Tumorspezifisch exprimierte und Wnt-1 induzierte Gene

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V.
ZUSAMMENFASSUNG
Kolorektale Tumoren entstehen durch eine Abfolge von genetischen Veränderungen in
Tumorsuppressorgenen und Proto-Onkogenen. Ein sehr frühes Ereignis ist dabei häufig eine
Mutation entweder im APC- oder im β-Catenin-Gen, deren Genprodukte an einem Signalweg
beteiligt sind, der normalerweise durch Wachstumsfaktoren der Wnt-Familie reguliert wird.
Diese Mutationen führen zur Transkriptionsaktivierung von zum Teil noch unbekannten Zielgenen dieses Signalwegs. Aber auch andere genetische Veränderungen bei der Tumorentwicklung führen häufig zu einem veränderten Genexpressionsmuster in den Tumorzellen
im Vergleich zu gesunden Zellen.
Ziel dieser Arbeit war es zum einen, durch die „Differential Display Reverse Transcription
PCR“ (DD-PCR) das Genexpressionsmuster der normalen Kolonzelllinie NCM460 mit dem
der beiden Kolon-Adenokarzinomzelllinien SW480 und HCT116 zu vergleichen. Dabei
wurden folgende differentiell exprimierten Gene identifiziert: Das Gen für das „Plazenta
Protein diff33“, Cholecystokinin (CCK), „Histon macroH2A1.2“, RTP („Reducing Agents
and Tunicamycin-responsive Protein“), Reticulocalbin, TRAG3 („Taxol Resistance
Associated Gene 3“), Caldesmon sowie ein unbekannter EST. Weiterhin konnten im Rahmen
dieser Arbeit auch zwei bisher unbekannte menschliche Gene kloniert werden, nämlich das
menschliche Homolog des Gens für den Rab5 GDP/GTP Austauschfaktor vom Rind (Rabex5)
sowie ein Gen das aufgrund seines Expressionsmusters den Namen UCC1 („Upregulated in
Colon Carcinoma“) erhalten hat. Das hieraus abgeleitete Protein zeigt Ähnlichkeit zu
Ependyminen von verschiedenen Fischarten, einem in der Hirnmatrix vorkommenden
Glykoprotein. Für eine ähnliche Funktion von UCC1 spricht auch die erhöhte Expression des
Gens in allen Bereichen des menschlichen Gehirns. Die differentielle Expression von UCC1
und TRAG3 konnte auch in primären menschlichen Darmtumorproben nachgewiesen werden.
Im zweiten Teil der Arbeit sollten Gene identifiziert werden, deren Expression in der MausBrustdrüsenepithelzelllinie C57MG durch Wnt-1-Überexpression induziert wird. Mittels einer
Subtraktiven Hybridisierung wurden drei Gene gefunden, die in Wnt-1-transformierten Zellen
stärker exprimiert wurden als in den entsprechenden Kontrollzellen. Dies waren eine nur in
der Maus bekannte repetitive Sequenz, ein bei der Maus bisher unbekanntes Gen, dessen
menschliches Homolog „KIAA0025“ noch nicht näher charakterisiert wurde, und das Gen für
den Zellkernrezeptor nur/77. Expressionstests der letzteren beiden Gene in Wnt-1transformierten PC12 Zellen zeigten für das KIAA0025-Homolog keine Unterschiede.
NGFI-B, das vermutliche nur/77-Homolog der Ratte, wies dagegen in PC12-Wnt-1 eine
geringere Expression als in den Wildtypzellen auf. Somit scheint Wnt-1 in den PC12 Zellen
ein Gegenspieler von NGF zu sein, welches die NGFI-B Expression induziert.
In menschlichen 293-Zellen konnte weder für KIAA0025 noch für das menschliche Homolog
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von nur/77 eine Transkriptionsaktivierung durch β-Catenin-Transfektion festgestellt werden.
In den zuvor untersuchten menschlichen Kolon-Tumorzelllinien zeigte KIAA0025 eine
geringere Expression als in der normalen Zelllinie. Insgesamt deuten diese Ergebnisse darauf
hin, dass Wnt-1 die Expression der identifizierten Gene entweder indirekt beeinflusst oder
dass sie nicht über den bekannten β-Catenin/TCF-vermittelten Wnt-Signalweg reguliert
werden.
Die nur/77-Überexpression in C57MG-Wnt-1 könnte eine wichtige Rolle bei der durch das
„Mouse mammary tumor virus“- (MMTV) induzierten Tumorentstehung haben, da ein
Promoterbereich dieses Virus, das „MMTV-Long Terminal Repeat“, ein potentielles
Response Element des Zellkernrezeptors nur/77 enthält.
Um Anhaltspunkte für die Funktion des KIAA0025-Proteins zu erhalten, wurden immuncytochemische Analysen zur Lokalisierung dieses Proteins in der Zelle durchgeführt. Dabei
zeigte sich, dass das Protein eventuell mit den zu den Intermediären Filamenten zählenden
Cytokeratinfilamenten kolokalisiert. Außerdem wurde bei einem Expressionstest in
verschiedenen menschlichen Geweben eine ubiquitäre Expression des Gens festgestellt. Dies
deutet darauf hin, dass das Protein eine essentielle Funktion für die Zelle hat.