Zentrum für Humangenetik

Zentrum für Humangenetik
Universität Bremen
Quantitative Analysen der HMG-Expression in
ausgewählten malignen Neoplasien
Dissertation
Zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften
- Dr. rer. nat -
Dem
Promotionsausschuss Dr. rer. nat.
im
Fachbereich Biologie / Chemie der Universität Bremen
vorgelegt von
Britta Meyer
Bremen, 29.09.2006
1. Gutachter: Prof. Dr. J. Bullerdiek
2. Gutachter: Prof. Dr. L. Rensing
Hiermit erkläre ich, Britta Meyer, geboren am 08.08.1974, dass zum Verfassen der
vorliegenden Dissertation „Quantitative Analysen der HMG-Expression in
ausgewählten malignen Neoplasien” folgende drei Aussagen zutreffen:
1. Ich habe die Arbeit ohne unerlaubte fremde Hilfe angefertigt.
2. Ich habe keine anderen als die von mir angegebenen Quellen und Hilfsmittel
benutzt.
3. Ich habe die den benutzten Werken wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen
als solche kenntlich gemacht.
Bremen, 29.09.2006
Britta Meyer
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung........................................................................................................ 1
2
Material und Methoden .................................................................................. 9
2.1
Gewebeproben ............................................................................................. 9
2.2
Blutproben .................................................................................................... 9
2.3
Zelllinien ....................................................................................................... 9
2.4
DNA-Isolierung ........................................................................................... 10
2.4.1
2.4.2
2.4.3
2.4.4
2.5
Isolierung genomischer DNA aus Zellkultur ............................................ 10
Plasmid DNA-Isolierung.......................................................................... 10
BAC DNA-Isolierung ............................................................................... 10
Quantifizierung von DNA im Photometer ................................................ 10
RNA-Isolierung ........................................................................................... 10
2.5.1
2.5.2
2.5.3
2.5.4
2.5.5
RNA-Isolierung aus Frischgewebe und Zellen........................................ 10
RNA-Isolierung aus Blut (PAXgene) ....................................................... 11
RNA-Isolierung aus Blut (ROCHE) ......................................................... 11
mRNA-Anreicherung............................................................................... 12
Quantifizierung von RNA im Photometer ................................................ 12
2.6
Northern Blot .............................................................................................. 12
2.7
cDNA-Erststrangsynthese .......................................................................... 13
2.8
PCR............................................................................................................ 13
2.9
Gelelektrophorese ...................................................................................... 13
2.10
Klonierung und Sequenzierung von DNA-Fragmenten............................... 14
2.11
Herstellung von cDNA/DNA-Sonden .......................................................... 14
2.12
BAC-Screening und Verifizierung ............................................................... 15
2.13
Semi-quantitative RT-PCR ......................................................................... 15
2.14
Quantitative Real-time PCR ....................................................................... 16
2.14.1 Absolute Quantifizierung bei humanen Templates ................................. 16
2.14.2 Absolute Quantifizierung bei caninen Templates .................................... 18
2.14.3 Relative Quantifizierung.......................................................................... 18
2.15
Herstellung rekombinanter HMGB1-Proteine in Bakterien ......................... 19
2.16
SDS-PAGE ................................................................................................. 20
2.17
Statistische Auswertung ............................................................................. 20
3
Ergebnisse.................................................................................................... 21
3.1
Mapping und Charakterisierung ausgewählter HMG-Gene beim Modelltier
Hund........................................................................................................... 21
3.1.1 Mapping und Charakterisierung des caninen HMGA1-Gens .................. 21
3.1.2 Mapping und Charakterisierung des caninen HMGB1-Gens .................. 23
3.2
Quantitative Expressionsanalysen von HMGA2 und HMGB1 beim
Menschen bzw. Hund ................................................................................. 24
3.2.1 Quantitative Expressionsanalyse des HMGA2-Gens im Tumor und
korrespondierenden tumorfreien Lungengewebe von NSCLC-Patienten 24
3.2.2 Quantitative Expressionsanalyse des HMGA2-Gens in Prostatageweben
des Hundes............................................................................................. 25
3.2.3 Quantitative Expressionsanalyse des HMGA2-Gens im Blut von
Mammakarzinompatientinnen ................................................................. 26
3.2.4 Quantitative Expressionsanalyse des HMGA2-Gens im Blut von Patienten
mit unterschiedlichen Diagnosen ............................................................ 27
3.2.5 Quantitative Expressionsanalyse des HMGA2-Gens im Blut von Patienten
mit Erkrankungen des hämatopoetischen und lymphatischen Systems im
Vergleich zu gesunden Probanden ......................................................... 28
3.2.6 Semi-quantitative Expressionsanalyse des HMGB1-Gens in Sarkomen
des Hundes............................................................................................. 30
3.3
Untersuchung zur Funktion des HMGB1-Proteins...................................... 32
3.3.1 Untersuchung zur angiogenen Wirkung des HMGB1-Proteins ............... 32
4
Diskussion.................................................................................................... 33
5
Zusammenfassung ...................................................................................... 47
6
Summary....................................................................................................... 49
7
Literatur ........................................................................................................ 51
8
Danksagung ................................................................................................. 67
9
Publikationsübersicht.................................................................................. 68
10
Anhang.........................................................................................................154
10.1
Tabellen.....................................................................................................154
10.2
Abbildungen ..............................................................................................161
Abkürzungsverzeichnis
°C
A
AC
AGE
AK
ALL
AML
APL
AS
BAC
BCR
bFGF
Bp
C
c-ABL
CCND1
CD
CDK
cDNA
CDS
CFA
CLL
CML
Da
dCTP
DNA
DNase
dNTP
DTT
EDTA
ER
EtOH
FAB
FACS
FAM
FISH
FFPE
g
G
Grad Celsius
Adenin
Adenocarcinoma
Advanced glycation end products
Antikörper
Akute lymphatische Leukämie
Akute myeloische Leukämie
Akute Promyelozyten Leukämie
Aminosäure
Bacterial artificial chromosome
Breakpoint cluster region
Basic fibroblast growth factor
Basenpaare
Cytosin
v-abl Abelson murine leukemia viral oncogene homolog
Cyclin D1
Cluster of differentiation
Cyclin-abhängige Kinasen
Copy DNA
Codierende Sequenz
Canis familiaris
Chronische lymphatische Leukämie
Chronische myeloische Leukämie
Dalton
Desoxycytidintriphosphat
Desoxyribonukleinsäure
Desoxyribonuklease
Desoxynukleosidtriphosphat
Dithiothreitol
Ethylendiamintetraessigsäure
Östrogenrezeptorstatus
Ethanol
French American British, Klassifizierung der AML
Fluorescence activated cell sorting
6-Carboxyfluorescein-aminohexyl Amidit
Fluoreszenz in situ Hybridisierung
Formalin-fixiert in Paraffin eingebettet
Gravitationsbeschleunigung
Guanin
GAPDH
GST
h
HCl
HFPE
HMG
HMGA
HMGA1a
HMGA1b
HMGB
HMGN
HOPE
HSA
Hz
IL-1β
IHC
IPTG
J
JNK
Kb
KCl
kDa
KRAS
l
LB
LPS
M
MAP
MDS
µg, µl, µm, µM
mg, ml, mm, mM
MGB
MgCl2
MgSO4
min
M-MLV
MOPS
mRNA
NaCl
NaOH
NCBI
Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase
Glutathion S-Transferase
Stunde
Salzsäure
HOPE-fixiert in Paraffin eingebettet
High Mobility Group
High Mobility Group Protein A
High Mobility Group Protein A Isoform a
High Mobility Group Protein A Isoform b
High Mobility Group Protein B
High Mobility Group Protein N
Hepes-glutamic acid buffer mediated organic solvent protection
effect
Homo sapiens
Hertz
Interleukin-1β
Immunhistochemie
Isopropyl-Thio-β-D-Galactopyranosid
Joule
c-Jun N-terminale Kinase
Kilobasenpaare
Kaliumchlorid
Kilodalton
Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog
Liter
Luria Bertani
Lipopolysaccharid
Molar
Mitogen-activated protein
Myelodysplastisches Syndrom
Mikrogramm, -liter, -meter, -molar
Milligramm, -liter, -meter, -molar
Minor groove binder
Magnesiumchlorid
Magnesiumsulfat
Minute
Moloney Murine Leukemia Virus
3-[N-Morpholino]propansulfonsäure
Messenger Ribonukleinsäure
Natriumchlorid
Natriumhydroxid
National Center for Biotechnology Information
ng, nm, nM
NRAS
NSCLC
OD
ORF
PAC
PAGE
PCR
PBS
PMSF
PR
qRT-PCR
RAGE
RB
RISH
RNA
RNase
RNAi
rRNA
RT
RT-PCR
SCC
SDS
sec
sRAGE
SSC
ssDNA
T
TAE
TAMRA
TNF-α
TNM
TP53
U
UNG
UTR
UV
v
V
VEGF
w
Nanogramm, -meter, molar
Neuroblastoma RAS viral (v-ras) oncogene homolog
Non-small cell lung cancer
Optische Dichte
Offenes Leseraster
P1-derived artificial chromosome
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Polymerase-Kettenreaktion
Phosphate buffered saline
Phenylmethansulfonylfluorid
Progesteronrezeptorstatus
Quantitative Real-time RT-PCR
Receptor for advanced glycation end products
Retinoblastoma
RNA in situ Hybridisierung
Ribonukleinsäure
Ribonuklease
RNA-Interferenz
Ribosomale Ribonukleinsäure
Raumtemperatur
Reverse Transkriptase-PCR
Squamous cell carcinoma
Natriumdodecylsulfat
Sekunde
Soluble RAGE
Standard Saline Citrat
Single stranded DNA
Thymin
Tris-Acetat EDTA
6-Carboxy-tetramethyl-rhodamin
Tumornekrosefaktor α
Tumorklassifikation (T - Tumor, N - Nodus, M - Metastasen)
Tumorsuppressorprotein p53
Unit
Uracil-N-Glykosylase
Untranslatierte Region
Ultraviolett
Volumen
Volt
Vascular endothelial growth factor
Gewicht
Einleitung
1
1
Einleitung
In der Krebsbehandlung besteht ein großes Interesse an molekularen Biomarkern,
welche in Ergänzung der histopathologischen Standardmethoden die Diagnose,
Prognosestellung und Therapieplanung bei malignen Erkrankungen verbessern
könnten (Bast et al., 2005; Basil et al., 2006).
Als potentielle Tumormarker werden seit längerem die High Mobility Group (HMG)Proteine diskutiert, insbesondere HMGA1, HMGA2 sowie HMGB1. In einer Vielzahl
von Tumoren konnte eine Überexpression der HMGA-Proteine mit einem
aggressiveren Phänotyp korreliert werden (Tamimi et al., 1993; Chiappetta et al.,
1998; Abe et al., 2003a; Balcerczak et al., 2003; Flohr et al., 2003; Miyazawa et al.,
2004). Für die HMGB1-Proteine wurde ebenfalls eine Überexpression in einer Reihe
von Tumoren verglichen mit dem korrespondierenden Normalgewebe beschrieben.
HMGB1 scheint bei der Invasion und Metastasierung der Tumoren eine wichtige
Rolle zu spielen (Xiang et al., 1997; Taguchi et al., 2000; Brezniceanu et al., 2003).
Zu Beginn dieser Arbeit im Jahre 2002 basierten Angaben zur Höhe der HMGExpression bei malignen Neoplasien zumeist auf Untersuchungen mittels semiquantitativer RT-PCR oder auf Northern Blot-Analysen. Eine echte quantitative
Expressionsanalyse wurde erst mit Einführung der quantitativen Real-time RT-PCR
(qRT-PCR) möglich. Die qRT-PCR ist durch Einsatz einer fluoreszenzmarkierten
Sonde sehr spezifisch und sensitiv, so dass auch seltene Transkripte verlässlich
quantifiziert und falsch negative Ergebnisse vermieden werden können.
Thema der vorliegenden Arbeit ist die quantitative Analyse der HMGA- und HMGBExpression in verschiedenen malignen Neoplasien des Menschen sowie des
Modelltieres Hund im Vergleich zu entsprechenden nicht-neoplastischen Geweben
und Zellen. Ziel ist es, über Expressionsanalysen u.a. mit Hilfe der qRT-PCR die
Bedeutung einer Reaktivierung der HMG-Gene für die Entstehung und Progression
von Tumoren zu untersuchen.
HMG-Proteine sind kleine Chromatin-assoziierte Nicht-Histon-Proteine, welche
ursprünglich über ihre gemeinsamen physikochemischen Eigenschaften definiert
wurden. So lassen sich die Proteine mit 0,35 M NaCl aus Chromatin extrahieren, sind
löslich in 2% Trichloressigsäure bzw. 5% Perchlorsäure und besitzen einen hohen
Anteil an basischen und sauren Aminosäuren. Der Name leitet sich aus ihrer hohen
Einleitung
2
Mobilität im sauren Harnstoff-Polyacrylamidgel ab (Goodwin et al., 1973; Johns,
1982). Sämtliche Proteine der HMG-Familie gehören zu den „architektonischen
Transkriptionsfaktoren“ (Grosschedl et al., 1994). Sie können allein keine Transkription auslösen, sondern ermöglichen durch Änderung der DNA-Konformation
definierte Protein-DNA- sowie Protein-Protein-Wechselwirkungen und regulieren
somit die Expression einer Vielzahl von Zielgenen (Bustin et al., 1996). Gemäß ihrer
charakteristischen
funktionellen
Domänen
erfolgte
eine
Einteilung
in
drei
Proteinfamilien: HMGA, HMGB und HMGN (Bustin et al., 1996; Bustin, 2001). Die
Proteine der HMGA-Familie binden über drei so genannte AT-Hooks mit hoher
Affinität an AT-reiche Sequenzen in der kleinen Furche der DNA (Solomon et al.,
1986; Reeves et al., 1990). Die HMGB-Proteine besitzen zwei HMG-Box-Domänen,
mit denen sie sequenzunspezifisch ebenfalls an die kleine Furche der DNA binden
(Bianchi et al., 1992), während sich die HMGN-Proteine über eine Nukleosomenbindende Domäne an nukleosomale DNA anlagern (Crippa et al., 1992). Auch
aufgrund dieser unterschiedlichen funktionellen Motive induziert jede der drei HMGFamilien spezifische Änderungen der DNA-Struktur und besitzt individuelle zelluläre
Funktionen (Bustin, 1999).
Zur Familie der HMGA-Gene gehören HMGA1 und HMGA2. Das HMGA1-Gen ist in
der chromosomalen Region 6p21 lokalisiert und codiert für die Proteine HMGA1a,
HMGA1b und HMGA1c, welche Produkte dreier Splicevarianten des HMGA1-Gens
sind (Johnson et al., 1989; Friedmann et al., 1993; Nagpal et al., 1999). Das HMGA2Gen, welches in der chromosomalen Region 12q14-15 lokalisiert ist (Chau et al.,
1995; Schoenmakers et al., 1995), hat mindestens zwei Splicevarianten HMGA2a
und HMGA2b (Hauke et al., 2002). Neben den drei stark konservierten DNAbindenden AT-Hooks besitzen die HMGA-Proteine eine saure C-terminale Domäne
(Friedmann et al., 1993; Chau et al., 1995). Über die gesamte Länge der HMGAProteine wurden posttranslationale Modifikationen, wie Phosphorylierung, Acetylierung, Methylierung und Poly(ADP)-Ribosylierung, identifiziert, welche sowohl die
Bindungseigenschaften der Proteine als auch ihre biologische Aktivität beeinflussen
können (Elton et al., 1986; Nissen et al., 1991; Sgarra et al., 2003). Durch die
Anlagerung von HMGA-Proteinen werden Änderungen der DNA-Struktur, wie z.B.
Krümmung, Streckung, Entwindung und Supercoils induziert (Lehn et al., 1988; Falvo
et al., 1995; Chase et al., 1999; Bagga et al., 2000; Slama-Schwok et al., 2000).
Einleitung
3
Diese Konformationsänderungen der DNA sowie Protein-Protein-Wechselwirkungen
von HMGA-Proteinen mit anderen Transkriptionsfaktoren beeinflussen die Bildung
stereospezifischer Enhanceosomen an Promotoren einer Reihe von Genen, wodurch
deren Expression positiv so wie auch negativ reguliert werden kann (Thanos et al.,
1995; Klein-Hessling et al., 1996; Zentner et al., 2001). Erst kürzlich wurde gezeigt,
dass Hmga1-„knockout“-Mäuse unter Hypertrophie des Herzens und malignen
Erkrankungen des hämatologischen und lymphatischen Systems leiden (Fedele et
al., 2006). Die homozygote Deletion des Hmga2-Gens führt bei Mäusen zu einem
stark verminderten Wachstum („pygmy“-Phänotyp) (Zhou et al., 1995), während
transgene Mäuse, die eine trunkierte Variante des HMGA2-Gens exprimieren, einen
abnorm großen „giant“-Phänotyp mit vorwiegend abdominaler Lipomatose zeigen
(Battista et al., 1999). Einen ähnlichen Phänotyp mit übersteigertem Wachstum weist
auch
ein
zum
Zeitpunkt
der
Untersuchung
8-jähriger
Junge
mit
einer
Keimbahnmutation im HMGA2-Gen auf, was die Bedeutung von HMGA2 für
Wachstum und Entwicklung unterstreicht (Ligon et al., 2005).
Die Expression der HMGA-Proteine ist maximal während der Embryonalentwicklung
und in stark proliferierenden Zellen, während sie in voll differenzierten adulten Zellen
und Geweben kaum nachweisbar ist (Chiappetta et al., 1996; Rogalla et al., 1996;
Hirning-Folz et al., 1998; Gattas et al., 1999). In einer Reihe von Neoplasien konnte
jedoch eine Reexpression der HMGA-Gene detektiert werden. In benignen, zumeist
mesenchymalen, Tumoren, wie z.B. Lipomen, Uterus-Leiomyomen, pleomorphen
Adenomen der Kopfspeicheldrüse und in chondroiden Hamartomen der Lunge, ist
die transkriptionelle Reaktivierung wahrscheinlich auf chromosomale Translokationen
zurückzuführen (Schoenmakers et al., 1995; Kazmierczak et al., 1996; Hennig et al.,
1997; Williams et al., 1997; Gattas et al., 1999; Kazmierczak et al., 1999; Sornberger
et al., 1999). Bei malignen Tumoren scheinen genregulatorische Mechanismen bei
der Reaktivierung der HMGA-Expression eine wichtige Rolle zu spielen. Eine
Expression von HMGA1-Proteinen oder der korrespondierenden mRNA wurde in
einer Vielzahl von Karzinomen detektiert, wie z.B. beim kolorektalen Karzinom
(Fedele et al., 1996; Abe et al., 1999; Kim et al., 1999; Chiappetta et al., 2001;
Balcerczak et al., 2003), Prostatakarzinom (Bussemakers et al., 1991; Tamimi et al.,
1993), Schilddrüsenkarzinom (Chiappetta et al., 1995; Chiappetta et al., 1998),
Mammakarzinom (Liu et al., 1999; Flohr et al., 2003; Chiappetta et al., 2004),
Ovarialkarzinom (Masciullo et al., 2003) und Zervixkarzinom (Bandiera et al., 1998).
Einleitung
4
Weniger Studien sind über die Expression des HMGA2-Gens bei malignen Tumoren
durchgeführt worden. Zu den malignen Tumoren, bei denen eine Überexpression von
HMGA2 detektiert wurde, gehören das Plattenepithelkarzinom der Mundhöhle
(Miyazawa et al., 2004), das Mammakarzinom (Rogalla et al., 1997), das
Pankreaskarzinom (Abe et al., 2003b) und das nicht-kleinzellige Bronchialkarzinom
(Rogalla et al., 1998). Zudem wurde eine Expression im Blut von AML- bzw. CMLPatienten (Rommel et al., 1997) und bei Patientinnen mit metastasiertem
Mammakarzinom festgestellt (Sezer et al., 2000; Langelotz et al., 2003).
Die HMGA-Expression korreliert in einer Reihe von Tumoren mit dem Grad ihrer
Malignität bzw. der Metastasierungsneigung und wird deswegen als diagnostischer
bzw. prognostischer Marker diskutiert (Bussemakers et al., 1991; Tamimi et al., 1993;
Bandiera et al., 1998; Chiappetta et al., 1998; Abe et al., 1999; Abe et al., 2003a;
Balcerczak et al., 2003; Flohr et al., 2003; Chiappetta et al., 2004; Miyazawa et al.,
2004). Hinweise auf eine direkte Beteiligung der HMGA-Proteine bei der
Tumorgenese wurden durch die Inhibition der HMGA2-Synthese mittels AntisenseVektoren erbracht, was die neoplastische Transformation durch Retroviren in
Schilddrüsenzellen der Ratte verhindert (Berlingieri et al., 1995). Zudem konnte
durch eine erhöhte HMGA-Expression in verschiedenen Zelllinien ein transformierter
Phänotyp induziert werden (Wood et al., 2000a; Wood et al., 2000b; Reeves et al.,
2001; Treff et al., 2004). Die Induktion der Hmga-Expression in transgenen Mäusen
führt zur Entwicklung von verschiedenen Tumoren, was die wichtige Rolle der
HMGA-Proteine bei der Entstehung von Tumoren in vivo verdeutlicht (Fedele et al.,
2002; Xu et al., 2004; Fedele et al., 2005; Zaidi et al., 2006).
Die Familie der HMGB-Proteine umfasst HMGB1, HMGB2 und HMGB3, wovon
HMGB1, auch Amphoterin genannt, das am besten untersuchte Protein ist. Das
humane HMGB1-Gen ist auf Chromosom 13q12-13 lokalisiert (Ferrari et al., 1996)
und codiert für ein 215 AS langes Protein (Wen et al., 1989). Das hochkonservierte
HMGB1-Protein besitzt zwei DNA-bindende Domänen HMG Box A und HMG Box B
mit überwiegend basischen AS (Reeck et al., 1982; Bianchi et al., 1992) sowie einen
sauren C-Terminus, der an Wechselwirkungen mit anderen Proteinen, z.B. Histonen,
beteiligt ist (Stros et al., 1990) und die DNA-Bindungsaffinität von HMGB1 reguliert
(Stros et al., 1994). Während HMGB1 mit hoher Affinität an spezielle DNAStrukturen, wie z.B. „Four-way junction DNA“ (Bianchi et al., 1989; Webb et al., 1999)
Einleitung
5
und Cisplatin-DNA-Addukte bindet (Pil et al., 1992), ist die sequenzunspezifische
Bindung von HMGB1 an die kleine Furche linearer DNA eher schwach. Die
Rekrutierung von HMGB1-Proteinen zu bestimmten DNA-Sequenzen erfolgt über
Protein-Protein Wechselwirkungen mit anderen nukleären Proteinen (Agresti et al.,
2003). Die Anlagerung von HMGB1 an die DNA bewirkt eine starke Krümmung der
DNA (Pil et al., 1993), was die Bildung von Multiproteinkomplexen ermöglicht. Durch
die Interaktion mit HMGB1 wird die Aktivität einer Reihe von Transkriptionsfaktoren
reguliert, wie z.B. des TATA-binding-protein (TBP), p53, NF-κB, verschiedener
Steroidhormonrezeptoren und HOX-Proteine (Agresti et al., 2003). Hmgb1„Knockout“-Mäuse sterben kurz nach ihrer Geburt aufgrund einer unzureichenden
Transkription des Glucocorticoid-Rezeptor-Gens an Hypoglykämie, was die wichtige
Rolle von HMGB1 bei der Genregulation verdeutlicht (Calogero et al., 1999). HMGB1
wird in fast allen Zelltypen exprimiert, die Expression in Geweben von gesunden
Probanden variiert jedoch je nach Differenzierungsgrad und Alter (Muller et al.,
2004). Hohe nukleäre HMGB1 Level findet man in wenig differenzierten Zellen,
während die Expression in ausdifferenzierten Zellen oft deutlich herunterreguliert ist
(Seyedin et al., 1981; Mosevitsky et al., 1989; Begum et al., 1990). HMGB1 wird in
transformierten Zelllinien stark exprimiert (Parkkinen et al., 1993) und in den meisten
malignen Neoplasien wurde eine Überexpression verglichen mit den entsprechenden
Normalgeweben gefunden, so z.B. beim Leberzellkarzinom (Kawahara et al., 1996),
beim Magen- und kolorektalen Adenokarzinom (Xiang et al., 1997), beim
Mammakarzinom (Brezniceanu et al., 2003) und in leukämischen Zellen (Cabart et
al., 1995).
Neben der Rolle als architektonischer Transkriptionsfaktor im Zellkern hat HMGB1
auch extrazelluläre Funktionen (Muller et al., 2001). Bei Entzündungen oder
Verletzungen kann HMGB1 sowohl passiv freigesetzt als auch aktiv sezerniert
werden. Eine passive Freisetzung erfolgt bei Zelltod durch Nekrose, jedoch nicht
nach Apoptose, und führt zur Einleitung von Entzündungsprozessen (Scaffidi et al.,
2002).
Außerdem
wird
die
Migration
u.a.
von
glatten
Muskelzellen
und
Mesoangioblasten und damit die Geweberegeneration angeregt (Degryse et al.,
2001; Palumbo et al., 2004). Zum anderen wird HMGB1 durch aktivierte Monozyten
und Makrophagen als Antwort auf verschiedene Endotoxine oder Zytokine, wie z.B.
LPS, TNF-α oder IL-1β, aktiv sezerniert und bewirkt als Zytokin-ähnlicher Faktor die
Freisetzung weiterer Zytokine (Wang et al., 1999a; Andersson et al., 2000). Darüber
Einleitung
6
hinaus fungiert HMGB1 als Ligand von RAGE (Rezeptor for advanced glycation end
products) (Hori et al., 1995). Durch Bindung von HMGB1 an RAGE werden die MAPKinasen p38, SAP/JNK und p44/p42 aktiviert, welche bei der Wachstumsregulierung
von Zellen eine wichtige Rolle spielen. Es konnte gezeigt werden, dass eine
Blockade der HMGB1-RAGE-Signalkaskaden das Wachstum und die Metastasierung
von implantierten und spontan auftretenden Tumoren erheblich verringert (Taguchi et
al., 2000).
Im Rahmen dieser Promotionsarbeit sollte erstmals die HMG-Expression in größeren
Serien maligner Neoplasien bzw. im Blut von Patienten mit malignen und anderen
Erkrankungen quantitativ untersucht werden.
Lungenkrebs stellt die häufigste krebsbedingte Todesursache dar. Da die Tumoren
meist erst in fortgeschrittenem Stadium diagnostiziert werden, ist die Prognose mit
einer 5-Jahres-Überlebensrate von unter 10% (Europa) sehr schlecht (Parkin et al.,
2005). Lungenkarzinome entwickeln sich aus prämalignen Läsionen, die an
verschiedenen Stellen innerhalb des bronchoalveolären Epithels entstehen können
(Saccomanno et al., 1974). Dieser Feldkanzerisierungs-Prozess (Strong et al., 1984)
ist
auf
eine
wiederholte
Exposition
der
Lunge
gegenüber
Karzinogenen,
hauptsächlich verursacht durch Tabakkonsum, zurückzuführen (Parkin et al., 1994).
Lungenkrebs wird in zwei Hauptgruppen unterteilt, das kleinzellige Bronchialkarzinom
(SCLC) und das nicht-kleinzellige Bronchialkarzinom (NSCLC). Die häufigsten
Formen
des
NSCLC
stellen
das
Plattenepithelkarzinom
(SCC)
und
das
Adenokarzinom (AC) dar. Bisher detektierte genetische Veränderungen bei
Lungenkrebs treten jeweils nur bei einer begrenzten Zahl von Fällen auf, so dass
weiterhin nach molekularen Markern für die Früherkennung und die Entwicklung
neuer Therapieansätze gesucht wird (Kettunen et al., 2004).
Da das HMGA2-Protein als ein solches Target bei NSCLC diskutiert wird, sollten im
Rahmen dieser Arbeit korrespondierende Tumor- und Nicht-Tumorgewebe von ACund SCC-Patienten erstmals quantitativ mittels qRT-PCR hinsichtlich ihrer HMGA2Expression untersucht werden. Zusätzlich zu den quantitativen Untersuchungen an
Frischgewebe sollte die HMGA2-Expression mittels Immunhistochemie (IHC) an
HOPE-fixierten, in Paraffin eingebetteten (HFPE) Gewebeschnitten nachgewiesen
werden.
Einleitung
7
In vorangegangenen Untersuchungen wurde eine HMGA2-Reexpression auch im
peripheren Blut von Leukämie- und Tumorpatienten detektiert (Rommel et al., 1997;
Sezer et al., 2000; Langelotz et al., 2003). Zu Beginn dieser Arbeit lagen jedoch
ausschließlich Ergebnisse qualitativer Analysen der HMGA2-Expression mittels
konventioneller RT-PCR im peripheren Blut vor. Im Rahmen dieser Arbeit sollte der
Einfluss diverser Erkrankungen auf die HMGA2-Expression im Blut erstmalig mittels
quantitativer Real-time RT-PCR untersucht werden. Zum einen erfolgten quantitative
Genexpressionsanalysen am Blut eines Kollektivs von Mammakarzinompatientinnen
vor und während der Therapie, um Auswirkungen der Behandlung auf die HMGA2Expression zu testen. Zum anderen wurde die HMGA2-Expression im Blut von
Patienten
mit
verschiedenen
hämatopoetischen
bzw.
Tumoren,
lymphatischen
mit
malignen
Systems,
sowie
Erkrankungen
mit
des
verschiedenen
Autoimmunerkrankungen quantitativ bestimmt. Die Expressionsdaten wurden mit
denen gesunder Spender verglichen. Aufbauend auf diesen Ergebnissen sollte im
Folgenden die HMGA2-Expression im peripheren Blut eines umfassenderen
Kollektivs
von
Patienten
mit
Leukämien
und
anderen
Erkrankungen
des
hämatopoetischen und lymphatischen Systems quantitativ untersucht werden.
Neben Untersuchungen zur Expression des HMGA2-Gens wurden im Rahmen
dieser Arbeit zudem Analysen zur Expression und Funktion von HMGB1
durchgeführt. Erstmals sollte die HMGB1-Expression in caninen Osteosarkomen
untersucht
werden.
Canine
Osteosarkome
sind
maligne,
sehr
aggressive
Knochentumoren, die ebenso wie humane Osteosarkome standardmäßig mit
Cisplatin behandelt werden (MacEwen, 1990; Vail et al., 2002). Da HMGB1 durch
Bindung an Cisplatin-DNA-Addukte die Reparatur der DNA durch „nucleotide
excision repair“-Mechanismen behindert und damit die antitumorale Wirkung des
Zytostatikums Cisplatin verstärkt (Zamble et al., 1996; He et al., 2000), sollte die
intertumorale Varianz der HMGB1-Expression mittels Northern Blot-Analyse
untersucht werden. Die Entwicklung einer semi-quantitativen RT-PCR sollte zeigen,
ob diese Methode eine kosten- und zeitsparende Alternative zum Blot bietet. Darüber
hinaus sollte die Funktion des humanen HMGB1-Proteins als angiogener Faktor im in
vitro-Modell untersucht werden.
Einleitung
8
Als Basis für Untersuchungen am Modelltier Hund sollten im Rahmen dieser Arbeit
die caninen HMGA-Gene sowie das canine HMGB1-Gen auf dem Hundegenom
gemappt und ihre Struktur und cDNA-Sequenz aufgeklärt werden. Für HMGA1 und
HMGB1 sollten basale Expressionsmuster mittels Northern Blot-Analysen bestimmt
werden. Zudem sollten quantitative Analysen der HMGA2-Expression mittels qRTPCR bei caninen Prostatageweben verschiedener Histologien zeigen, ob ein
Zusammenhang zwischen Höhe der HMGA2-Expression und Aggressivität der
Tumoren besteht.
Material und Methoden
2
Material und Methoden
2.1
Gewebeproben
9
Die humanen Tumorproben und korrespondierenden tumorfreien Gewebeproben der
Patienten mit nicht-kleinzelligem Bronchialkarzinom (NSCLC) stammen aus der
Klinischen und Experimentellen Pathologie des Forschungszentrums Borstel.
Die verwendeten Gewebeproben des Hundes wurden von der Klinik für kleine
Haustiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover zur Verfügung gestellt.
2.2
Blutproben
36 Blutproben von Patienten mit unterschiedlichen Diagnosen und 46 Proben von
Patienten mit Erkrankungen des hämatopoetischen und lymphatischen Systems für
die HMGA2-Genexpressionsanalysen wurden von D. Krisponeit des Zentrums für
Innere Medizin, Hämatologie und Onkologie, Klinikum Bremen-Mitte entnommen und
bereitgestellt. Sieben weitere Blutproben von CML-Patienten stammen von C.
Junghanß, Abteilung Hämatologie und Onkologie, Klinik für Innere Medizin der
Universität Rostock.
Das Patientenmaterial für die vergleichenden Expressionsanalysen vor und während
der Therapie im Blut von 22 Mammakarzinompatienten wurde von C.-O. Schulz,
Innere Klinik mit Schwerpunkt Onkologie und Hämatologie der Charité Campus Mitte
in Berlin zur Verfügung gestellt.
Die mittels FACS aufgereinigten mononukleären CD33+/CD34+ Zellen aus
peripherem Blut bzw. Knochenmark von insgesamt fünf Leukämiepatienten wurden
von der Arbeitsgruppe Tumorimmunologie und Experimentelle Stammzelltransplantation, Abteilung Hämatologie und Onkologie, Klinik für Innere Medizin, Medizinische
Fakultät der Universität Rostock zur Verfügung gestellt.
2.3
Zelllinien
Die verwendeten caninen Zelllinien ZMTH3 und MTH52 wurden im Zentrum für
Humangenetik der Universität Bremen etabliert. ZMTH3 leitet sich von einem
Pleomorphen Adenom der Mamma und MTH52 von einem malignen kleinzelligen
Tumor der Mamma ab.
Material und Methoden
10
Die Leukämiezelllinien NB4 (akute Promyelozyten Leukämie, APL) und HL-60 (akute
myeloische Leukämie, AML) wurden von der Arbeitsgruppe Tumorimmunologie und
Experimentelle Stammzelltransplantation, Abteilung Hämatologie und Onkologie,
Klinik für Innere Medizin, Medizinische Fakultät der Universität Rostock zur
Verfügung gestellt.
2.4
DNA-Isolierung
2.4.1
Isolierung genomischer DNA aus Zellkultur
Zur Isolierung genomischer DNA aus Zellkultur wurde das QIAamp DNA Mini Kit
(Qiagen, Hilden) gemäß den Angaben des Herstellers im „Protocol for cultures cells“
verwendet.
2.4.2
Plasmid DNA-Isolierung
Die Isolierung von Plasmid DNA erfolgte mit Hilfe des QIAprep Spin Miniprep Kit
(Qiagen) gemäß den Angaben des Herstellers. Zur Plasmid-Isolierung wurden
standardmäßig 10 ml Übernacht-Kulturen in selektivem LB-Medium verwendet.
2.4.3
BAC DNA-Isolierung
BAC DNA wurde mittels QIAGEN Plasmid Maxi Kit (Qiagen) nach Angaben des
Herstellers im „Very Low-Copy Plasmid/Cosmid Purification“-Protokoll isoliert.
Ausgangsmaterial waren entsprechende 5 ml LB-Kulturen, mit denen nach 8 h
Wachstum 250 ml Übernacht-Kulturen mit selektivem LB-Medium angeimpft wurden.
2.4.4
Quantifizierung von DNA im Photometer
Zur Quantifizierung von DNA wurden 2-5 µl DNA-Lösung mit 60 µl Bidest in einer
Küvette gemischt und im BioPhotometer (Eppendorf, Hamburg) bei 260 nm
gemessen.
2.5
RNA-Isolierung
2.5.1
RNA-Isolierung aus Frischgewebe und Zellen
Die RNA-Isolierung aus Gewebe, mononukleären Zellen und Zellkulturen erfolgte im
Allgemeinen mit Hilfe des RNeasy Mini Kits (Qiagen) gemäß den Angaben des
Material und Methoden
11
Herstellers. Die Zerkleinerung des Gewebes wurde in Puffer RLT mittels Skalpell
durchgeführt und die Homogenisierung des Lysats durch Zentrifugation in
QIAshredder-Säulen (Qiagen) erreicht. Alternativ wurde die Aufschließung und
Homogenisierung der Proben mit Hilfe des TissueLysers durch Schütteln für 2 x 3
min bei 25 Hz unter Verwendung von 5 mm Stahlkügelchen ausgeführt. Bei proteinreichem Gewebe wurde das RNeasy Mini Protokoll für die Isolierung aus Herz,
Muskel und Haut-Gewebe verwendet, welches sowohl einen Proteinase K-Verdau
als auch einen DNase I-Verdau umfasst.
Die für den Northern Blot benötigten RNA-Mengen wurden aus bis zu 250 mg
Gewebe mittels RNeasy Midi Kit (Qiagen) gemäß dem RNeasy Midi Protokoll für die
Isolierung aus Herz, Muskel und Haut-Gewebe isoliert, welches einen Proteinase KVerdau beinhaltet. Dazu wurden die Gewebeproben in 2 ml RLT-Puffer
aufgenommen und mit dem Homogenisator Ultra-Turax (IKA-Werke, Staufen)
zerkleinert und homogenisiert. Die weitere Durchführung erfolgte gemäß den
Herstellerangaben.
2.5.2
RNA-Isolierung aus Blut (PAXgene)
Die Abnahme von je 2,5 ml Vollblut erfolgte direkt in die mit einer RNAStabilisierungslösung gefüllten PAXgene Röhrchen der Firma PreAnalytiX (Qiagen).
Die Lagerung der gefüllten Röhrchen erfolgte entweder bei 4°C für bis zu 7 Tage
oder
bei
-20°C.
Die
Isolierung
der
Gesamt-RNA
wurde
gemäß
den
Herstellerangaben durchgeführt. Um eine komplette mechanische Zerstörung der
genomischen DNA zu gewährleisten, wurde das Lysat nach dem Proteinase KVerdau mittels QIAshredder-Säule (Qiagen) homogenisiert. Des Weiteren wurde ein
DNase I-Verdau auf der Säule durchgeführt, um DNA-Kontaminationen der RNA zu
minimieren. Das Eluat wurde abweichend vom Protokoll ohne Denaturierung sofort
quantifiziert und bei -80°C gelagert.
2.5.3
RNA-Isolierung aus Blut (ROCHE)
Je 5 ml Vollblut wurden im Verhältnis 1:10 mit „RNA/DNA Stabilization Reagent for
Blood/Bone Marrow“ (Roche Diagnostics, Mannheim) versetzt und bei -20°C
gelagert. Die Isolierung von Gesamt-RNA aus 25 ml des Lysats (enthält 2,5 ml Blut)
erfolgte mit Hilfe des High Pure RNA Isolation Kit (Roche Diagnostics) nach Angaben
Material und Methoden
12
des Herstellers, wobei das Lysat in mehreren Schritten auf jeweils zwei Säulen
aufgetragen wurde.
2.5.4
mRNA-Anreicherung
Die Anreicherung von poly A+ mRNA aus Gesamt-RNA erfolgte mittels Oligotex
mRNA Kit (Qiagen) gemäß den Herstellerangaben.
2.5.5
Quantifizierung von RNA im Photometer
Zur Quantifizierung der isolierten RNA wurden in einer Küvette 60 µl 10 mM Tris-HCl
(pH 8,0) mit 3 µl der RNA gemischt und bei 260 nm die Absorbanz mit dem
BioPhotometer (Eppendorf) bestimmt. Da für die absolute Quantifizierung über RealTime PCR eine genaue Konzentrationsbestimmung maßgeblich ist, erfolgten die
entsprechenden Messungen in Triplikat. Gegebenenfalls wurden Verdünnungen der
RNA mit RNase-freiem Wasser hergestellt, um eine Konzentration von ca. 100 – 125
ng/µl RNA zu erreichen, so dass bei der Verwendung von 250 ng RNA mindestens
2 µl der RNA in die cDNA-Synthese eingesetzt werden konnten.
2.6
Northern Blot
Die Northern Blot-Analyse erfolgte nach einem modifizierten Hybond XL Protokoll
(Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK). Es wurden je 5 µg mRNA in einem
denaturierenden 1,2% (w/v) Agarosegel mit 0,67% (v/v) Formaldehyd in 1x MOPS
Puffer bei 80 V ca. 3 h aufgetrennt. Anschließend erfolgte eine Inkubation für 20 min
in 50 mM NaOH, gefolgt von zwei Inkubationen für je 15 min in 1,5 M NaCl/0,5 M
Tris-HCl (pH 7,5) und zwei weiteren Inkubationsschritten für je 15 min in 10x SSC
(pH 7,0). Die RNA wurde mittels Kapillarblot über Nacht mit 10x SSC auf eine
geladene Hybond-XL Membran (Amersham Biosciences) übertragen. Eine kovalente
Bindung der RNA wurde mit Hilfe des Crosslinking unter UV-Licht (0,4 J/cm2)
erreicht.
Die Markierung der wie unter Punkt 2.11 beschrieben hergestellten cDNA-Sonden
mit dem Radionuklid [α-32P]dCTP mit Hilfe des Megaprime DNA labelling system
(Amersham Biosciences) und die Hybridisierung des Blots wurden im Zentrum für
Humangenetik von H. Murua Escobar und A. M. Flohr durchgeführt.
Material und Methoden
13
Für die Auswertung des Northern Blots wurden die Signale mit dem Storm
PhosphorImager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, USA) detektiert und mit dem
Computerprogramm „ImageQuant“ (Molecular Dynamics) quantifiziert.
2.7
cDNA-Erststrangsynthese
cDNA-Erststrangsythesen wurden im Allgemeinen mit 2,5 µM Poly-(A)-AdapterPrimer AP2 (5’ AAGGATCCGTCGACATCT(17) 3’), 0,5 mM der vier dNTPs, 0,01 M
1,4-Dithiotreitol und 1x Erststrangpuffer (50 mM Tris-HCl, 75 mM KCl, 3 mM MgCl2,
pH 8.3) an 5 µg Gesamt-RNA bzw. 500 ng mRNA mit Hilfe der Reversen
Transkriptase Superscript II (Invitrogen, Karlsruhe) gemäß Herstellerangaben in
einem 20 µl Reaktionsvolumen durchgeführt. Die Reaktion erfolgte für 50 min bei
42°C und wurde durch eine Inkubation von 15 min bei 70°C gestoppt.
2.8
PCR
Sämtliche PCR bzw. RT-PCR-Ansätze wurden standardmäßig mit ca. 50-200 ng
DNA bzw. 2 µl cDNA und 2,5 U Taq-Polymerase (Invitrogen), 1,5 mM MgCl2, 0,2
mM der vier dNTPs sowie 0,4 µM Forward und Reverse-Primer gemäß Herstellerangaben in einem 50 µl Reaktionsvolumen angesetzt.
Die Reaktion erfolgte nach folgendem
Schema im Mastercycler Gradient
(Eppendorf): Initiale Denaturierung für 5 min bei 94°C, anschließend 35 Zyklen mit
Inkubationen für 30 sec bei 94°C, 30 sec mit einer dem Primerpaar angepassten
Annealingtemperatur
und
45
sec
bei
72°C
gefolgt
von
einem
finalem
Elongationsschritt für 10 min bei 72°C.
2.9
Gelelektrophorese
PCR- und RT-PCR-Produkte wurden standardmäßig in einem 1,5% (w/v) Agarosegel
versetzt mit 0,1 μg/ml Ethidiumbromid in TAE-Puffer (0,04 M Tris-Base, 0,04 M
Essigsäure, 1 mM EDTA, pH 8,0) elektrophoretisch bei 100 V für ca. 90 min
aufgetrennt. Anschließend wurden die Gele im UV-Durchlicht bei 254 nm mit einer
Polaroidkamera fotografiert.
Material und Methoden
2.10
14
Klonierung und Sequenzierung von DNA-Fragmenten
Nach der gelelektrophoretischen Auftrennung von PCR- bzw. RT-PCR-Produkten
wurden einzelne Banden erwarteter Fragmentlänge mittels Skalpell aus dem
Agarosegel herausgeschnitten und die darin enthaltene DNA mit Hilfe des QIAEX II
Kits (Qiagen) gemäß den Angaben des Herstellers isoliert.
Die
Ligation
der
aufgereinigten
PCR-Produkte
über
den
3’
terminalen
Desoxyadenosin-Überhang erfolgte mit Hilfe des Klonierungsvektors pGEM-T Easy
(Promega, Mannheim) gemäß dem Standard Reaktionsprotokoll des Herstellers in 10
µl Reaktionsvolumen bei 4°C über Nacht.
Die Thermotransformation erfolgte ebenso wie die Herstellung der kompetenten
Bakterien nach dem Protokoll von Inoue et al. (1990) (Inoue et al., 1990). Für die
Transformation der Ligationsansätze in thermokompetente E. coli DH5α Bakterien
wurde SOB-Medium (2% (w/v) Bacto-Trypton, 0,5% (w/v) Hefeextrakt, 10 mM NaCl,
2,5 mM KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, pH 7,0), zum Ausplattieren sowie zur
Übernachtkultivierung der Bakterien wurde LB-Medium (1% (w/v) NaCl, 1% (w/v)
Bacto-Trypton, 0,5% (w/v) Hefe-Extrakt, pH 7,0) eingesetzt. Positive Klone wurden
über „Blue-White-Screening“ auf 2% LB-AIX-Platten (100 µg/ml Ampicillin, 0,5 mM
IPTG, 50 µg/ml X-Gal) identifiziert.
Die Isolierung der Plasmid-DNA aus 10 ml LB-Übernachtkulturen erfolgte mit Hilfe
des QIAprep Spin Miniprep-Kits (Qiagen) nach Herstellerangaben.
Standardmäßig wurde der Erfolg der Transformation durch einen Restriktionsverdau
über die EcoRI Schnittstellen der Multiple Cloning Site des Vektors pGEM-T Easy
und
gelelektrophoretische
Auftrennung
verifiziert.
Anschließend
erfolgte
die
Sequenzierung derjenigen Klone mit erwarteten Restriktionsfragmentlängen durch
die Firma MWG (Ebersberg) unter Verwendung der Standardprimer M13uni (5’
TGTAAAACGACGGCCAGT 3’) und M13rev (5’ CAGGAAACAGCTATGACC 3’). Die
Sequenzdaten wurden mit Hilfe von Programmen des Softwarepaketes „Lasergene”
(DNASTAR, Madison, USA) ausgewertet.
2.11
Herstellung von cDNA/DNA-Sonden
Zur Herstellung der cDNA-Sonden für die Hybridisierung im Northern Blot und der
DNA-Sonden zum BAC-Screening wurden geeignete cDNA- bzw. DNA-Fragmente
der nachzuweisenden Gene wie beschrieben kloniert und über Sequenzierung
verifiziert. Die klonierten Fragmente wurden als Template für die anschließende
Material und Methoden
15
Amplifizierung über PCR eingesetzt. Die PCR-Produkte wurden im Gel aufgetrennt,
mittels QIAEX II (Qiagen) aus dem Gel isoliert und dienten wiederum als Template
für eine zweite PCR, welche frei von störenden Plasmiden ist und deren Produkte
nach
Aufreinigung
mittels
QIAquick
PCR
Purification
Kit
(Qiagen)
und
photometrischer Quantifizierung direkt in die radioaktive Markierung eingesetzt
werden konnten (s. Kapitel 2.6).
2.12
BAC-Screening und Verifizierung
Das BAC-Library-Screening erfolgte über zwei unterschiedliche Wege: Für HMGA1
und HMGB1 wurden canine RPCI-81 BAC/PAC Filter (BACPAC Resources,
Oakland, USA) mit radioaktiv markierten caninen DNA-Sonden gemäß dem
Herstellerprotokoll („Hybridisation of High Density Filters“) durch H. Murua Escobar
im
Zentrum
für
Humangenetik
hybridisiert.
Signale
wurden
mittels
Storm
PhosphorImager (Molecular Dynamics) detektiert und positive Klone identifiziert.
Alternativ wurden die caninen CCND1 und NRAS BACs mittels PCR-Screening mit
humanen CCND1 Primern bzw. caninen NRAS Primern an der DogBAC library
(http://www.dogmap.ch) identifiziert. Sämtliche BAC-Klone wurden mittels PCR,
Klonierung und Sequenzierung verifiziert.
2.13
Semi-quantitative RT-PCR
Für die semi-quantitative Expressionsanalyse wurde eine Duplex-PCR an caniner
cDNA etabliert, um die Expression des Zielgens im Verhältnis zum HousekeepingGen GAPDH bestimmen zu können. Gegenüber den unter 2.8 beschriebenen PCRBedingungen wurde die Zyklenzahl auf 28 beschränkt, so dass beide Amplifikationen
in der exponentiellen Phase gestoppt wurden.
Die Visualisierung der PCR-Fragmente erfolgte in einem 1,2% (w/v) Agarosegel,
welches in einer Vistra Green Färbelösung bestehend aus 50 ml 1x TAE-Pffer und 5
µl Vistra Green für 15 min lichtgeschützt gefärbt wurde. Die Signale wurden mit Hilfe
des Storm PhosphorImagers (Molecular Dynamics) detektiert und mit dem
Computerprogramm „ImageQuant“ (Molecular Dynamics) quantifiziert.
Material und Methoden
2.14
16
Quantitative Real-time PCR
Zur quantitativen Analyse der HMGA2-Expression in Blut, Zellen und Gewebe wurde
die Methode der quantitativen Real-time RT-PCR (qRT-PCR) nach dem TaqManPrinzip (Livak et al., 1995) sowohl zu Anwendung bei humanen wie auch caninen
Templates etabliert.
Zwei verschiedene Methoden stehen bei der Expressionsanalyse eines Zielgens
mittels
Real-time
RT-PCR
zur
Verfügung,
die
absolute
und
die
relative
Quantifizierung. Bei der absoluten Quantifizierung wird die absolute Transkriptmenge
des Zielgens anhand einer externen Standardkurve mit bekannten Konzentrationen
ermittelt. Ergebnisse werden als Kopienzahl pro eingesetzte Nukleinsäuremenge
angegeben. Bei der relativen Quantifizierung erfolgt die Normalisierung der
Expression eines Zielgens mit Hilfe eines Referenzgens, welches als endogene
Kontrolle dient. Damit ist keine spektrometrische Quantifizierung der eingesetzten
RNA nötig, was bei der Analyse geringer RNA-Mengen von Vorteil ist. Anders als bei
der absoluten Quantifizierung werden die Transkriptmengen nicht auf einen Standard
bekannter Konzentration bezogen, sondern die Expression relativ zu einer
festgesetzten Probe, dem so genannten Kalibrator, angegeben. Als endogene
Kontrolle diente 18S rRNA, welches in Vorversuchen eine konstante Expression in
den zu untersuchenden Proben zeigte. Zudem muss bei der relativen Quantifizierung
gewährleistet sein, dass die PCR-Amplifikationen von Ziel- und Referenzgen eine
vergleichbare Effizienz aufweisen.
2.14.1 Absolute Quantifizierung bei humanen Templates
Zur
absoluten
Transkription
Quantifizierung
durch
M-MLV
der
HMGA2-Expression
Reverse
Transkriptase
wurde
(Invitrogen)
die
mit
Reverse
einem
genspezifischen HMGA2 Reverse Primer (5’ GCCATTTCCTAGGTCTGCCTC 3’)
(Gross et al., 2003) unter Verwendung zweier Mastermixe durchgeführt. 2 µl
Mastermix I bestehend aus 1 µl HMGA2lo (2 µM) und 1 µl dNTPs (10 mM) wurden zu
jeweils 250 ng RNA pipettiert und mit der entsprechenden Menge an dest. H2O auf
ein Volumen von 12 µl gebracht. Zur Auflösung von Sekundärstrukturen wurde jeder
Ansatz für 5 min bei 65°C inkubiert und 1 min auf Eis gelagert. Nach kurzer
Zentrifugation wurde Mastermix II mit 4 µl 5x Erststrangpuffer (50 mM Tris-HCl, 75
mM KCl, 3 mM MgCl2, pH 8.3), 2 µl 1,4-Dithiotreitol (0,1 M DTT), 1 µl RNaseOUT
(40U) (Invitrogen) und 1 µl M-MLV (200 U) auf Eis zugefügt, durch Pipettieren
Material und Methoden
17
vermischt und abzentrifugiert. Die Erststrangsynthese erfolgte für 50 min bei 37°C im
Eppendorf Gradient Thermocycler (Eppendorf) und wurde durch Inkubation für 15
min bei 70°C gestoppt.
Für
die
Real-time
PCR
zur
HMGA2-Expressionsanalyse
wurden
Dreifach-
bestimmungen mit jeweils 2 µl cDNA entsprechend 25 ng RNA-Äquivalenten in
einem Reaktionsvolumen von 25 µl durchgeführt. Für alle zu messenden Proben
eines
Laufes
wurde
ein
Mastermix
mit
600
nM
Forward
Primer
(5’
AGTCCCTCTAAAGCAGCTCAAAAG 3’) und Reverse Primer (s. oben), 200 nM
fluoreszenzmarkierter Sonde (5’ 6-FAM-AGAAGCCACTGGAGAAAAACGGCCATAMRA 3’) (Gross et al., 2003), 1x Universal PCR Mastermix (Applied Biosystems,
Darmstadt) und dest. Wasser angesetzt und in 96-well Platten (Sarstedt, Nümbrecht)
vorgelegt. Nach der Zugabe von jeweils 2 µl cDNA, dem Verschließen der Platte mit
transparenter Klebefolie (Applied Biosystems) und Zentrifugation für 15 sec bei 1000
x g erfolgte die PCR-Amplifikation mittels ABI Prism 7000 Sequence Detection
System (Applied Biosystems), bzw. mit Hilfe des Applied Biosystems 7300 Real-Time
PCR System (Applied Biosystems) unter folgenden PCR-Bedingungen: Zunächst
erfolgte eine Inkubation für 2 min bei 50°C zur Aktivierung der Uracil-N-Glykosylase
(UNG), welche Kontaminationen durch vorherige PCR-Produkte beseitigt. Zur
Denaturierung des Templates und gleichzeitiger Deaktivierung der UNG bzw.
Aktivierung der HotStart Taq-Polymerase wurde 10 min bei 95°C inkubiert.
Anschließend wurden 40-45 Zyklen mit 15 sec Denaturierung bei 95°C und einem
kombinierten Annealing- und Elongationsschritt für 1 min bei 60°C durchgeführt.
Bei jedem qRT-PCR Lauf wurden zwei „Non-template“-Kontrollen mit Wasser statt
cDNA bzw. mit der Wasserkontrolle aus der cDNA-Synthese und eine „-RT“-Kontrolle
ohne Reverse Transkriptase durchgeführt, welche als erstes pipettiert und
anschließend mit Folie verschlossen wurden.
Da bei der absoluten Quantifizierung die Transkriptmengen in Bezug auf eine
Standardgerade ermittelt werden, wurde parallel eine Verdünnungsreihe (102 bis 108
Kopien) eines dem PCR-Fragment entsprechenden synthetisch hergestellten 80 bp
ssDNA-Standards (5’ AGAGTCCCTCTAAAGCAGCTCAAAAGAAAGCAGAAGCCACTGGAGAAAAACGGCCAAGAGGCAGACCTAGGAAATGGCCA 3’) mit bekannter
Konzentration sowohl in der cDNA-Synthese als auch bei der PCR mitgeführt
(Bustin, 2000). Zur Normalisierung wurden alle Ergebnisse auf 250 ng Gesamt-RNA
Material und Methoden
18
bezogen, so dass Transkriptmengen in Kopienzahl / 250 ng Gesamt-RNA
angegeben wurden.
2.14.2 Absolute Quantifizierung bei caninen Templates
Eine Real-time RT-PCR zur absoluten Quantifizierung der HMGA2-Expression bei
caninem Template wurde entsprechend der unter 2.14.1 beschriebenen Methode
etabliert. Auf Grund der hohen Konserviertheit des HMGA2-Gens zwischen Hund
und Mensch konnten sowohl der humane Reverse Primer als auch die humane
fluoreszenzmarkierte
Sonde
beibehalten
werden,
Forward
Primer
(5’
AGTCCCTCCAAAGCAGCTCAAAAG 3’) und Standard (5’ AGAGTCCCTCCAAAGCAGCTCAAAAGAAAGCAGAAGCCACTGGAGAAAAACGGCCAAGAGGCAGACCT
AGGAAATGGCCA
3’)
wurden
der
caninen
HMGA2-Sequenz
entsprechend
angepasst. Sowohl die cDNA-Synthese als auch die Real-time PCR erfolgten wie
unter 2.14.1 beschrieben.
2.14.3 Relative Quantifizierung
Die cDNA-Synthese zur relativen Quantifizierung erfolgte wie für die absolute
Quantifizierung unter 2.14.1 beschrieben mit dem Unterschied, dass als Primer ein
Hexamergemisch (150 ng/µl Random Hexamers) verwendet wurde, welches die
Umschreibung der gesamten RNA einschließlich rRNA in cDNA ermöglicht.
Abweichend vom oben angegebenen Protokoll wurde dem 50 min Inkubationsschritt
bei 37°C ein Annealingschritt von 10 min bei 25°C vorangestellt.
Für die relative Quantifizierung mittels Real-time PCR wurden sowohl für Ziel- als
auch Referenzgen fertige Genexpressionsassays verwendet, welche genspezifische
Primer und eine FAM-MGB-markierte Sonde enthalten (HMGA2: Hs00171569_m1;
18S: Hs99999901_s1, Applied Biosystems). Die Reaktionen erfolgten in einem
Reaktionsvolumen von 20 µl in Triplikat. Je 18 µl eines Mastermixes mit 2x Universal
PCR Mastermix (Applied Biosystems), 20x HMGA2- bzw. 18S-Assay und dest.
Wasser wurden in 96-well Platten (Sarstedt) vorgelegt. Nach der Zugabe von je 2 µl
cDNA wurden die verschlossenen Platten für 15 sec bei 1000 x g zentrifugiert.
Anschließend erfolgte die PCR-Amplifikation mittels Applied Biosystems 7300 RealTime PCR System (Applied Biosystems) gemäß den unter 2.14.1 angegebenen
Parametern. Analog zur absoluten Quantifizierung wurden bei jedem qRT-PCR Lauf
zwei „Non-template“-Kontrollen und eine „-RT“-Kontrolle mitgeführt. Die Auswertung
Material und Methoden
19
der Real-time PCR erfolgte gemäß der „comperative CT-method“ (ΔΔCT-Methode)
(Livak et al., 2001) mittels Applied Biosystems 7300 Sequence Detection Software,
Version 1.2.3, RQ Study Application (Applied Biosystems).
2.15
Herstellung rekombinanter HMGB1-Proteine in Bakterien
Für die Expression rekombinanter HMGB1-Proteine wurde ein bereits fertiges
Konstrukt bestehend aus dem humanen HMGB1-ORF kloniert im Expressionsvektor
pGEX-6P-1 (Amersham Biosciences) mit GST-Fusion-Tag verwendet, welches in E.
coli BL21 Zellen als Glycerolstock (H1Oo-4) vorlag.
Die Aufreinigung der HMGB1-GST-Fusionsproteine erfolgte nach einem modifizierten
Protokoll des „GST Gene Fusion System Handbook“ (Amersham Biosciences). Dazu
wurden die Bakterien auf LBAG-Platten (100 µg/ml Ampicillin, 20 mM Glucose)
ausgestrichen, in einer 10 ml LBAG-Vorkultur für 6 h bei 37°C und einer
anschließenden 1 l LBAG-Hauptkultur für ca. 17 h bei 18°C kultiviert. Bei einer
OD600 von 0,6 - 0,8 erfolgte die Induktion durch Zugabe von 200 µl 0,5 M IPTG.
Nach einer Inkubation für 2 h bei 18°C wurden die Bakterien durch Zentrifugation für
15 min mit 4000 x g bei 4°C pelletiert und in 100 ml PBS* (90 ml PBS, 10 ml Glycerol
100%, 50 µl 1 M PMSF, 500 µl 1 M DTT, 100 µl 1 mg/ml Aprotenin) auf Eis
resuspendiert. Die Lyse der Bakterien erfolgte durch Einfrieren in flüssigem
Stickstoff, Auftauen bei 37°C, Zugabe von 200 µl Lysozym (50 mg/ml) und Inkubation
für 30 min bei 6°C gefolgt von 2 weiteren Einfrier- und Auftauschritten. Nach Zugabe
von 5 ml Tween 20 erfolgte eine weitere Inkubation des Lysats für 30 min bei 6°C
unter leichtem Schütteln. Dann wurde das Lysat erneut eingefroren und aufgetaut
und für 30 min mit 20.000 x g bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde mit 2 ml
50% (v/v) „Slurry“ (Glutathione Sepharose 4B, Amersham Biosciences) versehen und
zur Bindung des GST-Tags der Fusionsproteine für 45 min bei 6°C unter leichtem
Schütteln inkubiert. Nach einer Zentrifugation für 10 min mit 1000 x g bei 4°C wurde
der
Überstand
verworfen
und
das
„Slurry“
mit
den
daran
gebundenen
Fusionsproteinen durch dreimalige Zugabe von 10 ml PBS und Zentrifugation für 5
min mit 500 x g bei 4°C gewaschen. Anschließend wurde erneut mit 10 ml
PreScission Cleavage Buffer (PSCB: 50 mM Tris-HCl (pH 7,0), 150 mM NaCl, 1 mM
EDTA, 1 mM DTT) gewaschen und für 5 min mit 500 x g bei 4°C zentrifugiert. Zum
Trennen der Proteine vom GST-Tag und damit auch von der Glutathione Sepharose
wurde das Pellet mit 40 µl (40U) PreScission Protease und 960 µl PSCB bei 6°C
Material und Methoden
20
über Nacht inkubiert und anschließend für 5 min mit 500 x g bei 4°C abzentrifugiert.
Der Überstand mit dem gelösten HMGB1 Protein wurde bei -80°C gelagert.
2.16
SDS-PAGE
Die Überprüfung der rekombinant exprimierten HMGB1-Proteine erfolgte über SDSPolyacrylamid Gelelektrophorese (PAGE). Gemäß dem BioRad Mini Protean IIProtokoll zur Herstellung von „Discontinuous Polyacrylamid Gels“ (Bio-Rad
Laboratories, München) wurden Gele mit 12% Separationsgel (0,375 M Tris-HCl, pH
8,8) und 4% Sammelgel (0,125 M Tris-HCl, pH 6,8) angefertigt. Die Auftrennung im
Laufpuffer (0,1% (w/v) SDS, 0,02 M Tris-Base, 0,2 M Glycine) erfolgte für ca. 40 min
bei 200V. Das Gel wurde mit 0,1% (w/v) Coomassie Blue R-250 Färbelösung gefärbt
und mit einer 40% (v/v) Ethanol/10% Eisessig-Lösung entfärbt.
2.17
Statistische Auswertung
Die statistische Analyse der HMGA2-Expressionsunterschiede zwischen Tumormaterial und tumorfreien Proben von NSCLC-Patienten erfolgte über den einseitigen
Zweistichproben t-Test bei abhängigen Stichproben (Paarvergleichstest). Da die
Transkriptmengen keine Normalverteilung aufwiesen, wurde dem t-Test eine
logarithmische Transformation der Werte vorangestellt.
Die statistische Auswertung der HMGA2-Expression im Blut von Mammakarzinompatientinnen und von Leukämiepatienten erfolgte unter Verwendung des
Paarvergleichstests bzw. des einseitigen Zweistichproben t-Tests unter Annahme
unterschiedlicher Varianzen.
Um einen statistischen Zusammenhang zwischen zwei Merkmalen zu bestimmen,
wurden Korrelationstests nach Spearman bzw. Pearson durchgeführt. Sowohl der
durchgeführte Test, der entsprechende Korrelationskoeffizient als auch das
zugehörige Signifikanzniveau sind angegeben.
Ergebnisse mit p-Werten unter 0,05 wurden als signifikant erachtet.
Ergebnisse
21
3
Ergebnisse
3.1
Mapping und Charakterisierung ausgewählter HMG-Gene
beim Modelltier Hund
Für die im Rahmen dieser Arbeit geplanten Genexpressionsstudien der HMG-Gene
wurde auch auf Gewebe des Modelltieres Hund zurückgegriffen, da hier die
Bereitstellung von Probenmaterial erheblich einfacher ist als beim Menschen. Der
Hund stellt in vielerlei Hinsicht ein geeignetes Tiermodell für die humane
Krebsforschung dar. Der Hauptvorteil des caninen Modells besteht in den diversen
Tumorerkrankungen, die im Unterschied zu anderen Modelltieren beim Hund spontan
auftreten. Zudem zeigen die caninen Krebserkrankungen ein ähnliches biologisches
und
histologisches
Verhalten
wie
die
korrespondierenden
menschlichen
Erkrankungen. Aufgrund der guten medizinischen Versorgung und der im Vergleich
zum Menschen geringeren ethischen Probleme beim Hund ist neben der
Beschaffung von Probenmaterial auch die Durchführung von Therapiestudien
einfacher als beim Menschen. Zu den Krebserkrankungen des Hundes, welche als
geeignetes Modell für humane Neoplasien gelten, zählen u.a. Osteosarkome,
Mammakarzinome, Bronchialkarzinome und Prostatakarzinome.
3.1.1
Mapping und Charakterisierung des caninen HMGA1-Gens
I) Becker et al. (2003)
II) Murua Escobar et al. (2004)
III) Murua Escobar et al. (2005)
Die HMGA1-Proteine sind an einer Vielzahl zellulärer Prozesse beteiligt, wie z.B.
Genregulation, Integration viraler DNA in das Genom und neoplastische Transformation von Zellen. Eine Überexpression des HMGA1-Gens wurde für eine Reihe
maligner Tumoren beschrieben, wobei die Höhe der HMGA1-Expression oft mit dem
Grad der Malignität bzw. der Metastasierungsneigung eines Tumors korreliert.
Zudem wurden chromosomale Abberationen des humanen HMGA1-Gens auf
Chromosom 6p21 in vielen gutartigen meist mesenchymalen Tumoren, wie z.B. in
Uterusleiomyomen, chondroiden Hamartomen der Lunge, Lipomen sowie follikulären
Schilddrüsenadenomen, detektiert.
Ergebnisse
22
Im Rahmen dieser Arbeit wurde das canine HMGA1-Gen unter Verwendung
entsprechender BAC-Klone auf Chromosom CFA 23 des Hundes gemappt. Anders
als beim Menschen stellt dieses Chromosom keinen Hot-Spot für chromosomale
Bruchpunkte beim Hund dar.
Die molekulare Charakterisierung der caninen HMGA1 cDNA ergab hingegen eine
sehr hohe Ähnlichkeit zwischen Hund und Mensch. Wie beim Menschen besteht die
cDNA des Hundes aus 6 Exons, welche die beiden Splicevarianten HMGA1a und
HMGA1b codieren. Die Ähnlichkeit der gesamten cDNA-Sequenz beträgt für beide
Splicevarianten 80,6%. 5’UTR, CDS und 3’UTR zeigen 95,6%, 95,1% bzw. 74,7%
Sequenzähnlichkeit zwischen Hund und Mensch. Die aus der caninen cDNASequenz abgeleiteten Proteine HMGA1a und HMGA1b weisen eine Länge von 107
bzw. 96 AS auf und zeigen eine 100% Sequenzübereinstimmung zu den
entsprechenden humanen Splicevarianten. Ein Vergleich zu orthologen Proteinsequenzen anderer Organismen, wie z.B. Maus, Ratte, Hamster, Schwein, Pferd,
Rind und Huhn, zeigt, dass nur das Pferd dieselbe Sequenzübereinstimmung zum
Menschen aufweist wie der Hund, jedoch ist bislang nur die equine HMGA1bVariante in der NCBI-Datenbank verzeichnet. Alle anderen Spezies weisen eine
Ähnlichkeit zwischen 69,7% (Huhn) und 99,1% (Schwein) auf, wobei die funktionellen
AT-Hook Domänen besonders stark konserviert sind. Bei der Sequenzanalyse der
CDS von zwölf verschiedenen Hunderassen wurde für HMGA1b bei einer Probe
eines
Teckels
ein
Basenaustausch
detektiert,
welcher
zum
Einbau
einer
abweichenden AS an Codon 64 führt. Um einen Eindruck über die Expression des
HMGA1-Gens beim Hund zu gewinnen, wurde ein Northern Blot mit Gesamt-RNA
bzw. mRNA aus Nieren-, Milz-, Herz-, Lungen- und Muskelgewebe durchgeführt. Die
Hybridisierung mit einer radioaktiv markierten HMGA1a-cDNA-Sonde zeigt in allen
Geweben außer der Niere eine Bande mit ca. 1,8 Kb Länge. Dieser Wert entspricht
der vom Menschen bekannten mRNA-Länge.
Ergebnisse
3.1.2
23
Mapping und Charakterisierung des caninen HMGB1-Gens
IV) Murua Escobar et al. (2003)
Das humane HMGB1-Gen hat neben seiner Rolle im Zellkern als architektonischer
Transkriptionsfaktor auch eine extrazelluläre Funktion. Dieses „Doppelleben“ macht
HMGB1 als Target in der Krebstherapie so interessant. Bestimmte Zellen, wie z.B.
Makrophagen, sezernieren HMGB1, welches als Ligand an den RAGE-Rezeptor
binden kann. Die Bindung von HMGB1 an RAGE führt zur Aktivierung der MAPKinasen p38, SAP/JNK und p44/p42, welche bei entzündlichen Prozessen und der
Tumormetastasierung eine wichtige Rolle spielen.
Zur Charakterisierung des caninen HMGB1-Gens wurden die cDNA-Sequenz, die
genomische Struktur, die Lokalisation im Hundegenom und das Expressionsmuster
untersucht. Das canine HMGB1-Gen liegt auf Chromosom CFA 25 und besteht wie
auch das humane Gen aus fünf Exons und vier Introns. Die aus der cDNA-Sequenz
abgeleitete Proteinsequenz mit 215 AS stimmt zu 100% mit der des Menschen
überein, wohingegen Rind und Maus jeweils einen AS-Austausch in der sauren Cterminalen Domäne des Orthologs aufweisen. Die Expressionsanalyse mittels
Northern-Blot mit Gesamt-RNA bzw. mRNA aus Nieren-, Milz-, Herz-, Lungen- und
Muskelgewebe ergab eine deutliche Expression in allen Geweben außer der Niere.
Analog zum Menschen wurden zwei HMGB1-Transkripte mit einer Länge von 1,4
und 2,4 Kb detektiert.
Ergebnisse
3.2
24
Quantitative Expressionsanalysen von HMGA2 und HMGB1
beim Menschen bzw. Hund
3.2.1
Quantitative Expressionsanalyse des HMGA2-Gens im Tumor und
korrespondierenden tumorfreien Lungengewebe von NSCLC-Patienten
V) Meyer et al. (im Druck)
Lungenkrebs ist weltweit die häufigste krebsbedingte Todesursache. Grund dafür ist
das meist fortgeschrittene Stadium des Tumors zum Zeitpunkt der Diagnosestellung.
Eine Aufklärung der molekularen Mechanismen, welche bei Entwicklung und
Progression der Tumoren eine Rolle spielen, könnte bei der Früherkennung und der
Entwicklung von neuen Therapieansätzen helfen. In früheren Untersuchungen
unserer Arbeitsgruppe mittels konventioneller RT-PCR konnte eine HMGA2Reexpression im Tumor von 14/19 NSCLC-Patienten detektiert werden, während im
nicht-neoplastischen Umgebungsgewebe keine HMGA2-Expression festzustellen
war. Ziel dieser Studie war die quantitative Analyse der HMGA2-Expression bei
Patienten
mit
NSCLC.
Tumorproben
und
korrespondierendes
tumorfreies
Lungengewebe von 17 Adenokarzinompatienten (AC) und 17 Plattenepithelkarzinompatienten (SCC) wurden mittels quantitativer Real-time RT-PCR untersucht
und die Ergebnisse immunhistochemisch überprüft.
Eine HMGA2-Expression konnte in allen untersuchten Lungenproben detektiert
werden. Die Transkriptmengen variieren zwischen 289 und 525.947 Kopien pro 250
ng Gesamt-RNA im tumorfreien Gewebe und zwischen 5.422 und 16.991.545 Kopien
im Tumorgewebe. In 33/34 Fällen konnte eine Überexpression von HMGA2 mRNA
im Tumor verglichen zum korrespondierenden Umgebungsgewebe mit statistisch
hoch signifikanten Unterschieden sowohl für die Adenokarzinompatienten (p <
0,0001) als auch für die Plattenepithelkarzinompatienten (p < 0,0001) festgestellt
werden. Die HMGA2-Expression im Tumor liegt bis zu 911,02-fach (Mittelwert
158,41) für die Adenokarzinome und bis zu 2503,68-fach (Mittelwert 336,26) für die
Plattenepithelkarzinome
über
der
Expression
im
entsprechenden
nicht-
neoplastischen Gewebe, wobei ein statistisch signifikant höherer Anstieg (p < 0,05)
bei den Plattenepithelkarzinomen zu verzeichnen ist. Eine signifikante Korrelation zu
Grading oder Staging der Tumoren konnte nicht nachgewiesen werden, jedoch ist
die höchste HMGA2-Transkriptmenge unter den Adenokarzinomproben bei der
Ergebnisse
25
einzigen Neoplasie mit T4-Klassifizierung detektiert worden. Die qRT-PCRErgebnisse konnten durch immunhistochemische Untersuchungen, welche an einem
Teil der NSCLC-Proben durchgeführt wurden, bestätigt werden.
3.2.2
Quantitative Expressionsanalyse des HMGA2-Gens in Prostatageweben
des Hundes
VI) Winkler et al. (in Vorbereitung)
Neben dem Menschen ist der Hund die einzige Spezies, bei der häufig
Prostatatumoren spontan auftreten. Zudem sind große Übereinstimmungen der
beiden Spezies hinsichtlich Entwicklung und Progression der Adenokarzinome, wie
z.B. Histopathologie und Metastasierungsverhalten, zu beobachten. Ebenso wie
beim Menschen variiert die Aggressivität von Prostatatumoren des Hundes stark, so
dass die Identifizierung von molekularen Markern, welche Rückschlüsse auf die
Malignität eines Tumors erlauben, für eine verbesserte Prognosestellung und
Therapie von großem Interesse ist. Bisherige Untersuchungen beim Menschen
haben gezeigt, dass die Expression von HMGA1 mit der Aggressivität von
Prostatatumoren korreliert. Zudem wird HMGA2 in anaplastischen Zellen der
Prostata reexprimiert.
Im Rahmen dieser Studie konnte bei der quantitativen Untersuchung der HMGA2Expression in 16 caninen Prostatageweben mit unterschiedlichen histologischen
Befunden mittels Real-time RT-PCR eine erhebliche Überexpression von HMGA2 in
Tumorgewebe verglichen mit gesundem Prostatagewebe nachgewiesen werden. Im
nicht-neoplastischen Gewebe schwankt die HMGA2-Expression zwischen 127 und
1.433 Transkripten pro 250 ng Gesamt-RNA, in benignen Veränderungen der
Prostata zwischen 963 und 20.755 Transkripten und in Adenokarzinomen zwischen
27.215 und 4.239.000 Transkripten. Der mit zunehmender Malignität der Tumoren
steigende HMGA2-Level zeigt, dass die HMGA2-Expression als prognostischer
Marker sowohl beim Menschen als auch beim Hund dienen könnte.
Ergebnisse
3.2.3
26
Quantitative Expressionsanalyse des HMGA2-Gens im Blut von
Mammakarzinompatientinnen
Unpublizierte Ergebnisse
Brustkrebs ist der häufigste maligne Tumor bei Frauen. Daher wird seit langem
neben den histologischen und klinischen Parametern nach molekularen Faktoren
gesucht, die Auskunft über die Prognose von Brustkrebserkrankungen geben
können. In Untersuchungen an Blutproben von Brustkrebspatientinnen konnte mittels
konventioneller RT-PCR eine HMGA2-Expression bei Patienten mit metastasiertem
Mammakarzinom nachgewiesen werden, während dieses Transkript bei gesunden
Spendern nicht detektierbar war. Statistische Analysen ergaben eine Korrelation
zwischen HMGA2-Expression und schlechter Prognose bezüglich der Überlebenszeit, so dass die HMGA2-Expression im peripheren Blut als prognostischer Marker
dienen könnte.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte eine quantitative Analyse der HMGA2-Expression
mittels Real-time RT-PCR an Blut von Brustkrebspatientinnen durchgeführt werden.
Zudem sollte untersucht werden, ob sich die HMGA2-Expression während einer
Therapie verändert und eventuell Rückschlüsse auf das Ansprechen der Therapie
zulässt. Dazu wurde von 22 Mammakarzinompatientinnen (s. Anhang, Tab. 1) je
eine Blutprobe vor Therapiebeginn (-1) sowie eine zweite Probe während der
Therapie (-2) entnommen und relativ quantifiziert.
In allen untersuchten Blutproben war mittels der relativen Quantifizierung eine
HMGA2-Expression nachweisbar. Aufgrund der teilweise sehr geringen RNAAusbeute schwanken einige der Ct-Werte für die endogene Kontrolle 18S jedoch so
stark, dass nur in 16 von 22 Fällen eine verlässliche Quantifizierung der HMGA2Expression möglich war. Bei diesen 16 Patientinnen variiert die HMGA2-Expression
vor Therapie um das 19,7-fache und nach der Therapie um das 13,3-fache. Es sind
keine statistisch signifikanten Zusammenhänge der Expressionshöhen mit den
klinischen Daten festzustellen. Ein Vergleich der HMGA2-Expression im Blut von
Patientinnen mit und ohne Metastasen mittels Zweistichproben t-Test unter Annahme
unterschiedlicher Varianzen ergab keine signifikanten Expressionsunterschiede
zwischen diesen beiden Gruppen. Bezieht man die relative Transkriptmenge im Blut
jeder Patientin während der Therapie auf die entsprechende Probe vor der Therapie,
so dass diese als Kalibrator den Wert eins annimmt, wird deutlich, dass während der
Ergebnisse
27
Behandlung sowohl Expressionssteigerungen bis zum 5,8-fachen (Patient 15) als
auch Abnahmen der Expression bis zum 5,2-fachen (Patient 09) zu verzeichnen sind
(s. Anhang, Abb. 1). Der Paarvergleichstest zeigt, dass die Therapie keine
allgemeine Auswirkung auf die HMGA2-Expression hat, das heißt, die Therapien
vermochten die HMGA2-Expression aller Patientinnen weder signifikant zu
vermindern noch zu erhöhen.
3.2.4
Quantitative Expressionsanalyse des HMGA2-Gens im Blut von
Patienten mit unterschiedlichen Diagnosen
Unpublizierte Ergebnisse
Frühere HMGA2-Expressionsanalysen mittels konventioneller RT-PCR hatten
gezeigt, dass HMGA2 im peripheren Blut gesunder Probanden nicht detektierbar ist,
während bei CML- bzw. AML-Patienten sowie in CD34-positiven hämatopoetischen
Stammzellen von gesunden Personen eine HMGA2-Expression nachweisbar ist.
Zudem konnte, wie unter 3.2.3 beschrieben, eine HMGA2-Reexpression im Blut von
Patienten mit metastasiertem Mammakarzinom festgestellt werden.
Um die Auswirkungen verschiedenster Erkrankungen auf die HMGA2-Expression im
Blut zu evaluieren, wurden im Rahmen dieser Arbeit zunächst 36 Blutproben u.a. von
Patienten mit soliden Tumoren, mit malignen Erkrankungen des hämatopoetischen
bzw. lymphatischen Systems sowie mit verschiedenen Autoimmunerkrankungen
erstmals mittels quantitativer Real-time RT-PCR untersucht und mit Blut von sieben
gesunden Spendern verglichen (s. Anhang, Tab. 2).
Im Gegensatz zu vorhergehenden Untersuchungen unter Verwendung der
konventionellen
RT-PCR
war
eine
HMGA2-Expression
in
allen
Blutproben
nachweisbar, sowohl bei den diversen Patienten als auch bei den untersuchten
gesunden Probanden (s. Anhang, Abb. 2). Mit Ausnahme der Probe 45 sind im
peripheren Blut keine signifikanten Unterschiede in der HMGA2-Expression zwischen
den Patienten mit verschiedenen Diagnosen (Mittelwert 6.689 Transkripte / 250 ng
Gesamt-RNA ohne Probe 45 bzw. 10.878 Transkripte mit Probe 45) und den
untersuchten gesunden Probanden (Proben 30-36, Mittelwert 5.819 Transkripte / 250
ng Gesamt-RNA) festzustellen. Die Blutprobe 45, welche eine 27-fache Überexpression verglichen zum Mittelwert im gesunden Blut zeigt, stammt von einem
Ergebnisse
28
Patienten mit CML in Akzeleration nach abgebrochener Therapie, der in der
Zwischenzeit verstorben ist. Bei den übrigen Patienten schwanken die Werte
zwischen 1.126 Transkripten gemessen bei einem Patienten mit angeborenem
gemischten variablen Immundefektsyndrom und 15.131 Transkripten bei einer
Immunthrombozytopenie, was einer Varianz um das 13-fache entspricht. Die
gesunden Probanden zeigen hingegen nur eine Varianz um das 2-fache. Neben der
beschriebenen CML mit HMGA2-Überexpression waren unter den untersuchten
Patienten zwei weitere maligne Erkrankungen des hämatopoetischen Systems
vertreten. Sowohl Patient 1 mit CLL unter Endoxan-Behandlung als auch Patient 13
mit Myelodysplastischem Syndrom (MDS) zeigten mit 5.809 bzw. 8.221 Transkripten
pro 250 ng Gesamt-RNA keine erhöhte HMGA2-Expression.
3.2.5
Quantitative Expressionsanalyse des HMGA2-Gens im Blut von
Patienten mit Erkrankungen des hämatopoetischen und lymphatischen
Systems im Vergleich zu gesunden Probanden
VII) Meyer et al. (in Vorbereitung)
Unpublizierte Ergebnisse
Aufbauend auf den unter 3.2.4 beschriebenen Ergebnissen sollte im Folgenden die
HMGA2-Expression im peripheren Blut eines umfassenderen Kollektivs von 53
Patienten mit verschiedenen Erkrankungen des hämatopoetischen und lymphatischen Systems, darunter 37 Leukämiepatienten, quantitativ untersucht werden (s.
Anhang, Tab. 3).
Die mittels qRT-PCR gemessene HMGA2-Expression schwankt stark mit Werten
zwischen 2.870 Transkripten pro 250 ng Gesamt-RNA bei einem Patienten mit
hochmalignem Lymphom und 6.360.200 Transkripten bei einem CML-Patienten in
der Blastenkrise, was einer Varianz um das 2.216-fache entspricht (s. Anhang, Abb.
3). Da unter den elf am höchsten exprimierenden Patienten ausschließlich
Leukämiepatienten zu finden sind, wurde diese Gruppe gesondert betrachtet und
ihre Expressionsdaten mit denen der gesunden Probanden aus der vorhergehenden
Untersuchung verglichen (s. Anhang, Abb. 4). Bei den Leukämiepatienten schwankt
die HMGA2-Expression zwischen 3.936 (AML nach MDS) und 6.360.200
Transkripten (CML in Blastenkrise). Diese Varianz um das 1.616-fache steht einer
Ergebnisse
29
ca. 2-fachen Varianz bei den gesunden Probanden gegenüber. Statistische Analysen
mittels einseitigem t-Test unter Annahme unterschiedlicher Varianzen ergaben eine
signifikant erhöhte HMGA2-Expression im Blut von Leukämiepatienten verglichen mit
dem Blut gesunder Probanden (p < 0,05). Um festzustellen, ob die Therapie einen
Einfluss auf die HMGA2-Expression hat, wurden Patienten, welche sich zur Zeit der
Blutabnahme in der Therapie befanden bzw. eine Therapie hinter sich hatten, mit
solchen Patienten, bei denen das Blut vor einer Therapie entnommen wurde,
verglichen. Mittels eines entsprechenden t-Tests ergaben sich keine statistisch
signifikanten Unterschiede.
Eine gesonderte Betrachtung der HMGA2-Expression im peripheren Blut aller CMLPatienten (s. Anhang, Tab. 3) einschließlich des Patienten 45 mit CML in
Akzeleration aus der vorangegangenen Studie (vgl. 3.2.4) zeigt, dass dieses
Patientenkollektiv ebenfalls eine starke Varianz der HMGA2-Expression aufweist. Die
gemessene Transkriptmenge reicht von 4.392 bei Patient C2 in Remission bis zu
6.360.200 Transkripten pro 250 ng Gesamt-RNA bei Patient B22 in der Blastenkrise,
dem einzigen Patienten ohne Philadelphia-Chromosom bzw. nachweisbarem BCRABL-Fusionstranskript (s. Anhang, Abb. 5). Die statistische Analyse der Ergebnisse
ergaben signifikante Korrelationen der Leukozytenzahlen zum Zeitpunkt der
Blutabnahme und der gemessenen HMGA2-Expressionslevel sowohl für alle
untersuchten CML-Patienten (Spearman-Korrelation: r = 0,899; p < 0,0001) als auch
bei den Philadelphia-positiven Patienten (Spearman-Korrelation: r = 0,879; p <
0,0001). Da die HMGA2-Expression überproportional zur Leukozytenzahl ansteigt, ist
von
einer
Hochregulierung
der
HMGA2-Gens
in
den
besonders
für
die
fortgeschrittenen Stadien der CML charakteristischen unreifen leukämischen Zellen
auszugehen.
Die Daten der Expressionsanalyse bei AML-Patienten (s. Anhang, Abb. 6) zeigen
keine derartige Korrelation mit der Leukozytenzahl (s. Anhang, Tab. 3). Die
Transkriptmenge schwankt bei dieser Gruppe der Patienten zwischen 3.936
Transkripten pro 250 ng Gesamt-RNA bei einer AML nach MDS unter Therapie und
2.686.860 bei gleicher Diagnose vor einer Behandlung. Es finden sich jedoch keine
generellen signifikanten Unterschiede zwischen allen AML-Patienten während oder
nach einer Therapie zu jenen, bei denen noch keine Behandlung aufgenommen
wurde. Allerdings ergibt der t-Test, dass AML-Patienten allgemein eine statistisch
Ergebnisse
30
signifikant höhere HMGA2-Expression aufweisen als die gesunden Probanden (p <
0,05).
Um weitere Einsichten über die HMGA2-Expression bei AML-Patienten zu erhalten,
wurden im Durchflusszytometer (FACS) angereicherte mononukleäre Zellen aus dem
peripheren Blut oder Knochenmark von fünf AML-Patienten mit unterschiedlichen
Anteilen an CD33- und CD34-positiven Zellen mittels qRT-PCR untersucht (s.
Anhang, Tab. 3). Bis auf eine Probe mit 7.251 Transkripten zeigen alle Proben eine
erhöhte Expression mit 144.781 bis 1.027.741 Transkripten pro 250 ng Gesamt-RNA
(s. Anhang, Abb. 7). Ein direkter Zusammenhang mit dem Anteil an CD33- und
CD34-exprimierenden Zellen ist aufgrund der begrenzten Probenzahl nicht
festzustellen. Die stärkste Expression findet sich jedoch bei einer Probe mit 90%
CD34-positiven Zellen, welche hämatopoetische Stammzellen bzw. Progenitoren
repräsentieren. Die parallel untersuchten Zelllinien von Patienten mit akuter
Promyelozyten Leukämie (APL) bzw. AML zeigen mit 574.453 bzw. 827.466
Transkripten pro 250 ng Gesamt-RNA ebenfalls eine starke Expression (s. Anhang,
Abb. 7).
3.2.6
Semi-quantitative Expressionsanalyse des HMGB1-Gens in Sarkomen
des Hundes
VIII) Meyer et al. (2004)
Die Platinderivate Cisplatin und Carboplatin gehören zu den am häufigsten
angewendeten Zytostatika bei der Krebstherapie. Ihre Wirkung beruht auf der
Bildung von kovalenten Cisplatin- bzw. Carboplatin-DNA-Addukten, welche die DNAReplikation und Transkription behindern und somit zur Apoptose der betroffenen
Zellen führen. Das HMGB1-Protein bindet mit hoher Affinität an diese Addukte und
verhindert so deren Reparatur durch „nucleotide-excision repair“, was die
zytostatische Wirkung der Platinderivate verstärkt. Eine intertumorale Varianz der
HMGB1-Expression könnte demnach den Therapieerfolg mit Cisplatin bzw.
Carboplatin beeinflussen. Vorstellbar ist auch eine Anpassung der eingesetzten
Dosis der Chemotherapeutika abhängig von der individuellen HMGB1-Expression,
um häufig auftretende Nebenwirkungen zu vermindern.
Ergebnisse
31
Sowohl bei humanen als auch bei caninen Osteosarkomen wird standardmäßig eine
Therapie mit Cisplatin bzw. Carboplatin durchgeführt. Deshalb wurden im Rahmen
dieser Studie sieben canine Sarkome, darunter fünf Osteosarkome, ein Fibrosarkom
und ein Leiomyosarkom, mittels Northern Blot-Analyse und semi-quantitativer RTPCR auf ihre HMGB1-Expression hin untersucht. Die Northern Blot-Analyse ergab
nach Normalisierung der eingesetzten RNA-Menge über die GAPDH-Expression eine
deutliche Varianz der HMGB1-Expression um das 5,5-fache. Anschließend wurde
eine semi-quantitative HMGB1/GAPDH Duplex-RT-PCR etabliert, deren Ergebnisse
statistisch signifikant mit den Blottingergebnissen korreliert (Pearson Korrelation: r =
0,8919, p = 0,0071).
Die detektierte deutliche intertumorale Varianz der HMGB1-Expression in sieben
Sarkomen des Hundes zeigt die Bedeutung dieses Tumormarkers in Bezug auf das
Ansprechen auf eine Chemotherapie mit Cisplatin bzw. Carboplatin. Die Etablierung
der semi-quantitativen Duplex-PCR ermöglicht eine material- und zeitsparende
quantitative Analyse der HMGB1-Expression, welche auch in der klinischen Praxis
einsetzbar ist.
Ergebnisse
32
3.3
Untersuchung zur Funktion des HMGB1-Proteins
3.3.1
Untersuchung zur angiogenen Wirkung des HMGB1-Proteins
IX) Schlüter et al. (2005)
Während der Tumorentwicklung kommt es durch unzureichende Neubildung von
Blutgefäßen häufig zu Sauerstoffmangel im schnell proliferierenden Gewebe. Dies
kann zum einen zur Induktion der Apoptose von Tumorzellen, zum anderen zur
Bildung nekrotischer Bereiche in den betroffenen hypoxischen Arealen führen. Ein
ungehemmtes Tumorwachstum ist demnach nur bei ausreichender Vaskularisierung
des Gewebes möglich, was durch den sogenannten „Angiogenetischen Switch“
ermöglicht wird. Sowohl in hypoxischen als auch nekrotischen Bereichen eines
Tumors kommt es zur vermehrten Expression angiogener Wachstumsfaktoren,
welche die Neubildung von kleinen Blutgefäßen fördern. Zudem werden durch
nekrotische Zellen Makrophagen angelockt, welche ihrerseits eine Reihe von
angiogenen Zytokinen und Wachstumsfaktoren ausschütten. Das High Mobility
Group Protein HMGB1 wird sowohl von den nekrotischen Zellen eines Tumors als
auch von aktivierten Makrophagen sezerniert.
Durch immunhistochemische Untersuchungen konnte im Rahmen dieser Arbeit die
Expression von HMGB1 in nekrotischen Tumorbereichen von Mammakarzinomen
bestätigt werden. Daraufhin wurde die mögliche angiogene Wirkung von HMGB1 auf
die Differenzierung von Endothelzellen unter Verwendung eines dreidimensionalen
Spheroid-Modells
getestet.
Erstmalig
konnte
gezeigt
werden,
dass
durch
rekombinant hergestelltes HMGB1 in-vitro die Migration von Endothelzellen und die
Aussprossung von neuen Blutgefäßen induziert werden kann. Nach Applikation von
2 µg/ml, 0,4 µg/ml bzw. 0,08 µg/ml HMGB1 wurde eine statistisch signifikante (p <
0,0001) dosisabhängige kapillarähnliche Aussprossung beobachtet.
Zwei Mechanismen der angiogenen Wirkung von HMGB1 in vivo sind denkbar: zum
einen könnte HMGB1 selbst direkt als angiogener Faktor wirken und zum anderen
könnte HMGB1 indirekt über Aktivierung von Makrophagen die Sekretion von
angiogenen Faktoren, wie z.B. VEGF, induzieren.
Diskussion
4
Die
33
Diskussion
HMGA-Proteine
sind
architektonische
Transkriptionsfaktoren,
die
eine
entscheidende Rolle bei der neoplastischen Transformation, Progression und
Metastasierung von Tumoren spielen. Eine Überexpression des embryonalen
HMGA2-Proteins bzw. des HMGA2-Gens konnte bei einer Reihe maligner Tumoren
detektiert werden, darunter das Mammakarzinom (Rogalla et al., 1997), das
Pankreaskarzinom (Abe et al., 2003b) und das nicht-kleinzellige Bronchialkarzinom
(Rogalla et al., 1998). Zu Beginn dieser Arbeit im Jahre 2002 waren keinerlei
quantitative Untersuchungen zur HMGA2-Expression bei malignen Tumoren
erhältlich. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine quantitative Real-time RT-PCR (qRTPCR) zur Quantifizierung der HMGA2-Expression in malignen Neoplasien, u.a. bei
nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinomen (NSCLC), etabliert. In der Studie von Meyer
et al. (2006) wurde korrespondierendes tumorfreies Lungengewebe von 17 Patienten
mit Adenokarzinom (AC) und 17 Patienten mit Plattenepithelkarzinom (SCC)
untersucht (Meyer et al., 2006b). Es konnte mittels qRT-PCR gezeigt werden, dass
HMGA2
sowohl
in
allen
Tumorproben
als
auch
im
nicht-neoplastischen
Lungengewebe nachweisbar exprimiert wird. Verglichen mit den entsprechenden
tumorfreien Lungengeweben ergab die absolute Quantifizierung der Expression eine
statistisch hoch signifikante Überexpression des HMGA2-Gens sowohl für die
untersuchten AC- als auch die SCC-Proben. Im Mittel war bei den AC- bzw. den
SCC-Proben
eine
159-fache
bzw.
336-fache
HMGA2-Überexpression
zu
verzeichnen, mit einer signifikant höheren Expressionssteigerung bei den SCCProben. In einer zusätzlichen Untersuchung eines Teils der Gewebeproben mittels
Immunhistochemie (IHC) konnte in sechs der sieben höchstexprimierenden Fälle
ebenfalls eine HMGA2-Expression nachgewiesen werden, was die Ergebnisse der
qRT-PCR bestätigt. Ein Vergleich der beiden Detektionsmethoden zeigt, dass die
PCR-basierte Methode um ein Vielfaches sensitiver ist als die IHC. Während mittels
qRT-PCR 289 Kopien in 250 ng Gesamt-RNA detektierbar waren, konnte ein
positives IHC-Ergebnis nur in Proben mit einer Expression von mindestens 1,3·106
HMGA2-Transkripten nachgewiesen werden. Eine Korrelationsanalyse zwischen
HMGA2-Transkriptmengen und histopathologischen Parametern der Tumoren, wie
TNM, Grading und Staging, ergab keinen signifikanten Zusammenhang, jedoch ist
Diskussion
34
auffällig, dass die höchste HMGA2-Transkriptmenge unter den AC-Proben bei der
einzigen Neoplasie mit T4-Klassifizierung detektiert wurde.
In früheren Untersuchungen wurden chromosomale Rearrangierungen des HMGA2Gens bei chondroiden Hamartomen der Lunge festgestellt (Fletcher et al., 1995;
Kazmierczak et al., 1995). Zudem konnten Rogalla et al. (1998) eine Reexpression
von HMGA2 in NSCLC-Proben mittels konventioneller RT-PCR in 14 von 19 NSCLCProben nachweisen, während in keinem der untersuchten Umgebungsgewebe
Transkripte detektierbar waren (Rogalla et al., 1998). Der in dieser Arbeit erstmals
erbrachte Nachweis von HMGA2-Transkripten auch im histologisch tumorfreien
Gewebe verdeutlicht die höhere Sensitivität der qRT-PCR gegenüber der
herkömmlichen RT-PCR. Übereinstimmend konnte in neueren Studien mittels qRTPCR eine HMGA2-Expression auch in gesundem Myometrium (Gross et al., 2003)
bzw. in normalen Keratinozyten der Mundhöhle (Miyazawa et al., 2004) detektiert
werden, was auf eine Basalexpression von HMGA2 in gesundem Gewebe hinweist.
Bemerkenswert sind die starken Schwankungen der HMGA2-Expression um das
1820-fache im nicht-neoplastischen Gewebe. Die Entwicklung von Lungentumoren
ist ein multifaktorieller Prozess, bei dem prämaligne Läsionen an verschiedenen
Stellen innerhalb des bronchoalveolären Epithels entstehen. Diese sind gekennzeichnet durch genetische Veränderungen, welche auch im Bronchialkarzinom
vorhanden sind (Park et al., 1999; Wistuba et al., 1999). Demnach könnten die
erhöhten HMGA2-Transkriptmengen, die in einigen der nachweislich tumorfreien
Gewebeproben gefunden wurden, Folge bzw. Kennzeichen dieser charakteristischen
prämalignen
Veränderungen
sein.
Diese
Annahme
wird
durch
neueste
Untersuchungen an malignen und prämalignen Läsionen der Lunge gestützt (Sarhadi
et al., 2006). In der betreffenden Arbeit wurden Gewebe-Mikroarrays mit 152
Lungenkarzinomen und Gewebeschnitte von 17 Patienten mit Hyperplasie,
Metaplasie und Dysplasie des Bronchienepithels immunhistochemisch auf ihre
HMGA2-Expression untersucht. Neben 90% der Karzinome waren auch einzelne
Zellen bzw. Areale des normalen Bronchienepithels HMGA2-positiv. Zudem war eine
schwache HMGA2-Expression in den untersuchten Metaplasien und eine höhere
Expression in den meisten Dysplasien zu verzeichnen. Statistische Analysen mittels
Log-Rank Test ergaben für die untersuchten AC-Proben eine signifikante Korrelation
der HMGA2-Expression mit einer schlechten Überlebensrate. Die zusätzlich von
Sarhadi et al. (2006) durchgeführte relative Quantifizierung der HMGA2-Expression
Diskussion
35
mittels qRT-PCR an 23 Lungenkarzinomen, darunter je acht AC- und acht SCCProben, verglichen mit drei tumorfreien Lungengeweben bestätigen zudem die im
Rahmen dieser Promotion festgestellte Überexpression bei NSCLC. Im Unterschied
zu den Ergebnissen dieser Arbeit beträgt die Überexpression im Tumor im Schnitt
jedoch nur das 6-fache der im tumorfreien Gewebe gemessenen Expression.
Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die quantitativen Ergebnisse zur
Überexpression des HMGA2-Gens die Bedeutung der HMGA2-Expression sowohl
als diagnostischer als auch als prognostischer Marker beim NSCLC untermauern.
Da Prostatatumoren bezüglich ihrer Malignität sehr heterogen sind und somit nach
genetischen Markern zur verbesserten Klassifikation der Tumoren gesucht wird
(Bussemakers et al., 1991), wurde im Rahmen dieser Arbeit in Zusammenarbeit mit
S. Winkler die HMGA2-Expression bei caninen Prostatageweben mit unterschiedlichen histologischen Befunden quantitativ mittels qRT-PCR untersucht
(Winkler et al., 2006). In früheren Untersuchungen mittels RNA in situ Hybridisierung
(RISH) konnte die Expression des dem HMGA2-Gen verwandten HMGA1-Gens mit
der Aggressivität der untersuchten Prostatatumoren korreliert werden (Tamimi et al.,
1993; Tamimi et al., 1996). Erst kürzlich wurde die Reexpression von HMGA2 bei
Zellen eines anaplastischen Adenokarzinoms der Prostata nachgewiesen (Diana et
al., 2005). Der Hund ist neben dem Menschen die einzige Spezies, bei der
Prostatatumoren spontan auftreten (Boutemmine et al., 2002). Aufgrund ihres
ähnlichen histologischen und biologischen Verhaltens gelten Prostatatumoren des
Hundes als anerkannte Modelle für die entsprechenden humanen Neoplasien
(MacEwen, 1990; Knapp et al., 1997). Im Rahmen dieser Arbeit konnte mittels qRTPCR erstmals eine erhebliche Überexpression von HMGA2-mRNA-Transkripten in
Tumorgeweben im Vergleich zu gesundem Prostatagewebe nachgewiesen werden.
Entsprechend
den
untersuchten
nicht-neoplastischen
Geweben
der
voran-
gegangenen Studie an NSCLC-Patienten wurde eine geringe Expression auch in den
Prostatageweben gesunder Hunde detektiert. In benignen Veränderungen der
Prostata
konnten
erhöhte
HMGA2-Transkriptmengen
nachgewiesen
werden,
während die stärkste Expression in Adenokarzinomen zu verzeichnen war. Der mit
zunehmender Malignität der Prostatatumoren steigende HMGA2-Level zeigt, dass
die HMGA2-Expression als prognostischer Marker sowohl beim Menschen als auch
beim Hund dienen könnte.
Diskussion
36
Vorangegangene Untersuchungen mit der konventionellen RT-PCR haben gezeigt,
dass auch im Blut von Patienten mit malignen Neoplasien eine Reexpression von
HMGA2 detektiert werden kann. In dieser Arbeit sollten erstmals quantitative
Analysen an RNA aus peripherem Blut von Patienten mit unterschiedlichen
Diagnosen durchgeführt werden.
Zunächst wurde die HMGA2-Expression im Blut von 22 Mammakarzinompatientinnen, darunter 14 Patientinnen mit Metastasen, vor Therapiebeginn sowie
während der Therapie relativ quantifiziert. In früheren Untersuchungen mittels heminested RT-PCR konnte eine HMGA2-Expression in invasiv duktalen Mammakarzinomen vornehmlich mit hohem histologischen Grading detektiert werden,
während
in
tumorfreien
Umgebungsgeweben
keine
nachweisbare
HMGA2-
Expression auftrat (Rogalla et al., 1997). Mit derselben Methode konnte eine
HMGA2-Expression im Blut von Patientinnen mit metastasiertem Mammakarzinom
detektiert und mit einer schlechten Prognose bezüglich der Überlebensrate korreliert
werden (Sezer et al., 2000; Langelotz et al., 2003). Keine HMGA2-Expression war
hingegen im Blut gesunder Spender und bei Patientinnen ohne Metastasen
detektierbar (Sezer et al., 2000). In der vorliegenden Arbeit konnte in allen
Blutproben der Patientinnen mit Mammakarzinom, darunter hauptsächlich invasiv
duktale Tumoren, eine HMGA2-Expression detektiert werden. Bei den 16 verlässlich
quantifizierbaren Probenpaaren konnten allerdings keine statistisch signifikanten
Expressionsunterschiede zwischen den Proben von Patienten vor und während der
Therapie festgestellt werden. Die Ergebnisse von Sezer et al. (2000) und Langelotz
et al. (2003) konnten ebenfalls nicht bestätigt werden. Weder ließen sich signifikante
Expressionsunterschiede zwischen Patienten mit und ohne Metastasen nachweisen,
noch konnte eine Korrelation der HMGA2-Transkriptmengen vor der Therapie zu
TNM oder Grading der Tumoren ermittelt werden. Diese Ergebnisse werden im
Wesentlichen von parallel zu dieser Arbeit ebenfalls mittels qRT-PCR gemachten
Untersuchungen von Fabjani et al. 2005 gestützt. Darin wurde die HMGA2Expression in Blutproben von Brustkrebspatientinnen verschiedener Histologien mit
der Expression gesunder Individuen verglichen. Es wurden keine signifikanten
Unterschiede zwischen beiden Gruppen gefunden. Darüber hinaus konnten auch
keine Zusammenhänge zwischen der Höhe der HMGA2-Expression und jeglichen
histopathologischen Daten hergestellt werden (Fabjani et al., 2005). Damit scheint
die HMGA2-Expression im peripheren Blut von Patientinnen als Indikator für
Diskussion
37
Brustkrebs wenig geeignet. Allerdings konnte in derselben Arbeit ein Zusammenhang
der HMGA2-Expression mit dem invasiven Wachstum von Mammatumorzelllinien
hergestellt werden, was als Hinweis darauf interpretiert wurde, dass HMGA2 bei der
Invasion von Tumoren eine Rolle spielt. Dieses Ergebnis passt wiederum zu der
eingangs erwähnten Reexpression von HMGA2 in invasivem Mammakarzinomgewebe (Rogalla et al., 1997).
Zur Klärung der Frage, ob andere Erkrankungen einen Einfluss auf die HMGA2Expression im peripheren Blut haben, wurde im Rahmen dieser Arbeit die HMGA2Expression in 36 Blutproben u.a. von Patienten mit diversen Tumoren, mit malignen
Erkrankungen des hämatopoetischen bzw. lymphatischen Systems sowie mit
verschiedenen Autoimmunerkrankungen quantitativ bestimmt. Als Vergleichskollektiv
dienten sieben Proben gesunder Spender. Über die absolute Quantifizierung mittels
qRT-PCR
konnte
in
allen
untersuchten
Proben
eine
HMGA2-Expression
nachgewiesen werden. Im Gegensatz zu früheren Untersuchungen mittels
konventioneller RT-PCR (Rommel et al., 1997; Sezer et al., 2000) waren auch
sämtliche Proben gesunder Probanden nachweisbar HMGA2-positiv. Dieses
Ergebnis zeigt erneut die um ein Vielfaches höhere Sensitivität der qRT-PCR
gegenüber der konventionellen RT-PCR. Die bereits erwähnten Untersuchungen von
Fabjani et al. (2005) mittels qRT-PCR bestätigen die Expression von HMGA2Transkripten auch im Blut gesunder Probanden. Allerdings zeigt die Expression in
der betreffenden Arbeit eine Schwankung um das 170-fache, während in der hier
vorliegenden Arbeit im Blut gesunder Probanden nur Schwankungen um das
zweifache detektiert wurden. Diese vergleichsweise kleine Variation kann zum einen
auf die niedrigere Probenzahl der im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Studie
zurückzuführen sein, zum anderen jedoch auch auf die Verwendung einer RNAStabilisierungsreagenz, welche Genexpressionsänderungen, die normalerweise nach
der Blutentnahme in vitro stattfinden, verhindert. Im Vergleich der HMGA2Expression im Blut aller Patienten mit der Expression im Blut der gesunden
Probanden konnte kein signifikanter Unterschied festgestellt werden. Einzig die
Expression der Probe eines Patienten mit chronisch myeloischer Leukämie (CML) in
Akzeleration ist mit dem 27-fachen der durchschnittlichen Expression des
Vergleichskollektivs deutlich erhöht. Übereinstimmend dazu haben Rommel et al.
(1997) mit Hilfe der herkömmlichen RT-PCR im Blut von elf CML- und drei AMLPatienten und in CD34-positiven hämatopoetischen Stammzellen eine HMGA2-
Diskussion
38
Expression detektiert, während im Blut gesunder Probanden keine HMGA2Expression nachweisbar war (Rommel et al., 1997).
Aufbauend auf diesen Ergebnissen wurde im Folgenden die HMGA2-Expression in
einem
Kollektiv
aus
53
Patienten
mit
verschiedenen
Erkrankungen
des
hämatopoetischen und lymphatischen Systems erstmals quantitativ untersucht. Die
gemessene HMGA2-Expression zeigt sehr starke Schwankungen um das 2.216fache. Den niedrigsten Wert weist ein Patient mit hochmalignem Lymphom und den
höchsten Wert ein CML-Patient in der Blastenkrise auf. Da unter den elf am höchsten
exprimierenden Patienten ausschließlich Leukämiepatienten zu finden sind, wurde
diese Gruppe gesondert betrachtet. Ihre Expressionsdaten wurden dafür mit denen
der gesunden Probanden aus der vorhergehenden Untersuchung verglichen.
Leukämien sind maligne Erkrankungen des blutbildenden Systems. Sie sind
gekennzeichnet durch eine Infiltration des hämatopoetischen Systems mit atypischen
Leukozyten und ihren funktionsuntüchtigen Vorstufen (Blasten). Durch Verdrängung
der normalen Blutbestandteile wird die Blutbildung im Knochenmark gestört und es
kommt zur Anämie. Je nach klinischem Verlauf und Abstammung der pathologisch
veränderten
Leukozyten
unterscheidet
man
akute
und
chronische
sowie
lymphatische und myeloische Leukämien (Kleihauer et al., 1978). Die Auswertung
der quantitativen Analyse im Blut von Leukämiepatienten ergab eine Schwankung
der HMGA2-Expression um das 1.616-fache, was einer bei den gesunden
Probanden gemessenen Abweichung um das zweifache gegenübersteht. Verglichen
mit dem Blut gesunder Probanden zeigen statistische Analysen eine signifikant
erhöhte HMGA2-Expression im Blut von Leukämiepatienten. Keine signifikanten
Unterschiede konnten hingegen zwischen Patienten nach bzw. während einer
Therapie und unbehandelten Patienten festgestellt werden. Dabei ist jedoch zu
berücksichtigen, dass der höchste Wert bei einer CML gemessen wurde, die sich
trotz Behandlung in der Blastenkrise befand, so dass davon auszugehen ist, dass in
diesem Fall die Therapie keine Wirkung mehr zeigt. Ohne diesen Patienten (B22)
liegt die Irrtumswahrscheinlichkeit für den entsprechenden t-Test bei 0,0502, so dass
ein signifikantes Ergebnis mit p < 0,05 nur knapp verfehlt wird.
Abgesehen von den Ergebnissen von Rommel et al. (1997) konnten auch in weiteren
Untersuchungen
eine
HMGA2-Reexpression
und/oder
chromosomale
Re-
arrangierungen im Bereich des HMGA2-Gens im Blut oder Knochenmark von
Patienten mit malignen Erkrankungen des hämatologischen Systems nachgewiesen
Diskussion
39
werden. Submikroskopische Deletionen wurden in 20 von 78 untersuchten Fällen
von akuter lymphatischer Leukämie (ALL) detektiert (Patel et al., 2005).
Verschiedene Rearrangierungen des HMGA2-Gens wurden zudem bei einem
Patienten mit chronisch lymphatischer Leukämie (CLL) (Santulli et al., 2000) und
einem Patienten mit ALL (Pierantoni et al., 2003) nachgewiesen. Eine Reexpression
des HMGA2-Gens war mittels RT-PCR bei zwei Patienten mit Osteomyelofibrose
und myeloider Metaplasie mit Translokation im Bereich des HMGA2-Gens und in
zehn weiteren Patienten ohne verändertem Karyotyp nachweisbar, während keine
Expression bei gesunden Probanden detektiert werden konnte (Andrieux et al.,
2004). Trunkierte HMGA2-Transkripte oder aberrante Splicevarianten wurden bei
sechs Patienten mit myeloider Leukämie mit Rearrangierungen der chromosomalen
Region 12q13-15 (Odero et al., 2005) sowie in zwei Fällen von akuter myeloischer
Leukämie (AML) identifiziert (Kottickal et al., 1998). Zudem wurde in der letzteren
Studie eine starke Expression eines trunkierten HMGA2-Transkripts unter anderem
bei der CML-Zelllinie BV 173 detektiert, welche keine offensichtliche Rearrangierung
der chromosomalen Region 12q aufweist (Kottickal et al., 1998).
Die chronische myeloische Leukämie (CML) ist gekennzeichnet durch die starke und
unkontrollierte klonale Vermehrung hauptsächlich der Granulozyten. Während in der
chronischen Phase sämtliche Vorstufen der Granulopoese im peripheren Blut
nachweisbar sind, kommt es in der Akzeleration bzw. Blastenkrise zu einem
Differenzierungsarrest und der Akkumulation undifferenzierter Blasten im peripheren
Blut der Patienten (Clarkson et al., 1997; Hehlmann et al., 2005). In 95% der Fälle
kommt es durch reziproke Translokation zur Fusion des c-ABL-Gens auf Chromosom
9q34 mit dem BCR-Gen auf Chromosom 22q11 und damit zur Bildung des so
genannten Philadelphia-Chromosoms (Nowell et al., 1960; Rowley, 1973), was zur
Expression des BCR-ABL-Fusionsproteins führt (Shtivelman et al., 1985; Ben-Neriah
et al., 1986). Dieses Fusionsprotein codiert für ein Onkogen, welches im Unterschied
zum normalen c-ABL-Gen eine konstitutive Tyrosinkinaseaktivität besitzt und für die
Ausprägung des malignen Phänotyps verantwortlich ist (Konopka et al., 1984;
Kloetzer et al., 1985). Die HMGA2-Expression im peripheren Blut aller im Rahmen
dieser Arbeit mittels qRT-PCR untersuchten CML-Patienten zeigte eine Schwankung
um das 1448-fache (Meyer et al., 2006a). Die niedrigsten Transkriptmengen finden
sich bei Patienten mit CML in chronischer Phase oder in Remission, stark erhöhte
Werte finden sich bei zwei Patienten in Akzeleration, der höchste Wert bei einem
Diskussion
40
Patienten mit CML in der Blastenkrise. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass die
Leukozytenzahl im Blut der Patienten zum Zeitpunkt der Blutabnahme mit dem
HMGA2-Expressionslevel signifikant korreliert. Der Anstieg der HMGA2-Expression
ist jedoch weit höher als der Anstieg der Leukozytenzahlen, was auf eine
Hochregulierung des HMGA2-Gens in den leukämischen Zellen schließen lässt.
Grund für den überproportionalen Anstieg der HMGA2-Expression könnte die
Akkumulation undifferenzierter Blasten bei Progression der CML in Akzelerationsphase und Blastenkrise sein. Da diese Blasten unreife Zellen mesenchymalen
Ursprungs sind, die sich unkontrolliert vermehren, stimmt dieses Ergebnis mit
früheren Untersuchungen überein, wonach HMGA2 vornehmlich in undifferenzierten
und
proliferierenden
mesenchymalen
Zellen
und
Geweben
exprimiert
wird
(Manfioletti et al., 1991; Rogalla et al., 1996; Zhou et al., 1996; Hirning-Folz et al.,
1998).
Die größte Gruppe der im Rahmen dieser Studie untersuchten Leukämiepatienten
stellen die AML-Patienten dar. Die AML umfasst eine heterogene Gruppe von
Erkrankungen, die u.a. anhand der Morphologie der proliferierenden Blasten gemäß
der FAB-Klassifikation in die Subtypen M0 bis M7 untergliedert wird (Bennett et al.,
1985). Die Daten der Expressionsanalyse bei AML-Patienten zeigen keine
Korrelation der HMGA2-Transkriptmengen zur Leukozytenzahl, was auf eine
unterschiedlich starke Expression in diesen Zellen bei den verschiedenen Probanden
hinweist. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass AML-Patienten allgemein eine
statistisch signifikant höhere HMGA2-Expression aufweisen als die gesunden
Probanden. Eventuell auch aufgrund der
begrenzten Probenzahl war ein
Zusammenhang zwischen Subtyp und HMGA2-Transkriptmenge nicht nachweisbar.
Zusätzlich wurden im Durchflusszytometer (FACS) angereicherte mononukleäre
Zellen aus dem peripheren Blut oder Knochenmark von fünf AML-Patienten mit
unterschiedlichen Anteilen an CD33- und CD34-positiven Zellen und zwei APL(akute Promyelozyten Leukämie) bzw. AML-Zelllinien quantitativ auf ihre HMGA2Expression untersucht. Sowohl in vier der fünf untersuchten Zellpopulationen als
auch in den beiden Zelllinien konnte im Vergleich zum Kontrollblut eine stark erhöhte
HMGA2-Expression nachgewiesen werden. CD33-Antigene werden von myeloiden
Progenitorzellen exprimiert und treten bei ca. 80-90% aller AMLs auf (Peiper et al.,
1988), während CD34-Antigene Marker der pluripotenten hämatopoetischen
Stammzellen sind und bei AML-Patienten u.a. abhängig vom jeweiligen Subtyp sehr
Diskussion
41
unterschiedlich häufig exprimiert werden (Katz et al., 1985; Kanda et al., 2000). Da
schon in der Untersuchung von Rommel et (1997) eine Expression des HMGA2Gens in CD34+ hämatopoetischen Stammzellen gesunder Spender nachgewiesen
wurde, müssen weitere vergleichende Studien zeigen, ob die erhöhten HMGA2Werte einiger AML-Patienten auf die Anreicherung von Stammzellen im peripheren
Blut zurückzuführen sind oder ob es zur Hochregulierung des HMGA2-Gens in den
leukämischen Zellen kommt. Weiterhin stellt sich die Frage, ob ein Zusammenhang
zwischen HMGA2-Expression und Verlauf der Erkrankung besteht und die Höhe der
Expression damit Rückschlüsse auf die Prognose der Patienten erlaubt. Die CD34Expression wurde als prognostischer Faktor für das Ansprechen auf eine Therapie
vielfach untersucht und ist nach wie vor umstritten (Kanda et al., 2000; Junghanss et
al., 2005). Eine Ausweitung der Studie zur quantitativen Analyse der HMGA2Expression muss in der Zukunft zeigen, ob sich die Ergebnisse in einem größeren
Probenumfang ähnlich verhalten. Aufgrund der Heterogenität der unter dem Begriff
AML zusammengefassten Subtypen M0 bis M7 sollten speziell Blutproben aus
größeren Patientenkollektiven jeder dieser Gruppen vor und während einer Therapie
untersucht werden.
Die im Rahmen dieser Arbeit gefundene signifikante Überexpression von HMGA2 im
Blut von Leukämiepatienten, in Prostatakarzinomen des Hundes sowie bei NSCLC
zeigt einen deutlichen Zusammenhang zwischen HMGA2-Überexpression und
malignem Phänotyp. Übereinstimmende Ergebnisse wurden u.a. auch bei Pankreaskarzinomen und Plattenepithelkarzinomen festgestellt (Abe et al., 2003b; Miyazawa
et al., 2004), so dass HMGA2 als Target für mögliche kausale Krebstherapien über
Inhibierung des Proteins diskutiert wird. Berlingieri et al. (1995) haben gezeigt, dass
durch Inhibierung der HMGA2-Proteinsynthese über Antisense-Konstrukte die
neoplastische Transformation von Schilddrüsenzellen der Ratte verhindert werden
kann (Berlingieri et al., 1995). Neben gentherapeutischen Strategien über AntisenseKonstrukte oder RNA-Interferenz (RNAi), ist auch der Einsatz so genannter „small
molecules“ denkbar, welche in die Zelle eindringen und Proteine gezielt blockieren
können.
Ein anderer klinisch relevanter Aspekt der HMGA2-Überexpression wurde von Boo et
al. (2005) beschrieben. Demnach besteht bei Brustkrebszellen eine Korrelation
zwischen erhöhter HMGA2-Expression und einer gesteigerten Sensitivität gegenüber
Diskussion
42
dem Anthracyclin Doxorubizin und anderen DNA-Doppelstrangbruch-induzierenden
Zytostatika (Boo et al., 2005). Dieser Effekt ist offenbar eine Folge der gestörten
DNA-Reparaturmechanismen, welche in HMGA2-exprimierenden Zellen beobachtet
wurde und könnte für die Therapie der stark HMGA2-exprimierenden Neoplasien
eine wichtige Rolle spielen. Entsprechend konnte gezeigt werden, dass sowohl
natives HMGA2 als auch trunkierte HMGA2-Varianten die Promotoraktivität des
DNA-Reparatur-Gens ERCC1 stark herunterregulieren (Borrmann et al., 2003). Die
so erhöhte genomische Instabilität könnte ursächlich mit der Tumorentstehung
zusammen hängen.
Es bleibt die Frage, wie es zur Hochregulierung der HMGA2-Expression in den
untersuchten malignen Neoplasien kommen kann. Bei vielen gutartigen zumeist
mesenchymalen Tumoren ist die HMGA2-Reexpression auf Aberrationen in der
entsprechenden chromosomalen Region 12q13-15 zurückzuführen (Schoenmakers
et al., 1995; Kazmierczak et al., 1996; Dal Cin et al., 1997; Kazmierczak et al., 1998;
Kazmierczak et al., 1999b). Diese Chromosomenveränderungen können entweder
zur Reaktivierung der Expression oder zur Expression aberranter Transkripte des
HMGA2-Gens führen (Kazmierczak et al., 1995; Petit et al., 1996). Neueste
Ergebnisse belegen, dass weder die Trunkierung der HMGA2-Transkripte noch die
Fusion zu ektopischen Sequenzen für die neoplastische Transformation von
mesenchymalen Zellen nötig sind. Ausschlaggebend für die Tumorgenese von
benignen mesenchymalen Tumoren scheint vielmehr die Überexpression des
HMGA2-Gens an sich zu sein, unabhängig von der Beschaffenheit des exprimierten
HMGA2-Transkripts (Zaidi et al., 2006). Die Tatsache, dass bei malignen Tumoren
im Allgemeinen keine wiederkehrenden Translokationen der 12q13-15 Region
festzustellen sind, lässt darauf schließen, dass hier andere Mechanismen der
Genaktivierung zur HMGA2-Reexpression führen. Eine starke Induktion der HMGA2Expression kann u.a. durch die PI-3 Kinase bzw. Ras/MAP Kinase Signalkaskaden
sowie über Signalwege des oxidativen Stresses vermittelt werden (Li et al., 1997;
Ayoubi et al., 1999; Zentner et al., 2001). Geht man von einem mehrstufigen Prozess
der Krebsentstehung aus, könnte die Hochregulierung der HMGA2-Expression Folge
der Reaktivierung des Gens durch frühere Ereignisse in der Tumorgenese sein.
Das HMGB1-Protein wird im Gegensatz zu den HMGA-Proteinen auch in vielen
adulten nicht-neoplastischen Geweben deutlich messbar exprimiert. Die Höhe der
Diskussion
43
HMGB1-Expression unterliegt jedoch einer gezielten Regulation und nimmt mit
zunehmender Differenzierung der Gewebe ab (Muller et al., 2004). In malignen
Neoplasien wurde eine Überexpression des HMGB1-Gens u.a. in Leberzellkarzinomen (Kawahara et al., 1996), beim Magen- und kolorektalen Adenokarzinom
(Xiang et al., 1997), beim Mammakarzinom (Brezniceanu et al., 2003) und in
leukämischen Zellen (Cabart et al., 1995) gefunden.
Das HMGB1-Protein bindet mit hoher Affinität an Cisplatin-DNA-Addukte (Pil et al.,
1992). Cisplatin ist eine anorganische Verbindung, welche als Zytostatikum weite
Verbreitung in der Behandlung maligner Neoplasien findet. Die Wirkung von Cisplatin
beruht in erster Linie auf der Bildung von DNA-Intrastrang-Quervernetzungen, welche
eine Biegung der DNA-Struktur bewirken und sowohl die DNA-Replikation als auch
die Transkription beeinträchtigen (Pinto et al., 1985; Mello et al., 1995). Die Bindung
von HMGB1 an diese deformierten DNA-Strukturen hat Einfluss auf die Sensibilität
der Zelle gegenüber Cisplatin. Es wurde gezeigt, dass HMGB1 in vitro die Reparatur
von
DNA-Addukten
durch
„nucleotide excision repair“-Mechanismen
verhindert
(Huang et al., 1994; Zamble et al., 1996). Zudem führt eine durch Steroidhormone
induzierte Überexpression von HMGB1 bei humanen Brustkrebszellen zur
Sensibilisierung der Zellen gegenüber Cisplatin (He et al., 2000). Auf der anderen
Seite wird HMGB1 in Cisplatin-resistenten Zelllinien und in bestimmten Cisplatinbehandelten Geweben überexprimiert (Nagatani et al., 2001; Li et al., 2006). Da
Cisplatin auch vielfach bei der adjuvanten Chemotherapie des Hundes Verwendung
findet (Vail et al., 2002), sollte im Rahmen dieser Arbeit die Expression des HMGB1Gens bei Osteosarkomen des Hundes untersucht werden. Als Voraussetzung für
derartige Untersuchungen an Geweben des Hundes wurden zunächst die cDNASequenz, die genomische Struktur und die chromosomale Lokalisation des caninen
HMGB1-Gens bestimmt. Zudem wurde mittels Northern Blot-Analyse die Expression
der beiden vom Menschen bekannten 1,4 und 2,4 kb Splicevarianten des caninen
HMGB1-Gens in Milz-, Herz-, Lungen- und glattem Muskelgewebe, jedoch nicht in
der Niere, des Hundes nachgewiesen (Murua Escobar et al., 2003). Anschließend
wurde die HMGB1-Expression in fünf caninen Osteosarkomen, einem Fibrosarkom
und einem Leiyomyosarkom mittels Northern Blot-Analyse und semi-quantitativer RTPCR untersucht (Meyer et al., 2004a). Beide Methoden zeigten deutliche
Schwankungen der HMGB1-Expressionslevel in den caninen Sarkomen. Vergleichbare Ergebnisse wurden bei humanen Mammakarzinomen dokumentiert (Flohr et al.,
Diskussion
44
2001; Brezniceanu et al., 2003). Die deutliche intertumorale Varianz der HMGB1Expression könnte künftig für die Chemotherapie von caninen Osteosarkomen mit
Cisplatin von Bedeutung sein: zum einen könnten Behandlungserfolge mit Cisplatin
besser abgeschätzt, zum anderen könnte die Höhe der Cisplatingabe an die
entsprechende HMGB1-Expression angepasst werden, um Nebenwirkungen so
gering wie möglich zu halten. Da beim Hund viele Krankheiten große Ähnlichkeiten
zu den entsprechenden humanen Erkrankungen aufweisen, bietet sich das
Hundemodell
für
zukünftige
Studien
über
die
Bedeutung
der
HMGB1-
Expressionshöhe auf die Wirkung einer Cisplatintherapie an. Darüber hinaus zeigt
die gute Korrelation der Northern Blot-Ergebnisse mit der semi-quantitativen RTPCR, dass letztere Methode eine schnelle und kostengünstige Alternative für die
Bestimmung der HMGB1-Expression darstellt. Im Gegensatz zum HMGA2-Gen sind
für das HMGB1-Gen Retropseudogene sowohl im humanen (Stros et al., 1993;
Rogalla et al., 2000; Strichman-Almashanu et al., 2003) als auch im caninen Genom
(persönliche Mitteilung von H. Murua Escobar) identifiziert worden und können eine
Quantifizierung der HMGB1-Expression über qRT-PCR verfälschen. Die qRT-PCR ist
aufgrund ihrer hohen Sensitivität besonders empfindlich gegenüber Verunreinigungen mit genomischer DNA (Bustin, 2002). Da durch Standardaufreinigungsmethoden
eine DNA-Kontamination der isolierten RNA kaum zu vermeiden ist, werden
gegenwärtig verschiedene Methoden zur Beseitigung dieses Problems getestet, um
zukünftig entsprechende Untersuchungen zur HMGB1-Expression bei einem
größeren Kollektiv an Sarkomen mittels qRT-PCR durchführen zu können.
Neben
der
nukleären
Funktion
des
HMGB1-Proteins
als
architektonischer
Transkriptionsfaktor spielt extrazelluläres HMGB1 eine wichtige Rolle als Mediator
von Entzündungsprozessen und bei der Tumormetastasierung (Muller et al., 2001).
Bei schnell wachsenden Tumoren kann es durch unzureichende Neovaskularisierung
und damit verbundene Hypoxie zur Bildung von nekrotischen Zellarealen kommen,
welche zum einen angiogene Wachstumsfaktoren ausschütten, zum anderen
Makrophagen anlocken, welche wiederum zahlreiche Wachstumsfaktoren und
Zytokine freisetzen (Leek et al., 1999; Harris, 2002). HMGB1 kann sowohl von den
nekrotischen Zellen eines Tumors in den extrazellulären Raum entlassen werden
(Scaffidi et al., 2002) als auch von aktivierten Makrophagen aktiv sezerniert werden
(Wang et al., 1999a; Wang et al., 1999b). Sezerniertes HMGB1 führt wiederum zur
Diskussion
45
Aktivierung von Makrophagen und somit zur Synthese von verschiedenen Zytokinen
(Andersson et al., 2000). Extrazelluläres HMGB1 interagiert mit membranständigen
Rezeptoren, darunter RAGE (Receptor for advanced glycation end products). RAGE
wird u.a. von Neuronen (Hori et al., 1995; Huttunen et al., 2002), Monozyten (Hou et
al., 2004; Rouhiainen et al., 2004), Makrophagen (Kokkola et al., 2005),
Endothelzellen (Kuniyasu et al., 2003) und glatten Muskelzellen (Lander et al., 1997)
exprimiert. Verschiedene Untersuchungen haben gezeigt, dass die HMGB1/RAGEInteraktion die Migration und Invasion von Zellen sowie das Tumorwachstum und die
Tumormetastasierung induziert (Taguchi et al., 2000; Degryse et al., 2001). Durch
Bindung von HMGB1 an RAGE werden über verschiedene Signalkaskaden ERK1/2
und NF-κB aktiviert (Yang et al., 2005), die beide bei der Angiogenese eine Rolle
spielen (Eliceiri et al., 1998; Klein et al., 2002). Okamoto et al. (2002) haben gezeigt,
dass AGEs (advanced gycation end products), die eigentlichen Liganden von RAGE,
Angiogenese induzieren können (Okamoto et al., 2002). Im Rahmen dieser Arbeit
konnte in der Untersuchung von Schlueter et al. (2005) eine angiogene Wirkung von
HMGB1 bei Endothelzellen nachgewiesen werden (Schlueter et al., 2005). Durch
Applikation von rekombinant hergestelltem HMGB1 konnte im dreidimensionalen
Spheroidmodell eine dosisabhängige Induktion der Zellmigration und die Ausbildung
von neuen kapillarähnlichen Strukturen beobachtet werden. Bestätigt werden diese
Ergebnisse durch neuere Untersuchungen von Mitola et al. (2006). Übereinstimmend
konnte in vitro durch rekombinantes HMGB1 die Aussprossung von endothelialen
Zellen im dreidimensionalen Fibringel induziert werden. Zudem konnte durch HMGB1
in vivo die Neovaskularisierung in der Chorioallantoismembran (CAM) von
Hühnerembryonen angeregt werden. Durch eine Blockade von RAGE mit
neutralisierenden Antikörpern kommt es zur Inhibition der beobachteten Effekte, was
darauf hinweist, dass die HMGB1/RAGE-Interaktion bei der Angiogenese eine
wichtige Rolle spielt (Mitola et al., 2006). Diese Ergebnisse stehen im Widerspruch
zur Arbeit von Taguchi et al. (2000), in welcher durch sRAGE keine Inhibierung einer
mit bFGF (basic fibroblast growth factor) induzierten Kapillaraussprossung in der
Hornhaut erreicht werden konnte (Taguchi et al., 2000). Da neben RAGE noch
andere Rezeptoren für HMGB1 bekannt sind, welche bei der Angiogenese eine Rolle
spielen (Yuan et al., 2004; Frantz et al., 2005), könnte die durch HMGB1 induzierte
Angiogenese über verschiedene Signalkaskaden erfolgen. Zu klären ist außerdem,
ob HMGB1 die Sekretion angiogener Wachstumsfaktoren in vivo durch direkte
Diskussion
46
Interaktion mit Endothelzellen und/oder indirekt über die Aktivierung von Makrophagen induziert.
Zusätzlich zur Quantifizierung der HMGA2- und HMGB1-Expression bei verschiedenen Tumorentitäten und zur funktionellen Analyse des HMGB1-Gens als
angiogener Faktor wurde als Voraussetzung für zukünftige Expressionsanalysen das
canine HMGA1-Gen charakterisiert und auf den Hundechromosomen lokalisiert
(Becker et al., 2003; Murua Escobar et al., 2004; Murua Escobar et al., 2005). Für
das HMGA1-Gen konnten beide vom Menschen bekannten Splicevarianten HMGA1a
und HMGA1b mit der charakteristischen 33 bp Deletion und die Expression einer 1,8
kb HMGA1 mRNA mittels Northern Blot-Analyse in Milz-, Herz-, Lungen- und glattem
Muskelgewebe des Hundes nachgewiesen werden. Die aus den cDNA-Sequenzen
abgeleiteten Proteinsequenzen stimmen zu 100% mit den menschlichen überein,
was die Relevanz des Hundes als Modell für weiterführende Untersuchungen und
Therapiestudien hinsichtlich der HMG-Proteine unterstreicht. Der hohe Grad an
Konserviertheit zwischen Hund und Mensch wurde darüber hinaus bei der
Charakterisierung des caninen CCND1-Gens bestätigt (Meyer et al., 2004b).
Zusammenfassung
5
47
Zusammenfassung
Die High Mobility Group (HMG)-Proteine HMGA1, HMGA2 und HMGB1 werden seit
längerem als potentielle Tumormarker diskutiert. Sie gehören zur Gruppe der HMGProteine, welche als architektonische Transkriptionsfaktoren an der Regulation der
Chromatinstruktur und der Expression einer Reihe von Genen beteiligt sind. Eine
Überexpression bzw. Reexpression dieser embryonalen Proteine konnte in einer
Reihe von malignen Erkrankungen detektiert werden.
Da zu Beginn dieser Arbeit im Jahre 2002 keine quantitativen Analysen zur HMGAExpression bei malignen Tumoren vorlagen, sollte im Rahmen dieser Arbeit erstmals
die HMGA2-Expression in soliden Tumoren und im peripheren Blut von Patienten
überwiegend mit malignen Erkrankungen mittels quantitativer Real-time RT-PCR
(qRT-PCR) untersucht werden. Die absolute Quantifizierung der HMGA2-Expression
in Tumorproben und korrespondierendem nicht-neoplastischen Lungengewebe von
34 Patienten mit nicht-kleinzelligem Bronchialkarzinom (NSCLC) ergab eine
statistisch hoch signifikante Überexpression sowohl in den untersuchten Adenokarzinomen als auch in den Plattenepithelkarzinomproben. Die in einigen der
nachweislich tumorfreien Gewebeproben gefundenen erhöhten HMGA2-Transkriptmengen könnten Kennzeichen prämaligner Veränderungen sein, die häufig innerhalb
des bronchoalveolären Epithels von Rauchern und/oder Tumorpatienten zu beobachten sind. In 16 caninen Prostatageweben mit unterschiedlichen histologischen
Befunden konnte mit Hilfe der entsprechend modifizierten Methode mit zunehmender
Malignität der Tumoren ein steigender HMGA2-Level detektiert werden. Diese
Ergebnisse unterstreichen die Relevanz der HMGA2-Expression als diagnostischer
und prognostischer Marker in der Krebsbehandlung.
Durch eine relative Quantifizierung der HMGA2-Expression im peripheren Blut von
22 Mammakarzinompatientinnen mittels qRT-PCR konnte im Gegensatz zu früheren
Untersuchungen mit Hilfe der konventionellen RT-PCR in allen untersuchten
Blutproben eine HMGA2-Expression nachgewiesen werden. Zudem konnten keine
signifikanten
Expressionsunterschiede
zwischen
Patientinnen
mit
und
ohne
Metastasen festgestellt werden, so dass die HMGA2-Expression im peripheren Blut
von Patientinnen als prognostischer Faktor für Brustkrebs wenig geeignet scheint.
Bei weiteren Untersuchungen mittels qRT-PCR an 36 Blutproben u.a. von Patienten
mit soliden Tumoren, mit malignen Erkrankungen des hämatopoetischen bzw.
Zusammenfassung
48
lymphatischen Systems sowie mit verschiedenen Autoimmunerkrankungen konnte
lediglich bei einem Patienten mit CML eine stark erhöhte HMGA2-Expression
gegenüber den sieben Proben gesunder Probanden festgestellt werden. Darauf
aufbauend
wurden
56
Blutproben
von
Patienten
mit
Erkrankungen
des
hämatopoetischen bzw. des lymphatischen Systems auf ihre HMGA2-Expression
untersucht. Bei den Leukämiepatienten allgemein sowie speziell bei den AMLPatienten konnte eine statistisch signifikante Überexpression des HMGA2-Gens
gezeigt werden. Zudem wurde bei den zwölf untersuchten CML-Patienten eine
Korrelation der HMGA2-Transkriptmenge mit der Leukozytenzahl im Blut der
Probanden zum Zeitpunkt der Blutabnahme festgestellt.
Da HMGB1 nachweislich die zytostatische Wirkung von Cisplatin verstärken kann
und dieses Zytostatikum zur Standardtherapie bei Osteosarkomen des Hundes
gehört, wurde die HMGB1-Expression in sieben caninen Sarkomen untersucht. In
vorausgehenden Sequenzanalysen konnte gezeigt werden, dass das canine
HMGB1-Gen und das abgeleitete Protein eine hohe Ähnlichkeit zum menschlichen
Ortholog aufweisen. Mittels Northern Blot-Analyse und mittels semi-quantitativer RTPCR
konnte
übereinstimmend
in
sieben
caninen
Sarkomen
eine
stark
unterschiedliche HMGB1-Expression festgestellt werden. Dieses Ergebnis könnte für
künftige chemotherapeutische Behandlungen mit Cisplatin von Bedeutung sein.
Neben
der
nukleären
Funktion
des
HMGB1-Proteins
als
architektonischer
Transkriptionsfaktor spielt extrazelluläres HMGB1 eine wichtige Rolle als Mediator
von Entzündungsprozessen und bei der Tumormetastasierung. Im Rahmen dieser
Arbeit konnte in vitro erstmalig eine angiogene Wirkung des HMGB1-Proteins bei
humanen Endothelzellen nachgewiesen werden. Die Applikation von rekombinant
hergestelltem HMGB1 führte im dreidimensionalen Spheroidmodell zur dosisabhängigen Induktion der Zellmigration und zur Ausbildung von neuen kapillarähnlichen Strukturen.
Summary
6
49
Summary
The high mobility group (HMG) proteins HMGA1, HMGA2, and HMGB1 have been
discussed as potential tumour markers for years. They belong to the group of HMG
proteins acting as architectural transcription factors regulating chromatin structure
and gene expression. Over- or re-expression of these embryonic proteins have been
detected in various malignancies.
Since at the outset of this work in the year 2002 no quantitative analyses of HMGA
expression in malignant tumours existed, it was the aim of this study to examine
HMGA2 expression in solid tumours and in the peripheral blood of patients mainly
with malignant neoplasias using quantitative real-time RT-PCR (qRT-PCR). Absolute
quantification of HMGA2 expression in matching tumourous and non-tumourous lung
tissue of 34 non-small cell lung cancer patients revealed a highly significant overexpression in the adenocarcinoma as well as in the squamous cell carcinoma
samples. In some of the non-neoplastic tissues elevated levels of HMGA2 transcripts
were detected which could be due to premalignant changes frequently observed in
bronchoalveolar epithelium of smokers and/or lung cancer patients. In 16 canine
prostatic tissues with diverse histologic findings a correlation of HMGA2 level and
malignant potential was apparent using an accordingly modified qRT-PCR protocol.
These results underline the relevance of HMGA2 expression as diagnostic and
prognostic marker in cancer therapy.
By relative quantification using qRT-PCR HMGA2 expression could be detected in
the peripheral blood of all 22 mamma carcinoma patients tested, which is in contrast
to previous studies with conventional RT-PCR. Furthermore, no significant
differences of HMGA2 expression were detected between patients with or without
metastatic disease, indicating that HMGA2 expression in the peripheral blood is not
applicable as prognostic marker for breast cancer. qRT-PCR analyses of 36 blood
samples from patients with solid tumours, malign diseases of the haematopoietic and
lymphatic system, and various autoimmune diseases compared to seven samples of
healthy donors showed a strong HMGA2 over-expression solely for one CML patient.
Based on this result a study on 56 patients with diseases of the haematopoietic and
lymphatic system was conducted. For the leukaemia patients in general as well as for
the AML patients in particular a significant over-expression of HMGA2 could be
shown. In addition, for the twelve CML patients examined a positive correlation of
Summary
50
HMGA2 mRNA transcript levels and white blood cell count at the time of blood drawl
was found.
Since it was shown that HMGB1 can sensitise cancer cells to cisplatin and this
cytostatic drug is commonly used for the treatment of osteosarcomas of the dog,
HMGB1 expression was examined in seven canine sarcomas. Preceding sequence
analyses revealed a strong similarity of the canine HMGB1 gene and the deduced
protein to the human orthologs. Northern Blot analysis and semi-quantitative RT-PCR
consistently showed a clear variation of HMGB1 expression, which could be of
importance for further therapeutic protocols using cisplatin.
Apart from the nuclear function of the HMGB1 protein as architectural transcription
factor, extra cellular HMGB1 plays an important role as mediator of inflammation and
in tumour metastasis. Herein the angiogenic potential of recombinant HMGB1 protein
was shown in vitro for the first time. Application of HMGB1 induced cell migration and
sprouting in an endothelial sprouting assay in a dose dependent manner.
Literatur
7
51
Literatur
Abe N, Watanabe T, Izumisato Y, Suzuki Y, Masaki T, Mori T, Sugiyama M,
Fusco A, Atomi Y (2003a) High mobility group A1 is expressed in metastatic
adenocarcinoma to the liver and intrahepatic cholangiocarcinoma, but not in
hepatocellular carcinoma: its potential use in the diagnosis of liver neoplasms. J
Gastroenterol 38: 1144-1149.
Abe N, Watanabe T, Sugiyama M, Uchimura H, Chiappetta G, Fusco A, Atomi Y
(1999) Determination of high mobility group I(Y) expression level in colorectal
neoplasias: a potential diagnostic marker. Cancer Res 59: 1169-1174.
Abe N, Watanabe T, Suzuki Y, Matsumoto N, Masaki T, Mori T, Sugiyama M,
Chiappetta G, Fusco A, Atomi Y (2003b) An increased high-mobility group A2
expression level is associated with malignant phenotype in pancreatic exocrine
tissue. Br J Cancer 89: 2104-2109.
Agresti A, Bianchi ME (2003) HMGB proteins and gene expression. Curr Opin
Genet Dev 13: 170-178.
Andersson U, Wang H, Palmblad K, Aveberger AC, Bloom O, Erlandsson-Harris
H, Janson A, Kokkola R, Zhang M, Yang H, Tracey KJ (2000) High mobility group
1 protein (HMG-1) stimulates proinflammatory cytokine synthesis in human
monocytes. J Exp Med 192: 565-570.
Andrieux J, Demory JL, Dupriez B, Quief S, Plantier I, Roumier C, Bauters F, Lai
JL, Kerckaert JP (2004) Dysregulation and overexpression of HMGA2 in
myelofibrosis with myeloid metaplasia. Genes Chromosomes Cancer 39: 82-87.
Ayoubi TA, Jansen E, Meulemans SM, Van de Ven WJ (1999) Regulation of
HMGIC expression: an architectural transcription factor involved in growth control
and development. Oncogene 18: 5076-5087.
Bagga R, Michalowski S, Sabnis R, Griffith JD, Emerson BM (2000) HMG I/Y
regulates long-range enhancer-dependent transcription on DNA and chromatin by
changes in DNA topology. Nucleic Acids Res 28: 2541-2550.
Balcerczak M, Pasz-Walczak G, Balcerczak E, Wojtylak M, Kordek R, Mirowski
M (2003) HMGI(Y) gene expression in colorectal cancer: comparison with some
histological typing, grading, and clinical staging. Pathol Res Pract 199: 641-646.
Bandiera A, Bonifacio D, Manfioletti G, Mantovani F, Rustighi A, Zanconati F,
Fusco A, Di Bonito L, Giancotti V (1998) Expression of HMGI(Y) proteins in
squamous intraepithelial and invasive lesions of the uterine cervix. Cancer Res 58:
426-431.
Basil CF, Zhao Y, Zavaglia K, Jin P, Panelli MC, Voiculescu S, Mandruzzato S,
Lee HM, Seliger B, Freedman RS, Taylor PR, Hu N, Zanovello P, Marincola FM,
Wang E (2006) Common cancer biomarkers. Cancer Res 66: 2953-2961.
Literatur
52
Bast RC, Jr., Lilja H, Urban N, Rimm DL, Fritsche H, Gray J, Veltri R, Klee G,
Allen A, Kim N, Gutman S, Rubin MA, Hruszkewycz A (2005) Translational
crossroads for biomarkers. Clin Cancer Res 11: 6103-6108.
Battista S, Fidanza V, Fedele M, Klein-Szanto AJ, Outwater E, Brunner H,
Santoro M, Croce CM, Fusco A (1999) The expression of a truncated HMGI-C gene
induces gigantism associated with lipomatosis. Cancer Res 59: 4793-4797.
Becker K, Murua Escobar H, Richter A, Meyer B, Nolte I, Bullerdiek J (2003) The
canine HMGA1 gene maps to CFA 23. Anim Genet 34: 68-69.
Begum N, Pash JM, Bhorjee JS (1990) Expression and synthesis of high mobility
group chromosomal proteins in different rat skeletal cell lines during myogenesis. J
Biol Chem 265: 11936-11941.
Ben-Neriah Y, Daley GQ, Mes-Masson AM, Witte ON, Baltimore D (1986) The
chronic myelogenous leukemia-specific P210 protein is the product of the bcr/abl
hybrid gene. Science 233: 212-214.
Bennett JM, Catovsky D, Daniel MT, Flandrin G, Galton DA, Gralnick HR, Sultan
C (1985) Proposed revised criteria for the classification of acute myeloid leukemia. A
report of the French-American-British Cooperative Group. Ann Intern Med 103: 620625.
Berlingieri MT, Manfioletti G, Santoro M, Bandiera A, Visconti R, Giancotti V,
Fusco A (1995) Inhibition of HMGI-C protein synthesis suppresses retrovirally
induced neoplastic transformation of rat thyroid cells. Mol Cell Biol 15: 1545-1553.
Bianchi ME, Beltrame M, Paonessa G (1989) Specific recognition of cruciform DNA
by nuclear protein HMG1. Science 243: 1056-1059.
Bianchi ME, Falciola L, Ferrari S, Lilley DM (1992) The DNA binding site of HMG1
protein is composed of two similar segments (HMG boxes), both of which have
counterparts in other eukaryotic regulatory proteins. Embo J 11: 1055-1063.
Boo LM, Lin HH, Chung V, Zhou B, Louie SG, O'Reilly MA, Yen Y, Ann DK
(2005) High mobility group A2 potentiates genotoxic stress in part through the
modulation of basal and DNA damage-dependent phosphatidylinositol 3-kinaserelated protein kinase activation. Cancer Res 65: 6622-6630.
Borrmann L, Schwanbeck R, Heyduk T, Seebeck B, Rogalla P, Bullerdiek J,
Wisniewski JR (2003) High mobility group A2 protein and its derivatives bind a
specific region of the promoter of DNA repair gene ERCC1 and modulate its activity.
Nucleic Acids Res 31: 6841-6851.
Boutemmine D, Bouchard N, Boerboom D, Jones HE, Goff AK, Dore M, Sirois J
(2002) Molecular characterization of canine prostaglandin G/H synthase-2 and
regulation in prostatic adenocarcinoma cells in vitro. Endocrinology 143: 1134-1143.
Literatur
53
Brezniceanu ML, Volp K, Bosser S, Solbach C, Lichter P, Joos S, Zornig M
(2003) HMGB1 inhibits cell death in yeast and mammalian cells and is abundantly
expressed in human breast carcinoma. Faseb J 17: 1295-1297.
Bussemakers MJ, van de Ven WJ, Debruyne FM, Schalken JA (1991)
Identification of high mobility group protein I(Y) as potential progression marker for
prostate cancer by differential hybridization analysis. Cancer Res 51: 606-611.
Bustin M (1999) Regulation of DNA-dependent activities by the functional motifs of
the high-mobility-group chromosomal proteins. Mol Cell Biol 19: 5237-5246.
Bustin M (2001) Revised nomenclature for high mobility group (HMG) chromosomal
proteins. Trends Biochem Sci 26: 152-153.
Bustin M, Reeves R (1996) High-mobility-group chromosomal proteins: architectural
components that facilitate chromatin function. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 54: 35100.
Bustin SA (2000) Absolute quantification of mRNA using real-time reverse
transcription polymerase chain reaction assays. J Mol Endocrinol 25: 169-193.
Bustin SA (2002) Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR
(RT-PCR): trends and problems. J Mol Endocrinol 29: 23-39.
Cabart P, Kalousek I, Jandova D, Hrkal Z (1995) Differential expression of nuclear
HMG1, HMG2 proteins and H1(zero) histone in various blood cells. Cell Biochem
Funct 13: 125-133.
Calogero S, Grassi F, Aguzzi A, Voigtlander T, Ferrier P, Ferrari S, Bianchi ME
(1999) The lack of chromosomal protein Hmg1 does not disrupt cell growth but
causes lethal hypoglycaemia in newborn mice. Nat Genet 22: 276-280.
Chase MB, Haga SB, Hankins WD, Williams DM, Bi Z, Strovel JW, Obriecht C,
Berg PE (1999) Binding of HMG-I(Y) elicits structural changes in a silencer of the
human beta-globin gene. Am J Hematol 60: 27-35.
Chau KY, Patel UA, Lee KL, Lam HY, Crane-Robinson C (1995) The gene for the
human architectural transcription factor HMGI-C consists of five exons each coding
for a distinct functional element. Nucleic Acids Res 23: 4262-4266.
Chiappetta G, Avantaggiato V, Visconti R, Fedele M, Battista S, Trapasso F,
Merciai BM, Fidanza V, Giancotti V, Santoro M, Simeone A, Fusco A (1996) High
level expression of the HMGI (Y) gene during embryonic development. Oncogene 13:
2439-2446.
Chiappetta G, Bandiera A, Berlingieri MT, Visconti R, Manfioletti G, Battista S,
Martinez-Tello FJ, Santoro M, Giancotti V, Fusco A (1995) The expression of the
high mobility group HMGI (Y) proteins correlates with the malignant phenotype of
human thyroid neoplasias. Oncogene 10: 1307-1314.
Literatur
54
Chiappetta G, Botti G, Monaco M, Pasquinelli R, Pentimalli F, Di Bonito M,
D'Aiuto G, Fedele M, Iuliano R, Palmieri EA, Pierantoni GM, Giancotti V, Fusco
A (2004) HMGA1 protein overexpression in human breast carcinomas: correlation
with ErbB2 expression. Clin Cancer Res 10: 7637-7644.
Chiappetta G, Manfioletti G, Pentimalli F, Abe N, Di Bonito M, Vento MT,
Giuliano A, Fedele M, Viglietto G, Santoro M, Watanabe T, Giancotti V, Fusco A
(2001) High mobility group HMGI(Y) protein expression in human colorectal
hyperplastic and neoplastic diseases. Int J Cancer 91: 147-151.
Chiappetta G, Tallini G, De Biasio MC, Manfioletti G, Martinez-Tello FJ,
Pentimalli F, de Nigris F, Mastro A, Botti G, Fedele M, Berger N, Santoro M,
Giancotti V, Fusco A (1998) Detection of high mobility group I HMGI(Y) protein in
the diagnosis of thyroid tumors: HMGI(Y) expression represents a potential
diagnostic indicator of carcinoma. Cancer Res 58: 4193-4198.
Clarkson BD, Strife A, Wisniewski D, Lambek C, Carpino N (1997) New
understanding of the pathogenesis of CML: a prototype of early neoplasia. Leukemia
11: 1404-1428.
Crippa MP, Alfonso PJ, Bustin M (1992) Nucleosome core binding region of
chromosomal protein HMG-17 acts as an independent functional domain. J Mol Biol
228: 442-449.
Degryse B, Bonaldi T, Scaffidi P, Muller S, Resnati M, Sanvito F, Arrigoni G,
Bianchi ME (2001) The high mobility group (HMG) boxes of the nuclear protein
HMG1 induce chemotaxis and cytoskeleton reorganization in rat smooth muscle
cells. J Cell Biol 152: 1197-1206.
Diana F, Di Bernardo J, Sgarra R, Tessari MA, Rustighi A, Fusco A, Giancotti V,
Manfioletti G (2005) Differential HMGA expression and post-translational
modifications in prostatic tumor cells. Int J Oncol 26: 515-520.
Eliceiri BP, Klemke R, Stromblad S, Cheresh DA (1998) Integrin alphavbeta3
requirement for sustained mitogen-activated protein kinase activity during
angiogenesis. J Cell Biol 140: 1255-1263.
Elton TS, Reeves R (1986) Purification and postsynthetic modifications of Friend
erythroleukemic cell high mobility group protein HMG-I. Anal Biochem 157: 53-62.
Fabjani G, Tong D, Wolf A, Roka S, Leodolter S, Hoecker P, Fischer MB, Jakesz
R, Zeillinger R (2005) HMGA2 is associated with invasiveness but not a suitable
marker for the detection of circulating tumor cells in breast cancer. Oncol Rep 14:
737-741.
Falvo JV, Thanos D, Maniatis T (1995) Reversal of intrinsic DNA bends in the IFN
beta gene enhancer by transcription factors and the architectural protein HMG I(Y).
Cell 83: 1101-1111.
Literatur
55
Fedele M, Bandiera A, Chiappetta G, Battista S, Viglietto G, Manfioletti G,
Casamassimi A, Santoro M, Giancotti V, Fusco A (1996) Human colorectal
carcinomas express high levels of high mobility group HMGI(Y) proteins. Cancer Res
56: 1896-1901.
Fedele M, Battista S, Kenyon L, Baldassarre G, Fidanza V, Klein-Szanto AJ,
Parlow AF, Visone R, Pierantoni GM, Outwater E, Santoro M, Croce CM, Fusco
A (2002) Overexpression of the HMGA2 gene in transgenic mice leads to the onset
of pituitary adenomas. Oncogene 21: 3190-3198.
Fedele M, Fidanza V, Battista S, Pentimalli F, Klein-Szanto AJ, Visone R, De
Martino I, Curcio A, Morisco C, Del Vecchio L, Baldassarre G, Arra C, Viglietto
G, Indolfi C, Croce CM, Fusco A (2006) Haploinsufficiency of the hmga1 gene
causes cardiac hypertrophy and myelo-lymphoproliferative disorders in mice. Cancer
Res 66: 2536-2543.
Fedele M, Pentimalli F, Baldassarre G, Battista S, Klein-Szanto AJ, Kenyon L,
Visone R, De Martino I, Ciarmiello A, Arra C, Viglietto G, Croce CM, Fusco A
(2005) Transgenic mice overexpressing the wild-type form of the HMGA1 gene
develop mixed growth hormone/prolactin cell pituitary adenomas and natural killer
cell lymphomas. Oncogene 24: 3427-3435.
Ferrari S, Finelli P, Rocchi M, Bianchi ME (1996) The active gene that encodes
human high mobility group 1 protein (HMG1) contains introns and maps to
chromosome 13. Genomics 35: 367-371.
Fletcher JA, Longtine J, Wallace K, Mentzer SJ, Sugarbaker DJ (1995)
Cytogenetic and histologic findings in 17 pulmonary chondroid hamartomas:
evidence for a pathogenetic relationship with lipomas and leiomyomas. Genes
Chromosomes Cancer 12: 220-223.
Flohr AM, Rogalla P, Bonk U, Puettmann B, Buerger H, Gohla G, Packeisen J,
Wosniok W, Loeschke S, Bullerdiek J (2003) High mobility group protein HMGA1
expression in breast cancer reveals a positive correlation with tumour grade. Histol
Histopathol 18: 999-1004.
Flohr AM, Rogalla P, Meiboom M, Borrmann L, Krohn M, Thode-Halle B,
Bullerdiek J (2001) Variation of HMGB1 expression in breast cancer. Anticancer
Res 21: 3881-3885.
Frantz S, Vincent KA, Feron O, Kelly RA (2005) Innate immunity and angiogenesis.
Circ Res 96: 15-26.
Friedmann M, Holth LT, Zoghbi HY, Reeves R (1993) Organization, inducibleexpression and chromosome localization of the human HMG-I(Y) nonhistone protein
gene. Nucleic Acids Res 21: 4259-4267.
Gattas GJ, Quade BJ, Nowak RA, Morton CC (1999) HMGIC expression in human
adult and fetal tissues and in uterine leiomyomata. Genes Chromosomes Cancer 25:
316-322.
Literatur
56
Goodwin GH, Sanders C, Johns EW (1973) A new group of chromatin-associated
proteins with a high content of acidic and basic amino acids. Eur J Biochem 38: 1419.
Gross KL, Neskey DM, Manchanda N, Weremowicz S, Kleinman MS, Nowak RA,
Ligon AH, Rogalla P, Drechsler K, Bullerdiek J, Morton CC (2003) HMGA2
expression in uterine leiomyomata and myometrium: quantitative analysis and tissue
culture studies. Genes Chromosomes Cancer 38: 68-79.
Grosschedl R, Giese K, Pagel J (1994) HMG domain proteins: architectural
elements in the assembly of nucleoprotein structures. Trends Genet 10: 94-100.
Harris AL (2002) Hypoxia--a key regulatory factor in tumour growth. Nat Rev Cancer
2: 38-47.
Hauke S, Flohr AM, Rogalla P, Bullerdiek J (2002) Sequencing of intron 3 of
HMGA2 uncovers the existence of a novel exon. Genes Chromosomes Cancer 34:
17-23.
He Q, Liang CH, Lippard SJ (2000) Steroid hormones induce HMG1 overexpression
and sensitize breast cancer cells to cisplatin and carboplatin. Proc Natl Acad Sci U S
A 97: 5768-5772.
Hehlmann R, Berger U, Hochhaus A (2005) Chronic myeloid leukemia: a model for
oncology. Ann Hematol 84: 487-497.
Hennig Y, Rogalla P, Wanschura S, Frey G, Deichert U, Bartnitzke S, Bullerdiek
J (1997) HMGIC expressed in a uterine leiomyoma with a deletion of the long arm of
chromosome 7 along with a 12q14-15 rearrangement but not in tumors showing
del(7) as the sole cytogenetic abnormality. Cancer Genet Cytogenet 96: 129-133.
Hirning-Folz U, Wilda M, Rippe V, Bullerdiek J, Hameister H (1998) The
expression pattern of the Hmgic gene during development. Genes Chromosomes
Cancer 23: 350-357.
Hori O, Brett J, Slattery T, Cao R, Zhang J, Chen JX, Nagashima M, Lundh ER,
Vijay S, Nitecki D, et al. (1995) The receptor for advanced glycation end products
(RAGE) is a cellular binding site for amphoterin. Mediation of neurite outgrowth and
co-expression of rage and amphoterin in the developing nervous system. J Biol
Chem 270: 25752-25761.
Hou FF, Ren H, Owen WF, Jr., Guo ZJ, Chen PY, Schmidt AM, Miyata T, Zhang
X (2004) Enhanced expression of receptor for advanced glycation end products in
chronic kidney disease. J Am Soc Nephrol 15: 1889-1896.
Huang JC, Zamble DB, Reardon JT, Lippard SJ, Sancar A (1994) HMG-domain
proteins specifically inhibit the repair of the major DNA adduct of the anticancer drug
cisplatin by human excision nuclease. Proc Natl Acad Sci U S A 91: 10394-10398.
Literatur
57
Huttunen HJ, Fages C, Kuja-Panula J, Ridley AJ, Rauvala H (2002) Receptor for
advanced glycation end products-binding COOH-terminal motif of amphoterin inhibits
invasive migration and metastasis. Cancer Res 62: 4805-4811.
Inoue H, Nojima H, Okayama H (1990) High efficiency transformation of Escherichia
coli with plasmids. Gene 96: 23-28.
Johns EW (1982) The HMG chromosomal proteins. Academic Press, London.
Johnson KR, Lehn DA, Reeves R (1989) Alternative processing of mRNAs
encoding mammalian chromosomal high-mobility-group proteins HMG-I and HMG-Y.
Mol Cell Biol 9: 2114-2123.
Junghanss C, Waak M, Knopp A, Kleine HD, Kundt G, Leithauser M, Hilgendorf
I, Wolff D, Casper J, Freund M (2005) Multivariate analyses of prognostic factors in
acute myeloid leukemia: relevance of cytogenetic abnormalities and CD34
expression. Neoplasma 52: 402-410.
Kanda Y, Hamaki T, Yamamoto R, Chizuka A, Suguro M, Matsuyama T,
Takezako N, Miwa A, Kami M, Hirai H, Togawa A (2000) The clinical significance of
CD34 expression in response to therapy of patients with acute myeloid leukemia: an
overview of 2483 patients from 22 studies. Cancer 88: 2529-2533.
Katz FE, Tindle R, Sutherland DR, Greaves MF (1985) Identification of a
membrane glycoprotein associated with haemopoietic progenitor cells. Leuk Res 9:
191-198.
Kawahara N, Tanaka T, Yokomizo A, Nanri H, Ono M, Wada M, Kohno K,
Takenaka K, Sugimachi K, Kuwano M (1996) Enhanced coexpression of
thioredoxin and high mobility group protein 1 genes in human hepatocellular
carcinoma and the possible association with decreased sensitivity to cisplatin.
Cancer Res 56: 5330-5333.
Kazmierczak B, Meyer-Bolte K, Tran KH, Wockel W, Breightman I, Rosigkeit J,
Bartnitzke S, Bullerdiek J (1999) A high frequency of tumors with rearrangements
of genes of the HMGI(Y) family in a series of 191 pulmonary chondroid hamartomas.
Genes Chromosomes Cancer 26: 125-133.
Kazmierczak B, Wanschura S, Rommel B, Bartnitzke S, Bullerdiek J (1996) Ten
pulmonary chondroid hamartomas with chromosome 6p21 breakpoints within the
HMG-I(Y) gene or its immediate surroundings. J Natl Cancer Inst 88: 1234-1236.
Kazmierczak B, Wanschura S, Rosigkeit J, Meyer-Bolte K, Uschinsky K, Haupt
R, Schoenmakers EF, Bartnitzke S, Van de Ven WJ, Bullerdiek J (1995)
Molecular characterization of 12q14-15 rearrangements in three pulmonary
chondroid hamartomas. Cancer Res 55: 2497-2499.
Literatur
58
Kettunen E, Anttila S, Seppanen JK, Karjalainen A, Edgren H, Lindstrom I,
Salovaara R, Nissen AM, Salo J, Mattson K, Hollmen J, Knuutila S, Wikman H
(2004) Differentially expressed genes in nonsmall cell lung cancer: expression
profiling of cancer-related genes in squamous cell lung cancer. Cancer Genet
Cytogenet 149: 98-106.
Kim DH, Park YS, Park CJ, Son KC, Nam ES, Shin HS, Ryu JW, Kim DS, Park
CK, Park YE (1999) Expression of the HMGI(Y) gene in human colorectal cancer. Int
J Cancer 84: 376-380.
Kleihauer E, Kohne E (1978) Hämatologie: Physiologie, Pathologie, Klinik. Springer,
Berlin u.a.
Klein-Hessling S, Schneider G, Heinfling A, Chuvpilo S, Serfling E (1996) HMG
I(Y) interferes with the DNA binding of NF-AT factors and the induction of the
interleukin 4 promoter in T cells. Proc Natl Acad Sci U S A 93: 15311-15316.
Klein S, de Fougerolles AR, Blaikie P, Khan L, Pepe A, Green CD, Koteliansky
V, Giancotti FG (2002) Alpha 5 beta 1 integrin activates an NF-kappa B-dependent
program of gene expression important for angiogenesis and inflammation. Mol Cell
Biol 22: 5912-5922.
Kloetzer W, Kurzrock R, Smith L, Talpaz M, Spiller M, Gutterman J, Arlinghaus
R (1985) The human cellular abl gene product in the chronic myelogenous leukemia
cell line K562 has an associated tyrosine protein kinase activity. Virology 140: 230238.
Knapp DW, Waters DJ (1997) Naturally occurring cancer in pet dogs: important
models for developing improved cancer therapy for humans. Mol Med Today 3: 8-11.
Kokkola R, Andersson A, Mullins G, Ostberg T, Treutiger CJ, Arnold B, Nawroth
P, Andersson U, Harris RA, Harris HE (2005) RAGE is the major receptor for the
proinflammatory activity of HMGB1 in rodent macrophages. Scand J Immunol 61: 19.
Konopka JB, Watanabe SM, Witte ON (1984) An alteration of the human c-abl
protein in K562 leukemia cells unmasks associated tyrosine kinase activity. Cell 37:
1035-1042.
Kottickal LV, Sarada B, Ashar H, Chada K, Nagarajan L (1998) Preferential
expression of HMGI-C isoforms lacking the acidic carboxy terminal in human
leukemia. Biochem Biophys Res Commun 242: 452-456.
Kuniyasu H, Chihara Y, Takahashi T (2003) Co-expression of receptor for
advanced glycation end products and the ligand amphoterin associates closely with
metastasis of colorectal cancer. Oncol Rep 10: 445-448.
Lander HM, Tauras JM, Ogiste JS, Hori O, Moss RA, Schmidt AM (1997)
Activation of the receptor for advanced glycation end products triggers a p21(ras)dependent mitogen-activated protein kinase pathway regulated by oxidant stress. J
Biol Chem 272: 17810-17814.
Literatur
59
Langelotz C, Schmid P, Jakob C, Heider U, Wernecke KD, Possinger K, Sezer O
(2003) Expression of high-mobility-group-protein HMGI-C mRNA in the peripheral
blood is an independent poor prognostic indicator for survival in metastatic breast
cancer. Br J Cancer 88: 1406-1410.
Leek RD, Landers RJ, Harris AL, Lewis CE (1999) Necrosis correlates with high
vascular density and focal macrophage infiltration in invasive carcinoma of the
breast. Br J Cancer 79: 991-995.
Lehn DA, Elton TS, Johnson KR, Reeves R (1988) A conformational study of the
sequence specific binding of HMG-I (Y) with the bovine interleukin-2 cDNA. Biochem
Int 16: 963-971.
Li D, Lin HH, McMahon M, Ma H, Ann DK (1997) Oncogenic raf-1 induces the
expression of non-histone chromosomal architectural protein HMGI-C via a p44/p42
mitogen-activated protein kinase-dependent pathway in salivary epithelial cells. J Biol
Chem 272: 25062-25070.
Li G, Liu W, Frenz D (2006) Cisplatin ototoxicity to the rat inner ear: a role for HMG1
and iNOS. Neurotoxicology 27: 22-30.
Ligon AH, Moore SD, Parisi MA, Mealiffe ME, Harris DJ, Ferguson HL, Quade
BJ, Morton CC (2005) Constitutional rearrangement of the architectural factor
HMGA2: a novel human phenotype including overgrowth and lipomas. Am J Hum
Genet 76: 340-348.
Liu WM, Guerra-Vladusic FK, Kurakata S, Lupu R, Kohwi-Shigematsu T (1999)
HMG-I(Y) recognizes base-unpairing regions of matrix attachment sequences and its
increased expression is directly linked to metastatic breast cancer phenotype. Cancer
Res 59: 5695-5703.
Livak KJ, Flood SJ, Marmaro J, Giusti W, Deetz K (1995) Oligonucleotides with
fluorescent dyes at opposite ends provide a quenched probe system useful for
detecting PCR product and nucleic acid hybridization. PCR Methods Appl 4: 357-362.
Livak KJ, Schmittgen TD (2001) Analysis of relative gene expression data using
real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods 25: 402408.
MacEwen EG (1990) Spontaneous tumors in dogs and cats: models for the study of
cancer biology and treatment. Cancer Metastasis Rev 9: 125-136.
Manfioletti G, Giancotti V, Bandiera A, Buratti E, Sautiere P, Cary P, CraneRobinson C, Coles B, Goodwin GH (1991) cDNA cloning of the HMGI-C
phosphoprotein, a nuclear protein associated with neoplastic and undifferentiated
phenotypes. Nucleic Acids Res 19: 6793-6797.
Masciullo V, Baldassarre G, Pentimalli F, Berlingieri MT, Boccia A, Chiappetta
G, Palazzo J, Manfioletti G, Giancotti V, Viglietto G, Scambia G, Fusco A (2003)
HMGA1 protein over-expression is a frequent feature of epithelial ovarian
carcinomas. Carcinogenesis 24: 1191-1198.
Literatur
60
Mello JA, Lippard SJ, Essigmann JM (1995) DNA adducts of cisdiamminedichloroplatinum(II) and its trans isomer inhibit RNA polymerase II
differentially in vivo. Biochemistry 34: 14783-14791.
Meyer B, Krisponeit D, Junghanss C, Murua Escobar H, Bullerdiek J (2006a)
Quantitative expression analysis in peripheral blood of CML patients suggests
correlation of HMGA2 expression and WBC status. (in Vorbereitung)
Meyer B, Loeschke S, Schultze A, Weigel T, Sandkamp M, Goldmann T, Vollmer
E, Bullerdiek J (2006b) HMGA2 overexpression in non-small cell lung cancer. Mol
Carcinog (im Druck)
Meyer B, Murua Escobar H, Hauke S, Richter A, Winkler S, Rogalla P, Flohr AM,
Bullerdiek J, Nolte I (2004a) Expression pattern of the HMGB1 gene in sarcomas of
the dog. Anticancer Res 24: 707-710.
Meyer B, Murua Escobar H, Winkler S, Dolf G, Schelling C, Bullerdiek J, Nolte I
(2004b) Molecular characterization and mapping of the canine cyclin D1 (CCND1)
gene. Anim Genet 35: 413.
Mitola S, Belleri M, Urbinati C, Coltrini D, Sparatore B, Pedrazzi M, Melloni E,
Presta M (2006) Cutting edge: extracellular high mobility group box-1 protein is a
proangiogenic cytokine. J Immunol 176: 12-15.
Miyazawa J, Mitoro A, Kawashiri S, Chada KK, Imai K (2004) Expression of
mesenchyme-specific gene HMGA2 in squamous cell carcinomas of the oral cavity.
Cancer Res 64: 2024-2029.
Mosevitsky MI, Novitskaya VA, Iogannsen MG, Zabezhinsky MA (1989) Tissue
specificity of nucleo-cytoplasmic distribution of HMG1 and HMG2 proteins and their
probable functions. Eur J Biochem 185: 303-310.
Muller S, Ronfani L, Bianchi ME (2004) Regulated expression and subcellular
localization of HMGB1, a chromatin protein with a cytokine function. J Intern Med
255: 332-343.
Muller S, Scaffidi P, Degryse B, Bonaldi T, Ronfani L, Agresti A, Beltrame M,
Bianchi ME (2001) New EMBO members' review: the double life of HMGB1
chromatin protein: architectural factor and extracellular signal. Embo J 20: 43374340.
Murua Escobar H, Meyer B, Richter A, Becker K, Flohr AM, Bullerdiek J, Nolte I
(2003) Molecular characterization of the canine HMGB1. Cytogenet Genome Res
101: 33-38.
Murua Escobar H, Soller JT, Richter A, Meyer B, Winkler S, Bullerdiek J, Nolte I
(2005) "Best friends" sharing the HMGA1 gene: comparison of the human and canine
HMGA1 to orthologous other species. J Hered 96: 777-781.
Murua Escobar H, Soller JT, Richter A, Meyer B, Winkler S, Flohr AM, Nolte I,
Bullerdiek J (2004) The canine HMGA1. Gene 330: 93-99.
Literatur
61
Nagatani G, Nomoto M, Takano H, Ise T, Kato K, Imamura T, Izumi H, Makishima
K, Kohno K (2001) Transcriptional Activation of the Human HMG1 Gene in Cisplatinresistant Human Cancer Cells. Cancer Res 61: 1592-1597.
Nagpal S, Ghosn C, DiSepio D, Molina Y, Sutter M, Klein ES, Chandraratna RA
(1999) Retinoid-dependent recruitment of a histone H1 displacement activity by
retinoic acid receptor. J Biol Chem 274: 22563-22568.
Nissen MS, Langan TA, Reeves R (1991) Phosphorylation by cdc2 kinase
modulates DNA binding activity of high mobility group I nonhistone chromatin protein.
J Biol Chem 266: 19945-19952.
Nowell PC, Hungerford DA (1960) Chromosome studies on normal and leukemic
human leukocytes. J Natl Cancer Inst 25: 85-109.
Odero MD, Grand FH, Iqbal S, Ross F, Roman JP, Vizmanos JL, Andrieux J, Lai
JL, Calasanz MJ, Cross NC (2005) Disruption and aberrant expression of HMGA2
as a consequence of diverse chromosomal translocations in myeloid malignancies.
Leukemia 19: 245-252.
Okamoto T, Yamagishi S, Inagaki Y, Amano S, Koga K, Abe R, Takeuchi M,
Ohno S, Yoshimura A, Makita Z (2002) Angiogenesis induced by advanced
glycation end products and its prevention by cerivastatin. Faseb J 16: 1928-1930.
Palumbo R, Sampaolesi M, De Marchis F, Tonlorenzi R, Colombetti S, Mondino
A, Cossu G, Bianchi ME (2004) Extracellular HMGB1, a signal of tissue damage,
induces mesoangioblast migration and proliferation. J Cell Biol 164: 441-449.
Park IW, Wistuba, II, Maitra A, Milchgrub S, Virmani AK, Minna JD, Gazdar AF
(1999) Multiple clonal abnormalities in the bronchial epithelium of patients with lung
cancer. J Natl Cancer Inst 91: 1863-1868.
Parkin DM, Bray F, Ferlay J, Pisani P (2005) Global cancer statistics, 2002. CA
Cancer J Clin 55: 74-108.
Parkin DM, Pisani P, Lopez AD, Masuyer E (1994) At least one in seven cases of
cancer is caused by smoking. Global estimates for 1985. Int J Cancer 59: 494-504.
Parkkinen J, Raulo E, Merenmies J, Nolo R, Kajander EO, Baumann M, Rauvala
H (1993) Amphoterin, the 30-kDa protein in a family of HMG1-type polypeptides.
Enhanced expression in transformed cells, leading edge localization, and interactions
with plasminogen activation. J Biol Chem 268: 19726-19738.
Patel HS, Kantarjian HM, Bueso-Ramos CE, Medeiros LJ, Haidar MA (2005)
Frequent deletions at 12q14.3 chromosomal locus in adult acute lymphoblastic
leukemia. Genes Chromosomes Cancer 42: 87-94.
Peiper SC, Ashmun RA, Look AT (1988) Molecular cloning, expression, and
chromosomal localization of a human gene encoding the CD33 myeloid
differentiation antigen. Blood 72: 314-321.
Literatur
62
Pierantoni GM, Santulli B, Caliendo I, Pentimalli F, Chiappetta G, Zanesi N,
Santoro M, Bulrich F, Fusco A (2003) HMGA2 locus rearrangement in a case of
acute lymphoblastic leukemia. Int J Oncol 23: 363-367.
Pil PM, Chow CS, Lippard SJ (1993) High-mobility-group 1 protein mediates DNA
bending as determined by ring closures. Proc Natl Acad Sci U S A 90: 9465-9469.
Pil PM, Lippard SJ (1992) Specific binding of chromosomal protein HMG1 to DNA
damaged by the anticancer drug cisplatin. Science 256: 234-237.
Pinto AL, Lippard SJ (1985) Sequence-dependent termination of in vitro DNA
synthesis by cis- and trans-diamminedichloroplatinum (II). Proc Natl Acad Sci U S A
82: 4616-4619.
Reeck GR, Isackson PJ, Teller DC (1982) Domain structure in high molecular
weight high mobility group nonhistone chromatin proteins. Nature 300: 76-78.
Reeves R, Edberg DD, Li Y (2001) Architectural Transcription Factor HMGI(Y)
Promotes Tumor Progression and Mesenchymal Transition of Human Epithelial
Cells. Mol. Cell. Biol. 21: 575-594.
Reeves R, Nissen MS (1990) The A.T-DNA-binding domain of mammalian high
mobility group I chromosomal proteins. A novel peptide motif for recognizing DNA
structure. J Biol Chem 265: 8573-8582.
Rogalla P, Drechsler K, Frey G, Hennig Y, Helmke B, Bonk U, Bullerdiek J
(1996) HMGI-C expression patterns in human tissues. Implications for the genesis of
frequent mesenchymal tumors. Am J Pathol 149: 775-779.
Rogalla P, Drechsler K, Kazmierczak B, Rippe V, Bonk U, Bullerdiek J (1997)
Expression of HMGI-C, a member of the high mobility group protein family, in a
subset of breast cancers: relationship to histologic grade. Mol Carcinog 19: 153-156.
Rogalla P, Drechsler K, Schroder-Babo W, Eberhardt K, Bullerdiek J (1998)
HMGIC expression patterns in non-small lung cancer and surrounding tissue.
Anticancer Res 18: 3327-3330.
Rogalla P, Kazmierczak B, Flohr AM, Hauke S, Bullerdiek J (2000) Back to the
roots of a new exon--the molecular archaeology of a SP100 splice variant. Genomics
63: 117-122.
Rommel B, Rogalla P, Jox A, Kalle CV, Kazmierczak B, Wolf J, Bullerdiek J
(1997) HMGI-C, a member of the high mobility group family of proteins, is expressed
in hematopoietic stem cells and in leukemic cells. Leuk Lymphoma 26: 603-607.
Rouhiainen A, Kuja-Panula J, Wilkman E, Pakkanen J, Stenfors J, Tuominen
RK, Lepantalo M, Carpen O, Parkkinen J, Rauvala H (2004) Regulation of
monocyte migration by amphoterin (HMGB1). Blood 104: 1174-1182.
Literatur
63
Rowley JD (1973) Letter: A new consistent chromosomal abnormality in chronic
myelogenous leukaemia identified by quinacrine fluorescence and Giemsa staining.
Nature 243: 290-293.
Saccomanno G, Archer VE, Auerbach O, Saunders RP, Brennan LM (1974)
Development of carcinoma of the lung as reflected in exfoliated cells. Cancer 33:
256-270.
Santulli B, Kazmierczak B, Napolitano R, Caliendo I, Chiappetta G, Rippe V,
Bullerdiek J, Fusco A (2000) A 12q13 translocation involving the HMGI-C gene in
richter transformation of a chronic lymphocytic leukemia. Cancer Genet Cytogenet
119: 70-73.
Sarhadi V, Wikman H, Salmenkivi K, Kuosma E, Sioris T, Salo J, Karjalainen A,
Knuutila S, Anttila S (2006) Increased expression of high mobility group A proteins
in lung cancer. J Pathol
Scaffidi P, Misteli T, Bianchi ME (2002) Release of chromatin protein HMGB1 by
necrotic cells triggers inflammation. Nature 418: 191-195.
Schlueter C, Weber H, Meyer B, Rogalla P, Roser K, Hauke S, Bullerdiek J
(2005) Angiogenetic Signaling through Hypoxia: HMGB1: An Angiogenetic Switch
Molecule. Am J Pathol 166: 1259-1263.
Schoenmakers EF, Wanschura S, Mols R, Bullerdiek J, Van den Berghe H, Van
de Ven WJ (1995) Recurrent rearrangements in the high mobility group protein gene,
HMGI-C, in benign mesenchymal tumours. Nat Genet 10: 436-444.
Seyedin SM, Pehrson JR, Cole RD (1981) Loss of chromosomal high mobility group
proteins HMG1 and HMG2 when mouse neuroblastoma and Friend erythroleukemia
cells become committed to differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A 78: 5988-5992.
Sezer O, Langelotz C, Blohmer JU, Schmid P, Akrivakis K, Possinger K (2000)
Detection of HMGI-C in the peripheral blood of breast cancer patients. Eur J Cancer
36: 1944-1948.
Sgarra R, Diana F, Bellarosa C, Dekleva V, Rustighi A, Toller M, Manfioletti G,
Giancotti V (2003) During apoptosis of tumor cells HMGA1a protein undergoes
methylation: identification of the modification site by mass spectrometry. Biochemistry
42: 3575-3585.
Shtivelman E, Lifshitz B, Gale RP, Canaani E (1985) Fused transcript of abl and
bcr genes in chronic myelogenous leukaemia. Nature 315: 550-554.
Slama-Schwok A, Zakrzewska K, Leger G, Leroux Y, Takahashi M, Kas E,
Debey P (2000) Structural changes induced by binding of the high-mobility group I
protein to a mouse satellite DNA sequence. Biophys J 78: 2543-2559.
Solomon MJ, Strauss F, Varshavsky A (1986) A mammalian high mobility group
protein recognizes any stretch of six A.T base pairs in duplex DNA. Proc Natl Acad
Sci U S A 83: 1276-1280.
Literatur
64
Sornberger KS, Weremowicz S, Williams AJ, Quade BJ, Ligon AH, Pedeutour F,
Vanni R, Morton CC (1999) Expression of HMGIY in three uterine leiomyomata with
complex rearrangements of chromosome 6. Cancer Genet Cytogenet 114: 9-16.
Strichman-Almashanu LZ, Bustin M, Landsman D (2003) Retroposed copies of
the HMG genes: a window to genome dynamics. Genome Res 13: 800-812.
Strong MS, Incze J, Vaughan CW (1984) Field cancerization in the aerodigestive
tract--its etiology, manifestation, and significance. J Otolaryngol 13: 1-6.
Stros M, Dixon GH (1993) A retropseudogene for non-histone chromosomal protein
HMG-1. Biochim Biophys Acta 1172: 231-235.
Stros M, Stokrova J, Thomas JO (1994) DNA looping by the HMG-box domains of
HMG1 and modulation of DNA binding by the acidic C-terminal domain. Nucleic
Acids Res 22: 1044-1051.
Stros M, Vorlickova M (1990) Non-histone chromosomal protein HMG1 reduces the
histone H5-induced changes in c.d. spectra of DNA: the acidic C-terminus of HMG1
is necessary for binding to H5. Int J Biol Macromol 12: 282-288.
Taguchi A, Blood DC, del Toro G, Canet A, Lee DC, Qu W, Tanji N, Lu Y, Lalla E,
Fu C, Hofmann MA, Kislinger T, Ingram M, Lu A, Tanaka H, Hori O, Ogawa S,
Stern DM, Schmidt AM (2000) Blockade of RAGE-amphoterin signalling suppresses
tumour growth and metastases. Nature 405: 354-360.
Tamimi Y, van der Poel HG, Denyn MM, Umbas R, Karthaus HF, Debruyne FM,
Schalken JA (1993) Increased expression of high mobility group protein I(Y) in high
grade prostatic cancer determined by in situ hybridization. Cancer Res 53: 55125516.
Tamimi Y, van der Poel HG, Karthaus HF, Debruyne FM, Schalken JA (1996) A
retrospective study of high mobility group protein I(Y) as progression marker for
prostate cancer determined by in situ hybridization. Br J Cancer 74: 573-578.
Thanos D, Maniatis T (1995) Virus induction of human IFN beta gene expression
requires the assembly of an enhanceosome. Cell 83: 1091-1100.
Treff NR, Pouchnik D, Dement GA, Britt RL, Reeves R (2004) High-mobility group
A1a protein regulates Ras/ERK signaling in MCF-7 human breast cancer cells.
Oncogene 23: 777-785.
Vail DM, Kurzman ID, Glawe PC, O'Brien MG, Chun R, Garrett LD, Obradovich
JE, Fred RM, 3rd, Khanna C, Colbern GT, Working PK (2002) STEALTH
liposome-encapsulated cisplatin (SPI-77) versus carboplatin as adjuvant therapy for
spontaneously arising osteosarcoma (OSA) in the dog: a randomized multicenter
clinical trial. Cancer Chemother Pharmacol 50: 131-136.
Literatur
65
Wang H, Bloom O, Zhang M, Vishnubhakat JM, Ombrellino M, Che J, Frazier A,
Yang H, Ivanova S, Borovikova L, Manogue KR, Faist E, Abraham E, Andersson
J, Andersson U, Molina PE, Abumrad NN, Sama A, Tracey KJ (1999a) HMG-1 as
a late mediator of endotoxin lethality in mice. Science 285: 248-251.
Wang H, Vishnubhakat JM, Bloom O, Zhang M, Ombrellino M, Sama A, Tracey
KJ (1999b) Proinflammatory cytokines (tumor necrosis factor and interleukin 1)
stimulate release of high mobility group protein-1 by pituicytes. Surgery 126: 389392.
Webb M, Thomas JO (1999) Structure-specific binding of the two tandem HMG
boxes of HMG1 to four-way junction DNA is mediated by the A domain. J Mol Biol
294: 373-387.
Wen L, Huang JK, Johnson BH, Reeck GR (1989) A human placental cDNA clone
that encodes nonhistone chromosomal protein HMG-1. Nucleic Acids Res 17: 11971214.
Williams AJ, Powell WL, Collins T, Morton CC (1997) HMGI(Y) expression in
human uterine leiomyomata. Involvement of another high-mobility group architectural
factor in a benign neoplasm. Am J Pathol 150: 911-918.
Winkler S, Murua Escobar H, Meyer B, Simon D, Fork M, Baumgartner W,
Hedrich H-J, Nolte I, Bullerdiek J (2006) HMGA2 expression in canine prostatic
tissues. (eingereicht)
Wistuba, II, Behrens C, Virmani AK, Milchgrub S, Syed S, Lam S, Mackay B,
Minna JD, Gazdar AF (1999) Allelic losses at chromosome 8p21-23 are early and
frequent events in the pathogenesis of lung cancer. Cancer Res 59: 1973-1979.
Wood LJ, Maher JF, Bunton TE, Resar LM (2000a) The oncogenic properties of
the HMG-I gene family. Cancer Res 60: 4256-4261.
Wood LJ, Mukherjee M, Dolde CE, Xu Y, Maher JF, Bunton TE, Williams JB,
Resar LM (2000b) HMG-I/Y, a new c-Myc target gene and potential oncogene. Mol
Cell Biol 20: 5490-5502.
Xiang YY, Wang DY, Tanaka M, Suzuki M, Kiyokawa E, Igarashi H, Naito Y, Shen
Q, Sugimura H (1997) Expression of high-mobility group-1 mRNA in human
gastrointestinal adenocarcinoma and corresponding non-cancerous mucosa. Int J
Cancer 74: 1-6.
Xu Y, Sumter TF, Bhattacharya R, Tesfaye A, Fuchs EJ, Wood LJ, Huso DL,
Resar LM (2004) The HMG-I oncogene causes highly penetrant, aggressive
lymphoid malignancy in transgenic mice and is overexpressed in human leukemia.
Cancer Res 64: 3371-3375.
Yang H, Wang H, Czura CJ, Tracey KJ (2005) The cytokine activity of HMGB1. J
Leukoc Biol 78: 1-8.
Literatur
66
Yuan K, Hong TM, Chen JJ, Tsai WH, Lin MT (2004) Syndecan-1 up-regulated by
ephrinB2/EphB4 plays dual roles in inflammatory angiogenesis. Blood 104: 10251033.
Zaidi MR, Okada Y, Chada KK (2006) Misexpression of Full-length HMGA2 Induces
Benign Mesenchymal Tumors in Mice. Cancer Res 66: 7453-7459.
Zamble DB, Mu D, Reardon JT, Sancar A, Lippard SJ (1996) Repair of cisplatin-DNA adducts by the mammalian excision nuclease. Biochemistry 35: 10004-10013.
Zentner MD, Lin HH, Deng HT, Kim KJ, Shih HM, Ann DK (2001) Requirement for
high mobility group protein HMGI-C interaction with STAT3 inhibitor PIAS3 in
repression of alpha-subunit of epithelial Na+ channel (alpha-ENaC) transcription by
Ras activation in salivary epithelial cells. J Biol Chem 276: 29805-29814.
Zhou X, Benson KF, Ashar HR, Chada K (1995) Mutation responsible for the
mouse pygmy phenotype in the developmentally regulated factor HMGI-C. Nature
376: 771-774.
Zhou X, Benson KF, Przybysz K, Liu J, Hou Y, Cherath L, Chada K (1996)
Genomic structure and expression of the murine Hmgi-c gene. Nucleic Acids Res 24:
4071-4077.
Danksagung
8
67
Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Prof. Dr. J. Bullerdiek für die Überlassung des Themas
und die wissenschaftliche Betreuung dieser Arbeit.
Prof. Dr. L. Rensing danke ich für die Übernahme des Koreferates und für die
Organisation des Glasgow-Austausches 98/99.
Für das Bereitstellen von Probenmaterial und die Beantwortung fachlicher Fragen zu
klinischen Aspekten danke ich Prof. Dr. I. Nolte, Prof. Dr. C. Junghanß, Dr. C.-O.
Schulz und Dr. D. Krisponeit.
Darüber hinaus möchte ich mich bei allen Mitarbeitern des Zentrums für
Humangenetik für die gute Zusammenarbeit bedanken. Besonders danke ich Dr.
Hugo Murua Escobar (für die ständige Hilfsbereitschaft), Dipl.-Biol. Andreas Richter
(für mehr als nur Hilfe bei allen Computerfragen), Dipl.-Biol. Susanne (Susi) Winkler,
Dipl.-Biol. Jan Thies (ja, nein, vielleicht…äh doch nicht) Soller und dem Rest der
Hundegruppe für eine wirklich tolle Zeit in und außerhalb des ZHG.
Ebenso möchte ich mich bei den ehemaligen Mitarbeitern des ZHG Dr. Aljoscha
Flohr, Dr. Sven Hauke, Dr. Maren Meiboom, Dr. Piere Rogalla, Dr. Claudia Schlüter,
Dipl.-Biol. Sandra Ehser und Dipl.-Biol. Sabine Wallbaum ganz herzlich für die
Unterstützung und Freundschaft bedanken.
Außerdem danke ich meinen Freunden Birte (bis bald im Chat), Andi, Kiki, Thorsten,
Claudia B., Claudia L., Claudia R., Sandra (Bubi), Claudia H., Gjon und einigen mehr
dafür, dass sie immer für mich da waren und sind.
Nicht zuletzt möchte ich mich von ganzem Herzen bei meiner Familie bedanken, die
mir bei allen Höhen und Tiefen zur Seite gestanden hat und ohne deren
immerwährende Unterstützung diese Arbeit nicht möglich gewesen wäre.
Publikationsübersicht
9
68
Publikationsübersicht
In der folgenden Übersicht sind die der vorliegenden Arbeit zugrunde liegenden
Publikationen in der Reihenfolge, in der sie im Ergebnisteil erscheinen, aufgeführt:
I)
Becker K, Murua Escobar H, Richter A, Meyer B, Nolte I, Bullerdiek J (2003)
The canine HMGA1 gene maps to CFA 23. Anim Genet 34: 68-69
II)
Murua Escobar H, Soller JT, Richter A, Meyer B, Winkler S, Flohr AM, Nolte I,
Bullerdiek J (2004) The canine HMGA1. Gene 330: 93-99
III)
Murua Escobar H, Soller JT, Richter A, Meyer B, Winkler S, Bullerdiek J, Nolte I
(2005) "Best friends" sharing the HMGA1 gene: comparison of the human and
canine HMGA1 to orthologous other species. J Hered 96: 777-781
IV)
Murua Escobar H, Meyer B, Richter A, Becker K, Flohr AM, Bullerdiek J, Nolte I
(2003) Molecular characterization of the canine HMGB1. Cytogenet Genome
Res 101: 33-38
V)
Meyer B, Loeschke S, Schultze A, Weigel T, Sandkamp M, Goldmann T,
Vollmer E, Bullerdiek J (2006) HMGA2 overexpression in non-small cell lung
cancer. Molecular Carcinogenesis (im Druck)
VI)
Winkler S, Murua Escobar H, Meyer B, Loeschke S, Eberle N, Simon D,
Baumgartner W, Nolte I, Bullerdiek J (2006) HMGA2 expression in canine
prostatic tissues – a potential prognostic tool. (in Vorbereitung)
VII) Meyer B, Krisponeit D, Junghanss C, Neugebauer C, Murua Escobar H,
Bullerdiek J (2006) Quantitative expression analysis in peripheral blood of CML
patients: correlation of HMGA2 expression and WBC status. (in Vorbereitung)
Publikationsübersicht
69
VIII) Meyer B, Murua Escobar H, Hauke S, Richter A, Winkler S, Rogalla P, Flohr
AM, Bullerdiek J, Nolte I (2004) Expression pattern of the HMGB1 gene in
sarcomas of the dog. Anticancer Res 24: 707-710
IX)
Schlueter C, Weber H, Meyer B, Rogalla P, Röser K, Hauke S, Bullerdiek J
(2005) Angiogenetic signaling through hypoxia. HMGB1: an angiogenetic switch
molecule. Am J Pathol 166: 1259-1263
Folgende zusätzliche Publikationen erscheinen nicht im Ergebnisteil, sind jedoch der
vorliegenden Arbeit beigefügt:
X)
Meyer B, Murua Escobar H, Winkler S, Dolf G, Schelling C, Bullerdiek J, Nolte I
(2004) Molecular characterization and mapping of the canine cyclin D1
(CCND1) gene. Anim Genet 35: 413
XI)
Richter A, Murua Escobar H, Günther K, Meyer B, Winkler S, Dolf G, Schelling
C, Nolte I, Bullerdiek J (2004) The canine NRAS gene maps to CFA 17. Anim
Genet 35: 355-356
I)
The canine HMGA1 gene maps to CFA 23
Becker K, Murua Escobar H, Richter A, Meyer B, Nolte I, Bullerdiek J
Anim Genet 34: 68-69 (2003)
Eigenanteil:
- Erstellen der DNA-Sonde für BAC-Screening und BAC-Verifizierung
II)
The canine HMGA1
Murua Escobar H, Soller JT, Richter A, Meyer B, Winkler S, Flohr AM, Nolte I,
Bullerdiek J
Gene 330: 93-99 (2004)
Eigenanteil:
- Amplifizierung und Klonierung von cDNA-Fragmenten
- Herstellung der Northern Blot-Sonde
- Sequenzanalyse
Gene 330 (2004) 93 – 99
www.elsevier.com/locate/gene
The canine HMGA1
Hugo Murua Escobar a,b, Jan T. Soller a, Andreas Richter a, Britta Meyer a, Susanne Winkler a,
Aljoscha M. Flohr a, Ingo Nolte b, Jörn Bullerdiek a,*
b
a
Centre for Human Genetics, University of Bremen, Leobener Strasse ZHG, D-28359 Bremen, Germany
Small Animal Clinic, School of Veterinary Medicine, Bischofsholer Damm 15, D-30173 Hanover, Germany
Received 28 October 2003; received in revised form 19 December 2003; accepted 15 January 2004
Received by D.A. Tagle
Abstract
Due to the emerging advantages of numerous canine diseases as a genetic model for their human orthologs, the dog could join the mouse
as the species of choice to unravel genetic mechanisms, e.g. of cancer predisposition, development and progression. However, precondition
for such studies is the characterisation of the corresponding canine genes.
Human and murine HMGA1 non-histone proteins participate in a wide variety of cellular processes including regulation of inducible gene
transcription, integration of retroviruses into chromosomes, and the induction of neoplastic transformation and promotion of metastatic
progression of cancer cells.
Chromosomal aberrations affecting the human HMGA1 gene at 6p21 were described in several tumours like pulmonary chondroid
hamartomas, uterine leiomyomas, follicular thyroid adenomas and others. Over-expression of the proteins of HMGA1 is characteristic for
various malignant tumours suggesting a relation between high titer of the protein and the neoplastic phenotype.
In this study, we characterised the molecular structure of the canine HMGA1 cDNA, its splice variants and predicted proteins HMGA1a
and HMGA1b. Furthermore, we compared the coding sequence(s) (CDS) of both splice variants for 12 different breeds, screened them for
single nucleotide polymorphisms (SNPs) and characterised a basic expression pattern.
D 2004 Elsevier B.V. All rights reserved.
Keywords: High mobility group proteins; HMGA1; HMGA1a; HMGA1b; Comparative genomics
1. Introduction
As witnessed by a number of recent articles (Kuska,
1996; Kingman, 2000; Ostrander et al., 2000; Vail and
Abbreviations: A, adenosine; aa, amino acid(s); BAC, bacterial
artificial chromosome; bp, base pair(s); cDNA, DNA complementary to
RNA; CDS, coding sequence(s); CFA, Canis familiaris; Ci, Curie; D,
Dalton; dCTP, deoxycytidine 5V-triphosphate; DNA, deoxy-ribonucleic
acid; DNase, deoxyribonuclease; G, guanosine; GAPDH, glyceraldehyde3-phosphate dehydrogenase; HMG, high mobility group; HMGA1, high
mobility group protein A1; HMGA2, high mobility group protein A2;
HSA, Homo sapiens; M-MLV, Moloney murine leukemia virus; mRNA,
messenger ribonucleic acid; NCBI, National Center for Biotechnology
Information; ORF, open reading frame; PCR, polymerase chain reaction;
RACE, rapid amplification of cDNA ends; RNA, ribonucleic acid; SDS,
sodium dodecyl sulfate; SNP, single nucleotide polymorphism; UTR,
untranslated region.
* Corresponding author. Tel.: +49-421-2184239; fax: +49-4212184239.
E-mail address: [email protected] (J. Bullerdiek).
0378-1119/$ - see front matter D 2004 Elsevier B.V. All rights reserved.
doi:10.1016/j.gene.2004.01.009
MacEwen, 2000), a growing number of scientists predict
that human genetics will focus on the dog in this century
(Kuska, 1996). Due to the emerging advantages of numerous canine diseases as a genetic model for their human
counterparts, the dog could join the mouse as the species of
choice to unravel genetic mechanisms, e.g. of cancer predisposition, development and progression.
The proteins of the human HMGA1 gene HMGA1a and
HMGA1b are associated with various human diseases
including cancer. Due to the similarities of various human
and canine cancer entities, the characterisation of the canine
HMGA1 gene could open new fields for experimental and
therapeutic approaches.
Four human members of the HMGA protein family
are presently known: the HMGA1a, HMGA1b, HMGA1c
and HMGA2 proteins, which can modify chromatin
structure by bending DNA, thus influencing the transcription of a number of target genes. The human
HMGA1 gene on 6p21 encodes the well characterised
94
H. Murua Escobar et al. / Gene 330 (2004) 93–99
HMGA1a and HMGA1b proteins (formerly known as
HMGI and HMGY) derived by alternative splicing and
the barely characterised HMGA1c variant, while the
HMGA2 protein is encoded by a separate gene on
chromosome 12 (12q14 – 15) (for review, Reeves and
Beckerbauer, 2001).
Expression of HMGA1 is detectable only at very low
levels or is even absent in adult tissues, whereas it is
abundantly expressed in embryonic cells (Chiappetta et
al., 1996). In humans, 6p21 is often affected by aberrations leading to an up-regulation of HMGA1 in benign
mesenchymal tumours, e.g. lipomas, uterine leiomyomas,
pulmonary chondroid hamartomas and endometrial polyps
(Williams et al., 1997; Kazmierczak et al., 1998; Tallini
et al., 2000). Transcriptional activation due to a chromosomal alteration of HMGA1 is probably an early and
often even primary event of cancer development. In
contrast, HMGA1 expression in malignant epithelial
tumours seems to be a rather late event associated with
an aggressive behaviour of the tumours. Thus, an overexpression of HMGA1 was reported for a number of
malignancies including thyroid, prostatic, pancreatic, cervical and colorectal cancer (Tamimi et al., 1993; Chiappetta et al., 1995, 1998; Fedele et al., 1996; Bandiera et
al., 1998; Abe et al., 1999, 2000). The correlation
between HMGA expression and tumour aggressiveness
in these malignancies has led to the conclusion that
HMGA expression may present a powerful prognostic
molecular marker. The causal role of HMGA1 expression
in the progression of carcinomas has been elucidated by a
set of in vitro experiments involving HMGA1 sense and
antisense transfection assays (Reeves et al., 2001). An
experimental approach aimed at the down-regulation of
HMGA protein in tumours has been presented by Scala et
al. (2000) who were able to show that an HMGA1
antisense strategy using an adenoviral vector treatment
of tumours induced in athymic mice caused a drastic
reduction in tumour size.
Recently, the canine HMGA1 gene has been mapped to
CFA 23. This cytogenetic assignment indicates that the
canine HMGA1 gene does not map to a hotspot of
chromosomal breakpoints seen in canine tumours (Becker
et al., 2003). However, despite the emerging role of
HMGA1 gene expression in malignancies, the molecular
characterisation of the canine HMGA1 gene had not been
carried out before. The characterisation of the molecular
structure could permit new therapeutic approaches using
the dog as model organism.
In this study, we characterised the molecular structure
of the canine HMGA1 gene on cDNA level, its splice
variants and proteins HMGA1a and HMGA1b, and a basic
expression pattern. Furthermore, for 12 different canine
breeds the coding sequence(s) (CDS) of both splice variants were characterised and screened for SNPs to find out
if changes at protein level exist between the different
breeds.
2. Materials and methods
2.1. Tissues
The tissues used in this study were provided by the Small
Animal Clinic, Veterinary School, Hanover, Germany. The
breeds represented were Alsatian, Bull Terrier, Collie,
Dachshund, Doberman Pinscher, German Shorthaired Pointer, Golden Retriever, Jack Russell Terrier, Kangal, Munsterland, West Highland Terrier and Yorkshire Terrier. From
each breed up to three samples of testis tissue were taken
and used for analyses.
2.2. cDNA characterisation
Total RNA was isolated from 150 mg canine testis tissue
using TRIZOL LS (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) following the manufacturer’s protocol. To avoid genomic
DNA contamination a DNase digest of each sample was
performed using DNA-free (Ambion, Huntingdon, Cambridgeshire, UK). cDNA was synthesised using 3V-RACE
adaptor primer AP2 (AAGGATCCGTCGACATC(17)T), 5
Ag total RNA and M-MLV (Invitrogen) reverse transcriptase according to the manufacturer’s instructions. The
polymerase chain reactions (PCRs) for the molecular cloning of the cDNA were done using the primer pairs Ex1up
and Ex8lo (5V GCTCTTTTTAAGCTCCCCTGA 3V/5V
CTGTCCAGTCCCAGAAGGAA 3V) and primer pair
Ex8up and 3VUTRlo (5V AGGGCATCTCGCAGGAGTC
3V/5V ATTCAAGTAACTGCAAATAGGA 3V) which were
derived from human cDNA sequences (accession no.
X14957). The PCR products were separated on a 1.5%
agarose gel, recovered with QIAEX II (QIAGEN, Hilden,
Germany), cloned in pGEM-T Easy vector system (Promega, Madison, USA) and sequenced. The cDNA contig and
the homology alignments were created with Lasergene
software (DNAStar, Madison, USA) and various sequences
from the NCBI database (GenBank accession nos. X14957,
X14958, NM _ 002131, NM _ 145899, NM _ 145900,
NM_145901, NM_145902, NM_145903, NM_145904,
NM_145905).
2.3. Characterisation of splice variants
The splice variants HMGA1a and HMGA1b were
detected by amplifying a fragment spanning the CDS with
primer pair Up (5V CATCCCAGCCATCACTC 3V) and Lo
(5V GCGGCTGGTGTGCTGTGTAGTGTG 3V) using the
canine testis cDNA samples as template. The primer pair
was designed using the cDNA cloned as described in
Section 2.2. The obtained PCR products were separated
on a 4.0% agarose gel, recovered with QIAEX II (QIAGEN), cloned in pGEM-T Easy vector system (Promega)
and sequenced. The contigs and the homology alignments
were created with two sequences from the NCBI database
(GenBank accession nos. X14957, X14958).
H. Murua Escobar et al. / Gene 330 (2004) 93–99
2.4. CDS comparison between breeds
The CDS of both splice variants were characterised for
all breeds as described previously in Section 2.3. The
contigs and the homology alignments were created using
two sequences from the NCBI database (GenBank accession
nos. X14957, X14958). In case of single nucleotide
exchanges, the samples were sequenced again in both
forward and reverse direction. Exchanges causing no amino
acid (aa) substitution were not taken into account for further
analyses. For all samples with aa substitutions the initial
PCR was repeated and the exchange verified by sequencing
the product in both forward and reverse direction. If
possible, a restriction enzyme digestion was performed
additionally.
2.5. Protein sequences
The canine HMGA1a and HMGA1b protein sequences
were derived from the open reading frames (ORFs) of the
characterised cDNA sequences described previously in
Section 2.2. The protein homology alignments were created
with two sequences from the NCBI database (GenBank
accession nos. X14957, X14958).
2.6. Northern blot
Total RNAs were isolated from canine heart, lung,
muscle, kidney and spleen tissue using RNeasy system
(QIAGEN). An additional sample of total RNA was isolated
from canine heart tissue by TRIZOL LS acid guanidine
isothiocyanate – chloroform method (Invitrogen) in order to
figure out whether this isolation method would lead to any
difference in hybridisation. Further on poly A RNA was
purified from canine spleen total RNA with OLIGOTEX
(QIAGEN) and total RNA was prepared from human
cultured fibroblasts by RNeasy system (QIAGEN). Spleen
poly A RNA was placed on the blot in case that HMGA1
was not detectable in the total RNA samples.
For Northern Blot hybridisation, 20 Ag of total RNA
from each sample with the exception of 10 Ag of muscle and
3.6 Ag of spleen poly A RNA were separated on a 1.2%
denaturing agarose gel containing 0.65% formaldehyde.
RNAs were transferred onto Hybond-N+ positive nylon
membrane (Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany) by capillary blot.
A 489-bp cDNA fragment derived from the canine
HMGA1a sequence (exon 5/exon 8) served as a molecular
probe for hybridisation. The probe was generated by PCR
with the primer set Up and Lo (5V CATCCCAGCCATCACTC 3V/5V GCGGCTGGTGTGCTGTGTAGTGTG 3V)
using the cloned cDNA described in Section 2.2. Probe
labelling was performed by random primed labelling (Amersham Pharmacia Biotech) as described in the manufacturer’s
protocol with 50 ACi(a32P)dCTP (Amersham Pharmacia
Biotech). Purification of the labelled probe was performed
95
using Sephadex G-50 Nick Columns (Amersham Pharmacia
Biotech) and the probe was stored at 20 jC before use.
Using the PERFECTHYB PLUS hybridisation solution
(Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, USA) prehybridisation
was carried out for 30 min and hybridisation for 2.5 h at 68
jC. The membrane was washed for 5 min at room temperature in 2SSC/0.1% SDS, and twice for 20 min at 68 jC in
0.5SSC/0.1% SDS. Signals were visualised using a
STORM phosphorimager (Molecular Dynamics, Sunnyvale,
USA).
3. Results and discussion
3.1. The canine HMGA1 cDNA transcripts
For the human HMGA1 gene various transcripts were
described for both splicing variants (HMGA1a and
HMGA1b) that differ in their 5V-UTR. The characterisation
of the canine HMGA1 cDNAs revealed that the complete
canine HMGA1 cDNA spans six exons and codes for two
splicing variants HMGA1a with 1836 bp and HMGA1b with
1803 bp which are similar to the human transcripts
(HMGA1a GenBank accession no. AY366390 and
HMGA1b GenBank accession no. AY366392). The exon
structure, the UTRs and the ORFs of both splice variants
were defined and their homologies to their human counterparts analysed (Fig. 1, Table 1). The splicing variants
showed the ‘‘typical’’ 33 bp gap which is conserved across
various species such as human, mouse, hamster and rat
(GenBank accession nos. BC013455, NM _ 016660,
A7193763, NM_139327, A7511040). The homology of
the canine cDNAs to their human counterparts is 80.6%
for both splice variants. The 5V-UTR, CDS and the 3V-UTR
showed homologies of 95.6%, 95.1% and 74,7%, respectively (Table 1). Homologies of the canine CDS with the
CDS from mouse, hamster and rat on nucleotide level vary
from 90.4% to 93.1%. The cDNA sequences were submitted
to the NCBI database: HMGA1a, GenBank accession no.
AY366390 and HMGA1b, GenBank accession no.
AY366392.
3.2. The canine HMGA1a and HMGA1b proteins
The canine HMGA1a and HMGA1b protein sequences
were deduced from the respective cDNA sequences. The
canine HMGA1a protein is a 107-amino acid molecule with
a calculated weight of 11,674.97 D and HMGA1b a 96amino acid molecule with a calculated weight of 10,677.85
D (Fig. 2). Homology comparison to the human counterparts (GenBank accession nos. P17096, X14957) showed
100% homology of the molecules including the three ‘‘AThooks’’ and the acidic carboxy-terminal domain.
Comparison of the canine and human HMGA1a and
HMGA1b proteins with the described mouse, rat and
hamster molecules showed aa changes in positions 5, 34,
96
H. Murua Escobar et al. / Gene 330 (2004) 93–99
Fig. 1. Structure of the canine HMGA1a and HMGA1b transcripts and partial genomic structure.
69, 75 and 78 of HMGA1a and positions 5, 34, 58, 64 and
67 of HMGA1b, respectively (Fig. 2) (Johnson et al., 1988,
1989; Friedmann et al., 1993; Aldrich et al., 1999; Sgarra et
al., 2000; Strausberg et al., 2002; Sgarra et al., 2003).
According to the definition of the AT-hooks (HMGA1a: I
aa 21 – 31, II aa 53 –63, III aa 78– 89; HMGA1b: I aa 21–
31, II aa 42– 52, III aa 67 – 78) by Reeves and Nissen (1990)
and Reeves (2000), none but the aa exchange at position 78
Table 1
Detailed analysis of the canine HMGA1a and HMGA1b cDNA
Element of canine
HMGA1 cDNAs
Size in bp
Homology to human
counterpart in %
Total cDNA HMGA1a
Total cDNA HMGA1b
5V-UTR
CDS HMGA1a
CDS HMGA1b
3V-UTR
Exon 1
Exon 2
Exon 5 HMGA1a
Exon 5 HMGA1b
Exon 6
Exon 7
Exon 8
1836
1803
231
324
291
1332
94
114
179
146
84
51
1386
80.6
80.6
95.6
95.1
95.1
74.7
97.8
96.5
93.9
93.9
96.4
94.1
75.4
Homology comparison of the cDNA elements of the canine HMGA1 to its
human counterpart (characterisation of the UTRs, the ORF and the exon
sizes).
(HMGA1a) or 67 (HMGA1b), respectively, do affect the
AT-hooks in either species. The exchange at position 78
leads to a difference in the third AT-hook of mouse and
hamster when compared to the other species. According to
the definition of the AT-hooks (HMGA1a: I aa 23– 31, II aa
55– 70, III aa 81– 89; HMGA1b: I aa 23 – 31, II aa 44– 59,
III aa 70 – 78) by Huth et al. (1997), this aa exchange does
not affect the third AT-hook. Following this definition, the
second AT-hook is affected by the aa exchange at position
69 (HMGA1a) or 58 (HMGA1b), respectively.
The canine protein sequences were submitted to the
NCBI database with GenBank accession nos. HMGA1a
AY366390 and HMGA1b AY366392.
Due to the identical structure of the canine HMGA
proteins to the respective human molecule, therapeutic
approaches applied in dogs could be more suitable in terms
of transferability for the development of human therapies
than to approaches tested in other organisms.
3.3. HMGA1a and HMGA1b CDS comparison between
canine breeds
For twelve different canine breeds the splicing variants
HMGA1a and HMGA1b were detected by amplification of a
fragment spanning the CDS using the canine testis cDNA
samples as template. The comparison of the characterised
protein coding sequences for these twelve canine breeds
H. Murua Escobar et al. / Gene 330 (2004) 93–99
97
Fig. 2. Comparison of the canine, human, mouse, rat and hamster HMGA1a and HMGA1b proteins.
revealed one amino acid change in a single breed. Nucleotide exchanges causing no amino acid substitution were not
taken into account in further analyses. Sample 2 (Teckel)
showed in its HMGA1b transcript a nucleotide transition
from A to G at the first base of codon 64 leading to an aa
replacement from threonine to alanine and a new restriction
recognition site for AluI causing four (58, 100, 158 and 176
bp) instead of three fragments (58, 100 and 334 bp) to
appear in an AluI digest. (data not shown). The substitution
was missing in the corresponding HMGA1a transcript of the
dog suggesting a heterozygous genotype. A possible PCR
artifact seems rather unlikely since the nucleotide transition
was verified as described in Section 2.4. The CDS cDNA
sequences of the twelve breeds were submitted to the NCBI
database with GenBank accession nos. AY363606,
AY 3 6 3 6 0 5 , AY 3 6 3 6 0 7 , AY 3 6 3 6 0 4 , AY 3 6 3 6 0 8 ,
AY 3 6 3 6 1 0 , AY 3 6 3 6 0 9 , AY 3 6 3 6 0 0 , AY 3 6 3 6 0 3 ,
AY 3 6 3 5 9 9 , AY 3 6 3 6 0 1 , AY 3 6 3 6 0 2 , AY 3 6 3 9 9 4 ,
AY 3 6 3 9 9 5 , AY 3 6 3 6 11 , AY 3 6 3 9 9 9 , AY 3 6 4 0 0 0 ,
AY 3 6 4 0 0 2 , AY 3 6 4 0 0 1 , AY 3 6 3 9 9 8 , AY 3 6 3 9 9 6 ,
AY363997, AY364003.
probe. Except for the kidney total RNA and one of two
heart samples (Trizol method) all total RNA samples
showed a weak signal of approximately 1.8 kb (Fig. 3,
Trizol sample not shown), while the poly A RNA spleen
sample revealed a distinct signal. After stripping, rehybridisation with a canine GAPDH probe showed signals
corresponding to approximately 1.3 kb in all but the Trizol
method (data not shown) samples, indicating a degradation
of the Trizol-prepared RNA.
In humans, HMGA1 expression in malignant epithelial
tumours seems to be associated with an aggressive behaviour of the tumours. Over-expression of HMGA1 was
reported for a number of malignancies including thyroid,
prostatic, pancreatic, uterus cervical and colorectal cancer
(Tamimi et al., 1993; Chiappetta et al., 1995, 1998; Fedele
et al., 1996; Bandiera et al., 1998; Abe et al., 1999, 2000).
The correlation between HMGA expression and tumour
3.4. Canine HMGA1 expression analysis
Expression of human HMGA1 is detectable at very low
levels or is even absent in adult tissues whereas it is
abundantly expressed in embryonic cells (Chiappetta et
al., 1996). To elucidate a basic HMGA1 gene expression
pattern in dogs, a canine Northern blot was generated
containing total RNA from canine spleen, heart, lung,
muscle and kidney tissue samples. In order to detect a
possible low level expression of HMGA1 as reported in
adult human tissues, a poly A RNA sample from canine
spleen was additionally added to the blot. Hybridisation was
performed with a a32P-labelled canine HMGA1a cDNA
Fig. 3. Northern blot showing 1.8-kb HMGA1 and 1.3-kb GAPDH
transcripts. Lanes: (1) canine kidney total RNA, (2) canine spleen total
RNA, (3) canine spleen poly A RNA, (4) canine heart total RNA, (5) canine
lung total RNA, (6) canine muscle total RNA and (7) human fibroblasts
total RNA.
98
H. Murua Escobar et al. / Gene 330 (2004) 93–99
aggressiveness in some of these malignancies has led to the
conclusion that HMGA expression may present a powerful
prognostic molecular marker.
So far no studies analysing the HMGA1 expression
pattern in canine tumours have been carried out. Since these
tumours occur spontaneously in dogs as well as in humans a
canine in vivo analysing system could have significant value
for research and drug development.
The causal role of HMGA1 expression in the progression
of carcinomas has been elucidated by a set of in vitro
experiments involving HMGA1 sense and antisense transfection assays (Wood et al., 2000a,b; Reeves et al., 2001). A
proof of concept for a therapy aimed at the down-regulation
of HMGA protein in tumours has been presented by Scala et
al. (2000) who were able to show that an HMGA1 antisense
strategy using an adenoviral vector treatment of tumours
induced in athymic mice caused a drastic reduction in
tumour size.
Due to the similarities of human and canine tumours, the
transfer of such experimental approaches could benefit
cancer research in either species.
The comprehension of the canine HMGA1 gene and its
gene products could be the precondition for future new
experimental approaches and for evaluating the canine gene
product as potential target for therapeutic strategies using
the dog as model system.
References
Abe, N., Watanabe, T., Sugiyama, M., Uchimura, H., Chiappetta, G.,
Fusco, A., Atomi, Y., 1999. Determination of high mobility group
I(Y) expression level in colorectal neoplasias: a potential diagnostic
marker. Cancer Res. 59, 1169 – 1174.
Abe, N., Watanabe, T., Masaki, T., Mori, T., Sugiyama, M., Uchimura, H.,
Fujioka, Y., Chiappetta, G., Fusco, A., Atomi, Y., 2000. Pancreatic duct
cell carcinomas express high levels of high mobility group I(Y) proteins. Cancer Res. 60, 3117 – 3122.
Aldrich, T.L., Reeves, R., Lee, C.C., Thomas, J.N., Morris, A.E., 1999.
HMG-I (Y) proteins implicated in amplification of CHO cell DNA.
Unpublished, GenBank Accession No. AF193763.
Bandiera, A., Bonifacio, D., Manfioletti, G., Mantovani, F., Rustighi, A.,
Zanconati, F., Fusco, A., Di Bonito, L., Giancotti, V., 1998. Expression
of HMGI (Y) proteins in squamous intraepithelial and invasive lesions
of the uterine cervix. Cancer Res. 58, 426 – 431.
Becker, K., Escobar, H.M., Richter, A., Meyer, B., Nolte, I., Bullerdiek,
J., 2003. The canine HMGA1 gene maps to CFA 23. Anim. Genet. 34,
68 – 69.
Chiappetta, G., Bandiera, A., Berlingieri, M.T., Visconti, R., Manfioletti,
G., Battista, S., Martinez-Tello, F.J., Santoro, M., Giancotti, V., Fusco,
A., 1995. The expression of the high mobility group HMGI (Y)
proteins correlates with the malignant phenotype of human thyroid
neoplasias. Oncogene 10, 1307 – 1314.
Chiappetta, G., Avantaggiato, V., Visconti, R., Fedele, M., Battista, S.,
Trapasso, F., Merciai, B.M., Fidanza, V., Giancotti, V., Santoro, M.,
Simeone, A., Fusco, A., 1996. High level expression of the HMGI
(Y) gene during embryonic development. Oncogene 13, 2439 – 2446.
Chiappetta, G., Tallini, G., De Biasio, M.C., Manfioletti, G., MartinezTello, F.J., Pentimalli, F., de Nigris, F., Mastro, A., Botti, G., Fedele,
M., Berger, N., Santoro, M., Giancotti, V., Fusco, A., 1998. Detection of
high mobility group I HMGI (Y) protein in the diagnosis of thyroid
tumors: HMGI (Y) expression represents a potential diagnostic indicator of carcinoma. Cancer Res. 58, 4193 – 4198.
Fedele, M., Bandiera, A., Chiappetta, G., Battista, S., Viglietto, G., Manfioletti, G., Casamassimi, A., Santoro, M., Giancotti, V., Fusco, A.,
1996. Human colorectal carcinomas express high levels of high mobility group HMGI (Y) proteins. Cancer Res. 56, 1896 – 1901.
Friedmann, M., Holth, L.T., Zoghbi, H.Y., Reeves, R., 1993. Organization,
inducible-expression and chromosome localization of the human HMGI (Y) nonhistone protein gene. Nucleic Acids Res. 21, 4259 – 4267.
Huth, J.R., Bewley, C.A., Nissen, M.S., Evans, J.N., Reeves, R., Gronenborn, A.M., Clore, G.M., 1997. The solution structure of an HMG-I
(Y)-DNA complex defines a new architectural minor groove binding
motif. Nat. Struct. Biol. 4, 657 – 665.
Johnson, K.R., Lehn, D.A., Elton, T.S., Barr, P.J., Reeves, R., 1988. Complete murine cDNA sequence, genomic structure, and tissue expression
of the high mobility group protein HMG-I (Y). J. Biol. Chem. 263,
18338 – 18342.
Johnson, K.R., Lehn, D.A., Reeves, R., 1989. Alternative processing of
mRNAs encoding mammalian chromosomal high-mobility-group proteins HMG-I and HMG-Y. Mol. Cell. Biol. 9, 2114 – 2123.
Kazmierczak, B., Dal Cin, P., Wanschura, S., Borrmann, L., Fusco, A., Van
den Berghe, H., Bullerdiek, J., 1998. HMGIY is the target of 6p21.3
rearrangements in various benign mesenchymal tumors. Genes Chromosomes Cancer 23, 279 – 285.
Kingman, S., 2000. Painting a brighter future for dogs and humans. Drug
Discov. Today 5, 127 – 128.
Kuska, B., 1996. Sit, DNA, sit: cancer genetics going to the dogs. J. Natl.
Cancer Inst. 91, 204 – 206.
Ostrander, E.A., Galibert, F., Patterson, D.F., 2000. Canine genetics comes
of age. Trends Genet. 16, 117 – 124.
Reeves, R., 2000. Structure and function of the HMGI (Y) family of
architectural transcription factors. Environ. Health Perspect. 108
(Suppl. 5), 803 – 809.
Reeves, R., Beckerbauer, L., 2001. HMGI (Y) proteins: flexible regulators
of transcription and chromatin structure. Biochim. Biophys. Acta 1519,
13 – 29.
Reeves, R., Nissen, M.S., 1990. The A.T-DNA-binding domain of mammalian high mobility group I chromosomal proteins. A novel peptide
motif for recognizing DNA structure. J. Biol. Chem. 265, 8573 – 8582.
Reeves, R., Edberg, D.D., Li, Y., 2001. Architectural transcription factor
HMGI (Y) promotes tumor progression and mesenchymal transition of
human epithelial cells. Mol. Cell. Biol. 21, 575 – 594.
Scala, S., Portella, G., Fedele, M., Chiappetta, G., Fusco, A., 2000. Adenovirus-mediated suppression of HMGI (Y) protein synthesis as potential therapy of human malignant neoplasias. Proc. Natl. Acad. Sci.
U. S. A. 97, 4256 – 4261.
Sgarra, R., Diana, F., Bellarosa, C., Rustighi, A., Toller, M., Manfioletti,
G., Giancotti, V., 2000: Increase of HMGA1a protein methylation is a
distinctive characteristic of tumor cells induced to apoptosis. Unpublished, GenBank Accession No. AF511040.
Sgarra, R., Diana, F., Bellarosa, C., Dekleva, V., Rustighi, A., Toller, M.,
Manfioletti, G., Giancotti, V., 2003. During apoptosis of tumor cells
HMGA1a protein undergoes methylation: identification of the modification site by mass spectrometry. Biochemistry 42, 3575 – 3585.
Strausberg, R.L., et al., 2002. Generation and initial analysis of more than
15,000 full-length human and mouse cDNA sequences. Proc. Natl.
Acad. Sci. U. S. A. 99, 16899 – 16903.
Tallini, G., Vanni, R., Manfioletti, G., Kazmierczak, B., Faa, G., Pauwels,
P., Bullerdiek, J., Giancotti, V., Van Den Berghe, H., Dal Cin, P.,
2000. HMGI-C and HMGI (Y) immunoreactivity correlates with cytogenetic abnormalities in lipomas, pulmonary chondroid hamartomas,
endometrial polyps, and uterine leiomyomas and is compatible with
rearrangement of the HMGI-C and HMGI (Y) genes. Lab. Invest. 80,
359 – 369.
Tamimi, Y., van der Poel, H.G., Denyn, M.M., Umbas, R., Karthaus, H.F.,
Debruyne, F.M., Schalken, J.A., 1993. Increased expression of high
H. Murua Escobar et al. / Gene 330 (2004) 93–99
mobility group protein I(Y) in high grade prostatic cancer determined
by in situ hybridization. Cancer Res. 53, 5512 – 5516.
Vail, D.M., MacEwen, E.G., 2000. Spontaneously occurring tumors of
companion animals as models for human cancer. Cancer Invest. 18,
781 – 792.
Williams, A.J., Powell, W.L., Collins, T., Morton, C.C., 1997. HMGI (Y)
expression in human uterine leiomyomata. Involvement of another
99
high-mobility group architectural factor in a benign neoplasm. Am. J.
Pathol. 150, 911 – 918.
Wood, L.J., Maher, J.F., Bunton, T.E., Resar, L.M., 2000a. The oncogenic
properties of the HMG-I gene family. Cancer Res. 60, 4256 – 4261.
Wood, L.J., Mukherjee, M., Dolde, C.E., Xu, Y., Maher, J.F., Bunton, T.E.,
Williams, J.B., Resar, L.M., 2000b. HMG-I/Y, a new c-Myc target gene
and potential oncogene. Mol. Cell. Biol. 20, 5490 – 5502.
III)
"Best friends" sharing the HMGA1 gene: comparison of the
human and canine HMGA1 to orthologous other species
Murua Escobar H, Soller JT, Richter A, Meyer B, Winkler S, Bullerdiek J, Nolte I
J Hered 96: 777-781 (2005)
Eigenanteil:
- Amplifizierung und Klonierung von cDNA-Fragmenten
- Herstellung der Northern Blot-Sonde
- Sequenzanalyse
Journal of Heredity 2005:96(7):777–781
doi:10.1093/jhered/esi083
Advance Access publication June 15, 2005
ª The American Genetic Association. 2005. All rights reserved.
For Permissions, please email: [email protected].
‘‘Best Friends’’ Sharing the HMGA1
Gene: Comparison of the Human and
Canine HMGA1 to Orthologous Other
Species
H. MURUA ESCOBAR, J. T. SOLLER, A. RICHTER, B. MEYER, S. WINKLER, J. BULLERDIEK,
AND
I. NOLTE
From the Small Animal Clinic, School of Veterinary Medicine, Bischofsholer Damm 15, 30137 Hanover, Germany
(Murua Escobar, Soller, and Nolte), and Center for Human Genetics, University of Bremen, Leobener Str ZHG,
28359 Bremen, Germany (Meyer, Winkler, Richter, and Bullerdiek).
Address correspondence to Ingo Nolte at the address above, or e-mail: [email protected].
Abstract
HMGA1 nonhistone proteins are reported to participate in various cellular processes including regulation of inducible gene
transcription, integration of retroviruses into chromosomes, and the induction of neoplastic transformation and promotion
of metastatic progression of cancer cells. Overexpression of HMGA1 was shown to be characteristic for various malignant
tumors, suggesting a relation between the neoplastic phenotype and a high titer of the protein. Also chromosomal
aberrations affecting the human HMGA1 gene at 6p21 were described in several tumors, e.g., uterine leiomyomas,
pulmonary chondroid hamartomas, and follicular thyroid adenomas. We characterize the molecular structure of the canine
HMGA1 cDNA, its splice variants, and predicted proteins HMGA1a and HMGA1b. Furthermore, we compared the CDS
of both splice variants for 12 different breeds, screened them for SNPs, characterised a basic expression pattern, and
mapped the gene via FISH. Additionally, we compared the known human, canine, murine, rat, hamster, bovine, pig, Xenopus,
and chicken HMGA1 transcripts.
High mobility group proteins named according to their
characteristic mobility in gel electrophoresis are small
chromatin-associated nonhistone proteins, which can be
subdivided into three families because of their functional
sequence motives: the HMGA (functional motive ‘‘AThook’’), HMGB (functional motive ‘‘HMG-box’’), and
HMGN (functional motive ‘‘nucleosomal binding domain’’)
protein families (for review see Bustin 2001). By binding
DNA with their functional motives, the HMG proteins
induce DNA conformation changes influencing the binding
of various transcription factors and thus taking indirect
influence on transcription regulation as so-called architectural transcription factors (for detail see Bustin and Reeves
1996).
The proteins HMGA1a, HMGA1b, and HMGA2 of the
human HMGA genes are associated with various human
diseases, including cancer. Members of the human HMGA1
protein family presently known are HMGA1a and
HMGA1b, which by modifying chromatin structure take
influence on transcription and up- and down-regulation of
a number of target genes, for example, ATF2, IFN-b, NFjB, Interleukin-2 receptor, E-Selektin, Interleukin-4, Interfeone-A,
ERCC1, and Cyclin A (Chuvpilo et al. 1993; Du and Maniatis
1994; Thanos and Maniatis 1992; Lewis et al. 1994; John
et al. 1995, 1996; Klein-Hessling et al. 1996; Yie et al. 1997;
Borrmann et al. 2003).
The expression pattern of the HMGA genes in human
adult tissues shows only very low levels or even absent
expression, whereas it is abundantly expressed in embryonic
cells (Rogalla et al. 1996; Chiappetta et al. 1996). In humans
the HMGA1 gene is located on HSA 6p21, a region often
affected by aberrations leading to an up-regulation of this
gene in various benign mesenchymal tumors, for example,
endometrial polyps, lipomas, pulmonary chondroid hamartomas, and uterine leiomyomas (Williams et al. 1997;
Kazmierczak et al. 1998; Tallini et al. 2000). This suggests
that transcriptional activation due to these chromosomal
alterations is probably an early and often even primary event
of cancer development. Recently, the canine HMGA1 gene
has been mapped to CFA 23. This cytogenetic assignment
777
Journal of Heredity 2005:96(7)
Figure 1. Species comparison of HMGA1a and HMGA1b transcripts. Exon 5 is enlarged by factor fife for better
visualization.
indicates that the canine HMGA1 gene does not map to
a hotspot of chromosomal breakpoints seen in canine
tumours (Becker et al. 2003).
778
HMGA1 expression in human malignant epithelial
tumors is reported to be associated with an aggressive
behavior of the tumors. Overexpression of HMGA1 was
Murua Escobar et al. Human and Canine HMGA1 Gene
detected in a number of malignancies, including thyroid,
prostatic, pancreatic, uterine cervical, and colorectal cancer
(Tamimi et al. 1993; Chiappetta et al. 1995; Fedele et al. 1996;
Bandiera et al. 1998; Abe et al. 1999, 2000; Czyz et al. 2004;
Takaha et al. 2004). The correlation between HMGA expression and tumor aggressiveness in some of these malignancies
has led to the conclusion that HMGA expression may present a powerful diagnostic and prognostic molecular marker.
Due to the similarities of various human and canine
cancer entities, the characterization of the canine HMGA
genes could open new fields for experimental and
therapeutic approaches. We recently characterized the canine
HMGA1a and HMGA1b transcripts, deduced their proteins,
evaluated them as targets for therapeutic approaches, and
characterized a basic expression pattern in healthy tissues
(Murua Escobar et al. 2004). Sequence comparison showed
a 100% identity between the human and canine protein
molecules. Although both species showed the identical two
proteins, the number of found cDNA transcripts varies. For
the human HMGA1 seven different cDNA transcripts
(Figure 1: SPV1–SPV7) were described (Johnson et al. 1988)
of which SPV1 and SPV2 are the commonly found variants.
The characterized dog variants showed the same composition structure as the mentioned human variants SPV1 and
SPV2. Canine counterparts of the human transcript variants
SPV3–SPV7 could not be detected using polymerase chain
reaction (PCR) amplification approaches. Comparison of the
human cDNAs to the known transcripts of other species
shows that the dog is the only species showing similar
transcripts to those commonly found in humans referring to
exon structure and distribution. In detail, human and dog are
the only known species showing the presence of exon one
and two in both HMGA1a or HMGA1b transcripts,
respectively (Figure 1). Both isoforms (HMGA1a and
HMGA1b) were found in mouse (BC013455, NM_016660),
hamster (AF1893762, AF193763), and rat (NM_139327,
AF511040), of which for the last two species the described
transcripts are limited to the protein coding sequences and
the mouse transcripts show either exon one (HMGA1a) or
exon two (HMGA1b) in the respective transcripts (Figure 1).
For the HMGA1 transcripts of horse (CD535395), pig
(AU296646), chicken (AY303673), bovine (CK951567), and
Xenopus (BC084025), either the HMGA1a or the HMGA1b
isoform are currently (2004) present at the NCBI database.
For CDS (coding sequence) and protein identity analysis, we
used the described sequences and deduced, if necessary, the
corresponding parts for analyses. The in silico analyses were
done using Lasergene software programs (DNASTAR,
Madison). The coding sequence identities of the canine
HMGA1 transcripts to the sequences from other species
vary between 72.0% (chicken AY303673) and 95.7% (pig
AU296646, horse CD535395) (Table 1). Identity comparison
of the deduced proteins revealed similarities between 69.7%
(chicken AY303673) and 100.0% (human: P17096, X14957,
horse CD535395) (Table 1). The proteins of all species
showed strong conservation in the functional AT-Hook
DNA binding domains. Common for all species analysed is
that the protein coding sequences are composed of four
Table 1. HMGA1 identity comparison (CDS and protein) of
various species to the canine transcripts and proteins
Identity (%) to C. familiaris
Species
Isoform
CDS
Protein
Human (H. sapiens)
Human (H. sapiens)
Mouse (M. musculus)
Mouse (M. musculus)
Rat (R. norvegicus)
Rat (R. norvegicus)
Hamster (C. griseus)
Hamster (C. griseus)
Pig (S. scrofa)
Horse (E. caballus)
Cattle (B. taurus)
Chicken (G. gallus)
African clawed frog
(X. laevis)
HMGA1a
HMGA1b
HMGA1a
HMGA1b
HMGA1a
HMGA1b
HMGA1a
HMGA1b
HMGA1a
HMGA1b
HMGA1b
HMGA1b
95.1
95.1
90.1
90.1
90.4
90.4
92.6
92.6
95.7
95.7
94.4
72.0
100.0
100.0
96.3
96.9
96.3
95.8
98.1
97.9
99.1
100.0
99.0
69.7
HMGA1a
90.4
97.2
exons (Figure 1). The described proteins of the different
species are composed of 107 amino acids and 96 amino
acids, respectively, for HMGA1a and HMGA1b. Also
common for those species where both protein isoforms
were described is that the difference between the splicing
variants is the ‘‘typical’’ 33-bp deletion in the HMGA1b
transcripts resulting in the lack of 11 amino acids.
Previous results describing the comparison of the protein
coding sequences in 12 canine breeds revealed that the
mentioned deletion is also conserved in the analyzed breeds.
SNP screening in these breeds resulted in detection of oneamino-acid change in a single breed. A Teckel showed
a nucleotide transition from A to G at the first base of codon
64 in its HMGA1b transcript leading to an amino acid
replacement from threonine to alanine (Murua Escobar et al.
2004). As far as we know, no other canine HMGA1
polymorphisms have been described. Summarizing the
HMGA1 transcript and protein comparison data emphasizes
the relevance of the canine species as a model organism for
the research and development of therapeutic approaches for
human disorders.
Due to the mentioned properties of the HMGA1 gene,
its proteins HMGA1a/HMGA1b, and its reported role in
development of cancer, future studies targeting HMGA1
proteins could be of significant value.
Acknowledgments
This paper was delivered at the 2nd International Conference on the
‘‘Advances in Canine and Feline Genomics: Comparative Genome Anatomy
and Genetic Disease,’’ Universiteit Utrecht, Utrecht, The Netherlands,
October 14–16, 2004.
References
Abe N, Watanabe T, Masaki T, Mori T, Sugiyama M, Uchimura H, Fujioka Y,
Chiappetta G, Fusco A, and Atomi Y, 2000. Pancreatic duct cell carcinomas
express high levels of high mobility group I(Y) proteins. Cancer Res 60:
3117–3122.
779
Journal of Heredity 2005:96(7)
Abe N, Watanabe T, Sugiyama M, Uchimura H, Chiappetta G, Fusco A,
and Atomi Y, 1999. Determination of high mobility group I(Y) expression
level in colorectal neoplasias: a potential diagnostic marker. Cancer Res
59:1169–1174.
John S, Robbins CM, and Leonard WJ, 1996. An IL-2 response element in
the human IL-2 receptor alpha chain promoter is a composite element that
binds Stat5, Elf-1, HMG-I(Y) and a GATA family protein. EMBO J
15:5627–5635.
Aldrich TL, Reeves R, Lee CC, Thomas JN, and Morris AE, 1999. HMG-I(Y)
proteins implicated in amplification of CHO cell DNA. Sequence at NCBI
AF193763. Unpublished manuscript.
Johnson KR, Lehn DA, Elton TS, Barr PJ, and Reeves R, 1988. Complete
murine cDNA sequence, genomic structure, and tissue expression of
the high mobility group protein HMG-I(Y). J Biol Chem 263(34):
18338–18342.
Bandiera A, Bonifacio D, Manfioletti G, Mantovani F, Rustighi A,
Zanconati F, Fusco A, Di Bonito L, and Giancotti V, 1998. Expression of
HMGI(Y) proteins in squamous intraepithelial and invasive lesions of the
uterine cervix. Cancer Res 58:426–431.
Becker K, Murua Escobar H, Richter A, Meyer B, Nolte I, and Bullerdiek J,
2003. The canine HMGA1 gene maps to CFA 23. Anim Genet 34(1):
68–69.
Beitzel B and Bushman F, 2003. Construction and analysis of cells lacking
the HMGA gene family. Nucleic Acids Res 31(17):5025–5032.
Borrmann L, Schwanbeck R, Heyduk T, Seebeck B, Rogalla P, Bullerdiek J,
and Wisniewski JR, 2003. High mobility group A2 protein and its
derivatives bind a specific region of the promoter of DNA repair gene
ERCC1 and modulate its activity. Nucleic Acids Res 31:6841–6851.
Bustin M, 2001. Revised nomenclature for high mobility group (HMG)
chromosomal proteins. Trends Biochem Sci 26(3):152–153.
Bustin M and Reeves R, 1996. High-mobility-group chromosomal proteins:
architectural components that facilitate chromatin function. Prog Nucleic
Acid Res Mol Biol 54:35–100.
Chiappetta G, Bandiera A, Berlingieri MT, Visconti R, Manfioletti G,
Battista S, Martinez-Tello FJ, Santoro M, Giancotti V, and Fusco A, 1995.
The expression of the high mobility group HMGI (Y) proteins correlates
with the malignant phenotype of human thyroid neoplasias. Oncogene
10:1307–1314.
Chiappetta G, Avantaggiato V, Visconti R, Fedele M, Battista S, Trapasso F,
Merciai BM, Fidanza V, Giancotti V, Santoro M, Simeone A, and Fusco A,
1996. High level expression of the HMGI (Y) gene during embryonic
development. Oncogene 13:2439–2446.
Chuvpilo S, Schomberg C, Gerwig R, Heinfling A, Reeves R, Grummt F,
and Serfling E, 1993. Multiple closely-linked NFAT/octamer and HMG I(Y)
binding sites are part of the interleukin-4 promoter. Nucleic Acids Res
21(24):5694–5704.
Czyz W, Balcerczak E, Jakubiak M, Pasieka Z, Kuzdak K, and Mirowski M,
2004. HMGI(Y) gene expression as a potential marker of thyroid follicular
carcinoma. Langenbecks Arch Surg 389(3):193–197.
Du W and Maniatis T, 1994. The high mobility group protein HMG I(Y)
can stimulate or inhibit DNA binding of distinct transcription factor ATF-2
isoforms. Proc Natl Acad Sci USA 91:11318–11322.
Fedele M, Bandiera A, Chiappetta G, Battista S, Viglietto G, Manfioletti G,
Casamassimi A, Santoro M, Giancotti V, and Fusco A, 1996. Human
colorectal carcinomas express high levels of high mobility group HMGI(Y)
proteins. Cancer Res 56:1896–1901.
Johnson KR, Lehn DA, and Reeves R, 1989. Alternative processing of
mRNAs encoding mammalian chromosomal high-mobility-group proteins
HMG-I and HMG-Y. Mol Cell Biol 9(5):2114–2123.
Kazmierczak B, Dal Cin P, Wanschura S, Borrmann L, Fusco A, Van den
Berghe H, and Bullerdiek J, 1998. HMGIY is the target of 6p21.3
rearrangements in various benign mesenchymal tumors. Genes Chromosomes Cancer 23:279–285.
Klein SL, Strausberg RL, Wagner L, Pontius J, Clifton SW, and Richardson P,
2002. Genetic and genomic tools for Xenopus research: the NIH Xenopus
initiative. Dev Dyn 225(4):384–391.
Klein-Hessling S, Schneider G, Heinfling A, Chuvpilo S, and Serfling E,
1996. HMG I(Y) interferes with the DNA binding of NF-AT factors and
the induction of the interleukin 4 promoter in T cells. Proc Natl Acad Sci
USA 93:15311–15316.
Lewis H, Kaszubska W, DeLamarter JF, and Whelan J, 1994. Cooperativity
between two NF-kappa B complexes, mediated by high-mobility-group
protein I(Y), is essential for cytokine-induced expression of the E-selectin
promoter. Mol Cell Biol 14:5701–5709.
Murua Escobar H, Soller JT, Richter A, Meyer B, Winkler S, Flohr AM,
Nolte I, and Bullerdiek J, 2004. The canine HMGA1. Gene 14(330):
93–99.
Reeves R, Edberg DD, and Li Y, 2001. Architectural transcription factor
HMGI(Y) promotes tumor progression and mesenchymal transition of
human epithelial cells. Mol Cell Biol 21:575–594.
Rogalla P, Drechsler K, Frey G, Hennig Y, Helmke B, Bonk U, and
Bullerdiek J, 1996. HMGI-C expression patterns in human tissues.
Implications for the genesis of frequent mesenchymal tumors. Am J Pathol
149(3):775–779.
Sgarra R, Diana F, Bellarosa C, Rustighi A, Toller M, Manfioletti G, and
Giancotti V, 2002. Increase of HMGA1a protein methylation is a distinctive
characteristic of tumor cells induced to apoptosis. Sequence at NCBI
AF511040. Unpublished manuscript.
Sgarra R, Diana F, Bellarosa C, Dekleva V, Rustighi A, Toller M,
Manfioletti G, and Giancotti V, 2003. During apoptosis of tumor cells
HMGA1a protein undergoes methylation: identification of the modification
site by mass spectrometry. Biochemistry 42(12):3575–3585.
Sonstegard TS, Van Tassell CP, Matukumalli LK, Harhay GP, Bosak S,
Rubenfield M, and Gasbarre LC, 2004. Production of EST from cDNA
libraries derived from immunologically activated bovine gut. Sequence at
NCBI CK951567. Unpublished manuscript.
Friedmann M, Holth LT, Zoghbi HY, and Reeves R, 1993. Organization,
inducible-expression and chromosome localization of the human HMG-I(Y)
nonhistone protein gene. Nucleic Acids Res 21(18):4259–4267.
Strausberg RL, Feingold EA, Grouse LH, Derge JG, Klausner RD,
Collins FS, Wagner L, Shenmen CM, Schuler GD, and others, 2002.
Generation and initial analysis of more than 15,000 full-length human
and mouse cDNA sequences. Proc Natl Acad Sci USA 99(26):
16899–16903.
Fujisaki S, Hiraiwa H, Eguchi T, Watanabe Y, Honma D, Saitou T, and
Yasue H, 2003. Construction of a full-length library of swine olfactory bulb
and its preliminary characterization. Sequence at NCBI AU296646.
Unpublished manuscript.
Takaha N, Resar LM, Vindivich D, and Coffey DS, 2004. High mobility
group protein HMGI(Y) enhances tumor cell growth, invasion, and matrix
metalloproteinase-2 expression in prostate cancer cells. Prostate 60(2):
160–167.
John S, Reeves RB, Lin JX, Child R, Leiden JM, Thompson CB, and
Leonard WJ, 1995. Regulation of cell-type-specific interleukin-2 receptor
alpha-chain gene expression: potential role of physical interactions between
Elf-1, HMG-I(Y), and NF-kappa B family proteins. Mol Cell Biol 15:
1786–1796.
Tallini G, Vanni R, Manfioletti G, Kazmierczak B, Faa G, Pauwels P,
Bullerdiek J, Giancotti V, Van Den Berghe H, and Dal Cin P, 2000.
HMGI-C and HMGI(Y) immunoreactivity correlates with cytogenetic abnormalities in lipomas, pulmonary chondroid hamartomas,
endometrial polyps, and uterine leiomyomas and is compatible with
780
Murua Escobar et al. Human and Canine HMGA1 Gene
rearrangement of the HMGI-C and HMGI(Y) genes. Lab Invest 80:
359–369.
from equine (Equus caballus) unstimulated peripheral blood leukocytes.
Sequence at NCBI CD535395. Unpublished manuscript.
Tamimi Y, van der Poel HG, Denyn MM, Umbas R, Karthaus HF,
Debruyne FM, and Schalken JA, 1993. Increased expression of high
mobility group protein I(Y) in high grade prostatic cancer determined by in
situ hybridization. Cancer Res 53:5512–5516.
Williams AJ, Powell WL, Collins T, and Morton CC, 1997. HMGI(Y)
expression in human uterine leiomyomata. Involvement of another highmobility group architectural factor in a benign neoplasm. Am J Pathol
150:911–918.
Thanos D and Maniatis T, 1992. The high mobility group protein HMG
I(Y) is required for NF-kappa B-dependent virus induction of the human
IFN-beta gene. Cell 71:777–789.
Yie J, Liang S, Merika M, and Thanos D, 1997. Intra- and intermolecular
cooperative binding of high-mobility-group protein I(Y) to the betainterferon promoter. Mol Cell Biol 17:3649–3662.
Vandenplas M, Cordonnier-Pratt MM, Suzuki Y, Sugano S, Moore JN,
Liang C, Sun F, Sullivan R, Shah M, and Pratt LH, 2003. An EST database
Corresponding Editor: Francis Galibert
781
IV)
Molecular characterization of the canine HMGB1
Murua Escobar H, Meyer B, Richter A, Becker K, Flohr AM, Bullerdiek J, Nolte I
Cytogenet Genome Res 101: 33-38 (2003)
Eigenanteil:
- Charakterisierung der cDNA
- Charakterisierung der genomischen Gensequenz
- Sequenzanalyse
- Erstellen der DNA-Sonde für BAC-Screening und BAC-Verifizierung
- Herstellung der Northern Blot-Sonde
V)
HMGA2 overexpression in non-small cell lung cancer
Meyer B, Loeschke S, Schultze A, Weigel T, Sandkamp M, Goldmann T, Vollmer
E, Bullerdiek J
Molecular Carcinogenesis (im Druck)
Eigenanteil:
- Planung, Durchführung und Auswertung der Studie mit Ausnahme der immunhistochemischen Untersuchungen, die von S. Loeschke durchgeführt wurden
- Verfassen der Veröffentlichung
Author Proof
MOLECULAR CARCINOGENESIS 9999:1–9 (2006)
HMGA2 Overexpression in Non-Small
Cell Lung Cancer
A
Britta Meyer,1 Siegfried Loeschke,1 Anke Schultze,1 Thomas Weigel,2 Martin Sandkamp,2
Torsten Goldmann,3 Ekkehard Vollmer,3 and Jörn Bullerdiek1*
1
Centre for Human Genetics, University of Bremen, Bremen, Germany
Laboratory Dr. M. Sandkamp, B. Köster, Dr. R. Hiller, Bremen, Germany
3
Clinical and Experimental Pathology, Research Centre Borstel, Borstel, Germany
2
Lung cancer is still the leading cause of death from cancer worldwide primarily because of the fact that most lung
cancers are diagnosed at advanced stages. Overexpression of the high mobility group protein HMGA2 has been
observed in a variety of malignant tumors and often correlates with poor prognosis. Herein, HMGA2 expression levels
were analyzed in matching cancerous and non-cancerous lung samples of 17 patients with adenocarcinoma (AC) and
17 patients with squamous cell carcinoma (SCC) with real-time quantitative RT-PCR (qRT-PCR). Transcript levels were
compared to the results obtained by immunohistochemistry (IHC). HMGA2 expression was detectable by qRT-PCR in
all samples tested and varied from 5422 to 16 991 545 copies per 250 ng total RNA in the carcinoma samples and from
289 to 525 947 copies in the non-cancerous tissue samples. In 33/34 non-small cell lung cancer (NSCLC) samples
tested, an overexpression of HMGA2 was revealed with statistically highly significant differences between nonneoplastic and tumor samples for both AC (P < 0.0001) as well as for SCC (P < 0.0001). Overexpression varies strongly
and is increased up to 911-fold for AC and up to 2504-fold for SCC, respectively, with statistically significant higher
increase in SCC (P < 0.05). The results presented herein indicate that HMGA2 overexpression is a common event in
NSCLC and could serve as molecular marker for lung cancer. ß 2006 Wiley-Liss, Inc.
Key words: non-small cell lung cancer; HMGA2; quantitative real-time RT-PCR; immunohistochemistry
INTRODUCTION
The high mobility group A (HMGA) proteins are
small non-histone chromosomal proteins which are
characterized by three highly conserved DNA binding motifs called ‘‘AT-hooks‘‘ and an acidic tail. They
preferentially bind to the minor groove of AT-rich Bform DNA by recognizing a particular DNA structure
rather than a specific nucleotide sequence [1].
Members of the HMGA protein family are often
referred to as ‘‘architectural transcription factors’’ [2]
because of their ability to regulate expression of a
large number of target genes through alteration of
chromatin structure [3].
The human HMGA protein family comprises three
major members: HMGA1a, HMGA1b, and HMGA2.
The proteins HMGA1a and HMGA1b are splicing
variants derived from the same gene located at
chromosomal locus 6p21 [4,5]. The related HMGA2
protein is encoded by a separate gene assigned to
chromosomal locus 12q14-15 [6,7].
The HMGA expression level is maximal during
embryonic development but is low, or even undetectable, in fully differentiated or non-dividing adult
cells and tissues [8–11]. However, in a variety of
neoplasms, re-expression of the HMGA genes has
been detected. Recent findings suggest that overexpression of HMGA proteins is associated with
enhanced sensitivity to UV-light and several cytoß 2006 WILEY-LISS, INC.
static drugs because of diminished cellular DNA
repair activity. The inhibition of DNA repair conferred by HMGA might lead to accumulation of
mutations and genomic instabilities frequently
observed in many types of human cancers [12–15].
Transcriptional reactivation of the HMGA genes
because of chromosomal translocations was found in
many human benign tumors mostly of mesenchymal origin, as for example lipomas, uterine leiomyomas, pleomorphic adenomas of the salivary glands,
and pulmonary chondroid hamartomas [6,11,16–
20]. As for HMGA2, translocations often affect the
third intron leading to expression of fusion transcripts containing the three AT-hooks and ectopic
sequences from different origin [21]. Transgenic
mice expressing a truncated form of the HMGA2
protein comprising the first three binding domains
Abbreviations: NSCLC, non-small cell lung cancer; AC, adenocarcinoma; SCC, squamous cell carcinoma; HMGA, high mobility
group protein A; qRT-PCR, real-time quantitative reverse transcriptase polymerase chain reaction; IHC, immunohistochemistry.
*Correspondence to: Centre for Human Genetics, University of
Bremen, Leobener Str. ZHG, D-28359 Bremen, Germany.
Received 9 November 2005; Revised 28 February 2006; Accepted
15 March 2006
DOI 10.1002/mc.20235
Published online 00 Month 2006 in Wiley InterScience
(www.interscience.wiley.com)
MC/05-0176(20235)
2
Author Proof
MEYER ET AL.
exhibit a giant phenotype with high incidence of
lipomas. These results indicate that primarily truncation and/or aberrant expression of HMGA2 rather
than its fusion to other genes is responsible for cell
transformation [22,23]. In contrast, it was shown
that inactivation of the HMGA2 gene causes reduced
growth (‘‘pygmy phenotype’’) in mice [24].
In malign tumors, gene regulatory mechanisms
seem to be involved in reactivation of HMGA
expression. Overexpression of HMGA1 was observed
in a variety of cancers, as for example, in colorectal
cancer [25], prostate cancer [26], thyroid cancer [27],
breast cancer [28], and cervical cancer [29]. Examples
of malignant tumors showing HMGA2 overexpression are breast cancer [30], pancreatic cancer [31],
non-small cell lung cancer (NSCLC) [32], and
leukemia [33]. Nevertheless, so far to the best of our
knowledge, only one study has used real-time
quantitative reverse-transcriptase polymerase chain
reaction (qRT-PCR) to quantitate HMGA2 expression
in human malignancies. Miyazawa et al. (2004) [34]
detected a 84–315-fold higher HMGA2 expression
level in five squamous cell carcinoma (SCC) tissues of
the oral cavity than in normal gingival. As to benign
tumors, there is also one study by qRT-PCR. Gross
et al. (2003) [35] detected strongly elevated HMGA2
levels in 10 uterine leiomyomata (UL) with 12q15
rearrangement compared to karyotypically normal
UL and normal myometrium. Re-expression of
HMGA in malign neoplasias is frequently correlated
with an increased degree of malignancy, for example, a higher metastatic potential, and is therefore
considered as valuable diagnostic and prognostic
marker [27–29,34]. Moreover, HMGA proteins seem
to be causally involved in neoplastic transformation
[36,37].
As mentioned above, in previous work from our
group with conventional RT-PCR, HMGA2 expression was detected in 14/19 NSCLC cases examined
whereas in the surrounding non-malignant tissue,
HMGA2 was undetectable [32]. In NSCLC, some
recurrent molecular genetic changes have been
identified, such as deregulation of myc[38], activation of the MET/HGF pathway [39], and inactivation
of the RB1/TP16/CCND1 pathway [40,41]. Furthermore, the different types of NSCLC show characteristic genetic modulations as for instance EGFR and
TP53 co-expression in SCC [42] and HER2/neu overexpression [43] and recurrent KRAS mutations
frequently observed in AC [44]. Because most of
these genetic changes are detected only in a limited
number of lung cancer cases, a more common
molecular marker would be most valuable for early
diagnosis of lung cancer necessary to achieve higher
survival rates and for predictions concerning postoperative outcome in resectable tumors.
Aim of this study was to quantitate HMGA2
expression levels in NSCLC samples with the sensitive quantitative real-time RT-PCR (qRT-PCR). A
total of 34 lung cancer samples (17 ACs and 17 SCCs)
and the matching non-neoplastic lung tissue samples from the same patients were analyzed for
HMGA2 expression and transcript levels were compared to results obtained by immunohistochemistry
(IHC).
A
Molecular Carcinogenesis DOI 10.1002/mc
MATERIALS AND METHODS
Tissue Samples
All cancerous and matching non-cancerous samples used for this study (Tables 1 and 2) were provided
by the Clinical and Experimental Pathology of the
Research Centre Borstel, Borstel, Germany where
initial H&E staining and histologic diagnoses were
performed. Samples were frozen in liquid nitrogen
and stored at 808C until use.
RNA-Isolation
Total RNA was purified according to the ‘‘RNeasy
mini protocol for isolation of total RNA from heart,
muscle, and skin tissue’’ (Qiagen, Hilden, Germany)
including Proteinase K and on-column DNase I
digestion. RNA was quantitated spectrophotometrically in triplicate.
Reverse Transcription
cDNA-syntheses were performed with 2 pmol
gene-specific reverse primer (50 GCCATTTCCTAGGTCTGCCTC 30 ) [35] with 250 ng of total RNA
and 200 units M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) according to the manufacturer’s instructions.
Real-Time Quantitative RT-PCR
RT-PCR amplifications were carried out with
the ABI Prism 7000 Sequence Detection System
(Applied Biosystems, Darmstadt, Germany) or the
Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System
(Applied Biosystems), respectively. HMGA2 expression analyses were performed in triplicate in a total
volume of 25 mL using 2 mL of each cDNA corresponding to 25 ng of total RNA. cDNA was amplified using
600 nM of forward primer (50 -AGTCCCTCTAAAGCAGCTCAAAAG-30 ) and reverse primer (see above),
200 nM fluorogenic probe (50 6-FAM-AGAAGCCACTGGAGAAAAACGGCCA-TAMRA-30 ) [35] in
conjunction with universal PCR Mastermix (Applied
Biosystems). For each run, non-template controls
and no reverse transcriptase reactions were included.
PCR conditions were as follows: 2 min at 508C and
10 min at 958C, followed by 40 cycles with 15 s at
958C and 1 min at 608C. RNA levels were quantitated
relative to amplicon-specific standard curves (absolute quantification) and copy numbers were normalized to total RNA concentration and expressed as
copy number per 250 ng total RNA [45].
Author Proof
3
HMGA2 OVEREXPRESSION IN LUNG CANCER
Table 1. HMGA2 Expression in Matching Adenocarcinoma and Non-Neoplastic Samples of Lung Cancer Patients
Case No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
Histologic type
Sex
Age
Grade
TNM
Stage
Copy no. qRT-PCR{
IHC{
A
AC*
Non-neoplastic
AC
Non-neoplastic
AC
Non-neoplastic
AC
Non-neoplastic
AC
Non-neoplastic
AC
Non-neoplastic
AC
Non-neoplastic
AC
Non-neoplastic
AC
Non-neoplastic
AC
Non-neoplastic
AC
Non-neoplastic
AC
Non-neoplastic
AC
Non-neoplastic
AC
Non-neoplastic
AC
Non-neoplastic
AC
Non-neoplastic
AC
Non-neoplastic
M
61
1
T2N2M0
3A
M
73
3
T2N2MX
3A
M
70
3
T2N2M0
3A
M
62
2
T2N1M0
2B
W
63
3
T2N2M0
3A
W
70
2
T2N0M0
1B
M
57
3
T1N1MX
2A
M
61
2
T2N1M1
4
W
61
3
T3N1M0
3A
M
65
2
T2N0MX
1B
M
71
2
T2N1MX
2B
M
60
3
T4N1MX
3B
W
52
3
T2N0MX
1B
M
56
3
T3N1MX
3A
M
62
2
T2N0MX
1B
M
66
3
T2N3MX
3B
W
64
1
T2N0MX
1B
3.85E þ 05
7.52E þ 03
7.15E þ 03
2.89E þ 02
8.32E þ 06
5.26E þ 05
6.16E þ 05
6.95E þ 04
5.42E þ 03
1.66E þ 03
1.24E þ 05
8.20E þ 03
1.27E þ 05
2.33E þ 03
1.65E þ 04
2.54E þ 03
5.58E þ 06
1.92E þ 05
3.13E þ 04
4.09E þ 04
1.89E þ 06
4.17E þ 04
1.15E þ 07
9.07E þ 03
5.92E þ 05
3.87E þ 04
3.76E þ 06
4.13E þ 3
1.11E þ 07
1.30E þ 05
4.67E þ 06
2.92E þ 04
4.03E þ 05
3.95E þ 05
þ
þ
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
*AC, adenocarcinoma.
{
Expression results of quantitative real-time RT-PCR (qRT-PCR) are presented as copies per 250 ng total RNA.
{
Immunohistochemistry (IHC) staining was determined using the modified ‘‘Remmele-Score’’: , no intranuclear staining; þ, intranuclear
staining in 10–50% of the tumor cells; þþ, intranuclear staining in more than 80% of the tumor cells; n.d., not determined.
HOPE-Fixation
A part of each frozen tissue sample was incubated
in HOPE I solution (DCS, Hamburg, Germany)
overnight on ice. Subsequent incubation in acetone
with 1:1000 HOPE II solution (DCS) was carried out
on ice for 2 h, followed by three successive incubations in pure acetone on ice for 2 h. Afterwards, the
tissue samples were incubated overnight in pure
paraffin wax (Medite, Burgdorf, Germany) at 578C,
subsequently embedded in paraffin, and stored at
48C.
H&E Staining of the Embedded Tissue
From the HOPE-fixed paraffin embedded tissue,
5 mm sections were cut and deparaffinized twice in
diethylether (Riedel de Haen, Seelze, Germany) for
30 s. Rehydration was carried out in 95%, 90%, 80%
acetone, 10 min each, and 70% acetone for 20 min.
Molecular Carcinogenesis DOI 10.1002/mc
Sections were then incubated in bidest. water/
TritonX 100 (Merck, Darmstadt, Germany), 1:5000,
for 10 min followed by another 10 min incubation in
bidest. water. After air drying, samples were stained
for 30 s in Mayer’s Hemalaun (Merck) and washed
in bidest. water for 30 s. ‘‘Blueing’’ took place for 1–
2 min in running tap water. Subsequently samples
were incubated in alcoholic eosin-solution for 1 min
and washed in bidest. water for 1 min. After dehydration in 70%, 80%, and 96% ethanol for 2 min
each, agitated washing in xylol for 1 min, and
another washing in xylol for 5 min, sections
were mounted with Histokitt II (Roth, Karlsruhe,
Germany).
Immunohistochemistry
Sections were cut and rehydration was performed
as described above (H&E staining). After the bidest.
4
Author Proof
MEYER ET AL.
Table 2. HMGA2 Expression in Matching Squamous Cell Carcinoma and Non-Neoplastic Samples of Lung Cancer Patients
Case No.
Histologic type
Sex
Age
Grade
TNM
Stage
Copy no. qRT-PCR{
IHC{
A
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
SCC*
Non-neoplastic
SCC
Non-neoplastic
SCC
Non-neoplastic
SCC
Non-neoplastic
SCC
Non-neoplastic
SCC
Non-neoplastic
SCC
Non-neoplastic
SCC
Non-neoplastic
SCC
Non-neoplastic
SCC
Non-neoplastic
SCC
Non-neoplastic
SCC
Non-neoplastic
SCC
Non-neoplastic
SCC
Non-neoplastic
SCC
Non-neoplastic
SCC
Non-neoplastic
SCC
Non-neoplastic
M
70
2
T2N1M0
2B
M
68
2
T4N1M0
3B
M
64
3
T1N0M0
1A
W
62
1
T4N1M0
3B
M
62
2
T3N0M0
2B
M
74
1
T4N1M0
3B
M
69
1
T2N0M0
1B
W
62
3
T4N0M0
3B
M
59
1
T2N1MX
2B
M
68
1
T2N0MX
1B
M
60
1
T2N0MX
1B
M
63
3
T2N2MX
3A
M
75
3
T2N0MX
1B
M
68
2
T2N0MX
1B
M
65
2
T2N0MX
1B
M
73
2
T2N2MX
3A
M
50
2
T2N1MX
2B
3.53E þ 06
3.37E þ 05
7.78E þ 06
8.95E þ 03
3.62E þ 05
8.61E þ 03
1.37E þ 07
5.53E þ 04
1.64E þ 05
1.59E þ 04
1.32E þ 06
1.18E þ 04
1.15E þ 07
1.49E þ 04
3.14E þ 04
5.80E þ 03
1.24E þ 06
4.42E þ 03
2.09E þ 05
1.01E þ 03
7.43E þ 06
6.99E þ 04
8.31E þ 06
2.23E þ 04
1.70E þ 07
6.79E þ 03
3.32E þ 06
3.35E þ 04
1.17E þ 06
2.70E þ 05
1.87E þ 05
4.49E þ 03
5.01E þ 06
1.70E þ 05
þþ
þþ
þþ
þþ
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
*SCC, squamous cell carcinoma.
{
Expression results of quantitative real-time RT-PCR (qRT-PCR) are presented as copies per 250 ng total RNA.
{
Immunohistochemistry (IHC) staining was determined using the modified ‘‘Remmele-Score’’: , no intranuclear staining; þ, intranuclear
staining in 10–50% of the tumor cells; þþ, intranuclear staining in more than 80% of the tumor cells; n.d., not determined.
water bath, sections were incubated in 0.3% H2O2 for
10 min and rinsed for at least 20 min in 1 PBS. In a
humid chamber, they were incubated for 1 h with
1:50 in Ab-dilution buffer (DCS) diluted primary
anti-HMGA2 antibody (goat polyclonal antibody
raised against a peptide mapping within an internal
region of human HMGA2, S-15, sc-23684, Santa Cruz
Biotechnology, Santa Cruz, CA). After washing in 1
PBS for 2 min, incubation with the secondary
biotinylated anti-goat antibody (Biogenex, San
Ramon, CA) was carried out for 20 min in a humid
chamber. Sections were then washed for 2 min in PBS
and incubated for another 20 min with StreptavidinHRP label (DCS). After three further washing steps for
2 min each in PBS, sections were transferred to readyto-use AEC substrate solution (DCS) for 10 min and
then washed for 2 min in PBS. Counterstaining was
performed with Mayer’s Hemalaun and slides were
Molecular Carcinogenesis DOI 10.1002/mc
mounted with Aquamount (Merck). Positive and
negative controls were run as usual.
Statistical Analysis
The paired t-test was performed to analyze the
expression differences between cancerous and noncancerous tumor samples because the expression
data did not show normal distribution, data were
transformed by logarithmic transformation prior to
analysis. Correlation analyses were performed with
Pearson correlation coefficients. P-values below 0.05
were considered significant.
RESULTS
Histological Examination of Tissue Samples
Despite initial freezing of the material, morphology was excellent after HOPE-fixation and H&E
Author Proof
HMGA2 OVEREXPRESSION IN LUNG CANCER
staining of the tumor and non-tumor specimens.
The tumor specimens consisted of varying rates of
tumor- and non-tumor-cells. The non-tumor specimens were all completely tumor-free. Sometimes, a
mild activation of type II pneumocytes was observed.
5
AC samples (P < 0.05). Comparison of the copynumber of HMGA2 mRNA in the tumor samples
alone or the ratio of copies in the tumor/copies in the
corresponding non-neoplastic tissue to clinicopathologic findings (Tables 1 and 2) revealed no
clear relationship of HMGA2 expression level with
tumor classification, stage, or grading. However,
concerning the ACs, highest expression (1 148 7392
copies per 250 ng total RNA) was found in the sole
malignancy classified as T4.
A
HMGA2 Expression Analyses by Real-Time
Quantitative RT-PCR
Cancerous and matching non-cancerous samples
were obtained from 17 patients with adenocarcinoma (AC) and 17 patients with SCC of the lung. By
quantitative real-time RT-PCR, HMGA2 expression
could be detected in all samples tested (Tables 1 and
2). The expression varied from 5 422 to 16 991 545
copies per 250 ng total RNA in the carcinoma
samples and from 289 to 525 947 copies for the
non-cancerous tissue samples. Comparing matching
cancerous and non-cancerous lung specimens, a
statistically significant overexpression of HMGA2
was apparent in the ACs (Figure 1A) (P < 0.0001) as
well as in the SCC tested (Figure 1B) (P < 0.0001).
Apart from one sample were the expression in the
normal tissue exceeded the level observed in the
matching AC 1.3-fold, the increase detected between
non-neoplastic and malign tissue in the AC and SCC
ranged from 1.02- to 911.02-fold (mean 158.41-fold)
and from 4.34- to 2503.68-fold (mean 336.26-fold),
respectively. Statistical analysis revealed a significantly higher increase in the SCC samples than in the
HMGA2 Expression Analysis by
Immunohistochemistry
The immunohistochemical staining for HMGA2
was analyzed after HOPE-fixation in the specimens
AC 1–9 and SCC 1–9. The results confirmed the
expression pattern obtained by real-time quantitative RT-PCR as immunostaining of HMGA2 was
identified in two AC and four SCC samples representing six of the seven tumor samples with highest
copy-number levels (Tables 1 and 2). All nonneoplastic tissues were negative (Figure 2A). The
positive AC samples showed moderate intranuclear
staining in 10–50% of the tumor cells (Figure 2B)
while strong intranuclear staining was detected
in more than 80% of the tumor cells seen in positive SCC samples (Figure 2C). The intensity of
staining was determined with the modified
‘‘Remmele-Score’’ [46].
Figure 1. Results of the HMGA2 expression analyses obtained by real-time quantitative RT-PCR in (A)
adenocarcinomas (AC) and (B) squamous cell carcinomas (SCC) of the lung. Dark gray bars represent HMGA2 copyno. per 250 ng total RNA for cancerous and light gray bars for the matching non-cancerous samples.
Molecular Carcinogenesis DOI 10.1002/mc
6
Author Proof
MEYER ET AL.
A
COLOR
Figure 1. (Continued )
Figure 2. Immunohistochemical staining results using a goat
polyclonal antibody raised against a peptide mapping within an
internal region of human HMGA2, S-15, sc-23684, Santa Cruz
Biotechnology hybridized to the matching non-cancerous and
cancerous tissue of adenocarcinoma patient AC 3 and squamous
cell carcinoma patient SSC 6. No intranuclear staining was seen in
Molecular Carcinogenesis DOI 10.1002/mc
non-neoplastic lung tissue of adenocarcinoma (A) and squamous cell
carcinoma patients (C), while intranuclear staining was observed in
10–50% of tumor cells of the positive adenocarcinoma sample
(B) and more than 80% of tumor cells of the positive squamous cell
carcinoma sample (D) of the lung. Magnification: 200.
Author Proof
7
HMGA2 OVEREXPRESSION IN LUNG CANCER
DISCUSSION
To the best of our knowledge this is the first study
describing the results of quantitation of HMGA2
expression in lung cancer and in a larger series of
malignant tumors at all.
Lung cancer is still the leading cause of death from
cancer primarily because of the fact that the majority
of lung cancers are diagnosed at advanced stages [47].
Elucidation of the molecular mechanisms underlying its development and progression could lead to
an earlier diagnosis and more effective therapeutic
approaches [48]. As previously reported by our
group, HMGA2 expression was detected by conventional RT-PCR in 14/19 NSCLC samples while no
expression was found in the non-malignant adjacent
lung or pleural tissues examined, suggesting HMGA2
expression as potential indicator for lung cancer [32].
Aim of this study was to quantitate the HMGA2
expression in NSCLC. Real-time quantitative RT-PCR
was conducted on a total of 68 tissue samples
representing matching cancerous and non-cancerous samples from 17 AC and 17 SCC patients. The
qRT-PCR results were confirmed by results from IHC.
The comparison between qRT-PCR and IHC shows
that the PCR approach is far more sensitive than the
IHC. In this series, 289 copies of HMGA2 could be
detected in 250 ng total RNA by PCR, whereas
positive IHC results were obtained only in samples
showing more than 1.3 106 HMGA2 mRNA copies
per 250 ng total RNA. In contrast to the previous
study [32], herein HMGA2 expression was detected
not only in all cancerous samples but also in the nonneoplastic lung tissues. This is probably because of
the higher sensitivity of the real-time quantitative
RT-PCR compared to the hemi-nested RT-PCR
approach used in the former study. Consistent with
the present results, HMGA2 could be detected by
qRT-PCR in normal myometrium [35] and in normal
keratinocytes of the oral cavity [34] indicating a basal
HMGA2 expression in these non-neoplastic tissues as
well. Because all non-cancerous specimens were
completely tumor-free, the strong variation of
HMGA2 expression levels from 289 to 525 947 copies
per 250 ng total RNA measured in the normal tissue is
remarkable. As described by several groups, multiple
genetic alterations similar to those found in lung
cancer have frequently been detected in histologically normal lung tissue of smokers and/or lung
cancer patients [50,51]. Hence, the elevated HMGA2
expression levels measured in several non-cancerous
samples could result from these genetic changes
which might represent early stages in the tumorigenesis of lung cancer.
To date, TNM stage is still the most important
prognostic factor for prediction of survival rates in
NSCLC [52]. However, to explain the large variability
in postoperative outcome of patients with clinically
resectable tumors, the identification of new prog-
nostic parameters is required. Comparing matching
tumor and non-tumorous samples from the same
NSCLC patient the quantitative analysis revealed a
statistically highly significant overexpression in 33/
34 lung cancer cases with a significantly higher
increase in SCC than in AC samples. A strong
intertumoral variance of HMGA2 expression levels
was detected and for the ACs, highest expression was
found in the sole malignancy classified as T4.
Because the HMGA2 gene has shown to be of
prognostic relevance in several other cancer entities
[30,34,53], these findings indicate that HMGA2
overexpression is a common event in NSCLC and
HMGA2 expression can be considered as molecular
biological factor for NSCLC.
A
Molecular Carcinogenesis DOI 10.1002/mc
ACKNOWLEDGMENTS
We thank W. Wosniok for careful statistical
examination of the expression data.
REFERENCES
1. Reeves R, Nissen MS. The A.T-DNA-binding domain of
mammalian high mobility group I chromosomal proteins. A
novel peptide motif for recognizing DNA structure. J Biol
Chem 1990;265:8573–8582.
2. Wolffe AP. Architectural transcription factors. Science
1994;264:1100–1101.
3. Bustin M, Reeves R. High-mobility-group chromosomal
proteins: architectural components that facilitate chromatin
function. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 1996;54:35–100.
4. Friedmann M, Holth LT, Zoghbi HY, Reeves R. Organization,
inducible-expression and chromosome localization of the
human HMG-I(Y) nonhistone protein gene. Nucleic Acids Res
1993;21:4259–4267.
5. Johnson KR, Lehn DA, Reeves R. Alternative processing of
mRNAs encoding mammalian chromosomal high-mobilitygroup proteins HMG-I and HMG-Y. Mol Cell Biol 1989;
9:2114–2123.
6. Schoenmakers EF, Wanschura S, Mols R, Bullerdiek J, Van
den Berghe H, Van de Ven WJ. Recurrent rearrangements in
the high mobility group protein gene, HMGI-C, in benign
mesenchymal tumours. Nat Genet 1995;10:436–444.
7. Chau KY, Patel UA, Lee KL, Lam HY, Crane-Robinson C. The
gene for the human architectural transcription factor HMGIC consists of five exons each coding for a distinct functional
element. Nucleic Acids Res 1995;23:4262–4266.
8. Chiappetta G, Avantaggiato V, Visconti R, et al. High level
expression of the HMGI (Y) gene during embryonic development. Oncogene 1996;13:2439–2446.
9. Rogalla P, Drechsler K, Frey G, et al. HMGI-C expression
patterns in human tissues. Implications for the genesis of
frequent mesenchymal tumors. Am J Pathol 1996;149:775–
779.
10. Hirning-Folz U, Wilda M, Rippe V, Bullerdiek J, Hameister H.
The expression pattern of the Hmgic gene during development. Genes Chromosomes Cancer 1998;23:350–357.
11. Gattas GJ, Quade BJ, Nowak RA, Morton CC. HMGIC
expression in human adult and fetal tissues and in uterine
leiomyomata. Genes Chromosomes Cancer 1999;25:316–
322.
12. Boo LM, Lin HH, Chung V, et al. High mobility group A2
potentiates genotoxic stress in part through the modulation
of basal and DNA damage-dependent phosphatidylinositol
3-kinase-related protein kinase activation. Cancer Res
2005;65:6622–6630.
8
Author Proof
MEYER ET AL.
13. Adair JE, Kwon Y, Dement GA, Smerdon MJ, Reeves R.
Inhibition of nucleotide excision repair by high mobility group
protein HMGA1. J Biol Chem 2005.
14. Reeves R, Adair JE. Role of high mobility group (HMG)
chromatin proteins in DNA repair. DNA Repair (Amst) 2005;
4:926–938.
15. Baldassarre G, Belletti B, Battista S, et al. HMGA1 protein
expression sensitizes cells to cisplatin-induced cell death.
Oncogene 2005.
16. Hennig Y, Rogalla P, Wanschura S, et al. HMGIC expressed in
a uterine leiomyoma with a deletion of the long arm of
chromosome 7 along with a 12q14-15 rearrangement but
not in tumors showing del(7) as the sole cytogenetic
abnormality. Cancer Genet Cytogenet 1997;96:129–133.
17. Williams AJ, Powell WL, Collins T, Morton CC. HMGI(Y)
expression in human uterine leiomyomata. Involvement of
another high-mobility group architectural factor in a benign
neoplasm. Am J Pathol 1997;150:911–918.
18. Sornberger KS, Weremowicz S, Williams AJ, et al. Expression
of HMGIY in three uterine leiomyomata with complex
rearrangements of chromosome 6. Cancer Genet Cytogenet
1999;114:9–16.
19. Kazmierczak B, Meyer-Bolte K, Tran KH, et al. A high
frequency of tumors with rearrangements of genes of the
HMGI(Y) family in a series of 191 pulmonary chondroid hamartomas. Genes Chromosomes Cancer 1999;26:125–133.
20. Kazmierczak B, Wanschura S, Rommel B, Bartnitzke S,
Bullerdiek J. Ten pulmonary chondroid hamartomas with
chromosome 6p21 breakpoints within the HMG-I(Y) gene or
its immediate surroundings. J Natl Cancer Inst 1996;88:
1234–1236.
21. Kazmierczak B, Bullerdiek J, Pham KH, Bartnitzke S, Wiesner
H. Intron 3 of HMGIC is the most frequent target of
chromosomal aberrations in human tumors and has been
conserved basically for at least 30 million years. Cancer
Genet Cytogenet 1998;103:175–177.
22. Arlotta P, Tai AK, Manfioletti G, Clifford C, Jay G, Ono SJ.
Transgenic mice expressing a truncated form of the high
mobility group I-C protein develop adiposity and an
abnormally high prevalence of lipomas. J Biol Chem 2000;
275:14394–14400.
23. Battista S, Fidanza V, Fedele M, et al. The expression of a
truncated HMGI-C gene induces gigantism associated with
lipomatosis. Cancer Res 1999;59:4793–4797.
24. Zhou X, Benson KF, Ashar HR, Chada K. Mutation
responsible for the mouse pygmy phenotype in the developmentally regulated factor HMGI-C. Nature 1995;376:771–
774.
25. Fedele M, Bandiera A, Chiappetta G, et al. Human colorectal
carcinomas express high levels of high mobility group
HMGI(Y) proteins. Cancer Res 1996;56:1896–1901.
26. Bussemakers MJ, van de Ven WJ, Debruyne FM, Schalken JA.
Identification of high mobility group protein I(Y) as potential
progression marker for prostate cancer by differential
hybridization analysis. Cancer Res 1991;51:606–611.
27. Chiappetta G, Tallini G, De Biasio MC, et al. Detection of high
mobility group I HMGI(Y) protein in the diagnosis of thyroid
tumors: HMGI(Y) expression represents a potential diagnostic indicator of carcinoma. Cancer Res 1998;58:4193–4198.
28. Flohr AM, Rogalla P, Bonk U, et al. High mobility group
protein HMGA1 expression in breast cancer reveals a positive
correlation with tumour grade. Histol Histopathol 2003;18:
999–1004.
29. Bandiera A, Bonifacio D, Manfioletti G, et al. Expression of
HMGI(Y) proteins in squamous intraepithelial and invasive
lesions of the uterine cervix. Cancer Res 1998;58:426–431.
30. Rogalla P, Drechsler K, Kazmierczak B, Rippe V, Bonk U,
Bullerdiek J. Expression of HMGI-C, a member of the high
mobility group protein family, in a subset of breast cancers:
Relationship to histologic grade. Mol Carcinog 1997;19:
153–156.
31. Abe N, Watanabe T, Suzuki Y, et al. An increased highmobility group A2 expression level is associated with
malignant phenotype in pancreatic exocrine tissue. Br J
Cancer 2003;89:2104–2109.
32. Rogalla P, Drechsler K, Schroder-Babo W, Eberhardt K,
Bullerdiek J. HMGIC expression patterns in non-small lung
cancer and surrounding tissue. Anticancer Res 1998;18:
3327–3330.
33. Rommel B, Rogalla P, Jox A, et al. HMGI-C, a member of the
high mobility group family of proteins, is expressed in
hematopoietic stem cells and in leukemic cells. Leuk
Lymphoma 1997;26:603–607.
34. Miyazawa J, Mitoro A, Kawashiri S, Chada KK, Imai K.
Expression of mesenchyme-specific gene HMGA2 in squamous cell carcinomas of the oral cavity. Cancer Res 2004;
64:2024–2029.
35. Gross KL, Neskey DM, Manchanda N, et al. HMGA2
expression in uterine leiomyomata and myometrium: Quantitative analysis and tissue culture studies. Genes Chromosomes Cancer 2003;38:68–79.
36. Giancotti V, Pani B, D’Andrea P, et al. Elevated levels of a
specific class of nuclear phosphoproteins in cells transformed
with v-ras and v-mos oncogenes and by cotransfection with
c-myc and polyoma middle T genes. Embo J 1987;6:1981–
1987.
37. Wood LJ, Maher JF, Bunton TE, Resar LM. The oncogenic
properties of the HMG-I gene family. Cancer Res 2000;60:
4256–4261.
38. Broers JL, Viallet J, Jensen SM, et al. Expression of c-myc in
progenitor cells of the bronchopulmonary epithelium and in
a large number of non-small cell lung cancers. Am J Respir
Cell Mol Biol 1993;9:33–43.
39. Olivero M, Rizzo M, Madeddu R, et al. Overexpression and
activation of hepatocyte growth factor/scatter factor in
human non-small-cell lung carcinomas. Br J Cancer 1996;74:
1862–1868.
40. Otterson GA, Kratzke RA, Coxon A, Kim YW, Kaye FJ.
Absence of p16INK4 protein is restricted to the subset of lung
cancer lines that retains wildtype RB. Oncogene 1994;9:
3375–3378.
41. Jin M, Inoue S, Umemura T, et al. Cyclin D1, p16 and
retinoblastoma gene product expression as a predictor for
prognosis in non-small cell lung cancer at stages I and II. Lung
Cancer 2001;34:207–218.
42. Rusch V, Klimstra D, Linkov I, Dmitrovsky E. Aberrant
expression of p53 or the epidermal growth factor receptor
is frequent in early bronchial neoplasia and coexpression
precedes squamous cell carcinoma development. Cancer Res
1995;55:1365–1372.
43. Hirsch FR, Varella-Garcia M, Franklin WA, et al. Evaluation of
HER-2/neu gene amplification and protein expression in nonsmall cell lung carcinomas. Br J Cancer 2002;86:1449–1456.
44. Husgafvel-Pursiainen K, Hackman P, Ridanpaa M, et al. K-ras
mutations in human adenocarcinoma of the lung: Association with smoking and occupational exposure to asbestos. Int
J Cancer 1993;53:250–256.
45. Bustin SA. Absolute quantification of mRNA using real-time
reverse transcription polymerase chain reaction assays. J Mol
Endocrinol 2000;25:169–193.
46. Remmele W, Stegner HE. [Recommendation for uniform
definition of an immunoreactive score (IRS) for immunohistochemical estrogen receptor detection (ER-ICA) in breast
cancer tissue]. Pathologe 1987;8:138–140.
47. Greenlee RT, Hill-Harmon MB, Murray T, Thun M. Cancer
statistics, 2001. CA Cancer J Clin 2001;51:15–36.
48. Petty RD, Nicolson MC, Kerr KM, Collie-Duguid E, Murray GI.
Gene expression profiling in non-small cell lung cancer: From
molecular mechanisms to clinical application. Clin Cancer
Res 2004;10:3237–3248.
49. Kettunen E, Anttila S, Seppanen JK, et al. Differentially
expressed genes in nonsmall cell lung cancer: Expression
A
Molecular Carcinogenesis DOI 10.1002/mc
Author Proof
HMGA2 OVEREXPRESSION IN LUNG CANCER
profiling of cancer-related genes in squamous cell lung
cancer. Cancer Genet Cytogenet 2004;149:98–106.
50. Park IW, Wistuba II, Maitra A, et al. Multiple clonal
abnormalities in the bronchial epithelium of patients with
lung cancer. J Natl Cancer Inst 1999;91:1863–1868.
51. Wistuba II, Lam S, Behrens C, et al. Molecular damage in the
bronchial epithelium of current and former smokers. J Natl
Cancer Inst 1997;89:1366–1373.
9
52. Brundage MD, Davies D, Mackillop WJ. Prognostic factors in
non-small cell lung cancer: A decade of progress. Chest
2002;122:1037–1057.
53. Langelotz C, Schmid P, Jakob C, et al. Expression of highmobility-group-protein HMGI-C mRNA in the peripheral
blood is an independent poor prognostic indicator for
survival in metastatic breast cancer. Br J Cancer 2003;88:
1406–1410.
A
Molecular Carcinogenesis DOI 10.1002/mc
VI)
HMGA2 expression in canine prostatic tissues – a potential
prognostic tool
Winkler S, Murua Escobar H, Meyer B, Loeschke S, Eberle N, Simon D,
Baumgartner W, Nolte I, Bullerdiek J
(in Vorbereitung)
Eigenanteil:
- Isolierung der Gesamt-RNA aus caninem Prostatagewebe und Xenotransplantaten
- Etablierung und Durchführung der quantitativen HMGA2-Expressionsanalysen
mittels Real-Time RT-PCR beim Hund
HMGA2 Expression in Canine Prostatic Tissues – A Potential Prognostic Tool
Susanne Winkler1, Hugo Murua Escobar2, Britta Meyer1, Siegfried Loeschke1, Nina Eberle2,
Daniela Simon2, Wolfgang Baumgartner3, Ingo Nolte2 and Jörn Bullerdiek1
1
Center for Human Genetics, University of Bremen, Leobener Strasse ZHG, 28359 Bremen,
Germany
2
Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine, Bischofsholer Damm 15, 30173
Hannover, Germany
3
Department of Pathology, University of Veterinary Medicine, Bunteweg 17, 30559 Han-
nover, Germany
Correspondence to:
Prof. Dr. Jörn Bullerdiek: Center for Human Genetics, University of Bremen,
Leobener Strasse ZHG, D-28359 Bremen, Germany,
Phone:+49-(0)421-218-4239,
Fax: +49-(0)421-218-4239,
Email: [email protected]
Running title:
HMGA2 Expression in Canine Prostatic Tissues
Key Words:
Prostate cancer, HMGA2, Overexpression, Animal model, Real-Time quantitative PCR
1
Abstract
BACKGROUND: Prostate cancer is the most prevalent cancer in western countries, being the
third leading cause of male cancer death. Searching for molecular markers allowing a better
prognosis of the tumor, we analyzed the High-Mobility-Group-Protein-A2 (HMGA2) expression level because HMGA2 overexpression has been shown to correlate with malignant potential of various neoplasias. As the dog is the only species showing spontaneously occurring
prostate carcinomas with striking similarities to cancer growth and progression in man it is an
adequate animal model for this neoplasia. METHODS: Real-Time quantitative RT-PCR for
HMGA2 expression analyses in a subset of canine prostate tissue samples. RESULTS:
HMGA2 expression levels in all carcinomas were higher than those of any of the nonmalignant tissues. CONCLUSION: As we assume that our investigations are comparable to
the situation in man, our study provides a potential tool for better differentiation between
varying degrees of malignancy in prostate carcinomas.
2
Introduction
Beside humans the dog is the only mammalian species that spontaneously develops prostate
cancer with a considerably high frequency (1). In addition, both species show striking similarities in the development and clinical course of the disease. The average age in which prostate carcinomas appear in dogs is ten years (2). In both species, adenocarcinomas of the prostate show the same histopathology and represent a locally invasive disease. Also in both species, the tumors are likely to metastasize to the same distant regions by blood or lymphatic
system (3) and akin to their human counterparts canine prostatic cancers vary over a broad
range with respect to their clinical behavior. Currently, there is no widely accepted grading
for canine prostate cancer. Thus, molecular indicators allowing for a valid prognosis of these
cancers are of considerable interest.
In humans a type of genes overexpressed in prostate carcinomas are members of the High
Mobility Group Protein A (HMGA) family (4). The HMGA family consists of three proteins
known so far: HMGA1a, HMGA1b and HMGA2. HMGA1a and HMGA1b are due to alternatively spliced mRNA of the same gene, mapping to 6p21 in man (5) and to CFA 23 in dogs
(6). The related HMGA2 protein is encoded by a separate gene, mapping to 12q14-15 in man
(7). All three proteins show a high amino acid sequence homology in particular among their
three highly conserved AT-hooks, representing the DNA-binding domains (5). The human
and canine HMGA1 and HMGA2 proteins are highly conserved during evolution (8 and unpublished data). HMGA proteins are abundantly expressed during embryogenesis and expressed at very low levels in most normal adult tissues (9,10). HMGA1 overexpression was
first described in transformed rat thyroid cells and in experimental thyroid tumors (11). Subsequent studies addressed its role in human malignant neoplasias (12-17). Generally, the level
of overexpression correlates with the degree of neoplastic cell transformation and metastatic
tumor progression (17,18). Based on this correlation it has been suggested that the elevated
level of HMGA expression is a characteristic and diagnostic feature of the transformed pheno3
type (5). However, HMGA2 is frequently involved in chromosomal translocations occurring in
benign human tumors, such as lipomas, uterine leiomyomas, lung hamartomas, and fibroadenomas and adenolipomas of the breast (19-25). It could be demonstrated, that truncated transcripts are able to induce cell transformation (26).
The ability of both HMGA2 and HMGA1 to neoplastically transform mammalian cells and
the similarity between both proteins make it likely to assume that the overexpression of
HMGA2 may also lead to tumor progression. Because the dog is the only animal model for
spontaneously occurring prostate cancers we analyzed neoplastic tissues as well as nonneoplastic tissues of the canine prostate in respect of their expression of HMGA2. Herein we
report on the HMGA2 expression patterns in prostatic tissues from 16 dogs with different histological findings ranging from non-neoplastic tissues to carcinomas.
4
Materials and Methods
Tissue samples: All canine tissues samples used in this study were taken from dogs of different breeds admitted to the Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine, Hanover
because of different medical conditions. All samples were taken during surgery or autopsy,
immediately frozen in liquid nitrogen and stored at –80°C. Additionally, pathohistological
examination was carried out. Examples of two adenocarcinomas are given in Figure 2 and
Figure 3.
RNA isolation: Total RNA extraction of the canine prostatic tissue samples was performed
according to the RNeasy midi protocol for isolation of total RNA from animal tissues
(Qiagen, Hilden, Germany), following the manufacturer’s instructions.
cDNA-synthesis: 250 ng of total RNA was reverse transcribed using M-MLV-Reverse Transcriptase and RNase Out (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) with HMGA2dog Reverse Primer
(5’GCCATTTCCTAGGTCTGCCTC3’) and 10 mM dNTPs. Each sample was prepared in
triplicate for Real-Time Quantitative RT-PCR. Negative controls were prepared by adding
distilled water instead of RNA.
Standard curves: mRNA levels were measured using an “absolute” quantification method,
which is relative to amplicon specific standard curves. The standard curve resulted from seven
dilution steps from 102 to 108 copies; each dilution step was measured in triplicate. The sequence
for
this
standard
was
(5’
to
3’):
AGAGTCCCTCCAAAGCAGCTCAAAAGAAAGCAGAAGCCAATGGAGAAAAACGG
CCAAGAGGCAGACCTAGGAAATGGCCA. Copy numbers were normalized relative to
total RNA concentration and expressed as copy numbers/250 ng RNA.
Real-Time Quantitative RT-PCR: For quantitative analysis of canine HMGA2 expression levels 2µl of each of the cDNA triplicates were subjected to real time RT-PCR, using the ABI
Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Bioystems, Warrington, UK). To minimize
the risk of false positives, the dilutions for the standard curve were dispensed after the sam5
ples of interest had been dispensed and sealed. An additional negative control was prepared
using water with the PCR-reaction mix. Nucleotide sequences for the canine primers and
probe were designed according to Gross et al. (27) with slight modifications to the lower
primer: HMGA2dog up (5’ to 3’): AGTCCCTCCAAAGCAGCTCAAAAG, HMGA2dog lo
(5’ to 3’): GCCATTTCCTAGGTCTGCCTC, HMGA2 probe (5’ to 3’): 6FAMAGAAGCCACTGGAGAAAAACGGCCA-TAMRA. PCR-conditions were as follows: 50°C
for 2 minutes, initial denaturation at 95°C for ten minutes, followed by 45 cycles at 95 °C for
15 seconds and 60°C for 1 minute.
6
Results
Histopathological findings are listed in Table 1. The expression levels of all carcinomas were
higher than those of any of the non malignant tissues. All ten non malignant prostatic tissues
showed mean quantities lower than 50,000 transcripts per 250 ng total RNA. One prostatic
tissue (sample No. 16) designated as a carcinoma showed a mean quantity below this quantity, too. Histopathological examination of this tissue shows that the tumor consisted of large
areas of non-tumorigenic connective tissue. In respect of the fact that only small fragments of
the tumor were used for isolation of RNA it seems possible, that the sample used for preparation of total RNA consisted mostly of this benign tissue, explaining the low expression of
HMGA2. Additionally, the integrity of the cDNA was tested by PCR for the house-keeping
gene FUT6 (data not shown). Different from all other tissue samples investigated in this
study, there was no visible band for the gene product in tissue sample 16. Thus, the actual
HMGA2 transcript level of this tumor may be higher than revealed by our investigations. The
mean quantities among the investigated tissue samples, as indicated in Figure 1, showed a
broad range from 126.78 transcripts for the lowest level in non-neoplastic tissues and
4,239,000 transcripts as the highest level in adenocarcinomas. There was also some variety
observed between tissues with the same histopathological findings: non-neoplastic tissues
showed transcript levels from 126.78 to 1,432.75 whereas benign lesions presented transcript
levels from 962.54 to 20,754.81. Adenocarcinomas exhibited a much broader range than the
non-neoplastic tissues and benign lesions from 27,214.71 to 4,239,000.00 transcripts. Nevertheless, even when comparing the highest transcript level of non-neoplastic tissues to the lowest transcript level of adenocarcinomas, there is a nearly 19-fold increase of expression of
HMGA2.
7
Discussion
The results of this study clearly show that HMGA2 is overexpressed in canine prostatic cancer. It has been demonstrated previously that overexpression of HMGA-proteins is associated
with tumor progression in a variety of human tumors as e.g. colon cancers, squamous cell
carcinomas of the oral cavity, liposarcomas, and cervical cancers (9,28,29). The expression of
an embryonic protein in tumors of adults, as demonstrated in this study, suggests that
HMGA2 is associated with the malignant potential in the oncogenic process (30). Presumably, the neoplastic transformation of cells expressing high levels of HMGA proteins takes part
in a multi-step process, starting with an initial lesion in a tumors suppressor gene resulting in
the aberrant expression of factors able to induce the continuous expression of HMGA proteins. These elevated levels of HMGA proteins may then lead to neoplastic transformation of
the cells (7). The correlation between elevated levels of HMGA expression and the malignancy and metastatic potential of tumors is so striking that the overexpression of HMGA proteins has been suggested to be a diagnostic and prognostic feature (5,31). Thus, some efforts
have been made to establish HMGA2 expression as a tool to classify subsets of malignant
tumors with poor prognosis (32). Herein we report on HMGA2 expression in canine prostate
cancer, a disease in a companion animal which closely resembles the situation in man. Our
data clearly show that expression of HMGA2 is low in non-neoplastic tissues, rises in benign
lesions with intermediate values for cysts and hyperplasias and increases at least 19 fold in
carcinomas (Figure 1). In our study, all malignant neoplasias showed expression levels beyond a quantity of 50,000 transcripts per 250 ng total RNA, whereas none of the nonmalignant tissues showed expression levels beyond this dimension. Possibly the broad intratumoral range of transcript levels reflects the more aggressive potential of tumors with high
levels of HMGA2. As far as we know, no investigations have been performed so far using
real-time PCR for the detection of HMGA2 in human prostate cancers.
8
Conclusions: As we assume that our investigations in dogs are comparable to the situation in
man, because of the striking similarities between both species, our study provides a potential
tool for better differentiation between varying degrees of malignancy in prostate carcinomas.
Thus, real-time PCR might be a tool to accomplish a more reliable prognosis for both species,
because of the much more precise information provided by the results of real-time PCR compared to the results of histopathological examination.
9
References
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
Boutemmine D, Bouchard N, Boerboom D, Jones HE, Goff AK, Dore M, Sirois J.
Molecular characterization of canine prostaglandin G/H synthase-2 and regulation in
prostatic adenocarcinoma cells in vitro. Endocrinology 2002;143(3):1134-1143.
Nolte I, Nolte M. Praxis der Onkologie bei Hund und Katze. Stuttgart: Enke; 2000.
MacEwen EG. Spontaneous tumors in dogs and cats: models for the study of cancer
biology and treatment. Cancer Metastasis Rev 1990;9(2):125-136.
Tamimi Y, van der Poel HG, Denyn MM, Umbas R, Karthaus HF, Debruyne FM,
Schalken JA. Increased expression of high mobility group protein I(Y) in high grade
prostatic cancer determined by in situ hybridization. Cancer Res 1993;53(22):55125516.
Reeves R. Structure and function of the HMGI(Y) family of architectural transcription
factors. Environ Health Perspect 2000;108 Suppl 5:803-809.
Becker K, Murua Escobar H, Richter A, Meyer B, Nolte I, Bullerdiek J. The canine
HMGA1 gene maps to CFA 23. Anim Genet 2003;34(1):68-69.
Reeves R. Molecular biology of HMGA proteins: hubs of nuclear function. Gene
2001;277(1-2):63-81.
Murua Escobar H, Soller JT, Richter A, Meyer B, Winkler S, Flohr AM, Nolte I,
Bullerdiek J. The canine HMGA1. Gene 2004;330:93-99.
Pentimalli F, Dentice M, Fedele M, Pierantoni GM, Cito L, Pallante P, Santoro M,
Viglietto G, Dal Cin P, Fusco A. Suppression of HMGA2 protein synthesis could be a
tool for the therapy of well differentiated liposarcomas overexpressing HMGA2. Cancer Res 2003;63(21):7423-7427.
Rogalla P, Drechsler K, Frey G, Hennig Y, Helmke B, Bonk U, Bullerdiek J. HMGI-C
expression patterns in human tissues. Implications for the genesis of frequent mesenchymal tumors. Am J Pathol 1996;149(3):775-779.
Giancotti V, Pani B, D'Andrea P, Berlingieri MT, Di Fiore PP, Fusco A, Vecchio G,
Philp R, Crane-Robinson C, Nicolas RH, et al. Elevated levels of a specific class of
nuclear phosphoproteins in cells transformed with v-ras and v-mos oncogenes and by
cotransfection with c-myc and polyoma middle T genes. Embo J 1987;6(7):19811987.
Fedele M, Battista S, Manfioletti G, Croce CM, Giancotti V, Fusco A. Role of the
high mobility group A proteins in human lipomas. Carcinogenesis 2001;22(10):15831591.
Baldassarre G, Battista S, Belletti B, Thakur S, Pentimalli F, Trapasso F, Fedele M,
Pierantoni G, Croce CM, Fusco A. Negative regulation of BRCA1 gene expression by
HMGA1 proteins accounts for the reduced BRCA1 protein levels in sporadic breast
carcinoma. Mol Cell Biol 2003;23(7):2225-2238.
Chiappetta G, Tallini G, De Biasio MC, Manfioletti G, Martinez-Tello FJ, Pentimalli
F, de Nigris F, Mastro A, Botti G, Fedele M, Berger N, Santoro M, Giancotti V, Fusco
A. Detection of high mobility group I HMGI(Y) protein in the diagnosis of thyroid
tumors: HMGI(Y) expression represents a potential diagnostic indicator of carcinoma.
Cancer Res 1998;58(18):4193-4198.
Czyz W, Balcerczak E, Jakubiak M, Pasieka Z, Kuzdak K, Mirowski M. HMGI(Y)
gene expression as a potential marker of thyroid follicular carcinoma. Langenbecks
Arch Surg 2004;389(3):193-197.
Fedele M, Bandiera A, Chiappetta G, Battista S, Viglietto G, Manfioletti G, Casamassimi A, Santoro M, Giancotti V, Fusco A. Human colorectal carcinomas express high
levels of high mobility group HMGI(Y) proteins. Cancer Res 1996;56(8):1896-1901.
10
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
Reeves R, Edberg DD, Li Y. Architectural transcription factor HMGI(Y) promotes
tumor progression and mesenchymal transition of human epithelial cells. Mol Cell
Biol 2001;21(2):575-594.
Abe N, Watanabe T, Sugiyama M, Uchimura H, Chiappetta G, Fusco A, Atomi Y.
Determination of high mobility group I(Y) expression level in colorectal neoplasias: a
potential diagnostic marker. Cancer Res 1999;59(6):1169-1174.
Ashar HR, Fejzo MS, Tkachenko A, Zhou X, Fletcher JA, Weremowicz S, Morton
CC, Chada K. Disruption of the architectural factor HMGI-C: DNA-binding AT hook
motifs fused in lipomas to distinct transcriptional regulatory domains. Cell
1995;82(1):57-65.
Bullerdiek J, Wobst G, Meyer-Bolte K, Chilla R, Haubrich J, Thode B, Bartnitzke S.
Cytogenetic subtyping of 220 salivary gland pleomorphic adenomas: correlation to
occurrence, histological subtype, and in vitro cellular behavior. Cancer Genet Cytogenet 1993;65(1):27-31.
Hennig Y, Deichert U, Bonk U, Thode B, Bartnitzke S, Bullerdiek J. Chromosomal
translocations affecting 12q14-15 but not deletions of the long arm of chromosome 7
associated with a growth advantage of uterine smooth muscle cells. Mol Hum Reprod
1999;5(12):1150-1154.
Hennig Y, Wanschura S, Deichert U, Bartnitzke S, Bullerdiek J. Rearrangements of
the high mobility group protein family genes and the molecular genetic origin of uterine leiomyomas and endometrial polyps. Mol Hum Reprod 1996;2(4):277-283.
Kazmierczak B, Hennig Y, Wanschura S, Rogalla P, Bartnitzke S, Van de Ven W,
Bullerdiek J. Description of a novel fusion transcript between HMGI-C, a gene encoding for a member of the high mobility group proteins, and the mitochondrial aldehyde
dehydrogenase gene. Cancer Res 1995;55(24):6038-6039.
Kazmierczak B, Wanschura S, Rosigkeit J, Meyer-Bolte K, Uschinsky K, Haupt R,
Schoenmakers EF, Bartnitzke S, Van de Ven WJ, Bullerdiek J. Molecular characterization of 12q14-15 rearrangements in three pulmonary chondroid hamartomas. Cancer
Res 1995;55(12):2497-2499.
Schoenmakers EF, Wanschura S, Mols R, Bullerdiek J, Van den Berghe H, Van de
Ven WJ. Recurrent rearrangements in the high mobility group protein gene, HMGI-C,
in benign mesenchymal tumours. Nat Genet 1995;10(4):436-444.
Battista S, Fidanza V, Fedele M, Klein-Szanto AJ, Outwater E, Brunner H, Santoro M,
Croce CM, Fusco A. The expression of a truncated HMGI-C gene induces gigantism
associated with lipomatosis. Cancer Res 1999;59(19):4793-4797.
Gross KL, Neskey DM, Manchanda N, Weremowicz S, Kleinman MS, Nowak RA,
Ligon AH, Rogalla P, Drechsler K, Bullerdiek J, Morton CC. HMGA2 expression in
uterine leiomyomata and myometrium: quantitative analysis and tissue culture studies.
Genes Chromosomes Cancer 2003;38(1):68-79.
Miyazawa J, Mitoro A, Kawashiri S, Chada KK, Imai K. Expression of mesenchymespecific gene HMGA2 in squamous cell carcinomas of the oral cavity. Cancer Res
2004;64(6):2024-2029.
Scala S, Portella G, Fedele M, Chiappetta G, Fusco A. Adenovirus-mediated suppression of HMGI(Y) protein synthesis as potential therapy of human malignant neoplasias. Proc Natl Acad Sci U S A 2000;97(8):4256-4261.
Goodwin G. The high mobility group protein, HMGI-C. Int J Biochem Cell Biol
1998;30(7):761-766.
Rogalla P, Drechsler K, Kazmierczak B, Rippe V, Bonk U, Bullerdiek J. Expression
of HMGI-C, a member of the high mobility group protein family, in a subset of breast
cancers: relationship to histologic grade. Mol Carcinog 1997;19(3):153-156.
11
32.
Rogalla P, Drechsler K, Schroder-Babo W, Eberhardt K, Bullerdiek J. HMGIC expression patterns in non-small lung cancer and surrounding tissue. Anticancer Res
1998;18(5A):3327-3330.
12
Table 1: Histopathologial findings of the canine tissue samples examined. Additionally, information about breed and age of the related dogs is given.
Sample
Breed
No.
Age
Tissue
Metastatic behavior
(years)
1
Golden Retriever
4
Non-neoplastic
2
Engl. Setter
9
Adenocarcinoma
Bone metastases
3
Mixed breed
11
Adenocarcinoma
Infiltration of blood vessels
4
Mixed breed
14
Hyperplasia
5
Golden Retriever
11
Hyperplasia
6
Hovavart
10
Anapl. Carcinoma Lymph node metastases
7
Munsterlander
10
Non-neoplastic
8
Briard
10
Adenocarcinoma
9
Rottweiler
8
Hyperplasia
10
Mixed breed
10
Non-neoplastic
11
Mixed breed
11
Cyst
12
Mixed breed
13
Cyst
13
Pinsher
7
Cyst
14
Mixed breed
9
Adenocarcinoma
15
Mixed breed
16
Non-neoplastic
16
Mixed breed
10
Adenocarcinoma
Mesentery metastases
Not tested
Not tested
13
Figure legends:
Figure 1:
HMGA2 Expression in canine prostatic tissues
Figure 2:
Sample No 14: moderately to poor differentiated adenocarcinoma of the canine prostate
Figure 3:
Sample No 8: poor differentiated adenocarcinoma of the canine prostate with mucus filled
atypical glands on the left and several mitoses on the right.
14
Figure 1
15
Figure 2
Figure 3
16
VII)
Quantitative expression analysis in peripheral blood of
CML patients: correlation of HMGA2 expression and WBC
status
Meyer B, Krisponeit D, Junghanss C, Murua Escobar H, Bullerdiek J
(in Vorbereitung)
Eigenanteil:
- Alle Arbeiten außer Probenentnahme und routinemäßig durchgeführte
Blutuntersuchungen, welche unter Leitung von D. Krisponeit bzw. C. Junghanß im
Zentralkrankenhaus Bremen-Mitte bzw. in der Klinik für Innere Medizin der
Universität Rostock durchgeführt wurden
Quantitative expression analysis in peripheral blood of CML patients:
correlation of HMGA2 expression and WBC status
B. Meyera, D. Krisponeitb, C. Junghanssc, H. Murua Escobard, J. Bullerdieka
a
Centre for Human Genetics, University of Bremen, Leobener Str. ZHG, D-28359
Bremen, Germany
b
Klinikum Bremen Mitte, Zentrum für Innere Medizin, Hämatologie und Onkologie,
St.-Jürgen-Str. 1, D-28177 Bremen, Germany
c
Department of Internal Medicine, Devision of Hematology and Oncology, University
of Rostock, Ernst-Heydemann-Str. 6, D-18057 Rostock, Germany
d
Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine, Bischofsholer Damm 15, D-
30173 Hannover, Germany
Corresponding author:
Prof. Dr. Jörn Bullerdiek
Centre for Human Genetics
University of Bremen
Leobener Str. ZHG
D-28359 Bremen
Keywords: chronic myeloid leukaemia, high mobility group protein A2, quantitative
real-time RT-PCR
Abstract
The
architectural
transcription
factor
HMGA2
is
highly
expressed
during
embryogenesis but scarcely detectable in non-dividing adult cells. Previously,
HMGA2 re-expression was detected in blood from CML patients by conventional RTPCR, while blood samples from healthy volunteers were HMGA2-negative. Using the
sensitive method of qRT-PCR, herein HMGA2 expression was detectable not only in
peripheral blood from leukaemia patients but also in blood from healthy donors.
Statistical analysis revealed a highly significant correlation between white blood cell
count and HMGA2 transcript levels. Results indicate that HMGA2 expression is upregulated in undifferentiated leukaemic cells accumulating during progression of
chronic phase to blast crisis.
1. Introduction
The high mobility group protein HMGA2 is a small nuclear chromatin-associated
protein characterised by three DNA-binding domains called AT-hooks and an acidic
tail [1]. Binding of HMGA2 to AT-rich stretches in the minor groove of DNA induces
conformational changes on DNA influencing the recruitment of diverse transcription
factors. Thus, HMGA2 affects transcription of a variety of genes as architectural
protein [2]. The HMGA2 gene is located on 12q13-15, a region frequently rearranged
in human benign tumours mostly of mesenchymal origin [3-6]. Expression of HMGA2
is high during embryogenesis but low or even absent in non-dividing adult cells
[5,7,8]. In mice inactivation of the Hmga2 gene causes reduced growth (“pygmy
phenotype”) [9] while transgenic mice expressing a truncated Hmga2 gene develop
gigantism associated with lipomatosis [10]. A similar phenotype including extreme
somatic overgrowth was reported for an 8-year old boy with a germline mutation
affecting the HMGA2 gene showing the important role of HMGA2 for growth and
development [11]. Re-expression of HMGA2 was detected in several human
malignancies, such as squamous cell carcinomas of the oral cavity [12], breast
cancer [13], pancreatic cancer [14], and non-small cell lung cancer [15,16] often
correlated with a highly malignant phenotype. In the peripheral blood of breast cancer
patients HMGA2 expression was restricted to patients with metastatic disease.
Statistical analyses revealed a positive correlation between HMGA2 expression and
disease-free survival, suggesting HMGA2 expression as independent marker for poor
prognosis [17,18]. However, on that point conflicting data exist in that recent
quantitative analyses using real-time RT-PCR detected HMGA2 expression in
peripheral blood from breast cancer patients as well as from healthy donors.
Furthermore,
no
correlation
of
HMGA2
expression
with
any
clinical
or
histopathological data could be found [19].
In previous work from our group using conventional RT-PCR, CD34+ stem cells from
healthy donors and blood from patients with myeloid leukaemia was HMGA2 positive
while peripheral blood samples from healthy volunteers were negative [20]. Several
studies
have
demonstrated
HMGA2
re-expression
and/or
chromosomal
rearrangements affecting the chromosomal region 12q13-15 in patients with
haematologic malignancies. Submicroscopic deletions were detected in 20 of 78
acute lymphocytic leukaemias (ALL) [21] and rearrangements of the HMGA2 gene
have been reported in a case of Richter transformation of chronic lymphocytic
leukaemia (CLL) [22], a case of ALL [23] and two cases of myeolofibrosis with
myeloid metaplasia [24]. In the latter study HMGA2 expression was detected in both
cases affected by translocation and in ten additional patients bearing no 12q
anomalies, while HMGA2 was not expressed in normal subjects. Odero et al. (2005)
reported expression in 6 patients with myeloid leukaemia showing 12q13-15
rearrangements [25]. Accordingly, expression of several HMGA2 isoforms lacking the
acidic tail was found in 2 cases of acute myelogenous leukaemia (AML) with
translocations of chromosome 12q. Furthermore, an aberrant HMGA2 transcript was
detected in the CML cell line BV173 lacking apparent chromosomal anomalies of the
12q14-15 region [26]. Recently, it was suggested that aberrant HMGA2-expression,
in concert with mutant PIGA (phosphatidylinositol glycan, class A) accounts for clonal
expansion
of
haepoietic
stem
cells
in
two
PNH
(paroxysmal
nocturnal
hemoglobinuria) patients with acquired rearrangement of chromosome 12 in PIGAmutant cells [27]. In addition, aberrant HMGA2 expression was detected in CD34positive stem cells of patients with idiopathic myelofibrosis (IM) representing a
Philadelphia chromosome-negative chronic myeloproliferative disorder [28].
Herein, the results of quantitative analysis of HMGA2 expression in the peripheral
blood of 14 CML patients and of 7 healthy donors are reported. The findings indicate
that up-regulation of HMGA2-expression is correlated to the undifferentiated
phenotype of leukaemic cells
2. Material and methods
2.1. Blood samples
Blood samples from 14 CML patients and 7 healthy individuals were taken at the
Central Hospital Bremen Mitte, Bremen, Germany and at the Department of Internal
Medicine, Division of Hematology and Oncology, University of Rostock, Germany. Of
each donor 2.5 ml of whole blood were collected in PAXgene Blood RNA Tubes
(Qiagen, Hilden, Germany) containing RNA stabilising agent and stored until use at
4°C (for up to 6 days) or at -20°C. 12 out of 14 CML patients received medical
treatment, one patient was untreated (C3) and one patient abandoned therapy (45).
Blood from CML patients were routinely karyotyped and checked by RT-PCR for the
presence of BCR-ABL fusion transcripts. As revealed by cytogenetic analyses apart
from patient B22 all CML patients were Philadelphia chromosome-positive, which
was confirmed by the detection of the BCR-ABL fusion transcript via RT-PCR.
2.2. RNA-isolation
Total RNA was extracted using the PAXgene Blood RNA kit (Qiagen) according to
the manufacturer’s instructions. To ensure complete mechanical disruption of
genomic DNA QIAshredder spin columns were used. The optional on-column DNase
I treatment was included to eliminate any residual DNA in the RNA samples. RNA
was quantitated spectrophotometrically in triplicate.
2.3. Reverse transcription
For cDNA-syntheses 250 ng of total RNA were reverse transcribed using 2 pmol of
gene specific reverse primer (5’ GCCATTTCCTAGGTCTGCCTC 3’) [29] and 200
units M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen, Karlsruhe, Germany) according to
the manufacturer’s instructions.
2.4. Quantitative real-time RT-PCR
For absolute quantification of HMGA2 transcript levels RT-PCR amplifications were
carried out using the Applied Biosystems 7300 Real-Time PCR System (Applied
Biosystems, Darmstadt, Germany). 2 µl of each cDNA corresponding to 25 ng of total
RNA were amplified in a total volume of 25 µl using universal PCR Mastermix
(Applied
Biosystems)
with
600
nM
of
each
primer
(forward
primer:
5’
AGTCCCTCTAAAGCAGCTCAAAAG 3’, reverse primer: see above) and 200 nM
fluorogenic probe (5’ 6-FAM-AGAAGCCACTGGAGAAAAACGGCCA-TAMRA 3’)
[29]. PCR conditions were as follows: 2 min at 50°C and 10 min at 95°C, followed by
40 cycles with 15 s at 95°C and 1 min at 60°C. All samples were measured in
triplicate and for each run non-template controls and no reverse transcriptase
reactions were included. Expression levels of HMGA2 mRNA transcripts were
calculated using an amplicon-specific standard curve. Transcript levels were
normalised to total RNA concentration and expressed as copy number / 250 ng total
RNA.
2.5. Statistical analysis
Correlation analyses were done using Spearman’s correlation test. p values below
0.05 were considered significant.
3. Results and discussion
In previous work from our group using conventional RT-PCR, HMGA2 expression
was detected in peripheral blood of all leukaemia patients tested (11 CML and 3 AML
patients) and in CD34 positive haematopoietic stem cells from healthy donors, while
no expression was found in normal blood samples [20]. To the best of our knowledge
this is the first study presenting quantitative analysis of HMGA2 expression in blood
from CML patients compared to blood from healthy donors.
In contrast to the previous investigation herein HMGA2 expression was detectable
not only in peripheral blood from leukaemia patients but also in normal blood due to
the sensitive method of quantitative real-time RT-PCR. For healthy individuals
transcript levels varied between 4,441 and 9,076 copies / 250 ng total RNA. This
result is in accordance with findings by Fabjani et al. (2005) who detected a
background HMGA2 expression in blood specimens from healthy donors as well.
However, the variation of transcript levels measured in the present study in blood
from normal individuals was very small (about 2-fold) compared to the difference of
up to 170-fold detected by Fabjani et al. Most likely the small variance could result
from the utilization of RNA stabilisation reagent, which prevents changes in gene
expression that normally take place in vitro, after blood collection.
In the peripheral blood of CML patients tested HMGA2 expression levels varied
strongly from 4,392 up to 6,360,200 copies per 250 ng total RNA (Table 1, Figure 1)
corresponding to a variance of up to 1,448-fold. Lowest transcript levels were
measured in patients in chronic phase or in remission, elevated levels were detected
for CML patients in acceleration and the highest level was measured for patient B22
with blast crisis representing the only patient with Philadelphia-negative (Ph-) and
BCR-ABL-negative CML. Statistical analysis revealed highly significant correlations
between white blood cell (WBC) count and HMGA2 transcript levels for all CML
patients tested (Spearman’s correlation test: r = 0.899; p < 0.0001) as well as only for
those patients with Ph+ and BCR-ABL+ CML (Spearman’s correlation test: r = 0.879;
p < 0.0001), respectively. However, since the HMGA2 expression increases
disproportionately to the WBC count, HMGA2 expression is clearly up-regulated in
leukaemic cells.
The question arises what cells are responsible for up-regulation of HMGA2
expression and how HMGA2 expression could be linked to the malignant phenotype
of CML. CML is characterised by increased and unregulated clonal production of
predominantly myeloid cells. While chronic phase CML cells retain their capacity for
complete maturation, blast crisis is characterised by enhanced proliferation and
survival of cells and impaired differentiation resulting in an accumulation of premature
undifferentiated leukaemic blast cells [30,31]. Since HMGA2 is reported to be highly
expressed in undifferentiated mesenchymal and in proliferating cells [7,32,33] the
elevated HMGA2 expression shown herein is likely to result from the immature
leukaemic cells representing rapidly dividing cells of mesenchymal origin.
Progression of CML to blast crisis is generally accompanied by an increased BCRABL expression and accumulation of genetic and chromosomal abnormalities,
suggesting a genetic instability in Philadelphia-positive (Ph+) cells [31]. This genetic
instability could be causally linked to elevated HMGA2-expression levels, since it was
recently shown that HMGA2-expressing cells lose their ability to activate DNA repair
pathways in response to double-strand break damages [34]. Furthermore, in previous
work we were able to show that by binding to the promoter of ERCC1, an important
gene in the regulation of nucleotide excision repair, HMGA2 modulates its activity
leading to an altered genomic stability [35].
Further quantitative analyses studying HMGA2 expression in stem cells as well as
myeloid progenitors of healthy donors and of CML patients will be helpful to
understand the significance of HMGA2 expression changes during normal and
abnormal myelopoesis.
References
1. Reeves R, Nissen MS. The A.T-DNA-binding domain of mammalian high mobility
group I chromosomal proteins. A novel peptide motif for recognizing DNA structure. J
Biol Chem 1990;265:8573-8582.
2. Bustin M, Reeves R. High-mobility-group chromosomal proteins: architectural
components that facilitate chromatin function. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol
1996;54:35-100.
3. Schoenmakers EF, Wanschura S, Mols R, Bullerdiek J, Van den Berghe H, Van de
Ven WJ. Recurrent rearrangements in the high mobility group protein gene, HMGI-C,
in benign mesenchymal tumours. Nat Genet 1995;10:436-444.
4. Hennig Y, Rogalla P, Wanschura S, Frey G, Deichert U, Bartnitzke S, Bullerdiek J.
HMGIC expressed in a uterine leiomyoma with a deletion of the long arm of
chromosome 7 along with a 12q14-15 rearrangement but not in tumors showing
del(7) as the sole cytogenetic abnormality. Cancer Genet Cytogenet 1997;96:129133.
5. Gattas GJ, Quade BJ, Nowak RA, Morton CC. HMGIC expression in human adult
and fetal tissues and in uterine leiomyomata. Genes Chromosomes Cancer
1999;25:316-322.
6. Ashar HR, Fejzo MS, Tkachenko A, Zhou X, Fletcher JA, Weremowicz S, Morton
CC, Chada K. Disruption of the architectural factor HMGI-C: DNA-binding AT hook
motifs fused in lipomas to distinct transcriptional regulatory domains. Cell
1995;82:57-65.
7. Rogalla P, Drechsler K, Frey G, Hennig Y, Helmke B, Bonk U, Bullerdiek J. HMGIC expression patterns in human tissues. Implications for the genesis of frequent
mesenchymal tumors. Am J Pathol 1996;149:775-779.
8. Hirning-Folz U, Wilda M, Rippe V, Bullerdiek J, Hameister H. The expression
pattern of the Hmgic gene during development. Genes Chromosomes Cancer
1998;23:350-357.
9. Zhou X, Benson KF, Ashar HR, Chada K. Mutation responsible for the mouse
pygmy phenotype in the developmentally regulated factor HMGI-C. Nature
1995;376:771-774.
10. Battista S, Fidanza V, Fedele M, Klein-Szanto AJ, Outwater E, Brunner H,
Santoro M, Croce CM, Fusco A. The expression of a truncated HMGI-C gene
induces gigantism associated with lipomatosis. Cancer Res 1999;59:4793-4797.
11. Ligon AH, Moore SD, Parisi MA, Mealiffe ME, Harris DJ, Ferguson HL, Quade
BJ, Morton CC. Constitutional Rearrangement of the Architectural Factor HMGA2: A
Novel Human Phenotype Including Overgrowth and Lipomas. Am J Hum Genet
2004;76.
12. Miyazawa J, Mitoro A, Kawashiri S, Chada KK, Imai K. Expression of
mesenchyme-specific gene HMGA2 in squamous cell carcinomas of the oral cavity.
Cancer Res 2004;64:2024-2029.
13. Rogalla P, Drechsler K, Kazmierczak B, Rippe V, Bonk U, Bullerdiek J.
Expression of HMGI-C, a member of the high mobility group protein family, in a
subset of breast cancers: relationship to histologic grade. Mol Carcinog 1997;19:153156.
14. Abe N, Watanabe T, Suzuki Y, Matsumoto N, Masaki T, Mori T, Sugiyama M,
Chiappetta G, Fusco A, Atomi Y. An increased high-mobility group A2 expression
level is associated with malignant phenotype in pancreatic exocrine tissue. Br J
Cancer 2003;89:2104-2109.
15. Rogalla P, Drechsler K, Schroder-Babo W, Eberhardt K, Bullerdiek J. HMGIC
expression patterns in non-small lung cancer and surrounding tissue. Anticancer Res
1998;18:3327-3330.
16. Meyer B, Loeschke S, Schultze A, Weigel T, Sandkamp M, Goldmann T, Vollmer
E, Bullerdiek J. HMGA2 overexpression in non-small cell lung cancer. Mol Carcinog
2006;(in press).
17. Langelotz C, Schmid P, Jakob C, Heider U, Wernecke KD, Possinger K, Sezer O.
Expression of high-mobility-group-protein HMGI-C mRNA in the peripheral blood is
an independent poor prognostic indicator for survival in metastatic breast cancer. Br J
Cancer 2003;88:1406-1410.
18. Sezer O, Langelotz C, Blohmer JU, Schmid P, Akrivakis K, Possinger K.
Detection of HMGI-C in the peripheral blood of breast cancer patients. Eur J Cancer
2000;36:1944-1948.
19. Fabjani G, Tong D, Wolf A, Roka S, Leodolter S, Hoecker P, Fischer MB, Jakesz
R, Zeillinger R. HMGA2 is associated with invasiveness but not a suitable marker for
the detection of circulating tumor cells in breast cancer. Oncol Rep 2005;14:737-741.
20. Rommel B, Rogalla P, Jox A, Kalle CV, Kazmierczak B, Wolf J, Bullerdiek J.
HMGI-C, a member of the high mobility group family of proteins, is expressed in
hematopoietic stem cells and in leukemic cells. Leuk Lymphoma 1997;26:603-607.
21. Patel HS, Kantarjian HM, Bueso-Ramos CE, Medeiros LJ, Haidar MA. Frequent
deletions at 12q14.3 chromosomal locus in adult acute lymphoblastic leukemia.
Genes Chromosomes Cancer 2005;42:87-94.
22. Santulli B, Kazmierczak B, Napolitano R, Caliendo I, Chiappetta G, Rippe V,
Bullerdiek J, Fusco A. A 12q13 translocation involving the HMGI-C gene in richter
transformation of a chronic lymphocytic leukemia. Cancer Genet Cytogenet
2000;119:70-73.
23. Pierantoni GM, Santulli B, Caliendo I, Pentimalli F, Chiappetta G, Zanesi N,
Santoro M, Bulrich F, Fusco A. HMGA2 locus rearrangement in a case of acute
lymphoblastic leukemia. Int J Oncol 2003;23:363-367.
24. Andrieux J, Demory JL, Dupriez B, Quief S, Plantier I, Roumier C, Bauters F, Lai
JL, Kerckaert JP. Dysregulation and overexpression of HMGA2 in myelofibrosis with
myeloid metaplasia. Genes Chromosomes Cancer 2004;39:82-87.
25. Odero MD, Grand FH, Iqbal S, Ross F, Roman JP, Vizmanos JL, Andrieux J, Lai
JL, Calasanz MJ, Cross NC. Disruption and aberrant expression of HMGA2 as a
consequence of diverse chromosomal translocations in myeloid malignancies.
Leukemia 2005;19:245-252.
26. Kottickal LV, Sarada B, Ashar H, Chada K, Nagarajan L. Preferential expression
of HMGI-C isoforms lacking the acidic carboxy terminal in human leukemia. Biochem
Biophys Res Commun 1998;242:452-456.
27. Inoue N, Izui-Sarumaru T, Murakami Y, Endo Y, Nishimura JI, Kurokawa K,
Kuwayama M, Shime H, Machii T, Kanakura Y, Meyers G, Wittwer C, Chen Z,
Babcock W, Frei-Lahr D, Parker CJ, Kinoshita T. Molecular basis of clonal expansion
of hematopoiesis in two patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH).
Blood 2006.
28. Guglielmelli P, Zini R, Bogani C, Salati S, Pancrazzi A, Bianchi E, Mannelli F,
Ferrari S, Le Bousse-Kerdiles MC, Bosi A, Barosi G, Migliaccio AR, Manfredini R,
Vannucchi AM. Molecular profiling of CD34+ cells in idiopathic myelofibrosis
identifies a set of disease-associated genes and reveals the clinical significance of
Wilm's tumor gene (WT1). Stem Cells 2006.
29. Gross KL, Neskey DM, Manchanda N, Weremowicz S, Kleinman MS, Nowak RA,
Ligon AH, Rogalla P, Drechsler K, Bullerdiek J, Morton CC. HMGA2 expression in
uterine leiomyomata and myometrium: quantitative analysis and tissue culture
studies. Genes Chromosomes Cancer 2003;38:68-79.
30. Clarkson BD, Strife A, Wisniewski D, Lambek C, Carpino N. New understanding
of the pathogenesis of CML: a prototype of early neoplasia. Leukemia 1997;11:14041428.
31. Hehlmann R, Berger U, Hochhaus A. Chronic myeloid leukemia: a model for
oncology. Ann Hematol 2005;84:487-497.
32. Manfioletti G, Giancotti V, Bandiera A, Buratti E, Sautiere P, Cary P, CraneRobinson C, Coles B, Goodwin GH. cDNA cloning of the HMGI-C phosphoprotein, a
nuclear protein associated with neoplastic and undifferentiated phenotypes. Nucleic
Acids Res 1991;19:6793-6797.
33. Zhou X, Benson KF, Przybysz K, Liu J, Hou Y, Cherath L, Chada K. Genomic
structure and expression of the murine Hmgi-c gene. Nucleic Acids Res
1996;24:4071-4077.
34. Boo LM, Lin HH, Chung V, Zhou B, Louie SG, O'Reilly MA, Yen Y, Ann DK. High
mobility group A2 potentiates genotoxic stress in part through the modulation of basal
and DNA damage-dependent phosphatidylinositol 3-kinase-related protein kinase
activation. Cancer Res 2005;65:6622-6630.
35. Borrmann L, Schwanbeck R, Heyduk T, Seebeck B, Rogalla P, Bullerdiek J,
Wisniewski JR. High mobility group A2 protein and its derivatives bind a specific
region of the promoter of DNA repair gene ERCC1 and modulate its activity. Nucleic
Acids Res 2003;31:6841-6851.
Tables
Table 1: Results of the HMGA2 expression analyses in the peripheral blood of CML
patients using quantitative real-time RT-PCR.
Patient
Diagnosis
Age [y]
Philadelphia Chr. /
WBC count
HMGA2
BCR-ABL
[G/l]
[Copy-no. / 250
ng total RNA]
45
CML in acceleration
36
positive
18.3
157,506
B5
CML in remission
61
positive
8.9
29,062
B14
CML
66
positive
13.1
49,718
B22
CML blast crisis
64
negative
40.0
6,360,200
B25
CML in remission
68
positive
5.5
6,037
B57
CML in remission
68
positive
6.5
12,949
B60
CML in remission
54
positive
3.0
7,918
C1
CML in remission
55
positive
6.2
11,731
C2
CML in chronic phase
41
positive
1.4
4,392
C3
CML in acceleration
18
positive
165.0
251,210
C4
CML in remission
62
positive
4.8
6,453
C5
CML in chronic phase
45
positive
6.2
8,189
C6
CML in chronic phase
53
positive
4.4
4,985
C7
CML in remission
47
positive
3.9
8,640
Figure 1:
1.00E+07
CML patients
Healthy donors
HMGA2 Copy-no. / 250 ng total RNA
1.00E+06
1.00E+05
1.00E+04
1.00E+03
1.00E+02
1.00E+01
1.00E+00
C2
31
34
33
C6
32
35
B25
C4
30
B60
Sample no.
C5
C7
36
C1
B57
B5
B14
45
C3
Figure legend
Figure 1:
HMGA2 copy-no. per 250 ng total RNA as revealed by quantitative real-time RT-PCR
in peripheral blood from CML patients (black bars) and from healthy donors (light
grey bars) on logarithmic scale. Plain black bars represent CML patients in chronic
phase or in remission, horizontally striped bars represent patients with CML in
acceleration and the vertically striped bar represents a patient with CML in blast
crisis.
VIII)
Expression pattern of the HMGB1 gene in sarcomas of the
dog
Meyer B, Murua Escobar H, Hauke S, Richter A, Winkler S, Rogalla P, Flohr AM,
Bullerdiek J, Nolte I
Anticancer Res 24: 707-710 (2004)
Eigenanteil:
- Isolierung der Gesamt-RNA aus caninen Sarkomen
- Erstellung des Northern Blot
- Herstellung der Northern Blot-Sonde
- Etablierung und Durchführung der semi-quantitativen RT-PCR
- Auswertung der Ergebnisse
- Verfassen der Veröffentlichung
ANTICANCER RESEARCH 24: 707-710 (2004)
Expression Pattern of the HMGB1 Gene
in Sarcomas of the Dog
BRITTA MEYER1, HUGO MURUA ESCOBAR2,3, SVEN HAUKE1, ANDREAS RICHTER1,
SUSANNE WINKLER3, PIERE ROGALLA1, ALJOSCHA M. FLOHR3, JÖRN BULLERDIEK3 and INGO NOLTE2
1alcedo
biotech GmbH, Leobener Strasse ZHG, D-28359 Bremen;
for Small Animals, School of Veterinary Medicine, Bischofsholer Damm 15, D-30173 Hannover;
3Center for Human Genetics, University of Bremen, Leobener Strasse ZHG, D-28359 Bremen, Germany
2Clinic
Abstract. Background: The human high mobility group protein
B1 (HMGB1) has attracted considerable interest among
oncologists because it sensitises cancer cells to the anticancer
drug cisplatin by shielding cisplatin-DNA adducts from
nucleotide excision repair. Materials and Methods: Since
cisplatin is the cornerstone of adjuvant systemic therapy for
osteosarcomas, in both humans and dogs, the expression pattern
of the HMGB1 gene in seven canine sarcomas was investigated
by Northern blot analysis and semi-quantitative RT-PCR.
Results: A strong intertumoural variation of HMGB1 expression
was detected by Northern blot analysis and confirmed by the
semi-quantitative RT-PCR established herein. Conclusion: The
observed variations of HMGB1 expression in canine sarcomas
emphasises the role of HMGB1 as a potential marker of clinical
interest as its expression level may predict the clinical outcome of
therapies based on cisplatin. The semi-quantitative RT-PCR
established allows a quick and convenient determination of the
HMGB1 expression level as necessary for clinical applications.
are chromatin-associated non-histone proteins characterised
by low molecular weight, acid-solubility and a high content
of charged amino acids. According to their molecular size,
sequence and DNA binding capacity, three families have
been distinguished: HMGB (formerly HMG1/2), HMGN
(formerly HMG14/17) and HMGA (formerly HMGI(Y))
(2,3). The HMGB family, comprising HMGB1, HMGB2
and HMGB3, is characterised by its two DNA-binding
domains called the "HMG-Box" (4,5).
One of the best analysed members of the group of HMGBox proteins is HMGB1 (synonymously known as HMG1 or
amphoterin). Both DNA-binding domains selectively bind
with a very high affinity to major cisplatin-DNA adducts (68) and interaction between HMGB1 and cisplatin-damaged
DNA contributes to its biological activity, as it sensitises
cancer cells to cisplatin by shielding its major DNA adducts
from nucleotide excision repair (9,10).
Interestingly, HMGB1 gene expression can be induced by
oestrogens in breast cancer cells probably due to an upregulation of the gene, so that HMGB1 itself can be
considered an oestrogen-responsive gene (11). Recently, we
were able to explain this observation by the identification of
two oestrogen responsive elements within the first intron of
HMGB1 (12). He et al. (10) have shown that, in oestrogen
receptor-positive human breast cancer cells, oestrogen can
significantly increase the effect of cisplatin by causing an
overexpression of HMGB1. This finding has led to the
conclusion that oestrogen treatment prior to cisplatin
therapy may sensitise the cancer cells against that drug.
Accordingly, a clinical trial for the treatment of
gynaecological tumours with cisplatin has already been
approved by the Food and Drug Administration (FDA)
(10). On the other hand, the former experiment clearly
shows that the quantitation of the intratumoural HMGB1
expression level may be of high impact for a
cisplatin/carboplatin therapy for two reasons. Firstly, it may
predict the clinical outcome of the therapy; secondly, it may
influence the therapy protocol as, for example, tumours
AR
The related platinum compounds cisplatin and carboplatin
are widely used antitumour drugs for the treatment of a
number of malignancies. The main cytotoxic effect of
cisplatin/carboplatin is the formation of cisplatin/carboplatinDNA adducts characterised by intrastrand cross-links and
significantly bended and distorted DNA.
Gel mobility shift assays revealed a selective affinity of
high mobility group (HMG) proteins for cisplatin-DNA
adducts (1). The recognition of cisplatin damage by HMG
is assumed to mediate cisplatin cytotoxicity. HMG proteins
Correspondence to: Prof. Dr. Ingo Nolte, Clinic for Small Animals,
School of Veterinary Medicine, Bischofsholer Damm 15, D-30173
Hannover, Germany. Tel: +49-511-8567251, Fax: +49-5118567686, e-mail: [email protected]
Key Words: Osteosarcoma, cisplatin, HMGB1 expression, semiquantitative RT-PCR.
0250-7005/2004 $2.00+.40
707
ANTICANCER RESEARCH 24: 707-710 (2004)
Table I. Sarcoma samples analysed in this study.
Sarcoma
sample
OS1
OS2
OS3
OS4
OS5
FS
LMS
1n.r.
Tumour
Osteosarcoma
Osteosarcoma
Osteosarcoma
Osteosarcoma
Osteosarcoma
Fibrosarcoma
Leiomyosarcoma
Breed
Sex
Rottweiler
Crossbreed
German Shepherd
Crossbreed
German Shepherd
Bobtail
Crossbreed
f
f
m
m
m
m
f
Age
1 yr
4 yrs
6 yrs
9 yrs
n.r.1
5 yrs
10 yrs
= not reported
TCTTCCTCCTCCTCCTCATCC 3’). A 445 bp cDNA probe
detecting the 1.3 kb transcript of the canine GAPDH gene was
amplified by PCR with the primer set GAPDH2up (5’
GTGAAGGTCGGAGTCAAC 3’) and GAPDHdog5do (5’
AGGAGGCATTGCTGACAAT 3’). Probes were labelled with 50
ÌCi(·-32P)dCTP (Amersham Biosciences) using the Megaprime
Labelling Kit (Amersham Biosciences) for random-primed
labelling (14). Hybridisation was performed for 3 h at 68ÆC in 10
ml of PerfectHyb Plus Hybridisation Buffer (Sigma-Aldrich, Saint
Louis, USA). The membranes were washed for 5 min with low
stringency at RT in 2x SSC, 0.1% SDS and twice for 20 min with
high stringency at 68ÆC in 0.5x SSC, 0.1% SDS. Signals were
visualised using a Storm PhosphorImager (Molecular Dynamics,
Sunnyvale, USA). Quantitation of the transcripts of HMGB1 and
GAPDH was performed using the software program ImageQuant
(Molecular Dynamics).
showing a high HMGB1 expression level may be treated
with a lower amount of this antitumour drug.
Due to the close similarities of numerous canine diseases
to their human counterparts, the role of the dog as a model
organism for therapeutic approaches is justified.
Furthermore, genes and proteins known to be of high
diagnostic and therapeutic impact in man can also be
considered to play an important role in the dog.
Osteosarcomas and several types of carcinomas belong to
the group of canine malignancies often treated with cisplatin
or carboplatin. So far no data are available analysing the
expression pattern of the HMGB1 gene in canine sarcomas.
Thus, in this study we analysed the HMGB1 expression level
in five canine osteosarcomas, one fibrosarcoma and one
leiomyosarcoma by Northern blot experiments. Based on
the observed strong intertumoural variation of HMGB1
expression, we further established a quick RT-PCR-based
diagnostic system for future studies.
Semi-quantitative RT-PCR. cDNA synthesis was performed using
primer AP2 (5’ AAGGATCCGTCGACATCT(17) 3’) with 500 ng of
mRNA with SuperScript Reverse Transcriptase (Invitrogen,
Karlsruhe, Germany) according to the manufacturer’s instructions. In
order to determine the expression of HMGB1 in relation to that of
the housekeeping gene GAPDH, a duplex PCR was established using
the primer sets ToastUP/Ex5lo and GAPDH2up/GAPDHdog5do
(see above). PCR reactions were set up according to the "basic PCR
protocol" of Taq DNA Polymerase (Invitrogen) using the following
PCR program: initial denaturation for 5 min at 94ÆC, 28 cycles of
denaturation for 30 sec at 94ÆC, primer annealing for 30 sec at 55ÆC
and extension for 45 sec at 72ÆC, followed by a final extension for 10
min at 72ÆC. The appropriate number of cycles was previously
determined so that for both PCR-products amplification was in the
exponential range (data not shown). PCR-products were separated
on a 1.2% agarose gel stained with VistraGreen (Amersham) and
visualised using a Storm PhosphorImager (Molecular Dynamics).
Quantitation of the PCR-fragments of HMGB1 and GAPDH was
performed using the software program ImageQuant (Molecular
Dynamics) measuring pixel intensities.
Materials and Methods
Results
AR
Tissue samples. All canine tumour samples used in this study (Table
I) were provided by the Clinic for Small Animals, Hanover,
Germany. Samples were taken during surgery, immediately frozen
in liquid nitrogen and stored at -80ÆC.
RNA isolation. Total RNA extraction of the canine sarcoma samples
was performed according to the RNeasy midi protocol for isolation
of total RNA from heart, muscle and skin tissue (Qiagen, Hilden,
Germany) including a Proteinase K digest. Enrichment of poly A+
mRNA was carried out using the Oligotex mRNA kit (Qiagen).
Northern blot hybridisation. For Northern blot analysis, 5 Ìg of
mRNA from each sample were separated on a 1.2% denaturing
agarose gel containing 0.65% formaldehyde. RNAs were
transferred onto a Hybond-XL charged nylon membrane
(Amersham Biosciences, Buckinghamshire, England) by capillary
blot overnight. As a probe for hybridisation, a 603 bp cDNA
fragment derived from the ORF (exon 2-5) of the canine HMGB1
gene was generated by PCR using the primer pair ToastUP (5’
GGGCAAAGGAGATCCTAAGAAG 3’) (13) and Ex5lo (5’
708
Northern blot hybridisation on a series of 5 osteosarcomas,
one fibrosarcoma and one leiomyosarcoma sample of the
dog (Table I), using a cDNA probe derived from the ORF
(Exon 2-5) of the canine HMGB1 gene, resulted in the
detection of two HMGB1 mRNA transcripts of
approximately 1.4 and 2.4 kb (Figure 1), which are similar
to that observed in human tissues (15-17) and various
canine tissues (18). In order to quantify the expression of
HMGB1, the blot was rehybridised with a canine GAPDHspecific cDNA probe (Figure 1). Summing up the intensities
of the 1.4 and 2.4 kb HMGB1 signals, the HMGB1-RNA /
GAPDH-RNA ratios were calculated. As shown in Figure 1,
the analysed canine sarcoma samples revealed a strong
intertumoural variation in the relative expression of
HMGB1. Values obtained by Northern blot analysis for the
osteosarcoma samples varied between 0.52 and 1.31, while
the fibrosarcoma and the leiomyosarcoma showed ratios of
0.73 and 0.24, respectively (Table II).
Meyer et al: HMGB1 and Canine Sarcomas
Figure 2. Semi-quantitative duplex RT-PCR products of HMGB1 (603
bp) and GAPDH (445 bp) using canine cDNAs of five osteosarcomas,
one fibrosarcoma and one leiomyosarcoma after electrophoresis and
VistraGreen staining (Amersham Biosciences). Lane 1: DNA molecular
weight standard 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen). Lanes 2-6:
osteosarcoma samples 1-5 (OS1-5). Lane 7: fibrosarcoma sample (FS).
Lane 8: leiomyosarcoma sample (LMS). Lane 9: H2O, negative control.
Figure 1. Northern blot analysis of five osteosarcomas (OS1-5), one
fibrosarcoma (FS) and one leiomyosarcoma (LMS) of the dog hybridised
with a HMGB1-specific cDNA probe detecting the two canine HMGB1
transcripts of approximately 1.4 and 2.4 kb (upper part). Co-hybridisation
of the same membrane with a GAPDH-specific cDNA probe detecting a
1.3 kb transcript (lower part).
obtained by the Northern blot hybridisation and RT-PCR
analyses, mean values for each test series were calculated,
set to one, and relative expression levels were determined
(Table II, Figure 3). Statistical analysis using the Pearson’s
Correlation Test revealed a significant correlation between
the relative HMGB1 expression level obtained by Northern
blot hybridisation and the level obtained by the established
RT-PCR (r=0.8919, p=0.0071).
Table II. Absolute and relative HMGB1-mRNA / GAPDH-mRNA ratios.
Discussion
Sarcoma
sample
Absolute HMGB1 /
GAPDH-RNA ratios
RT-PCR
Northern blot
Relative HMGB1 /
GAPDH-RNA ratios1
RT-PCR Northern blot
OS1
OS2
OS3
OS4
OS5
FS
LMS
0.95
0.99
1.02
1.28
0.72
0.73
0.42
0.52
0.79
1.05
1.31
0.60
0.73
0.24
1.09
1.13
1.17
1.47
0.83
0.84
0.48
0.7
1.06
1.41
1.75
0.79
0.97
0.32
Mean value
0.87
0.75
1.0
1.0
1 Calculated with the mean values of the absolute HMGB1 / GAPDHRNA ratios set to one.
In order to confirm the results and to develop a less timeand material-consuming technique, we established a semiquantitative duplex RT-PCR suitable for detecting
intertumoural variation of HMGB1 expression in relation to
expression of the house-keeping gene GAPDH (Figure 2).
After quantitation of the signals obtained by RT-PCR, the
HMGB1-RNA / GAPDH-RNA ratios were calculated. The
values for the osteosarcoma samples varied between 0.72
and 1.28, while the ratios for the fibrosarcoma and the
leiomyosarcoma were 0.73 and 0.42, respectively (Table II).
In order to determine the comparability of the results
Cisplatin and carboplatin are widely used anticancer drugs,
manifesting their cytotoxicity to tumour cells by damaging
DNA, generating a distorted DNA duplex. HMGB1 proteins
selectively bind with high affinity to cisplatin or carboplatinDNA adducts and several investigations revealed that this
interaction contributes to tumour death by blocking excision
repair of the major cisplatin-DNA adducts (9,10).
No features have been identified yet allowing clinicians to
predict the response to cisplatin or carboplatin therapies in
dogs with osteosarcomas at the time of diagnosis or during
treatment (19). Hence, it was the aim of this study to analyse
the expression level of HMGB1 in canine sarcomas.
Based on Northern blot and RT-PCR analyses, we were
able to show an intertumoural variation of HMGB1
expression levels among canine sarcomas. Very recently,
comparable results were obtained for human breast cancer
samples (17,20) and a clinical trial designed to increase
HMGB1 expression by oestrogen treatment has been
approved by the FDA (10). The observed intertumoural
variances of HMGB1 expression in seven sarcomas analysed
in this study may be of importance for therapeutic
approaches based on cisplatin/carboplatin treatment as, for
example, tumours showing a high HMGB1 expression level
may be treated with a lower amount of this antitumour
drug. However, future clinical studies including a greater
number of tumours have to be performed to correlate the
709
ANTICANCER RESEARCH 24: 707-710 (2004)
Figure 3. Variation of relative HMGB1 expression in five osteosarcomas
(OS1-5), one fibrosarcoma (FS) and one leiomyosarcoma (LMS) of the
dog as revealed by Northern blot analysis (dark grey bars) and semiquantitative RT-PCR (light grey bars). In order to compare the results
obtained by the two methods, mean values for each test series were
calculated, set to one and relative expression levels were determined.
HMGB1 expression level with clinical outcome of
cisplatin/carboplatin chemotherapy. The statistically
significant correlation of the relative HMGB1 expression
levels obtained by Northern blot analyses as well as duplex
RT-PCR makes the established PCR approach a quick and
convenient method to determine the intratumoural HMGB1
expression.
References
AR
1 Kartalou M and Essigmann JM: Recognition of cisplatin
adducts by cellular proteins. Mutat Res 478: 1-21, 2001.
2 Bustin M, Lehn DA and Landsman D: Structural features of
the HMG chromosomal proteins and their genes. Biochim
Biophys Acta 1049: 231-243, 1990.
3 Bustin M and Reeves R: High-mobility-group chromosomal
proteins: architectural components that facilitate chromatin
function. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol 54: 35-100, 1996.
4 Jantzen HM, Admon A, Bell SP and Tjian R: Nucleolar
transcription factor hUBF contains a DNA-binding motif with
homology to HMG proteins. Nature 344: 830-836, 1990.
5 Landsman D and Bustin M: A signature for the HMG-1 box
DNA-binding proteins. Bioessays 15: 539-546, 1993.
6 Pil PM and Lippard SJ: Specific binding of chromosomal
protein HMG1 to DNA damaged by the anticancer drug
cisplatin. Science 256: 234-237, 1992.
7 Jung Y and Lippard SJ: Nature of full-length HMGB1 binding
to cisplatin-modified DNA. Biochemistry 42: 2664-2671, 2003.
710
8 Kasparkova J, Delalande O, Stros M, Elizondo-Riojas M-A,
Vojtiskova M, Kozelka J and Brabec V: Recognition of DNA
interstrand cross-link of antitumor cisplatin by HMGB1 protein.
Biochemistry 42: 1234-1244, 2003.
9 Zamble DB, Mu D, Reardon JT, Sancar A and Lippard SJ:
Repair of cisplatin-DNA adducts by the mammalian excision
nuclease. Biochemistry 35: 10004-10013, 1996.
10 He Q, Liang CH and Lippard SJ: Steroid hormones induce
HMG1 overexpression and sensitize breast cancer cells to
cisplatin and carboplatin. Proc Natl Acad Sci USA 97: 57685772, 2000.
11 Chau KY, Lam HY and Lee KL: Estrogen treatment induces
elevated expression of HMG1 in MCF-7 cells. Exp Cell Res
241: 269-272, 1998.
12 Borrmann L, Kim I, Schultheiss D, Rogalla P and Bullerdiek J:
Regulation of the expression of HMG1, a co-activator of the
oestrogen receptor. Anticancer Res 21: 301-305, 2001.
13 Jiang Z, Priat C and Galibert F: Traced orthologous amplified
sequence tags (TOASTs) and mammalian comparative maps.
Mamm Genome 9: 577-787, 1998.
14 Feinberg AP and Vogelstein B: A technique for radiolabeling
DNA restriction endonuclease fragments to high specific
activity. Anal Biochem 132: 6-13, 1983.
15 Wen L, Huang JK, Johnson BH and Reeck GR: A human
placental cDNA clone that encodes nonhistone chromosomal
protein HMG-1. Nucleic Acid Res 17: 1197-1214, 1989.
16 Rogalla P, Kazmierczak B, Flohr AM, Hauke S and Bullerdiek
J: Back to the roots of a new exon--the molecular archaeology
of a SP100 splice variant. Genomics 63: 117-122, 2000.
17 Flohr AM, Rogalla P, Meiboom M, Borrmann L, Krohn M,
Thode-Halle B and Bullerdiek J: Variation of HMGB1
expression in breast cancer. Anticancer Res 21: 3881-3885, 2001.
18 Murua Escobar H, Meyer B, Richter A, Becker K, Flohr AM,
Bullerdiek J and Nolte I: Molecular characterization of the
canine HMGB1. Cytogenet Genome Res 101: 33-38, 2003.
19 Hahn KA, Legendre AM and Talbott JR: The frequency of
micronuclei in lymphocytes of dogs with osteosarcomas: a
predictive variable for tumor response during cisplatin
chemotherapy. Cancer Epidemiol Biomakers Prev 5: 653-656,
1996.
20 Brezniceanu M-L, Völp K, Bösse S, Solbach C, Lichter P, Joos
S and Zörnig M: HMGB1 inhibits cell death in yeast and
mammalian cells and is abundantly expressed in human breast
cancer carcinoma. FASEB J 17: 1295-1297, 2003.
Received July 9, 2003
Revised November 4, 2003
Accepted December 12, 2003
IX)
Angiogenetic signaling through hypoxia.
HMGB1: an angiogenetic switch molecule
Schlueter C, Weber H, Meyer B, Rogalla P, Röser K, Hauke S, Bullerdiek J
Am J Pathol 166: 1259-1263 (2005)
Eigenanteil:
- Expression und Aufreinigung der rekombinanten HMGB1-Proteine
American Journal of Pathology, Vol. 166, No. 4, April 2005
Copyright © American Society for Investigative Pathology
Vascular Biology, Atherosclerosis and Endothelium Biology
Angiogenetic Signaling through Hypoxia
HMGB1: An Angiogenetic Switch Molecule
Claudia Schlueter,* Holger Weber,† Britta Meyer,*
Piere Rogalla,* Kerstin Röser,‡ Sven Hauke,* and
Jörn Bullerdiek*
From the Center for Human Genetics,* University of Bremen,
Bremen; the Tumor Biology Center,† Institute of Molecular
Medicine, Freiburg; and the Department of Gynecopathology,‡
Institute of Pathology, University Hospital Eppendorf,
Hamburg, Germany
The initiation of angiogenesis, called the angiogenetic
switch, is a crucial early step in tumor progression
and propagation, ensuring an adequate oxygen supply. The rapid growth of tumors is accompanied by a
reduced microvessel density, resulting in chronic
hypoxia that often leads to necrotic areas within the
tumor. These hypoxic and necrotic regions exhibit
increased expression of angiogenetic growth factors,
eg, vascular endothelial growth factor, and may also
attract macrophages, which are known to produce a
number of potent angiogenetic cytokines and growth
factors. A group of molecules that may act as mediators of angiogenesis are the so-called high-mobility
group proteins. Recent studies showed that HMGB1,
known as an architectural chromatin-binding protein, can be extracellularly released by passive diffusion from necrotic cells and activated macrophages.
To examine the angiogenetic effects of HMGB1 on
endothelial cells an in vitro spheroid model was used.
The results of the endothelial-sprouting assay clearly
show that exogenous HMGB1 induced endothelial cell
migration and sprouting in vitro in a dose-dependent
manner. Thus, this is the first report showing strong
evidence for HMGB1-induced sprouting of endothelial
cells. (Am J Pathol 2005, 166:1259 –1263)
Cell death mediated by hypoxia is a frequent event during the proliferation of tumor cell populations.1 Hypoxia
may induce apoptosis of areas of the growing tumor but
it can also lead to necrotic death of the corresponding
cells.2,3 Tumor propagation and progression depends on
the induction of tumor vascularization, ie, the angioge-
netic switch.4 Although it is now well documented that
tumor cells have the ability to induce angiogenesis by
secretion of extracellular molecules promoting the outgrowth of small vessels, the stimulation of angiogenesis
mediated by the necrotic cells themselves may be a very
efficient mechanism by which tumors can escape growth
limiting because of hypoxia.5 A group of molecules that
may act as mediators of angiogenesis released by necrotic cells are members of the so-called high-mobility
group protein family. High-mobility group proteins are
small DNA-binding proteins playing an important role in
transcriptional regulation.6 In addition, there is now increasing evidence that besides their role as regulators of
transcription at least some members of that group of
proteins can also exert extracellular functions. Of these
proteins, HMGB1 currently has been investigated most
intensively.7,8 It can be secreted by certain cells and
plays an important role in inflammation, cell migration,
differentiation, and tumorigenesis and has been identified as one of the ligands binding to the receptor for
advanced glycation end products (RAGE).9,10 HMGB1
binding to RAGE activates key cell-signaling pathways
such as MAP kinases and nuclear factor-␬B.11 In vivo, two
potential sources of circulating HMGB1 exist: HMGB1
released from damaged or necrotic cells and HMGB1
secreted from activated macrophages in response to,
eg, oxygen stress, endotoxin, tumor necrosis factor␣, or interleukin-1␤.12–14 Scaffidi and colleagues15
showed that HMGB1 rapidly leaked out from permeabilized necrotic cells, but not from permeabilized apoptotic cells. Through its secretion by activated macrophages HMGB1 again activates macrophages,
resulting in secretion of angiogenetic factors, eg, vascular endothelial growth factor (VEGF), tumor necrosis
factor-␣, and interleukin-8.16,17
Supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (grant Bu 592/4-3).
C.S. and H.W. contributed equally to this work.
Accepted for publication November 30, 2004.
Address reprint requests to Dr. J. Bullerdiek, Center for Human Genetics, University of Bremen, Leobenerstr. ZHG, D-28359 Bremen, Germany.
E-mail: [email protected].
1259
1260
Schlueter et al
AJP April 2005, Vol. 166, No. 4
It is well documented that advanced glycation end
products (AGEs) can promote angiogenesis.18,19 Okamoto and colleagues19 have cultured skin microvascular
endothelial cells with AGE resulting in a stimulated
growth and tube formation. This effect was enlarged with
increased expression of RAGE. Similar results were obtained by Yonekura and colleagues20 who were able to
show that the formation of the cord-like structure of endothelial cells induced by AGE was completely abolished
by soluble RAGE. As for the molecular mechanism of
AGE-induced angiogenesis the up-regulation of VEGF
because of signaling via nuclear factor-␬B seems to be
the key effect.19
Nevertheless, Taguchi and colleagues11 have attempted to exclude an angiogenetic effect of that protein
by placing basic fibroblast growth factor-laden pellets
into a corneal pocket. In these experiments, no differences in capillary outgrowth from the corneal limbus
compared to that after treatment with the competitive
inhibitor sRAGE were observed. sRAGE is a truncated
variant of the RAGE receptor that binds HMGB1 and
blocks the interaction with its receptor. Based on their
results Taguchi and colleagues11 have concluded that
RAGE blockade does not impair the process of neovascularization at all. However, the latter experimental design does not allow drawing a general conclusion about
possible angiogenetic effects of HMGB1. Therefore we
used a spheroid model to re-examine the effects of
HMGB1 on human endothelial cells.
Materials and Methods
Expression and Purification of HMGB1
The full-length HMGB1 cDNA-coding region was inserted
into the glutathione S-transferase (GST) fusion protein
expression vector pGEX-6P1 (Amersham Biosciences,
Freiburg, Germany) by ligation to SmaI and NotI restriction sites. Escherichia coli BL21, transformed with the recombinant plasmid, were grown in LB medium supplemented with 100 ␮g/ml of ampicillin for 6 hours at 37°C as
preparatory culture and 17 hours at 18°C as main culture.
Expression of the GST-HMGB1 fusion protein was induced by incubation with 0.1 mmol/L IPTG for 2 hours at
18°C. The bacterial pellet was resuspended in phosphate-buffered saline (PBS) and lysed by nitrogen and
lysozyme. A crude extract was separated by centrifugation and added to a 50% slurry of glutathione-Sepharose
4B equilibrated with PBS. After gentle agitation at 6°C for
45 minutes the matrix was sedimented and washed with
PBS. To obtain HMGB1 fragments without GST, fusion
protein was cleaved with PreScission Protease (Amersham Biosciences) at 6°C overnight with gentle agitation.
The cleaved GST, bonded to the slurry, was then removed by centrifugation. The identity of HMGB1 was
confirmed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel
electrophoresis. As a control to exclude any sprouting
activity from contaminating proteins obtained during the
purification process, proteins were isolated using GST
fusion protein expression vector pGEX-6P1 (Amersham
Biosciences) without any cloned insert. Purification was
performed as mentioned above.
Cell Culture
Human umbilical vein endothelial cells (Promocell, Heidelberg, Germany) were cultured according to the manufacturer’s instructions at 37°C using endothelial cell
growth media and endothelial cell growth supplement.
Only human umbilical vein endothelial cells cultured from
passages 4 to 5 were used for experiments. Endothelial
cell growth medium, endothelial cell growth supplement,
and endothelial cell basal medium were purchased from
Promocell. Fetal calf serum was obtained from Biochrom
(Berlin, Germany).
Preparation of a Collagen Stock Solution
A collagen stock solution was prepared from rat tail by
isolating the tendons without attached connective tissue.
The tendons were transferred into 0.1% acetic acid (v/v in
H2O) and stored for 48 hours at 4°C. The final solution
was centrifuged at 17,000 ⫻ g, 4°C, for 1 hour and the
clear supernatant was diluted to an OD 280 nm of 0.25.
In Vitro Angiogenesis Assay
Endothelial cells were harvested and a defined cell number (400 cells/100 ␮l) was suspended in endothelial cell
growth medium containing 0.25% (w/v) methylcellulose
(Sigma, Taufkirchen, Germany) for the generation of
spheroids. One hundred ␮l/well of the cell suspension
was seeded into nonadherent round-bottom 96-well
plates (Greiner, Frickenhausen, Germany). Nearly all
cells per well contributed to the formation of a single
spheroid (400 cells/spheroid) during the 24-hour culture
at 37°C. The spheroids were harvested and embedded in
collagen.21
In brief, at room temperature 48 spheroids were suspended in 0.5 ml of endothelial cell basal medium containing 20% fetal calf serum and 1% (w/v) methylcellulose
to prevent sedimentation of spheroids before polymerization of the collagen gel. The ice-cold collagen stock
solution (8 vol) was mixed with 10⫻ M199 (1 vol; Sigma)
and 0.1 N of NaOH (⬃1 vol) to adjust the pH to 7.4. Then
0.5 ml of the neutralized collagen solution was rapidly
mixed with 0.5 ml of spheroid suspension and transferred
into prewarmed 24-well plates. After polymerization 100
␮l of basal medium with 10⫻ concentrated test substance was added on top of each gel. The gels were
incubated at 37°C in 5% CO2 at 100% humidity. After 24
hours and fixation with 1 ml of 10% paraformaldehyde, in
vitro angiogenesis was digitally quantitated by measuring
the length of the sprouts that had grown out of each
spheroid (ocular grid at ⫻40 magnification, cumulative
sprout length) using the digital imaging software analySIS
(Soft Imaging System, Muenster, Germany). The mean
and SD of the cumulative sprout length from 10 randomly
selected spheroids per gel was determined (correspond-
HMGB1: A Potential Angiogenetic Factor
1261
AJP April 2005, Vol. 166, No. 4
ing to one test substance). All experiments were performed twice.
Statistics
Statistical significance was tested using the t-test and
was set at P ⬍ 0.001.
Tissue Samples
In the present study breast cancer samples taken directly
after surgery were immunohistochemically analyzed. All
patients signed an informed consent.
Immunohistochemistry
Immunohistochemical examination of 5-␮m sections of
human breast cancer was performed with a goat polyclonal antibody raised against a peptide mapping within
an internal region of the HMGB1 protein of human origin
(sc-12523; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).
Immunostaining was achieved by a three-step procedure
(primary antibody, secondary antibody, and avidin-biotin-complex) using the Vectastain ABC method (Vector
Laboratories, Burlingame, CA). Briefly, sections of paraffin-embedded tissue were dewaxed in xylene and rehydrated in an ethanol series and finally resuspended in
PBS (pH 7.4). Endogenous peroxidase activity was
quenched by incubation in 0.75% H2O2 in methanol followed by a microwave pretreatment for 15 minutes with
citric acid buffer (pH 6.0). After washing two times in tap
water and PBS, tissue sections were incubated for 20
minutes in rabbit serum followed by incubation with the
goat polyclonal HMGB1 antibody (1:100 diluted in 2%
bovine serum albumin in PBS). After incubation overnight
at 4°C, tissue sections were washed three times in PBS
and incubated with biotin-conjugated rabbit anti-goat
IgG for 30 minutes at room temperature. After further
washing in PBS, they were incubated for 30 minutes with
ABComplex and freshly prepared according to the manufacturer’s instructions. After final washing in PBS, the
peroxidase reaction was initiated by application of diaminobenzidine solution (prepared according to the manufacturer’s instructions). The reaction was stopped after 10
minutes by washing in tap water and tissue sections were
counterstained with Meyer’s hematoxylin, dehydrated,
cleared, and mounted. Immunohistochemistry was evaluated using a digital camera (AxioCam; Zeiss, Göttingen,
Germany).
Results
Immunohistochemical analysis confirmed HMGB1 expression in all macrophages within necrotic areas of the
tumors tested (Figure 1). To check the specificity of secondary antibody, staining controls without the primary antibody were performed. No immunostaining for HMGB1 was
visible in these controls. Furthermore, we examined possible angiogenetic effects of HMGB1 in a three-dimensional
Figure 1. Immunohistochemical analysis of a necrotic area of breast cancer
sample using an antibody raised against the human HMGB1 protein. a:
HMGB1 is present in the nuclei and cytoplasm of the breast cancer cells next
to the necrotic area. b: Magnification of boxed area of a. HMGB1 is detectable in the nuclei as well as in the cytoplasm of macrophages. Original
magnifications: ⫻100 (a); ⫻400 (b).
spheroid model of endothelial cell differentiation. For a better comparison of the HMGB1 sprouting effects the results
were compared to the effects of VEGF, which is known to be
one of the key regulators of angiogenesis. Endothelial cell
spheroids of defined cell number (400 cells/spheroid) were
seeded in collagen gels, stimulated with HMGB1 in different
concentrations (2 ␮g/ml, 0.4 ␮g/ml, and 0.08 ␮g/ml) and
compared to a VEGF stimulation (25 ng/ml). The cumulative
length of outgrowing capillary-like sprouts was quantitated
after 24 hours. For every concentration the mean ⫾ SD
measuring the average cumulative sprout lengths of 10
randomly selected spheroids per experimental group were
determined.
The results clearly point out that HMGB1 induces endothelial cell migration and sprouting in vitro in a dosedependent manner. In detail, there is no endothelial cell
sprouting activity without HMGB1 measurable, reflecting
the quiescent phenotype of the human umbilical vein
endothelial cells. In contrast, sprouting activity can be
stimulated strongly by exogenous HMGB1. A concentra-
1262
Schlueter et al
AJP April 2005, Vol. 166, No. 4
Figure 3. A proposed model for the angiogenetic effects of HMGB1. Solid
lines, released factors; dashed lines, their effects.
Figure 2. Quantitative three-dimensional in vitro angiogenesis assay based
on collagen gel-embedded endothelial cell spheroids treated with VEGF and
HMGB1, respectively. Capillary sprouting originating from the spheroids was
quantified after 24 hours using digital imaging software analysis. The average
cumulative length of 10 randomly selected sprouts was calculated.
tion of 2 ␮g/ml of HMGB1 induced the outgrowth of
capillary-like sprouts with an average length of 394 ␮m.
HMGB1 (0.4 ␮g/ml) induced an average sprouting activity of 242 ␮m and 0.08 ␮g/ml HMGB1 an average sprouting of 221 ␮m, respectively (Figure 2).
In general, relative potency in sprouting formation produced by HMGB1 was lower than that produced by
VEGF (average sprouting of 552 ␮m), but highly significant (P ⬍ 0.0001) compared to the negative control.
Comparing the HMGB1 angiogenetic effects with those
of VEGF, 2 ␮g/ml of HMGB1 induced an endothelial cell
sprouting of 70%, 0.4 ␮g/ml HMGB1 44%, and 0.08
␮g/ml HMGB1 40% activity, respectively. Additionally, to
exclude any sprouting activity from contaminating proteins obtained during the purification process, proteins
were isolated using a pGEX-6P1 vector without any
cloned insert. These proteins did not show sprouting
activity at all (data not shown).
Discussion
The initiation of angiogenesis, called the angiogenetic
switch, is a crucial early step in tumor progression and
propagation, ensuring an adequate oxygen supply.4,5
The rapid growth of tumors is accompanied by a reduced
microvessel density, resulting in chronic hypoxia, often
leading to necrotic areas within the tumor.22 These hypoxic and necrotic regions correspond to an increased
expression of angiogenetic growth factors, eg, VEGF,
which are capable to turn what is called the angiogenetic
switch, ie, to stimulate endothelial cell growth as a step in
angiogenesis.1,23 Recent studies showed that necrotic
cells may attract macrophages into the tumor, which then
contribute to the angiogenetic process.2 Macrophages
have been shown to produce a number of potent angiogenetic cytokines and growth factors, eg, VEGF, tumor
necrosis factor-␣, and interleukin-8 and constitute a key
type of angiogenetic effector cells.16,24 Necrotic cells as
well as activated macrophages are a source for a novel
type of chemokines, the high-mobility group proteins. As
to its proinflammatory activity HMGB1 is the currently
best-investigated high-mobility group protein.17
Recent studies showed that HMGB1, known as an
architectural chromatin-binding protein, can be extracellularly released by passive diffusion from necrotic cells
and is secreted by activated macrophages.8,15,25 Further
studies revealed that extracellular HMGB1 may act as a
strong macrophage-activating factor when binding to the
receptor for advanced glycation end products (RAGE).17
RAGE is a multiligand receptor with advanced glycation
end products (AGEs) constituting a major group of ligands. Among the effects of an engagement of RAGE by
AGEs are proangiogenetic effects on vascular endothelial cells as for example, their tube formations. This effect
is mediated by the induction of VEGF via nuclear factor-␬B signaling.19 Accordingly, it seems well reasonable
to assume that yet another ligand of RAGE, HMGB1, can
also act as an angiogenetic switch molecule.
This is the first report showing that HMGB1 can induce
sprouting of endothelial cells. To examine the angiogenetic effects of HMGB1 on endothelial cells a spheroid
model of endothelial cells in vitro was used. The results of
the endothelial-sprouting assay clearly show that exogenous HMGB1 induces endothelial cell migration and
sprouting in vitro in a dose-dependent manner. In vivo two
sources of HMGB1 exist: necrotic cells and macrophages. Two different ways for the angiogenetic function
of HMGB1 can be postulated. One mechanism could be
an indirect effect via the activation of macrophages, resulting in secretion of angiogenetic factors as, for example, VEGF, tumor necrosis factor-␣, and interleukin-8.16,17
Secondly, HMGB1, acting as an angiogenetic factor itself, can actively be released by activated macrophages
and necrotic cells (Figure 3).8,25
Our knowledge of the signaling mechanism by which
HMGB1 activates endothelial cells and macrophages is
still incomplete.17 One possible signaling way could be
through its receptor for advanced glycation end products, RAGE, which is expressed, for example, in endothelial cells.26,27 Apart from HMGB1-receptor interactions, it has been demonstrated that HMGB1 binds to
many membrane molecules, possibly stimulating angiogenetic effects.28,29
Our results, revealing an angiogenetic effect of
HMGB1, are in contrast to an interpretation by Taguchi
and colleagues11 placing basic fibroblast growth factorladen pellets into a corneal pocket, and observing capillary growth from the corneal limbus compared to that
after treatment with sRAGE. Taguchi and colleagues11
showed that the interaction between HMGB1 and its receptor RAGE has no effect on neovascularization in the
fibroblast growth factor-mediated angiogenesis pathway.
HMGB1: A Potential Angiogenetic Factor
1263
AJP April 2005, Vol. 166, No. 4
Either it could be that the RAGE/HMGB1 interaction does
not play a significant role in fibroblast growth factormediated angiogenesis or the angiogenetic effect of
HMGB1 is masked in this case by stronger effects of
other angiogenetic factors not examined in that study.
Nevertheless this is the first report that shows an angiogenetic effect of HMGB1. It remains to be investigated if
this is solely because of the induction of VEGF or if there
are other effects supporting the role HMGB1 as an angiogenetic switch molecule.
14.
15.
16.
17.
References
1. Pugh CW, Ratcliffe PJ: Regulation of angiogenesis by hypoxia: role of
the HIF system. Nat Med 2003, 9:677– 684
2. Leek RD, Landers RJ, Harris AL, Lewis CE: Necrosis correlates with
high vascular density and focal macrophage infiltration in invasive
carcinoma of the breast. Br J Cancer 1999, 79:991–995
3. Harris AL: Hypoxia—a key regulatory factor in tumour growth. Nat Rev
Cancer 2002, 2:38 – 47
4. Ruoslahti E: Specialization of tumour vasculature. Nat Rev Cancer
2002, 2:83–90
5. Bergers G, Benjamin LE: Tumorigenesis and the angiogenic switch.
Nat Rev Cancer 2003, 3:401– 410
6. Bustin M, Lehn DA, Landsman D: Structural features of the HMG
chromosomal proteins and their genes. Biochim Biophys Acta 1990,
1049:231–243
7. Muller S, Scaffidi P, Degryse B, Bonaldi T, Ronfani L, Agresti A,
Beltrame M, Bianchi ME: New EMBO members’ review: the double life
of HMGB1 chromatin protein: architectural factor and extracellular
signal. EMBO J 2001, 20:4337– 4340
8. Degryse B, Bonaldi T, Scaffidi P, Muller S, Resnati M, Sanvito F,
Arrigoni G, Bianchi ME: The high mobility group (HMG) boxes of the
nuclear protein HMG1 induce chemotaxis and cytoskeleton reorganization in rat smooth muscle cells. J Cell Biol 2001, 152:1197–1206
9. Guazzi S, Strangio A, Franzi AT, Bianchi ME: HMGB1, an architectural
chromatin protein and extracellular signalling factor, has a spatially
and temporally restricted expression pattern in mouse brain. Gene
Expr Patterns 2003, 3:29 –33
10. Hori O, Brett J, Slattery T, Cao R, Zhang J, Chen JX, Nagashima M,
Lundh ER, Vijay S, Nitecki D: The receptor for advanced glycation
end products (RAGE) is a cellular binding site for amphoterin. Mediation of neurite outgrowth and co-expression of RAGE and amphoterin in the developing nervous system. J Biol Chem 1995,
270:25752–25761
11. Taguchi A, Blood DC, del Toro G, Canet A, Lee DC, Qu W, Tanji N, Lu
Y, Lalla E, Fu C, Hofmann MA, Kislinger T, Ingram M, Lu A, Tanaka H,
Hori O, Ogawa S, Stern DM, Schmidt AM: Blockade of RAGE-amphoterin signalling suppresses tumour growth and metastases. Nature
2000, 405:354 –360
12. Wang H, Bloom O, Zhang M, Vishnubhakat JM, Ombrellino M, Che J,
Frazier A, Yang H, Ivanova S, Borovikova L, Manogue KR, Faist E,
Abraham E, Andersson J, Andersson U, Molina PE, Abumrad NN,
Sama A, Tracey KJ: HMG-1 as a late mediator of endotoxin lethality in
mice. Science 1999, 285:248 –251
13. Wang H, Vishnubhakat JM, Bloom O, Zhang M, Ombrellino M, Sama
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
A, Tracey KJ: Proinflammatory cytokines (tumor necrosis factor and
interleukin 1) stimulate release of high mobility group protein-1 by
pituicytes. Surgery 1999, 126:389 –392
Abraham E, Arcaroli J, Carmody A, Wang H, Tracey KJ: HMG-1 as
a mediator of acute lung inflammation. J Immunol 2000,
165:2950 –2954
Scaffidi P, Misteli T, Bianchi ME: Release of chromatin protein
HMGB1 by necrotic cells triggers inflammation. Nature 2002,
418:191–195
Ono M, Torisu H, Fukushi J, Nishie A, Kuwano M: Biological implications of macrophage infiltration in human tumor angiogenesis. Cancer
Chemother Pharmacol 1999, 43:S69 –S71
Andersson U, Erlandsson-Harris H, Yang H, Tracey KJ: HMGB1 as a
DNA-binding cytokine. J Leukoc Biol 2002, 72:1084 –1091
Treins C, Giorgetti-Peraldi S, Murdaca J, Van Obberghen E: Regulation of vascular endothelial growth factor expression by advanced
glycation end products. J Biol Chem 2001, 276:43836 – 43841
Okamoto T, Yamagishi S, Inagaki Y, Amano S, Koga K, Abe R,
Takeuchi M, Ohno S, Yoshimura A, Makita Z: Angiogenesis induced
by advanced glycation end products and its prevention by cerivastatin. FASEB J 2002, 16:1928 –1930
Yonekura H, Yamamoto Y, Sakurai S, Petrova RG, Abedin MJ, Li H,
Yasui K, Takeuchi M, Makita Z, Takasawa S, Okamoto H, Watanabe
T, Yamamoto H: Novel splice variants of the receptor for advanced
glycation end-products expressed in human vascular endothelial
cells and pericytes, and their putative roles in diabetes-induced
vascular injury. Biochem J 2003, 370:1097–1109
Korff T, Augustin HG: Tensional forces in fibrillar extracellular matrices control directional capillary sprouting. J Cell Sci 1999,
112:3249 –3258
Hemmerlein B, Kugler A, Ozisik R, Ringert RH, Radzun HJ, Thelen P:
Vascular endothelial growth factor expression, angiogenesis, and
necrosis in renal cell carcinomas. Virchows Arch 2001, 439:645– 652
Kim I, Kim HG, Moon SO, Chae SW, So JN, Koh KN, Ahn BC, Koh GY:
Angiopoietin-1 induces endothelial cell sprouting through the activation of focal adhesion kinase and plasmin secretion. Circ Res 2000,
86:952–959
Torisu H, Ono M, Kiryu H, Furue M, Ohmoto Y, Nakayama J, Nishioka
Y, Sone S, Kuwano M: Macrophage infiltration correlates with tumor
stage and angiogenesis in human malignant melanoma: possible
involvement of TNFalpha and IL-1alpha. Int J Cancer 2000,
85:182–188
Gardella S, Andrei C, Ferrera D, Lotti LV, Torrisi MR, Bianchi ME,
Rubartelli A: The nuclear protein HMGB1 is secreted by monocytes
via a non-classical, vesicle-mediated secretory pathway. EMBO Rep
2002, 3:995–1001
Rauvala H, Huttunen HJ, Fages C, Kaksonen M, Kinnunen T, Imai S,
Raulo E, Kilpelainen I: Heparin-binding proteins HB-GAM (pleiotrophin) and amphoterin in the regulation of cell motility. Matrix Biol
2000, 19:377–387
Schmidt AM, Yan SD, Yan SF, Stern DM: The biology of the receptor
for advanced glycation end products and its ligands. Biochim Biophys Acta 2000, 1498:99 –111
Salmivirta M, Rauvala H, Elenius K, Jalkanen M: Neurite growthpromoting protein (amphoterin, p30) binds syndecan. Exp Cell Res
1992, 200:444 – 451
Bianchi ME: Interaction of a protein from rat liver nuclei with cruciform
DNA. EMBO J 1988, 7:843– 849
X)
Molecular characterization and mapping of the canine
cyclin D1 (CCND1) gene
Meyer B, Murua Escobar H, Winkler S, Dolf G, Schelling C, Bullerdiek J, Nolte I
Anim Genet 35: 413 (2004)
Eigenanteil:
- Planung, Durchführung und Auswertung der Studie mit Ausnahme des BACScreenings, welches von G. Dolf und C. Schelling durchgeführt wurde, und des
FISH-Mappings, welches von S. Winkler durchgeführt wurde
- Verfassen der Veröffentlichung
Brief notes
doi:10.1111/j.1365-2052.2004.01172.x
Molecular characterization and mapping of the
canine cyclin D1 (CCND1) gene
B. Meyer*, H. Murua Escobar*,†, S. Winkler*, G.
Dolf‡, C. Schelling§, J. Bullerdiek* and I. Nolte†
*Center for Human Genetics, University of Bremen, Bremen,
Germany. †Small Animal Clinic, School of Veterinary Medicine,
Hanover, Germany. ‡Institute of Animal Genetics, Nutrition and
Housing, University of Berne, Berne, Switzerland. §Department of
Animal Science, Swiss Federal Institute of Technology Zurich and
Faculty of Veterinary Medicine, University of Zurich, Zurich,
Switzerland
Accepted for publication 23 June 2004
Introduction: Cyclin D1, also known as PRAD1 or BCL-1, acts
as regulator of progression through the G1 phase during the
cell cycle by activation of cyclin-dependent kinases CDK4 and
CDK6. In humans overexpression of cyclin D1, partially due to
gene amplification, has been found in a wide variety of cancers,
including breast cancer.1
Sequence analysis: For characterization of the canine CCND1
gene and the corresponding protein, cDNA from a canine osteosarcoma was screened with primers specific for the ORF of
human cyclin D1 (GenBank accession no. NM_053056; primer
pair CYCup: CGA TGC CAA CCT CCT CAA CGA, CYClo: TGT
GGC ACA AGA GGC AAC GAA). After cloning and sequencing
of the amplification product two additional primer sets were
used to amplify the complete ORF (primer pairs Cyc1up: CAC
ACG GAC TAC AGG GGA GT, Cyc333doglo: GCA CAC ACT
TGA AGT AGG ACA C and Cyc695dogup: ACA CTT CCT CTC
CAA GAT GCC, AP2: AAG GAT CCG TCG ACA TCT TTT TTT
TTT TTT TTT T). Sequence analyses allowed the composition of
a 1246 bp cDNA contig (GenBank accession no. AY620434),
showing 90.4% sequence identity of the canine ORF compared
with the human counterpart. In accordance with the human
orthologue the deduced canine protein comprises 295 AA with
93.3% similarity between the two species.
BAC library screening: For use as FISH probe, a BAC clone was
PCR-screened from the DogBAC library (http://www.dogmap.ch)
with primers designed using human CCND1 DNA sequence
GenBank accession no. L09054 (primer pair CYCup: CGA TGC
CAA CCT CCT CAA CGA, CYCint1lo: GAA ACG TGG GTC TGG
GCA ACA). The obtained positive BAC clone (DogBAC library
ID S041P23D08) was verified by PCR, cloning and subsequent
sequencing.
Gene mapping: For mapping of the chromosomal location of the
canine CCND1 gene, metaphase preparations and fluorescence
in situ hybridization (FISH) were performed as described previously.2 G-banded chromosomes were identified according to
Reimann et al.3 Ten well-spread metaphases were analysed
exhibiting a signal on CFA17 on both chromatids of both
chromosomes (Fig. 1).
Comments: During the last decade the dog has gained in
importance as a model organism for the investigation of
mechanisms underlying human genetic disease, including
cancer. Immunohistochemical analyses of cyclin D1 expression
in canine mammary tumours using a polyclonal antibody
against human cyclin D1 revealed contradictory data. Murakami et al.4 found cyclin D1 expression in only two adenocarcinomas of 75 mammary lesions tested whereas Sfacteria et al.5
detected cyclin D1 in 60% of pre-cancerous lesions and 44% of
cancerous lesions of the canine mammary gland with correlation of proliferative ratio and cyclin D1 expression. Mapping
and sequencing of the canine CCND1 gene and corresponding
protein could help to elucidate the role of cyclin D1 in dogs and
its usefulness as model organism concerning this matter. Yang
et al.6 found no conservation of synteny between HSA11,
where the human CCND1 maps, and CFA17. This discordance
could be due to small rearrangements, deletions and insertions
existing in the dog.7
References
1 Ormandy C. J. et al. (2003) Breast Cancer Res Treat 78, 323–
35.
2 Murua Escobar H. et al. (2001) Cytogenet Cell Genet 94,
194–5.
3 Reimann N. et al. (1996) Cytogenet Cell Genet 73, 140–4.
4 Murakami Y. et al. (2000) J Vet Med Sci 62, 743–50.
5 Sfacteria A. et al. (2003) J Comp Pathol 128, 245–51.
6 Yang F. et al. (1999) Genomics 62, 189–202.
7 Guyon R. et al. (2003) Cold Spring Harb Symp Quant Biol 68,
171–8.
Correspondence: Prof. Dr Ingo Nolte (inolte@klt.
tiho-hannover.de)
Figure 1 Canine metaphase spread after GTGbanding (a) and the same metaphase after
FISH with BAC S041P23D08 showing signals
on both chromosomes 17 (b).
2004 International Society for Animal Genetics, Animal Genetics, 35, 408–423
413
XI)
The canine NRAS gene maps to CFA 17
Richter A, Murua Escobar H, Günther K, Meyer B, Winkler S, Dolf G, Schelling
C, Nolte I, Bullerdiek J
Anim Genet 35: 355-356 (2004)
Eigenanteil:
- Klonierung eines NRAS PCR-Produktes für das BAC-Screening
Brief notes
canine AKT3 gent to CFA 7q17 and defined the chromosomal band following the nomenclature established by
Reimann et al.6
References
1 Masure S. et al. (1999) Eur J Biochem 265, 353–60.
2 Nicholson K. M. et al. (2002) Cell Signal 14, 381–95.
3 Schelling C. et al. (2002) J Anim Breed Genet 119, 400–1.
4 Murua Escobar H. et al. (2001) Cytogenet Cell Genet 94, 194–5.
5 Yang F. et al. (1999) Genomics 62, 189–202.
6 Reimann N. et al. (1996) Cytogenetics Cell Genetics 73, 140–4.
Correspondence: J. Bullerdiek ([email protected])
doi:10.1111/j.1365-2052.2004.01158.x
The canine NRAS gene maps to CFA 17
A. Richter*, H. Murua Escobar*,†, K. Günther*,
B. Meyer*, S. Winkler*, G. Dolf‡, C. Schelling§,
I. Nolte† and J. Bullerdiek*
*Centre for Human Genetics, University of Bremen, Bremen,
Germany. †Small Animal Clinic, School of Veterinary Medicine
Hanover, Hanover, Germany. ‡Institute of Animal Genetics,
Nutrition and Housing, University of Berne, Berne, Switzerland.
§
Department of Animal Science, Swiss Federal Institute of Technology Zurich, Faculty of Veterinary Medicine, University of Zurich,
ETH-Zentrum, Zurich, Switzerland
Accepted for publication 1 May 2004
Figure 1 Metaphase spread after fluorescence in situ hybridization
with signals on both chromosome 7s (above) and GTG- banding
(below).
cloned and sequenced for verification of AKT3 with BAC clone
10C05-4.
Fluorescence in situ hybridization: Metaphase preparations and
fluorescence in situ hybridization (FISH) were performed as
described previously.4 Ten metaphases were examined and all
demonstrated hybridization of the AKT3 probe on both
chromatids of canine chromosome 7 (Fig. 1).
Comments: It has been reported that canine chromosome 7
shares homology with human chromosomes (HSA) 1 and 18.
The long (q) arm of CFA7 corresponds to the homologous
region on HSA1, whereas the homologous regions with HSA18
are distributed over both arms of CFA7.5 The human AKT3
gene is located at HSA 1q43–44. According to Yang et al.,5
this region shares homology with CFA7. We mapped the
Introduction: The dog is an emerging model organism for the
investigation of mechanisms involved in human disease,
including cancer. Several parallels in human and canine
tumours have been described, with comparable environmental
living conditions and age of tumour onset in both human and
canine patients as well as similarities in development and histology of tumours in both species.1 NRAS is a member of the ras
proto-oncogene family of proteins that act in growth-related
signal transduction and are frequently involved in the development of human tumours, with ras point mutations being one
of the most important alterations in the onset of malignancies.2
Ras genes show high sequence similarity across different
mammalian species such as human, cat, dog, cattle and
rodents, with most nucleotide differences representing synonymous changes not affecting the amino acid sequence.3 In
malignancies, most amino acid exchanges in ras genes are
caused by alterations of the so-called hot spot codons 12, 13,
and 61 in exons 1 and 2, respectively, leading to constitutively
active ras proteins that bring about constant signal transduction, facilitating uncontrolled cell division. These hot-spot
codons have been described to be affected in other mammalian
species as well. In dogs, NRAS mutations were found in
lymphomas4 and malignant melanomas.5
The canine NRAS gene had not been mapped so far, therefore, in this study we localized the chromosomal location of the
canine NRAS gene by fluorescence in situ hybridization (FISH).
2004 International Society for Animal Genetics, Animal Genetics, 35, 350–359
355
356
Brief notes
Figure 1 Metaphase spread after fluorescence
in situ hybridization showing signals on both
chromosomes 17 (right) and the same metaphase after GTG-banding (left).
BAC library screening: In order to isolate a FISH probe, the
DogBAC canine BAC library6 (http://www.dogmap.ch/) was
polymerase chain reaction (PCR)-screened. Primers were
designed using canine mRNA sequence GenBank accession no.
U62093 (primer UP: GACTGAGTACAAACTGGTGG and primer
LO: GGGCCTCACCTCTATGGTG). The PCR conditions were
established on canine blood genomic DNA, the corresponding
PCR product cloned and verified by sequencing. The positive
BAC clone (DogBAC library ID S050P24H09) was verified by
PCR and sequencing.
Gene mapping: For mapping the chromosomal location of the
canine NRAS gene, metaphase preparations and FISH were
performed as described previously.7 Ten well spread metaphases
exhibited a signal on CFA 17 on both chromatids of both
chromosomes (Fig. 1), following the nomenclature of the canine
karyotype as established by Reimann et al.8
Comments: NRAS mutations in humans have been found in
30% of liver tumours, 40% of myelodysplastic syndrome, 30%
of acute myelogenous leukaemia, 13% of brain tumours and in
53% of follicular and 60% of undifferentiated papillary thyroid
tumours.9 In dogs, depending on tumour type, comparable
occurrences exist in malignant melanomas,5 while fibrosarcomas showed no amino acid alteration of the NRAS protein
(H. Murua Escobar, K. Günther, A. Richter, J. T. Soller,
S. Winkler, I. Nolte & J. Bullerdiek 2004, personal communication). Overall, data available on involvement of ras protooncogenes in tumours of dogs are still insufficient. Knowledge
of the cytogenetic properties of NRAS will further the understanding of this important gene. The mapping results obtained
in this study are in accordance with the known homology between canine chromosome 17 and the centromer-proximal
regions 11.1–13.3 of the p-arm of human chromosome 1.10
References
1 Hahn K A. et al. (1994) In Vivo 8, 133–43.
2 Arber N. (1999) Apoptosis 4, 383–8.
3 Watzinger F. et al. (1998) Mamm Genome 9, 214–9.
4
5
6
7
8
9
10
Mayr B. et al. (2003) Acta Vet Hung 51, 91–4.
Mayr B. et al. (2003) Vet J 165, 169–71.
Schelling C. et al. (2002) J Anim Breeding Genet 119, 400–1.
Becker K. et al. (2003) Anim Genet 34, 68–9.
Reimann N. et al. (1996) Cytogenet Cell Genet 73, 140–4.
Spandidos D. A. et al. (2002) Int J Oncol 21, 237–41.
Yang F. et al. (1999) Genomics 62, 189–202.
Correspondence: J. Bullerdiek ([email protected])
doi:10.1111/j.1365-2052.2004.01159.x
Linkage mapping of chicken ovoinhibitor and
ovomucoid genes to chromosome 13
K. Kinoshita*, T. Shimogiri†, S. Okamoto†, K. Yoshizawa‡, H. Mannen‡, H. R. Ibrahim†, H. H Cheng§
and Y. Maeda†
*The United Graduate School of Agricultural Sciences, Kagoshima
University, Korimoto, Kagoshima 890-0065, Japan. †Faculty of
Agriculture, Kagoshima University, Korimoto, Kagoshima 8900065, Japan. ‡Faculty of Agriculture, Kobe University, Nada-ku,
Kobe 657-8501, Japan. §United States Department of Agriculture,
Agriculture Research Service, East Lansing, MI 48823, USA
Accepted for publication 10 May 2004
Source/description: Ovoinhibitor (OIH) and ovomucoid (OVM)
are the major proteinase inhibitors constituting 1.5 and 11% of
the total proteins in hen egg white, respectively. Although OVM
exerts its antiprotease activity only against trypsin, OIH has a
wide spectrum of inhibitory activity for other proteinases that
occur in chicken egg white and blood plasma.1 They are
functionally similar proteins and having multiple domains with
a characteristic pattern of disulphide bridges.1 From the analysis of DNA sequences and the positions of exons and introns, it
2004 International Society for Animal Genetics, Animal Genetics, 35, 350–359
Anhang
154
10
Anhang
10.1
Tabellen
Tab. 1: Klinische Daten der 22 Mammakarzinompatientinnen, deren peripheres Blut vor (-1)
und während (-2) der Therapie mittels Real-time RT-PCR auf ihre HMGA2-Expression
untersucht wurde. n.d. - not determined (Daten nicht bekannt); PR - partial response
(Teilremission), CR - complete response (Vollremission), SD - stable disease (Stabilisierung).
Patient
01-1
01-2
02-1
02-2
03-1
03-2
04-1
04-2
05-1
05-2
06-1
06-2
07-1
07-2
08-1
08-2
09-1
09-2
10-1
10-2
11-1
11-2
12-1
12-2
13-1
13-2
14-1
14-2
15-1
15-2
16-1
16-2
17-1
17-2
18-1
18-2
19-1
19-2
20-1
20-2
21-1
21-2
22-1
22-2
Alter
38
42
38
62
67
68
76
62
54
59
73
67
42
51
54
49
58
60
44
51
74
85
Tumor
invasiv
duktal
invasiv
duktal
invasiv
duktal
invasiv
duktal
szirrhös
invasiv
duktal
invasiv
duktal
invasiv
duktal
invasiv
duktal
invasiv
duktal
Adeno-Ca
invasiv
papillär
invasiv
duktal
invasiv
duktal
invasiv
duktal
invasiv
duktal
invasiv
duktal
invasiv
duktal
invasiv
duktal
invasiv
duktal
invasiv
lobulär
invasiv
duktal
Grade
TNM (initial)
ER
PR
Her2
Stadium
Ansprechen
3
n.d.
n.d.
n.d.
nd
neoadjuv
PR
neg
3+
neoadjuv
CR
neg
3+
neoadjuv
CR
pos
3+
metast
PR
ypT1a ypN0 (0/12)
neg
cM0 pL0 pV0
ypTx ypN0 (0/14)
neg
3
cM0 pL0 pV0 GX RX
pT3 pN1biii (4/12) M0
pos
2 bis 3
G2-3
3
2
pT1 N1 (5/8) M0 G2
pos
pos
3+
metast
SD
n.d.
ypT3 pN2a (5/5) M0
L0 V0 R0
pos
neg
2+
neoadjuv
PR
3
pT2 pN1biii M0
pos
pos
3+
metast
SD
n.d.
pT2 pN0 M0
pos
pos
1+
metast
SD
3
pT4 pN1biii G3
pos
neg
neg
metast
SD
n.d.
pT1 pN1 (3/10) M0
neg
neg
1+
metast
SD
n.d.
n.d.
pos
neg
3+
metast
SD
neg
neg
1+
metast
SD
neg
neg
neg
neoadjuv
PR
neg
neg
3+
metast
SD
neg
neg
3+
neoadjuv
PR
pos
pos
3+
metast
PR
pos
pos
1+
metast
CR
pos
n.d.
neoadjuv
PR
pos
1+
neoadjuv
SD
neg
1+
metast
PR
pT1c R0 G2 pN1bi
(1/21) M0
ypT1b ypN3a (22/23)
3
M0 G3 R0
pt1c(m) pN1bii (5/18)
3
M0 G3
ypT0 N1a (1/8) R0
2 bis 3
M0
ypT4d pN1biii (2/22)
2
G2 L1 R0
2
n.d.
2
2
3
pT2 N1b N0
pT3 pN0 M0 G1-2 L1
pos
R1
ypT3, pN2a (6/11) R0
pos
G2 M0
pT2 (1c) pN0 M0 G3
neg
L1
2
cT4 Nx M1 G2
neg
neg
neg
metast
PR
2
pT1 pN1b M0 G2
n.d.
n.d.
n.d.
metast
PR
Anhang
155
Tab. 2: Patientendaten und Ergebnisse der HMGA2-Expressionsanalyse mittels quantitativer
Real-time RT-PCR im peripheren Blut von Patienten mit unterschiedlichen Diagnosen sowie
von gesunden Probanden (Z.n. - Zustand nach).
Diagnose
Transkriptmenge /
250 ng Gesamt-RNA
5.809
Probe
Alter
01
59
03
73
04
72
CLL unter Endoxan-Behandlung
Glomerulonephritis unter Cortison-Behandlung,
Z.n. geheiltem Merkelzelltumor
progredientes follikuläres Lymphom, Z.n. Kolonkarzinom
06
60
Lupus erythematodes
4.174
07
58
Lupus erythematodes unter MTX- u. Cortisonbehandlung
5.279
09
67
diffuse Knochenmetastasierung
6.609
10
64
Pankreaskarzinom
4.073
11
56
kongenitales gemischtes variables Immundefektsyndrom
1.126
12
86
Z.n. geheiltem hochmalignen Lymphom
3.183
13
71
MDS
8.221
14
61
follikuläres Lymphom
6.018
15
58
follikuläres Lymphom
5.681
16
67
rheumatoide Arthritis, Z.n. M.Hodgkin geheilt
8.701
17
33
Lymphom, bisher unklassifiziert
4.361
18
31
Immunthrombozytopenie
15.131
19
41
familiäres Immundefektsyndrom (B-Zell-Defekt)
7.380
20
18
familiäres Immundefektsyndrom (B-Zell-Defekt)
9.734
21
69
hochmalignes Lymphom in Remission
6.247
22
24
Sarkoidose
5.427
23
79
ossär metastasiertes Mammakarzinom
8.277
24
70
Autoimmunthrombozytopenie
5.097
25
58
ossär metastasiertes Mammakarzinom
9.580
26
45
Langerhanshistiozytose
7.393
27
54
Lupus erythematodes mit Myositis
6.845
28
58
follikuläres Lymphom Grad II
8.556
30
47
gesund
6.940
31
51
gesund (Asthma bronchiale)
4.441
32
43
gesund (Diabetes mellitus)
5.202
33
57
gesund (Hepatitis B nicht aktiv)
4.779
34
31
gesund
4.702
35
28
gesund
5.599
36
43
gesund (Mammakarzinom geheilt)
9.076
40
33
Takayasu-Syndrom
6.126
41
66
cutanes B-Zell-Lymphom
5.363
42
71
gemischtes variables Immundefektsyndrom
10.608
43
18
Z.n. geheiltem M. Hodgkin
6.988
44
31
M. Behçet
4.731
45
36
CML in Akzeleration
46
63
Lupus erythematodes
7.705
12.070
157.506
4.187
Anhang
156
Diagnose
Transkriptmenge /
250 ng Gesamt-RNA
5.034
Probe
Alter
47
65
sekundäres hochmalignes Lymphom
48
58
follikuläres Lymphom Grad I
5.285
49
68
metastasiertes Mammakarzinom
9.773
50
69
Merkel-Zellkarzinom
3.340
Anhang
157
Tab. 3: Klinische Daten zu den mittels quantitativer Real-time RT-PCR auf ihre HMGA2-Expression untersuchen Blutproben von Patienten mit
Erkrankungen des hämatopoetischen und lymphatischen Systems.
Probe
Alter
Diagnose
B1
29
ALL nach Transplantation, jetzt: GvH
Zellzahl
[109/l]
11,1
B2
66
Haarzellleukämie
1,7
B3
59
CLL
30,9
B4
56
5,9
B5
61
AML M5a,
später Rezidiv mit 85,5 G/l
CML
8,9
B6
B8
44
34
ALL L2
ALL/AML (M6/c-ALL)
5,8
7,0
B13
B14
70
66
4,5
13,1
B15
B16
B17
66
69
61
B18
B21
65
84
MDS (refraktäre Anämie)
CML,
später verstorben im septischen Schock
AML M2
AML M4 nach MDS, niedrigzellig
ALL (Burkitt-Typ/c-ALL mit schwacher
Expression Myeloperoxidase)
CLL mit Hämolyse
AML nach MDS
13,2
2,2
B22
B24
B25
64
72
68
CML in Blastenkrise, später verstorben
MDS mit Panzytopenie
CML
40,0
2,4
5,5
B26
B28
B29
68
96
69
AML M2
AML M1, später verstorben
AML M2, später verstorben
9,6
10,0
2,2
5,8
1,4
2,9
Art der Therapie
Therapiedauer
a) Polychemotherapie
b) Hochdosistherapie mit allogener Stammzelltransplantation
c) Glukokortikoide und Cyclosporin
a) α-Interferon
b) α-Interferon
c) Cladribin (=Leustatin)
a) Chlorambucil
b) Cyclophosphamid (=Endoxan), Oncovin, Prednisolon
c) Fludarabin
a) Polychemotherapie
a) ab 02/03
b) 08/03
c) jetzt
a) 11/95-11/96
b) 06/97-12/98
c) seit 01/00
a) 06/03-11/03
b) 02/04-06/04
c) 10/04-12/04
a) 04/04-08/04
a) α-Interferon + Hydroxyurea
b) Hydroxyurea
a) Polychemotherapie
a) Polychemotherapie
b) ZNS- Bestrahlung
a) Cyclosporin
a) Hydroxyurea
b) Imatinib (=Glivec)
a) Polychemotherapie
vor Therapie
vor Therapie
a) 02/95-02/00
b) seit 02/00
a) 03/91-12/93
a) 02/99- 02/01
b) 04/99-06/99
a) seit 08/04
a) 10(04-11/04
b) seit 18.1.04
a) seit 08/03
a) Fludarabin
a) bei MDS
b) nach Übergang in AML: Idarubicin
a) Hydroxyurea
vor Therapie
a) Hydroxyurea
b) Imatinib (=Glivec)
vor Therapie
vor Therapie
vor Therapie
a) 10/04-12/04
a) 01/04-05/04
b) seit 11/04
a) seit 03/04
a) 12/02-02/03
b) seit 02/03
Anhang
158
Probe
Alter
Diagnose
Art der Therapie
39
67
80
67
44
68
AML M5a nach Polyzythämie,
später verstorben
c-ALL
AML nach MDS
AML M5, später verstorben
prä-B-ALL
AML M4
AML M5
Zellzahl
[109/l]
1,8
B31
71
B32
B33
B34
B35
B36
B37
4,8
1,2
2,9
2,5
17,0
6,2
B41
B43
B46
B47
B49
B50
B52
24
68
61
83
62
57
85
Morbus Hodgkin
großzelliges B-Zell-Lymphom
Plasmozytom
extranodales Marginalzonen-B-Zelllymphom
Hochmalignes B-Zelllymphom
Plasmozytom
AML nach MDS
12,4
6,1
3,8
9,8
3,7
11,5
70,0
B53
B54
74
57
AML M4
CLL
1,3
5,0
B57
B58
B60
B61
B62
B64
68
75
54
66
51
42
CML
Polycythämie
CML
IgG-Gammopathie
AML M1
hochmalignes Lymphom
6,5
76,1
3,0
4,2
8,0
9,1
B65
B66
B68
C1
48
57
74
55
IgG-Plasmozytom
Polycythämie
primäre Thrombozythämie
CML in Remission
3,0
3,4
4,1
6,2
C2
41
CML in chronischer Phase
1,4
vor Therapie
vor Therapie
vor Therapie
vor Therapie
vor Therapie
a) Polychemotherapie
b) Rezidiv:keine Therapie
vor Therapie
vor Therapie
a) Melphalan
vor Therapie
a) Polychemotherapie
vor Therapie
a) Cyclosporin
b) Idarubicin
vor Therapie
a) Fludarabin
b) Cyclophosphamid, Vincristin, Prednison
a) Hydroxyurea
a) Hydroxyurea
a) α-Interferon
a) Melphalan
a) Polychemotherapie
a) Polychemotherapie mit Stammzelltransplantation
b) Polychemotherapie mit Stammzelltransplantation (Rezidiv)
a) Idarubicin und Dexamethason
a) Hydroxyurea
a) Hydroxyurea
a) Hydroxyurea
b) Imatinib
a) Hydroxyurea
b) Imatinib
c) AMN 107
Therapiedauer
vor Therapie
a) 11/96-11/99
b) jetzt
a) bis 06/05
a) 05-10/04
a) 01-05/04
b) seit 11/04
a) 12/02-03/03
b) 04/03-09/03
a) seit 08/04
a) seit 05/01
a) seit 10/02
a) seit 05/05
a) 01/95-02/96
a) 04-08/94
b) 05-08/03
a) seit 09/05
a) seit 08/05
a) seit 04/05
a) 04/03-06/03
b) seit 07/03
a) 06/04
b) 07/04-03/06
c) seit 03/06
Anhang
159
Probe
Alter
Diagnose
C3
C4
18
62
CML in Akzeleration
CML in Remission
Zellzahl
[109/l]
165,0
4,8
C5
45
CML in chronischer Phase
6,2
C6
53
CML in chronischer Phase
4,4
C7
47
CML in Remission
3,9
Art der Therapie
Therapiedauer
vor Therapie
a) Hydroxyurea
b) Imatinib
a) Hydroxyurea
b) Imatinib
a) Hydroxyurea
b) Imatinib
a) Imatinib
a) seit 09/05
b) seit 09/05
a) seit11/05
b) seit 11/05
a) 01/06-02/06
b) seit 02/06
a) seit 03/03
Anhang
160
Tab. 4: Daten zu mittels FACS aufgereinigten mononukleären Zellen (MC) aus peripherem
Blut (PBMC) oder aus Knochenmark (KM) von fünf AML-Patienten und zwei APL- (NB4)
bzw. AML- (HL-60) Zelllinien
Patient
2811
2555
2521
2440
2439
NB4
HL-60
Alter
78
51
76
69
-
Art der Zellen
PBMC
PBMC
PBMC
MC (aus KM)
PBMC
akute Pomyelozyten Leukämie (APL)
akute myeloische Leukämie (AML)
FACS-Reinheit
CD34+ 48%, CD33+ 37%
CD34+ 90%
CD34+ 25%, CD33+ 30%
CD33+ 90%
CD34+ 33%
-
Anhang
10.2
161
Abbildungen
Abbildung 1:
8.00
7.00
Relative Transkriptmenge
6.00
5.00
4.00
3.00
2.00
1.00
22-2
22-1
19-2
19-1
18-2
18-1
16-2
16-1
15-2
15-1
14-2
14-1
13-2
13-1
12-2
12-1
09-2
09-1
08-2
08-1
07-2
07-1
05-2
05-1
04-2
04-1
03-2
03-1
02-2
02-1
01-2
01-1
0.00
Proben-Nr.
Abb. 1: Relative HMGA2-Transkriptmengen im peripheren Blut von 22 Mammakarzinompatientinnen vor (-1, in gelb dargestellt) und während (-2, in rot dargestellt) der Therapie. Als
Kalibrator dient jeweils die Probe vor Therapiebeginn.
Anhang
162
Abbildung 2:
180000
Absolute Transkriptmenge / 250 ng Gesamt-RNA
160000
140000
120000
100000
80000
60000
40000
20000
0
1 3 4 6 7 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 30 31 32 33 34 35 36 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50
Probennummer
Abb. 2: Absolute HMGA2-Transkriptmengen pro 250 ng Gesamt-RNA im peripheren Blut
von Patienten mit unterschiedlichen Diagnosen (rot dargestellt) und von gesunden
Probanden (gelb dargestellt).
ne
sL
y
Po mph
AM lyzy om
t
B6
CL L na häm
ie 4
L m ch
B
M
66
it
D
CM Häm S B
21
L c oly
se
Mo
h
rbu ronis B18
CM s Ho ch C
L c dgk 02
in
h
Pla ronis B41
ch
sm
Pla ozy C06
sm tom
ex
oz
tra
yto B50
IgG
no
m
da
Ga
B
C
les
CM
mm ML 46
Ma
L
op
B2
in
rgi
a
5
th
Re
na
lzo
mi ie B
ss
61
ne
i
o
n-B
AM n C
-Z
L M 04
IgG ell-L
1
ho
ch
Pla ymp B62
ma
ho
sm
m
lign
oz
yto B4 7
es
m
B-Z
B
ell
-Ly CLL 63
B5
mp
4
h
AM om
L M B49
MD
4B
CM
S,
3
ref L ch CML 6
ron
ra k
B6
t
CM äre isch 0
Li
n R Anäm C05
em
ie
B1
iss
3
AM ion C
MD
L M 07
Sm
it P AM 1 B2
L
an
8
pri
zy M 5
mä
top
B3
re
7
e
n
Th
i
A
gro
rom ML e B2
ßz
4
M2
elli Haa ozyt
B2
ge
h
9
s B rzelll ämi
-Ze euk e B
68
ll-L äm
ym ie B
ph
0
2
o
AL m B
43
LL
2
AM
B0
L
6
CM
AM M4 B
Li
5
L
n
M2 3
Re
AL
Ln
mi
ss B15
ac
ion
hT
C
ran
sp CML 01
lan
B
5
t
AM ation 7
L M B0
IgG
5a 1
B0
Pla
sm CLL 4
oz
B0
y
AL tom 3
L/A
B
ML 65
B
CM 08
LB
Po
0
lyz ALL 5
yth
B
AM
äm 17
LM
ie
B5
4n
C
8
ac ML
h M B1
4
AM DS B
CM
1
L
L i prä- M5 6
nA
B
B
kz -ALL 34
ele
rat B35
AM ion C
AM
L M 03
LM
2B
A
5 n ML n
AL 2 6
ac
a
L
c
hP
h
B
oly MD 32
S
CM AML zythä B5
2
m
L m nac
it B h M ie B3
1
DS
las
ten
B3
kri
3
se
B2
2
ho
ch
ma
lig
Absolute HMGA2 -Transkriptmenge / 250 ng Gesamt-RNA
Anhang
1.00E+06
163
Abbildung 3:
1.00E+07
vor Therapie
unter Therapie
nach Therapie
1.00E+05
1.00E+04
1.00E+03
1.00E+02
1.00E+01
1.00E+00
Diagnosen
Abb. 3: Logarithmische Darstellung der absoluten HMGA2-Transkriptmengen pro 250 ng Gesamt-RNA in Blutproben von Patienten mit Erkrankungen
des hämatopoetischen und lymphatischen Systems. Blau dargestellt sind Patienten, welche noch keine Therapie erhalten haben, rot markiert sind
Patienten unter Therapie und grau solche Patienten, welche sich zur Zeit der Blutentnahme nicht mehr in Therapie befanden.
AM
Ln
CL
L m ach M
it H
DS
B2
CM ämo
1
lys
Lc
eB
h ro
18
nis
ch
ge C02
su
n
ge d 31
su
n
CM
ge d 34
Lc
su
nd
h ro
3
nis
ch 3
ge C06
su
n
ge d 32
su
CM
nd
Li
CM 35
nR
L
em
iss B25
i
AM on C
L M 04
1B
62
ge
su
nd
CL 30
AM L B5
LM
4
4B
CM
3
CM
6
CM L ch
LB
ro
Li
n R nisc 60
h
em
iss C05
ion
AM
C
L M 07
1B
28
ge
s
AM und
L M 36
AM 5 B
L M 37
2B
AL
L L 29
AM 2 B
L M 06
CM
AM 4 B
Li
n R L M 53
2
AL
em
Ln
iss B15
ac
i
o
n
hT
C
ran
CM 01
sp
lan L B5
ta
7
AM tion
L M B01
5a
B
CL 04
LB
AL
L/A
0
ML 3
B0
CM
8
LB
0
5
AL
AM
LB
LM
CM 17
4n
L
ac
h M B14
DS
AM
B
L M 16
CM
p
r
ä -B 5 B
Li
34
nA
-A
LL
kz
ele
B
35
rat
i
AM on C
L M 03
AM
2B
LM
AM
Ln
AL 2 6
5n
L
a
ac
h P ch M B32
oly
DS
zy
A
thä B52
CM ML
mi
L m nac
eB
it B h M
31
DS
las
ten
B3
3
kri
se
B2
2
Absolute HMGA2 -Transkriptmenge / 250 ng Gesamt-RNA
Anhang
164
Abbildung 4:
1.00E+07
1.00E+06
vor Therapie
unter Therapie
nach Therapie
Gesunde
1.00E+05
1.00E+04
1.00E+03
1.00E+02
1.00E+01
1.00E+00
Diagnosen
Abb. 4: Logarithmische Darstellung der absoluten HMGA2-Transkriptmengen pro 250 ng Gesamt-RNA in Blutproben von Leukämiepatienten im
Vergleich zu gesunden Probanden (gelb). Blau dargestellt sind Patienten, welche noch keine Therapie erhalten haben, rot markiert sind Patienten
unter Therapie, grau solche Patienten, welche sich zur Zeit der Blutentnahme nicht mehr in Therapie befanden.
ge
su
nd
31
ge
su
nd
34
ge
C
M
s
un
L
ch
d
ro
33
ni
sc
h
C
06
ge
su
nd
32
ge
su
nd
C
M
35
L
C
in
M
L
Re
B2
m
5
iss
io
n
C
04
ge
su
nd
30
C
C
M
M
L
L
ch
C
B6
M
ro
0
L
ni
in
sc
h
Re
C
m
05
iss
io
n
C
C
M
07
ge
L
in
su
Re
nd
m
36
iss
io
n
C
01
C
M
L
B5
7
C
M
L
C
B0
M
5
L
C
in
M
L
Ak
C
M
B1
ze
L
4
le
in
ra
Ak
C
tio
M
ze
n
L
l
45
e
m
ra
it
t
i
Bl
on
as
C
te
03
nk
ris
e
B2
2
Absolute HMGA2 -Transkriptmenge / 250 ng Gesamt-RNA
Anhang
165
Abbildung 5:
1.00E+07
1.00E+06
Patienten
Gesunde
1.00E+05
1.00E+04
1.00E+03
1.00E+02
1.00E+01
1.00E+00
Diagnosen
Abb. 5: Logarithmische Darstellung der absoluten HMGA2-Transkriptmengen pro 250 ng Gesamt-RNA von CML-Patienten (rot) im Vergleich zu
gesunden Probanden (gelb).
Anhang
166
1.00E+07
1.00E+06
1.00E+05
vor Therapie
unter Therapie
nach Therapie
Gesunde
1.00E+04
1.00E+03
1.00E+02
1.00E+01
M
D
S
B2
ge
1
su
nd
31
ge
su
nd
34
ge
su
nd
33
ge
su
nd
32
ge
su
AM nd
35
L
M
1
B6
ge
2
su
AM nd
30
L
M
AM 4 B
36
L
M
1
B2
ge
8
su
AM nd
36
L
M
AM 5 B
37
L
M
AM 2 B
29
L
M
AM 4 B
53
L
M
2
AM
B1
L
5
M
5a
AM
AL
B0
L
L/
M
AM 4
4
na
L
ch
B0
8
M
D
S
AM
B1
6
L
M
AM
5
B3
L
AM AM
M
4
L
L
5
M
na
na
2
ch
B2
ch
6
M
Po
D
ly
S
zy
B
AM
th
äm 52
L
na
ie
B3
ch
1
M
D
S
B3
3
1.00E+00
AM
L
na
ch
Absolute HMGA2 -Transkriptmenge / 250 ng Gesamt-RNA
Abbildung 6:
Diagnosen
Abb. 6: Logarithmische Darstellung der absoluten HMGA2-Transkriptmengen pro 250 ng Gesamt-RNA in Blutproben von AML-Patienten im Vergleich
zu gesunden Probanden (gelb). Blau dargestellt sind Patienten, welche noch keine Therapie erhalten haben, rot markiert sind Patienten unter Therapie
und grau solche Patienten, welche sich zur Zeit der Blutentnahme nicht mehr in Therapie befanden.
167
Abbildung 7:
Absolute HMGA2 -Transkriptmenge / 250 ng Gesamt-RNA
1,20E+06
1.027.741
1,00E+06
938.769
827.466
8,00E+05
574.453
6,00E+05
494.370
4,00E+05
2,00E+05
144.781
7.251
0,00E+00
2811
2555
2521
2440
2439
NB4
HL-60
Mononukleäre Zellen und Zelllinien
Abb. 7: Absolute HMGA2-Transkriptmengen pro 250 ng Gesamt-RNA in mittels FACS aufgereinigten
mononukleären Zellen von fünf AML-Patienten bzw. in einer APL- (NB4) und einer AML-Zelllinie (HL60).