Molekulare Prognosemarker des Harnblasenkarzinoms

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Molekulare Prognosemarker
des Harnblasenkarzinoms
M. Retz und J. Lehmann
Molekulare Prognosemarker – Spielzeug
für die experimentelle Urologie oder
Werkzeug für die klinische Urologie?
In den letzten 10 Jahren ist die Anzahl der Publikationen über Prognosefaktoren des Harnblasenkarzinoms so explosiv angestiegen, dass eine
Gesamtübersicht für den klinisch tätigen Urologen
kaum möglich ist. Alleine für den Prognosemarker
p53 wurden im letzten Jahr über 120 Publikationen
zitiert. Zudem wurde die klinische Forschung in
den letzten fünf Jahren mit neuen und komplexen
Labortechniken konfrontiert.
Entscheidend ist die Frage, wann und zu welchem Zweck wir Prognosefaktoren im klinischen
Alltag brauchen. Therapieentscheidungen und
Nachsorgepläne für Blasenkarzinompatienten richten sich hauptsächlich nach den klassischen histopathologischen Kriterien. Zwar bietet die konventionelle Histopathologie eine gute Risikoabschätzung in Bezug auf Rezidiv- und Prognoseverlauf des
Harnblasenkarzinoms, jedoch ist das biologische
Verhalten für jeden individuellen Blasentumor nur
unzureichend charakterisiert. Im Idealfall braucht
der Urologe ein einfaches, in der Klinik anwendbares Testverfahren, das neben der Histopathologie
zusätzliche, unabhängige Informationen über die
Aggressivität des individuellen Blasentumors bietet. Damit wäre eine maßgeschneiderte Therapie
für jeden einzelnen Blasentumorpatienten möglich. Patienten mit einem oberflächlich wachsenden
Harnblasentumor (pTa, pT1) haben trotz lokaler
Therapiemaßnahmen mit transurethraler Blasentumorresektion (TUR-B) und ggf. adjuvanter, intravesikaler Immun- oder Chemotherapie eine hohe
Rezidivrate von bis zu 70%. Davon entwickeln bis
zu einem Drittel aller Rezidive eine Tumorprogression (Helpap et al. 2003; Quek et al. 2003).
Die Suche nach neuen Prognosemarkern wäre bei
oberflächlichen Blasentumoren wünschenswert,
damit einerseits das Rezidivrisiko, andererseits
die Gefahr der Tumorprogression sicher bestimmt
werden kann. Als Konsequenz würde eine Subgruppe von Patienten eine zusätzliche, intravesikale
Immun- oder Chemotherapie erhalten. Demgegenüber würde der Urologe einer Hochrisikogruppe
mit einem »aggressiven« oberflächlichen Tumor
eine frühzeitige radikale Zystektomie empfehlen.
Ein weiteres klinisches Dilemma findet sich auch
in der Patientengruppe mit einem muskelinvasiven
Blasenkarzinom. Nach den vorliegenden Langzeiterfahrungen entwickeln bis zu 25% aller Patienten
mit einem lokal begrenzten Blasentumor innerhalb von 3 Jahren nach radikaler Zystektomie eine
systemische Tumorprogression (Stein et al. 2001).
Auch in dieser Gruppe fehlen etablierte Prognosemarker, die das wahre biologische Tumorpotential
einschätzen können. Dies würde dem Urologen in
der weiteren Therapieentscheidung helfen, eine gesonderte Patientengruppe zu erkennen, die neben
der radikalen Zystektomie eine adjuvante Chemotherapie benötigt.
28
4
Kapitel 4 · Molekulare Prognosemarker des Harnblasenkarzinoms
Molekulare Prognosemarker sind nicht nur als
Vorhersagewert für den individuellen Krankheitsverlauf wichtig, sondern sie können auch entscheidende Informationen bezüglich der Wirksamkeit
einer medikamentösen Therapie bieten. Für das
oberflächliche Blasenkarzinom wäre es wünschenswert, Therapieversager frühzeitig zu identifizieren,
die trotz adjuvanter intravesikaler Immun- oder
Chemotherapie ein Blasentumorrezidiv oder eine
Tumorprogression entwickeln. Für Patienten mit
einem lokal fortgeschrittenen Blasenkarzinom wären Prognosemarker unerlässlich, die nach radikaler Zystektomie entscheidende Informationen zur
Wirksamkeit einer systemischen Chemotherapie
bieten können. Dabei muss zwischen einer primären
und sekundären Resistenz gegenüber Zytostatika
unterschieden werden. Eine effektive und gezielte
Chemotherapie bei Tumorpatienten ist nur dann
möglich, wenn man die Wirksamkeit für jede einzelne Zytostatikakomponente bereits vor der Behandlung erfassen kann. Im Gegensatz zu den bisher
einheitlichen Chemotherapieprotokollen für alle
Blasentumorpatienten, wäre eine individuell angepasste Zytostatikakombination möglich. Neben der
primären Chemoresistenz findet sich im urologischen Alltag das Problem der erworbenen Resistenz
unter einer laufenden Chemotherapie. Die Etablierung von molekularen Markern zur frühzeitigen Erkennung einer sekundären Chemoresistenz würde
dem Urologen erlauben, eine gezielte Änderung des
Chemotherapieprotokolls vorzunehmen.
Die Entdeckung von neuen molekularen Markern beim Blasenkarzinom hat nicht nur ihren
klinischen Stellenwert als Prognostikum, sondern
mittlerweile werden sie auch als Targetmoleküle in
der Tumortherapie verwendet. Es wurde bereits eine
Reihe von neuen Medikamenten entwickelt, die sich
derzeit in der klinischen Erprobung befinden, teilweise in Kombination mit klassischen Zytostatika.
Das folgende Buchkapitel soll eine Übersicht
über die Anwendung und den Einsatz von molekularen Blasentumormarkern in Bezug auf die jeweils
klinisch urologische Fragestellung geben. Im ersten
Abschnitt des Buchbeitrages wurde eine möglichst
einfache und verständliche Darstellung der molekularen und genetischen Veränderungen beim Harnblasenkarzinom beschrieben. Im zweiten Abschnitt
wurde der Schwerpunkt auf die klinische Anwendung von Prognosemarkern gelegt. Dabei wurde
unterschieden zwischen Prognosemarkern für das
oberflächliche und muskelinvasive Blasenkarzinom
sowie Markern zur Bestimmung der medikamentösen Wirksamkeit.
Ying und Yang zwischen Zellteilung
und programmiertem Zelltod
Die Zelle reguliert die Balance zwischen Zellproliferation, Zellarrest und programmiertem Zelltod
(Apoptose). Als bestes Beispiel sei hier die Wundheilung zu nennen. Liegt eine Gewebedefekt vor,
dann werden spezielle Gruppen von Genen, die Protoonkogene, in der Zelle aktiviert, die die Zellteilung
und Gewebeneubildung fördern. Nach Abschluss
der Wundheilung wird eine weitere Gruppe an
Genen, die Tumorsuppressorgene hochreguliert,
die den Zellzyklus und damit auch die Zellproliferation stoppen. Dadurch wird vermieden, dass
sich überschießendes Gewebe im Wundbett nach
Abschluss der Wundheilung bilden kann. Tumorsuppressorgene sind also wichtige Gegenspieler zu
den Protoonkogenen. Stark beschädigte Zellen in
der Wunde können durch Reparationsenzyme häufig nicht mehr in eine funktionsfähige Zelle überführt werden. Der Organismus besitzt eine eigenes
Regulationssystem, um stark beschädigte Zellen zu
eliminieren. Dieser programmierte Zelltod (Apoptose) wird durch eine gesonderte Gruppe von Apoptoseproteinen eingeleitet. Somit ist die Wundheilung
ein Balanceakt zwischen proliferationsfördernden
und hemmenden Mechanismen in der Zelle.
Das Blasenkarzinom – eine Wunde,
die nicht heilt
Bei der Tumorformation bedient sich die Zelle
ähnlicher Mechanismen wie bei der Wundheilung.
Im Gegensatz zur Wundheilung fehlt jedoch die
Balance zwischen Stimulation und Inhibierung des
Zellzyklus. Die Tumorbildung kann in drei Hauptabschnitte eingeteilt werden:
A Triggerung der Karzinogenese durch Chromosomenalterationen
B Unkontrollierte Zellprolifertion infolge des Verlusts der Balance von Zellzyklus und Apotose
C Zellinvasion und Metastasierung.
Karzinogenese des Harnblasentumors
Die Karzinogenese des Harnblasentumors ist eine
Kaskade, die zu frühen und späten Veränderungen
in der Chromosomenstruktur führt. Bereits vor 10
Jahren wurde von Spruck und Knowles ein Modell
zur Karzinogenese des Harnblasentumors vorgeschlagen. Es wurde zwei Hypothesen aufgestellt:
29
Das Blasenkarzinom – eine Wunde, die nicht heilt
Zum einen erfolgt die Entwicklung des Harnblasentumor über zwei verschiedene Mutationswege.
Zum anderen gibt es frühe und späte Mutationsereignisse (Knowles 1995; Spruck III et al. 1994).
Im Gegensatz zum normalen Urothelgewebe findet
sich in oberflächlichen Blasentumoren (pTa) ein
Chromosomenverlust der Region 9p und 9q. Chromosomenverluste in diesen Regionen stellen frühe
Ereignisse in der Karzinogenese des oberflächlichen
Blasenkarzinoms dar. Erst spätere Chromosomenalterationen wie Verluste in der Region 3p, 8p, 11p,
13q und 17p führen zu invasiven Blasenkarzinomen.
Der zweite, alternative Weg in der Karzinogenese
wird durch eine frühe p53-Mutation auf Chromosom 17p charakterisiert. Daraus entwickelt sich ein
Carcinoma in situ. Spätere Mutationsereignisse führen anschließend zu Chromosomenverluste in der
Region 9p und 9q. Im fortgeschrittenen Blasentumorstadium zeigen sich dann weitere typische genetische Veränderungen wie Chromosomenverluste
der Region 3p, 8p, 11p und 13q. Eine französische
Arbeitsgruppe konnte kürzlich zeigen, dass Genmutationen von FGFR3 (»fibroblast growth factor
receptor 3«) frühe Ereignisse in der Karzinogenese des Harnblasenkarzinoms darstellen und überwiegend in oberflächlichen Tumoren (pTa) nachzuweisen sind. Demgegenüber waren in invasiven
Blasenkarzinomen nur selten FGFR3-Mutationenen
erkennbar. FGFR3 befindet sich auf dem Chromosom 4p16.3. Es gehört zu den Tyrosinkinaserezeptoren und reguliert wichtige Signalwege im Bereich
der Zellproliferation, Zelldifferenzierung, Migration
und Angiogenese. Zusammenfassend unterstützt
die französische Arbeitsgruppe die Hypothese von
Knowles, dass die Karzinogenese über zwei verschiedene Mutationswege erfolgen muss (Bakkar et
al. 2003). Das Modell zur Karzinogenese des Blasentumors von Knowles wird in ⊡ Abb. 4.1 in abgeänderter Version dargestellt.
Unkontrollierte Zellproliferation
– Verlust der Balance zwischen Zellzyklus
und Apoptose
Alterationen in der Chromosomenstruktur können
zu Veränderungen in speziellen Genabschnitten führen, die letztlich für die Regulation der Signaltransduktion, Zellprolifertion, Zellarrest oder Apoptose
verantwortlich sind. Onkogene werden aktiviert und
fördern die ungebremste Zellteilung. Die entsprechenden Gegenspieler, die Tumorsuppressorgene
werden im Zellzyklus ausgeschaltet und können ihre
Funktion als Inhibitor der Zellproliferation nicht
mehr erfüllen. Das Gleiche gilt für die Regulation
der Apoptose. Einerseits wird die Aktivität proapoptotischer Proteine gehemmt, andererseits werden
antiapoptotische Prozesse gefördert. Das führt zum
vollständigen Ausfall des Zellzyklusregulationssystems mit der Folge, dass der gesamte Zellablauf auf
kontinuierliche Zellteilung programmiert ist. In den
folgenden Kapiteln werden die wichtigsten Mecha-
Urothel
LOH
9p + 9q
Mutation p53
(17p)
CIS
Blasentumor
Ta
Blasentumor
Muta
tio n
p
LOH
3p 8p 11p 13q
LOH
9p + 9q
53
LOH
3p 8p 11p 13q
Invasives Blasenkarzinom
4
⊡ Abb. 4.1. Karzigonese des Blasenkarzinoms
30
Kapitel 4 · Molekulare Prognosemarker des Harnblasenkarzinoms
nismen der Zellregulation beschrieben, zudem werden in diesem Kontext Prognosemarker für das
Blasenkarzinom aus aktuellen Studien vorgestellt.
Der Zellzyklus – Zentralstation
der Zelle (⊡ Abb. 4.2)
4
Zellteilung und Zellarrest werden über den Zellzyklus reguliert. Der Zellzyklus unterteilt sich in
4 Hauptabschnitte. In der S-Phase wird die DNA
repliziert, dadurch wird das genomische Material
verdoppelt. Die G2-Phase dient als Vorbereitung
auf die M-Phase. In der M-Phase kommt es zur
Chromosomensegregation mit anschließender Zellteilung. In der G1-Phase finden Zellwachstum und
Reifung statt. Der Übergang von der einen Phase
in die folgende Zellphase ist ein hochregulatives
System. Bevor die Zelle in die nächste Phase eintreten kann, müssen spezielle Proteinkomplexe in
der Zelle zum richtigen Zeitpunkt synthetisiert und
aktiviert werden. Diese Proteinkomplexe heißen
cyclinabhängige Kinasen (CdKs) und bestehen aus
zwei Untereinheiten. Nur in Komplexbildung mit
Cyclin ist die Kinase als Enzym aktiv. Durch Phosphorylierung oder Dephosphorylierung können die
CdK-Komplexe bestimmte Proteine aktivieren oder
inhibieren. CdKs bilden daher eine Schlüsselfunktion in der Zellzyklusregulation. Jeder Zellzyklusabschnitt wird durch gesonderte Cdks kontrolliert und
sie funktionieren daher als wichtige »Checkpoints«
im Zellzyklus. Der CdK4/Cyclin-D-Komplex wird
ausschließlich in der frühen G1-Phase aktiviert und
triggert dadurch die Synthese von CdK2/Cyclin E.
Nur wenn CdK2/Cyclin E in der Zelle hochreguliert
wird, ist es der Zelle erlaubt, von der G1- in die
S-Phase überzutreten. Befindet sich die Zelle nun
in der S-Phase, dann müssen neue CdK-Komplexe
aktiviert werden. CdK2/Cyclin A bildet den nächsten Checkpoint und führt die Zelle in die G2-Phase.
Der letzte wichtige Checkpoint ist der Übergang von
der G2- in die M-Phase, der von der CdK1/Cyclin-BKinase kontrolliert wird.
Spezielle Genmutationen können eine Überexpression von CdK-Komplexen hervorrufen. Eine
kontinuierliche Hochregulation und Aktivierung
der einzelnen Cdk-Komplexe würde daher zu einer
ungehemmten Zellproliferation führen. Zahlreiche
Studien haben daher verschiedene Proliferationsantigene als Prognosemarker für das oberflächliche und invasive Blasenkarzinom getestet. Zu den
wichtigsten Proliferationsmarkern gehört das Antigen Ki-67. Andere Proliferationsmarker wie PCNA
(»proliferating cell nuclear antigen«) und MCM
(»minichromosomal maintenance proteins«) spielen nur eine unbedeutende Rolle für das Harnblasenkarzinom.
Proliferationsmarker Ki-67
Ki-67 Antigen wird im Nukleus von proliferierenden
Zellen von der G1- bis zur M-Phase exprimiert. Hingegen synthetisieren ruhende Zellen, die sich in der
CdK1
p53
p21
p27
Cyclin B
G2
p27 p21
p53
M
CdK4
CdK2
Cyclin A
p53
S
p21 p27 Rb
G1
p16
p27
p21
CdK2
Cyclin E
⊡ Abb. 4.2. Zellzyklus
Cyclin D
p53
31
Das Blasenkarzinom – eine Wunde, die nicht heilt
G0-Phase befinden, kein Ki-67. Die Proteinexpression von Ki-67 wird in der Regel immunhistochemisch nachgewiesen, dabei werden im Allgemeinen
monoklonale Antikörper wie Ki-67 oder MIB-1 verwendet. Der Antikörperklon Ki-67 (Ki steht für Kiel
und weist auf das Institut für Pathologie der Kieler
Universitätsklinik hin), funktionierte nur zuverlässig an Kryostatschnitten. Der Klon MIB-1 (»made in
Borstel«) war der erste paraffingeeignete Antikörper, mit dem das Proliferationsantigen auch in der
Routinehistologie dargestellt werden konnte.
Oberflächliches Harnblasenkarzinom. In mehreren
immunhistochemischen Studien korrelierte die
Ki-67-Expression in oberflächlichen Blasentumoren mit einer hohen Rezidivrate im Langzeitverlauf. Dabei konnte Ki-67 in mehreren multivariaten
Analyse als einen wichtigen, unabhängigen Prognosemarker zur Einschätzung des Rezidivrisikos
beim oberflächlichen Blasentumor evaluiert werden
(Popov et al. 1997; Oosterhuis et al. 2000; Wu et al.
2000; Gontero et al. 2000; Rodriguez-Alonso et al.
2002; Stavropoulos et al. 2002; Pich et al. 2002; Santos et al. 2003a; Santos et al. 2003b; Rodriguez et al.
2003; Kruger et al. 2003). Demgegenüber war Ki-67
in der multivariaten Analyse von zwei Studien der
Arbeitsgruppen Pfister und Liukkonen kein unabhängiger Prognosefaktor (Pfister et al. 1999a; Liukkonen et al. 1999). Im Vergleich zu den zahlreichen
Studien, die Ki-67 als Marker zur Abschätzung des
Tumorrezidivs analysierten, gibt es nur limitierte
Arbeiten, die Ki-67 auch als Progressionsmarker
für das oberflächliche Harnblasenkarzinom untersuchten. Die bisher publizierten Studienergebnisse
sind so extrem divergent, dass der klinische Einsatz
von Ki-67 als Marker zur Risikoabschätzung für den
Progressionsverlauf von oberflächlichen Blasentumoren derzeit nicht empfohlen werden kann (Liukkonen et al. 1999; Rodriguez-Alonso et al. 2002;
Santos et al. 2003b). Demgegenüber überprüfte eine
norwegische Arbeitsgruppe, ob die Kombination
aus mehreren Proliferationsmarkern eine verbesserte Vorhersage in Bezug auf den Progressionsverlauf
bieten kann. Neben dem schon bekannten Biomarker Ki-67 wurde zusätzlich der MAI- (»mitotic activity index«) und der MNA- (»mean area of the 10
largest nuclei«)Index bestimmt. Im Vergleich zu den
klassisch histologischen Risikofaktoren, waren die
Markerkombination MNA/Ki-67 oder MNA/MAI in
der multivariaten Analyse die stärksten unabhängigen Prognosefaktoren (Bol et al. 2001).
Invasives Harnblasenkarzinom. Im Gegensatz zum
oberflächlichen Blasentumor gibt es nur eine
begrenzte Anzahl an Arbeiten, die Ki-67 auch beim
4
invasiven Blasenkarzinom untersuchten. In zwei
Studien korrelierte die Ki-67-Expression in invasiven Blasenkarzinomen mit einer höheren Rezidivund Tumorprogressionsrate. Zudem war Ki-67 in
der multivariaten Analyse ein unabhängiger Prognosemarker in Bezug auf die progressionsfreie- und
tumorspezifische Überlebensrate (Cohen et al. 1993;
Popov et al. 1997).
Tumorsupressorgene – die Bremse
des Zellzyklus (s. ⊡ Abb. 4.2)
CdK-Inhibitoren sind die Gegenregulatoren im Zellzyklus. Zu den wichtigsten CdK-Inhibitoren zählen
die Proteine Rb (Retinoblastom), p21, p27, p16 und
p53. Sie gehören auch zur Gruppe der Tumorsupressorgene, bremsen den Zellzyklus und damit die
Zellteilung. Tumorsupressorgene können nur dann
ihre Funktion als »Bremse« des Zellzyklus verlieren,
wenn beide Allele inaktiviert werden. Typischerweise geht das erste Allel durch vollständigen Chromosomenverlust verloren (LOH, »loss of heterozygosity«). Das zweite Allel wird in der Regel durch Genmutation inaktiviert. Dieser Mechanismus wurde
von Knudson erstmals 1971 als »Two-hit-Hypothese«
beschrieben (Knudson Jr 1971). Zusammenfassend
führt nur die Ausschaltung beider Allele zu einem
vollständigen Funktionsverlust der Tumorsupressorgene. Als funktionslose Cdk-Inhibitoren können
sie den Zellzyklus nicht mehr gegenregulieren, was
zu einer ungebremsten Aktivität der CdK/CyclinKomplexe führt. Dadurch wird die Zellteilungsrate
drastisch erhöht.
Das Rb-Gen ist auf Chromosom 13q14 lokalisiert und kodiert ein nukleäres Phosphoprotein.
In seiner aktiven, hypophosphorylierten Form inhibiert es gezielt nur den CDK2/Cyclin-Komplex
und blockiert im Zellzyklus den Übergang von der
G1- in die S-Phase. Das CDKN2/INK4A-Gen liegt auf
Chromosom 9p21 und kodiert den CdK-Inhibitor
p16. Es inhibiert spezifisch nur den CdK4/Cyclin-DKomplex und führt zum Zellarrest in der G1-Phase.
Demgegenüber können p21 und p27 generell alle
zuvor beschriebenen CdK-Komplexe im gesamten
Zellzyklus in ihrer Aktivität blockieren.
Uneingeschränkt gehört p53 zu den am meisten und intensivsten untersuchten Tumorsupressorgenen beim Harnblasenkarzinom (⊡ Abb. 4.3).
Das Gen p53 wurde erstmals 1979 beschrieben, aber
erst 1989 als ein Tumorsuppressorgen identifiziert
(Smith et al. 2003). Das p53-Gen ist auf Chromosom
17p13.1 lokalisiert. Das Genprodukt ist ein nukleäres
Phosphoglykoprotein mit einem Molekulargewicht
von 53.000 kDa. P53 kontrolliert im Zellzyklus den
32
Kapitel 4 · Molekulare Prognosemarker des Harnblasenkarzinoms
p53
DNA
Schädigung
Mdm2
P
Thyrosin
Kinase
4
p53 aktiv
A ktivie
p53
rung la
ng
P
Mdm2
P
A ktivie
ru n g k
u rz
p53
Bindung an Promotor
von PUMA Gen
Bindung an Promotor
von p21 Gen
p53
p53
PUMA-Gen
P21-Gen
Transkription
Transkription
Translation
Translation
PUMA-Protein
Aktivierung von
Caspasen
+
⊡ Abb. 4.3. Das Tumorsuppressorgen p53
P
p21-Protein
Inhibierung von
CdK-Cyclin
Caspasen
CdK-Cyclin
Apoptose
Zellarrest
Checkpoint von der G1- in die S-Phase. Im ungestörten, normalen Zellzyklus ist das inaktive p53 an das
Protein Mdm2 gebunden. Kommt es zu einer DNASchädigung, dann wird das p53-Protein aktiviert. Es
löst sich von der Mdm2-Bindung und wird durch
eine Tyrosinkinase phosphoryliert. Die nun aktive
p53-Form wandert in den Zellnukleus und bindet
an die Promotorregion des p21-Gens. P53 wirkt als
Transkriptionsfaktor und bewirkt durch die Promotorbindung eine Aktivierung des p21-Gens, das zur
erhöhten Synthese des p21-Proteins führt. P21 bindet
an CdK/Cyclin-Komplexe und blockiert dadurch die
CdK/Cyclin-Aktivität im Zellzyklus. Dadurch wird
der Zellzyklus in der G1-Phase gestoppt und der
Übergang in die S-Phase inhibiert. Beschädigte oder
alterierte DNA-Abschnitte können nun in der SPhase nicht mehr repliziert werden. Dafür haben
Reparaturenzyme im Zellzyklusarrest die Möglichkeit, beschädigte DNA-Abschnitte zu reparieren.
Eine sehr starke Zell- oder DNA-Schädigung führt
zu einer verlängerten p53-Aktivierung und letztlich
zur Bindung an ein zweites Gen, PUMA (»p53-upregulated modulator of apoptosis«). PUMA gehört
zur Bcl-2 Familie und ist ein Proapoptosegen. Die
33
Das Blasenkarzinom – eine Wunde, die nicht heilt
Aktivierung von PUMA durch p53 führt zu einer
erhöhten Synthese des PUMA-Proteins, das eine
Signalkaskade zur Einleitung der Apoptose triggert.
Damit erfüllt p53 zwei wichtige Funktionen: Je nach
Ausmaß der DNA-Schädigung induziert p53 entweder einen Zellzyklusarrest mit Aktivierung von
Reparaturenzymen oder es leitet den programmierten Zelltod ein. Mutationen von p53 sind in vielen
Tumorentitäten sehr häufig. Es handelt sich meistens um Punktmutationen. Alterierte p53-Proteine
verlieren ihre Funktion als »Wächter der DNA und
des Zellzyklus«, sodass Sicherheitsmechanismen
wie Zellarrest und Einleitung der Apoptose ausgeschaltet werden mit der Folge einer ungehemmten
Zellteilung.
Tumorsuppressorgene p53, p21, p27 und Rb
Oberflächliches Harnblasenkarzinom.
▬ Tumorsuppressorgen p53: Zahlreiche Studien untersuchten p53 als Prädiktor zur Bestimmung der
Tumorprogression von oberflächlichen Blasentumoren. Der p53-Protein Wildtyp hat nur eine
sehr kurze Halbwertszeit von weniger als 20 min
und entzieht sich weitgehend dem p53-Nachweis
in der Immunhistochemie. Hingegen findet sich
eine verlängerte Halbwertszeit bei den p53-Mutanten, sodass die mutierte p53-Form in der
Immunhistochemie als »positive« p53-Färbung
erkennbar ist (Smith et al. 2003).
Insgesamt wurden 12 größere Studien publiziert, die mit der multivariaten Analyse für p53
keine prognostische Signifikanz zeigen konnten
(Thomas et al. 1994; Gardiner et al. 1994; Vatne
et al. 1995; Tetu et al. 1996; Burkhard et al. 1997;
Liukkonen et al. 1999; Leissner et al. 2001; Stavropoulos et al. 2002; Reiher et al. 2002; Gil et al.
2003; Shariat et al. 2003a; Masters et al. 2003).
Demgegenüber wurde p53 in neun Studien als
ein unabhängiger Prognosemarker bewertet
(Sarkis et al. 1993; Sarkis et al. 1994; Serth et al.
1995; Casetta et al. 1997; Schmitz-Drager et al.
1997; Hermann et al. 1998; Grossman et al. 1998;
Malmstrom et al. 1999; Rodriguez-Alonso et al.
2002). Trotz der zahlreichen und umfangreichen
Studien gibt es nach wie vor keinen Konsens, ob
p53 als ein Prognosemarker für das oberflächliche Blasenkarzinom im klinischen Alltag eingesetzt werden kann.
▬ Kombination von p53 und Rb: Eine Studie von
Grossman untersuchte die Expression von zwei
Tumorsupressorgenen p53 und Rb in pT1-Blasentumoren. Patienten mit normaler p53-Wildtyp-Expression und normaler Rb-Expression
4
hatten einen exzellenten Langzeitverlauf ohne
Hinweis auf ein Tumorrezidiv. Demgegenüber
war der Nachweis einer alterierten Expression
von nur einem Marker oder beiden Marker mit
einer deutlich schlechteren Prognose verbunden
(Grossman et al. 1998).
Invasives Harnblasenkarzinom.
▬ Tumorsuppressorgen p53: Das gleiche Dilemma
von p53 als Prognosemarker findet sich auch
für das invasive Harnblasenkarzinom. In einer
Metaanalyse wurden insgesamt 43 Studien von
1993 bis 1999 mit insgesamt 3764 Patienten ausgewertet. Die multivariate Analyse von Patienten mit einem invasiven Blasenkarzinom (pT2pT4) zeigte, dass p53 nur in 2 von 7 Studien
einen unabhängigen Prognosemarker in Bezug
auf die Tumorprogression darstellte. Auch bei
Einschluss aller Tumorstadien (pTa-pT4) konnte nur in 3 von 14 Studien p53 als ein unabhängiger Prognostikator beurteilt werden (SchmitzDräger et al. 2000). Nach Einschätzung vieler
Autoren basieren die ausgeprägten Differenzen in der p53-Analyse auf sehr unterschiedliche und nichtstandardisierte Studiendesigns
(s. auch Seite 50).
▬ Tumorsuppressorgen Rb: Rb-Mutationen fanden
sich überwiegend in muskelinvasiven und entdifferenzierten Blasentumoren (Ishikawa et al.
1991; Takahashi et al. 1991). In zwei Studien war
die verminderte Rb-Expression in muskelinvasiven Blasenkarzinomen mit einer deutlich signifikant kürzeren tumorfreien Überlebenszeit
assoziiert (Cordon-Cardo et al. 1992; Logothetis
et al. 1992).
▬ Tumorsuppressorgen p27: In der univariaten
Analyse war eine verminderte p27-Expression
mit einer signifikant kürzeren Gesamtüberlebenszeit verbunden (Del Pizzo et al. 1999). Hingegen war nur die Kombination aus Ki-67 und
p27 in der multivariaten Analyse ein unabhängiger Prognosemarker in Bezug auf die Gesamtüberlebenszeit (Korkolopoulou et al. 2000).
▬ Kombination der Tumorsuppressorgene p53 und
p21: p21 ist ein CdK-Inhibitor und wird im klassischen Weg über p53 aktiviert. Eine p53-Mutation würde also auch zu einer verminderten Expression von p21 führen. Alternativ wurde nun
in mehreren Studien auch ein p53-unabhängiger
Weg beschrieben, sodass trotz vorliegender p53Mutation eine aktive p21-Expression vorliegen
kann (Parker et al. 1995). Eine Reihe von Arbeiten empfahlen daher die Bestimmung beider
Marker p21 und p53, um erweiterte Informatio-
34
4
Kapitel 4 · Molekulare Prognosemarker des Harnblasenkarzinoms
nen zum individuellen biologischen Tumorverhalten zu erhalten. In einer immunhistochemischen Studie mit 242 Patienten mit einem lokal
fortgeschrittenem Blasentumor wurde der p53und p21-Status gleichzeitig bestimmt. Patienten
mit einer gleichzeitig bestehenden p53-Mutation
und p21-negativen Expression hatten in Bezug
auf die Tumorrezidivrate und Überlebensrate
die schlechteste Prognose im Vergleich zu der
Wildtyp-Form. Patienten mit der Kombination
aus p53-Alteration und normaler p21-Expression
hatten hingegen den gleichen prognostischen
Krankheitsverlauf wie Patienten mit normaler
p53-Wildtyp-Expression (Stein et al. 1998). Die
Studie von Lipponen untersuchte ebenfalls die
Expression von p53 und p21 in 186 Blasentumoren. In der univarianten Analyse war weder der
alleinige Marker p21 noch die Kombination aus
p21 und p53 ein unabhängiger Prognosemarker
(Lipponen et al. 1998a).
▬ Kombination der Tumorsuppressorgene p53 und
Rb: Eine kombinierte Analyse der zwei Marker p53 und Rb wurde von drei Studien vorgeschlagen, um eine verbesserte Vorhersage zum
Krankheitsverlauf zu erhalten. Mutationen beider Marker waren mit einer signifikant schlechteren Prognose verbunden im Vergleich zu den
Wildtyp Formen. Patienten mit nur einer Mutation stellten eine intermediäre Risikogruppe
dar (Cote et al. 1998; Cordon-Cardo et al. 1997;
Primdahl et al. 2000).
Proto-Onkogene – der Motor
des Zellzyklus
In der normalen Zelle sind Protoonkogene hauptsächlich in der Zellteilung, Zellproliferation und
Zelldifferenzierung involviert. Zu der Gruppe der
Protoonkogene gehören Kinasen (Enzyme, die spezielle Proteine durch Phosphorylierung aktivieren),
G-Proteine (Proteine, die das Nukleotid Guanosin
Triphosphat binden), Transkriptionsfaktoren (Proteine, die an spezielle Genabschnitte binden und
die Genexpression regulieren), Wachstumsfaktoren und deren Rezeptoren. Mutationen von Protoonkogenen können einerseits zu einer erhöhten
Genamplifikation und folglich Überexpression ihrer
Proteinprodukte führen. Andererseits können sie
auch alterierte Proteinstrukturen bilden mit entsprechend veränderter Funktion in der Zellregulation. Protoonkogene mit alterierten Genabschnitten
werden als Onkogene bezeichnet. Im Gegensatz zu
den Tumorsuppressorgenen ist bei den Onkogenen
nur ein dominantes Mutationsereignis erforderlich.
Als vereinfachte Regel kann gelten, dass Onkogene
eine Steigerung der Zellprolifertion, Neoangiogenese und Tumorzellinvasion induzieren. Die wichtigsten Onkogene für das Blasenkarzinom sind die EGF
Rezeptor (EGFR) Familie, c-myc (Transkriptionsfaktor) und die Ras-Familie (G-Protein).
EGF-Rezeptor (EGFR) Familie. EGFR sind Tyrosinkinaserezeptoren und bestehen aus vier Untereinheiten. Dazu gehören ErbB1 (EGFr/HER1), ErbB2
(HER2/neu), ErbB3 (HER3) und ErbB4 (HER4).
EGFR besitzen eine extrazelluläre Domäne mit spezifischen Bindungsstellen für diverse Wachstumsfaktoren, einen transmembranen lipophilen Anteil
und eine zytoplasmatische Domäne, die mit einer
Tyrosinkinase gekoppelt ist. Wachstumsfaktoren wie z. B. EGF (»epidermal growth factor«) und
TGF-alpha (»transforming growth factor-alpha«)
binden als Liganden an den extrazelluären EGFRAnteil. Durch die Liganden-Rezeptor-Bindung wird
eine Dimerisierung der EGF-Rezeptoren ausgelöst.
Gleichzeitig aktivieren die zytoplasmatischen Tyrosinkinasen eine Autophosphorylierung des eigenen
EGF-Rezeptors. Der nun phosphorylierte zytoplasmatische EGFR-Anteil bietet durch seine Konformationsänderung neue Bindungsmöglichkeiten für
neue Proteinkomplexe wie z. B. Grb2-Sos. Durch
die Bindung der phosphorylierten Tyrosinkinase
mit spezifischen Proteinkomplexen werden nun
mehrere Signalkaskaden getriggert. Bei der ersten
Signalkaskade wird das Onkoprotein Ras aktiviert,
das in Folge eine erneute Signalkette auslöst und
letztlich eine Überexpression von Cdk4/Cyclin D im
Zellzyklus bewirkt. Der aktivierte CdK4/Cyclin-DKomplex triggert den Übergang von der G1- in die
S-Phase im Zellzyklus mit folgender DNA-Replikation und anschließender Zellteilung. Zusammenfassend wird also über die EGFR-Liganden-Bindung
eine aufwendige Signalkaskade initiiert, die zu einer
Überexpression von CdK4/Cyclin D führt. Dieser
CdK/Cyclin-Komplex wirkt als Motor im Zellzyklus
und erhöht die Zellteilungsrate. Bei der zweiten
Signalkaskade werden Proangiogenesefaktoren synthetisiert und aktiviert. Dazu zählen VEGF (»vascular endothelial growth factor«), FGF (»fibroblast
growth factor«) und IL-8 (Interleukin-8). Diese Faktoren induzieren neue Blutgefäße (Angiogenese) im
Gewebe. Eine dritte Signalkaskade führt zu einer
erhöhten Synthese von extrazellulären Matrixmetalloproteinasen (MMP). MMP ist ein Enzym, das die
extrazelluäre Matrix im Bindegewebe sowie epitheliale Basalmembranen abbauen und zerstören kann.
Eine schematische Darstellung über die Funktion
der EGF-Rezeptoren zeigt ⊡ Abb. 4.4.
4
35
Das Blasenkarzinom – eine Wunde, die nicht heilt
EGF
Thyrosin
Kinase
Thyrosin
Kinase
EGF
EGF
Thyrosin Thyrosin
Kinase
Kinase
Thyrosin Thyrosin
Kinase Kinase
P
P
P
P
Dimerisierung
+
Autophosphorylierung
S
S O tein
o
r
EGFR P
S
P r OS
ot
e in
SOS
Proteinkomplex
+
+
Ras
VEGF
bFGF
IL-8
+
Cdk4-Cyclin D
Zellproliferation
MMP-9
Zellinvasion
Angiogenese
⊡ Abb. 4.4. Funktion der EGF-Rezeptoren
Ras-Familie. Die Ras-Familie besteht aus 3 Gruppen,
dazu gehören Ral, Rap und Ras. Weiterhin kann die
Gruppe Ras in 5 verschiedene Proteine unterteilt
werden, das sind H-Ras, K-Ras, M-Ras, N-Ras und
R-Ras (Oxford u. Theodorescu 2003). Ras-Proteine
sind G-Proteine und können an Guanosintriphosphat (GTP) binden. Ras-GTP-Bindungen sind energiereiche und aktivierte Formen. Sie erfüllen ihre
Aufgaben nicht nur in der Zellzyklus- und Apoptosekontrolle, sondern sind auch wichtige Mediatoren
im Prozess der Endo- und Exozytose. Aktivierte
Ras-GTP-Bindungen können durch Dephosphorylierung in ihre inaktive Form als Ras-GDP (Guanosindiphosphat) übergehen. Genmutationen von
Ras können zu einer Imbalance zwischen der aktivierten Ras-GTP- und inaktivierten Ras-GDP-Form
führen. Ein Überangebot an aktivierten Ras-GTPBindungen fördert einerseits die Zellproliferation
und hemmt andererseits die Apoptose. Erwähnenswert ist, dass H-ras erstmals 1984 in der Blasentumorzellinie T-24 entdeckt wurde (Feramisco et al.
1984). 20 Jahre nach Erstentdeckung von H-RasMutationen im Blasenkarzinom konnten auch in
zahlreichen anderen Tumorentitäten Genmutationen von H-Ras, K-Ras und N-Ras nachgewiesen
werden.
Onkogene Ras, Myc, EGFr/HER1
und HER2/neu
Oberflächliches Harnblasenkarzinom. Nur vereinzel-
te Studien mit kleiner Fallzahl haben verschiedene
Onkogene als Prognosemarker für das oberflächliche
Harnblasenkarzinom untersucht. Insgesamt spielen
jedoch Onkogene beim oberflächlichen Harnblasenkarzinom eher eine untergeordnete Rolle.
Invasives Harnblasenkarzinom.
▬ Onkogen Ras: H-Ras-Mutationen sind häufig
Punktmutationen im Bereich der Kodons 12 und
13 (Exon 1) und Kodon 61 (Exon2) (Bos 1989).
H-Ras-Muationen fanden sich zwischen 3% und
84% aller Blasentumore (Knowles u. Williamson
1993; Saito et al. 1997; Cerutti et al. 1994; Burchill
et al. 1994). Es wurden jedoch keine Korrelationen zwischen der H-ras-Mutation und dem
Tumorstadium sowie dem Differenzierungsgrad
gefunden (Knowles u. Williamson 1993; Leve-
36
4
Kapitel 4 · Molekulare Prognosemarker des Harnblasenkarzinoms
sque et al. 1993). Zudem konnte bisher keine
Studie eine prognostische Relevanz nachweisen
(Bittard et al. 1996; Olderoy et al. 1998). Eine aktuelle Studie entdeckte eine neue H-ras-Punktmutation im Kodon 27 (Exon1), die überwiegend
in muskelinvasiven und entdifferenzierten Blasentumoren nachzuweisen war. Allerdings liegen bisher keine Nachbeobachtungsdaten zum
Krankheitsverlauf vor (Johne et al. 2003). In der
Arbeit von Przybojewska wurde in über 80%
aller Blasentumorproben neben der H-Ras-Mutation gleichzeitig auch eine N-Ras-Mutationen
nachgewiesen. Allerdings ist die Funktion des
N-Ras-Onkogens und deren Mutation beim Blasenkarzinom nahezu ungeklärt (Przybojewska
et al. 2000).
▬ Onkogen c-Myc: Eine c-myc-Überexpression
korrelierte mit dem Tumorstadiums und dem
Differenzierungsgrad (Kotake et al. 1990). Jedoch hatte eine c-myc-Expression im Blasenkarzinom keine prognostische Relevanz in Bezug
auf die Tumorprogressions- und Überlebensrate
(Lipponen 1995; Ejarque et al. 1999; Kee et al.
2001).
▬ Onkogen EGFr/HER1: Im normalen Urothelgewebe findet sich eine EGFr/HER1-Expression
ausschließlich in der Basalzellschicht. Hingegen
exprimieren Blasenkarzinome EGFr/HER1 in
ihrer gesamten Epithelschicht (Messing 1990).
Eine Überexpression von EGFr/HER1 in Blasentumoren war signifikant mit dem Tumorstadium und dem Differenzierungsgrad assoziiert
(Neal et al. 1985; Sauter et al. 1994). In der
Studie von Neal wurde zudem EGFr/HER1 als
signifikanter Prognosemarker in Bezug auf die
Tumorprogressions- und Gesamtüberlebensrate
bewertet (Neal et al. 1990). Allerdings konnten aktuellere Studien EGFr/HER1 nicht als einen unabhängigen Prognosemarker bestätigen
(Nguyen et al. 1994; Ravery et al. 1997; Sriplakich
et al. 1999). EGFr/HER1 wurde weniger als ein
Prognosemarker diskutiert, sondern vielmehr
als ein neues Targetmolekül zur Therapie des
metastasierten Blasenkarzinoms. Zu den interessantesten Medikamenten gehören sicherlich
monoklonale Antikörper gegen die extrazelluläre Domäne von EGFr/HER1 (IMC-C225, CetuximabTM, Imclone/Merck) und Inhibitoren
der intrazytoplasmatischen Tyrosinkinase von
EGFr/HER1 (ZD 1839, IressaTM, AstraZeneca).
(s. Kap. 11)
▬ Onkogen HER2/neu: Eine Reihe von immunhistochemischen Studien zeigten, dass die Über-
expression von HER2/neu mit einer signifikant
erhöhten Rezidiv- und Tumorprogressionsrate sowie mit einer verkürzten Gesamtüberlebensrate korrelierte (Miyamoto et al. 2000;
Lipponen u. Eskelinen 1994; Moriyama et al.
1991; Sato et al. 1992; Gorgoulis et al. 1995).
Demgegenüber konnte in zwei weiteren Studien
HER2/neu nicht als unabhängiger Prognosemarker bestätigt werden (Mellon et al. 1996;
Underwood et al. 1995). Eine weitere Studie
untersuchte die HER2/neu-Expression sowohl
im Primärtumor als auch in den korrespondierenden Lymphknotenmetastasen. Weder im
Primärtumor noch in den regionären Lymphknotenmetastasen war die HER2/neu-Überexpression ein unabhängiger Prognosemarker
in Bezug auf die Überlebensrate (Jimenez et
al. 2001). Zusammenfassend ist die Datenlage
bisher unzureichend, um HER/neu als einen
potentiellen Prognosemarker für das Blasenkarzinom zu empfehlen. Vergleichend zu EGFr/
HER1 wurde auch HER2/neu als ein neues Targetmolekül zur Behandlung des Harnblasenkarzinoms entdeckt. Es wurden monoklonale
Antikörper entwickelt, die an die extrazelluläre
Domäne des HER2/neu-Rezeptors binden. Zu
den bekanntesten Medikamenten gehört hier
Trastuzumab (HerceptinTM, Genentech). Ein
neuer Hemmstoff der Rezeptortyrosinkinasen,
GW572016 (GlaxoSmithKline), wurde kürzlich
in einer einarmigen, multizentrischen Phase-IIStudie als Monotherapie in der Second-Line-Behandlung von Patienten mit lokal fortgeschrittenem oder metastasiertem Blasenkarzinom
getestet. Die Patientenrekrutierung konnte im
August 2003 abgeschlossen werden. Entsprechende Auswertungen der Studie werden derzeit noch evaluiert. (s. Kap. 11)
Apoptose – der programmierte Zelltod
Die kontrollierte Zellproliferation im gesunden
Organismus wird einerseits durch den Zellzyklus,
andererseits durch die Apoptose, den programmierten Zelltod reguliert. Prinzipiell kann der programmierte Zelltod durch die Zelle selbst ausgelöst werden oder sie erfolgt durch externe Signale über FasLiganden. Für die Triggerung bzw. Inhibierung der
Apoptose in der Zelle ist eine besondere Gruppe von
Proteinen verantwortlich, die zu der Bcl-2-Familie
gehören. Innerhalb der Bcl-2-Familie werden zwei
Subklassen unterschieden: Proapotoseproteine wie
z. B. Bax, Bad, Puma fördern die Apoptose. Antiapoptoseproteine, dazu gehören BcL-2, Bcl-xL, SUR-
37
Das Blasenkarzinom – eine Wunde, die nicht heilt
VIVIN und LIVIN, inhibieren den programmierten
Zelltod. Bei Aktivierung des programmierten Zelltods formieren Proapoptoseproteine Kanäle in die
Mitochondrienmembran, sodass Cytochrom C aus
den Mitochondrien in das Zellzytoplasma heraustreten kann. Cytochrom C aktiviert die Pro-Caspase
9 im Zytoplasma, das anschließend die CaspasenKaskade triggert und letztlich über deren Signalwege den programmierten Zelltod einleitet. Antiapoptoseproteine können den Austritt von Cytochrom
C verhindern, indem sie Komplexe mit den Proapoptoseproteine an der Mitochondrienmembran
bilden und dadurch die Kanäle verschließen. Bei
der Tumorzelle findet sich eine Imbalance zwischen
der Proapopstose- und Antiapoptoseproteinaktivität, sodass die Zelle letztlich auf Unsterblichkeit
programmiert ist.
Zusätzlich kann die Apoptose auch durch externe Signale ausgelöst werden. Zytotoxische T-Lymphozyten und natürliche Killerzellen synthetisieren
spezielle transmembrane Proteine, die Fas-Liganden (FasL), die an spezifische Fas-Rezeptoren (Fas)
einer Targetzelle binden können. Durch die FasLiganden/Rezeptor-Bindung an der Zellmembran
wird im Zellzytoplasma die Pro-Caspase 8 aktiviert,
die ebenfalls über die Caspasen-Kaskade den programmierten Zelltod initiiert (Ju et al. 1999). Ein
Gruppe von membrangebundenen Fas-Liganden
kann durch Proteasen an der extrazellulären Seite gespalten werden, sodass lösliche Fas-Liganden
(sFasL) im Serum nachweisbar sind (Tanaka et al.
1996). In der Arbeit von Lee und Mitarbeiter fand
sich in 28% aller untersuchten Blasenkarzinomproben eine Fas-Mutation. Die Autoren vermuten, dass
eine Fas-Mutation möglicherweise auch mit dem
Verlust der Apoptosefunktion einhergehen kann
(Lee et al. 1999).
Apoptosemarker Bax, Bcl-2, Bcl-xL, Fas,
LIVIN und SURVIVIN
Oberflächliches Harnblasenkarzinom.
▬ Bax, Bcl-2, Bcl-xL, Fas, LIVIN und SURVIVIN:
Die alleinige Bestimmung des Antiapoptosemarkers BCL-2 konnte bei Patienten mit einem pT1-Blasentumor keinen Hinweis auf das
Tumorprogressionsrisiko und der Überlebenswahrscheinlichkeit geben (Plastiras et al. 1999).
Demgegenüber zeigte die Untersuchung an 30
Patienten mit einem pT1G3-Blasentumor, dass
die Gruppe mit positiver Bcl-2-Immunreaktion
eine signifikant kürzere tumorfreie Überlebenszeit hatte (Wolf et al. 2001). In der Studie von
Gazzaniga wurde die Genexpression des Proa-
4
poptosemarkers Bax sowie eine Kombination
aus den Antiapoptosemarkern Bcl-2, Bcl-xL, LIVIN und SURVIVIN in oberflächlichen Blasentumoren analysiert. In der Langzeitbeobachtung
korrelierten die Antiapoptosemarker LIVIN,
Bcl-xL und der Bcl-2/Bax-Index signifikant mit
der Tumorrezidivrate (Gazzaniga et al. 2003).
▬ Proapoptosemarker Fas und FasL: Serumkonzentrationen an löslichen Fas-Liganden (sFasL)
und löslichen Fas-Rezeptoren (sFas) waren in
Blasentumorpatienten signifikant höher als in
der gesunden Kontrollgruppe. Zudem korrelierten die erhöhten sFasL- und sFas-Serumkonzentrationen signifikant mit der rezidivfreien
Überlebenszeit von Patienten mit einem oberflächlichen, papillären Blasentumor (Mizutani
et al. 2001; Mizutani et al. 2002).
Invasives Harnblasenkarzinom.
▬ Antiapoptosemarker Bcl-2: Immunhistochemische Studien fanden keine Korrelation zwischen
der Bcl-2-Expression und dem Tumorstadium
sowie dem Differenzierungsgrad (Korkolopoulou et al. 2002; Shiina et al. 1996). Zusätzlich
konnte in keiner Studie eine prognostische Relevanz von Bcl-2 in Bezug auf die Gesamtüberlebensrate und tumorfreie Überlebenszeit von
Blasentumorpatienten nachgewiesen werden
(Korkolopoulou et al. 2002; Shiina et al. 1996;
Asci et al. 2001).
▬ Proapoptosemarker Bax: Entsprechend den Bcl2-Daten, korrelierte die Bax-Expression nicht
mit den histopathologischen Parametern. In
einer multivariaten Analyse von drei verschiedenen immunhistochemischen Studien war die
Überexpression von Bax hingegen mit einem
signifikant günstigeren Krankheitsverlauf verbunden (Hussain et al. 2003; Korkolopoulou et
al. 2002; Giannopoulou et al. 2002).
▬ Proapoptosemarker Fas und FasL: In der Studie
von Mizutani wurden die Serumkonzentrationen von löslichen Fas-Rezeptoren (sFas) untersucht und mit der tumorspezifischen Fünfahresüberlebensrate verglichen. Blasentumorpatienten mit erhöhten sFas-Serumkonzentrationen
hatten eine signifikant kürzere tumorspezifische
Fünfjahresüberlebensrate im Vergleich zu der
Gruppe mit niedrigen Serumwerten (Mizutani
et al. 1998). Hingegen zeigte eine immunhistochemische Untersuchung, dass die Proteinexpression von Fas im Blasentumorgewebe keine prognostische Signifikanz in Bezug auf den
Krankheitsverlauf besitzt (Giannopoulou et al.
2002).
38
Kapitel 4 · Molekulare Prognosemarker des Harnblasenkarzinoms
Zellinvasion und Metastasierung
(⊡ Abb. 4.5)
4
Der Begriff »Malignität« einer Tumorerkrankung
besteht nicht in der lokalen Tumorausdehnung
an sich, sondern in der Metastasierung, die letztlich zur lebenslimitierenden Situation führt. Dabei
herrscht eine intensive Interaktion zwischen der
Tumorzelle und ihrer Umgebung inklusive Fibroblasten, extrazellulärer Matrix, Endothelzellen und
immunkompetenten Zellen. Der Prozess der Metastasierung ist eine Kaskade, bestehend aus einer
Gefäßneubildung (Neoangiogenese) zur Sicherung
der Sauerstoffversorgung im Tumor, einer verminderten Zelladhäsion im Gewebeverband mit folglich
erhöhter Motilität von Tumorzellen, der Aktivierung proteolytischer Prozesse zur Steigerung der
Tumorzellinvasion in das umgebende Bindegewe-
be, der Tumorzelldisseminierung in das Lymphund Blutgefäßsystem und letztlich die zielgerichtete
Metastasierung in periphere Organe durch das Chemokinsystem.
Angiogenese
Große Tumormassen müssen mit Sauerstoff und
Nährstoffen versorgt werden, damit der Tumor in
seiner gesamten Ausdehnung überleben und auch
weiter wachsen kann. Die normale Diffusionsstrecke für Sauerstoff im Gewebe beträgt nur 2–3 mm
(Folkman 1992). Daher wird im Tumor eine eigene
Gerfäßversorgung (Neoangiogenese) aufgebaut. Die
Neoangiogenese ist ein komplexes System, bestehend aus verschiedenen Proteinklassen. Zu dieser
Gruppe gehören Wachstumsfaktoren, Zytokine und
Chemokine. Dabei sind sie nicht nur Mediatoren
für die Angiogenese, sondern erfüllen noch weitere
Apoptose
+
-
Tumorsuppressor
Gene
G2
M
S
G1
Pro-Apoptose: Bax, Bad, PUMA, Fas
Anti-Apoptose: Bcl-2, Bcl-X L , SURVIN, LIVIN
Onkogene
Angiogenese
Zellproliferation
Zellinvasion
Zelladhäsion
TumorzellDisseminierung
Proteolyse
Metastasierung
Lokalisation
⊡ Abb. 4.5. Zellinvasion und Metastasierung
+
COX2
VEGF, EGF, FGF, TGF-a,
-
TSP-1, TGF-b
-
E-Cadherin, Catenin, Integrin,
ICAM, CD44
+
MMP, uPA, Cathepsin, Laminin
-
+
TIMP
Chemokine: IL-8, CXCL12
39
Das Blasenkarzinom – eine Wunde, die nicht heilt
zahlreiche Funktionen in der Regulation der Zellproliferation und Zellmotilität sowie der Apoptose.
Wachstumsfaktoren lassen sich unterteilen in
fördernde und inhibierende Mediatoren der Angiogenese. Zu der Gruppe der Proangiogenesefaktoren
gehören VEGF (»vascular endothelial growth factor«), EGF (»epidermal growth factor«), FGF (»fibroblast growth factor«) und TGF-alpha (»transforming growth factor-alpha«). Inhibitoren der
Angiogenese sind TSP-1 (Thrombospondin-1) und
TGF-beta (»transforming growth factor-beta«). Im
Tumor herrscht ein Ungleichgewicht zu Gunsten
der Proangiogenesefaktoren.
Zusätzlich werden in Tumorzellen Enzyme überexprimiert, die normalerweise nur in der Wundheilung oder bei Entzündungen hochreguliert werden.
Zu dieser Gruppe gehört das Enzym Cycloxygenase-2 (COX-2), das in der Regel unter hypoxischen
Bedingungen oder bei Zellschädigung verstärkt
synthetisiert wird. COX-2 ist ein wichtiges Enzym
in der Synthese von Prostaglandinen. Eine erhöhte
COX-2-Enzymaktivität führt zu einer verstärkten
Prostaglandinsynthese im Tumorgewebe. Zusätzlich
fördert es die Angiogenese sowie Zellproliferation
und inhibiert die Apoptose (Pruthi et al. 2003).
Angiogenesemarker MVD (»microvessel
density«)
Oberflächliches Harnblasenkarzinom. Bei der MVD(»microvessel density«-)Methode werden zunächst
immunhistochemisch neugebildete Gefäßendothelien markiert, anschließend wird die Gefäßdichte
im Tumor und seiner Umgebung mikroskopisch
bestimmt (Offersen et al. 2003). Alle bisher publizierten Studien zeigten eine deutliche Korrelation
zwischen dem Grad der MVD und dem Tumorstadium. Allerdings konnte der MVD-Faktor in zwei
Studien nicht als unabhängiger Prognosemarker
in Bezug auf Tumorrezidivrate und Progression
evaluiert werden (Korkolopoulou et al. 2001; Reiher et al. 2002). Vergleichend dazu wurde in einer
größeren Studie von Goddard der MVD-Index an
170 oberflächlichen Blasentumoren bestimmt. Interessanterweise entwickelten hier nur Patienten mit
einem hohen MVD-Index einen Progress zum muskelinvasiven Tumorstadium. In der multivariaten
Analyse war der hohe MVD-Index ein unabhängiger
Prognosefaktor in Bezug auf die tumorrezidivfreie
Überlebenszeit (Goddard et al. 2003). Diese Ergebnisse wurden konnten ebenfalls von Ozer an pT1G3Blasentumoren bestätigt werden (Ozer et al. 1999).
Invasives Harnblasenkarzinom. Die überwiegende
Anzahl an Studien zeigten eine signifikante Korre-
4
lation zwischen einem hohen MVD-Index und der
Tumorprogression (Dickinson et al. 1994; Philp et
al. 1996; Jaeger et al. 1995; Inoue et al. 2000a). In
der multivariaten Analyse wurde der MVD-Index
zudem auch als unabhängiger Prognosemarker in
Bezug auf die tumorspezifische Überlebensrate und
Gesamtüberlebenszeit beschrieben (Korkolopoulou et al. 2001; Chaudhary et al. 1999; Bochner et
al. 1995). Demgegenüber zeigten zwei Studien von
Hawke und Lianes, dass die Analyse der MVD keine
prognostische Relevanz im Blasenkarzinom besitzt
(Hawke et al. 1998; Lianes et al. 1998).
Wachstumsfaktoren und Inhibitoren
der Angiogenese VEGF, FGF, EGF, TGF-alpha
und TGF-beta, TSP-1
Oberflächliches Harnblasenkarzinom.
▬ Vascular endothelial growth factor (VEGF): Immunhistochemische Arbeiten konnten keine
Assoziation zwischen der VEGF-Proteinexpression in oberflächlichen Blasentumoren und der
Tumorrezidivrate erkennen (Santos et al. 2003c;
Chow et al. 1999). Hingegen zeigte eine hohe
mRNA-Expression von VEGF in oberflächlichen
Blasentumoren eine signifikante Korrelation
mit der Tumorrezidivrate und Progressionsrate
(Crew et al. 1997). Zusätzlich wurden in aktuellen Studien die VEGF-Konzentrationen in
präoperativen Urinproben von Patienten mit
einem oberflächlichen Blasentumor bestimmt.
Hohe VEGF-Urinkonzentrationen waren dabei
signifikant mit einer erhöhten Tumorrezidivrate
verbunden (Jeon et al. 2001; Crew et al. 1999).
▬ Thrombospondin-1 (TSP-1): Während im normalen Urothelgewebe eine hohe TSP-1-Proteinexpression nachweisbar war, zeigte sich eine
verminderte TSP-1-Expression im stark vaskularisierten Blasentumorgewebe (Campbell et al.
1998). In einer immunhistochemischen Studie an
220 oberflächlichen Blasentumoren korrelierte
eine verminderte oder fehlende TSP-1-Expression signifikant mit einer kürzeren tumorprogressfreien Überlebensrate (Goddard et al. 2002).
Invasives Harnblasenkarzinom.
▬ Vascular endothelial growth factor (VEGF): Die
überwiegende Anzahl an publizierten Studien
untersuchte die VEGF-Konzentration im Serum
von Blasentumorpatienten. Erhöhte VEGF-Serum-Konzentrationen korrelierten zwar mit
dem Tumorstadium und Differenzierungsgrad,
jedoch war VEGF in der multivariaten Analyse kein unabhängiger Prognosefaktor in Bezug auf die Überlebensrate (Edgren et al. 1999;
40
4
Kapitel 4 · Molekulare Prognosemarker des Harnblasenkarzinoms
Bernardini et al. 2001). Zusammenfassend ist
die Datenlage bisher unzureichend, um VEGF
als einen potentiellen Prognosemarker für das
Blasenkarzinom zu empfehlen. Hingegen wurde
VEGF als Targetmolekül zu Behandlung von
soliden Tumoren sehr intensiv in den letzten
Jahren diskutiert. Die Idee, dass man durch
Blockung von Proangiogenesefaktoren die Gefäßneubildung im Tumor stoppen und praktisch
»austrocknen« kann, wurde bereits 1971 von Judah Folkman vorgeschlagen (Kerbel u. Folkman
2002). In den letzten Jahren wurden mehrere
humane monoklonale Antikörper gegen VEGF
(z. B. Bevacizumab, Avastin, Genentech, San
Francisco) entwickelt. Die aktuellen Ergebnisse
einer randomisierten Phase-II-Studie bei Patienten mit einem metastasierten Kolonkarzinom
zeigten in der Kombination von Bevacizumab
mit der Chemotherapie Fluorouracil und Leucovorin eine verbesserte mediane Überlebenszeit
von 20,3 Monaten im Vergleich zu 16,6 Monaten
mit der alleinigen Chemotherapie (Kabbinavar
et al. 2003). Aufgrund der sehr ermutigenden
Ergebnisse wurde von der FDA das Zulassungsverfahren für Avastin verkürzt. (s. Kap. 11).
▬ Fibroblast growth factor (FGF): FGF ist nicht nur
ein potenter Proangiogenesefaktor, sondern auch
ein wichtiger Mediator für die Tumorzellproliferation, Zellmotilität, Chemotaxis sowie Inhibitor
der Apoptose. Bisher wurde überwiegend die
basische Isoform von FGF (bFGF) in Blasentumoren am intensivsten untersucht (Cronauer et
al. 2003). Hohe bFGF-Proteinexpressionen fanden sich überwiegend in entdifferenzierten und
fortgeschrittenen Blasentumoren im Vergleich
zu einer minimalen Expression im normalen
Urothelgewebe und in oberflächlich, papillären
Blasentumoren (O’Brien et al. 1997; Cordon-Cardo et al. 1990; Palcy et al. 1995). Zahlreiche Studien haben den prognostischen Wert von bFGF in
Urinproben von Blasentumorpatienten getestet.
Es fanden sich hohe bFGF-Konzentrationen in
Urinproben von Blasentumorpatienten im Gegensatz zur gesunden Kontrollgruppe (Watanabe et al. 1991; Nguyen et al. 1993). Allerdings korrelierte die bFGF-Urinkonzentration nicht mit
dem Tumorstadium und dem Differenzierungsgrad (O’Brien et al. 1995). Ebenso konnte auch
die Messung von bFGF im Serum von Blasentumorpatienten keine prognostische Relevanz
in Bezug auf die Gesamtüberlebensrate zeigen
(Edgren et al. 1999). Derzeit werden Inhibitoren
von bFGF wie z. B. Thalidomid und Suramin in
▬
▬
▬
▬
klinischen Phase-I/II-Studien bei Patienten mit
Harnblasen- und Prostatakarzinomen getestet
(Uchio et al. 2003; Walther et al. 1996).
Epidermal growth factor (EGF): Quantitative
Messungen der EGF-Genexpression im Blasenkarzinomgewebe zeigten keine Korrelation mit
den Tumorstadium und dem Differenzierungsgrad. Im Langzeitverlauf hatten weder die EGFGenexpression noch deren Proteinexpression
eine prognostische Bedeutung für den Krankheitsverlauf (Thogersen et al. 2001; Ravery et al.
1997).
Transforming growth factor-alpha (TGF-alpha):
Während eine Studie von Ravery eine signifikante Korrelation zwischen der TGF-alpha-Proteinexpression im Blasenkarzinom und der
tumorspezifischen Überlebensrate nachweisen
konnte, hatte TGF-alpha in der Studie von Thogersen keine prognostische Bedeutung (Ravery
et al. 1997; Thogersen et al. 1999).
Transforming growth factor-beta (TGF-beta):
TGF-beta hemmt die endotheliale Zellproliferation und ist damit ein Inhibitor der Angiogenese. Im Vergleich zum normalen Urothelgewebe
konnte im Blasenkarzinom eine hohe TGF-betaProteinexpression nachgewiesen werden. Allerdings gab es keine enge Korrelation zwischen
der TGF-beta-Expression und dem Tumorstadium sowie dem Differenzierungsgrad (Eder et
al. 1997; Izadifar et al. 1999). In der Studie von
Kim war die TGF-beta im Langzeitverlauf ein
unabhängiger Prognosemarker in Bezug auf die
tumorprogressionsfreie Überlebenszeit (Kim et
al. 2001). Ebenso zeigte auch die Bestimmung
der TGF-beta-Konzentration im Serum von Blasentumorpatienten eine signifikante Korrelation
mit der tumorrezidivfreien und tumorspezifischen Überlebenszeit (Shariat et al. 2001a).
Thrombospondin-1 (TSP-1): Bisher untersuchte
nur eine Studie von Grossfeld die TSP-1-Expression an 163 Zystektomiepräparaten. Patienten
mit einer verminderten TSP-1-Expression zeigten eine signifikant erhöhte Tumorprogressionsrate und eine deutlich verkürzte Gesamtüberlebensrate. TSP-1 war in der multivariaten Analyse
ein unabhängiger Prognosemarker (Grossfeld et
al. 1997).
Angiogenesemarker COX-2
(Cyclooxygenase-2)
Oberflächliches Harnblasenkarzinom. Aktuelle im-
munhistochemische Studien haben eine COX-2Überexpression im Blasenkarzinom verglichen zum
41
Das Blasenkarzinom – eine Wunde, die nicht heilt
normalen Urothelgewebe beschrieben. Dabei korrelierte die COX-2-Expression mit dem Tumorstadium und dem Differenzierungsgrad (Mohammed et
al. 1999; Komhoff et al. 2000; Ristimaki et al. 2001).
Im Langzeitverlauf konnte jedoch keine Korrelation
zwischen der COX-2-Expression in oberflächlichen
Blasentumoren und der Tumorrezidivrate nachgewiesen werden (Friedrich et al. 2003; Shariat et
al. 2003b). Demgegenüber untersuchte die Arbeitsgruppe Kim ausschließlich eine Hochrisikogruppe
mit pT1G3-Blasentumoren und konnte COX-2 als
einen unabhängigen Prognosemarker in Bezug auf
die Tumorrezidivrate evaluieren (Kim et al. 2002).
COX-2-Enzyme sind nicht nur in der Neoangiogenese involviert, sondern fördern ebenso die
Zellproliferation, Zellmotilität und Invasion, aber
hemmen auch Mechanismen der Apoptose. Aufgrund ihrer Multifunktionalität in der Karzinogenese wurden neue COX-2-Inhibitoren in der Tumortherapie entwickelt. Am M. D. Anderson Cancer
Center werden derzeit Hochrisikopatienten mit einem oberflächlichen Blasentumor nach TUR-B und
BCG-Instillation mit dem COX-2-Inhibitor Celecoxib getestet. Die vom NCI geförderte Phase-II/IIIStudie untersucht dabei die Tumorrezidivrate im
Langzeitverlauf (Pruthi et al. 2003).
Invasives Harnblasenkarzinom. In zwei Studien war
die COX-2-Überexpression im Blasenkarzinom mit
einer kürzeren progressionsfreien- sowie tumorspezifischen Überlebensrate assoziiert. Allerdings
konnte COX-2 im Vergleich zu den klassisch histopathologischen Kriterien nicht als unabhängiger
Prognosefaktor für den Krankheitsverlauf evaluiert
werden (Shirahama et al. 2001; Shariat et al. 2003c).
Im Gegensatz zu den bisherigen Studien zeigte die
Arbeit von Tiguert mit einer Serie von 172 invasiven
Blasentumoren, dass die COX-2-Überexpression mit
einer signifikant besseren Überlebensrate verbunden ist. Es wurde daraus gefolgert, dass COX-2 in
weniger aggressiven Blasentumoren exprimiert wird
(Tiguert et al. 2002).
Zelladhäsion
Im gesunden Organismus bilden verschiedene
Zelladhäsionsproteine eine komplexe Einheit und
gewährleisten dadurch den interzellulären Kontakt
und die Zellpolarität im Gewebeverband. Zu den
wichtigsten Zelladhäsionsmolekülen gehören die
Cadherine, Catenine, Integrine, ICAM und CD44.
In vielen Tumorentitäten wurde eine fehlende oder
verminderte Expression von Zelladhäsionsproteinen
beschrieben. Dadurch wird die Ablösung einzelner
Tumorzellen aus ihrem Gewebeverband erleichtert.
4
Dies führt ebenso zur Steigerung der Zellmotilität
und Migration.
Das epitheliale Cadherin (E-Cadherin) ist ein
transmembranes Glykoprotein und bildet mit ihrer
extrazellulären Domäne ein wichtiges Adhäsionsmolekül, das den interzellulären Verband sichert
(Gruss u. Herlyn 2001).
Catenine sind Zelladhäsionsproteine und ein
wichtiges Verbindungsglied zwischen den transmembranen E-Cadherinen und dem intrazellulären
Zytoskelett. Es wurden drei Isoformen beschrieben:
die alpha-, beta- und gamma-Catenine. Zusätzlich
besitzen sie weitere Funktionen in Bereich der Signaltransduktion, Inhibierung der Apoptose sowie
Förderung der Zellproliferation und Migration (Polakis 2001).
Integrine sind transmembrane Rezeptoren und
bestehen aus zwei Hauptdomänen, der alpha und
beta Untereinheit. Extrazelluläre Matrixproteine
wie Laminin, Kollagen und Fibronektin binden an
spezifische Integrin-Rezeptoren. Dadurch wird die
Adhäsion, Form und Struktur im Zellverband gewährleistet. Integrine erfüllen aber auch wichtige
Aufgaben im Bereich der Zellmotilität und Angiogenese (Hynes 2002).
CD44 ist ein transmembranes Glykoprotein und
bildet Oberflächenrezeptoren im Urothelgewebe. Es
wird zwischen dem Standart CD44 (CD44s) und seiner varianten Isoform (CD44v) unterschieden. Sie
bilden wichtige Adhäsionsmoleküle im interzellulären Verband sowie in der Zell-Matrix-Interaktion.
Zum anderen erfüllen sie auch wichtige Funktionen
in der Lymphozytenaktivierung (Lesley et al. 1993;
Haynes et al. 1989).
Adhäsionsmarker E-Cadherin, Catenin,
Integrin, ICAM und CD44
Oberflächliches Harnblasenkarzinom.
▬ E-Cadherin: In zahlreichen Studien war der Verlust oder die verminderte E-Cadherin-Expression mit dem Differenzierungsgrad und dem
Ausmaß der Tumorinvasion verbunden (Otto et
al. 1994; Fujisawa et al. 1996; Bindels et al. 2001;
Sun u. Herrera 2002). Immunhistochemische
Studien an pTa- und pT1-Blasentumoren zeigten, dass Patienten mit einer verminderterten
E-Cadherin-Expression ein signifikant kürzeres rezidivfreies Intervall im Vergleich zu der
Gruppe mit normaler E-Cadherin-Expression
hatten. In der multivariaten Analyse war E-Cadherin jedoch kein alleiniger unabhängiger Prognosefaktor in Bezug auf die tumorrezidivfreie
Überlebenszeit (Lipponen u. Eskelinen 1995).
42
4
Kapitel 4 · Molekulare Prognosemarker des Harnblasenkarzinoms
In der Studie von Shariat wurde die E-Cadherin-Expression ausschließlich an Blasengewebe
mit einem Carcinoma in situ untersucht. Die
veminderte E-Cadherin-Expression war in der
multivariaten Analyse ein unabhängiger Prognosemarker (Shariat et al. 2001b). Zusätzlich
wurde die E-Cadherin-Konzentration im Serum
von Blasentumorpatienten gemessen. Hohe ECadherin-Konzentrationen waren mit einer kürzeren rezidivfreien Zeit assoziiert (Griffiths et al.
1996).
▬ CD44: Die bisher größte immunhistochemische
Studie von Toma untersuchte die CD44v3–6Proteinexpression an 241 oberflächlichen Blasentumoren (pTa/pT1). Im Langzeitverlauf korrelierte der Verlust der CD44v3–6-Expression
signifikant mit der verkürzten tumorrezidivfreien Überlebenszeit von Patienten mit einem pTaBlasentumor. Allerdings konnte die prognostische Relevanz von CD44v3–6 nicht bei Patienten
mit einem pT1-Blasenkarzinom bestätigt werden
(Toma et al. 1999). Demgegenüber analysierte eine zweite Studie die CD44s Expression in
oberflächlichen Blasentumoren in Bezug auf die
progressionsfreie Überlebenszeit. In der multivariaten Analyse war CD44s jedoch kein unabhängiger Prognosemarker (Stavropoulos et al. 2001).
Invasives Harnblasenkarzinom.
▬ E-Cadherin: Im Langzeitzverlauf war eine verminderte E-Cadherin-Expression im Harnblasentumor mit einer signifikant verkürzten
progressionsfreien Zeit oder einer verkürzten
tumorspezifischen Überlebenszeit verbunden
(Bringuier et al. 1993; Shimazui et al. 1996; Syrigos et al. 1998; Byrne et al. 2001; Nakopoulou
et al. 2000). Allerdings zeigte die Studie von
Lipponen, dass E-Cadherin im Vergleich zu den
klassischen histopathologischen Kriterien keine
zusätzlichen Informationen liefert und daher
keinen unabhängiger Prognosemarker darstellt
(Lipponen u. Eskelinen 1995). Demgegenüber
untersuchte eine aktuelle Studie die präoperative E-Cadherin-Konzentration im Serum von
Blasentumorpatienten. Dabei korrelierten hohe
E-Cadherin-Serumkonzentrationen signifikant
mit dem histopathologischen Nachweis einer
Lymphknotenmetastasierung und einer kürzeren progressionsfreien Überlebenszeit (Matsumoto et al. 2003).
▬ Catenin: Mehrere immunhistochemische Studien zeigten im Langzeitverlauf, dass eine verminderte oder fehlende Expression der verschiedenen Catenin-Isoformen mit einer kürzeren
Gesamtüberlebensrate verbunden war. In der
multivariaten Analyse war jedoch keine der Catenin-Isoformen ein unabhängiger Prognosemarker in Bezug auf die Überlebenszeit (Shimazui et al. 1996; Nakopoulou et al. 2000; Syrigos et
al. 1998).
▬ Integrine: Die Rolle der Integrine beim Harnblasenkarzinom wurde bisher nur sporadisch
untersucht. Die bisher größte Studie von Grossman untersuchte die Proteinexpression von
alpha6/beta4-Integrin an 57 Blasentumorproben. In der Analyse wurden drei unterschiedliche Expressionsmuster jeweils mit fehlender,
schwacher oder starker Immunreaktion evaluiert. Patienten mit schwacher alpha6/beta-Integrin-Expression zeigten im Gegensatz zu einer
alterierten starken oder fehlenden Expression
eine statistisch signifikant verbesserte Überlebensrate (Grossman et al. 2000). Mittlerweile
wurden die Integrinrezeptoren als neue therapeutische Targetmoleküle entdeckt. In aktuellen Studien konnte mit der Behandlung von
Integrinantagonisten die Angiogenese in soliden Tumoren inhibiert und folglich das Tumorwachstum reduziert werden (Kerr et al. 2002).
▬ Intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1): Immunhistochemische Studien fanden hohe ICAM1-Proteinexpressionen in invasiv wachsenden
Blasenkarzinomen, während keine ICAM-1-Expression im normalen Urothelgewebe nachweisbar war (Tomita et al. 1993). Zusätzlich wurde
auch lösliches ICAM-1 im Urin (uICAM-1) von
Blasentumorpatienten und Kontrollpersonen
gemessen. Im Vergleich zu der Kontrollgruppe
war die uICAM-1-Konzentration von Blasentumorpatienten signifikant erhöht. Allerdings
konnte keine Korrelation zwischen der uICAM1-Konzentration und den histopathologischen
Parametern sowie dem Krankheitsverlauf evaluiert werden (Chow et al. 1998). Eine weitere Studie untersuchte die ICAM-1-Serumkonzentration (sICAM-1) von 90 Blasentumorpatienten und
30 gesunden Probanden. Auch in dieser Studie
war die sICAM-1-Konzentration von Blasentumorpatienten signifikant höher vergleichend
zur Kontrollgruppe. Hohe sICAM-1-Konzentrationen fanden sich überwiegend in entdifferenzierten und großen Blasentumoren mit einem Durchmesser von mindestens 3 cm. Bisher
wurden keine Studien publiziert, die auch die
sICAM-1 Konzentration mit dem Krankheitsverlauf von Blasentumorpatienten überprüften
(Ozer et al. 2003).
43
Das Blasenkarzinom – eine Wunde, die nicht heilt
CD44: Im Vergleich zum normalen Urothelgewebe und oberflächlichen Blasentumoren wurde eine
deutlich verminderte CD44 s und CD44v Expression
in entdifferenzierten und invasiven Blasenkarzinomen gefunden (Ross et al. 1996; Sugino et al. 1996;
Hong et al. 1995). Eine hohe Expression der Variante
CD44v6 in muskelinvasiven Blasentumoren war mit
einem deutlich günstigeren Krankheitsverlauf verbunden. In der multivariaten Analyse war CD44v6
ein unabhängiger Prognosefaktor in Bezug auf die
Gesamtüberlebensrate (Lipponen et al. 1998b). Eine
aktuelle Studie untersuchte den CD44v8–10/CD44sIndex in präoperativen Spontanurinproben von
Patienten mit einem muskelinvasiven Blasentumor.
Hohe CD44v8–10/CD44s-Indexwerte im Urin von
Patienten mit einem invasiven Blasenkarzinom
waren signifikant mit einer verkürzten tumorrezidivfreien Überlebenszeit verbunden. Der CD44v8–
10/CD44s-Index in Spontanurinproben wurde daher
als eine effektiver, nichtinvasiver Prognosemarker
vorgeschlagen (Miyake et al. 2002).
Proteolyse
Epithelzellen bilden mit ihrer extrazellulären Umgebung eine dynamische Einheit und gewährleisten den
kontinuierlichen, kontrollierten und lokalen Umbau
im Gewebeverband. An den Umbauprozessen ist
eine Reihe von verschiedenen proteolytischen Enzyme beteiligt, die in sechs Enzymklassen eingeteilt
werden können: Matrixmetalloproteinasen (MMP),
Serinproteasen inklusive Urokinase-Plasminogenaktivator (u-PA), Cathepsine, Heparansen, BMP1 Metalloproteinasen und ADAM (»a disintegrin
and metalloprotease«). Sie degradieren epitheliale
Basalmembranen und extrazelluläre Matrixproteine
und bilden verschiedene Abbauprodukte wie Laminin, Kollagen und Fibronektin. Demgegenüber kann
eine gesonderte Gruppe von Proteinen die proteolytische Enzymaktivität inhibieren und verhindert
dadurch den unkontrollierten Gewebeabbau. Zu
den inhibierenden Proteinen gehört unter anderem
TIMP (»tissue inhibitor of metalloproteinases«). Im
Tumorverband wird das Gleichgewicht zwischen
der proteolytischen und inhibierenden Enzymaktivität zu Gunsten der abbauenden Enzyme verschoben. Tumorzellen sezernieren verschiedene Mediatoren wie Chemokine, Cytokine und EMMPRIN
(»extracellular matrix metalloproteinase inducer«).
Diese Mediatoren stimulieren Fibroblasten in der
extrazellulären Matrix und induzieren dadurch die
Sekretion von Metalloproteinasen in den Fibroblasten. Gleichzeitig wird die Synthese von inhibierenden Proteinen in stromalen Zellen blockiert,
4
sodass nun ein unkontrollierter Gewebeabbau erfolgen kann. Dadurch ist eine ungehinderte Migration
und Invasion von Tumorzellen in das umgebende
Gewebe und Gefäßsystem möglich (Egeblad u. Werb
2002).
Proteolytische Enzyme und BasalmembranAbbauprodukte: MMP, TIMP, u-PA, Cathepsin
und Laminin-P1
Oberflächliches Harnblasenkarzinom.
▬ Matrixmetalloproteinasen (MMP) und Inhibitoren der Metalloproteinasen (TIMP): Eine Überexpression von MMP findet sich überwiegend
in entdifferenzierten und muskelinvasiven Blasentumoren (Ozdemir et al. 1999; Bianco Jr et
al. 1998; Sumi et al. 2003). Daher wurde MMP
als Prognosemarker in oberflächlichen Blasentumoren nur in wenigen Studien untersucht.
In der Studie von Hara war eine erhöhte Genexpression von MMP-9 signifikant mit einer
kürzeren tumorrezidivfreien Überlebensrate
verbunden. Hingegen hatte MMP-2 in der multivariaten Analyse keine prognostische Relevanz
(Hara et al. 2001). In einer aktuellen Studie
von Durkan wurden die Konzentrationen von
MMP9 und deren Inhibitor TIMP-1 in präoperativen Urinproben von Blasentumorpatienten
gemessen. Die Analyse zeigte, dass ein niedriger
MMP9/TIMP-1-Index signifikant mit einer höheren Tumorrezidivrate assoziiert war (Durkan
et al. 2003)
Invasives Harnblasenkarzinom.
▬ Matrixmetalloproteinasen (MMP) und Inhibitoren der Metalloproteinasen (TIMP): Mehrere immunhistochemische Studien konnten
zwar eine erhöhte Expression von MMP2- und
MMP9-Expression in entdifferenzierten und
muskelinvasiven Blasentumoren nachweisen,
allerdings konnten MMP-2 und MMP-9 nicht als
unabhängige Prognosemarker in Bezug auf die
progressionsfreie Überlebenszeit evaluiert werden (Ozdemir et al. 1999; Bianco Jr et al. 1998;
Grignon et al. 1996; Papathoma et al. 2000).
Hingegen zeigten drei Studien, dass eine positive MMP2- bzw. MMP9-Expression signifikant
mit einer kürzeren tumorspezifischen Überlebensrate verbunden war (Kanayama et al. 1998;
Vasala et al. 2003; Durkan et al. 2003). Zusätzlich
wurde in drei Studien die Expression von TIMP2 im Blasentumorgewebe getestet und mit der
Überlebensrate verglichen. Übereinstimmend in
allen Studien war eine erhöhte TIMP-2-Expression mit einem ungünstigeren Krankheitsver-
44
4
Kapitel 4 · Molekulare Prognosemarker des Harnblasenkarzinoms
lauf verbunden. Jedoch konnte TIMP-2 in der
multivariaten Analyse nicht als unabhängiger
Prognosemarker evaluiert werden (Gakiopoulou et al. 2003; Kanayama et al. 1998; Grignon et
al. 1996).
Zusätzlich wurden in präoperativen Urinproben von Blasentumorpatienten die MMP-2 and
MMP-9 Konzentrationen gemessen. Dabei korrelierten hohe MMP Konzentrationen mit dem
Tumorstadium und dem Differenzierungsgrad
(Gerhards et al. 2001). Im Langzeitverlauf war
eine hohe MMP-9 Konzentration im Urin statistisch jedoch nicht mit einer erhöhten Rezidivoder Progressionsrate verbunden (Durkan et al.
2003).
Weitere Studien untersuchten auch die präoperativen Serumkonzentrationen von MMP2 und
MMP9. Erhöhte Serumkonzentrationen fanden
sich insbesondere bei Patienten mit einem lokal
fortgeschrittenen oder lymphogen metastasierten Blasentumor (Guan et al. 2003; Gohji et
al. 1998). Eine kombinierte Bestimmung von
MMP-2 und deren Inhibitor TIMP-2 im Serum von Patienten mit einem fortgeschrittenen
Blasenkarzinom zeigte, dass ein hoher MMP2/TIMP-2-Index mit einer deutlich verkürzten
rezidivfreien Überlebenszeit verbunden war. In
der multivariaten Analyse konnte der MMP-2/
TIMP-Index als ein unabhängiger Prognosefaktor bestätigt werden (Gohji et al. 1998).
Obwohl derzeit keiner der Metalloproteinasen bzw.
deren Inhibitoren als Prognosemarker in der Klinik
empfohlen werden kann, gibt es jedoch eine Reihe
von klinischen Studien, die Metalloproteinasen als
Targetmoleküle in der Therapie von soliden Tumoren testen. In einer randomisierten Phase-III-Studie
wurde der MMP-Inhibitor, BB2516 (British Biotech,
Oxford), an Patienten mit einem fortgeschrittenen
Magenkarzinom untersucht und zeigte eine statistisch signifikant verbesserte tumorspezifische Überlebenszeit im Vergleich zur Kontrollgruppe. Ein
weiterer MMP-Inhibitor, AG3340, wird derzeit in
einer Phase-III-Studie an Patienten mit einem hormonrefraktären Prostatakarzinom getestet (Hidalgo
and Eckhardt 2001).
▬ Urokinase-Plasminogenaktivator (U-PA): Die Serinprotease u-PA führt über die Aktivierung von
Plasmin zu einem proteolytischen Abbau der extrazellulären Matrix. Eine erhöhte Genexpression von u-PA war überwiegend in invasiven Blasenkarzinomen im Vergleich zu oberflächlichen
Blasentumoren nachweisbar (Seddighzadeh et
al. 2002). In der Studie von Hasui war eine hohe
u-PA Proteinexpression im Blasentumorgewebe
signifikant mit einer kürzeren Gesamtüberlebensrate verbunden (Hasui et al. 1992). Eine
aktuelle Studie untersuchte die präoperative
u-PA Serumkonzentration von Blasentumorpatienten. Hohe u-PA Serumkonzentration waren
insbesondere bei lymphogen metastasierten Blasenkarzinompatienten nachweisbar. Zudem war
u-PA ein signifikanter Prognosemarker in Bezug
auf die progressionsfreie Überlebenszeit (Shariat et al. 2003d)
▬ Cathepsin: Die bisher publizierten Studien untersuchten überwiegend die Proteinexpression
von Catepsin D im Blasentumorgewebe. Zwar
konnten mehrere Studien eine Korrelation zwischen der Cathepsin-D-Expression und dem Tumorstadium sowie Differenzierungsgrad zeigen,
jedoch hatte Cathepsin in keiner multivariaten
Analyse eine prognostische Relevanz in Bezug
auf die Gesamtüberlebenszeit (Ioachim et al.
2002; Carrascosa et al. 2002; Iizumi et al. 1997;
Dickinson et al. 1995). Eine neue Studie untersuchte auch die Proteinexpression von Cathepsin B im Blasenkarzinomgewebe. Dabei fanden
sich überwiegend hohe Cathepsin-B Expressionen in invasiven Blasenkarzinomen. Allerdings
liegen keine Daten in Bezug auf den Krankheitsverlauf vor (Eijan et al. 2003).
▬ Laminin-P1: Laminin, eine Hauptkomponente
der Basalmembran, wird durch Proteinasen in
seine Fragmente Laminin-P1 abgebaut. In der
Studie von Mungan waren die Serum-LamininP1-Konzentrationen von Blasentumorpatienten
deutlich höher im Vergleich zu gesunden Probanden. Zudem korrelierten erhöhte Serum-Laminin-P1-Werte mit dem Tumorstadium, Tumorgröße und Anzahl der Blasentumoren, aber
nicht mit dem Differenzierungsgrad. In der Verlaufkontrolle konnte bei Patienten mit hohen
Laminin-P1-Konzentrationen auch erhöhte Tumorrezidivrate nachgewiesen werden (Mungan
et al. 1996).
Tumorzelldisseminierung
Patienten mit einem lokal fortgeschrittenen Harnblasenkarzinom entwickeln trotz radikaler Zystektomie in bis zu 50% eine systemische Progression
in den ersten drei Jahren (Stein et al. 2001). Ursache
dafür ist vermutlich eine zum Operationszeitpunkt
bereits vorhandene, aber klinisch nicht nachweisbare lymphogene oder hämatogene Metastasierung,
die durch lokale Therapiemaßnahmen nicht beein-
45
Das Blasenkarzinom – eine Wunde, die nicht heilt
flusst werden kann (Gusterson 1992). Zirkulierende Tumorzellen werden durch das derzeit übliche
Tumorstaging nicht erfasst. Die frühzeitige Detektion von disseminierten Tumorzellen im Blut, Knochenmark oder Lymphknoten von Blasentumorpatienten wäre damit ein wichtiger Prognosemarker
für das Blasenkarzinom.
Durch die Entwicklung der Immunzytologie
steht zum Nachweis zirkulierender Tumorzellen
im Blut oder Knochenmark eine sensitive, allerdings auch aufwendige Methode zur Verfügung. Die
bisherigen Erfahrungen zeigen, dass Zytokeratine
(CK) als integrierte Bestandteile des Zytoskeletts
epithelialer Zellen stabil exprimierte Merkmale in
Tumorzellen besitzen, die mit spezifischen monoklonalen Antikörpern in einzelnen Karzinomzellen
eindeutig nachweisbar sind (Pantel et al. 1996). Die
überwiegende Zahl der immunzytologischen Studien haben CK-18 als epithelialen Tumormarker bevorzugt, der in der Regel nicht in mesenchymalem
Kompartimenten wie peripheres Blut, Knochenmark und Lymphknoten exprimiert wird. Obwohl
verschiedene Arbeitsgruppen die prognostische Relevanz der immunzytologischen Nachweismethode
durch prospektive Studien bestätigen konnten (Diel
et al. 1996), wurden Zweifel an die Aussagekraft
der Methode geäußert. Hauptkritikpunkt war die
mangelnde Reproduzierbarkeit dieser angewandten
Technik. Das würde auch die sehr unterschiedlichen
Detektionsraten von 4–45% erklären, die für das
Mammakarzinom publiziert worden sind (Osborne
u. Rosen 1994). Daher ist eine Standardisierung
dieser Methode unerlässlich, um eine genauere und
reproduzierbare Bestimmung der residuellen Tumorzellzahl zu ermöglichen.
In den letzten Jahren kamen zusätzlich molekulare Nachweisverfahren auf der Grundlage der
Reversen Transkriptase-Polymerasekettenreaktion(RT-PCR-)Technik vermehrt zum Einsatz. Damit
ist es möglich, spezielle DNA-Abschnitte von disseminierten Tumorzellen millionenfach zu kopieren,
sodass auch geringste Mengen von Tumorzell-RNA
für ihren Nachweis ausreichen (Schlimok et al. 1991).
Vorraussetzung hierfür ist jedoch, dass die Tumorzelle spezifische Veränderungen in ihrem Genom
aufweist und sich dadurch von den umgebenden hämatopoetischen Zellen unterscheidet. Für das Harnblasenkarzinom wurden bevorzugt gewebsspezifische Marker wie CK-20, Muzin 7 (MUC7), Uroplakin
II (UP II) und EGFR gewählt. Das Hauptproblem
der RT-PCR-Technik liegt zurzeit in ihrer unzureichenden Spezifität, bedingt durch Amplifikation
von Pseudogenen oder die illegitime Expression von
4
tumorassoziierter m-RNA in benignen Zellen (Krismann et al. 1995).
Selbst wenn in absehbarer Zukunft perfekte
Detektionstechniken mit sehr guter Spezifität und
Sensitivität vorliegen sollten, darf nicht vergessen werden, dass eine Tumorzelldisseminierung
nicht mit einer Metastasierung gleich zustellen ist.
Nur eine Subgruppe von disseminierten Tumorzellen führt tatsächlich zu einer klinisch relevanten
Metastasierung. Experimentelle In-vivo-Arbeiten
zeigten, dass nur 0,02% aller zirkulierenden Tumorzellen im Gefäßsystem zu einer histologisch
nachweisbaren Metastasierung führten (Chambers
et al. 2002). Nach wie vor ist unklar, welche Bedingungen im mesenchymalen Gewebe wie Knochenmark und Lymphknoten vorliegen müssen,
damit vereinzelte Tumorzellen proliferieren und
Tumorkolonien ausbilden. Analysen an vereinzelten Tumorzellen zeigten, dass ein Großteil disseminierter Tumorzellen nicht proliferiert und als
ruhende Tumorzellen (»tumor cell dormancy«) mit
einer langen Latenzzeit ausharren (Pantel et al.
1993). Der folgende Abschnitt stellt die wichtigsten Arbeiten zum Nachweis von disseminierten
Tumorzellen im venösen Blut, Knochenmark und
Lymphknoten vor.
Immunzytologische Technik zur Detektion
von disseminierten Tumorzellen
Zytokeratin-18- (CK-18-)Nachweis im Knochenmark.
In der Studie von Hofmann wurden Knochenmarksproben von 128 Blasentumorpatienten und 28 Kontrollpersonen immunzytologisch auf CK-18 untersucht. Alle Kontrollpersonen hatten einen negativen
CK-18-Knochenmarksbefund. Hingegen zeigte die
Analyse eine signifikant hohe CK-18-positive Detektionsrate im Knochenmark von Patienten mit einem
lokal fortgeschrittenen Blasenkarzinom sowie mit
lymphogener Metastasierung. Im Langzeitverlauf
hatten Patienten mit einem positiven CK-18-Nachweis eine signifikant erhöhte Tumorprogressionsrate im Vergleich zu der CK-18-negativen Gruppe
(Hofmann et al. 2003).
Zytokeratinnachweis in Lymphknoten. Zwei Studien von Yang und Leissner haben immunhistochemische Analysen mit verschiedenen Zytokeratinantikörpern an histologisch unauffälligen Lymphknoten von Blasentumorpatienten durchgeführt.
Im Vergleich zur klassischen Histopathologie,
konnten keine zusätzlichen zytokeratinpositiven
Tumorzellen oder Mikrometastasen im Lymphknoten detektiert werden (Yang et al. 1999; Leissner et al. 2002).
46
4
Kapitel 4 · Molekulare Prognosemarker des Harnblasenkarzinoms
RT-PCR-Technik zur Detektion
von disseminierten Tumorzellen
Epidermal-growth-factor-receptor- (EGFR-)Nachweis
im peripheren Blut. Bisher wurde die EGFR-mRNA-
Zytokeratin-20- (CK-20-)Nachweis im peripheren
Blut und Knochenmark. Drei Studien untersuch-
Expression im venösen Blut von Blasentumorpatienten und Kontrollgruppen nur in einer Studie
untersucht (Gazzaniga et al. 2001). Alle gesunden
Probanden und Patienten mit einer Zystitis hatten
in ihren Blutproben einen negativen EGFR-Befund.
Die EGFR-Expressionsrate in Blutproben von Blasentumorpatienten zeigte zwar keine enge Korrelation zum Tumorstadium und Differenzierungsgrad,
jedoch konnte EGFR als ein wichtiger Prognosemarker in Bezug auf die progressionsfreie Überlebenszeit evaluiert werden.
ten jeweils präoperativ die CK-20-Genexpression
im peripheren Blut von Blasentumorpatienten und
Kontrollprobanden (Fujii et al. 1999; Güdemann et
al. 2000; Gazzaniga et al. 2001).
In den Studie von Güdemann und Fujii hatten
alle Kontrollpersonen einen negativen CK-20-Befund. Hingegen zeigten die Ergebnisse von Gazzanagia, dass in 4 von 30 venösen Blutproben gesunder
Probanden und in 2 von 9 Proben von Patienten mit
einer Zystitis eine positive CK-20-Expression nachweisbar war. In dieser Arbeit wurde jedoch keine
Isolierung der mononukleären Blutzellen nach der
Ficoll-Technik (Soeth et al. 1996) durchgeführt, was
bekanntermaßen zu falsch-positiven CK-20-Befunden führt (Jung et al. 1999). In den Studien von Fujii
und Güdemann korrelierte die CK-20-Nachweisrate
im Blut mit dem Tumorstadium. Vergleichend dazu
war in der Arbeit von Gazzanagia die CK-20-Expression weder mit dem Tumorstadium noch mit dem
Lymphknotenstatus assoziiert. Des weiteren hatte
CK-20 keine prognostische Relevanz im Krankheitsverlauf. Im Gegensatz zu der CK-20-Bestimmung im
peripheren Blut, analysierte eine vierte Arbeitsgruppe die CK-20 Genexpression im Knochenmark. Der
CK-20-Nachweis gelang in 35% aller untersuchten
Knochenmarksproben von Blasentumorpatienten.
Allerdings konnte keine enge Korrelation zwischen
der CK-20-Detektionsrate und dem Tumorstadium
und Differenzierungsgrad nachgewiesen werden
(Retz et al. 2001). In der aktuellen Analyse war die
tumorspezifische Überlebensrate nach 48 Monaten
bei Patienten mit einem CK-20-positiven Knochenmarksbefund mit 38,4% im Vergleich zu der CK-20negativen Gruppe mit 64,6% (p=0,01) signifikant
kürzer. In der multivariaten Analyse war CK-20
zusammen mit dem Lymphknotenstatus ein unabhängiger Prognosemarker in Bezug auf die tumorspezifische Überlebensrate (Retz et al. 2004a).
Uroplakin-II- (UP II-)Nachweis im peripheren Blut.
In allen Studien war die UP-II-Genexpression im
venösen Blut von gesunden Probenden negativ.
Demgegenüber lag die UP-II-Detektionsrate in
venösen Blutproben von lymphogen metastasierten Blasentumorpatienten nur zwischen 12,5% und
40%. Zudem konnte in einer aktuellen Studie keine Korrelation zwischen der UP-II-Detektionsrate
im Blut und der progressionsfreien Überlebensrate
gefunden werden (Li et al. 1999; Lu et al. 2000; Gazzaniga et al. 2001).
Muzin-7- (MUC7-)Nachweis im Lymphknotengewebe. In einer aktuellen Studie wurden insgesamt 166
Lymphknoten (LK) bei der radikalen Zystektomie
von 25 Blasentumorpatienten und 20 LK von 10
Kontrollpatienten entnommen. Jeweils eine Hälfte
des Lymphknotens wurde für die MUC7 RT-PCR
und für die konventionelle Histologie verwendet.
Alle Kontroll-LK waren MUC7-negativ und alle histologisch nachweisbaren Lymphknotenmetastasen
waren MUC7-positiv. Von den 160 histopathologisch unauffälligen LK konnte in 46 LK (29%) von
17 Patienten eine MUC7-Genexpression nachgewiesen werden. Es konnte keine Korrelation zwischen
der MUC7 Detektionsrate und dem Tumorstadium
sowie Differenzierungsgrad gefunden werden. Im
Langzeitverlauf muss evaluiert werden, ob MUC7
ein unabhängiger Prognosemarker für das Blasenkarzinom darstellt (Retz et al. 2004b).
Zielgerichtete Metastasierung
Die Lokalisation von Blasenkarzinommetastasen in
periphere Organe wie Lymphknoten, Lunge, Leber
und Knochen ist kein zufälliger Prozess in der
Metastasierungskaskade, sondern eine zielgerichtete Steuerung durch das Chemokinsystem. Noch
vor einigen Jahren galt die Hypothese, dass Tumorzellen in hämatogenen und lymphogenen System
zirkulieren, sich im Kapillarsystem peripherer Organe als Tumorembolus mechanisch verankern und
neue Kolonien bilden (Bogenrieder u. Herlyn 2003).
Aktuelle Arbeiten konnten nun zeigen, dass die
zielgerichtete Wanderung von Tumorzellen in periphere Organe durch das Chemokinsystem reguliert
wird (Strieter 2001). Chemokine gehören zur Familie der Zytokine und haben eine Molekulargewicht
von 8–10 kDa. Sie spielen im gesunden Körper eine
entscheidende Rolle in der Immunabwehr und Entzündungsreaktion. Chemokine können als »Lockstoffe« spezielle Chemokinrezeptoren von immunkompetenten Zellen wie z. B. Lymphozyten aktivie-
47
Molekulare Prognosemarker
ren und sie zu einem definierten Ort lokomotorisch
anziehen. Tumorzellen bedienen sich der gleichen
Botenstoffe für ihre zielgerichtete Wanderung in
periphere Organe. Die eindruckvolle Arbeit von
Müller zeigt, dass Mammakarzinomzellen spezielle
Chemokinrezeptoren wie CXCR4 and CCR7 hochregulieren, die dagegen in der normalen Drüsenzelle
fehlen. Die korrespondierenden Chemokinliganden,
CXCL12 und CCL21, werden hauptsächlich in Lunge,
Leber, Knochenmark und Lymphknoten in hohen
Konzentrationen gebildet. Die Stimulation der Chemokinrezeptoren durch ihre zugehörigen Liganden
führte zu einer deutlich erhöhten Migration und
zielgerichteten Metastasierung von Mammakarzinomzellen in die entsprechenden chemokinreichen
Organe (Muller et al. 2001). Bisher wurden nur wenige Arbeiten über Chemokine und deren Rezeptoren
beim Blasenkarzinom publiziert. Jedoch sind die
ersten Ergebnisse so ermutigend, dass Chemokine
eine neue potentielle Rolle in der Prognose des Blasenkarzinoms darstellen könnten.
Chemokin IL-8
Die Stimulation von Blasentumorzellen mit IL-8
führte zu einer erhöhten Kollagenase- und Matrixmetalloproteinase-Aktivität und folglich zu einer
verstärkten Tumorzellinvasion. Zusätzlich fördert
IL-8 die Neoangiogenese. Weiterhin konnten IL8-aktivierte Blasentumorzellen im Mausmodell im
Gegensatz zur unstimulierten Kontrollgruppe eine
spontane lymphogene Metastasierung hervorrufen
(Inoue et al. 2000b).
In der Studie von Sheryka wurden die IL-8-Konzentrationen im Urin von Blasentumorpatienten
und Kontrollgruppen analysiert. Es fanden sich signifikant erhöhte IL-8-Urinkonzentrationen bei allen
Blasenkarzinompatienten im Vergleich zur gesunden
Kontrollgruppe. Erhöhte IL-8 Urinkonzentrationen
korrelierten dabei mit dem steigendem Tumorstadium. Zusätzlich wurden IL-8-Urinkonzentrationen
nach TUR-B und abgeschlossener intravesikaler
Instillation von oberflächlichen Blasentumoren gemessen. Patienten mit weiterhin nachweisbar hohen
IL-8-Konzentration hatten eine signifikant erhöhte
Tumorrezidivrate (Sheryka et al. 2003).
Chemokin CXCL12
In einer Screening-Untersuchung wurde die Genund Proteinexpression aller bekannten Chemokinrezeptoren in Blasenkarzinomen und in normalen
Urothelzellen analysiert. Von den 18 bekannten
Chemokinrezeptoren war ausschließlich CXCR4
im Blasenkarzinom deutlich überexprimiert, hin-
4
gegen waren normale Urothelzellen CXCR4 negativ.
Weiterhin korrelierte die erhöhte Gen- und Proteinexpression im Blasenkarzinomgewebe mit dem
steigendem Tumorstadium. Zudem führte die Stimulation von CXCR4-positiven Blasentumorzellen
mit ihrem Chemokinliganden CXCL12 zu einer signifikanten Steigerung der Tumorzellmigration und
Invasion in die extrazelluläre Matrix (Retz et al.
2004c).
Molekulare Prognosemarker
zur Bestimmung der Wirksamkeit
einer medikamentösen Therapie
Molekulare Prognosemarker wurden nicht nur zur
besseren Einschätzung des Krankheitsverlaufes von
oberflächlichen und muskelinvasiven Blasenkarzinomen evaluiert, sondern auch zur Bestimmung
der Wirksamkeit einer medikamentösen Therapie.
Dabei wird zwischen Prognosemarkern unterschieden, die eine Vorhersage zur Wirksamkeit einer
intravesikalen Blaseninstillation beim oberflächlichen Blasentumor erlauben und Marker, die die
Chemosensitivität von Zytostatika beim fortgeschrittenen Blasenkarzinom vorhersagen können.
Molekulare Prognosemarker
zur Bestimmung der Wirksamkeit
von intravesikalen Blaseninstillationen
beim oberflächlichen Blasentumor
In der überwiegenden Anzahl der Studien wurden
p53, Ki-67 und Zytokine in oberflächlichen Blasentumoren getestet, um eine bessere Vorhersage
über die Tumorrezidiv- und Progressionsrate nach
intravesikaler Instillation zu erhalten. Dabei ist zu
unterscheiden, ob die Bestimmung von Prognosemarkern in Blasenbiopsaten vor oder nach Instillationstherapie erfolgte.
Tumorsuppressorgen p53
Bestimmung von p53 in Harnblasenbiopsaten vor
intravesikaler Instillationstherapie. Zahlreiche Studi-
en haben die p53-Proteinexpression in Blasentumorgewebe jeweils vor der BCG-Behandlung getestet und
mit der Tumorrezidiv- und Progressionsrate verglichen. Jedoch war p53 in der überwiegenden Anzahl
der Arbeiten kein unabhängiger Prognosemarker
zur Vorhersage über die Wirksamkeit einer intravesikalen BCG Behandlung (Lebret et al. 1998; Pages
et al. 1998; Peyromaure et al. 2002; Zlotta et al. 1999;
48
4
Kapitel 4 · Molekulare Prognosemarker des Harnblasenkarzinoms
Lacombe et al. 1996). Hingegen zeigten zwei Studien
mit kleiner Fallzahl, dass die p53-Überexpression in
oberflächlichen Blasentumorgewebe signifikant mit
der Ansprechrate einer BCG-Behandlung korrelierte (Caliskan et al. 1997; Lee et al. 1997). Eine Studie
von Pfister untersuchte die Genmutation von p53
in oberflächlichen, unbehandelten Blasentumorproben. In der univariaten Analyse war die p53-Genmutation signifikant mit der Tumorrezidivrate nach
BCG-Therapie assoziiert. Eine multivariate Analyse
wurde in dieser Arbeit jedoch nicht durchgeführt
(Pfister et al. 1999b).
Bestimmung von p53 in Harnblasenbiopsaten nach
intravesikaler Instillationstherapie. Drei Studien
untersuchten den p53-Status in Blasenbiopsaten
nach abgeschlossener intravesikaler BCG-Behandlung. In den Studien von Ovesen und Ick korrelierte die alterierte p53-Expression in Blasenbiopsaten
nach BCG-Behandlung mit der Tumorprogressionsrate (Ovesen et al. 1997; Ick et al. 1997). In der
bisher größten Studie mit 98 Patienten konnte in
der multivariaten Analyse gezeigt werden, dass die
p53-Alteration einen unabhängigen und alleinigen
Prognosemarker zur Bestimmung der Tumorprogressionsrate darstellte. Anhand der vorliegenden
Daten wurde von den Autoren diskutiert, ob eine
radikale Zystektomie bei der Patientengruppe mit
bestehender p53-Alteration nach BCG-Therapie
empfohlen werden sollte (Lacombe et al. 1996).
wurde in der Studie von Kaempfer die IL-2-Genexpression in mononukleären Blutzellen gemessen.
Eine hohe IL-2-Genexpression in mononukleären
Blutzellen nach BCG-Therapie war mit einer niedrigen Tumorrezidivrate assoziiert. Zudem konnte
IL-2 in der multivariaten Analyse als ein unabhängiger Prognosemarker bestätigt werden (Kaempfer
et al. 1996).
Interleukin-8 (IL-8). Neben IL-2 untersuchten auch
zahlreiche Studien die IL-8-Konzentration in Urinproben nach BCG-Instillation. Allerdings fanden
sich hier sehr gegensätzliche Studienergebnisse.
Während drei Studien eine signifikante Korrelation zwischen einer hohen IL-8-Konzentration in
Urinproben und einem günstigen Krankheitsverlauf
mit niedriger Tumorrezidivrate nachweisen konnte
(Thalmann et al. 1997, 2000; Kumar et al. 2002) war
IL-8 in zwei Studien kein unabhängiger Prognosemarker (Sanchez-Carbayo et al. 2001; Rabinowitz
et al. 1997).
Proliferationsantigen Ki-67
Die Proteinexpression von Ki-67 in Blasenbiopsaten
wurde mit dem Krankheitsverlauf von Patienten
nach abgeschlossener BCG-Therapie analysiert. In
der multivariaten Analyse konnte keine Studie Ki-67
als einen unabhängigen Prognosemarker zur Vorhersage der Tumorrezidiv- oder Progressionsrate
evaluieren (Lebret et al. 2000; Zlotta et al. 1999).
Zytokine IL-2 und IL-8
Antiapoptosemarker Survivin
Intravesikale Behandlungen mit BCG lösen in
der gesamten Blasenschleimhaut eine spezifische
Immunreaktion aus. Unter anderem werden dabei
eine Reihe von Zytokinen wie z. B. die Interleukine
im Urothelgewebe exprimiert und sezerniert. Unter
der Annahme, dass eine hohe Zytokinexpression ein
Spiegelbild der immunologischen Reaktion in der
Blasenschleimhaut darstellt, wurden insbesondere
die Gruppe der Interleukine als Prognosemarker im
Urin getestet.
Interleukin-2 (IL-2). Alle bisher durchgeführten Studien konnte eine signifikante Korrelation zwischen
einer hohen IL-2-Konzentration im Urin nach BCGBehandlung und einer niedrigen Tumorrezidivrate
zeigen. Die Autoren schlussfolgerten, dass eine hohe
IL-2-Konzentration im Urin mit einem günstigen
Krankheitsverlauf verbunden ist. Allerdings wurden
in allen Studien zum einen nur univariate Analysen
durchgeführt, zum anderen wurden die Tumorprogressionsraten nicht bestimmt (Sanchez-Carbayo et
al. 2001; de Reijke et al. 1999; Saint et al. 2002). Im
Gegensatz zu den Il-2-Messungen in Urinproben,
In einer aktuellen Studie von Hausladen wurde
erstmals Survivin in Urinproben jeweils vor und
nach Blaseninstillation mit Mitomycin oder BCG
gemessen. Hohe Survivin-Urinkonzentrationen vor
intravesikaler Therapie korrelierten im Langzeitverlauf mit einer hohen Tumorrezidivrate. Interessanterweise konnte bei Patienten mit kompletter
Remission kein Survivin im Urin mehr gemessen
werden. Demgegenüber hatten Patienten, die ein
Tumorrezidiv entwickelten, erhöhte Survivin-Urinkonzentrationen (Hausladen et al. 2003).
Molekulare Prognosemarker zur
Bestimmung der Wirksamkeit
von systemischen Chemotherapien
beim fortgeschrittenen Blasenkarzinom
Glutathion-Transferasen
Glutathion-Transferasen sichern die Entgiftung von
Umweltsubstanzen und Medikamenten im Organis-
49
Molekulare Prognosemarker
mus. Durch ihre Enzymaktivität werden verschiedene Substanzen mit Glutathion konjugiert und im
weiteren Stoffwechselprozess als Merkaptursäuren ausgeschieden. Über den gleichen Mechanismus werden auch Zytostatika wie z. B. Cisplatin,
als Hauptkomponente in der Chemotherapie des
Blasenkarzinoms, verstoffwechselt und entgiftet.
Experimentelle Daten zeigten, dass eine gesteigerte Enzymaktivität von Glutathion-Transferasen zu
einer erhöhten Konjugation von Glutathion mit
Cisplatin führt und folglich eine verminderte zytostatische Wirksamkeit der Blasentumorzellen nachweisbar war (Kotoh et al. 1997; Pendyala et al. 1997).
In einer klinischen Studie korrelierte die jeweilige
Gewebekonzentration von Glutathion im Blasenkarzinom mit der Wirksamkeit einer Cisplatin-basierten Chemotherapie (Yang et al. 1997).
Metallothioneine
Metallothioneine sind Proteine mit einem sehr
hohem Cystein-Gehalt und besitzen die Eigenschaft,
Metalle und freie Radikale in der Zelle zu binden. Experimentelle Studien konnten zeigen, dass
eine hohe Metallothionein-Gewebeexpression zu
einer verstärkten Cisplatinresistenz führte (Kelley
u. Rozencweig 1989; Kotoh et al. 1994; Satoh et al.
1994). In zwei klinischen Studien war die Überexpression von Metallothionein im Blasentumorgewebe mit einer deutlich schlechteren Wirksamkeit
der Cisplatin-basierten Chemotherapie beim Blasenkarzinom assoziiert (Bahnson et al. 1994; Siu et
al. 1998).
4
gewebe von Blasentumorpatienten, die mit mehr
als 6 Zyklen nach dem M-VAC-Schema behandelt
wurden (Petrylak et al. 1994). Jedoch zeigte der PGlykoprotein-Status im Tumorgewebe bei Patienten
mit einem lokal fortgeschrittenen Blasentumor und
abgeschlossener Chemotherapie keine prognostische Signifikanz im Krankheitsverlauf (Siu et al.
1998).
Cyclooxygenase-2 (COX-2)
Eine aktuelle immunhistochemische Studie untersuchte die COX-2-Proteinexpression in Zystektomiepräparaten und korrelierte den COX-2-Status
mit der Überlebensrate von 62 Blasentumorpatienten mit abgeschlossener Chemotherapie. Eine hohe
COX-2-Expression im Blasentumor war mit einer
signifikant kürzeren Gesamtüberlebensrate (p=0,01)
der chemotherapierten Tumorpatienten verbunden
(Wülfing et al. 2004).
Tumorsuppressorgen p21
Nur vereinzelte klinische Studien haben den p21Status von Blasentumorpatienten mit deren Krankheitsverlauf nach Chemotherapie verglichen. Patienten mit einem lokal fortgeschrittenen Blasentumor
und positiver p21-Expression hatten nach adjuvanter Chemotherapie nach dem M-VAC-Schema eine
signifikant bessere mittlere Gesamtüberlebenszeit
von 60 Monaten. Demgegenüber lag die mittlere
Gesamtüberlebenszeit nur bei 21 Monaten in der
p21-negativen Patientengruppe (p<0,005) (Jankevicius et al. 2002).
Multi-Drug-Resistance-P-Glykoprotein
Tumorsuppressorgen p53
Das MDR-P-Glykoprotein ist in der Zellmembran
lokalisiert und funktioniert als Efluxpumpe, das
toxische Substanzen aus der Zellen nach außen
transportiert. Allerdings spielt das MDR-P-Glykoprotein keine entscheidende Rolle für die CisplatinResistenz (Pu et al. 1996). Demgegenüber finden sich
Hinweise, dass eine erhöhte MDR-P-GlykoproteinExpression in Blasentumoren zu einer verstärkten
Resistenz von Anthrazyklinen und Taxanen führen
kann (Pu et al. 1996; Guo et al. 1997). In einer klinischen Studie wurde die P-Glykoprotein-Expression
von Blasentumorbiopsaten jeweils vor und nach
Chemotherapie nach dem M-VAC- (Methotrexat,
Vinbalstin, Doxorubicin, Cisplatin) Protokoll verglichen. Die P-Glykoprotein-Expression war in
Gewebeproben nach durchgeführter zytostatischer
Behandlung signifikant höher im Vergleich zu den
chemonaiven Biopsaten. Allerdings fand sich die
höchste P-Glykoprotein-Expression in Metastasen-
p53-Expression bei Patienten mit einem metastasiertem Blasenkarzinom. Mehrere Studien untersuchten
den p53-Status bei Patienten mit einem metastasiertem Blasenkarzinom in Abhängigkeit von der
Wirksamkeit einer durchgeführten systemischen
Chemotherapie. Die klinischen Daten zeigten übereinstimmend, dass die Chemosensitivität und der
Krankheitsverlauf unabhängig von der p53-Expression im Blasentumorgewbe waren (Sengelov et al.
1997; Siu et al. 1998; Kakehi et al. 1998).
p53-Expression bei Patienten mit einem organbegrenzten Blasenkarzinom. In zwei Studien wurde der
p53-Status von Patienten mit einem organbegrenzten Blasentumor bestimmt und mit der Wirksamkeit einer neoadjuvanten Cisplatin-basierten Chemotherapie verglichen. Patienten mit einer normalen p53-Expression hatten eine signifikant bessere
Ansprechrate und tumorspezifische Überlebenszeit
im Vergleich zu der Patientengruppe mit alterierter
50
4
Kapitel 4 · Molekulare Prognosemarker des Harnblasenkarzinoms
p53-Expression (Sarkis et al. 1995; Kakehi et al. 1998;
Koga et al. 2000). Hingegen zeigte eine Studie im
adjuvanten Ansatz nach dem M-VAC-Schema, dass
der p53-Status bei Patienten mit einem lokal fortgeschrittenem Blasentumor keine prognostische Signifikanz in Bezug auf die Gesamtüberlebenszeit besitzt
(Jankevicius et al. 2002). Demgegenüber hatten Patienten mit alterierter p53-Expression und adjuvanter
Chemotherapie nach dem CisCA- (Cisplatin, Cyclophosphamid, Adriamycin) Protokoll eine deutlich bessere Ansprechrate und einen günstigeren
Prognoseverlauf im Vergleich zu der p53-negativen
Gruppe (Cote et al. 1997).
Basierend auf diesen Daten wurde die erste prospektiv, randomisierte Studie zur Evaluierung von
p53 als Prognosemarker von der Southern California Universität, Baylor College of Medicine und
der Chicago Universität initiiert. An der multizentrischen Phase-III- und NCI-gesponserten Studie
nimmt zusätzlich die SWOG (Southwest Oncology
Group) teil. In dieser Studie wird der p53-Status
von Patienten mit einem organbegrenzten Blasentumor (pT1-pT2bpN0M0) nach radikaler Zystektomie
bestimmt. Patienten mit normaler p53-Expression
werden regulär ohne weitere adjuvante Behandlungen nachgesorgt. Dagegen werden Patienten mit alterierter p53-Expression entweder in den Chemotherapiearm oder im Kontrollarm randomisiert. Bei der
ersten Patientengruppe wird nach radikaler Zystektomie eine adjuvante Chemotherapie mit 3 Zyklen
nach dem M-VAC-Schema druchgeführt. Die zweite
Studiengruppe wird als Kontrollarm ohne Adjuvanz
nachbeobachtet. Es handelt sich hierbei um die erste klinische Studie beim Harnblasenkarzinom unter Einbezug eines molekularen Prognosemarkers.
Diese Studie soll analysieren, ob Patienten mit einem organbegrenzten Blasentumor und gleichzeitig
vorliegender p53-Mutation eine Hochrisikogruppe
darstellen und von einer zusätzlichen Chemotherapie profitieren können. Obwohl die Initiierung
dieser prospektiv, multizentrischen Studie sicherlich ein erster, richtungsweisender Meilenstein für
die Zukunft darstellt, bleibt dennoch die Frage, ob
das Studiendesign den aktuellen klinischen Anforderungen erfüllt. Ein Problem ist sicherlich, dass
bisher sehr divergente Ergebnisse zu p53 als unabhängigem Prognosemarker vorliegen und viele Institutionen den direkten Übergang in eine klinische
Therapieentscheidung scheuen. Zum anderen wurden zwischenzeitlich neue und besser verträgliche
Zytostatikakombinationen mit Gemcitabin oder Taxol entwickelt, sodass für viele Kliniker die alte MVAC-Kombination nicht mehr attraktiv erscheint.
Trotz der Kritikpunkte bleibt zu hoffen, dass eine
schnelle Patientenrekrutierung mit einer kalkulierten Patientenzahl von 760 stattfinden wird.
Jetzt geht es erst richtig los!
Der Vergleich von Äpfel mit Birnen
in der klinischen Forschung
Uneingeschränkt ist p53 der bisher am intensivsten
untersuchte Prognosemarker für das Harnblasenkarzinom. So ist es dennoch verwunderlich, dass
trotz der umfangreichen Daten über p53, mit teilweise sehr großen Patientenfallzahlen, immer noch
keine Aussage zur »klinischen Tauglichkeit« getroffen werden kann. Am Beispiel der p53-Studie von
Masters, mit der bisher größten Fallzahl von 502
Patienten mit einem oberflächlichen Blasentumor,
werden die Probleme im klinischen Studiendesign,
in der Labormethodik und in der statistischen Auswertung deutlich (Masters et al. 2003).
▬ Einschlusskriterien: Die Patientenauswahl in Bezug auf das Tumorstadium ist in den einzelnen
Studien sehr unterschiedlich. Eine Reihe von
Studien untersuchte nur Patientengruppen mit
ausschließlich pTa- (Casetta et al. 1997; Leissner
et al. 2001), pTis- (Shariat et al. 2003a) oder
pT1-Blasentumoren (Grossman et al. 1998; Hermann et al. 1998). Hingegen analysierten andere
Studien die Gesamtgruppe aller oberflächlich
wachsenden Blasentumoren mit Einbeziehung
der Stadien von pTaG1 bis pT1G3 (Malmstrom
et al. 1999; Masters et al. 2003). Es ist daher nicht
erstaunlich, dass bei der Vermischung der Patientengruppen mit unterschiedlichen Tumorstadien auch große statistische Differenzen in
Bezug auf die Tumorprogressionsrate entstehen.
In der Studie von Masters erreichte die positive
p53-Expression nur dann ein statistische Signifikanz in Bezug auf die Tumorprogression, wenn
die Variable »Stadium pT1G3« ausgeschlossen
wurde. Hingegen war in der multivariaten Analyse nicht p53, sondern das pT1G3-Stadium der
stärkste Prognosefaktor.
▬ Therapie: Klinische Studien können nur dann
miteinander verglichen werden, wenn auch die
Therapie des oberflächlichen Blasentumors einheitlich durchgeführt wird. Fakt ist, dass die
Behandlungsformen in den p53-Studien so divergent sind, dass eine vergleichende statistische Auswertung unzulässig ist. Je nach Studiendesign reichte das Therapiespektrum von
51
Jetzt geht es erst richtig los!
der einmaligen TUR-B, über eine zweite TURNachresektion bis zu den unterschiedlichsten
Blaseninstillationsprogrammen.
▬ Auswahl des Antikörpers (AK) für die p53-Immunohistochemie: In den p53-Studien wurden
überwiegend vier unterschiedliche Antikörper
verwendet, dazu gehören 1801, DO1, D07 und
CM1. In der Studie von Masters wurden zwei
Antikörper, 1801 und DO7, gleichzeitig getestet.
Je nach Einsatz der Antikörper war das Risiko,
einen Tumorprogress zu erleiden, in der »1801AK-Gruppe« 2,5fach erhöht, hingegen in der
»D07-AK-Gruppe« nur 1,3fach.
▬ Definition der p53-Positivität: Bei der detaillierten Analyse aller p53-Studien wird deutlich, dass
unterschiedliche Definitionen für einen »positiven« p53-Tumor vorliegen. Je nach Anteil der
positiv gefärbten p53-Zellen im Verhältnis zum
gesamten Tumorverband wird ein »Cut-offWert« festgelegt, der die einzelne Tumorprobe
als p53-positiv oder -negativ definiert. Die Variationen reichen dabei von >0% (Casetta et al.
1997), 5% (Masters et al. 2003), 10% (Esrig et al.
1994) bis über 20% (Cordon-Cardo et al. 1997).
Zusammenfassend liegen zwar umfangreiche Daten
zu p53 vor, jedoch gleicht keine Studie im Design
der anderen Studie. Es ist also nicht verwunderlich,
dass der verzweifelte akademische Versuch, Äpfel
mit Birnen zu vergleichen, leider nicht zum Erfolg
führt. Der neu gegründete internationale Verbund
»Bladder Tumor Marker Network« hat sich zum Ziel
gesetzt, multizentrische, prospektive und standardisierte Studien zur Evaluierung neuer Prognosemarker zu initiieren. Die praktische Durchführung der
Standardisierung von Labormethoden ist allerdings
nicht zu unterschätzen. Der Verbund »International
Bladder Cancer Network« hat eine eigene Qualitätsprüfung in fünf verschiedenen Institutionen zur
Bestimmung der p53-Positivität in Blasentumoren
durchgeführt. Alle Kliniken erhielten die gleichen 50
Präparate mit einem muskelinvasiven Blasentumor.
Nach der »standardisierten p53-Immunfärbung«
sollte der Anteil der p53-positiven Tumorzellen im
Gewebe bestimmt werden. Zwar zeigten alle Labore
eine hohe Konkordanz in der Bewertung von extrem
hohen oder niedrigen p53-Anfärbungen, jedoch
waren erhebliche Unterschiede in der Bewertung
der Grauzone zu erkennen (McShane et al. 2000).
Auch wenn derzeit noch anfängliche Schwierigkeiten in der multizentrischen Zusammenarbeit auftreten, sollten in Zukunft nur prospektiv, standardisierte Laborstudien gefördert und anerkannt wer-
4
den. Vergleichend zu den vom AUO (Arbeitskreis
Urologische Onkologie) empfohlenen klinischen
Studien, müssen auch die zukünftigen Laborstudien
mit einem Gütesiegel für ihr Studiendesign und ihrer
praktischer Durchführung ausgezeichnet werden.
Mittlerweile werden in vielen Arbeitsgruppen Tissue
Microarrays (TMA) verwendet, die eine verbesserte
Standardisierung von immunhistologischen Studien
gewährleisten. Bereits vor 18 Jahren entwickelte die
Arbeitsgruppe Battifora die Grundlage der Tissue
Microarrays. Hier werden aus vielen verschiedenen
Paraffinpräparaten Gewebeproben zylindrisch ausgestanzt und in einen gänzlich neuen Paraffinblock
überführt (Battifora 1986). Mit diesem Verfahren
können bis zu 2500 Gewebeproben von 0,6 mm
Durchmesser auf einem Objekträger aufgebracht
werden (Kocher et al. 2002). Im Vergleich zu der
klassischen Immunhistologie, können mit der TMA
große Fallzahlen in nur einem einzigen Arbeitsgang
untersucht werden. Die TMA bietet somit identische
Versuchsbedingungen für alle untersuchten Gewebeproben, sodass die Ergebnisse durch methodische
Unregelmäßigkeiten unbeeinflusst bleiben. Weitere
Vorteile der TMA finden sich in der zeit- und kostensparenden Analyse von großen Probenmengen.
Allerdings diskutieren Kritiker der TMA aktuell, ob
die aus Paraffinblöcken herausgestanzten Gewebezylinder von nur 0,6 mm Durchmesser die Charakteristika des Gesamttumors in vollem Umfang repräsentieren können. Bekannterweise präsentieren
histologische Großflächenschnitte von Prostatakarzinomen oder Blasenkarzinomen ein sehr heterogenen Tumormaterial. Vergleichende immunhistochemische Studien haben die p53-Proteinexpression
in Prostatakarzinomen mit der TMA-Technik und
mit den korrespondierenden Großflächenschnitten
untersucht. Dabei war die p53-Expression in der
TMA-Technik deutlich abweichend von den konventionellen Großflächenschnitten (Merseburger et
al. 2003). Auch wenn Optimierungen in der TMATechnologie weiterhin erforderlich sind, bietet sie
bereits heute klare Vorteile gegenüber der klassischen Immunhistologie in Bezug auf methodische
Standardisierung sowie zeit- und kostensparende
Analytik.
Nach HUGO kommt HUPO
Wissenschaftler aus 17 Ländern haben 1988 den
Verbund Human Genome Organisation (HUGO)
gegründet und sich zum Ziel gesetzt, das gesamte
menschliche Genom in 16 Jahren zu entschlüsseln.
52
4
Kapitel 4 · Molekulare Prognosemarker des Harnblasenkarzinoms
Das wissenschaftliche Projekt, das umgerechnet drei
Milliarden Euro kostete, wurde von vielen Beobachtern mit den Anstrengungen der ersten Mondlandung verglichen. Dank der Fortschritte in der
Sequenziertechnik konnte bereits nach 11 Jahren,
also fünf Jahre früher als erwartet, das gesamte
menschliche Genom mit seinen drei Milliarden einzelnen Nukleotiden entschlüsselt werden. Zahlreiche Wissenschaftler waren letztlich doch sehr überrascht, dass die Anzahl der Gene in der hoch entwickelten Spezies Homo sapiens von den anfänglich
geschätzten 100.000 Genen auf nur ca. 30.000 Genen
zusammenschrumpfte. Immerhin 300 Gene mehr
als die gewöhnliche Feldmaus. Mit dieser Erkenntnis mussten sich die Wissenschaftler zudem von ein
weiteres Dogma lösen, das der »Ein-Gen-ein-Protein-Hypothese«. Mittlerweile wird angenommen,
dass ein einzelnes Gen die Grundmatrize für nahezu 10 verschiedene Proteine enthält. Damit besitzt
der Mensch rund 300.000 bis 400.000 verschiedene
Proteine. Nach Abschluss der weltweit konzertierten
Aktion »Human Genome Project« lautete das Fazit
vieler Wissenschaftler: Jetzt geht es erst richtig los!
Der Biochemiker Friedrich Lottspeich vom MaxPlanck-Institut für Biochemie in Martinsried hat
den aktuellen Stand der Forschung sehr anschaulich
erklärt: »Wenn wir die menschliche Zelle mit einer
Großstadt vergleichen, ist die Genomsequenz nichts
weiter als eine Liste der Einwohner. Wir wissen
nichts darüber, was in der Stadt wirklich passiert,
wo die Bürger wohnen, wer sich mit wem unterhält,
wer welchen Beruf hat usw. Diese Akteure sind im
Körper die mehr als eine Million unterschiedlichen
Proteintypen, deren Herstellungsrezepte im Genom
kodiert sind. In jeder Zelle sind zu jedem Zeitpunkt
mehr als 50.000 Proteine aktiv.« Um die Struktur
und Funktion aller Proteine (Proteom) im Menschen
zu verstehen, haben Proteinforscher am 8. Februar 2001 einen neue internationalen Verbund, die
Human Proteomic Organization (HUPO) gegründet.
Ziel von HUPO ist die systematische und internationale Erforschung der Proteinsequenzen, Strukturen,
Modifikationen, Zelllokalisation sowie Protein-Protein-Wechselwirkungen. Auch wenn inzwischen mit
der heutigen Technologie Proteinsequenzen und
Molekülstrukturen automatisiert bestimmt werden
können, befindet sich die heutige Proteomanalytik
noch im frühen »Embryonalstadium«. Nach wie vor
fehlen standardisierte und messtechnisch sichere
Verfahren, um komplexe Proteinwechselwirkungen
und zeitliche Abläufe der einzelnen Proteininteraktionen in der Zelle zu bestimmen. So ist es auch
nicht verwunderlich, dass die Gründungsstunde von
HUPO unter dem Motto »Genes were easy« eröffnet
wurde. Im November 2002 wurde der erste HUPOWeltkongress eröffnet. Wenn man bedenkt, welche
überdimensionale Herausforderung HUPO darstellt,
so war der Kongress in Versailles, Frankreich, ein
durchaus angemessener Tagungsort. Auch wenn die
Bedeutung des entschlüsselten Genoms nicht mehr
mit der ersten Mondlandung vergleichbar ist, so
bleibt doch letztlich ein guter Aspekt für die selbst
ernannte Krone der Schöpfung, wie Friedrich Lottspeich abschließend kommentierte: »Dies lässt dem
Menschen mehr Freiheit. Die Gefahr, dass das entschlüsselte Genom den Menschen ‚gläsern’ machen
könnte, besteht nun auf absehbare Zeit nicht.«
Neue Technologien zwischen Genom
und Proteom
In den letzten fünf Jahren wurde die klinische Forschung mit neuen, teilweise extravaganten und
kostspieligen Labortechniken konfrontiert. Umso
schwieriger ist es für den klinisch tätigen Urologen,
noch den Überblick in der rasanten Entwicklung
zu behalten. Während sich die früheren klassischen Studien noch auf einzelne molekulare Marker
beschränkten, können heute mit den neuen Technologien riesige Datensätze von zahlreichen Markern
in kurzer Zeit effizient bestimmt werden.
Im Vergleich zu den früheren genetischen Untersuchungen, ermöglichen Microarrays (Genchips)
die Analyse von bis zu 30.000 Genen in nur einem
Versuchsdurchgang. Microarrays besitzen auf ihrer Oberfläche mehr als 500.000 verschiedene Sequenzabschnitte und repräsentieren wichtige tumorassoziierte Gene. Das ursprüngliche Prinzip der
Microarrays besteht darin, dass im ersten Schritt
die RNA aus einer Tumorprobe in ihre cDNA umgeschrieben wird. Anschließend wird die cDNA
radioaktiv markiert und auf einem Genchip aufgetragen. Einzelne cDNA-Abschnitte können nun
mit den passenden, komplementären Gensequenzen
des Microarrays binden und hybridisieren. Bei der
anschließenden Auswertung werden die radioaktiv
markierten Punkte genau dem Genabschnitt auf der
Microarray-Kartierung zugeordnet. Derzeit werden
generell zwei Grundtypen unterschieden: Genomische DNA-Microarrays identifizieren chromosomale Alterationen im Tumorgewebe. Demgegenüber
messen Genexpressions-Arrays die unterschiedlichen Expressionshöhen auf RNA-Ebene zwischen
Tumorzelle und normaler Zelle (Guo 2003). Nach
den bisherigen Erkenntnissen aus früheren Studien
53
Jetzt geht es erst richtig los!
kann die Analyse von nur einzelnen Genen nicht die
wahre biologische Eigenschaft eines individuellen
Tumors wiederspiegeln. Die Microarray-Technik
bietet nun die Möglichkeit, genetische Veränderungen von komplexen Regulationssystemen und
zahlreichen Signalkaskaden zu erfassen. Auch wenn
die Genchip-Technologie derzeit zum modernsten
und höchsten Standard gehört, dürfen auch hier die
potentiellen Fehlerquellen nicht vernachlässigt werden. Unregelmäßige Beschichtungen der Genchipoberflächen, fehlerhafte Auftragung von Gensequenzen und Staubkontaminationen können letztlich
die Hybridisierungsvorgänge einzelner Gensequenzen einschränken. Umso verständlicher, dass von
zahlreichen Kritikern der Genchiptechnologie die
inkonsistente Reproduzierbarkeit bemängelt wird.
Experten auf dem Gebiet der Microarray-Technik
empfehlen daher eine mindestens dreimalige Wiederholung der Genchipanalyse (Piper et al. 2002;
Lee et al. 2000).
Eine weitere Limitierung findet sich in der RNAProbenaufarbeitung. Das hochsensitive MicroarraySystem bedarf im Idealfall reinsten RNA-Materials aus Tumorgewebe ohne Kontaminationen mit
normalen oder entzündlich veränderten Zellen. In
der Regel ist das Blasentumorgewebe jedoch sehr
heterogen aufgebaut, sodass die klassische Isolierung von ausschließlich Tumorzellen nahezu unmöglich erscheint. Neue Standards fordern daher
die Separation von Tumorzellen mit der Laser-Mikrodissektionstechnik. Allerdings ist die praktische
Durchführung der Laser-Mikrodissektion bekanntermaßen sehr zeitaufwendig und kostenintensiv.
Häufig ist zudem das separierte Tumormaterial zu
gering, um eine ausreichende RNA-Menge für die
Microarray-Technologie zu gewinnen (EmmertBuck et al. 1996). Schlussfolgernd sind Microarrays
in der Routinediagnostik derzeit nicht geeignet. Die
gewonnen Datenmassen lassen häufig mehr Fragen
aufkommen, als dass sie uns Antworten liefern.
Aktuelle Studien haben sich daher zum Ziel gesetzt,
eine begrenzte Anzahl von Genen zu identifizieren,
die eine exakte Aussage über das biologische Verhalten des individuellen Tumors erlauben. Eine dänische Arbeitsgruppe untersuchte 40 verschiedene
Blasenkarzinomproben mit der Microarray-Technik und analysierte die Expression von über 7500
Genen. Bei der Auswertung konnten 1767 Gene im
Blasentumor identifiziert werden, die im Vergleich
zum normalen Urothelgewebe ein verändertes Expressionsprofil zeigten. Interessanterweise erlaubte eine weitere Datenanalyse die Eingrenzung der
Anzahl auf nur 32 Gene, die eine exakte Vorhersage
4
zum Progressionsverlauf von oberflächlichen Blasentumoren ermöglichte (Dyrskjot et al. 2003). Eine
amerikanische Arbeitsgruppe untersuchte mit der
Microarray-Technik das Expressionsprofil von über
16.000 Genen in Primärkarzinomen verschiedener
Tumorentitäten. In dieser Studie wurden Patienten
mit einem Mamma-, Lungen- oder Prostatakarzinom sowie Patienten mit Lymphomen und Medulloblastomen eingeschlossen. Aus den großen Datenmassen konnte letztlich ein Cluster von 17 Genen
im Primärtumor evaluiert werden, die im Langzeitverlauf mit einer späteren Metastasierung assoziiert war. Patienten mit Nachweis eines veränderten
Genclusters im Primärtumor hatten eine signifikant
kürzere Überlebenszeit im Vergleich zu der Gruppe
ohne alterierte Genexpression. Interessanterweise
war das Risikoprofil unabhängig von der Tumorentität (Ramaswamy et al. 2003). Entscheidend scheint
also nicht das Sammeln von Datenmassen zu sein,
sondern die Extraktion von Schlüsselgenen, die eine
bessere Risikoabschätzung für jeden individuellen
Tumorpatienten erlauben.
In den letzten Jahren fokussierte die klinische
Forschung insbesondere auf die Proteomanalyse.
Für die Proteinanalytik wird verstärkt die 2-D-Gelelektrophorese (»two-dimensional polyacrylamide
gel electrophoresis«, 2-D PAGE) in Kombination mit
der Massenspektroskopie eingesetzt. Hierbei werden
Proteine in der ersten Dimension nach ihrer Ladung
und in der zwei Dimensionen nach ihrem Molekulargewicht gelelektrophoretisch aufgetrennt. Moderne
Technologien erlauben es, bis zu 10.000 verschiedene Proteine durch die 2-D-Gelelektrophorese in einem Arbeitsgang aufzutrennen. Anschließend wird
die exakte Molekülmasse der einzelnen Proteine mit
Hilfe der MALDI-Massenspektroskopie bestimmt.
Bei der MALDI (»matrix-assisted laser desorption/
ionization«) Methode wird die Proteinprobe für wenige Nanosekunden mit kurzwelligen Laserlicht bestrahlt. Durch die elektronische Anregungsenergie
werden aus der Proteinprobe gasförmige Ionen im
Hochvakuum erzeugt. Im Massenanalysator werden
dann die Ionen nach ihrem Masse-/Ladungsquotienten (m/z) aufgetrennt. Ein Detektor liefert ein
Massenspektrum, aus dem bestimmt werden kann,
welche Ionen in welchen relativen Mengen erzeugt
werden. Mit diesem Verfahren ist es inzwischen
möglich, den Aufbau eines Proteins auch aus kleinsten Probenmengen voll automatisch zu bestimmen
(Karas et al. 2000).
Mittlerweile werden Genom- und Proteomanalysen kombiniert durchgeführt, um ein umfassenderes Bild auf der Transkriptions- und Transla-
54
4
Kapitel 4 · Molekulare Prognosemarker des Harnblasenkarzinoms
tionsebene in der Tumorzelle zu gewinnen. Eine
dänische Arbeitsgruppe untersuchte nicht nur die
chromosomalen Veränderungen in Blasenkarzinomen, sondern auch die verschiedenen Expressionslevels auf RNA- und Proteinebene. Mit Hilfe von
genomischen DNA-Microarrays, GenexpressionsArrays sowie der 2-D-Gelelektrophorese mit kombinierter Massenspektroskopie konnten in 11 Regionen chromosomale Alterationen nachgewiesen
werden, die ebenfalls konkordante Veränderungen
auf der RNA- und Proteinebene zeigten. Veränderte
Gen- und Proteinexpressionen im Blasenkarzinom
zeigten sich unter anderem für Cytokeratin 17 und
20 sowie Annexin II und IV (Orntoft et al. 2002).
Mit der neuen multidimensionalen Analyse ist es
nun gelungen, spezifische Gen- und Proteincluster
zu identifizieren, die eindeutig oberflächlich, papilläre Blasentumore von einem Carcinoma in situ
unterscheiden können. Weiterhin erlaubt die kombinierte Genom- und Proteomanalyse eine exaktere
Einschätzung des Progressionsrisikos von muskelinvasiven Blasenkarzinomen (Sanchez-Carbayo et
al. 2003). Die ersten kombinierten Analysen zeigen
richtungsweisend, dass die zukünftige Forschung
aufwendiger und komplizierter wird, denn ohne
Genomic gäbe es kein Proteomic und umgekehrt.
Medizinische Anwendungen stehen bereits im Mittelpunkt der Proteomforschung und werden vom
Bundesforschungsministerium seit Ende 1999 mit
über 40 Millionen Euro finanziert.
Als die Bilder laufen lernten
In der bisherigen medizinischen Forschung wurden
überwiegend statische Analysen auf DNA- und Proteinebene in der Tumorzelle durchgeführt. Klassisches Beispiel hierfür ist die Immunhistologie, bei
der durch Immunfärbungen in Formalin fixiertem
und Paraffin eingebetteten Gewebe Proteinexpressionen verschiedener Zellmarker untersucht werden,
die ggf. Rückschlüsse auf die Biologie der Tumorzelle ermöglichen sollen. Allerdings werden dabei
die Charakteristika einer »lebenden Tumorzelle«
vollständig außer Acht gelassen. Die konventionellen Techniken geben in der Regel keine Informationen, inwieweit Veränderungen auf DNA- oder
Proteinebene auch mit einer alterierten Motilität,
Migration oder Invasion von Tumorzellen korrelieren können.
Die CVTL (»computerized video time lapse analysis«) gehört zu den ersten Techniken, die das
Verhalten von lebenden Tumorzellen in der Zell-
kulturflasche als Film dokumentieren kann. Ein
spezielles CVTL-Mikroskop erlaubt die gleichzeitige
Beobachtung von 50 verschiedenen Feldern in der
Zellkulturflasche und dokumentiert alle 11 Sekunden Bilder von einzelnen Tumorzellen. Die autofokussierte Bilddokumentation von Tumorzellen
kann dabei über eine Woche erfolgen. Die einzelnen
Bilder werden computergestützt als Film verarbeitet
und erlauben dadurch umfassende Analysen über
Zellproliferation, Zellfusion, aberrante Mitosen und
Apoptoseverhalten von einzelnen Tumorzellen. Arbeitsgruppen an der UCSF (University of California
San Francisco) untersuchen derzeit mit der CVTLTechnik das dynamische Verhalten von Blasentumorzellen nach verschiedenen Bestrahlungsbehandlungen in Bezug auf Zellproliferation, Zellzyklusarrest und Apoptose (Leonhardt et al. 1998; Chu et
al. 2002) Filmsequenzen über dynamische Zellveränderungen von Blasentumorzellen sind unter der
Website http://www.ucsf.edu/cvtl/prev/gallery.html
zu finden.
Im Gegensatz zu der konventionellen CVTLTechnik im zweidimensionalen Zellkulturmodell
wurden neue In-vitro-Techniken entwickelt, die
auch die Motilität von Tumorzellen in einem dreidimensionalen Gitternetz beobachten können. Das
Gitternetz besteht aus Fibroblasten und Kollagenen
und ähnelt nahezu der extrazellulären Matrix (EZM)
in vivo. Die deutsche Arbeitsgruppe von Peter Friedl
konnte mit der dreidimensionalen In-vitro-Technik ganz neue und spannende Erkenntnisse über
das Migrations- und Metastasierungsverhalten von
Tumorzellen aufdecken (Friedl u. Wolf 2003). Noch
vor kurzem galt die vereinfachte Vorstellung, dass
im Prozess der Metastasierung sich einzelne Tumorzellen aus dem Karzinomverband lösen und sie
mit Hilfe von EZM degradierenden Enzymen in die
Lymph- und Blutsysteme eindringen. Mittlerweile
lehren uns die neuen Filmsequenzen, dass neben den
vereinzelten Tumorzellen auch ganze Zellkolonien
als Verband metastasieren können. Typische Zellkolonien bilden zum Beispiel Melanome, Mammaund Prostatakarzinome. Zusätzlich konnten zwei
grundsätzlich unterschiedliche Tumorzellformen
identifiziert werden: Der »Mesenchymtyp« ähnelt
mit seiner Spindelform eher einer Fibroblastenzelle.
Für die Migration benötigt der Mesenchymtyp ein
intaktes Zytoskelett inklusive der Aktine, Cadherine
und Integrine. Die Zellinvasion in das umgebende
Gewebe ist dabei nur mit Hilfe von proteolytischen
Enzymen möglich. Zum Mesenchymtyp gehören
Fibrosarkome und Glioblastome. Demgegenüber
imponiert der Amöboidtyp durch seine rundliche
55
Literatur
Zellform und kann durch seine flexible, hochelastische Formveränderungen durch das dreidimensionale Gitternetz »schlüpfen«. Der Amöboidtyp benötigt für die Migration also kein Aktinzytoskelett
und keine Cadherine oder Integrine, ebenso keine
proteolytischen Enzyme. Zum Amöboidtyp gehören
Lymphome, verschiedene Leukämieformen, kleinzellige Lungen- und Prostatakarzinome. Die Tatsache, dass der Prozess der Metastasierung nicht nur
von einem Tumorzelltyp bestimmt wird, eröffnete
kürzlich die Diskussion, in wieweit zytostatische
Behandlungen einen Einfluss auf die verschiedenen
Metastasierungstypen haben. Neue pharmakologische Studien untersuchten das Metastasierungsverhalten von Melanomzellen, die in der Regel als
einheitliche Zellkolonie in einem dreidimensionalen
Matrix wandern (Hegerfeldt et al. 2002). Je nach
Behandlung der Melanomzellen mit verschiedenen
Inhibitoren waren die Melanomzellen in der Lage,
ihre Zellform und Funktion wie ein Chamäleon zu
verändern. Die pharmakologische Blockierung von
Cadherinen führte zur Auflösung des Tumorzellkolonieverbandes und die einzelnen Melanomzellen
übernahmen die Form und Funktion des Mesenchymtyps. Wurden zusätzlich die Integrine oder alle
Proteasen blockiert, dann verwandelte sich die Melanomzelle vom Mesenchymtyp zum Amöboidtyp.
Die amöboide Melanomzelle konnte trotz der zahlreichen pharmakologischen Therapien ungehindert
weiter durch das Netzwerk wandern. Pharmakologische In-vitro-Studien werden in naher Zukunft das
herkömmliche Zellkulturverfahren durch eine dynamische Videomikroskopie mit dreidimensionaler
Bilddokumentation ersetzen. Beispielhafte Filmsequenzen sind unter der Website http://cancerres.
aacrjournals.org/cgi/content/full/62/7/2125/DC1 zu
finden.
Neueste Entwicklungen in der MultiphotonMikroskopie erlauben nun auch direkte In-vivoFilmaufnahmen von Tumorzellen im Tiermodell.
Damit ist es nun gelungen, die Migration, Invasion
und Metastasierung von einzelnen Tumorzellen in
lebenden Organismen zu beobachten. Erstaunlich
ist vor allem die gemessene Migrationsgeschwindigkeit von Karzinomzellen im lebenden Tiermodell.
Mit der Multiphoton-Mikroskopie erreichten Karzinomzellen eine Geschwindigkeit von 3 µm/min,
dagegen war die Zellbeweglichkeit im artifiziellen
dreidimensionalen Zellkulturmodell dreißigfach
langsamer (Condeelis u. Segall 2003). Mit der neuen
Technologie kann nicht nur die exakte Tumorzellmigration aus dem Primärtumor beobachtet werden, sondern es erlaubt auch den direkten Vergleich
4
zwischen dem Verhalten von nichtmetastasierten
und metastasierten Tumorzellen. Am Beispiel des
Mammakarzinoms konnte zwei Tumorzelltypen
identifiziert werden. Der Amöboidtyp wandert unter dem Einfluss von Chemokinen (s. auch S. 46)
zu den Blutgefäßen, formt dort polare Zellausstülpungen (Pseudopodien) und bindet direkt an die
Gefäßwand. Durch ihre starke Formflexibilität können sie direkt durch die Gefäßwandspalten wandern
und erreichen dadurch zügig die Blutzirkulation.
Im Gegensatz dazu formen Karzinomzellen vom
Mesenchymtyp keine Pseudopodien entlang der
Gefäßwand und besitzen eine geringere Tendenz,
in die Blutgefäße einzudringen. Erreichen dennoch
Tumorzellen vom Mesenchymtyp die Blutzirkulation, so werden sie durch Scherkräfte in viele
Zellfragmente zerstört. Amöboide Karzinomzellen
haben dagegen eine stabile Zellform und unterliegen
keiner Zellfragmentation (Wang et al. 2002). Mit der
Entwicklung von neuen visualisierenden Techniken wie zum Beispiel der Multiphoton-Mikroskopie
werden in naher Zukunft nicht nur revolutionäre
neue Erkenntnisse in der biomedizinischen Grundlagenforschung zu erwarten sein, sondern sie werden auch in der pharmakologischen Forschung neue
Therapieansätze anbieten können.
Zusammenfassung
Nach wie vor fehlt für das Harnblasenkarzinom im
klinischen Alltag ein geeigneter molekularer Prognosemarker. Therapieentscheidungen und Nachsorgepläne richten sich weiterhin nach den klassischen histopathologischen Kriterien. Während das
molekulare Zeitalter beim Prostatakarzinom bereits
erreicht ist, bleibt abzuwarten, ob in naher Zukunft
auch ein geeigneter »PSA-Marker« für das Blasenkarzinom etabliert werden kann.
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