Uber den Stoffwechsel des 5-Hydroxymethyl

Uber den Stoffwechsel des 5-Hydroxymethyl-cytosins bei Bakterien
V o n
FRIEDRICH WEYGAND,
ACHIM TREBST
u n d
ADOLF
OTTO PAUL
WACKER,
SWOBODA
Aus dem Organisch-chemischen Institut der Technischen Universität, Berlin-Charlottenburg
( Z . N a t u r f o r s c h g . 12 b, 1 8 4 — 1 8 6 [ 1 9 5 7 ] ; e i n g e g a n g e n am 4. D e z e m b e r 1956)
5-Hydroxymethyl-cytosin-[2- 1 4 C] wird von allen untersuchten Bakterienstämmen in geringer
Menge aufgenommen. Lb. leichmannii
und Lb. acidophilus
R 26 wandeln das aufgenommene
5-Hydroxymethyl-cytosin- [2- 1 4 C] vollständig in Thymin um, dagegen enthalten B. coli B und B. coli
1883 Co neben radioaktivem Thymin den größeren Teil der Radioaktivität in Form von 5-Hydroxymethyl-cytosin- [2- 1 4 C] -desoxyribosid.
Kürzlich konnten wir zeigen, daß Bakterien Uracil-[2-14C]
in Cytosin und Thymin umwandeln; da-
bei ist für die Synthese des Thymins
unbedingt
Folsäure bzw. Coenzym F notwendig 1 .
Weiterhin
wurde gefunden, daß Formiat-[ 1 4 C] den C r B a u s t e i n
der Methylgruppe des Thymins liefern kann 1 . Aus
diesen
Ergebnissen
ableitend
wurde
sodann
die
Frage diskutiert, ob bei der Biosynthese des Thymins eine 5-Hydroxymethyl-uracil-Verbindung
als
wurde Uracil weggelassen, bei der Züchtung der beiden
B. coli-Stämme auch die Purine. Wenn Lb. leichmannii
313 mehrere Passagen in einem uracil-freien Nährmedium gezüchtet wird, zeigt er in uracil-freiem Medium ein besseres Wachstum als der Ausgangsstamm.
Der so erhaltene Stamm wird im folgenden als Lb.
leichmannii 313 adaptiert bezeichnet.
Die Lb. leichmannii-Stämme wurden in Anwesenheit
von 2 my/ml Vitamin B 12 gezüchtet, Lb. acidophilus
R 26 mit 10 y/ml Adenindesoxyribosid. HMC wurde
vom Medium getrennt sterilisiert.
Intermediärprodukt auftritt.
Nachdem S. S.
B. coli
B
COHEN
2
aus dem
virusinfizierten
5-Hydroxymethyl-cytosin-desoxyribosid
isolieren konnte, schien es von Interesse zu prüfen,
ob 5-Hydroxymethyl-cytosin ( H M C ) für die Biosynthese des Thymins verwendet werden kann.
haben zu diesem Zweck
[2-14C]
Wir
5-Hydroxymethyl-cytosin-
synthetisiert 3 und seinen Stoffwechsel bei
Bestimmung der Radioaktivität
Zur Bestimmung der Radioaktivität wurden 40 mg
getrocknete Bakterien in einer Presse zur Herstellung
von KBr-Scheibchen für die UR-Spektroskopie in kleine
Scheibchen von 1 cm Durchmesser gepreßt und ihre
Radioaktivität unter einem Glockenzählrohr FHZ 15
(Friesecke & Hoepfner, 1,6 mg Glimmer/cm 2 ) bestimmt.
verschiedenen Bakterien untersucht.
Aufarbeitung
Methodik
5 - H y d r o x y m e t h y l - c y t o s i n - [ 2 - 14 C) :
A k t i v i t ä t 1 mC/mMol 3
Züchtung der Bakterien
Stämme: Lactobacillus leichmannii 313, Lactobacillus leichmannii 313 adaptiert, Lactobacillus leichmannii 4797, Lactobacillus acidophilus R 26, Lactobacillus
plantarum 10 S, Enterococcus Stei, B. coli 1883 Co
und B. coli B. Züchtung, Aufbewahrung der Bakterien
sowie Zusammensetzung der verwendeten Nährmedien
sind in früheren Arbeiten beschrieben 4 . B. coli B wurde
wie B. coli 1883 Co gezüchtet, fn allen Nährmedien
1
2
3
F . WEYGAND,
A . WACKER,
A . TREBST
U.
O . P . SWOBODA,
Z.
Naturforschg. 9 b, 764 [ 1 9 5 4 ] .
S. S. COHEN, Cold Spring Harbor Sympos. quantitat. Biol.
18. 221 [ 1 9 5 3 ] .
F. W E Y G A N D u. 0 . P. SWOBODA. Z Naturforschg. I I b . 369
[1956].
der Bakterien
Die Nucleinsäure aus kleineren Mengen Bakterien
wurde durch 10-stdg. Extraktion mit einer 10-proz.
Kochsalzlösung im verschlossenen Rohr bei 95° und anschließender Dialyse der von den Bakterien abzentrifugierten Lösung gewonnen. Zur Isolierung der Pyrimidine wurde die so aus 60 mg Bakterien erhaltene
Nucleinsäure-Lösung eingeengt, mit 3 ml konz. Ameisensäure versetzt und 2 Stdn. im Bombenrohr auf 170°
erhitzt. Nach dem Abdampfen der Ameisensäure wurde
in wenig Wasser aufgenommen und die Purine und
Pyrimidine papierchromatographisch in n-Butanol/Wasser gesättigt und in Isopropanol/konz. HCl/Wasser
(170 : 41 : 39) aufgetrennt. HMC wurde in den folgenden Systemen chromatographiert:
4
A . W A C K E R , A. TREBST U. F. W E Y G A N D , Z . Naturforschg. 11 b.
7 [1956] ; Lb. plantarum 10 S wurde in dem gleichen Nährmedium wie Lb. leichmannii 313 gezüchtet, jedoch ohne
Vitamin B 1 2 ; F. W E Y G A N D , A. W A C K E R , A. TREBST U. O . P.
SWOBODA, Z . Naturforschg. 9 b, 764 [ 1 9 5 4 ] , in dem in dieser Arbeit angegebenen Nährmedium A wurden Enterococcus Stei. B. coli 1883 Co u. B. coli B gezüchtet.
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n-Butanol/Wasser/konz. NH. } ( 8 6 : 1 3 : 1 ) , « / - W e r t
0,2; Methanol/2-n. NH 3 (70 : 3 0 ) , 7?/-Wert 0 , 4 3 ; 80%
Äthanol + 0,5% Acetat-Puffer pa 3,5, /«/-Wert 0,55.
Zur Isolierung der Desoxyriboside wurde die aus
den Bakterien gewonnene Nucleinsäure (von 4 1 Kulturmedium bei Lb. leichmannii 313, bzw. 1 l bei B. coli
1883 Co) enzymatisch mit einem Ferment aus Kälberdarm 5 und kristallisierter Desoxyribonuclease (GEA
Kopenhagen) gespalten. Nach dem Eindampfen der
Lösung wurden die Desoxyriboside mit Äthanol extrahiert und nach Abdampfen des Alkohols die wäßrige
Lösung der Desoxyriboside durch Ionenaustausch-Chromatographie an Dowex 2 x 8, 200 — 400 mesh, in der
Formiatform und Elution mit 0,2-proz. Ameisensäure
getrennt.
Zur Ermittlung der spezifischen Aktivität wurde das
so gewonnene Thymidin nochmals papierchromatographisch gereinigt.
Zunächst untersuchten wir die Radioaktivität der
P y r i m i d i n e . Hierzu wurde die extrahierte
Nuclein-
säure mit Ameisensäure g e s p a l t e n 2 und die P u r i n e
und P y r i m i d i n e papierchromatographisch
Es zeigte sich, daß Lb. leichmannii
sowie
Verbindung,
in B. coli
nämlich
nur
Thymin
4797
radioaktive
eine
enthielten,
während
1 8 8 3 C o und B. coli B außer T h y m i n noch
eine zweite
Auf
R 26
Lb. acidophilus
getrennt.
3 1 3 und
radioaktive
Substanz
vorhanden
den P a p i e r c h r o m a t o g r a m m e n
Nucleinsäuren
der
war.
gespaltenen
aus den B. c o / i - S t ä m m e n
zeigte
die
Stelle, an der sich die zweite radioaktive V e r b i n d u n g
b e f a n d , die weitaus g r ö ß e r e Radioaktivität.
Diese
zweite V e r b i n d u n g war nach ihrem R f - W e r t in verschiedenen Lösungsmittel-Systemen H M C .
( D i e zur
C h r o m a t o g r a p h i e benutzten Systeme sind unter M e Ergebnisse
thodik angegeben.)
unter-
Bei der Spaltung der isolierten Nucleinsäuren mit
aufgenommene
e i n e m Ferment aus K ä l b e r d a r m ° und kristallisierter
W i e aus T a b . 1 h e r v o r g e h t , nahmen alle
suchten
Bakterien
Menge
war
HMC
auf.
unterschiedlich.
Die
Die
Lb.
leichmannii-
Desoxyribonuclease
erhielten
wir
Desoxyriboside
Stämme n a h m e n am meisten auf, g e f o l g t v o n
Ente-
u n d R i b o s i d e , deren Radioaktivität
Stei. Eine g e r i n g e r e Radioaktivität,
d. h.
ten. A u s der gespaltenen Nucleinsäure v o n Lb.
rococcus
geringere H M C - A u f n a h m e ,
R 2 6 , Lb. plantarum
zeigten Lb.
1 0 S und
acidophilus
die b e i d e n
B
coli-
mannii
untersuchleich-
3 1 3 konnten wir durch Ionenaustausch-Chro-
m a t o g r a p h i e an D o w e x 2 w i e d e r u m nur eine
radio-
aktive V e r b i n d u n g isolieren, die nach ihrem papier-
Stämme.
Stamm
chromatographischen, spektroskopischen und m i k r o -
Im Nährmedium Radioaktivität
vorhandene Menge
von 40 mg
5- Hydroxy methylBakterien
cvtosin-[2- 14 C]
[Imp./min]
[v! ml]
Lb. leichmannii 313
Lb. leichmannii 313
10
185
adaptiert
10
215
Lb. leichmannii 4797
Lb. acidophilus R 26
Lb. plantarum 10 S
Enterococcus Stei
biologischen
Verhalten
Thymindesoxyribosid
ist.
Ein Vergleich der spezifischen Aktivität mit d e m eingesetzten H M C - [ 2 - 1 4 C ]
( = 1 0 0 % ) e r g a b , d a ß unge-
fähr 2 , 2 % des T h y m i n s aus H M C gebildet werden.
Bei B. coli
1 8 8 3 C o erhielten w i r nach enzymati-
scher Spaltung der Nucleinsäure und anschließender
10
96
papierchromatographischer
10
22
aktive V e r b i n d u n g e n . Eine d a v o n war
10
16
10
45
o x y r i b o s i d , das nur zu 0 , 2 % aus H M C gebildet w i r d
B. coli 1883 Co
10
20
20
35
B. coli B
20
45
(bezogen
A u s der Nucleinsäure der zu unseren
verwendeten
Bakterien
konnten
wir
auf
die
Trennung
Radioaktivität
zwei
des
radio-
Thymindeseingesetzten
H M C = 1 0 0 % ) . D i e andere radioaktive V e r b i n d u n g
war
nach
ihrem
in
Rf-Wert
Äthanol/Acetatpuffer
Ph 3 , 5 , H M C - D e s o x y r i b o s i d 2 .
D i e isolierte
Menge
H M C - D e s o x y r i b o s i d war aber so g e r i n g , daß sich die
Verbindung
Tab. 1. Radioaktivität der mit 5-Hydroxymethyl-cytosin[2- 1 4 C] gewachsenen Bakterien.
auf
dem
Papierchromatogramm
nur
durch ihre Radioaktivität nachweisen ließ.
Versuchen
bisher
kein
Diskussion
H M C isolieren. Es w a r daher wichtig zu wissen, auf
welche V e r b i n d u n g ( o d e r V e r b i n d u n g e n ) d i e R a d i o aktivität zurückzuführen war. U m dies zu ermitteln,
A u s den Versuchen ergibt sich, d a ß Lb.
nii und Lb. acidophilus
wurden die Bakterien nach verschiedenen M e t h o d e n
wandeln,
aufgearbeitet.
HMC-Desoxyribosid
5
wir
W . KLEIN, Hoppe-Seyler's Z . physiol. Chem. 2 5 5 , 82 [ 1 9 3 8 ] .
dagegen
leichman-
R 2 6 H M C in T h y m i n u m -
nicht
in
Uracil
und
ließ sich in diesen
Cytosin.
Bakterien
nicht nachweisen. Ein anderes Bild zeigt B. coli.
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Die
A u f n a h m e von H M C ist wie bei den Milchsäurebak-
aus H M C synthetisiert, ist interessant. S. S.
terien gering. Jedoch wandeln beide Stämme
den
entdeckte, daß Bakteriophagen (Stämme T 2 , T 4 , T 6 )
H M C in Thy-
diesen Stamm zur Bildung von H M C induzieren 2 . Die
kleineren Teil des aufgenommenen
COHEN
min um. Die größere Menge enthalten sie in Form
Phagen enthalten in
von H M C - D e s o x y r i b o s i d . Eine Umwandlung in Ura-
an Stelle von Cytosindesoxyribosid
cil und Cytosin findet ebenfalls nicht statt.
bosid. V o n grundsätzlicher Bedeutung ist dabei die
Nach diesen Versuchen mit isotopen-markiertem
ihrer
Desoxyribonucleinsäure
HMC-Desoxyri-
Frage, o b H M C nicht doch in Spuren normalerweise
H M C ergibt sich, daß H M C kein normales Zwischen-
in diesem Bakterium enthalten ist und die Phagen
produkt bei der Biosynthese des Thymins ist. Dies
lediglich eine Mengenverschiebung der vorhandenen
liegt sicherlich nicht daran, daß die in 6-Stellung
Pyrimidinbasen bewirken. W ä r e dagegen H M C kein
befindliche NH 2 -Gruppe nicht gegen eine OH-Gruppe
normaler Bestandteil der Bakterienzellen, so würde
ersetzt werden könnte.
— W i e schon früher beim
dies zeigen, daß Phagen auch Verbindungen enthalten
T h y m i n gefunden wurde, kann auch H M C nicht in
können, die nicht in dem Wirt vorhanden sind. Der
Cytosin und Uracil verwandelt w e r d e n 1 . Die Ein-
beachtliche Unterschied zwischen B. coli
führung eines Q-Bausteines in 5-Stellung des Pyri-
1 8 8 3 Co und den Milchsäurebakterien liegt in dem
midinringes scheint also ein irreversibler
H M C - D e s o x y r i b o s i d - Gehalt
Vorgang
der
B, B. coli
B. coli- Stämme.
zu sein, was mit der Sonderstellung des Thymins
Dies deutet darauf hin, daß in den normalen Zellen
zusammenhängen
von B. coli B H M C in Spuren vorhanden ist.
dürfte.
Wie
schon
S. S.
COHEN
f a n d 2 , kann auch Thymin nicht in H M C umgewandelt werden.
Der Befund, daß B. coli B nur in geringer Menge
H M C enthält und auch nur Spuren seines Thymins
Der D e u t s c h e n F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t
und dem Verband der chemischen Industrie, F o n d s
d e r C h e m i e , danken wir bestens für die Unterstützung dieser Arbeit.
Uber das optische Verhalten
v o n Desoxyribonucleinsäure-Histon-Kombinaten
V o n
OLAF
KLAMERTH
Aus dem Institut für Virusforschung, Heidelberg
(7.. Naturforschg. 12 b, 186—189 [1957] ; eingegangen am 5. September 1956)
The extinction of varying mixtures of desoxyribonucleic acid ( D N A ) and original histon at
260 mix does not show an increase in proportion to the increase in the amount of histon added to the
basic, constant D N A concentration, but is characterized by two points of inflexion. The composition
of the DNA-histon mixture at the first of these points reveals the N / P quotient ( 3 , 7 — 3 , 9 ) characteristic of natural DNA-histons, i . e . a ratio of one basic N atom to 1,5 P atoms. The second point
( N / P ratio 8,5 — 9,5) marks the limit of histon-binding capacity of the complex. Such recombinations
of D N A and histon are only incompletely degraded enzymatically by desoxyribonuclease. The rate
of degradation is inversely proportional to the histon concentration.
Bei der noch nicht geklärten Frage nach dem Aufbau nativer Desoxyribonucleoproteide
(DNP)
war
Histon-Adduhten
von
CHARGAFF
durchgeführt w o r d e n . Nach
und
ALEXANDER
Mitarbb2
verläuft die
es von Interesse festzustellen, o b Rekombinate von
Bildung solcher Kombinate nicht nach stöchiometri-
Desoxyribonucleinsäure
schen Verhältnissen, sondern ist abhängig vom Ver-
(DNS)
mit abgespaltenem
Histon in ihrer Zusammensetzung Gesetzmäßigkeiten
dünnungsgrad der Komponenten und führt zu Ge-
unterliegen.
DNS-Protamin-
bilden von wechselnder Zusammensetzung. Auf die
Komplexen sind kürzlich von ALEXANDER1, an DNS-
Ähnlichkeit des Verhaltens der bei großer Verdün-
1
Untersuchungen
an
P. ALEXANDER, Nature [ L o n d o n ] 169. 226 [1952] sowie
Biochim. biophysica Acta [Amsterdam] 10. 595 [ 1 9 5 3 ] .
2
F. CRAMPTON, R . LIPSHITZ U. E . CHARGAFF, J. biol. Chemistry 2 0 6 , 499 [ 1 9 5 4 ] . Weitere Literatur in E . CHARGAFF
u. J. N. DAVIDSON in „ T h e Nucleic A c i d s " , Vol. I. Kap. X ,
S. 307 ff.. A c a d e m i c Press Inc., New York 1955.
C.
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