, um eine bislang nicht vollständig verstandene Interaktion von angeborener und
adaptiver Immunabwehr. Hier sei auch der Einfluss des Lebensstils (Rauchen und andere
Drogen,
Ernährung,
Sexualverhalten)
erwähnt,
der
schwer
evaluierbar
bleibt.
Beispielsweise gibt es Untersuchungen, die unter anderem das Rauchen als wesentlichen
Risikofaktor für eine zervikale HPV-Infektion und zervikale plattenepitheliale Karzinome
herausstellen; in zervikalem Schleim von Raucherinnen mit CIN wurden neben Tabak
spezifischen Nitrosaminen und stark erhöhtem Nikotin-Level vermehrt Mutationen des
p53-Tumor-Supressorgens gefunden, mit konsekutiver Reduktion von DNA-Reparaturme65
chanismen (Winkelstein et al., 1990; Sikström et al., 1995; Hellberg et al., 2005). Lifestyle-Faktoren wie Rauchen und Alkohol wurden ebenfalls als Hauptrisikofaktoren für die
Ausbildung eines nicht-AIDS-definierenden Karzinoms bei HIV-infizierten MSM beschrieben (Palefsky et al., 1991; Critchlow et al., 1995; Patel et al., 2008; Crum-Cianflone
et al., 2009). Hier sind weiterführende Untersuchungen notwendig. Die Arbeitsgruppe um
Palefsky konnte interessante Hinweise auf eine Korrelation zwischen negativem AnergyTest an der Haut und zellulärer Kontrolle der HPV-Infektion bei HIV-positiven Frauen
feststellen (Palefsky, 2007), möglicherweise ein weiterer Parameter, der in LangzeitStudien mit einbezogen werden könnte.
Bei Organtransplantierten beginnt die Immunreduktion nach der Transplantation durch
immunsuppressive Arzneimittel und ist wahrscheinlich die Ursache für das erhöhte
Karzinomrisiko. Es sind in diesem Zusammenhang noch viele Fragen offen, und die
Einschätzung, dass es bei Menschen mit HIV/AIDS aufgrund wesentlich längerer
Überlebenszeiten und einem breiten Spektrum möglicher Karzinomtypen zu erhöhter
Morbidität und karzinombedingter Mortalität kommen wird, wird durch die Ergebnisse der
Untersuchung von Grulich et al. unterstützt (Grulich et al., 2007).
Man kann spekulieren, dass in naher Zukunft andere bislang weniger häufig untersuchte
onkogene HPV-Typen im Rahmen von genitoanalen HPV-Infektionen bei HIV-infizierten
MSM deutlich an pathogener Relevanz gewinnen werden. In Biopsien mehrerer peniler
Carcinomata in situ (Erythroplasie de Querat) von HIV-negativen Männern konnte mittels
Typen spezifischer PCR neben HPV-16 auch HPV-8, ein selteneres onkogenes HP-Virus
nachgewiesen werden (Wieland et al., 2000). Da penile HPV-Infektionen und AIN bei
HIV-infizierten MSM ebenfalls zunehmen (Kreuter et al., 2008c), ist davon auszugehen,
dass zukünftig auch der Morbus Bowen, PEIN, plattenepitheliale Karzinome auf dem
Boden einer Bowenoiden Papulose, Peniskarzinom und bislang wenig häufige, durch
seltenere onkogene HPV-Typen co-induzierte Tumoren, wie beispielsweise die
Erythroplasie de Querat, in dieser Hochrisikopopulation gehäuft auftreten werden.
Nicht zu unterschätzen ist die Fähigkeit bestimmter epitheliotroper Viren, aufgrund der
zugrunde liegenden Immunschwäche über lange Jahre Epithelien zu infizieren und lokal
epitheliale Neoplasien und spätere Karzinomentwicklung hervorzurufen. Es gibt
beispielsweise mögliche Zusammenhänge zwischen HPV-Infektion und der Ausbildung
eines Lungenkarzinoms (Gillison und Shah, 2003). Bei Kindern mit rezidivierenden
laryngealen Papillomen wurde ein vermehrtes Auftreten von Lungenkarzinomen beobachtet, und es ist denkbar, dass es bei HIV-Infizierten aufgrund chronischer oropha66
ryngealer HPV-Infektion in Zukunft auch zu vermehrter Inzidenz von Lungenkarzinomen
kommen wird. Es handelt sich hier um ein multifaktorielles Geschehen, bei dem die lokale
angeborene und erworbene Immunabwehr eine entscheidende Rolle spielt.
4.12 Schlussfolgerung
Die vorliegende Studie beleuchtet das Thema der Expression antimikrobieller Peptide bei
HPV-induzierten analen Dysplasien auf mikrobiologischer Ebene. Es konnte dargestellt
werden, dass hBD-2- und hBD-3-mRNA sowohl in AIN als auch in Condylomata
acuminata von HIV-postitiven MSM erhöht nachweisbar sind. Die Expression beider BetaDefensine in Condylomata acuminata bei HIV-positiven MSM unterschied sich nicht von
derjenigen der HIV-negativen MSM. Diese Studienergebnisse sind vergleichbar mit den
beiden kürzlich publizierten In-vivo-Studien von Chong et al. und Meyer-Hoffert et al., die
über hochregulierte Beta-Defensine in HPV-assoziierten Läsionen bei HIV-negativen
Individuen berichten (Chong et al., 2006; Meyer-Hoffert et al., 2008).
Dies ist die erste Arbeit über eine erhöhte Expression antimikrobiell aktiver Peptide in
HPV-assoziierten analen Läsionen von HIV-positiven MSM, die eine Hochrisikogruppe
für persistierende HPV-Infektionen und damit einhergehend für das Entstehen von
anogenitalen Warzen und Dysplasien sowie die Entwicklung eines Analkarzinoms darstellen. Die pathogenetische Bedeutung des Nachweises von erhöhter hBD-2 und hBD-3Expression in analen intraepithelialen Neoplasien und Condylomata acuminata bei HIVInfektion ist jedoch weiterhin unklar. Ob Ausprägung und Persistenz von HPV-induzierten
Läsionen bei HIV-positiven und HIV-negativen MSM durch antimikrobielle antiviral
wirksame Peptide gesteuert werden, ob HPV selbst die Defensin-Expression induziert oder
die Expression lediglich ein Teil einer allgemeinen antientzündlichen Stressreaktion gegen
epitheliale Infektionen darstellt, sowie die Rolle von HAART und HIV selbst, ist zum
jetzigen Zeitpunkt nicht erwiesen. Auch muss offenbleiben, ob die hBD-Hochregulierung
eher durch lokale proinflammatorische Zytokine oder durch virale Moleküle angestoßen
wird und inwieweit die erhöhte Expression überhaupt eine funktionelle Relevanz hat. Es
scheint am wahrscheinlichsten, dass die Funktion der epithelialen AMP in der
Aufrechterhaltung eines Gleichgewichtes der lokalen Mikroflora in verschiedenen
Bereichen von Haut und Schleimhaut liegt (Weinberg et al., 1998). Die Beobachtung, dass
induzierbare Defensine in HPV-infizierten Viruspapillomen erhöht nachweisbar sind,
deutet auf ihre wichtige Rolle im Rahmen der viralen Abwehr. Dies ist relevant für die
67
Entwicklungen neuer Vakzine und die Entwicklung von Defensin basierten Therapiestrategien beziehungsweise solchen, die eine Induktion von Defensinen im Epithel von
Haut und Mukosa herbeiführen. Es sind viele Fragen offen, die das Zusammenwirken der
Effektormoleküle von angeborener und adaptiver Immunabwehr betreffen. Eine wichtige
Aufgabe übernehmen hier die verschiedenen Subpopulationen der T-Zellen, die mit
dendritischen antigenpräsentierenden Zellen (DCs) der Haut interagieren. Während die
CD4+-T-Zellen in der Abwehr von Fremdantigenen aktiv sind, ist bekannt, dass beispielsweise zytotoxische CD8+-T-Zellen aktiv antivirale und antitumorwirksame Immunreaktionen vermitteln können (Meyer et al., 2007). Große Studien mit multiplen Parametern
des Immunsystems (AMP, T-Zell-Subpopulationen, Zytokine u.a.) sind notwendig, um den
Stellenwert der einzelnen Komponenten bei Immunkompetenten und Immunsupprimierten
herauszukristallisieren. Zum jetzigen Zeitpunkt lassen sich allenfalls Tendenzen mit
offenen Variablen aufzeigen. Die Erforschung des Stellenwertes der Defensine im Rahmen
von HPV/HIV-Co-Infektion ist hier sicherlich erst in den Anfängen. Inflammatorische
Zytokine wie beispielsweise IL-17 und IFN-γ regen die Promotoren der latenten HPVInfektion an und führen zur aktiven Virusreplikation (de Villiers und Ruhland, 2001;
Madkan et al., 2007). Denkbar ist, dass HIV neben der Wirkung des HIV-Tat-Gens auf die
Expression von HPV-18-E7 auch direkte, Zytokin-vermittelte Aktionen anstößt (Dolai et
al., 1999; Madkan et al., 2007), an denen die Defensine als Effektoren der nativen Abwehr
mitbeteiligt sind. Es werden zunehmend Daten zu der vermuteten Rolle von AMP im
Rahmen der Wundheilung, von entzündlichen Dermatosen wie Psoriasis vulgaris,
atopischen Dermatitis, Rosazea und Akne und auch von malignen epithelialen
Hauttumoren bzw. des T-Zelllymphoms publiziert (Gambichler et al., 2009, sowie die in
diesem Artikel erwähnten Zitate).
Die vorliegende Studie soll ein Beitrag sein, Erkenntnisse zur Bedeutung antimikrobiell
wirksamer Peptide im Rahmen von HPV-Infektionen in analen Läsionen bei
Immunsupprimierten und Immunkompetenten zu gewinnen. Trotz inzwischen guter
Behandelbarkeit der HIV-Infektion steigt die Inzidenz von HPV-assoziierten Infektionen
und Malignomen bei HIV-Infizierten, hier insbesondere bei HIV-infizierten MSM. Weitere
Studien zu intrinsischen Abwehrstrategien des oralen und genitalen mukosalen Epithels
sowohl gegenüber HIV als auch HPV und Strategien für Prävention und Therapie sind
notwendig. Da heute bekannt ist, dass die Anwesenheit von HPV allein nicht ausreicht für
die Entwicklung einer Neoplasie, sind auch Co-Faktoren wie Tabakkonsum, Veränderungen des Hormonstatus, Vorliegen anderer sexuell übertragbarer Erkrankungen (STD),
68
eine zugrundeliegende vorübergehende oder permanente Immundefizienz und der Einfluss
lokaler Traumata und sexuellen Verhaltens in Multicenter-Studien einzubeziehen (s. a.
Gonzales Intxaurraga, 2002). Weitere Untersuchungen zur pathogenetischen Relevanz der
antimikrobiellen Peptide in ihrer Interaktion mit angeborener und adaptiver Immunabwehr
sind ebenfalls erforderlich, um neue immunmodulatorische therapeutische Optionen insbesondere für schwere und therapieresistente HPV-induzierte Infektionen entwickeln zu
können. Dies ist von wachsender Bedeutung im Rahmen der Onkogenese HPV-induzierter
epithelialer Tumore insbesondere bei immunsupprimierten Individuen.
Wichtig ist in diesem Zusammenhang ebenfalls herauszufinden, warum es bei
Immunreduktion zu einer AIN-Regression bzw. -Progression kommt, um Algorithmen für
ein sinnvolles Follow-up zu entwickeln (Zbar et al., 2002). Fortschritte in der Therapie der
HIV-Infektion werden zunehmend den Beginn der AIDS-Erkrankung, des Vollbildes
AIDS, hinauszögern. Dies wird der Entwicklung HPV-assoziierter Neoplasien Vorschub
leisten und den natürlichen Verlauf der HIV-Infektion verändern, möglicherweise mit neu
zu definierenden HIV- und AIDS-assoziierten, aggressiv verlaufenden Neoplasien.
Manche dieser Karzinome, wie beispielsweise das Analkarzinom, lassen sich durch
effektive Screeningmaßnahmen und Therapien früh erkennen und verhindern (Palefsky,
2009). Forschungen und prospektive Studien zu den Effektoren im Zusammenspiel der
nativen und adaptiven Immunabwehr, wie zum Beispiel der antimikrobiellen Peptide,
scheinen extrem sinnvoll, um neue Strategien zur Verhinderung HPV-assoziierter
Präkurserläsionen dieser Neoplasien zu entwickeln. Effektive Screeningprogramme
hinsichtlich oraler und anogenitaler Läsionen, auch mit neuen Proliferationsmarkern, sind
notwendig, um weitere Erkenntnisse über den natürlichen Verlauf von HIV- und HPVInfektion zu gewinnen und in Hochrisikopopulationen die Inzidenz HPV-assoziierter
Karzinome zu reduzieren.
69
5
Zusammenfassung
Anale intraepitheliale Neoplasien (AIN) sind bekannte und inzwischen gut beschriebene
Vorläuferläsionen des invasiven squamösen Analkarzinoms, das jüngst mit erhöhter
Frequenz bei Immunsupprimierten festgestellt wird, hier insbesondere bei HIV-infizierten
MSM, die eine Hochrisikogruppe für persistierende HPV-Infektionen darstellen. Die
Ursache für die Zunahme der HPV-induzierten intraepithelialen Neoplasien liegt zum
einen wahrscheinlich an einem erhöhten Vorhandensein multipler Hochrisiko-HPV-Typen
im Genitoanalbereich, zum anderen in Langzeit-Immundefizienz aufgrund einer therapiebedingten erhöhten Überlebensrate der HIV-Infizierten begründet. Die Einführung der
hochaktiven antiretroviralen Therapie hat zwar zu einem dramatischen Rückgang der
Inzidenz von AIDS und verschiedener AIDS-definierender Erkrankungen und Karzinome
geführt. Dies scheint jedoch mit einem erhöhten Risiko der Ausbildung nicht-AIDSdefinierender Karzinome, insbesondere des Analkarzinoms, einherzugehen, das sich in den
letzten 10 Jahren als eine der häufigsten nicht-AIDS-definierenden Erkrankungen bei HIVpositiven MSM herauskristallisiert hat. Die genauen Ursachen hierfür sind letztlich nicht
vollständig geklärt, wahrscheinlich kommt es in Abhängigkeit von Dauer und Grad der
Immundefizienz zu fehlenden Immunantworten des Epithels auf onkogene HPV-Typen.
Zusätzlich hat die hohe Prävalenz von HPV-induzierten anogenitalen Karzinomen bei
HIV-Infektion ihre Ursache in einer Monate und Jahre andauernden erhöhten HPV-Besiedlung mit zunehmendem Zellzykluskontrollverlust der angeborenen und adaptiven Immunabwehr.
Die exakte Immunantwort auf High-risk HPV-Typen ist bisher in ihrer Komplexität nicht
ganz verstanden. Papillomviren fungieren als Auslöser für anogenitale Infektionen und
intraepitheliale Neoplasien, die entweder von Haut und Schleimhaut durch das
körpereigene Immunsystem eliminiert werden oder aber durch bisher nicht genau geklärte
Mechanismen in invasive Karzinome übergehen. Ein Zusammenhang zwischen sexuell
übertragbaren Erregern und Onkogenese wurde bereits im 19. Jhd. vermutet, und
Forschungen der letzten 30 Jahre konnten die Assoziation von HR-HPV und Dysplasie bei
zervikalen intraepithelialen Neoplasien (CIN) und Zervixkarzinom beweisen. Die Zervix
scheint am vulnerabelsten für eine HPV-assoziierte maligne Transformation zu sein, aber
auch der Analkanal weist aufgrund des dort vorhandenen erhöhten Proliferationsgrades im
Bereich seiner Übergangszonen von perianal (verhornendes Plattenepithel) zu intraanal
(unverhornendes Plattenepithel) und intraanal an der Linea dentata (Zylinderepithel) eine
70
vergleichbare Suszeptibilität für HPV-assoziierte Erkrankungen und intraepitheliale
Neoplasien auf. Eine zentrale Rolle spielt die Expression der viralen Onkogene E6 und E7
in epithelialen Stammzellen, die über die Blockierung von Tumorsupppressorgenen zu
chromosomaler Instabilität führt, so dass zunehmend virales HPV-Genom in die Wirtszelle
integriert wird.
Unter der Annahme, dass für die Persistenz und Onkogenität von genitalen HPVInfektionen das angeborene Immunsystem eine entscheidende Rolle spielt, stellt die
vorliegende Studie erstmals das Vorhandensein hochregulierter Beta-Defensine in analen
HPV-Läsionen von HIV-positiven MSM dar. Es wurden Biopsien aus AIN, Condylomata
acuminata und nicht-läsionaler Mukosa von 45 HIV-positiven MSM sowie aus
Condylomata von 8 HIV-negativen MSM auf das Vorhandensein der humanen BetaDefensine hBD-1, hBD-2 und hBD-3 sowie des Peptids LL-37 und des Proteins RNase 7
untersucht. Zusätzlich erfolgte die immunhistochemische Analyse der 45 Proben für hBD2 und hBD-3 sowie die HPV-Typisierung und HPV-DNA-Viruslast-Bestimmung für HPV
6, HPV 11, HPV 16, HPV 18 und HPV 33. Ziel war es, eine mögliche Korrelation
zwischen läsionalem HPV-Typ und AMP-Expression darstellen zu können. Eine
Hochregulierung von HBD-2 und -3 konnte signifikant in AIN-Läsionen der HIVpositiven MSM nachgewiesen werden, jedoch keine eindeutige Korrelation zum
vorhandenen HR-HPV-Typ. Auch war der Nachweis multipler HR-HPV-Typen in dieser
Studie nicht eindeutig mit einer stark hochregulierten hBD-mRNA-Expression assoziiert.
Die mRNA-Expression von LL-37, RNase 7 und hBD-1 war nicht signifikant erhöht
nachweisbar, was möglicherweise mit ihrer fehlenden Selektivität für HPV-infizierte
Epithelien zusammenhängt.
Die pathogenetische Bedeutung des Nachweises von hochregulierter hBD-2 und hBD-3Expression in analen intraepithelialen Neoplasien und Condylomata acuminata bei HIVInfektion ist unklar. Es ist inzwischen erwiesen, dass antimikrobiell aktive Peptide
maßgebliche Modulatoren der angeborenen Immunabwehr sind und als solche synergistisch mit anderen molekularbiologischen Strukturen der Haut an der Verhinderung oder
dem Fortschreiten einer malignen Transformation durch HPV beteiligt sind. Möglicherweise verläuft diese antimikrobielle Aktivität bei Immundefizienz und in Anwesenheit
bestimmter Co-Faktoren frustran oder dient lediglich einer Verzögerung der Aktivierung
der zellulären Abwehr. Auch ist unklar, ob HIV und HAART direkt an dem Prozess der
malignen Transformation beteiligt sind. Da die Expression der AMP jedoch in
Condylomata acuminata von HIV-positiven und HIV-negativen MSM gleichermaßen
71
erhöht nachweisbar war, ist davon auszugehen, dass die erhöhten Level von hBD-2 und
hBD-3 als HIV-unabhängig zu bewerten und eher auf die HPV-Infektion und ihre
Selektivität für HPV-infizierte Epithelien als solche zurückzuführen sind.
Auf der Basis der in dieser Arbeit dargestellten Daten lässt sich vermuten, dass ein
Zusammenhang zwischen hochregulierten antimikrobiellen Peptiden und persistierender
HPV-Infektion bei zugrundeliegender Immundefizienz besteht. Prospektive Studien zur
Interaktion von natürlicher und adaptiver Immunabwehr im Rahmen der HPV/HIV-CoInfektion unter Einbeziehung weiterer beeinflussender Faktoren sind notwendig, um
Promotoren für den Übergang intraepithelialer Neoplasien in invasive Karzinome
auszumachen und um herauszufinden, welche molekularbiologischen Faktoren zu einer
epithelialen Resistenz gegenüber einer HR-HPV-Infektion führen, bzw. wie diese
Kontrollmechanismen auf zellulärer Ebene genau funktionieren. Es scheint am
wahrscheinlichsten, dass die Funktion der epithelialen AMP in der Aufrechterhaltung eines
Gleichgewichtes der lokalen Mikroflora in verschiedenen Bereichen von Haut und
Schleimhaut liegt.
Größere Screening-Untersuchungen an HIV-positiven Individuen mit längeren Nachbeobachtungszeiten sind notwendig, da die HAART-bedingte längere Lebenszeit mit
präinvasiven HPV-induzierten genitoanalen Läsionen zu einem erhöhten Risiko einer
Progression in eine invasive genitoanale Neoplasie bei dieser Hochrisikopopulation führt.
Aufschlussreich wäre auch ein Vergleich zwischen HIV-positiven MSM und HIVpositiven Frauen, um herauszufinden, ob es möglicherweise neben unterschiedlichen
sexuellen Praktiken auch geschlechtsspezifische Unterschiede auf molekularbiologischer
Ebene gibt, oder ob sich beispielsweise die Expression von AMP im genitoanalen Milieu
geschlechtsspezifisch unterscheidet.
Die Untersuchung antimikrobieller und proinflammatorischer Eigenschaften von SignalPeptiden und ihre jeweilige Selektivität könnten zukünftig Persistenz oder Rückläufigkeit
von HPV-Infektionen sowie deren maligne Transformation erklären. Die Vermutung, dass
HPV in der Lage sein kann, über die Generierung verschiedener Peptide und Proteine eine
antivirale Aktivität der lokalen Immunabwehr zu induzieren oder zu blockieren, zeigt sich
mit der vorliegenden Studie unterstützt.
72
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Danksagung
An dieser Stelle bedanke ich mich bei Herrn Prof. Dr. P. Altmeyer für die bereitwillige
Überlassung des Arbeitsthemas dieser Dissertation.
Mein besonderer Dank gilt meinem Doktorvater Prof. Dr. Alexander Kreuter für den
Vorschlag zu diesem interessanten Thema, das ich als Proktologin hervorragend auch in
meinen beruflichen Alltag integrieren konnte. Ich bin ihm für sein Vertrauen, seine Geduld,
Ideen und Anregungen für immer zu tiefstem Dank verpflichtet. Er hat mich stets motiviert,
neben meiner beanspruchenden beruflichen Tätigkeit in eigener großer Praxis an diesem
Projekt festzuhalten, mit mir viele interessante Aspekte diskutiert und an mich geglaubt.
Ein besonderer Dank gebührt Prof. Dr. Ulrike Wieland für die fruchtbare Zusammenarbeit
im virologischen Teil der Arbeit.
Besonders möchte ich mich auch bei Dr. Martina Sgrygan bedanken, die sich Zeit
genommen hat, mich in die Materie der mRNA-Bestimmung einzuführen.
Dr. Thilo Gambichler danke ich für seine Unterstützung im statistischen Teil.
Ich danke Monika Jung, Nabila Ristow, Barbara Panz, Sabine Richter, Nicole Scholz und
Tanja Blome für ihre exzellente technische Assistenz im Rahmen dieser Studie.
Mein persönlicher Dank geht an meine Lebenspartnerin Dr. Annalisa Carnio, die mich
während dieser Zeit wunderbar unterstützt und motiviert hat.
Sehr danke ich auch meiner Mutter Frauke Herzler und Dr. Vassiliki Savvas für das
aufwändige Korrekturlesen sowie meinem Bruder Dr. Matthias Herzler für die Unterstützung bei PC-Fragen.
Das Bundesministerium für Bildung und Forschung (BMBF) im Rahmen seiner
Unterstützung des "Kompetenznetzes HIV/AIDS" (Grant No. 01 K1 0501, Subprojekt F8)
und der "Klinischen Forschergruppen Infektiologie" (KO 01 KI 0771, TP7) sowie die
Forschungsförderung Ruhr-Universität Bochum, Medizinische Fakultät (FoRUM, Project
F615-2008) finanzierten diese Studie.
Lebenslauf
Geburtsdatum:
24.05.1962
Geburtsort:
Münster/Westfalen
Schulbesuch:
1968-72
Martin-Luther-Grundschule, Münster
1972-81
Pascal-Gymnasium, Münster,
bilingualer Zweig Deutsch-Französisch
Schulabschluss:
1981
Deutsch-Französisches Abitur,
Pascal-Gymnasium, Münster
Freiwilliges soziales Jahr:
1981-82
Einrichtung für Behinderte
Llangadoc, Wales
Studium:
1982-83
Stipendium für Studium der
Romanistik, Germanistik,
Universität Orleáns, Frankreich
1983-85
Studium der Germanistik, Romanistik,
Psychologie,
Freie Universität Berlin
1985-92
Studium der Humanmedizin,
Freie Universität Berlin
Ärztliche Tätigkeit:
1992-94
Ärztin im Praktikum,
Abteilung für Dermatologie
Krankenhaus Spandau, Berlin,
Chefärztin Dr. G. Albrecht
Approbation:
1994
Freie Universität Berlin
1994-98
Assistenzärztin,
Abteilung für Dermatologie
Krankenhaus Spandau, Berlin,
Chefärztin Dr. G. Albrecht
Fachärztin für Haut- und
1997
Ärztekammer Berlin
Zusatzbezeichnung Allergologie:
1997
Ärztekammer Berlin
Zusatzbezeichnung Proktologie:
2007
Ärztekammer Berlin
Niedergelassene Dermatologin:
1999
in eigener Praxis in Berlin
Geschlechtskrankheiten:
Schwerpunkte: Operative Dermatologie,
Proktologie, STD
Eigene Veröffentlichungen:
2009
Kreuter, A., Skrygan, T., Gambichler, T.,
Brockmeyer, N. H., Stücker, M., Herzler,
C., Potthoff, A., Altmeyer, P., Pfister, H.,
Wieland, U. (2009). Human papillomavirus-associated induction of human ßdefensins in anal intraepithelial neoplasia.
Br J Dermatol 160, 1197-1205