eine klinische und wissenschaftliche Herausforderung
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Das Prostatakarzinom - eine klinische und wissenschaftliche Herausforderung Bernd Wullich Urologie und Kinderurologie Nach kontinuierlicher Zunahme der Prostatakarzinom-bedingten Todesfälle ist in den USA seit 1993 eine Trendumkehr zu verzeichnen. Ob dieser Mortalitätsrückgang allerdings auf die verbesserten Früherkennungsprogramme insbesondere unter Einsatz der SerumPSA-Diagnostik zurückgeführt werden kann, ist unklar. Auch in Ländern wie England, wo keine speziellen Screeningprogramme eingerichtet sind, wird ein solcher Rückgang beobachtet, so dass auch Veränderungen des LifeStyle als mögliche Ursachen in Betracht kommen. Unumstritten jedoch ist, dass Prostatakarzinom-Früherkennungsprogramme den Anteil derjenigen Tumoren, die in einem niedrigen Tumorstadium erstdiagnostiziert werden, deutlich erhöht. Diese Tatsache ist aber nur dann von Nutzen, wenn gezeigt werden kann, dass der Behandlungsbeginn in einem frühen Tumorstadium entweder zu einem verbesserten Gesamtüberleben führt oder die Häufigkeit, mit der aggressive Behandlungsmethoden eingesetzt werden müssen, reduziert. Das Dilemma bei der Behandlung des Prostatakarzinoms Ein klinisches Dilemma liegt darin, dass wir heute beim Prostatakarzinom nicht in der Lage sind vorauszusagen, welchem Patienten beispielsweise durch eine wait-and-see-Strategie die Chance einer Heilung genommen wird und umgekehrt, welcher Patient durch einen invasiven Therapieansatz wie der radikalen Prostatektomie oder Strahlenthe- Abb. 1: Karyogramm (GTG-Bandierung) einer Prostatakarzinomzelle nach Kurzzeitkultivierung: 46,XY,-16,+der(16)t(1;16)(q13;q23). rapie vielleicht sogar übertherapiert ist. Ein weiteres klinisches Dilemma resultiert aus der Diskrepanz zwischen Prävalenz und Mortalität. Autopsiestudien haben gezeigt, dass etwa 30% aller Männer älter als 50 Jahre histologisch ein Prostatakarzinom in sich tragen. Die geschätzte Wahrscheinlichkeit, im Laufe des Lebens ein klinisch manifestes Prostatakarzinom zu entwickeln, liegt jedoch nur bei etwa 10%, daran zu versterben bei etwa 3%. Das daraus ableitbare langsame Wachstumsverhalten des Prostatakarzinoms steht jedoch im Gegensatz zum statistischen Gesamtrisiko, an einem Prostatakarzinom zu versterben. Das Prostatakarzinom gehört zu den größten medizinischen und gesundheitspolitischen Herausforderungen unserer Zeit. Mit weitem Abstand ist es der häufigste bösartige Tumor des Mannes in den westlichen Industrienationen und rangiert in den Krebsmortalitätsstatistiken hinter dem Bronchialkarzinom auf Platz zwei. Allein in den USA wurde 2001 bei fast 200.000 Männern ein Prostatakarzinom diagnostiziert, in der Bundesrepublik Deutschland bei über 30.000. Trotz der Fortschritte in Diagnostik und Therapie, die in den vergangenen 25 Jahren zu einer deutlichen Verbesserung der Überlebensraten geführt haben, sind dennoch eine Reihe von Fragen beim Prostatakarzinom unbeantwortet oder Gegenstand kontroverser Diskussionen. 2 Welches sind die biologisch aggressiven Tumoren? Zur Beantwortung dieser Frage könnte der Molekulargenetik eine zentrale Aufgabe zukommen, die bereits bei anderen Tumorentitäten gezeigt hat, dass sie mit dem verbesserten Verständnis von Tumorentstehung und -wachstum einen wichtigen Beitrag zu einer verbesserten Tumordiagnostik, differenzierteren Abschätzung des Krankheitsverlaufs und Entwicklung neuer Therapieansätze leisten kann. Entstehung und Wachstum des Prostatakarzinoms unterliegen einem genetischen Vielschrittmechanismus. In diesen Vielschrittmechanismus sind sowohl die Aktivierung von Zellwachstum und Tumorprogression stimulierenden Genen (Onkogene, Metastasierungsgene), als auch die Inaktivierung von diese Mechanismen inhibierenden Genen (Tumor- und Metastasierungssuppressorgene) eingeschlossen. Die Variabilität in der Reihenfolge des Auftretens dieser genetischen Veränderungen lässt vermuten, dass ihr kumulativer Effekt für Tumorinitiation, -promotion und -pro- Universität des Saarlandes gression wichtiger ist als ihre Chronologie. Die Identifizierung von Genen und Molekülen sowie die Charakterisierung der Mechanismen, durch welche sie zu Tumorbildung und Tumorprogression beitragen, stellt ein zentrales Arbeitsgebiet der Prostatakarzinomforschung dar. Unsere eigenen Forschungsarbeiten am Prostatakarzinom sind eingebunden in eine interdisziplinäre Kooperationstruktur, in die neben der Urologischen Klinik insbesondere das Institut für Humangenetik, das Pathologische Institut und das Institut für Medizinische Biochemie der Universität des Saarlandes gleichermaßen eingebunden sind. Der genomischen Analyse von Prostatakarzinomzellen kommt dabei ein besonderer Schwerpunkt zu, wobei das Hauptinteresse der Analyse der Rolle von Genamplifikationen bei der Prostatakarzinomentwicklung gilt. In diesem Zusammenhang wurde jetzt ein Forschungsprojekt von der Deutschen Krebshilfe der Dr. Mildred ScheelStiftung für Krebsforschung bewilligt. Im Folgenden soll ein kurzer Überblick über den Stand unserer Forschungsarbeiten und die eingesetzten Methoden gegeben werden. Klassische Zytogenetik Ausgehend von ProstatakarzinomKurzzeitkulturen, die aus frischen Gewebepartikeln aus Prostatektomiepräparaten etabliert wurden, erfolgte zunächst mit Hilfe klassischer zytogenetischer Bänderungstechniken die Untersuchung von Prostatakarzinomzellen auf chromosomale Veränderungen. Obwohl klonale chromosomale Veränderungen in unserem Zellkulturmodell mit 22% nur selten nachgewiesen werden konnten (Abb. 1), war die Häufigkeit nonklonaler chromosomaler Veränderungen auffällig. Dies lässt auf eine genetische Instabilität der Prostatakarzinomzelle schließen. Die Annahme erscheint plausibel, dass Mutationen, die pUC1.77 pY3.4 Abb. 2: FISH mit den DNA-Sonden pUC1.77 (Chromosom 1-spezifisch) und pY3.4 (Y-spezifisch) an Zellvereinzelungspräparaten aus einem Prostatakarzinom. Es zeigt sich eine Zunahme von Chromosom 1- Signalen als Hinweis auf eine Polysomie 1 bei normaler Zahl von Y-Chromosomen. zu dieser genetischen Instabilität beitragen, dadurch zu einem Selektionsvorteil führen, dass sie die Bildungsrate genetischer Varianten, die an bestimmte Wachstumsbedingungen besser angepasst sind, erhöhen. Fluoreszenz- in situ-H Hybridisierung (FISH) Während die konventionelle Chromosomenbänderung ein rein zytologisches Verfahren darstellt, lassen sich mit den modernen Fortschritten der so genannten molekularen Zytogenetik zytologische und molekulare Informationen verbinden. Mit Hilfe der in situ-Hybridisierung können in zellulären Präparaten gezielt Veränderungen von Chromosomen oder Chromosomenabschnitten mit guter Auflösung detektiert werden. So fanden wir bei der Untersuchung nativer Prostatakarzinomgewebeproben unter Einsatz der FISH eine Aneuploidierate von 65% (Abb. 2). Die offensichtliche Diskrepanz zwischen Priv.-D Doz. Dr. Bernd Wullich absolvierte sein Medizinstudium an der Albert-Ludwigs-Universität in Freiburg/Br., wo er 1985 auch promovierte. Nach der Ausbildung zum Facharzt für Humangenetik sowie der Habilitation und Ernennung zum Privatdozenten für Humangenetik schloss er die Facharztausbildung für Urologie an und erweiterte 1999 seine Habilitation mit Verleihung der Venia legendi für das Fach Humangenetik, Urologie und Kinderurologie. Seit Dezember 2000 ist er Oberarzt der Klinik und Poliklinik für Urologie und Kinderurologie der Universitätskliniken in Homburg/Saar. magazin forschung 2/2002 den klassischen zytogenetischen und FISH-Untersuchungsergebnissen geht dabei auf eine der klassischen Zytogenetik innewohnende Schwierigkeit zurück: Die Metaphasezytogenetik ist auf proliferierende Zellen angewiesen, die bei Tumoren mit niedrigem Proliferationsindex, wie es beim Prostatakarzinom der Fall ist, durch Direktpräparation aus nativem Gewebe nicht in ausreichender Menge gewonnen werden können; dadurch wird die Zellkultur unumgänglich. In vitro-Bedingungen können die Situation in vivo aber nur unvollständig simulieren, so dass Selektionsvorgänge in Kultur nicht auszuschließen sind. Der Frage der Klonselektionierung in Zellkultur sind wir nachgegangen und konnten zeigen, dass in der Tat die aneuploiden Zellen unter unseren Zellkultivierungsbedingungen einen deutlichen Proliferationsnachteil aufweisen. Einer der Schwerpunkte der Arbeitsgruppe von Prof. G. Unteregger und Prof. Th. Zwergel in unserer Klinik gilt deshalb der Verbesserung der Zellkultivierungsbedingungen für Prostatakarzinomzellen, die der für das Prostatakarzinomwachstum in vivo wichtigen Epithel-Stroma-Interaktion in sehr viel höherem Maße Rechnung tragen als das durch die klassischen Zellkultivierungsverfahren bislang der Fall war. Vergleichende genomische Hybridisierung (CGH) Einer der Hauptkritikpunkte an FISHTechniken ist, dass die Detektion chro- 3 mosomaler Anomalien von der Auswahl geeigneter DNA-Sonden abhängt. Da nur die chromosomalen Regionen, für die entsprechende DNA-Sonden verwendet werden, mittels FISH beurteilbar sind, muss bei vielen Fragestellungen bereits vor einem Experiment ausreichend Grundwissen über mögliche veränderte Regionen vorhanden sein. Um diesen Nachteil zu überwinden, führten wir die erstmals 1992 beschriebene CGH als Technik in unserem Labor ein. Der Ansatz der CGH ermöglicht, das ganze Genom mit einem Hybridisierungsexperiment auf über- oder unterrepräsentierte DNAAbschnitte zu untersuchen. Da die CGH keine Zellkultivierung erfordert, findet Abb. 3: Die CGH bedeutet eine erhebliche Verfeinerung der Analyse chromosomaler Veränderungen. DNA aus normalem und Tumorgewebe werden nach differenzieller Markierung als Sonden eingesetzt und vergleichend auf normale Metaphasechromosomen hybridisiert. Dies ermöglicht im Überblick die Erfassung von überund unterrepräsentierten DNA-Sequenzen im gesamten Genom. Abb. 4: Beispiel einer CGH-Analyse, die den copy number-Karyotyp der Prostatakarzinomzelllinie DU145MN1 zeigt. Das durchschnittliche Verhältnis von Tumor- zu Normal-DNA wurde aus mindestens 13 Referenzchromosomen errechnet. Für jedes Pixel wird das Verhältnis von FITC-Fluoreszenz (grün, Tumor-DNA) zu Rhodamin-Fluoreszenz (rot, Normal-DNA) bestimmt und entlang der Chromosomenachse als Kurve aufgetragen. Die Schwellenwerte für überrepräsentierte DNA (grüne Linie) und unterrepräsentierte DNA (rote Linie) sind angegeben. 4 sie vor allem ihre Anwendung in der Tumorzytogenetik. Hierbei wird die gesamte genomische DNA der zu untersuchenden Gewebeprobe auf normale Metaphasechromosomen, die zum Beispiel aus Lymphozyten präpariert wurden, hybridisiert (Abb. 3). DNA-Abschnitte, die im Tumorgenom über- oder unterrepräsentiert sind, können durch differenzielle Markierung von Test- und Referenz-DNA sichtbar gemacht werden. Wir konnten mit dieser Technik genomische Veränderungen in 80% der untersuchten Prostatakarzinome nachweisen (Abb. 4). Beobachtungen, die in androgenunabhängig wachsenden Rezidivtumoren deutlich mehr DNA-Veränderungen beschrieben als in Primärtumoren, wurden bestätigt. Bemerkenswert an unserer eigenen Untersuchungsserie ist, dass wir DNA-Gewinne deutlich häufiger nachweisen konnten als DNA-Verluste. Dies lässt vermuten, dass neben den durch FISH– und Allelotypisierungsuntersuchungen gut dokumentierten allelischen Verlusten auch Amplifikationen von Genen eine wichtige Bedeutung bei der Entstehung und/oder Progression des Prostatakarzinoms zukommt. Mittlerweile sind eine Reihe von Genamplifikationen in Prostatakarzinomen beschrieben, wobei insbesondere der Abb. 5: Abb. 5: 56% der untersuchten Prostatakarzinome weisen in der CGH-Analyse DNA-Kopien-Gewinne auf 3q auf. Innerhalb der kleinsten gemeinsamen Region (3q25-q27) konnten wir Amplifikationen verschiedener Gene beim Prostatakarzinom nachweisen. Universität des Saarlandes Abb. 6: SKY-Karyogramm der Prostatakarzinomzelllinie PC3-125-1L. Chromosomen-spezifische DNA-Sonden werden simultan auf Metaphasechromosomen der Tumorzellen hybridisiert. Jedem Chromosom lässt sich dabei ein charakterisches Farbspektrum zuordnen, das sich aus der chromosomenspezifischen Kombination verschiedener Fluorochrome ergibt. Die bildhafte Darstellung erfolgt mittels Falschfarbenzuordnung. In dem gezeigten Karyogramm kommen die komplexen chromosomalen Umbauten gut zur Darstellung. Amplifikation des Androgenrezeptogens sowie der cMYC-Amplifikation eine prognostische Bedeutung zukommen könnte. nisch relevanter molekularer Marker für das Prostatakarzinom ergibt, bleibt der Klärung durch weitere Untersuchungen vorbehalten. Erstmals von uns beschrieben wurde eine DNA-Kopienzahlvermehrung auf dem langen Arm von Chromosom 3, den wir in über 50% der untersuchten Prostatakarzinome nachweisen konnten (Abb. 5). Die anschließende molekulare Analyse bestätigte die Existenz amplifizierter Gene in dieser Region, wobei dem IL12A-Gen eine besondere Bedeutung zukommen dürfte. Wir gehen davon aus, dass in unmittelbarer Nachbarschaft von IL12A ein oder mehrere bislang noch unbekannte Gene lokalisiert sind, denen eine Rolle bei der Prostatakarzinomentwicklung zukommen könnte. Ob daraus sich ein kli- Vielfarbenkaryotypisierung Abschließend soll auf eine neue in situHybridisierungsmethode eingegangen werden, der als Vielfarbenhybridisierung ein großes Anwendungspotenzial zukommt. Die Vielfarbenhybridisierung gehört zu den herausragenden methodischen Fortschritten in der molekularen Zytogenetik. Sie ermöglicht die Darstellung jedes Chromosoms in einer spezifischen Farbe und erlaubt damit eine Karyotypisierung mit einem einzigen FISH-Experiment. Voraussetzung ist jedoch, dass überhaupt Metaphasen aus dem zu untersuchenden Material vorliegen, die dann charakterisierbar sind. Beide Techniken der VielfarbenKaryotypisierung, sowohl die Multiplex-FISH (M-FISH) als auch die Spektralkaryotypisierung (SKY), basieren auf dem Prinzip, mehr DNA-Sonden eindeutig zu detektieren als Fluorochrome vorhanden sind. Dafür wurden Markierungsstrategien entwickelt, bei denen DNA-Sonden mit mehr als nur einem Fluorochrom markiert werden. Mit der kombinatorischen Markierungstechnik werden mindestens 5 Fluorochrome benötigt, um alle 24 Chromosomen des Menschen in verschiedenen Farben darzustellen. In bisherigen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass Aberrationen, die mit konventionellen Bänderungstechniken allein übersehen oder falsch interpretiert wurden, mittels Vielfarben-FISH entdeckt werden konnten. Damit ist dieses Verfahren insbesondere zur Analyse komplexer Chromosomenveränderungen geeignet. Wir selbst setzen SKY zur Charakterisierung von Tumorzelllinien ein, die in der Regel hochkomplexe Chromosomenveränderungen aufweisen (Abb. 6). Individualisierung der Prostatakarzinomtherapie Zusammenfassend erwarten wir von unseren Forschungsarbeiten ein besseres Verständnis der molekularen Grundlagen von Entstehung und Wachstum des Prostatakarzinoms. Mit neuen molekularen Markern können möglicherweise in der Zukunft solche Patientenkollektive identifiziert werden, die von spezifischen Therapieansätzen mehr profitieren als andere. Ziel ist damit eine weitergehende Individualisierung unserer Therapie des Prostatakarzinoms. Auf dem Weg zur maßgeschneiderten Therapie bei Prostatakarzinomen Mit einem neuen Projekt baut die Medizinische Fakultät der Universität des Saarlandes in Homburg ihre Position als einer der führenden Standorte in Sachen Prostatakarzinom-Forschung weiter aus: Mit rund 200 000 Euro fördert die Deutsche Krebshilfe der Dr. Mildred Scheel-Stiftung für Krebsforschung an der Klinik für Urologie und Kinderurologie Forschungsarbeiten, die neue Behandlungsansätze und auf den einzelnen Patienten zugeschnittene Therapien ermöglichen sollen. An der Medizinischen Fakultät der Saar-Universität arbeiten Mediziner der Klinik für Urologie und Kinderurologie (Direktor: Prof. Dr. med. Michael Stöckle) in mehreren Projekten daran, Diagnostik und Therapie des Prostatakarzinoms weiterzuentwickeln. Kennzeichnend für die Forschungen ist insbesondere die enge fachübergreifende Kooperation auf dem Homburger Campus; dabei arbeitet die Urologische Klinik vor allem mit den Instituten für Humangenetik, Pathologie und Medizinische Biochemie zusammen. Ein Ziel des neuen Projektes, das jetzt von der Deutschen Krebshilfe der Dr. Mildred Scheel-Stiftung für Krebsforschung gefördert wird, ist es, die Entstehungs- und Wachstumsgrundlagen des Prostatakarzinoms besser zu verstehen, um damit die Therapie des Prostatakarzinoms weiter zu individualisieren. magazin forschung 2/2002 5
