Dermatophyten-PCR

Werte für Menschen, Tiere und Umwelt
Dermatophyten-PCR
synlab.vet Fachinformation
DERMATOPHYTEN-PCR
Dermatophyten-PCR
Ergebnisse einer vergleichenden Studie von kultureller
mykologischer Untersuchung und PCR-Untersuchung.
Die Diagnose „Dermatophytose“ war bislang oft schwierig
zu stellen: Ein Problem stellt die klinische Präsentation der
Erkrankung dar. Durch Kratzen, übersteigerte Fellpflege und
Sekundärinfektionen erscheinen die Hautveränderungen häufig als unspezifische, ekzematöse Dermatitis. Das klassische
Krankheitsbild wird dadurch überdeckt und demzufolge oft
nicht mehr erkannt. Eine weitere Schwierigkeit entsteht durch
symptomlose Träger, die selbst nicht erkranken, die Infektion
aber weiter verbreiten.
Konidien von Microsporum canis
Hinzu kommt, dass der Nachweis mittels Kultur mehrere Wochen dauern kann und dabei immer die
Gefahr besteht, dass ein Überwachsen mit Schimmelpilzen eine Auswertung unmöglich macht. Mit
einem Laborergebnis konnte der behandelnde Tierarzt – wenn überhaupt – also erst sehr lange nach
bereits gestellter Verdachtsdiagnose oder erster Therapieentscheidung rechnen.
Aus diesen Gründen entwickelte synlab.vet eine schnelle und zuverlässige realtime PCR-Methode für
den Nachweis von Dermatophyten und initiierte eine Studie, um das konventionelle Kulturverfahren
mit der neuen realtime PCR-Methode zu vergleichen.
Studiendesign
Die Studie umfasste Proben von Patienten mit klinisch auffälliger Symptomatik und Verdacht auf Dermatophytose und als Kontrolle Proben von klinisch unauffälligen Patienten. Insgesamt wurden 133 Proben
parallel mittels Kultur und realtime-PCR auf Dermatophyten untersucht. Die Zusammensetzung bezüglich
Tierart, Geschlecht und Einteilung der Tiere in klinisch auffällig oder unauffällig ist in Tabelle 1 aufgeführt.
Tierarten
Hund
Katze*
Heimtiere
andere**
insgesamt
65
55
10
3
männlich
29
16
1
1
weiblich
36
38
9
2
klinisch verdächtig
51
44
10
3
klinisch unverdächtig
14
11
0
0
Tabelle 1: Aufschlüsselung der Patientenproben (*bei einer Katze lag keine Angabe zum Geschlecht vor; ** Pferd, Eisbär, Alpaka)
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DERMATOPHYTEN-PCR
Studienergebnisse
Übersicht
Bei 26 der insgesamt 133 Proben konnten in der Kultur und/oder mittels PCR Dermatophyten nachgewiesen werden (= 20 %). Bei den 10 positiv getesteten Hunden kamen rund zwei Drittel der positiven
Proben aus der Gruppe der klinisch verdächtigen Patienten, ein Drittel der Nachweise gelang bei
klinisch unverdächtigen Patienten. Bei den 14 Dermatophyten-positiven Katzen stammten knapp vier
Fünftel der Proben von klinisch verdächtigen und gut ein Fünftel von klinisch unverdächtigen Patienten.
Aus der Gruppe Heimtiere und andere Tierarten wurden für die Studie nur Proben von klinisch verdächtigen Patienten eingesandt. Dermatophyten wurden hier bei einem Meerschweinchen und bei
einem Alpaka nachgewiesen (siehe Tab. 2).
Tierarten
Hund
Katze*
Heimtiere
andere**
insgesamt
65
55
10
3
Dermatophyten positiv
10
14
1
1
klinisch verdächtig
7
11
1
1
klinisch unverdächtig
3
3
0
0
Tabelle 2: Verteilung der Dermatophyten-positiven Ergebnisse
Ergebnisübersicht: klinisch verdächtige Tiere
Von 51 Hunden aus der klinisch verdächtigen Gruppe wurden sieben Tiere positiv in der Dermatophyten-PCR getestet (siehe Tab. 3). Bei diesen sieben positiv getesteten Hunden wurden aber nur bei
drei Tieren Dermatophyten auch in der Kultur nachgewiesen. Die vier nur in der PCR positiven Proben
wurden in einer zweiten, speziesdifferenzierenden PCR je zweimal als Microsporum canis und pathogene Trichophyton spec. (nicht geophil) identifiziert. Die drei positiven Kulturen (einmal Microsporum
canis und zweimal Trichophyton mentagrophytes) bestätigten sich in der speziesdifferenzierenden
PCR.
Bei den klinisch verdächtigen Katzen konnten mit 11 von 44 bei einem Viertel der Patienten Dermatophyten nachgewiesen werden (siehe Tab. 3). Die PCR detektierte in 10 Proben Dermatophyten,
von denen nur fünf auch mittels Kultur positiv getestet werden konnten. In der speziesdifferenzierenden PCR konnten die anderen fünf Proben dreimal als Microsporum canis und einmal als Trichophyton spec. (pathogen, nicht geophil) identifiziert werden. Die fünf positiven Kulturen (dreimal
M. canis und zweimal T. mentagrophytes) bestätigten sich in der speziesdifferenzierenden PCR. Bei
einer Katzenprobe konnte allerdings ein positives Microsporum canis Kulturergebnis nicht in der PCR
bestätigt werden.
Mögliche Gründe hierfür könnten sein:
•D
as Untersuchungsmaterial, das für die PCR-Untersuchung zur Verfügung stand enthielt im Gegensatz zum Material, das für die Kultur verwendet wurde, keine Dermatophyten.
• Die Kultur wurde aufgrund einer Kreuzkontamination falsch positiv beurteilt.
• Bei der PCR-Untersuchung ist im Rahmen der Probenabarbeitung ein technischer Fehler unterlaufen, so
dass trotz vorhandener Dermatophyten der DNA-Nachweis nicht erfolgte.
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Bei zwei klinisch verdächtigen Proben konnte aber die PCR ein positives Ergebnis liefern, bei denen
die Kultur wegen Befall mit Schimmelpilzen nicht auswertbar war. Die speziesdifferenzierende PCR
ergab hier für eine Probe Trichophyton spec. (pathogen, nicht geophil). Die andere Probe konnte
nicht weiter identifiziert werden. Die Speziesbestimmung mittels Sequenzierung ergab wegen nicht
auswertbarer Mischsequenzen kein Ergebnis.
In der Gruppe Heimtiere/andere Tierarten wurden 13 Proben von klinisch verdächtigen Patienten
untersucht (siehe Tab. 3). Bei einem Meerschweinchen ergaben PCR und Kultur ein positives Ergebnis
(Trichophyton mentagrophytes). Eine Probe eines Alpakas konnte in der Kultur wegen Schimmelpilz­
befall nicht ausgewertet werden, war aber in der PCR positiv. Die speziesdifferenzierende PCR ergab
dann den Nachweis von Microsporum gypseum.
Tierarten
klinisch verdächtig
Hund
51
Katze
44
Heimtiere, andere
13
davon positiv
7
11
2
Kultur
PCR
Kultur
PCR
Kultur
PCR
3
7
6
10
1
2
Tabelle 3: Vergleich positiver Dermatophytenbefunde in Kultur und PCR bei klinisch verdächtigen Patienten
Ergebnisübersicht: klinisch unverdächtige Tiere
Bei den klinisch unverdächtigen Tieren ergab der Methodenvergleich, dass mittels PCR deutlich mehr
Tiere als latente Dermatophyten-Träger identifiziert werden können als mittels kulturellem Nachweis
(siehe Tab. 4).
Von 14 Hunden konnte mittels PCR bei zwei Tieren Dermatophyten nachgewiesen werden, die in der
Kultur wiederum wegen Befall mit Schimmelpilzen nicht auswertbar waren. Die speziesdifferenzierende PCR ergab hier für eine Probe Trichophyton spec. (pathogen, nicht geophil). Die andere Probe
konnte abermals nicht weiter identifiziert werden und die Speziesbestimmung mittels Sequenzierung
ergab wegen nicht auswertbarer Mischsequenzen ebenso kein Ergebnis. Eine positive Kultur mit dem
geophilen Dermatophyten Trichophyton phaseoliforme wurde in der PCR nicht bestätigt.
In der Katzen-Gruppe ergab nur die PCR positive Ergebnisse (einmal Microsporum gypseum und
zweimal Trichophyton spec. (pathogen, nicht geophil). Für Heimtiere/andere Tierarten standen keine
klinisch unverdächtigen Proben zur Verfügung.
Tierarten
klinisch unverdächtig
Hund
14
Katze
11
davon positiv
3
3
Kultur
PCR
Kultur
PCR
1
2
0
3
Tabelle 4: Vergleich positiver Dermatophytenbefunde in Kultur und PCR bei klinisch unverdächtigen Patienten
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DERMATOPHYTEN-PCR
Zusammenfassung der Studienergebnisse
Der molekularbiologische Nachweis brachte im Vergleich zur Kultur bei mehr als doppelt so vielen
Proben einen positiven Nachweis.
Dabei stammte der größte Teil der Proben von klinisch verdächtigen Patienten. Bei den klinisch
unverdächtigen Tieren konnte die PCR bei Hunden doppelt so viele und bei Katzen überhaupt erst
klinisch unauffällige, latente Träger identifizieren. Die besondere Robustheit der PCR-Methode zeigt
sich darin, dass 16 von 133 Proben
Kultur
davon in PCR:
in der Kultur wegen Schimmelpilzbefall
positiv
negativ
nicht, in der PCR jedoch sicher ausge11
9
2
wertet werden konnten. Fünf dieser 16 positiv
Proben waren Dermatophyten-positiv
und drei dieser fünf positiven Proben
stammten dabei aus der Gruppe der
klinisch verdächtigen Patienten.
negativ
106
nicht auswertbar
16
gesamt
133
10
5
24
96
11
109
Tabelle 5: Methodenvergleich Kultur versus PCR
Schlußfolgerung
Zusammengefasst zeigen die Studienergebnisse, dass der molekularbiologische Nachweis von Dermatophyten im Vergleich zur kulturellen Untersuchung deutliche Vorteile hat:
• Die Untersuchungsdauer ist mit nur drei Tagen, im Vergleich zur drei- bis fünfwöchigen Dauer bei der
Kultur, extrem schnell.
• Durch die Robustheit der Methode ist die PCR unempfindlich gegenüber Kontamination mit Schimmelpilzen und ermittelt für jede Probe ein zuverlässiges Ergebnis.
• Die PCR ist im Vergleich zur Kultur sensitiver.
• Klinisch unauffällige Tiere können schnell als latente Träger identifiziert werden. Dies ist besonders
wichtig für die Identifizierung oder den Ausschluss von Tieren als potentielle Infektionsquelle für Tierhalter und zur Bestandskontrolle.
• Die PCR erlaubt auch eine Differenzierung in klinisch relevante Dermatophytenspezies und in apathogene,
geophile Trichophytonarten. Folgende Dermatophytenarten können mittels PCR differenziert werden:
- Microsporum canis
- Trichophyton spec. (erfasst Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton erinacei, Trichophyton tonsurans,
Trichophyton equinum, Trichophyton verrucosum, Trichophyton rubrum)
-M
icrosporum gypseum
- geophile Trichophyton spec. (erfasst Trichophyton terrestre, Trichophyton phaseoliforme, Trichophyton
ajelloi)
Damit ist die von synlab.vet entwickelte Multiplex realtime-PCR eine sichere und schnelle Methode für
den Nachweis und die Differenzierung von Dermatophyten.
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