Untersuchung bronchialer Spülflüssigkeiten von Patienten mit
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Aus der Klinik für Pneumologie und Allergologie der Augusta Kranken-Anstalt-Bochum Direktor : Prof. Dr. J. A. Nakhosteen Untersuchung bronchialer Spülflüssigkeiten von Patienten mit Verdacht auf broncho-pulmonale Tumoren mittels automatisierter Image-Zytometrie - Ein Vergleich mit Histologie und Zytologie - Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Silke Krampe aus Recklinghausen 2000 Dekan : Prof. Dr. med. G. Muhr Referent : Privatdozent Dr. rer. nat. Wolfgang Marek Korreferent : Prof. Dr. med. K. Morgenroth Tag der mündlichen Prüfung: 8.Mai 2001 Meinen wundervollen Eltern in Liebe und Dankbarkeit gewidmet I . Einleitung 1.1. Lungenkrebs 1.1. 1.2. 1.3. 1.4. 1.5. 1.6. 1.7. Lungenkrebs.......................................................................................... Epidemiologie........................................................................................ Ätiologie................................................................................................ Wachstumsverhalten und Prognose....................................................... Morphologie der Lungentumoren.......................................................... Diagnoseverfahren................................................................................. Screening auf Lungentumoren................................................................ 1 2 3 4 7 7 10 I.2. Image-Zytometrie 2.1. 2.2. Kernveränderungen in bösartigen Geschwulsten.................................. Entwicklung der Image-Zytometrie...................................................... 12 15 II . Fragestellung............................................................................................. 17 III . Material und Methoden III.1. Die Patienten 1.1.1. 1.1.2. 1.2. 1.3. 1.4. Patienten im Überblick.......................................................................... Kontrollkollektiv................................................................................... Altersstruktur der Patienten- und Kontrollgruppe................................. Rauchverhalten der Patienten- und Kontrollgruppe.............................. Untersuchungsindikationen................................................................... 18 18 19 20 21 III.2. Untersuchungsmethoden 2.1. Röntgenuntersuchung............................................................................ 2.2. Bronchoskopie....................................................................................... 2.3. Bronchiale Spülungen........................................................................... 2.4. Zytometrie 2.4.1. Image-Zytometrie mit dem Cyto-Savant®............................................. 2.4.2. Bewertung der zytometrischen Befunde............................................... 2.4.3. Erstellen der „Bigfiles“......................................................................... 2.5. Zytologische Proben.............................................................................. 2.6. Histologische Proben............................................................................. 2.7. Klinische Enddiagnose........................................................................... 25 35 39 40 40 41 III.3. Statistik...................................................................................................... 41 I 22 22 24 IV. Ergebnisse 1. Allgemeine Ergebnisse 1.1.1. 1.1.2. 1.2. 1.3. 1.4. Kontrollgruppe.................................................................................... Patienten mit Tumorverdacht.............................................................. Klinische Enddiagnose ....................................................................... Gruppe der vorbehandelten Tumoren................................................. Ungeklärte Fälle.................................................................................. 43 43 44 46 46 2. Zytometrie 2.1. 2.2. 2.3. 2.4. Zytometrische Ergebnisse der Kontrollgruppe.................................... Zytometrische Ergebnisse der Patientengruppe................................... Zytometrie bei verschiedenen Tumorarten........................................... Vergleichende Analyse der Kernstrukturen......................................... 47 51 52 63 3. Zytologie 3.1. 3.2. 3.3. Probeentnahme..................................................................................... Zytologische Ergebnisse..................................................................... Ergebnisse nach Tumorart.................................................................. 68 68 68 4. Histologie 4.1. 4.2. Histologische Ergebnisse.................................................................... Ergebnisse nach Tumorart.................................................................. 71 71 5. Tumorlage nach bronchoskopischem Bild................................................ 73 5.1. Abhängigkeit der Zytometrie von der Tumorlage............................. 73 6. Sensitivität und Spezifität der unterschiedlichen Methoden.................... 75 7. Ergebnisse der unterschiedlichen Methoden nach Tumorart............... 76 8. Direkter Vergleich übereinstimmender Proben........................................ 77 V. Diskussion 1. Studiendurchführung................................................................................... 78 2. Ergebnisse..................................................................................................... 85 2.1. 2.2. 2.3. 2.4. 2.5. Sensitivität und Spezifität................................................................... Korrelation der Ergebnisse zur Tumorart........................................... Vorbehandelte Patienten..................................................................... Korrelation der zytometrischen Ergebnisse und Tumorlage.............. Analyse der Kernstrukturparameter................................................... 85 88 90 91 93 3. Einsatz der Image-Zytometrie.................................................................... 97 VI. Zusammenfassung ................................................................................ 99 Literaturverzeichnis......................................................................................... 100 II Abkürzungsverzeichnis c haploider Chromosomensatz der Keimzellen 2c diploider Chromosomengehalt einer normalen Zelle 2cDI Standardabweichung vom 2c Gehalt 5c Wert der den DNA-Gehalt einer in Teilung befindlichen Zelle von 4c gerade überschreitet 5cER Rate der 5c überschreitenden Zellen Ca Karzinom COPD chronic obstruktive lung disease CEA carcinoembrionales Antigen DNA desoxyribonuclein acid i.v. intravenös i.m. intramuskulär LDH Laktatdehydrogenase ml Milliliter MAC malignancy associated changes MG Malignitätsgrad min Minuten MI Malignitätsindex MOD mean optical density NSE neuronenspezifische Enolase N normal OD optische Dichte Tbc Tuberkulose µm Mikrometer III I. Einleitung I.1.1. Lungenkrebs Kaum eine andere Krebsart hat in den industrialisierten Ländern der westlichen Welt einen, dem des Lungenkrebs vergleichbaren, Anstieg der Inzidenz in diesem Jahrhundert zu verzeichnen. Was im letzten Jahrhundert noch eine Rarität war (25,94,111), zählt heute zur Todesursache Nummer eins unter den bösartigen Neubildungen beim Mann (8,25,94) und ist auch bei den Frauen schon dabei, den Brustkrebs auf den zweiten Platz der Todesursachenstatistik zu verdrängen (148). Nicht allein der rapide Anstieg der Inzidenz, sondern vor allem Verlauf und Prognose dieser bösartigen Erkrankung geben Anlaß, über therapeutische wie präventive Maßnahmen in diesem Bereich nachzudenken. Während sich bei anderen Tumorarten die Überlebenszeiten dank neuer Frühdiagnoseund Therapiemöglichkeiten verlängern, läßt sich eine solche Entwicklung für bösartige Neubildungen in der Lunge nur eingeschränkt feststellen (49,150). Die Diagnose "Lungenkrebs", mit durchschnittlichen 5-Jahresüberlebensraten von 8-11%, kommt somit heutzutage noch immer einem Todesurteil nahe, weil sie in der Mehrzahl der Fälle in einem Stadium gestellt wird, in dem eine Heilung nicht mehr möglich ist (8,94,129). Dies liegt zum einen an den Schwierigkeiten der Früherkennung dieser Tumoren, sowie zum anderen an dem in Spätstadien nur geringem Ansprechen auf vorhandene Therapiemöglichkeiten. Nur bei einer Erkennung in frühen Tumorstadien kann noch an eine kurative Therapie gedacht werden, so konnten in Screening-Untersuchungen durch frühe Diagnose vor allem der Plattenepithelkarzinome die 5-Jahresüberlebensraten von 50% auf 90% angehoben werden (30,94). Diese Studien zeigten sich durch überwiegend manuelle Verfahren jedoch zu aufwendig und kostspielig, um ein generelles Screening auf Lungenkrebs zu ermöglichen (38). Neue diagnostische Möglichkeiten zur Früherkennung sollten daher dem Anspruch gerecht werden, einfach, möglichst wenig invasiv und kostengünstig zu sein, um eine breite Verwendung finden zu können. Eine solche Methode könnte die im folgenden vorgestellte Image-Zytometrie darstellen. - 1 - I.1.2. Epidemiologie In der Bundesrepublik Deutschland ist der Lungenkrebs mit 18% aller bösartigen Neubildungen die häufigste maligne Neubildung beim Mann. Bei der Frau steht er mit 5% aller bösartigen Neubildungen an dritter Stelle hinter dem Brust- und Darmkrebs. Jährlich sterben in Deutschland ca. 28.300 Männer und 8.400 Frauen an den Folgen von bösartigen Neubildungen der Lunge (49). Die standardisierte Sterbeziffer des statistischen Bundesamtes liegt beim Mann mit 70/100.000 mehr als dreimal über dem Wert der Frauen, der 1991 bei ca.19/100.000 lag (33). Zahlen vergleichbarer Art finden sich auch für andere westliche Industrieländer, allen voran den USA, wo der Lungenkrebs 28% aller bösartigen Neubildungen stellt (39,147). Ein Anstieg der Mortalität ließ sich erstmalig in den dreißiger Jahren dieses Jahrhunderts feststellen (39,94). Zu diesem Zeitpunkt erreichte die standardisierte Sterbeziffer für bösartige Neubildungen der Lunge in den USA nur 4,9/100.000 Einwohner im Vergleich mit schon 75,6/100.000 in den 90er Jahren (145). In den 50er Jahren hatte der Lungenkrebs den Spitzenplatz unter den bösartigen Neubildungen beim Mann erreicht . Für die Frauen ergab sich eine etwas verzögerte Entwicklung, mit einem in den 50er Jahren beginnenden und bis heute kontinuierlich andauernden Anstieg. Diese geschlechtsspezifische Entwicklung wird im allgemeinen mit dem unterschiedlichen Verhalten hinsichtlich des Tabakkonsums erklärt (39,62,145). Das Zigarettenrauchen wurde bei Männern, die nach 1870 geboren waren und Frauen, geboren nach 1900 erstmalig modern (63). Rauchten 1930 nur 2% der Frauen waren es 1960 38%, bei den Männern ergibt sich ein ähnliches, allerdings um 20 Jahre nach vorn, verschobenes Bild. Während bei den Männern mittlerweile schon eine Trendwende in der Lungenkrebsmortalität mit stagnierenden oder sogar leicht sinkenden Mortalitätszahlen seit Mitte der 70er Jahre zu erkennen ist, läßt sich bei den Frauen ein solcher Trend leider nicht feststellen, hier steigen die Mortalitätszahlen weiter stetig an und ein Gipfel wird für die Jahre 2005-2010 prognostiziert (8,39,147). - 2 - I.1.3. Ätiologie Unter den ursächlichen Faktoren für das Auftreten von bösartigen Lungentumoren steht das Rauchverhalten ganz an der Spitze einer langen Liste anderer, vorwiegend beruflicher Expositionen. Der Zusammenhang zwischen einer ansteigenden Inzidenz von Lungentumoren und dem steigenden Tabakkonsum wurde schon früh vermutet, aber erst in den 50er Jahren durch breit angelegte Studien, wie die von Graham und Wynder in den USA und Doll und Hill in Großbritannien bewiesen (34,149). Dem Rauchen werden ätiologisch bis zu 90% der Lungentumoren zugeschrieben (34,38,57,62,82,138). Dabei läßt sich bei Rauchern in Abhängigkeit von Raucherjahren, Anzahl und Qualität der Zigaretten sowie dem Alter zu Beginn des Rauchens ein vielfach erhöhtes Risiko für die Entwicklung von Lungentumoren feststellen (34,37). Das Auftreten der Tumoren erfolgt dabei in der Regel mit einer 20-30jährigen Latenzphase nach Beginn des Tabakkonsums (145). Aber nicht nur die Raucher, sondern auch die durch passives Mitrauchen Betroffenen, zeigen ein erhöhtes Risiko zur Entwicklung bösartiger Lungentumoren. So ergab eine Studie von Janerich ein erhöhtes Erkrankungsrisiko für in ihrer Jugend exponierte Personen (63). Andere Studien zeigten, daß Kellnerinnen, aber auch Ehepartner von Rauchern ein erhöhtes Risiko haben, an Lungenkrebs zu erkranken (62,138). Neben dem Rauchverhalten spielen berufliche Expositionen eine erhebliche Rolle bei der Entstehung von bösartigen Lungentumoren, es werden ihnen ätiologisch 7-12% der Lungentumoren zugeschrieben (8,129). Das Auftreten von bösartigen Lungentumoren nach beruflicher Exposition gegenüber Aluminium, Arsen, Asbest, Chrom, Senfgas, Vinylchlorid, Beryllium, Radon, Cadmium, Formalin, Dieselverbrennungsstoffen und Nickel, wird in verschiedenen Studien beschrieben, wobei die kanzerogene Potenz dieser Stoffe zum Teil sehr unterschiedlich beurteilt wird (119,138,150). Auch für Arbeiter an Koksöfen und in der Stahl- und Eisenindustrie ergeben sich erhöhte Risiken, an bösartigen Neubildungen der Lunge zu erkranken, ebenso für Uranbergleute, bei welchen ein Zusammenhang zwischen der Strahlenbelastung durch Radonzerfallsprodukte und der Entstehung von Lungenkrebs festgestellt wurde (37,39,58). Bei der Untersuchung von Lungentumoren als Berufskrankheit zeigte sich, daß nicht nur ein additiver Effekt zum Tabakmißbrauch besteht, sondern diese Effekte teilweise sogar hyperadditiv oder - 3 - sogar multiplikativ sind, wie am Beispiel der Asbestexposition durch Schneider et al. gezeigt wurde (119). Neben diesen rein ätiologischen Gesichtspunkten, findet man bei vielen kanzerogenen Substanzen einen Zusammenhang mit einer speziellen histopathologischen Tumorart. So sind das Plattenepithelkarzinom und das kleinzellige Karzinom der Lunge die typischen Krebsarten des männlichen Rauchers, während man Adenokarzinome der Lunge anteilmäßig häufiger unter Nichtrauchern und Frauen findet (62). Wie bei anderen Tumorarten auch, wird eine genetische Prädisposition zur Entstehung bösartiger Lungentumoren diskutiert (25,111,138). Molekularpathologisch wurde hinsichtlich der Tumorgenese insbesondere für das kleinzellige Bronchialkarzinom ein Allelverlust der Chromosomen 3p, 13q, 17p gefunden, woraus ein Rezeptorverlust für Thyroxin und Retinsäure bzw. ein Verlust der Tumorsupressorgene p53 und RB resultieren. Zusätzlich werden im weiteren Verlauf Onkogene aus der myc und ras Gruppe aktiviert (111). Angesichts der Tatsache, daß viele ätiologische Faktoren bekannt sind und sich damit der potentiell gefährdete Personenkreis eingrenzen läßt, erscheint, neben weiteren Bemühungen in der Primärprävention, ein Screening dieser Hochrisikogruppen als Sekundärprävention um so bedeutender. I.1.4. Wachstumsverhalten und Prognose Bei der Entstehung bösartiger Lungentumoren geht man von einer stufenweisen Entwicklung über Metaplasien und Dysplasien sowie Carcinoma-in-situ bis hin zu den invasiven Karzinomen aus (79,84,92,93,137). Saccomanno untermauerte diese Theorie durch Untersuchungen an Uranbergleuten auf Vorstufen bzw. manifeste Plattenepithelkarzinome (112). Aber auch bei anderen Tumorarten geht man von einer stufenweisen Entwicklung aus (43,93). Von der Stufe des Carcinoma-in-situ bis zur Entstehung des invasiven Karzinoms kann ein längerer Zeitraum vergehen, diese klinisch okkulte Phase sollte man als Chance zur Früherkennung und kurativen Therapie nutzen (70). - 4 - Auch müßte man den Zeitraum, in dem schon ein Karzinom vorliegt, dieses aber mit den standardisierten Verfahren noch nicht zu diagnostizieren ist, verkürzen. Um eine Tumorzellansammlung mit üblichen radiologischen Verfahren sichtbar zu machen, bedarf es ausgehend von einer Tumorstammzelle 30 Teilungen, zu diesem Zeitpunkt enthält der Tumor ungefähr 1*1012 Zellen und ist ca. 1cm groß, er hat damit die Mehrzahl seiner Teilungsschritte schon hinter sich. Nach nur 10 weiteren Teilungszyklen ist in der Regel eine für den Patienten, durch Komplikationen wie Metastasierung, letale Tumormasse erreicht. Der Tumor kann auf diese Weise viele Jahre in einem klinisch unauffälligem Stadium bleiben (70,129,130). Die Tumorverdopplungszeit unterscheidet sich bei den verschiedenen Lungentumoren zum Teil erheblich, so ist sie bei den Adenokarzinomen mit durchschnittlich 183 Tagen am längsten, geringer schon bei den Plattenepithelkarzinomen mit 100 Tagen und am kürzesten für die kleinzelligen Tumoren mit durchschnittlich nur 55 Tagen (22,65,129,130). Die Prognose für den erkrankten Patienten ist von dem jeweils vorliegenden histologischen Tumortyp aber vor allem auch vom Tumorstadium abhängig. Zur Beurteilung des Tumorstadiums wird im allgemeinen die TNM Klassifikation bzw. die auf ihr basierende Stadieneinteilung des American Joint Commitee on Cancer 1973, bzw. 1986 sowie ein Tumorgrading nach Richtlinien der UICC von 1979 herangezogen (3,21,78). Tab. 1: TNM Klassifikation der Bronchialkarzinome T Primärtumor Tx T0 Primärtumor kann nicht beurteilt werden, bzw. ist radiologisch oder bronchoskopisch nicht darstellbar, obwohl in Sputum oder Bronchialspülung Tumorzellen zu sehen sind Kein Anhalt für Primärtumor Tis Carcinoma-in-situ T1 Tumor < 3cm, kein bronchoskopischer Nachweis einer Infiltration proximal eines Lappenbronchus T2 Tumor > 3cm, mit Befall des Hauptbronchus > 2cm distal der Carina, Infiltration viszeraler Pleura, assoziierte Atelektase oder obstruktive Entzündung bis zum Hilus aber nicht der ganzen Lunge Tumor jeder Größe bei Infiltration von Brustwand, Diaphragma, mediastinaler Pleura, parietales Perikard oder Tumor im Hauptbronchus, < 2cm distal der Carina ohne Befall der Carina oder Tumor mit Atelektase oder obstruktiver Entzündung der ganzen Lunge Tumor jeder Größe mit Infiltration von: Mediastinum, Herz, großen Gefäßen, Trachea, Ösophagus, Wirbelkörper, Carina oder Tumor mit malignem Pleuraerguß T3 T4 - 5 - Fortsetzung Tab. 1: TNM Klassifikation der Bronchialtumoren N Regionale Lymphknotenmetastasen Nx Regionale Lymphknoten nicht beurteilbar N0 Keine regionalen Lymphknotenmetastasen N1 Metastasen in ipsilateralen peribronchialen Lymphknoten und/oder ipsilateralen Hiluslymphknoten N2 Metastasen in ipsilateralen mediastinalen und/oder subcarinalen Lymphknoten N3 Metastasen in kontralateralen mediastinalen und Hiluslymphknoten oder in ipsi- oder kontralateralen Skalenus- oder supraklavikulären Lymphknoten Fernmetastasen M M x Vorliegen von Fernmetastasen nicht beurteilbar M 0 Keine Fernmetastasen M 1 Fernmetastasen Tab. 2: Stadieneinteilung des nicht-kleinzelligen Brocnhialkarzinoms Stadium 0 Carcinoma in situ Stadium I T1 N0 M0 , T2N0 M0 Stadium II T1 N1 M0 , T2N1 ,M1 Stadium IIIA T1 ,N2 M0 , T2N2 M0 , T3 N0 ,1 ,2 Mo Stadium IIIB TanyN3 M0 , T4NanyM0 Stadium IV TanyNany M1 Bei der Stadieneinteilung des kleinzelligen Bronchialkarzinoms erfolgt klinisch eine Unterscheidung in die Stadien "limited disease“ (ipsilaterale Ausbreitung), "extensive disease I“ (kontralaterale Ausbreitung oder Befall von Thoraxwand, Ergußbildung, Lymphangiosis carcinomatosa etc.) und "extensive disease II“ (Metastasen oder Perikarderguß) (25). Die 5-Jahresüberlebensraten der Patienten korrelieren eng mit dem Tumorstadium, der jeweiligen Tumorart, aber auch mit anderen Wachstumskriterien, wie der Tumorlokalisation. Von allen Lungentumoren haben die kleinzelligen Karzinome mit einer durchschnittlichen 5-Jahresüberlebensrate von 4-6% die schlechteste, die Plattenepithelkarzinome mit 50-60% post resectionem die beste 5-Jahresüberlebensrate (94). - 6 - 1.1.5. Morphologie der Lungentumoren Die WHO erstellte 1971 erstmalig eine Tabelle der verschiedenen Lungentumoren, welche 1980 revidiert wurde und heute die weltweit gültige Klassifikation ist. Nach dieser werden unterschieden (146): 1. Plattenepithelkarzinom (epidermoides Karzinom) 2. Kleinzelliges Karzinom (Oat-cell-Karzinom, Karzinom vom intermediären Zelltyp, kombiniertes Oat-cell-Karzinom) 3. Adenokarzinom (azinäres, papilläres und bronchioalveoläres Karzinom) 4. Großzelliges Karzinom (Riesenzellkarzinom und Klarzellkarzinom) 5. Gemischtes Plattenepithel-und Adenokarzinom 6. Karzinoid 7. Tumoren der Bronchialdrüsen (Zylindrom und Mukoepidermoidtumor) 8. Papilläre Tumoren des Oberflächenepithels 9. Sarkome 10. Nicht klassifizierbar Die drei häufigsten bösartigen Lungentumoren sind dabei das Plattenepithelkarzinom mit einer Häufigkeit von 30-50% aller Lungentumoren, das kleinzellige Karzinom mit 15% und das Adenokarzinom mit einer ansteigenden Häufigkeit von bis zu 30% aller Tumorfälle (74,81,98,111,152). Es wird aber auch diskutiert, ob nicht ein großer Anteil von Lungentumoren heterogen differenziert ist (80). I.1.6. Diagnoseverfahren Die Diagnosewahrscheinlichkeit von bösartigen Lungentumoren korreliert eng mit dem Auftreten von Symptomen. In frühen in der Regel wenig symptomatischen Stadien kann der Lungenkrebs noch kurativ mit einigem Erfolg therapiert werden (38). Die Diagnosemöglichkeiten in diesen frühen Stadien erweisen sich jedoch selten als sensitiv, so daß bisher Screening-Maßnahmen nicht zur Verfügung stehen (46). Neben der klinischen Symptomatik, die sich durch Husten, Hämoptysen, Gewichtsabnahme, - 7 - Nachtschweiß und viele andere Symptome darstellen kann, gibt das Röntgenbild meist den ersten Hinweis auf das Vorliegen einer malignen Veränderung in der Lunge. Da jedoch nicht alle Lungentumoren auf einer konventionellen Röntgenaufnahme sichtbar sind, dies vielmehr nur für solche ab einer Größe von ca.1cm und in peripheren Lungenabschnitten gelegenen Tumoren gilt, ist der darauffolgende Untersuchungsschritt die computertomographische Aufnahme der Lunge sowie die bronchoskopische Untersuchung der Patienten mit gleichzeitiger Probenentnahme (27,77). Seit der Erfindung des starren Bronchoskops von Killian und der Weiterentwicklung zur flexiblen Bronchoskopie durch Ikeda hat sich dieses Verfahren für die Untersuchung von Patienten mit erhärtetem Tumorverdacht zur Diagnosestellung durchgesetzt (61). Neben der Sichtung von möglichem Tumorgewebe ist die Art der Probeentnahme für die Etablierung einer Tumorartdiagnose wichtig. Material kann durch Spülung suspekter Areale, durch Bebürstung aber auch invasive Verfahren wie durch Katheter-, Zangen-, oder Nadel-Biopsien gewonnen werden (9,29,44,50,64). In der Literatur finden sich sehr unterschiedliche Angaben zur Sensitivität der diversen Methoden, wobei im allgemeinen einer Kombination aus mehreren Biopsiearten die höchste Treffsicherheit zugesprochen wird (9,50). Die diagnostische Sensitivität ist abhängig von der Größe des Tumorherdes und seiner Erreichbarkeit mit bronchoskopischen Hilfsmitteln, so gibt Mori eine Treffsicherheit der Kürettage von Lungentumoren von 83,5% bei peripheren Tumoren von einem Durchmesser größer als 2cm an, liegt der Durchmesser unter 1,1cm ist jedoch nach seiner Studie kein diagnostisch wertvolles Ergebnis mehr zu erzielen (77). Ng ermittelte für Sputumproben Werte von 39% bei Herden kleiner 2cm und 95,3% bei solchen größer 5cm, ferner zeigte er große Unterschiede zwischen peripher gelegenen (42% Sensitivität) und zentralen Tumoren (87% Sensitivität) (95). Radke erzielte hinsichtlich Lage und Größe der Tumoren ähnliche Ergebnisse (109). Es besteht ferner für alle verschiedenen Verfahren eine enge Korrelation zwischen der Anzahl der entnommenen Proben und der diagnostischen Sensitivität, so wird die Sensitivität bei mehr als 5 entnommenen Proben mit ca. 80% angegeben (64). Für die bronchoskopische Probengewinnung kann man zusammenfassend sagen, daß die Art und Weise der Probenentnahme individuell sehr unterschiedlich erfolgt und damit auch zum Teil zu sehr unterschiedlichen Ergebnissen - 8 - führt. Neuere Ansätze zur Verbesserung der bronchoskopischen Verfahren, besonders bei der Entdeckung von Frühkarzinomen sind fluoreszenz-gesteuerte Bronchoskopien, wobei man entweder dem Patienten ein fluoreszierendes Mittel vor der Bronchoskopie verabreicht oder sich die veränderte Autofluoreszenz von Tumorgewebe und vor allem Präneoplasien zu Nutzen macht (88,90,103). Mit Hilfe von konventionellen Sputumuntersuchungen läßt sich eine diagnostische Sensitivität von bis zu 70% bei einer Spezifität von bis zu 99% erreichen, daher nutzt man Sputumuntersuchungen bei manifestem Tumorverdacht heutzutage nicht als Routineuntersuchung, wohingegen ihr Einsatz als Screening-Untersuchung diskutiert wird (1,4,29,128,141). Andere Diagnoseverfahren, wie die Bestimmung von immunhistochemischen Markern und Chromosomenmutationen, wie CEA, und Keratinuntergruppen oder p53 und Ki-ras haben sich in der Diagnose von Lungentumoren auf Grund ihrer geringen Gewebs- und Tumorspezifität aber auch auf Grund ihrer Anfälligkeit gegenüber Störfaktoren, wie z.B. dem Rauchen, nicht durchgesetzt. Sie werden aber zur Kontrolle des Therapieverlaufs eingesetzt (4,43,68,76,83,142). Von entscheidendem Einfluß auf die Diagnosewahrscheinlichkeit von radiologischen, bronchoskopischen oder sputumzytologischen Verfahren ist sicherlich die Lage des Tumors. Die zentralen hilusnahen Lungentumoren stellen mit 70% zwar das Gros der Bronchialkarzinome, sind aber auf Grund von mediastinalen Überschattungen in der konventionellen Röntgenaufnahme in frühen Stadien nur schwer zu entdecken, wohingegen sie aber frühzeitiger symptomatisch werden und eher durch Sputumuntersuchungen entdeckt werden können als periphere Tumoren (47,48). Zusammenfassend läßt sich sagen, daß die Röntgenuntersuchung/Computertomographie mit einer alleinigen Sensitivität von 77% aber auch die bronchoskopische Exploration, deren Sensitivität stark von Tumorlage und Probengewinnung abhängig ist, heute Mittel der Wahl sind, um dem Verdacht auf einen Lungentumor nachzugehen. - 9 - I.1.7. Screening auf Lungentumoren Da die meisten Lungentumoren nur in einem sehr späten, den kurativen Therapieansätzen nicht mehr zugänglichem, Stadium diagnostiziert werden können (38), wurde in den letzten Jahrzehnten an mehreren Zentren versucht, Screeningmethoden, die in der Lage sind, auch Frühveränderungen oder sogar präneoplastische Veränderungen aufzudecken, zu entwickeln und auf ihre Wertigkeit zu untersuchen. Dazu nutzte man zunächst etablierte, wenig invasive Diagnoseverfahren wie Sputumuntersuchungen und Röntgenaufnahmen der Lunge. Die drei größten Studien stammen aus den USA, darunter die Memorial Sloan-Kettering Studie, die John Hopkins Studie sowie eine ähnlich angelegte Studie der Mayo-Klinik Rochester (29,42,45,46,47,75). Alle drei Studien ließen bei großen Patientenkollektiven, die meist Risikopatienten, wie Raucher mit einer Tabakexposition > 20 Pack-Years, umfaßten, über Jahre hinweg in regelmäßigen Abständen Röntgenthoraxaufnahmen und zum Teil zusätzlich Sputumuntersuchungen durchführen. In diesen Studien ergab sich für die durchgeführten Röntgenaufnahmen eine relative Sensitivität von 77% bei einer Spezifität von 90%. Für die Sputumzytologie ergab sich eine relative Sensitivität von 42% bei einer Spezifität von ca. 99%. Insgesamt wurden 60% der Tumoren im Stadium I durch Röntgenaufnahmen entdeckt, wobei es sich vorwiegend um peripher gelegene Adenokarzinome handelte und 40% durch Sputumuntersuchungen, hierbei handelte es sich in der Regel um Plattenepithelkarzinome. Es gab nur wenig Übereinstimmung zwischen diesen beiden Methoden, so daß man folgerte, daß sie sich bei der Lungenkrebsdiagnostik gut ergänzen (38). Die Rate, der in frühen Tumorstadien entdeckten und noch resezierbaren Lungentumoren wurde gesteigert und dadurch die 5-Jahresüberlebensraten dieser Tumoren auf 85% gehoben. Insgesamt konnte die 5-Jahresüberlebensrate von 10% auf 35% angehoben werden. Die Langzeitmortalität schien durch diese ScreeningUntersuchungen nicht reduziert werden zu können (38). Auch in Deutschland wurden ähnliche Studien mit vergleichbaren Resultaten durchgeführt. Die Erfurter Studie zeigte eine Steigerung der Detektionsraten von 6,5 auf 9,0%, der Resektionsraten von 19 auf 28% sowie auch der 5-Jahres (von 17 auf 52%) - 10 - und 10 Jahresüberlebensraten (19 auf 39%) bei halbjährlichem radiologischem Screening. Ähnlich den amerikanischen Studien, wird auch in dieser Studie die Frage aufgeworfen, ob solche Effekte nicht einfach auf einer früheren Tumordetektion beruhen, die eigentliche Tumormortalität aber unverändert bleibt (148). Die regelmäßige Durchführung von Röntgenuntersuchungen des Thorax sowie der herkömmlichen Sputumzytologie, scheinen nach den im vorangehenden vorgestellten Studien nicht der richtige Weg zu sein, um die Mortalität des Lungenkrebs effektiv zu senken. Für flächendeckende Screening-Zwecke werden also neue Methoden benötigt, die wenig invasiv aber dennoch ausreichend sensitiv und dazu noch ökonomisch sind. Davon ist die Realität jedoch noch weit entfernt. Daher müssen zunächst die Möglichkeiten, die sich mit den herkömmlichen Methoden ergeben, ausgeschöpft und in ihrer Aussagekraft und Durchführbarkeit verbessert werden. Ein Ansatz dazu ist die Weiterentwicklung der Image-Zytometrie, so daß sie für Sputumproben zu einem hoch sensitiven, aber auch kostengünstigen und einfach durchzuführenden Verfahren für die Tumordiagnostik wird (91). Gelänge es, mit Hilfe der Image-Zytometrie auch Präkanzerosen und Carcinoma-in-situ zu entdecken, so ergäbe sich eine reelle Möglichkeit die Mortalitätszahlen für bösartige Neubildungen in der Lunge maßgeblich zu senken. Erste Ansätze dazu sind Untersuchungen an alten Sputumpräparaten aus der Mayo Lungenkrebs-Screening-Studie mit demgleichen Gerät, das auch in der hier vorliegenden Studie benutzt wurde. In diesen Studien wurde mit Hilfe von sehr diskreten Kernveränderungen, sogenannten „malignancy associated changes“, schon an Hand von normalen epithelialen Kernen eine Differenzierung vorgenommen, wobei eine Sensitivität von 40% und eine Spezifität von 90% erreicht wurden (105). - 11 - I.2. Image -Zytometrie Die Image-Zytometrie zeichnet sich durch den Einsatz bildgebender Verfahren sowie von modernsten Datenverarbeitungsprogrammen aus, mit Hilfe derer man quantitative Zellkernveränderungen objektiv und automatisiert messen kann. Durchgesetzt haben sich Formen der Image-Zytometrie vor allem in Bereichen, in denen es darauf ankommt, eine Vielzahl von Präparaten in Screening-Tests möglichst kostengünstig und objektiv zu beurteilen, so z.B. der Untersuchung von Zervixabstrichen (15). Man macht sich bei der automatisierten Beurteilung vor allem quantifizierbare Kriterien der Zellstrukur zunutze, allen voran die Kerngröße und der DNA-Gehalt der Zellen. I.2.1. Kernveränderungen in bösartigen Geschwulsten Schon sehr früh wurden Veränderungen von Kernstrukturen mit der Tumorentwicklung an sich in Verbindung gebracht, so fand Virchow schon 1859 einen Zusammenhang zwischen der Vergrößerungen von Kernkörperchen und dem Tumorwachstum (85,111). Nieburgs beschrieb, basierend auf Untersuchungen an diversen kanzerösen Geweben, verschiedene Zellveränderungen bei Tumorgeschehen, wie z.B. vergrößerte Kern-Plasma Relation, geordnete Struktur des heterochromatischen Chromatin, viele Chromozentren, gekrümmte und angehäufte Chromatinbänder, runde gleichförmige Kerngegenden gleicher Größe mit gekrümmten pyknotischem Chromatin umgeben, Abwesenheit von Nucleoli und vielkernigen Zellen. In späteren Jahren versuchte Nieburgs diese bis dahin nur subjektiv zu beurteilenden Zellveränderungen auch quantitativ zu erfassen, wobei er bei der Untersuchung des DNA-Gehaltes verschiedener Zellpopulationen eine graduelle Steigerung des DNA-Gehaltes zwischen metaplastischen und neoplastischen Zellen nachweisen konnte (92,97). Er wies aber auch auf die Schwierigkeit hin, zwischen normalen, sich lediglich in Teilung befindlichen, Zellen und Tumorzellen mit einem doppelten diploiden DNA-Gehalt (4c) zu differenzieren. - 12 - Für tumoröse Prozesse konnte regelmäßig ein auch diesen DNA-Gehalt überschreitender Wert festgestellt werden. Nasiell konnte eine ähnliche stufenweise Steigerung des DNAGehalts für prämaligne Prozesse der Bronchialschleimhaut zeigen (92). Sandritter und andere Autoren fanden in ihren Studien für die meisten Tumoren einen erhöhten, wenn auch tumorspezifisch sehr unterschiedlichen DNA-Gehalt und führte erste DNAHistogramme ein, mit denen der Begriff der Stammlinie erklärt wurde (18,54,115-117). Dabei handelt es sich um ein Verteilungsmaximum des DNA-Gehaltes von untersuchten Tumorzellen, der sich für differenzierte Tumoren bei einem hyperdiploiden (>2c) bis triploiden (3c) DNA-Gehalt ergibt. Dementsprechend findet sich ein zweites Verteilungsmaximum für die in diesen Tumoren in Teilung befindlichen Zellen bei einem Wert von 5-6c, wohingegen undifferenzierte Tumoren eine weite Streuung ihrer DNAVerteilung zeigen, in der Regel aber weit vom diploiden Bereich entfernt sind. Auer typisierte in seinen Studien die schon allgemein gebräuchlichen DNA-Histogramme nach ihren Stammlinien in vier verschiedene Typen: Typ I und II zeigen eine euploide DNAVerteilung mit zwei Peaks der Histogramme im Bereich von 2c und 4c, während Typ III und IV zunehmend malignere Prozesse beschreiben, die sich durch ein weitgehend irreguläres Verteilungsmuster der DNA sowie ein vermehrtes Vorkommen von Kernen mit einem höheren DNA-Gehalt (>5% im Bereich 2c-4c) in den Histogrammen auszeichnen (6). Er konnte ferner zeigen, daß sich einige Tumoren durch ein diploides Wachstum auszeichnen, während andere, wie z.B. Plattenepithelkarzinome und kleinzellige Karzinome Ösophaguskarzinome und der Lunge, Pankreaskarzinome Zervixkarzinome, sich Osteosarkome, typischerweise aneuploid differenzieren (6). In Studien von Müller wurde ebenfalls der DNA-Gehalt der unterschiedlichen Lungentumoren untersucht und gefolgert, daß es einerseits für die verschiedenen Tumorarten bestimmte Verteilungsmuster hinsichtlich ihres DNAGehaltes gibt, daß aber andererseits in mehr als 50% der Tumoren mit einer heterogenen Tumordifferenzierung zu rechnen sei (85). Ein weiterer Versuch, Zellveränderungen in tumorösen Prozessen auch objektiv zu beschreiben, wurde 1974 von Klawe und Romaninski unternommen. Diese beobachteten als besonders gut differenzierendes Kriterium die optische Dichte in Relation zur Kerngröße und führten einen Koeffizienten „k“ ein, der den Grad der DNA-Kondensation beschreibt (69). - 13 - Die Gruppe von McAulay und Wied unternahm an Sputumuntersuchungen sowie Zervixabstrichen ähnliche Versuche der Objektivierung der Kernveränderungen in malignen Prozessen (56,72). Mit Hilfe teilautomatisierter image-zytometrischer Verfahren konnten sie an Hand von quantitativen Kernkriterien bis zu 80% der atypisch veränderten Proben herausfiltern und so erstmalig eine breite, automatisierte Anwendung der Image-Zytometrie demonstrieren (2,72). Kernveränderungen scheinen sich nicht nur im Tumorgewebe direkt, sondern auch in weiter von diesem entfernten Geweben zu finden, wie Gruner 1916 an Leukozyten im peripheren Blut von Tumorpatienten zeigte (55). Aber auch Nieburgs ging auf solche Zellveränderungen, die weit vom eigentlichen Tumorgeschehen entfernt zu finden waren, ein. Er faßte diese Zellveränderungen unter den Oberbegriff „malignancy associated changes“ (MAC‘s) (96,97). In den darauffolgenden Jahren fanden weitere Forscher ähnliche Veränderungen in den verschiedensten Geweben, mit der Zeit wurde der Begriff aber auch ausgedehnt auf diskrete noch nicht eindeutig als tumorös zu bezeichnende Kernveränderungen. Es wurde jedoch auch deutlich, daß diese Veränderungen zwar bei vielen Tumoren zu finden sind, jedoch nicht bei allen und das auch Nicht-Tumorpatienten sogenannte MAC's zeigen können (6,40,41,56,92,143). Es wurde in diesen Untersuchungen auch eine Korrelation zwischen Grad der Ausprägung von MAC's und der Nähe zum Tumorgeschehen sowie der Aggressivität des Tumorwachstums gefunden (56,72,92). Erste Versuche, diese MAC’s zu objektiveren, wurden von Klawe und Romanienski in Untersuchungen der Mundschleimhautzellen gemacht (69). Basierend auf der Theorie der „malignancy associated changes“ sowie der von Saccomanno erstmalig beschriebenen Stufenentwicklung zum bronchialen Plattenepithelkarzinom wurden in den letzten Jahren einige image-zytometrische Studien unternommen, um durch Messung von Kernstrukturparametern sowie dem DNA-Gehalt von Sputumzellen, Zellen des Bronchialsekretes aber auch Zellen aus Zervixabstrichen, eine Früherkennung und damit entscheidende Gebärmutterhalstumoren zu Verbesserung ermöglichen der Prognose (2,10,51,52,136). von Lungen-und Veränderungen der Kernstruktur sowie des DNA-Gehaltes werden heutzutage allgemein als Hinweise auf das Vorliegen maligner Prozesse anerkannt, wenngleich verschiedene Strukturen dabei sehr unterschiedlich in ihrer - 14 - Wertigkeit beurteilt werden (17,110). Das liegt zum einen an den Schwierigkeiten, typische Kernstrukturen in ihrem Verhalten bei malignen Prozessen zu charakterisieren, aber auch daran, diese dann zu objektivieren. Da die hier angewandte Form der ImageZytometrie auf den, im vorangehenden beschriebenen, subjektiven Kernveränderungen basiert, diese nur mittels mathematischer Funktionen objektivieren kann (66), könnte sich mit ihrer Hilfe ein neuer Weg zur Erforschung des Verhaltens von Kernstrukturen und ihrer Objektivierung ergeben. Zum einen könnte sie vonnutzen sein, um die Kernstrukturen, die Tumorkerne von normalen epithelialen Kernen unterscheiden, zu bestimmen und zu quantifizieren, zum anderen könnte sie eventuell genutzt werden, um durch solche Kernstrukturveränderungen auch schon präkanzeröses Gewebe zu erkennen. I.2.2. Entwicklung der Image-Zytometrie Die Erkenntnisse über Kernveränderungen bei malignen Prozessen gaben Anlaß, maschinelle Verfahren zu entwickeln, mit deren Hilfe man Kernstrukturen automatisiert und reproduzierbar bestimmen konnte. Dabei war man durch den allgemeinen Stand der Entwicklung in der Daten- und Bildverarbeitung zunächst jedoch sehr eingeschränkt. Die Datenverarbeitungsmöglichkeiten waren zu langsam und zu aufwendig, um sie effektiv zu nutzen und auch die Bildverarbeitung hatte nicht die Qualität, solche Verfahren in Konkurrenz mit manuellen Methoden treten zu lassen. Erst die Entwicklung hochauflösender Videokameras ohne Blindzonen sowie schneller Prozessoren ermöglichte schließlich die quantitative Vermessung von Kernstrukturen. Ein Vorreiter der image-zytometrischen Untersuchungen ist Böcking, der die ImageZytometrie dabei zunächst bei Zervixabstrichen im Routinelabor, dann aber auch bei der Untersuchung von verschiedenen anderen Geweben einsetzte und dabei versuchte, standardisierte quantitative Malignitätskriterien zu entwickeln (5,12,15,17). Das von ihm benutzte System ist in der Lage, DNA-Messungen und Kernstrukturen von per Hand ausgesuchten Kernen vorzunehmen. Zur Beurteilung der Befunde führte er Begriffe wie die 5c-Exceeding Rate, den 2c-Deviation Index und den Malignancy Index ein, die im - 15 - folgenden näher beschrieben werden sollen (11,13). Gleichzeitig wurden in den USA und Großbritannien Geräte entwickelt, die ein Vorauswählen per Hand durch in die Software einbezogene automatische Zellklassifizierprogramme überflüssig machten und nur eine manuelle Revision erforderten (60,118,139). Diese Geräte erwiesen sich in großen Studien so effektiv, daß man folgerte, einen Anteil von bis zu 50% der zytologischen Routineuntersuchungen maschinell vornehmen zu können (2). Eines dieser neueren Systeme ist der Cyto-Savant® der Firma Oncometrics (Vancouver B.C., Kanada). Dieses Gerät wurde 1996 vom Forschungsinstitut für Frühdiagnose und Therapie des Bronchialkarzinoms an der Augusta-Kranken-Anstalt erworben. Mit diesem Gerät und dem ihm eingebauten Zellklassifizierprogramm ist es erstmalig möglich, über 100 Kernstrukturelemente Zellsortierung quantitativ erfolgt, es ist zu bestimmen, lediglich wobei eine eine visuelle vollautomatische Kontrolle der Untersuchungsergebnisse nötig (102). In den letzten Jahren wurde die Image-Zytometrie in weiteren Bereichen genutzt, so auch bei der Untersuchung von Darmkarzinomen aber auch von Mammakarzinomen und Prostatakarzinomen sowie Tumoren des Mund- und Larynxbereiches (1,26,53,87,113,127). Ihr Haupteinsatzbereich blieb jedoch die Untersuchung von Zervixabstrichen und etwas eingeschränkter auch von Sputumproben (5,14,16). - 16 - II . Fragestellung Die Entwicklung der Image-Zytometrie ist durch ihre weitgehende Automatisierung heute an einem Punkt angelangt, an dem über ihren routinemäßigen Einsatz zur Untermauerung eines Tumorverdachtes im Bronchialsystem nachgedacht werden muß. Bevor man jedoch ein neues Verfahren allgemein einsetzen kann, muß es dem Vergleich mit den etablierten Methoden standhalten und zusätzlich weitere Vorteile bieten, die seinen Einsatz rechtfertigen. Für die Diagnose von Lungentumoren sind zytologische und histologische Untersuchungen der während Bronchoskopien gewonnenen Proben bis heute das Standardverfahren, an welchem die image-zytometrische Auswertung von Spülflüssigkeiten aus dem brochialen Kompartiment gemessen werden sollte. Mit der Untersuchung dieser Spülflüssigkeiten wurde bewußt ein wenig invasives Verfahren gewählt. Dieses umfaßte dasselbe Kompartiment wie Sputumproben, brachte aber im Vergleich mehr Material hervor und konnte so besser diesen ersten Basisuntersuchungen hinsichtlich der Wertigkeit der Image-Zytometrie sowie in einem zweiten Schritt auch Kernstrukturparameter einer dienen. ersten Ein image-zytometrischen weiterer Analyse Untersuchungsaspekt war der der Zusammenhang zwischen image-zytometrischem Ergebnis und bronchoskopischem Befund sowie Tumorart. Für die verschiedenen Tumortypen sollte zunächst nur zur Übersicht herausgearbeitet werden, welche Kernparameter als neoplastisch eingestufte Zellen von normalen epithelialen Zellen aus der Kontrollgruppe unterscheiden und ob sich diskriminierende Parameter der Kernstruktur auch zwischen den einzelnen Tumortypen finden lassen. Die hier vorliegende Studie sollte zusammenfassend vor allem folgenden Fragen beantworten: 1. Kann die automatisierte Image-Zytometrie von Bronchialspülungen tumorverdächtige endobronchiale Befunde feststellen? 2. Gibt es typische Kernveränderungen bei Tumoren, die die automatisierte ImageZytometrie erkennen kann? - 17 - III. Material und Methoden III.1. Patienten III.1.1. Patienten im Überblick Untersucht wurde Material aus 519 konsekutiv durchgeführten bronchialen Spülungen von 496 ambulant oder stationär behandelten Patienten, die sich im Zeitraum von April 1996 bis März 1998 zur Abklärung des Verdachts auf einen bösartigen Lungentumor in die pneumologische Klinik der Augusta-Kranken-Anstalt, Bochum begaben. Bei allen Patienten wurde im Rahmen einer diagnostischen Bronchoskopie eine bronchiale Spülung suspekt erscheinender Lungenareale vorgenommen. Für jeden Patienten wurde ein Datenerhebungsbogen mit Informationen über vorgetragene Beschwerden, die ärztlichen Voruntersuchungen sowie die ermittelten zytologischen, histologischen und klinischen Resultate erstellt. Wurde ein Patient mehrfach untersucht (22 Fälle mit zweifacher Probenentnahme, ein Fall mit dreifacher Probenentnahme), so geschah dies jeweils in zeitlich größeren Abständen, um den Krankheitsverlauf zu kontrollieren. Diese Proben wurden bei der Auswertung der vorliegenden Untersuchung als eigenständige Patienten behandelt. III.1.1.2. Kontrollkollektiv Das Kontrollkollektiv bestand aus 50 Patienten, bei denen eine Bronchoskopie vorgenommen wurde, ohne daß primär der Verdacht auf eine Neoplasie bestand. Dabei handelte es sich größtenteils um Patienten, die sich aus eigenem Antrieb zum allgemeinen gesundheitlichem „Check-Up“ bronchoskopieren ließen, oder um solche, bei denen eine therapeutische Lavage vorgenommen wurde oder eine nicht-maligne interstitielle Lungenkrankheit, wie z.B. die Sarkoidose, klinisch verfolgt werden sollte. Weder durch Röntgenuntersuchungen noch durch Bronchoskopie konnte in dieser Gruppe ein Hinweis für eine Präneoplasie oder einen manifesten Tumor gefunden werden. Das Kontrollkollektiv wurde zur Ermittlung von Normwerten für die abgrenzende Beurteilung der Präparate aus der Tumorverdachtsgruppe herangezogen. - 18 - III.1.2. Altersstruktur des Patienten- und des Kontrollkollektivs Das Patientenkollektiv setzte sich aus 368 Männern sowie 128 Frauen zusammen, während das Kontrollkollektiv aus 30 Männern und 20 Frauen bestand. Diese beiden Kollektive zeigten folgende Altersverteilung: Tab.3: Altersverteilung von Patienten- und Kontrollkollektiv Alter 10 - 20 Jahre 21 - 30 Jahre 31 - 40 Jahre 41 - 50 Jahre 51 - 60 Jahre 61 - 70 Jahre 71 - 80 Jahre 81 - 90 Jahre > 90 Jahre Summe Männer Patienten Frauen Kontrollen Patienten Kontrollen 1 3 8 38 93 127 84 14 0 368 0 0 2 5 8 11 4 0 0 30 0 1 0 5 7 5 2 0 0 20 0 1 6 23 29 32 30 6 1 128 Die zahlenmäßig größte Altersgruppe lag in der Patientengruppe bei den Männern in der Gruppe der 61-70jährigen, bei den Frauen ließ sich ein solcher Altersgipfel nicht feststellen. Hier fand man ein Häufigkeits-Plateau in den Gruppen der 51-80jährigen (s.Abb.1). Die Männer zeigten ein mittleres Alter von 62,8 ± 11,5 Jahren, mit einem Median von 64 Jahren. Bei den Frauen lag der arithmetische Mittelwert bei 61,5 ± 12,9 Jahren und der Median bei 62 Jahren. Der Anteil der Patienten unter 50 Jahren betrug bei den Männern lediglich 13% bei den Frauen jedoch 23%. Das Kontrollkollektiv setzte sich aus 30 Männern und 20 Frauen mit einem durchschnittlichen Alter von 58,0 ± 11,0 Jahren zusammen. Der Altersmittelwert der Männer lag dabei bei 58,5 ± 10,7 Jahren, ihr Median bei 60 Jahren, Minimum und Maximum jeweils bei 34 und 75 Jahren. Die entsprechenden Werte der Frauen lagen bei 56,4 ± 11,4 Jahren als Mittelwert, 57 Jahren als Median und 25 bzw. 76 Jahren als Minimum und Maximum. Die Patienten des Kontrollkollektivs waren folglich im Durchschnitt nur 3 - 4 Jahre jünger als die Patienten der Tumorverdachtsgruppe. - 19 - Anzah l 140 Frauen Männer 120 100 80 60 40 20 0 <20 21-30 31-40 41-50 51-60 61-70 71-80 81-90 Alter (Jahre) >90 Abb. 1: Altersverteilung der Patienten mit Verdacht auf einen bronchopulmonalen Tumor III.1.3. Rauchverhalten der Patienten und der Kontrollen Der Anteil der Raucher und Exraucher lag anamnestisch im männlichen Patientengut bei 76%, bei den Frauen lediglich bei 57%. Als durchschnittliche Mengenangabe in PackYears wurden bei den Männern 47,2 Pack-Years und bei den Frauen 40,0 Pack-Years angegeben. In der Kontrollgruppe zeigten Raucher/ehemalige starke Raucher und Nichtraucher einen Prozentanteil von jeweils 50%. 24% Männer Frauen 43% 76% 57% Raucher und Exraucher Nicht-Raucher Abb. 2: Rauchverhalten der Patienten mit Verdacht auf einen bronchopulmonalen Tumor - 20 - III.1.4. Untersuchungsindikationen der Patienten mit Tumorverdacht Es wurde eine Rangliste der von den Patienten selbst geäußerten bzw. ärztlich diagnostizierten klinischen Symptome erstellt - wobei eine Mehrfachnennung möglich war. An der Spitze dieser Liste standen als klinische Zeichen Husten, Hämoptysen sowie Dyspnoe. Eine ähnliche Verteilung läßt sich in der Literatur finden (24,70). Radiologische Befunde führten in ca. 150 Fällen zu einer bronchoskopischen Untersuchung des Patienten. Tab. 4: Untersuchungsindikationen bei Tumorverdacht Indikationen Anzahl Indikationen Anzahl Husten 73 Heiserkeit 8 Peripherer Rundherd 67 Leistungsknick 9 Hämoptysen 50 Karzinogen- Exposition 5 Dyspnoe 48 Pleuraerguß 4 Tumorverdächtige Infiltrate 34 Globusgefühl 4 Hilusverbreiterung 24 Räusperzwang 2 Gewichtsverlust 25 Horner-Syndrom 1 rezidiv.Infekte 19 Lymphknotenschwellung 1 Staging von bek.Tumoren 19 Obere Einflußstauung 1 Schmerz 17 Stridor 2 Fieber/Nachtschweiß 12 hohe Tumormarker 2 - 21 - III.2. Untersuchungsmethoden III.2.1. Röntgenuntersuchung Bevor die Patienten sich einer Bronchoskopie unterzogen, wurde eine Röntgenaufnahme des Thorax in zwei Ebenen gemacht, wenn diese nicht in der vorherigen haus/fachärztlichen Diagnostik schon vorgenommen worden war. In manchen Fällen wurde zusätzlich eine computertomographische Darstellung des Thoraxraumes angefertigt. Bei transthorakalen Biopsien wurde eine p.a.-Aufnahme des Thorax in Exspirationsstellung an die Untersuchung angeschlossen, um einen Pneumothorax auszuschließen. Bei Patienten mit peripheren radiologischen Auffälligkeiten erfolgte die Probeentnahme aus der Läsion immer unter Durchleuchtungskontrolle. III.2.2. Bronchoskopie Im allgemeinen wurde eine konventionelle Weißlicht - Bronchoskopie durchgeführt. In einigen Fällen wurde zusätzlich die Autofluoreszenz-Bronchoskopie angewandt, besonders wenn der Verdacht auf ein Frühkarzinom bestand. Es wurden flexible Bronchoskope vom Typ Olympus ® BFP 20d und BFP 200 für die Untersuchung benutzt. Die Patienten wurden für diese Untersuchung mit einem aerosolisierten Lokalanästhetikum (Lidocain 4%) vorbereitet, falls erforderlich wurde zusätzlich eine i.v. Sedierung mit Midazolam in der Konzentration 1mg/ml vorgenommen. Als weitere Prämedikation erhielten die stationär liegenden Patienten 0,5mg Atropin i.m. zur Sekretionshemmung, sowie Opiumalkaloide zur Sedierung. Während der Bronchoskopie wurden nach Bedarf 2 - 4 mal einige Mililiter 4%ige Lidocain-Lösung in die Larynxregion zur Betäubung der Stimmbänder, sowie je nach Bedarf 2%ige Scandicain Lösung in die eingesehenen Bronchialabschnitte gespritzt. Zuerst wurde das gesamte einsehbare Bronchialsystem zur Übersicht betrachtet, anschließend erfolgte die, auf die individuelle Situation abgestimmte, Probeentnahme - 22 - aus den suspekt erscheinenden Arealen. Je nach Läsionstyp wurden für die zentral gelegenen Bereiche Zange, Nadel oder Bürste verwandt, für die peripheren Bereiche neben der Nadel und Zange auch der Katheter. Bei Bedarf wurden zum Staging mögliche Tumorabsetzungsstellen zur Bestimmung der lymphangitischen Tumor-ausbreitung biopsiert (89). Die bronchoskopischen Befunde wurden nach einem modifizierten Schema von Ikeda in folgende Gruppen unterteilt (89): Tab.5: Einteilung der bronchoskopisch sichtbaren Befunde (modifiziert nach Ikeda) 1. unauffällig - normale bronchiale Schleimhaut oder entzündliche Veränderungen 2. direkte Tumorzeichen - in das Bronchiallumen exophytisch wachsende Neoplasien 3. indirekte Tumorzeichen - submuköse Raumforderung - 23 - III.2.3. Bronchiale Spülung Vor Entnahme der zytologischen und histologischen Proben wurde in den suspekten Bronchialabschnitten eine zweimalige Spülung mit jeweils 8 ml isotoner Kochsalz-lösung durchgeführt. Das Aspirat (ca.10 ml) wurde zunächst in 20ml Saccomanno-Fixierlösung konserviert, anschließend für 15 min bei 500 g zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 0,5-1,0 ml Saccomanno-Fixierlösung resuspendiert, der Überstand verworfen. Jeweils zwei Tropfen der Zellsuspension (ca. 0,2 ml) wurden auf sechs Objektträger gegeben und mit einem zweiten Objektträger analog einer Blutprobe ausgestrichen. Nach Lufttrocknung erfolgte die Färbung nach Papanicolaou sowie mit Thionin nach der Feulgenreaktion (19,121,122,124): Dazu wurden die Präparate zuerst 30 min in 96%igem Ethanol dehydriert, danach wurden sie 30-60 min in Böhm-Sprenger-Lösung fixiert, schließlich mit Aqua dest. gespült. Die Purinbasen wurden im folgenden durch eine 45 minütige Hydrolyse in 5 N HCl bei Zimmertemperatur (20o C) entfernt, an die Aldehydgruppen band sich das Thionin-SO2 im anschließenden Färbeschritt (60 min) streng stöchiometrisch. Es folgte eine mehrfache Spülung mit Natriumbisulfit-Lösung zur Entfernung der Farbreste sowie eine aufsteigende Alkoholreihe und schließlich Xylol. Die so aufbereiteten Proben wurden anschließend mit Immersionsöl eingedeckelt und dem Cyto-Savant® zur Untersuchung zugeführt. Für eventuelle Nachuntersuchungen sowie Verlaufskontrollen wurden die Präparate archiviert. - 24 - spätere III.2.4. Zytometrie III.2.4.1. Image-Zytometrie mit dem Cyto-Savant® Die zytometrische Untersuchung des Probematerials erfolgte mit einem automatisierten Image-Zytometer, dem Cyto-Savant® (Oncometrics Vancouver BC, Kanada). Der CytoSavant® setzt sich aus einer hochauflösenden CCD-Videokamera (Kodak Microimager 1400) einem leistungsfähigem Computer mit Pentium Prozessor, einer Matrox® Graphikkarte und der automatischen Ladevorrichtung zusammen (100,102). Abb. 3: Foto vom Cyto-Savant® (von rechts nach links: automatische Ladevorrichtung, Mikroskop mit angeschlossener Kamera und Barcodeleser, MikroskopBildschirm, Magnetbandlaufwerk und Analysebildschirm) Die Besonderheiten des Systems bestehen in der hohen räumlichen und photo-metrischen Auflösung der speziell für die Zytometrie entwickelten CCD-Videokamera, dem Microimager 1400 (Xillix Technologies Corp.). Diese Kamera verfügt über eine - 25 - Matrix von 1340 • 1037 Sensoren (1,4 • 10 6 Bildpunkte), die eine Fläche von jeweils 6,8µm mal 6,8 µm erfassen. Sie kann das gesamte Gesichtsfeld gleichzeitig mit einer Taktfrequenz von bis zu 20 MHz erfassen ohne dabei Blindbereiche zu enthalten. Die bei 20-facher Vergrößerung erhaltene Auflösung (Pixelgröße) von 0,1µm2 oder 0,34µm • 0,34µm Kantenlänge, liegt dabei nahe der Diffraktionsgrenze des sichtbaren Lichts (Rotbereich) von 600nm. Durch die hohe photometrische Auflösung ist das Gerät in der Lage, 256 verschiedene Graustufen zu differenzieren. Ebenso wie die weite Tiefenschärfe ist sie Voraussetzung für die exakte Messung des DNA-Gehaltes und der Verteilungen der Strukturen im Zellkern. Abb. 4: Vergleich der sensitiven Fläche einer handelsüblichen Videokamera (links) und dem System der CCD-Kamera des automatisierten Zytometers Als Graphikkarte wurde das Matrox-Image Board® ausgewählt, welches bereits eine Vorverarbeitung durchführt und die Objekte mit unveränderter Auflösung auf einem Grafikbildschirm wiedergibt. Das Mikroskop ist mit einer Barcode-Leseeinrichtung verbunden, so daß die Patientendaten mit den zu ermittelnden Ergebnissen verknüpft werden können. Das Zytometer kann innerhalb von 24 Stunden bis zu 50 Präparate in Folge unbeaufsichtigt automatisiert erfassen und vorbefunden, die endgültige Beurteilung sowie die Diagnosestellung erfolgen anschließend manuell. Die Präparate werden über den Greifarm auf den Kreuztisch gelegt, dann erfolgt die automatische Fokussierung. - 26 - Während der Untersuchung wird nach jedem Bewegungsschritt des Kreuztisches zunächst geprüft, ob sich Kerne in dem Ausschnittsbereich befinden, um dann nach einem Lichtintensitätsalgorithmus die optimale Fokusebene zu suchen. In dieser Ebene führt das Gerät eine Segmentierung der Kerne durch und ein Entscheidungsalghorithmus prüft, ob die gefundenen Objekte einzelne, nicht-überlappende Kerne sind. Diese Kerne werden nun markiert und das Gerät bestimmt im Abstand von 0,5µm in aufeinander folgenden Ebenen die Kernstrukturen. Alle Kerne, die nicht in eine Fokusebene fallen, werden ausgeschlossen. Der Effekt dieser Prozedur ist, daß alle Kerne in eine virtuelle Fokusebene gelegt werden. Die Segmentierung der Kerne erfolgt mit Hilfe einer Kernmaske, deren Grenze so lange erweitert wird, bis eine, in mindestens zwei aufeinander folgenden Schritten unverändert gebliebene, Verbindungslinie von Pixeln mit den höchsten Gradienten zu ihrer Umgebung entsteht, welche dann die endgültige Kernmaske darstellt. Ein durchschnittlicher normaler Epithelzellkern umfaßt ca.600 Pixel. Nachdem eine solche Kernmaske erstellt worden ist, kann die Bestimmung der Kernstruktureigenschaften erfolgen. Diese werden im folgenden genutzt, um eine Differenzierung zwischen den verschiedenen Zelltypen zu ermöglichen und Artefakte sowie unbrauchbare Zelltrümmer abzugrenzen (100). Kernstruktureigenschaften (Features) Bei den 114 Parameter, die mit dem Cyto-Savant® gemessen werden, erfolgt eine exakte mathematische Beschreibung in Form von linear diskriminierenden Funktionen. Die Gesamtheit der zu bestimmenden Kernstrukturelemente kann unterteilt werden in 11 Werte, die zur Bestimmung der Koordinaten, für eventuelle spätere Nachuntersuchungen, genutzt werden und 114 Chromatinstrukturparameter, welche die eigentlichen Kernstruktureigenschaften beschreiben (Tab.6). - 27 - Tab. 6 : Kernstruktureigenschaften Feature Nr. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 Feature Gruppe 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Feature Area X centroid Y centroid Mean radius Maximum radius Variance radius Sphericity Eccentricity Cell orientation Inertia shape Compactness Elongation Frequency low FFT Frequency high FF Harmonics 01 Harmonics 02 Harmonics 03 Harmonics 04 Harmonics 05 Harmonics 06 Harmonics 07 Harmonics 08 Harmonics 09 Harmonics 10 Harmonics 11 Harmonics 12 Harmonics 13 Harmonics 14 Harmonics 15 Harmonics 16 Harmonics 17 Harmonics 18 Harmonics 19 Harmonics 20 Harmonics 21 Harmonics 22 Harmonics 23 Harmonics 24 Harmonics 25 Feature Nr. 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 - 28 - Feature Gruppe 1 1 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 3 4 4 4 4 Feature Harmonics 26 Harmonics 27 Harmonics 28 Harmonics 29 Harmonics 30 Harmonics 31 Harmonics 32 Mean intensity Variance intensity DNA index DNA amount OD maximum OD variance OD skewness OD kurtosis Low DNA area Med. DNA area High DNA area Low DNA amount Med DNA amount High DNA amount Low DNA compactness Med DNA compactness High DNA compactness MH DNA compactness Low AV DST Med AV DST High AV DST MH AV DST Low VS MED Low VS HIGH Low VS MH DNA Low density object Med density object High density object Entropy Energy Correlation Contrast Tab. 6 (Fortsetzung): Kernstruktureigenschaften Feature Nr. Feature Gruppe Feature Feature Feature Nr. Gruppe Feature 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 4 4 4 5 5 5 5 5 3 3 3 6 6 6 7 7 7 7 Homogenity Cluster shade Cluster prominence Density light spot Density dark spot Range extreme Range average Center of gravidity Low center MAS Med center MAS High center MA Fractal dimension Fractal area Fractal2 area Texture orientation Size texture orientation Short 0 runs Short 45 runs 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 Short 90 runs Short 135 runs Long 0 runs Long 45 runs Long 90 runs Long 135 runs Gray 0 level Gray 45 level Gray 90 level Gray 135 level Run 0 lenght Run 45 lenght Run 90 lenght Run 135 lenght Run 0 percentage Run 45 percentage Run 90 percentage Run 135 percentage 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 7 Man unterscheidet dabei sieben wesentliche Kategorien von Kernstruktureigenschaften (35,36): 1. Morphometrische Eigenschaften der Chromatinverteilung Zu den morphometrischen Struktureigenschaften zählen als Kernstrukturparameter area, x/y-centroid, mean/max-radius, var-radius, sphericity, eccentricity, inertia-shape, compactness, cell-orientation, elongation, freq-low/high-fft sowie die harmonischen Ableitungen aus den Fourier Transformationen 1-32. All diese Parameter beschreiben Größe, Form und Beschaffenheit der Grenzstrukturen eines Zellkerns. Hervorzuheben ist hier das Feature area als Wert, der die Gesamtzahl aller Pixel eines Zellkernes angibt. - 29 - 2. Photometrische Kernstruktureigenschaften Photometrische Kernstruktureigenschaften beschreiben absolute Intensitäten und optische Dichten eines Kerns sowie ihre Verteilung. In diese Gruppe gehören die Parameter DNAamount, DNA-index, var-intensity, mean-intensity, die optische Dichte, die intergrierte optische Dichte (IOD), die mittlere optische Dichte, die Varianz der optischen Dichte sowie die Parameter OD-skewness und OD-curtosis. Entscheidender Parameter ist hier die optische Dichte (OD), die dem negativen Logarithmus aus dem Quotient der Eingangslichtstärke Io und der Intensität der austretenden Lichtstärke I entspricht: OD = –log (I/ Io ). Der DNA-Gehalt ist proportional der optischen Dichte. Die gesamte DNA-Menge eines Objektes entspricht der Summe aus den optischen Dichten aller Pixel in den Zeilen i und den Spalten j einer Kernabbildung. Sie wird auch als integrierte optische Dichte (IOD) bezeichnet. Die mittlere optische Dichte (MOD) ist die IOD, geteilt durch die Anzahl der Pixel; während die Varianz der optischen Dichte (OD-variance) ein Maß für die Gleichmäßigkeit der Chromatinverteilung ist. Das Feature OD-skewness beschreibt eine „Nicht- Gausverteilung“ der optischen Dichte, während OD-curtosis die Breite der Verteilung umschreibt. 3. Diskrete Kernstruktureigenschaften Diskrete Struktureigenschaften beruhen auf einer Segmentation der Kerne in Regionen mit hoher, mittlerer und geringer Chromatinkondensation. Um die Messungen unabhängig von der Variation der Färbung zu machen, werden die Schwellen für jeden Objektträger an Hand der mittleren optischen Dichte diploider Kontrollzellen, in der Regel einer Lymphozytenpopulation, festgelegt. Jedes Pixel wird einem der drei Kondensationszustände (low, medium, high) zugeordnet. Diskrete Kernstruktureigenschaften beschreiben Größe, Form, optische Dichte und räumliche Verteilung von Chromatinpartikeln. Dazu gehören low/med/high-DNA-area, low/med/high-DNA-amount, low/med/high-DNA-compactnes, low-versus-med/high-DNA, objects, low/med/high-center-mass. - 30 - low/med/high-density- 4. Markovianische Kerneigenschaften Markovianische Struktureigenschaften charakterisieren Graulevel-Variationen zwischen benachbarten Pixeln, dazu zählen entropy, energy, contrast, correlation, homogenity, cluster-shade und cluster-prominence. Entropy ist ein Maß für ungeordnetes Auftreten der Graustufen in einem Objekt, während energy und homogenity Maße für die Gleichmäßigkeit der Verteilung sind. Contrast beschreibt Grautonvariationen, correlation Bereiche homogener Grautöne mit starkem Grautonunterschied zu benachbarten Strukturen. Cluster-shade gibt hohe Werte für Objekte mit einigen Flecken homogener Intensität und starkem Kontrast zum übrigen Objekt, negative Werte entsprechen dunklen Flecken auf hellem Grund, positive Werte weisen auf helle Flecken auf dunklem Grund. Die cluster-prominence kennzeichnet den Grauton eines Clusters. 5. Extrembereichseigenschaften (Nicht-Makovianische Kernstrukturparameter) Zu den Extrembereichseigenschaften zählen unter anderen range-average, rangeextreme, center of gravity, density-light-spot und density-dark-spot. Sie geben Auskunft über den globalen Kontrast der gesamten Kernstruktur durch Messung des Bereichs der Graustufenunterschiede. Eine gemittelte Abschätzung des Intensitätsbereiches zwischen Regionen minimaler und maximaler Intensität geschieht mit dem Parameter rangeaverage. Die Differenz zwischen der höchsten und niedrigsten Intensität wird durch range-extreme beschrieben. Density-light-spot und density-dark-spot geben die Dichte der hellen und dunklen Flecken eines Nucleus an, indem die Anzahl der jeweiligen Flecken durch die Fläche (area) geteilt wird. Center of gravity bestimmt den Abstand zwischen geometrischem Mittelpunkt und Dichtefunktion, normalisiert durch den Radius. - 31 - dem Massezentrum der optischen 6. Brechungsstruktureigenschaften In diese Gruppe gehören fractal1-area, fractal2-area und fractal-dimension. Diese Kernstrukturparameter beschreiben die dreidimensionale Struktur der Verteilung der optischen Dichte 7. Streckenlängeneigenschaften Zu den Streckenlängeneigenschaften zählen die Parameter short0/45/90/135-run-, long0/45/90/135-run, grey0/45/90/135-level, size-texture-orientation, run0/45/90/135length, run0/45/90/135-percentage, texture-orientation und size texture-orientation. Sie beschreiben Chromatinverteilungen als Strecken- oder Linienlängen von aufeinanderfolgenden Pixeln gleicher Graustufen. Die short-run-Parameter geben zum Beispiel Auskunft über verschiedene Grade der Krümmung von kurzen Linien, für längere Linien zeigen die long-run -Features entsprechend hohe Werte. Textureorientation beschreibt die dominante Orientierung der linearen Formen, size-textureorientation die dominante Ausrichtung. An Hand dieser Kernstrukturparameter ordnet ein, speziell für den Cyto-Savant® entwickelter, trainierbarer Classifier (TANC: Trainable Automated Nuclear Classifier) die Zellkerne den verschiedenen, im Bronchialsystem zu findenden, Zellgruppen (Lymphozyten, polymorphkernige und eosinophile Granulozyten, normale epitheliale Kerne, suspekte Kerne mit 1,25< DNA-Index <2,5, maligne Kerne mit DNA-Index >2,5, keratinisierende Zellen, Kondensatmakrophagen) zu. In einem ersten Schritt werden dabei Objekte mittels einer IOD-Schwelle in Gruppen hoher und niedriger IOD aufgeteilt. In den folgenden Schritten werden auch andere Kernstruktureigenschaften zur Unterscheidung der verschiedenen Gruppen herangezogen. - 32 - Spülflüssigkeit IOD < 1,25 DNA-Index Objekte Objekte IOD > 1,25 DNA-Index Lymphozyten Objekte suspekte Kerne Seg.Kerne Objekte maligne Kerne Granulocyten eosinophile Granulocyten low IOD Debris polymorphkernige Granulozyten Alveolarmakrophagen Objekte normale Epithelhigh IDO e bDr i s zellkerne kerat. Zellen Abb. 5: Entscheidungsalgorithmus für die automatisierte Zellkernsortierung Die Unter- und Obergrenze der zu suchenden Zellkerne ist für jede dieser Gruppen frei wählbar und wird in einem „Logbuch“, welches Anweisungen an das Meß- und Auswertprogramm enthält, festgelegt. In der Untersuchung der Spülflüssigkeiten wurde folgendes Protokoll benutzt: Tab. 7 : Untersuchungsprotokoll für Spülflüssigkeiten Gruppe Zelltyp gesammelte Zellen Identifizierte Minimum Maximum Zellen 0 Unbenannt 0 0 0 1 Lymphozyten 100 200 3500 2 Polymorphkernige Granulozyten 100 200 3500 3 Eosinophile Granulozyten 100 200 3500 4 Normale Epithelzellkerne 1000 1000 6000 5a Auffällige Epithelzellkerne <5c 100 200 600 5b Auffällige Epithelzellkerne >5c 100 200 600 6 Keratinisierende Kerne 25 100 300 7 Pneumozyten II, Makrophagen 25 100 1000 8 Hohe IOD-Objekte 50 100 16000 9 Niedrige IOD-Objekte 50 100 5000 1650 2400 40000 Summe - 33 - Es werden maximal 1000 normale Epithelzellkerne gesammelt, hinzu kommen noch Kerne von Lymphozyten, Granulozyten und Makrophagen. Die Zahl der auffälligen Kerne ist auf maximal 200 für Kerne mit einem DNA-Gehalt <5c und 200 für auffällige Kerne mit einem DNA-Gehalt >5c festgelegt. Wurde die Zahl der gefundenen Zellkerne in einem Präparat in mehreren Gruppen, eine Ausnahme bildet hier die Gruppe der tumorverdächtigen Zellkerne, deutlich unterschritten, so wurde dieses Präparat aus der weiteren Beurteilung ausgeschlossen. Die Untersuchungszeit wurde auf 30 Minuten pro Präparat festgelegt, sie kann jedoch beliebig variiert werden. Die Anzahl der gefundenen Zellkerne korreliert dabei linear mit der Untersuchungszeit. Nach nur 5 Minuten hat das Zytometer in der Regel alle nach dem Protokoll geforderten Zellkerne gefunden, die restliche Untersuchungszeit dient dann nur noch dem Auffinden eventuell vorhandener suspekter und maligner Zellkerne. Daher ist die Zahl der identifizierten Zellkerne weitaus höher als die vorgegebene Maximalzahl zu suchender Zellkerne. Um Rechnerzeit zu sparen, wurden Schwellenwerte für Parameter der optischen Dichte und andere Kernstruktureigenschaften festgelegt, die nur die Sammlung von Objekten im voreingestellten Bereich zulassen. Diese Werte sind so gewählt worden, daß sie mit an Sicherheit grenzender Wahrscheinlichkeit außerhalb des Bereiches liegen, den man bei maligne veränderten Zellen findet. Man kann so vor allem Artefakte aus der Beurteilung ausschließen. Tab. 8: Schwellenwerte für die Zellsammlung durch das automatisierte Image-Zytometer Maximale Zirkularität der Leukozyten 400 Minimale preliminäre IOD 50 Minimale akzeptierte IOD (%vom Mittelwert) 50 Zell/Leukozytengröße 400 Preliminäres Zelllimit der Zirkularität 200 Minimale Leukozyten Intensitätsvariation 0 Maximale Zell-Intensitätsvariation 9800 IOD der Normalisierungszellen (%) 0 - 34 - III.2.4.2. Bewertung der zytometrischen Befunde Nach jeder Untersuchung erfolgte eine manuelle Revision der Präparate. Es wurden sämtliche Kerngalerien in allen Zellklassen auf Zuordnungsfehler des Gerätes untersucht, bei Bedarf korrigiert, anschließend erfolgte die Beurteilung der Präparate. Dabei wurde besonderen Wert auf den DNA-Gehalt der als maligne klassifizierten Zellkerne gelegt. Für die Befundung sind einige Definitionen nach Böcking und Hiddeman von entscheidender Bedeutung, sie werden in der folgenden Tabelle in ihrer für diese Untersuchung modifizierten Form dargestellt (13): Tab .9: Zytometrische Diagnose und Graduierung der Malignität Abkürzung 2c-Bereich 2c-Wert 2cDI 5cER Bezeichnung Euploidiebereich Euploidiewert 2c-Abweichungsindex Rate der 5c überschreitenden Zellen Berechnung 2c ± 0,25c DNA-Gehalt(lymphozyten )*Faktor 2cDI = 1/N (cI-2c)2 5cER = N5c / N tot c*100 Grenzwert 0,2 0,2% Aus den hier vorliegenden Messungen sollten vor allem zwei den DNA-Gehalt beschreibende Parameter bestimmt werden: die Rate der 5c-Werte überschreitenden Zellkerne (5cER) und der 2c-Abweichungsindex (2cDI). Anhand dieser Parameter können diagnostische Einteilungen vorgenommen werden. Aus dem Kontrollkollektiv wurde ermittelt, daß der 2cDI im Mittel bei 0,12 ± 0,04 lag, daher wurde 0,2 ( x +2 δ) als Grenzwert für den 2cDI zur Abgrenzung von pathologisch veränderten Zellkernen genommen (12). Die 5cER war in der Kontrollgruppe 0,00%, es konnten keine Zellkerne mit einem DNA Wert >5c gefunden werden. Die Bestimmung dieser Werte ist diagnostisch jedoch nur in Geweben sinnvoll, die nicht die Ploidie beeinflussenden Faktoren, wie z.B. Zytostatika-Therapie, Bestrahlung, Vitaminmangel etc. unterliegen und auch keine euploide Polyploidisierung, wie z.B. Herzmuskel- und Leberzellen, zeigen (11,86,141,153) . Daher wurde bei der statistischen Auswertung der Ergebnisse die Gruppe der radio-/chemotherapierten Patienten ausgeschlossen. Bei der vorliegenden Untersuchung wurde auf dem Hintergrund der - 35 - oben genannten Parameter folgende vereinfachte Einteilung, primär basierend auf der Untersuchung des DNA-Gehaltes und der Kerngröße gewählt (11): Tab. 10 : Modifizierte Befundung der Zytometrie nach ESACP 0 nicht auswertbar 5cER und 2cDI konnten nicht ermittelt werden, da Material nicht repräsentativ I benigne 5cER < 0,2 und 2cDI <0,2 II suspekt 5cER < 0,2 und 2cDI >0,2 III maligne 5cER >0,2 und 2cDI >0,2 Ein Präparat wurde als auffällig beurteilt, wenn der für die gesunden Kontrollprobanden ermittelte Grenzwert für den 2cDI von 0,2 überschritten wurde oder sich einzelne optisch höchst auffällige Zellkerne im Bereich 1,25< DNA-Index>2,5 fanden. Bei der Unterscheidung zwischen Stufe II und III wurde besonderen Wert auf das zusätzliche Vorkommen von aneuploiden Kernen mit einem DNA-Index größer 2,5 (cWert von 5c) gelegt. Als Schwellenwert wurde eine 5cER von 0,2% angenommen. Als Ergebnis der zytometrischen Untersuchung erstellt das Zytometer einen Untersuchungsbericht für jedes Präparat, in welchem die verschiedenen Kernstrukturen als Punktwolke und auch als Histogramm dargestellt werden können. Für jede einzelne Zellkerngruppe können die untersuchten Zellkerne photographisch in einer Galerie wiedergegeben werden, was eine manuelle Reselektion und Nachbeurteilung ermöglicht. Im folgenden sollen zwei Beispiele solcher Befundungs-Formulare kurz erläutert werden, darunter ein Normalpatient mit unauffälligem zytometrischem Befund und das Beispiel eines Tumorpatienten, hier ein Plattenepithelkarzinom (Abb. 6). In der Normalverteilung lassen sich die untersuchten Zellkerne annähernd auf eine exponentielle Zellverteilungskurve mit folgender mathematischer Funktion y=a * eb*x +c zurückführen. Es finden sich nur vereinzelt Zellkerne mit 1,25 < DNA-Index <2,5. Die 5c-ER ist 0,00%, der 2c- DI ist kleiner als 0,2. Die hier gefundenen normalen epithelialen Kerne zeigen keine Strukturanomalien und entsprechen auch hinsichtlich ihrer Größe den Durchschnittswerten epithelialer Zellen. - 36 - In einem Tumorpräparat hingegen finden sich zahlreiche Zellkerne, durch die sowohl den Grenzwert für den 2cDI- als auch die 5cER überschritten wird. Dazu kommt eine weiter um die oben beschriebene logarithmische Funktion streuende Verteilung der normalen Epithelzellkerne. 5c-und 2,5c-ER sowie 2c-DI sind über die für das Kontrollkollektiv ermittelten Schwellen erhöht. Die Zellkerne sind in ihrer Struktur auffälllig vergrößert und unregelmäßig geformt. Durch die Betrachtung der Alveolarmakrophagen und Lymphozyten kann man zusätzlich noch Rückschlüsse auf inhalative Belastungen sowie ein akutes oder chronisches Entzündungsgeschehen oder eine atopische Reaktion ziehen und diese bei der Begutachtung berücksichtigen. Dabei färben sich in der Gruppe der Makrophagen Zytoplasmaeinschlüsse unspezifisch an, was zu einer Erhöhung des photometrisch ermittelten DNA-Indexes dieser Zellen führt. Der trainierbare Klassifizierer ist jedoch in der Lage, diese Zellgruppe von den Tumorzellkernen zu unterscheiden. - 37 - - 38 - III.2.4.3. Erstellen der Bigfiles Nachdem alle Daten gewonnen waren, konnte eine Gruppierung der verschiedenen Tumortypen in Sammeldateien (Bigfiles) erfolgen. Die Untersuchung beschränkte sich dabei auf die drei häufigsten Tumorarten (Plattenepithelkarzinome, Adenokarzinome und kleinzellige Bronchialkarzinome), alle Präparate, bei denen histologisch auch nur der Verdacht auf ein heterogenes Tumorbild bestand, wurden zu diesem Zwecke ausgeschlossen. Aus den so gruppierten Daten konnten im folgenden sogenannte „Bigfiles“ erstellt werden. Dabei handelt es sich um Megadateien, welche repräsentative Zellkerne aus den verschiedenen Einzeldateien enthalten. Dazu wählt das Zytometer aus jedem einzelnen Präparat aus jeder Zellgruppe nach dem Zufallsprinzip eine bestimmte vorgegebene Zahl an Kernen aus und führt diese in einer übergeordneten Datei als quasi neues repräsentatives Präparat zusammen (Tab.11). Tab. 11 : Sammelprotokoll zum Erstellen der „Bigfiles“ Zellart Anzahl gesammelter Kerne Lymphozyten 2000 Polymorphkernige Granulozyten 2000 Eosinophile Granulozyten 2000 Normale epitheliale Zellen 2500 suspekte Zellen mit DNA-Gehalt <5c * 700 maligne Zellen mit DNA-Gehalt >5c * 200 Makrophagen 200 * nur in den Tumorgruppen wurde diese Anzahl auch erreicht Die 114 mit dem Zytometer bestimmbaren Kernstrukturparameter wurden für die einzelnen Zellgruppen in jedem Bigfile als Mittelwerte mit Standardabweichung bestimmt. Dabei betrachteten wir in der Kontrollgruppe alle Zellgruppen und wählten aus den verschiedenen Tumorgruppen nur die als normal eingestuften Zellkerne sowie auffällige Kerne mit 1,25< DNA-Index <2,5 und DNA-Index >2,5 zum Vergleich untereinander aus. Anschließend erfolgte eine Umrechnung mit den aus der Kontrollgruppe ermittelten Daten für normale epitheliale Zellkerne als Bezugswerte, um eine vereinfachte graphische Darstellung zur Auswertung zur ermöglichen. - 39 - Dazu wurde jeweils der Quotient aus dem Mittelwert des jeweiligen Kernstrukturparameters der normalen epithelialen Zellkerne und der aneuploiden Zellkerne der Tumorgruppen im Zähler und den Mittelwerten der Kernstrukturen der normalen epithelialen Kerne der Kontrollgruppe im Nenner gebildet. Die Quotienten selber wurden graphisch in einem Punkt-Liniendiagramm dargestellt und konnten so im Vergleich der einzelnen Tumorarten untereinander und mit der Kontrollgruppe eine erste Übersicht über die am besten differenzierenden Kernstrukturparameter liefern. III.2.5. Zytologische Proben Die lichtmikroskopischen zytologischen Untersuchungen von Tupfpräparaten bzw. Abstrichen der Zangen-, Katheter- oder Nadel-Biopsien bzw. Zytozentrifugaten der bronchialen Spülungen erfolgte unabhängig voneinander durch zwei auswärtige Zytologen. Zusätzlich zu den Färbungen nach Papanicolaou und May-Grünwald Giemsa wurden auch zytochemische Färbungen (unspezifische Esterase, alkalische und saure Phosphatase, PAS, Amylase-PAS, Mucinamin) sowie immunzytochemische Färbungen (CEA, NSE, Vimentin) zur weiterführenden Spezifikation durchgeführt. Die Befunde wurden nach einem modifiziertem Schema von Papanicolaou mit den Stufen PAP 0 PAP V eingeteilt (111). II.2.6. Histologische Proben Histologische Proben wurden in der Regel mittels Zangenbiopsie aus den auffälligen Arealen entnommen, in 4% Formalinlösung fixiert und noch am gleichen Tag dem Institut für Pathologie zugeschickt. Dort wurden sie nach Entwässerung durch eine Alkoholreihe über Methylbenzoat und Benzol in Paraffin eingebettet. Nach Erstellen von Mikrotomschnitten erfolgte die Entparaffinierung mit Xylol und die anschließende Färbung mit Hämatoxylin-Eosin sowie Giemsa. Für spezielle Fragestellungen wurden weitergehende immunhistochemische Verfahren angewandt. Die Beurteilung erfolgte in modifizierter Form nach den Angaben der WHO 2nd edition 1981 (146). - 40 - III.2.7. Enddiagnose Die Enddiagnose wurde jeweils dem Entlassungsbericht bzw. dem Therapieplan entnommen. Sie ergab sich in der Regel als Synthese aller erhobener Daten (Klinisches Bild, Röntgenbefund, Bronchoskopie, Zytologie, Histologie, Resektionspräparat). Besonderes Gewicht wurde dabei der histologischen und zytologischen Beurteilung zugemessen, in Zweifelsfällen wurde noch ein Referenzgutachten angestrebt. Es verblieben 14 Patienten, die weiterführenden Maßnahmen nach einmaliger erfolgloser Bronchoskopie ablehnten, obwohl sich bei ihnen starke Hinweise auf das Vorliegen eines malignen Prozesses in den Atemwegen ergaben. Diese gingen nicht in die statistische Auswertung ein. III.3. Statistik Für die Ergebnisse dieser Untersuchung wurden die Sensitivität und Spezifität aller Untersuchungsmethoden (Zytologie, Histologie und Zytometrie) ermittelt. Ferner wurden prädiktiver-positiver und -negativer Wert sowie die diagnostische Effizienz bestimmt. Die Sensitivität ist der prozentuale Anteil der Proben, bei denen durch ein positives Testergebnis die Diagnose Krankheit richtig gestellt wird unter Ausschluß der nicht auswertbaren Präparate (140): richtig-positive Ergebnisse Sensitivität (%) = * 100 richtig-positive + falsch-negative Ergebnisse Die Spezifität ist der prozentuale Anteil der Präparate, bei denen durch ein negatives Testergebnis Nichtkranke erkannt werden, in ihre Berechnung gehen ebenfalls nur Präparate mit ausreichendem Material ein: richtig-nega tive Ergebnisse * 100 Spezifität (%) = richtig-negative Ergebnisse + falsch-positive Ergebnisse - 41 - Der prädiktive Wert ist eine Größe, die die Wahrscheinlichkeit angibt, mit der bei einer Krankheit ein positives Testergebnis (positiver prädiktiver Wert) und im Gesundheitsfall ein negatives Testergebnis (negativer prädiktiver Wert) ermittelt wird. richtig-positive Ergebnisse PW pos= Gesamtheit aller positiven Ergebnisse (richtig + falsch-positiv) richtig-negative Ergebnisse PW neg = Gesamtzahl der negativen Ergebnisse (richtig + falsch-negativ) Die diagnostische Effizienz beschreibt das Verhältnis der richtigen Untersuchungsergebnisse zu der Gesamtheit aller Ergebnisse eines Kollektivs. richtig-positive + richtig-negative Ergebnisse Effizienz = ____________________________________________ Gesamtzahl aller Ergebnisse Für die Berechnung dieser Größen wurden alle Proben mit unzureichendem Material ausgeschlossen, daher kann man Sensitivität/Spezifität sprechen. - 42 - auch von der relativen IV. Ergebnisse IV.1.1.1. Kontrollgruppe Unter den 50 Patienten der Kontrollgruppe wurde bei keinem Patienten ein maligner Prozeß durch die histologischen, zytologischen und zytometrischen Untersuchungen oder während der Bronchoskopie gefunden. Alle Patienten zeigten lediglich entzündliche Veränderungen der Atemwege. Die Kontrollgruppe wurde genutzt, um Grenzwerte für die Beurteilung von Patienten mit Tumorverdacht zu ermitteln. IV.1.1.2. Patienten mit Tumorverdacht Von anfänglich 519 bronchialen Spülungen von Patienten mit Tumorverdacht konnten abschließend 442 in der Auswertung berücksichtigt werden. Von der Gesamtbewertung ausgeschlossen wurden alle Proben, bei denen nicht davon ausgegangen werden konnte, daß die Zellstruktur von äußeren Einflüssen unbeeinträchtigt war, wie z.B. im Falle einer vorherigen radio- oder chemotherapeutischen Behandlung. Ferner konnten einige Proben nicht in der Auswertung berücksichtigt werden, da die Enddiagnose zum Zeitpunkt des Studienabschlusses nicht etabliert werden konnte oder sich die Patienten einer nachgehenden Untersuchung entzogen. Bei den von der allgemeinen Untersuchung ausgeschlossenen Proben, handelt es sich also um folgende Gruppen: Ø 63 Proben mußten von der Untersuchung ausgeschlossen werden, da es sich um Kontrolluntersuchungen bei schon bekannten Bronchialkarzinomen handelte, die vor Entnahme der bronchialen Spülungen mittels Radio-, Chemotherapie oder Resektion einschließlich Nachbehandlung therapiert worden waren. Ø In 14 Fällen konnte keine klinische Enddiagnose gestellt werden. Obwohl bei diesen Patienten ein dringender radiologischer oder klinischer Verdacht auf ein Bronchialkarzinom bestand, war die endoskopische Exploration nicht diagnostisch und weitergehende Untersuchungen wurden von den Patienten abgelehnt. Der folgenden allgemeinen und auch der methodenspezifischen Auswertung liegen also die Daten von 442 bronchialen Spülflüssigkeiten von Patienten mit Tumorverdacht zugrunde. - 43 - IV.1.2. Klinische Enddiagnose Unter den 442 Patienten mit Tumorverdacht wurde bei 262 Patienten tatsächlich eine maligne Veränderung des Atemtraktes diagnostiziert, während 180 Patienten ein lediglich entzündliches wenn überhaupt auffällig, dann metaplastisch verändertes, Bronchialsystem zeigten. Die malignen Veränderungen entschlüsselten sich dabei wie folgt : An der Spitze der prozentualen Häufigkeiten steht das Adenokarzinom mit 79 Fällen (30,1%), gefolgt von 64 Plattenepithelkarzinomen (24,4%), 62 kleinzelligen Karzinomen (23,6%), 28 nicht-kleinzelligen Karzinomen (heterogene adenosquamöse Tumoren) (10,6%), 3 Alveolarzellkarzinomen (1,1%), 1 neuroendokrinem Tumor und 1 Karzinoid (je 0,3%), 2 schweren Kollisionstumoren Dysplasien (kleinzellige (0,7%), Anteile 1 vermischt Carcinoma-in-situ mit (0,3%), plattenepithelialen adenomatösen Strukturen) (1,9%), 16 diversen Metastasen (6,1%). Alveolarzell Ca. 1% Carcinoma in situ 0,3% schwere Dysplasien 0,7% Karzinoid 0,7%% Kollisionstumore 2% n = 262 Tumoren Metastasen 6% kleinzelliges Ca. 24% nichtkleinzelliges Ca. 11% Plattenep. Ca. 24% Adeno Ca. 30% Abb.7 : Verteilung der verschiedenen Tumoren innerhalb der TumorpatientenGruppe (n = 262) - 44 - 5 oder Die nicht-tumorösen Atemwegsveränderungen wurden in der Regel durch die Zusammenführung bronchoskopischer und klinischer Untersuchungsergebnisse diagnostiziert, nur in einzelnen Fällen wurden histologische und zytologische Proben entnommen. Es wurden entzündlich bedingte Veränderungen von gänzlich unauffälligen Befunden unterschieden. Unter den entzündlichen Veränderungen stehen die chronische und die akute Bronchitis ganz im Vordergrund (75 Fälle), es folgen persistierende Pneumonien, das Asthma, die Atemwegsüberempfindlichkeit und das chronische Sinubronchial-Syndrom mit jeweils nur einem kleinen Prozentsatz der Fälle. Eine weitere Aufschlüsselung der Enddiagnosen dieser Fälle ergibt Tabelle 12. In 34 Fällen lagen völlig unauffällige Bronchialsysteme vor, in denen auch keine entzündlichen Veränderungen festgestellt werden konnten. Tab. 12 : Aufschlüsselung der entzündlich bedingten Veränderungen Diagnose akute/chronischeBronchitis Sarkoidose Pneumonie Anzahl 75 2 16 COPD 4 5 Asthma Postinfektiöse Residuen 5 bronchiale Hyperreagibilität 9 1 Stimmbandparese 5 Sinubronchial-Syndrom 1 Trauma Diagnose Anzahl Gefäßrupturen leichte Dysplasie Alveolitis Linksherzinsuffizienz Tuberkulose Fibrose Metaplasie Erguß Sekretverlegung Alveolarzellhyperplasie 3 3 1 2 2 2 5 2 2 2 - 45 - IV.1.3. Gruppe der vorbehandelten Tumoren Unter den 63 vorbehandelten Tumorpatienten fanden sich 29 lungenresezierte und nachbehandelte, 4 chemotherapeutisch behandelte, 12 ausschließlich bestrahlte und 14 radio-chemotherapierte Tumorpatienten. In vier Fällen wurden zusätzlich auch therapeutische Interventionen wie Stentimplantationen oder Laserungen eines bekannten und therapierten Karzinoms durchgeführt. 29 Patienten dieser Gruppe zeigten dabei ein Tumorrezidiv, während 34 Patienten zur Zeit der Untersuchung als in Vollremission befindlich beurteilt wurden. Die Gruppe der Tumorrezidivpatienten setzte sich aus 23 Männern und 6 Frauen, darunter 19 Raucher/innen und 10 Nichtraucher/innen mit einem mittleren Alter von 63,8 ± 9,9 Jahren zusammen. In der Gruppe der Vollremissionen fanden sich 23 Männer und 11 Frauen mit einem mittleren Alter von 65,9 ± 8,8 Jahren, darunter 20 Raucher/innen und 14 Nichtraucher/innen. Zytometrisch waren in der Gruppe der Tumorrezidive 62% der bronchialen Spülungen als auffällig beurteilt worden, bei den Vollremissionen waren es 32%. Zytologisch ergab sich eine positive Rate von 59% bei den Tumorpatienten und 15% unter den in Vollremission befindlichen Patienten. Bei einer sehr hohen Zahl an nicht biopsierten Patienten wurden histologisch in der Gruppe der Tumorpatienten 10/12 bei 17 fehlenden Untersuchungen für tumor-positiv befundet. In der Gruppe der Vollremissionen waren es 3/14 tumor-positive Befunde bei 20 fehlenden Präparaten. Hier muß berücksichtigt werden, daß die klinische Diagnose sich bei diesen Patienten verstärkt nach der bronchoskopischen Diagnose orientierte, daher nicht in allen Fällen Proben entnommen wurden. IV.I.4. Ungeklärte Fälle Bei dieser Gruppe von 14 Patienten handelte es sich in der Regel um solche, die ein- oder mehrfach diagnostisch erfolglos bronchoskopiert worden waren und daraufhin trotz radiologischer oder klinischer Tumorsymptomatik eine weitergehende Untersuchung zum Beispiel in Form einer diagnostischen Thorakoskopie oder Mediastinoskopie ablehnten. Diese Patienten wurden aus der weiteren Beurteilung ausgeschlossen. Es befanden sich darunter aber 6 zytometrisch auffällig beurteilte Patienten, die histologisch und zytologisch als tumor-negativ beurteilt worden waren. 3 Präparate zeigten sogar auffällig viele veränderte Zellkerne. - 46 - IV.2. Zytometrische Ergebnisse IV.2.1. Zytometrische Ergebnisse der Kontrollgruppe Die Präparate aus der Kontrollgruppe zeigten eine regelrechte Zellverteilung ohne ein vermehrtes Vorkommen auffällig veränderter Zellkerne. In dieser Gruppe lag der 2cDI in der Regel unter 0,2 die 5cER betrug 0,0%. Abb. 8:A: Zytometrischer Befundbogen einer Kontrollperson mit Verteilungshistogramm, Punktwolke (DNA-Index versus area) und einer Galerie der normalen epithelialen Zellkerne. B: zytologisches Präparat C: histologisches Präparat (B und C sind nicht fester Bestandteil des zytometrischen Befundberichtes) - 47 - Faßt man alle 50 Kontrollpräparate in Form eines Bigfiles zusammen, so zeigt sich eine DNA-Verteilung, die im Vergleich zum Einzelpräparat etwas weiter streut aber immer noch der Verteilung des Einzelpräparates ähnelt. In einem solchen Bigfile findet sich eine für ein Einzelpräparat auffällige Anzahl suspekter Kerne, man muß aber berücksichtigen, daß Zellkerne aus 50 Präparaten gesammelt wurden. Abb. 9: Bigfile der Kontrollgruppe zusammengestellt aus 50 Einzelpräparaten In dem für diese Gruppe erstellten Bigfile-Diagramm, welches die Quotienten der Mittelwerte der Kernstrukturparameter der einzelnen Zellarten in Relation zu den normalen epithelialen Zellkernen der Kontrollgruppe darstellt, sieht man, daß die normalen Epithelzellkerne in Form einer horizontalen Linie im Bereich 1 dargestellt sind. - 48 - Die Quotienten der Lymphozyten, Granulozyten und Kondensatmakrophagen streuen zum Teil erheblich um diese Linie, was angesichts der stark unterschiedlichen Kernstrukturen in diesen Gruppen (z.B. gelappte Kerne) erklärbar ist. Lymphozyten und polymorphkernige Granulozyten zeigen besonders im Bereich der, die Kernform beschreibenden, morphometrischen Kernstrukturparameter (Feature 1-46) wie den Harmonieparametern starke Abweichungen, während Kondensatmakrophagen vor allem durch photometrische Werte wie den DNA-Gehalt (Feature 50) aber auch durch Extrembereichseigenschaften wie range-average (Feature 85) und range-extreme (Feature 86), Brechungsstruktureigenschaften wie fractal-area (Feature 91+92) sowie die Streckenlängen-Parameter long-run (Feature 99-102), gray-level (Feature 103-106) und run-lenght (Feature 108-114) von den normalen epithelialen Zellkernen abweichen. Zahlenwert der Quotienten 12 polymorphkernige Granulozyten 11 eosinophile Granulozyten 10 normale Kerne 9 Alveolarmakrophagen 8 7 suspekte Kerne (1,25< DNA-Index< 2,5) 6 Lymphozyten 5 4 3 2 1 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Feature Nummer Abb.10 : Bigfile-Diagramm, dargestellt sind die Quotienten der Mittelwerte der Kernstrukturparameter der verschiedenen Zellgruppen (Zähler) in Relation zu den Kernstrukturparametern der normalen epithelialen Zellkernen der Kontrollgruppe (Nenner) für 114 Chromatinstrukturparameter - 49 - Man kann festhalten, daß die verschiedenen im Bronchialsystem zu findenden Zellgruppen in ihren Kernstruktureigenschaften zum Teil schon weit um die Kernstrukturparameter der normalen epithelialen Zellkerne streuen. Eine weitere Betrachtung dieser Zellgruppen in den Tumor-Bigfiles wurde somit für nicht angebracht gehalten, wohingegen ein Vergleich der normalen epithelialen Zellkerne mit den tumorverdächtigen Zellkernen und auch den in den Tumorpräparaten als normal eingestuften Zellkernen, im Hinblick auf eventuell vorhandene diskrete präneoplastische Kernveränderungen, als sinnvoll erschien. Die für die Kontrollgruppe ermittelten Quotienten zeigen, daß vor allem polymorphkernige Granulozyten, Kondensatmakrophagen und eosinophile Granulozyten weit um die Werte der normalen epithelialen Zellkerne streuen (Tab.13). Für die normalen epithelialen Zellkerne wurde eine Standardabweichung von 0,41 berechnet, welche über den Standardabweichungen der Lymphozyten und suspekten Kerne liegt, aber noch unter den entsprechenden Daten der Granulozyten und Kondensatmakrophagen. Tab. 13 : Quotienten der Kontrollgruppe (Gruppe x/normale epitheliale Zellkerne) Polymorph. Eosinophile Lymphozyten Susp. Makrophagen Granuloz. Granuloz. Mittelwert 1,4 1,34 1,00 1,06 1,4 Stdabw. 1,54 0,87 0,35 0,31 0,65 Variationskoeff. 1,1 0,64 0,29 1,06 0,46 Median 1,11 1,14 1,00 0,98 1,16 Minimum 0,33 0,27 0,2 0,1 0,29 Maximum 12,09 7,19 1,82 1,87 4,0 - 50 - Kerne V.2.2. Zytometrische Ergebnisse der Patientengruppe Von 262 Patienten mit histologisch gesichertem Bronchialkarzinom wurden in der zytometrischen Untersuchung 193 als tumor-positiv erkannt (74%), 34 Präparate (13%) zeigten zytometrisch kein auffälliges Ergebnis, davon waren 18 bronchoskopisch ebenfalls unauffällig und 35 Präparate (13%) enthielten zu wenig Material, um zytometrisch beurteilt werden zu können. Unter den als tumorverdächtig eingestuften Präparaten waren 67 Präparate, die sowohl in ihrem 2cDI als auch in der 5cER von den Grenzwerten abwichen und daher dem Beurteilungsgrad III (maligne) zugeordnet wurden. 126 Präparate zeigten einen auffälligen 2cDI ohne dabei vermehrt Kerne mit mehr als 5c aufzuweisen (Stufe II- malignitäts-suspekt). Insgesamt konnten von den untersuchten Präparaten aus Spülflüssigkeiten bei Tumorpatienten 85% durch das Image-Zytometer richtig eingestuft werden. Es fielen 34 falsch negative Präparate bei der Berechnung der Sensitivität ins Gewicht, von denen 12% von zentralen Tumorherden stammten. Diese Präparate enthielten zu 75% eine nur mittelmäßige Anzahl von beurteilbaren Zellen, im Vergleich zu 50% bei den gutartigen Veränderungen und 46% bei den Tumorpatienten im allgemeinen Durchschnitt enthielten. Unter den 180 gutartigen Veränderungen wurden zytometrisch 21 (12%) als falsch tumor-positiv eingestuft, 139 (77%) als unauffällig und 20 (11%) Präparate enthielten zu wenig Material. Unter den als falsch tumor-positiv gewerteten Präparaten waren nur 3 Präparate, die auch eine auffällige 5cER zeigten. Es handelte sich bei diesen falschpositiven Präparaten in der überwiegenden Zahl der Fälle (19/21) um starke Raucher mit einer mittleren Pack-Year-Zahl von 35 ± 11 Jahren, zusätzlich hatten 14 Patienten aus dieser Gruppe entzündliche Veränderungen der Atemwege vorzuweisen. Die Sensitivität der Zytometrie ergab in dieser Untersuchung 85%, ihre Spezifität lag bei 87%. Der positive prädiktive Wert erreichte 90%, der negative prädiktive Wert 80%. Die diagnostische Effizienz betrug somit 86%. - 51 - IV.2.3. Zytometrie bei verschiedenen Tumorarten Ein kleinzelliges Bronchialkarzinomen wurden in 51/62 Fällen, bei sechs (10%) nicht repräsentativen Präparaten erkannt. Fünf Präparate erwiesen sich also als falsch negativ. Unter den richtig positiven fanden sich 28 Präparate mit auffälligem 2cDI (Stufe IIsuspekt) und 23 Präparate zeigten darüber hinaus noch eine verdächtige 5cER (Stufe IIImaligne). Die Sensitivität der Zytometrie ergibt sich damit für die kleinzelligen Bronchialkarzinome mit 91%. Abbildung 11 zeigt den Untersuchungsbericht des Zytometers (Teil A) für ein kleinzelliges Bronchialkarzinoms ebenso wie das zytologische Präparat (Teil B) und das histologische Präparat desselben Patienten (Teil C). Abb. 11: A: Zytometrischer Befundbogen eines kleinzelligen Bronchialkarzinoms mit Verteilungshistogramm, Punktwolke (DNA-Index versus Area) und einer Galerie der auffälligen epithelialen Zellkerne B: zytologisches Präparat C: histologisches Präparat (B und C sind nicht fester Bestandteil des zytometrischen Befundberichtes) - 52 - Auf den ersten Blick fällt auf, daß die aneuploiden Zellkerne in der Regel in ihrer Zellkerngröße nicht weit über 800 Pixel (Area) hinausragen. Dies ist typisch für die Punktwolke eines kleinzelligen Bronchialkarzinoms. Man kann eine zweite Zellkernverteilungskurve in den Bereichen eines erhöhten DNA-Index sehen. Die Rate der 5c überschreitenden Zellkerne ist hier 6,06 %, der 2c-DI 0,77. Bei der Zusammenstellung der Präparate aus kleinzelligen Lungentumoren ergibt sich als Bigfile folgendes Bild (Abb.12): Man erkennt eine dem Einzelpräparat ähnliche Form der Punktwolke. Abb. 12: Bigfile aus 62 Präparaten von kleinzelligen Bronchialkarzinomen. In der Auswertung der Bigfiles ergab sich für die kleinzelligen Karzinome folgendes Verteilungsmuster der Mittelwerte der Kernstrukturen, normiert auf die Mittelwerte der Kernstrukturen der gleichen Gruppe der Kontrollen: Zu erkennen ist, daß die größten Abweichungen von den Kernstrukturen der normalen epithelialen Kerne in der Gruppe der malignen Kerne mit einem DNA-Gehalt >5c zu finden sind. - 53 - Aber auch die auffälligen Kerne mit einem DNA-Gehalt <5c streuen weit um die Werte der normalen epithelialen Kerne. Wert der Quotienten 5,0 maligne Kerne (DNA-Index>2,5) suspekte Kerne (1,25<DNA-Index<2,5) 4,0 "Normale" Epithelzellkerne 3,0 2,0 1,0 Feature Nummer 0,0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Abb. 13: Bigfile-Diagramm, dargestellt sind die Quotienten der Mittelwerte der Kernstrukturparameter der verschiedenen Zellgruppen aus Präparaten von kleinzelligen Bronchialkarzinomen (Zähler) in Relation zu den Kernstrukturparametern der normalen epithelialen Zellkerne der Kontrollgruppe (Nenner) für 114 Chromatinstrukturparameter Betrachtet man das Punkt-Liniendiagramm, so sieht man zunächst einen kleinen Peak der aneuploiden Zellen mit einem DNA-Index von >2,5 im Bereich der morphometrischen, die Kernform beschreibenden, Parameter area (Feature 1) und maximaler Radius (Feature 5), daraufhin fallen die Werte der suspekten und malignen Kerne über eine lange Strecke unter die Werte der Kontrollen, hier handelt es sich um die Werte der harmonischen Ableitungen aus den Fourier Transformationen 15-46 (Feature 15-46), die die Gleichverteilung der DNA im Zellkern beschreiben. Im Bereich des Features 50, dem DNA-Gehalt findet sich ein neuer Peak der malignen Zellkerne. Zwischen den Features 55 und 85 - entspricht zum Teil den diskreten Parametern, den - 54 - Graulevelvariationen sowie den Extrembereichseigenschaften (s.Tabelle 6) - streut auch die Gruppe der normalen epithelialen Kerne sehr weit um die Kontrollen, hier müssen noch genauere Analysen erfolgen, um eventuell auch diese Parameter zur Differenzierung heranziehen zu können. Weitere Peaks der malignen und suspekten Kerne finden sich bei den Features fractal-area (Feature 91+92) und long-run (Feature 99-102). Bildet man aus dem Bigfile der kleinzelligen Karzinome die Quotienten der Mittelwerte der Kernstrukturparameter der als normal eingestuften epithelialen Zellkerne, der suspekten Zellkerne mit DNA-Index <2,5 und der malignen Zellkerne mit DNA-Index >2,5 jeweils mit den Mittelwerten der normalen epithelialen Zellkerne der Kontrollgruppe als Bezugspunkt, so erhält man einen Mittelwert der Quotienten der suspekten Zellkerne von 1,10 ± 0,34, bei den malignen Kernen ergibt sich ein Wert von 1,21 ± 0,59. Der Quotient der normalen epithelialen Kerne aus diesem Bigfile zu den Werten der Kontrollgruppe ergibt sich mit 1,04 ± 0,15. - 55 - Für die Plattenepithelkarzinome ergab sich in der vergleichenden Untersuchung der Diagnosen eine positive Rate von 42/64 bei 13 (20%) nicht repräsentativen Präparaten und 9 (14%) fälschlicherweise als tumor-negativ eingestuften Präparaten, die daraus ermittelte relative Sensitivität beträgt 82%. Unter den auffälligen Präparaten zeigten 9/42 sowohl einen auffälligen 2cDI als auch eine verdächtige 5cER (Stufe III-maligne). In Abbildung 14 ist die zytometrisch erstellte Zellkernverteilungskurve Plattenepithelkarzinoms sowie histologisches und zytologisches Präparat zu sehen: Abb. 14: A.: Zytometrischer Befundbogen eines Plattenepithelkarzinoms mit Verteilungshistogramm, Punktwolke (DNA-Index versus Area) und einer Galerie der auffälligen epithelialen Zellkerne B: zytologisches Präparat C: histologisches Präparat (B und C sind nicht fester Bestandteil des zytometrischen Befundberichtes) - 56 - eines Man sieht zahlreiche von der Normverteilung abweichende aneuploide Zellen mit einer erhöhten Zellkerngröße. Die 5cERbeträgt hier 12,7%, der 2cDI 1,09. Fügt man die Einzelpräparate der Plattenepithelkarzinome zu einem Bigfile zusammen, so kann man erkennen, daß die Form der Punktwolke dem Einzelpräparat sehr ähnlich ist. Abb. 15: Bigfile aus 64 Präparaten von Plattenepithelkarzinomen Bestimmt man für diesen Bigfile die Quotienten der Mittelwerte der Kernstrukturparameter der einzelnen Zellkerngruppen und setzt sie in Relation zu den Werten der normalen epithelialen Zellkerne aus der Kontrollgruppe zeigt sich auch hier, daß die Quotienten der Mittelwerte der Kernparameter der suspekten und malignen Zellkerne im Bigfile-Diagramm deutlich abweichende Werte zeigen. Ähnlich wie bei den kleinzelligen Karzinomen ergeben sich vier Hauptgipfel der Abweichungen in den Bereichen der Kernparameter area (Feature 1), DNA-amount (Feature 50), fractal-area (Feature 91+92) und der long-run Werte (Feature 99-102). Hinzu kommen weitere - 57 - Abweichungen der malignen Zellkerne bei den Kernparametern low-DNA-compactness (Feature 61) und med-DNA-compactness (Feature 62) sowie low/med und high-densityobject (Feature 72-74). Auch bei den Plattenepithelkarzinomen liegen die Werte der harmonischen Ableitungen aus den Fourier Transformationen (Feature 15-46) unter denen der normalen epithelialen Zellkerne. Die Quotienten der Abweichungen der Mittelwerte von den normalen epithelialen Zellkernen der Kontrollgruppe ergeben sich für die Plattenepithelkarzinome mit 1,03 ± 0,07 für die als normal eingestuften Zellkerne, mit 1,15 ± 0,31 für die suspekten Zellkerne und 1,28 ± 0,75 für die malignen Zellkerne. Wert der Quotienten 5,0 Maligne Kerne (DNA-Index>2,5) Suspekte Kerne (1,25<DNA-Index<2,5) 4,0 Normale Kerne nuclei 3,0 2,0 1,0 Feature Nummer 0,0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Abb.16 : Bigfile-Diagramm, dargestellt sind die Quotienten der Mittelwerte der Kernstrukturparameter der verschiedenen Zellgruppen aus Präparaten von Plattenepithelkarzinomen (Zähler) in Relation zu den Kernstrukturparametern der normalen epithelialen Zellkernen der Kontrollgruppe (Nenner) für 114 Chromatinstrukturparameter - 58 - Unter den Adenokarzinomen wurden 57/79 Präparaten zytometrisch als tumor-positiv befundet, darunter 18 maligne und 39 suspekte Präparate. Bei 12 (15%) Präparaten war zu wenig repräsentatives Material vorhanden und 10 (13%) wurden als tumor-negativ eingestuft. Ein Beispiel für die zytometrisch untersuchten Adenokarzinome ist in Abb.17 dargestellt: Abb.17: A.: Zytometrischer Befundbogen eines Adenokarzinoms mit Verteilungshistogramm, Punktwolke (DNA-Index versus area) und einer Galerie der auffälligen epithelialen Zellkerne B: zytologisches Präparat C: histologisches Präparat (B und C sind nicht fester Bestandteil des zytometrischen Befundberichtes) - 59 - Man sieht auch hier zahlreiche aneuploide Zellkerne mit einer 5cER von 3,8% sowie einem 2cDI von 0,65. Die Auswertung des entsprechenden Bigfile aus 79 Einzelpräparaten ist in Abbildung 18 wiedergegeben. Abb.18: Bigfile aus 79 Einzelpräparaten von Adenokarzinomen Berechnet man die Quotienten der Mittelwerte der Kernstrukturparameter ergeben sich die schon bekannten Gipfel in den Bereichen der Kernparameter area (Feature1), maxradius (Feature 5), DNA-amount (Feature 50), fractal-area (Feature 91+92), der longrun-Werte (Feature 99-102), sowie den niedrigen Werten der harmonischen Ableitungen aus den Fourier-Transformationen (Feature 15-46). Hinzu kommen noch zwei deutliche Gipfel im Bereich der Kernparametern low-DNA-compactness (Feature 61) und medDNA-compactness (Feature 62) sowie low/med (Feature 72+73) und high density-object (Feature74). Die Quotienten der Abweichungen von der Kontrollgruppe ergeben sich bei den Adenokarzinomen mit 1,04 ± 0,16 für die als normal klassifizierten Zellkerne, mit 1,12 ± 0,24 für die suspekten Kerne und 1,29 ± 0,65 für die malignen Kerne. - 60 - 5,0 maligne Kerne ( DNA-Index>2,5) suspekte Kerne (1,25<DNA-Index<2,5) 4,0 "normale" Epithelzellkerne 3,0 2,0 1,0 0,0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Abb. 19: Bigfile-Diagramm, dargestellt sind die Quotienten der Mittelwerte der Kernstrukturparameter der verschiedenen Zellgruppen aus Präparaten von Adenokarzinomen (Zähler) in Relation zu den Kernstrukturparametern der normalen epithelialen Zellkernen der Kontrollgruppe (Nenner) für 114 Chromatinstrukturparameter Für die Gruppe der Metastasen primär nicht-pulmonaler Tumoren ergab sich in der vergleichenden Wertung der zytometrischen Ergebnisse eine Anzahl von 12/16 positiv befundeten Präparaten, darunter drei Präparate der Stufe III (maligne) und 9 der Stufe II (suspekt) bei 3 als normal eingestuften und einem fehlenden Präparat. Alle Kollisionstumoren wurden zytometrisch erkannt und 3/5 als höchst auffällig eingestuft, ebenso das Karzinoid und der nicht näher differenzierte neuroendokrine Tumor. Unter den Nicht-kleinzelligen Karzinomen fanden sich 21/28 zytometrisch auffällige Präparate mit sechs höchst auffälligen Fällen, bei vier falsch negativen (14%) und drei (11%) nicht bewertbaren Präparaten. Das Carcinoma-in-situ und das Alveolarzellkarzinom wurden beide zytometrisch erkannt, nur die Dysplasien Normalpräparate eingestuft. - 61 - wurden falsch negativ als 7 unauffällige Patienten 14 entzündliche Atemwegserkrankungen 130 146 1 1 1 Carcinoma in situ schwere Dysplasien 29 34 0 Karzinoide Alveolarzellkarzinome 2 2 2 2 2 positive Präparate 2 2 3 Gesamtzahl repräsentative Präparate 5 5 5 Kollisionstumoren 12 15 16 Metastasen 21 25 28 NSCLC 42 Plattenepithelkarzinome 51 64 51 56 62 SCLC Adenokarzinome 57 0 20 40 60 67 79 80 100 120 140 160 Anzahl Abb.20 : Zytometrische Ergebnisse nach Tumorart, dargestellt sind in Dreiergruppen jeweils die Gesamtzahl aller Präparate einer Gruppe, die Anzahl der Präparate mit repräsentativem Material sowie die Anzahl der tumor-positiv gewerteten Präparate Unter den gutartigen Veränderungen (146 Entzündungsreaktionen, 34 unauffällige Bronchialsysteme) fanden sich bei 21 Präparaten mit zu wenig Material, insgesamt 21 (12%) als tumor-positiv eingestufte Präparate, dabei drei mit einem Befund, bei dem die Zellkerne vielfach einen DNA-Gehalt zeigten, der sogar >5c überschritten. - 62 - IV.2.4. Vergleichende Analyse der Kernstrukturen Stellt man die Gruppen der normalen, suspekten und malignen Zellkerne aus den Bigfiles der drei großen Tumorgruppen (Adeno-, Plattenepithel- und kleinzelliges Karzinom) einander in Form ihrer Quotienten der Mittelwerte der Kernstrukturen gegenüber, so zeigen sich folgende Verteilungen (siehe auch Tab.6): Wert der Quotienten 5,0 4,5 " normale" Epithelzellkerne aus Plattenepithelkarzinomen 4,0 3,5 "normale" Epithelzellkerne aus kleinzelligen Tumoren 3,0 "normale" Epithelzellkerne aus Adenokarzinomen 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 Feature Nummer 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Abb. 21: Quotienten der Mittelwerte der Kernstrukturen für normale epitheliale Kerne bezogen auf die entsprechenden Werte der Kontrollgruppe Wert der Quotienten 5,0 suspekte Kerne aus Plattenepithelkarzinomen suspekte Kerne aus kleinzelligen Karzinomen 4,5 4,0 suspekte Kerne aus Adenokarzinomen 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 Feature Nummer 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 Abb. 22: Quotienten der Mittelwerte der suspekten Zellkerne aus den verschiedenen Tumorgruppen bezogen auf die entsprechenden Werte der Kontrollgruppe - 63 - Wert der Quotienten 5,0 maligne Kerne aus Plattenepithelkarzinomen 4,5 maligne Kerne aus kleinzelligen Karzinomen 4,0 maligne Kerne aus Adenokarzinomen 3,5 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0 0,5 Feature Nummer 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 Abb.23 : Quotienten der Mittelwerte der malignen Zellkerne aus den verschiedenen Tumor-Bigfiles bezogen auf die entsprechenden Werte der Kontrollgruppe Im Diagramm für die Quotienten der Mittelwerte von Kernstrukturen normaler epithelialer Zellkerne sieht man, daß die Mittelwerte aus den drei verschiedenen TumorBigfiles nur in einigen Parametern weiter streuen. Die Mittelwerte und Standardabweichungen der Quotienten liegen bei 1,03 ± 0,07 (Bigfile aus Plattenepithelkarzinomen), 1,04 ± 0,15 (Bigfile aus kleinzelligen Tumoren) und 1,04 ± 0,15 (Bigfile aus Adenokarzinomen). Bereiche größerer Differenzen der morphometrischen Parameter ergeben sich für die Zellkerne aus Adenokarzinomen für den Parameter Variance-radius (Feature 6), für die Zellkerne aus Platten- epithelkarzinomen im Bereich des Parameters freq-low-fft (Feature 13). Bei den photometrischen Parametern zeigte sich der Wert low-DNA-amount (Feature 58) für Zellkerne aus den Bigfiles der kleinzelligen Karzinome und Adenokarzinome als auffällig, ebenso wie der Streckenlängenparamter size-texture-orientation (Feature 94). Als allen drei Gruppen gemeinsam auffällige Parameter zeigten sich die Werte der diskreten Kernstruktureigenschaften med-density-object (Feature 73) und low-DNAamount (Feature 58) sowie cluster-shade (Feature 80) als makrovianischem Parameter. - 64 - Abbildung 22 stellt die Quotienten der Mittelwerte von Kernstrukturen suspekter Zellkerne der drei Tumor-Bigfiles gegenüber und zeigt dabei einen Verlauf der Punktlinien, der in vielen Bereichen weit von den für die normalen epithelialen Zellkerne der Kontrollen ermittelten Werte abweicht. Die Mittelwerte und Standardabweichungen liegen allesamt über den Werten aus dem Vergleich der Bigfiles hinsichtlich der als normal eingestuften Zellkerne und ergeben sich mit 1,15 ± 0,31 (suspekte Kerne aus Plattenepithelkarzinomen), 1,10 ± 0,34 (suspekte Zellkerne aus kleinzelligen Karzinomen) und 1,12 ± 0,25 (suspekte Zellkerne aus Adenokarzinomen). Gemeinsame Gipfel ergeben sich für die suspekten Zellkerne aus den Bigfiles der drei großen Tumorgruppen für die photometrischen Parameter DNA-Index und DNA-amount (Feature 49,50) sowie den Brechungsstrukturparameter fractal-area02 (Feature 92) und einige Streckenlängenwerte (Feature 93-110). Der Verlauf der Kurven der Quotienten aus Adeno- und Plattenepithelpräparaten liegt sehr eng beieinander, während die Quotienten für die suspekten Zellkerne aus dem Bigfile für kleinzellige Karzinome in vielen Werten größere Abweichungen zeigen. So liegt der mittlere Radius (Feature 4) der kleinzelligen Karzinome unter dem der anderen zwei Gruppen, während die Parameter high-DNAarea/amount (Feature 57,58) leicht über den entsprechenden Werten der anderen Tumorarten liegen. Auch für die Streckenlängenparameter ergibt sich für die suspekten Zellkerne aus kleinzelligen Karzinomen ein anderes Bild: Die long-run Parameter (Feature 99-102) liegen über den Quotienten der anderen Bigfiles während die gray-level Parameter (Feature 103-106) darunter liegen. Betrachtet man das entsprechende Diagramm für die malignen Zellkerne aus allen drei Bigfiles, so sieht man, daß hier in weiten Bereichen die drei Punktlinien übereinstimmen. Es ergeben sich nur einzelne Abweichungen, wie z.B. im Vergleich zu dem Bigfile aus kleinzelligen Karzinomen die erhöhte Kernfläche (area) (Feature 1) und Varianz des Radius (Feature 6) in Zellkernen aus Plattenepithelkarzinomen und Adenokarzinomen. Ein anderes Beispiel wäre der diskrete Parameter high-DNA-compactness (Feature 63), in welchem die malignen Zellkerne aus Plattenepithel-karzinomen und kleinzelligen Karzinome ebenfalls nach oben abweichen oder der makrovianische Parameter clustershade (Feature80), bei welchem die kleinzelligen Karzinomzellen die anderen Gruppen leicht übertreffen. - 65 - Im Bereich der Streckenlängenparameter ergibt sich ein ähnliches Bild wie schon bei den suspekten Zellkernen gesehen: Die Zellkerne aus kleinzelligen Tumoren überragen im Bereich der long-run Parameter (Feature 99-102), aber verlaufen nahe dem Wert 1 bei den gray-level Parametern (Feature103-106). Insgesamt sieht man bei der Gegenüberstellung normaler, suspekter und maligner Zellkerne aus den drei großen Tumorgruppen eine von den normalen über die suspekten bis hin zu den malignen Zellkernen immer stärker ausgeprägte Streuung um die entsprechenden Werte der Kontrollgruppe (Tab.14). Es fanden sich einzelne Parameter die sich bei den verschiedenen Tumoren unterschiedlich verhalten, viele Parameter zeigen jedoch ein ähnliches Verhalten: Für eine allgemeine Differenzierung von Tumorgewebe und gesundem Gewebe haben sich in dieser Untersuchung neben dem DNA-Gehalt und der Zellkerngröße in Form des Parameters Area, folgende Kernstrukturparameter als möglicherweise geeignet gezeigt: In den Parametern varradius, fractal-1/2-area, gray0/45/90/135-level, med-density-object, high_DNA-compactness, high-density-object, Run-length90/135, size-texture-orientation, freq-low-fft und cluster-shade ergeben sich sowohl bei suspekten als auch bei malignen Zellkernen größere Werte als bei normalen epithelialen Zellkernen. Für die harmonischen Ableitungen aus den Fourier Transformationen, welche insbesondere die Grenzstrukturen des Zellkernes beschreiben, darunter besonders Harmonics14/15/16/17/19/20/21/22/23/26 ergeben sich in Tumorgewebe kleinere Werte als bei den Kontrollen. Ähnliches gilt für die Parameter low-DNA-area, contrast, freq-high-fft, mean-intensity, med-DNA-area, high-center-mass sowie med-DNA-amount, für die sich ebenfalls niedrigere Werte ergaben. - 66 - Abschließend soll eine zusammenfassende Darstellung der Mittelwerte der Abweichungsquotienten für die einzelnen Tumorarten mit der folgenden Tabelle erfolgen: Tab. 14 : Mittelwerte der Abweichungsquotienten für verschiedene Tumorarten Plattenepithelkarzinome normal suspekt maligne Mittelwert 1,03 1,15 1,28 Standardabweichung 0,07 0,31 0,75 Mittelwert 1,04 1,10 1,21 Standardabweichung 0,15 0,34 0,59 Mittelwert 1,04 1,12 1,29 Standardabweichung 0,16 0,24 0,65 Kleinzellige Karzinome Adenokarzinome Man erkennt die für die verschiedenen Malignitätsstufen unterschiedlich hohe Streuung von den normalen epithelialen Zellkernen der Kontrollgruppe, aber auch ein, im Vergleich der einzelnen Tumoren untereinander, nicht signifikant unterschiedliches Bild. - 67 - V.3. I. Zytologie IV.3.1. Probeentnahme Die Proben wurden individuell, je nach dem sich ergebenden bronchoskopischem Bild entnommen. Dabei waren die Zangen-Biopsie, bzw. der zytologische Abstrich aus einer solchen Biopsie am häufigsten (insgesamt 63 % der Präparate), gefolgt von der Spülung suspekter Lungenareale mit 21% der Untersuchungen und der transbronchialen Biopsie mit 14% der Proben. Bürste, Katheter und bronchoalveoläre Lavage spielten eine nur untergeordnete Rolle, sie wurden vor allem bei den bronchoskopisch nicht sichtbaren Tumoren angewandt. IV.3.2. Zytologische Ergebnisse In der Gruppe der 262 Tumoren wurden durch die Zytologie 237 (93%) von 254 untersuchten Proben als tumor-positiv bewertet, 18 Proben (7%) waren tumor-negativ und 7 Präparate enthielten zu wenig Material für die zytologischen Untersuchungen. Die falsch negativen Präparate stammten zu überwiegender Zahl (14/18) aus bronchoskopisch unauffällig bewerteten Patienten von denen 15 einen peripheren Rundherd hatten. Es ergibt sich eine richtig positive Rate von 93 %. Unter den 180 entzündlich veränderten oder unauffälligen Präparaten fanden sich zwei falsch positive Ergebnisse, die auf schwere Pneumonien zurückzuführen waren, damit ergibt sich die Spezifität der Zytologie mit 98 %. Der positive prädiktive Wert ergibt sich mit 99%, ihr negativer prädiktiver Wert beträgt 85%. Daraus läßt sich eine diagnostische Effizienz von 94% ermitteln. IV.3.3.Ergebnisse nach Tumorart Bei den kleinzelligen Bronchialkarzinomen wurden von 62 untersuchten Präparaten 61 zytologisch erkannt, daraus ergibt sich die Sensitivität der Zytologie für kleinzellige Karzinome mit 98%. In der Gruppe der Plattenepithelkarzinome wurden 59 von 63 zytologisch untersucht und davon 54 als tumor-positiv bewertet, woraus sich eine Sensitivität von 92% ermitteln läßt. - 68 - Für das Adenokarzinom ergab sich mit 72 tumor-positiven von insgesamt 78 untersuchten Präparaten eine Sensitivität von 92 %. In der Gruppe der Metastasen wurden 11 von 18 bei insgesamt 16 untersuchten Präparaten erkannt (Sensitivität 69 %). Die mit kleinzelligen Anteilen gemischten Tumore (4) wurden zytologisch alle richtig erkannt. Die Gruppe der nicht- kleinzelligen Karzinome ist eine sehr heterogene Gruppe, in der sich mit 28 / 28 eine positive Rate von 100% für die Zytologie ergab. Bei den Alveolarzellkarzinomen wurden zwei von drei erkannt. Zum Carcinoma-in-situ lag keine aktuelle Zytologie vor. Die Diagnose ergab sich aus Vorbefunden, sowie der aktuellen Autofluoreszenz-Bronchoskopie. Beide schweren Dysplasien wurden erkannt. Sowohl das Karzinoiden als auch der neuroendokrinen Tumoren (2) wurden zytologisch erkannt. - 69 - 0 18 unauffällige Patienten 34 entzündliche Atemwegserkrankungen Carcinoma in situ 2 90 146 0 0 1 2 2 2 schwere Dysplasien 2 2 2 Karzinoide 2 3 3 Alveolarzellkarzinome positive Präparate repräsentative Präparate Gesamtzahl 4 4 5 Kollisionstumoren 11 16 16 Metastasen 28 28 28 NSCLC Plattenepithelkarzinome 54 59 64 61 62 62 Kleinzellige Karzinome 72 78 79 Adenokarzinome 0 20 40 60 80 100 120 140 160 Anzahl Abb. 24: Zytologische Ergebnisse nach Tumorhistologie dargestellt in Balken: positive Untersuchungsergebnisse, Anzahl der repräsentativen Präparate und Gesamtzahl aller untersuchten Präparate der Präparate jeder Gruppe - 70 - IV.4. Histologie IV.4.1. Histologische Ergebnisse Von den insgesamt 262 malignen Veränderungen wurden von 191 (73%) untersuchten Präparaten 169 (88%) als richtig positiv eingestuft, falsch negativ waren 22 (11%) Präparate. Von den 180 gutartigen Läsionen wurden lediglich 62 weiter histologisch untersucht, es wurde allerdings kein Präparat als tumor-positiv beurteilt. Die Sensitivität der Histologie ergab sich mit 88%, bei einer Spezifität von 100%. Der prädiktive positive Wert war 100%, der negative prädiktive Wert 73%, woraus sich eine diagnostische Effizienz von 91% ergibt. IV.4.2. Ergebnisse nach Tumorart Von den kleinzelligen Karzinomen wurden 42 erkannt, bei 18 fehlenden Untersuchungen und zwei falsch negativen Ergebnissen. Von den Plattenepithelkarzinomen wurden histologisch 46/64 bei einer Rate von 16 fehlenden und zwei falsch negativen Präparaten erkannt, unter den Adeno-Bronchialkarzinomen waren es 51/79 bei 20 fehlenden und acht falsch negativen. Bei den Metastasen (16) wurden von 8 untersuchten Präparaten vier richtig erkannt. Unter den Kollisionstumoren wurden 5/5 erkannt. Bei den nicht-kleinzelligen Bronchialkarzinomen waren es 19/28 bei vier fehlenden und fünf unauffälligen Präparaten. Von den Alveolarzellkarzinomen wurde nur eins untersucht und auch richtig erkannt. Der neuroendokrine Tumor sowie das Karzinoid wurden beide richtig erkannt. Die aktuelle Histologie des Carcinoma-in-situ fehlte. Die untersuchte Dysplasie wurde zu den Metaplasien gezählt. Von den unauffälligen Patienten (34) sowie den entzündlichen Veränderungen wurden nur 64 untersucht, dabei wurde kein Präparat als auffällig eingestuft. - 71 - - 72 - IV.5.Tumorlage nach bronchoskopischem Bild Die bronchoskopische Einteilung der Befunde erfolgte angelehnt an das unter Material und Methoden beschriebene Schema von Ikeda in direkte und indirekte Tumorzeichen sowie unauffällige Bronchialsysteme. Somit war indirekt auch eine Einteilung in zentrale, d.h. bronchoskopisch sichtbare Tumoren und periphere, d.h. in nicht-einsehbaren Bereichen gelegene Tumoren gegeben. Insgesamt fanden sich in 203 Fällen (45%) bronchoskopisch Tumorzeichen, darunter 116 (57%) mit einem direkt sichtbaren exophytischen Tumorwachstum und 87 (43%) Fälle in denen submukös ein Tumor zu erwarten war. Bei 239 (55%) Patienten konnten keine Tumorzeichen festgestellt werden, obwohl 63 (26%) unter ihnen dennoch einen Lungentumor hatten. 116 87 239 direkte Tumorzeichen indirekte Tumorzeichen bronchoskopisch unauffällig Abb. 26 : bronchoskopische Ergebnisse in Relation zur Tumorlage IV.5.1 Abhängigkeit der Image-Zytometrie von der Tumorlage nach bronchoskopischem Bild Von den Patienten mit direkten Tumorzeichen (116) bestätigte sich in allen Fällen, bis auf einen Patienten mit einer Tuberkulose, die Tumor-Diagnose. Von diesen erwiesen sich 93 als zytometrisch auffällig. Bei einer Anzahl von 12 fehlenden Präparaten ergibt dies eine positive Rate von 89%. Unter den Patienten mit indirekten Tumorzeichen (87) fanden sich 68 zytometrisch auffällige Präparate, was abzüglich der 13 fehlenden Präparate eine positive Rate von 92 % ergibt. - 73 - Unter den bronchoskopisch als unauffällig eingestuften Patienten, hatten 63 einen peripher gelegenen Tumor. Zytometrisch wurden 54 dieser peripher gelegenen Tumoren entdeckt, sechs darunter mit einem malignen Befund (Stufe III). Abzüglich der 11 fehlenden Präparate ergibt dies eine positive Rate von 86 %. 250 239 Anzahl Tumore 200 untersuchte 209 positiv gewertete 150 116 100 115 104 87 93 83 74 63 68 50 54 0 direkte Tumorzeichen indirekte Tumorzeichen bronchoskopisch unauffällige Abb.27: bronchoskopische Tumorklassifikation und zytometrische Ergebnisse Betrachtet man die Tumorlage für die drei größten Tumorartgruppen, Adenokarzinom, Plattenepithelkarzinom und kleinzelliges Karzinom, so ergibt sich folgende Verteilung: Tab. 15: Tumorart und bronchoskopisches Bild Kleinzelliges Ca. Plattenepithel Ca. Adeno Ca Anzahl % Anzahl % Anzahl % 5 8% 9 14% 27 34% indirekte Tumorzeichen 30 48% 15 23% 23 29% direkte Tumorzeichen 43% 40 61% 29 35% unauffällig 27 Direkte Tumorzeichen zeigten sich vor allem bei Plattenepithelkarzinomen, während in der Gruppe der Adenokarzinome die Bronchoskopie vielfach unauffällig blieb. - 74 - IV.6. Sensitivität und Spezifität der unterschiedlichen Methoden imVergleich In der Sensitivität lag die Zytometrie mit 85% hinter Zytologie mit 92% und Histologie mit 88%. Die Spezifität der Image-Zytometrie liegt bei 87% die Werte von Zytologie und Histologie bei 98% und 100% (Tab.16). Tab. 16 : Sensitivität und Spezifität Anzahl richtig richtig falsch falsch der pos. neg. pos. neg. Sensitivität Spezifität Proben Zytometrie 385 193 138 21 33 85% 87% Zytologie 363 237 106 2 18 93% 98% Histologie 253 169 62 0 22 88% 100% Insgesamt zeigten sich jedoch alle drei Methoden als hoch sensitiv (Abb.28). 100% 80% 100% 98% 90% 87% 93% 88% 85% 70% 60% 50% Sensitivität 40% Spezifität 30% 20% 10% 0% Zytometrie Zytologie Histologie Abb.28: Sensitivität und Spezifität der Methoden im Vergleich Die prädiktiven Werte der Zytometrie bronchialer Spülungen lagen mit 90% (prädiktiver positiver Wert) und 80% (prädiktiver negativer Wert) unter den Werten der Zytologie (99% / 85%) und Histologie (100% / 73%). Auch bei der diagnostischen Effizienz lag die Zytometrie mit 86% noch unter den für die etablierten Methoden erreichten Werten. - 75 - IV.7. Ergebnisse der unterschiedlichen Methoden nach Tumorart Betrachtet man die Sensitivitäten und Spezifitäten in Relation zur Tumorart, so zeigen sich keine relevanten Unterschiede in der Diagnosewahrscheinlichkeit im allgemeinen. Die Zytometrie erzielte bei den kleinzelligen Karzinomen besonders gute Resultate, was vielleicht auf das typische Zellbild des kleinzelligen Karzinoms zurückzuführen ist. Die Histologie zeigte sich bei den Adenokarzinomen, die in der Regel peripher zu finden waren, etwas schwächer. Zytologisch scheint ebenfalls das kleinzellige Karzinom besonders gut zu diagnostizieren zu sein. Tab. 17: Relative Sensitivität nach Tumorart Tumorart Zytometrie Zytologie Kleinzelliges Ca. 91% 98% 95% Plattenepithel-Ca. 82% 92% 96% Adeno-Ca. 85% 92% 86% Metastasen 70% 68% 44% Nicht-kleinzellige Ca. 84% 100% 79% - 76 - Histologie IV.8. Direkter Vergleich übereinstimmender Proben Da in einer Anzahl von Patienten nicht alle drei diagnostischen Methoden angewandt wurden, stellten wir diejenigen Patienten gegenüber bei denen in allen drei Methoden diagnostisch verwertbares Material produziert worden war. Dabei handelte es sich um 200 Patienten, darunter 165 Tumorpatienten und 35 Patienten mit lediglich entzündlichen Atemwegserkrankungen. Zytometrisch wurden 144/165 Tumorpatienten richtig erkannt, während die 21 restlichen Patienten falsch negativ beurteilt wurden, wobei es sich hierbei in vielen Fällen um Proben mit wenig Material und einem unauffälligem Bronchoskopiebefund handelte. Zytologisch wurden 158/165 Proben von Tumorpatienten richtig erkannt, die 7 falschnegativ beurteilten Präparate stammten ebenfalls aus bronchoskopisch unauffälligen Patienten. Histologisch wurden 144/165 Tumorpatienten erkannt, die 21 falsch negativen Proben stammten aus Bronchoskopien, die keinen Tumorprozeß sichten konnten. Die Nicht-Tumorpatienten wurden histologisch alle als solche erkannt, zytologisch ergab sich bei 2 Patienten mit schweren Pneumonien ein falsch positives Ergebnis. Zytometrisch zeigten sich 8 als falsch positiv, dabei handelte es sich in 7 Fällen um starke Raucher und 6 Patienten zeigten entzündliche Atemwegserkrankungen. Die in dieser Untergruppe der Patienten ermittelten Sensitivitäten und Spezifitäten ergeben sich somit zu den in Tabelle 18 zusammengestellten Werten: Tab. 18 : Sensitivität und Spezifität bei identischen Patienten Zytometrie Zytologie Histologie Sensitivität 87% 95% 87% Spezifität 78% 95% 100% - 77 - V. Diskussion V.1. Studiendurchführung Die Einführung einer neuen Untersuchungsmethode setzt voraus, daß sie eine wesentliche Ergänzung der etablierten Verfahren bietet. Die Image-Zytometrie ist ein schon länger bekanntes Verfahren, um Kern- und Zellstrukturen quantitativ und objektiv zu erfassen und somit vergleichbare diagnostische Schlüsse zu ziehen. Ihr Einsatz in der Vergangenheit erwies sich auf Grund der begrenzten technischen Möglichkeiten, was die graphische Darstellung betraf, aber auch auf Grund der noch begrenzten Datenverarbeitungsmöglichkeiten sowie der fehlenden Automatisierung von Färbungsund Beladungsschritten sowie der Voranalyse, nur eingeschränkt als sinnvoll. Vor allem in der Untersuchung von Zervixabstrichen im Rahmen von Vorsorgeuntersuchungen wurde die Image-Zytometrie als Erleichterung der manuellen Beurteilung eingesetzt (14,60). Die Entwicklung der Durchflußzytometrie in den 70er Jahren ließ das Interesse an image-zytometrischen Methoden schwinden, da sich mit dieser Methode eine sehr schnelle und effiziente Methode zur Untersuchung von Zellsuspensionen ergab (20,32,71,99,104,108,151). Dank der Entwicklung von hochauflösenden CCD-VideoKameras und von Zellklassifikationssoftware sowie der weitreichenden Automatisierung image-zytometrischer Methoden in den letzten Jahren, schienen sich jedoch einige Kritikpunkte an der Image-Zytometrie zu relativieren und es ergaben sich weitere Einsatzbereiche (32,153). Die Entwicklung ist dabei soweit fortgeschritten, daß die Image-Zytometrie nicht mehr nur als Arbeitserleichterung dienen kann, sondern auch in der Lage ist, automatisiert Vorauswahlen zu treffen und damit den Anteil der manuell noch zu überprüfenden Präparate weitgehend reduzieren kann (2,67,101). Diese Charakteristika treffen insbesondere auf das in der hier vorgestellten Studie verwandte Gerät, den Cyto-Savant® (Oncometrics, Vancouver B.C., Kanada) zu. Das Gerät wurde in Kanada bereits zur Untersuchung von Zervixabstrichen genutzt, wobei in großangelegten Studien seine diagnostische Wertigkeit bewiesen wurde (2,56). McAulay zeigte, daß mit diesem Gerät die Anzahl der manuell zu untersuchenden Präparate bei der - 78 - Untersuchung von Zervixabstrichen auf die Hälfte reduziert werden kann, da eine Vorauswahl der unauffälligen Präparate voll automatisiert ablaufen konnte (2). Es stellte sich die Frage, ob sich auch andere Einsatzbereiche für dieses so effizient erscheinende Gerät finden ließen. Eine Möglichkeit ergab sich mit dem Screening auf Lungentumoren. Großangelegten Screening-Untersuchungen auf Lungentumoren in den USA konnten alle nicht dazu beitragen, die Mortalität an Lungentumoren zu senken (42,45-48). Man folgerte aus diesen Studien, daß Screening Untersuchungen in der allgemeinen Gesundheitsfürsorge, vor allem bei Risiokopatienten, nicht dazu in der Lage sind, die Mortalität zu senken, auch wenn zum Zeitpunkt des Studienabschlusses noch nicht ganz klar war, wie die Langzeitüberlebensraten sich darstellen werden. Kritisch zu beurteilen sind sicherlich die hohen Kosten, die durch breit angelegte manuelle ScreeningUntersuchungen entstehen und damit die Praktizierbarkeit auf lange Sicht (38,59). Eddy gibt in seiner Zusammenfassung dieser Studien ebenfalls zu bedenken, daß durch breit angelegte Screening-Untersuchungen eine nicht unerhebliche Zahl an falsch positiven Ergebnissen mit nachfolgenden Aufarbeitungsuntersuchungen produziert werden könnte und sich andererseits negativ diagnostizierte Patienten in falscher Sicherheit wiegen könnten (38). Strauss argumentiert gegen den aus diesen Studien allgemein gezogenen Schluß, ein Screening auf Lungenkrebs sei nicht effektiv, indem er die in diesen Studien erreichte frühere Diagnose und damit bessere Resezierbarkeit der entdeckten Tumoren sowie die Verbesserung der 5-Jahresüberlebensraten betont (131,132,133). Einzelne Patienten aus diesen Studien konnten von lebensverlängernden Therapiemaßnahmen profitieren, bei ihnen handelte es sich in der Regel um solche mit langsam wachsenden Plattenepithelkarzinomen, die durch Sputumuntersuchungen entdeckt worden waren (42,45-48). Daher schien ein Versuch, die Image-Zytometrie im Bereich des Screening auf bösartige Lungentumoren auf ihre Tauglichkeit zu testen, gerechtfertigt, um eine neue standardisierte Methode zu etablieren, die gleichzeitig durch ihre weitgehende Automatisierung wenig kostenintensiv und dennoch ausreichend sensitiv wäre. Zunächst einmal wurden Sputumproben aus den im vorhergehenden vorgestellten Studien untersucht, wobei sich bei Sensitivitätsraten um 40% und Spezifitäten um 90% ein nur begrenzter Erfolg zeigte, obgleich dies den üblichen Ergebnissen von manuellen Sputumuntersuchungen entsprach (105). - 79 - Der Einsatz der Image-Zytometrie beim Sputum-Screening bietet sich dennoch als sehr wenig invasive Methode, die noch nicht einmal eine ambulante Hospitalisierung erfordert, vor dem Zurückgreifen auf invasive Mittel an. Eine Weiterentwicklung dieser Methode in der Zukunft könnte zu einer Anhebung der Sensitivitätsraten führen und damit auch Sputumuntersuchungen wieder sinnvoll erscheinen lassen. Dazu sind jedoch zunächst nähere Erkenntnisse zum Verhalten von Kernstruktureigenschaften in Lungentumoren nötig. Eine Möglichkeit, solche Kenntnisse zu gewinnen, ergab sich mit der Untersuchung bronchialer Spülflüssigkeiten, die in der Regel sehr viel mehr Material enthalten als Sputumproben, aber dennoch dasselbe bronchiale Kompartiment der exfoliierten Zellen aus oberflächlichen Schichten des Bronchialepithels erfassen. Ferner ist die Probengewinnung durch bronchiale Spülung wenig invasiv und bei der Aufbereitung der Proben sind keine Verfahren zur Dissoziation von Gewebe für die zytometrische Untersuchung nötig. Neben dem vorbereitenden Aspekt auf mögliche zukünftige Screening-Untersuchungen sollte die Image-Zytometrie in ihrer Leistungsfähigkeit im Vergleich zu bestehenden diagnostischen Verfahren geprüft werden. Hierfür boten sich histologische und zytologische Proben, die im Rahmen von Bronchoskopien bei Tumorverdacht entnommen wurden, als Vergleichspunkt zu den weniger invasiven bronchialen Spülungen an. Histologische und zytologische Proben umfaßten in dieser Untersuchung in der Regel invasivere Probeentnahmen als diejenigen der Zytometrie. Dies erscheint somit als ungerechtfertigter Vergleich, da bronchiale Spülflüssigkeiten ebenso wie Sputumproben ungleich weniger Material enthalten und auch nicht so gezielt nur den suspekt erscheinenden Bereich umfassen. In dieser Untersuchung sollte aber gerade geprüft werden, ob die Untersuchung von Spülflüssigkeiten mittels der Image-Zytometrie trotz geringerer Invasivität dennoch eine gleichwertige Methode ist. Zu beachten ist auch, daß die Durchführung einer Spülung von Bronchialabschnitten für den Patienten kaum Risiken, die über das der Bronchoskopie an sich hinausgehen, birgt, während man bei der Entnahme histologischer und zytologischer Proben in einer, wenn auch geringen Zahl der Fälle, mit dem Risiko iatrogener Schädigungen (Pneumothorax, Blutung) zu rechnen hat. - 80 - Ein noch besseres Resultat hätte eventuell mit der Untersuchung von Tupfpräparaten aus Biopsien erreicht werden können, wobei man sich damit aber noch weiter von dem eigentlichem Ziel der wenig invasiven Screening-Untersuchungen entfernt hätte. Zudem hätte es sich dabei auch nicht mehr um lediglich exfoliierte Zellen, sondern um Zellen aus tieferen Tumorschichten gehandelt, was für den vorbereitenden Charakter dieser Studie in Hinblick auf spätere Sputumstudien ungünstig erschien. Die Enddiagnose wurde als Goldstandard eingesetzt, da sich nach ihr das weitere Therapievorgehen richtete. Sie basierte auf den gewerteten Ergebnissen der Histologie und Zytologie, aber auch auf dem klinischen Bild und konnte somit als Referenzstandard für alle drei Methoden angesehen werden. Ein endgültiger Referenzstandard wäre die Untersuchung von Resektionspräparaten gewesen, was jedoch im Rahmen dieses großen Patientenkollektivs nicht durchzuführen war. Zur Beschreibung der Tumorlage wurde das bronchoskopische Bild gewählt, da nicht in allen Patienten eine exakte Tumorlokalisation durch computertomographische Untersuchungen gemacht worden war. Außerdem schien es sinnvoll, nach Einflußfaktoren auf das Ausmaß an Exfoliation von Zellen während bronchialer Spülungen zu suchen und wir vermuteten einen solchen Zusammenhang im Unterschied zwischen exophytischem Wachstum (direkte Tumorzeichen), submukösem Wachstum (indirekte Tumorzeichen) und peripherem Tumorwachstum (unauffälliges Bronchialsystem im einsehbaren Bereich trotz vorhandenem Tumor). Eine getrennte Beurteilung des Tumorstadiums wurde nicht vorgenommen, da sich hieraus nicht unbedingt Hinweise für eine bessere Probengewinnung ergeben, hier wurde das sich ergebende bronchoskopische Bild als Beurteilungsweg herangezogen. Bei den Patienten wurde, um ein möglichst reelles Bild zu erhalten, keine Vorauswahl getroffen, sondern alle Patienten die im Untersuchungszeitraum (April 1996 - März 1998) bronchoskopisch mit dem Verdacht auf einen Lungentumor untersucht wurden, wurden in die Studie aufgenommen. Darunter waren sowohl Patienten, bei denen eine Erstdiagnose etabliert werden sollte, als auch solche, bei denen ein bekanntes Tumorgeschehen nur noch histologisch und zytologisch verifiziert werden sollte, bzw. eine Therapiekontrolle erfolgen sollte. Letztere wurden auf Grund der zytotoxischen Einflüsse der Therapie und damit der Veränderung des zytologischen Bildes aus der Endwertung herausgenommen und im Ergebnisteil getrennt beurteilt. - 81 - Nicht von allen Patienten konnten in den drei Methoden gleichzeitig repräsentative Proben gewonnen werden, so daß wir nur in 200 Fällen eine direkte Vergleichbarkeit hatten, die getrennte Auswertung dieses Kollektives wurde der allgemeinen Auswertung gegenübergestellt. Insgesamt handelt es sich bei dem Patientenkollektiv - allein durch die Untersuchungsindikation gegeben - schon um ein hoch selektives Patientengut, an dem aber keine zusätzliche studienbedingte Selektion erfolgte. Bei der Zusammenstellung der Kontrollgruppe schien es nicht gerechtfertigt, junge, völlig lungengesunde Probanden einer Bronchoskopie zu unterziehen. Aus diesem Grunde wurden solche Patienten, bei denen die Krankengeschichte mit aller Wahrscheinlichkeit eine bösartige Veränderung in der Lunge ausschloß, als Kontrollpatienten genommen. Diese Gruppe umfaßte Patienten mit akut entzündlich veränderten Atemwegen, die sich einer therapeutischen Bronchoskopie mit bronchio-alveolärer Lavage zur Mukusentfernung unterzogen oder zur Verlaufskontrolle anderer gutartiger Lungenerkrankungen, wie z.B. der Sarkoidose, kamen. Einzelne Patienten dieser Gruppe kamen auch ohne therapeutische Indikation aus freien Stücken zur Untersuchung und wünschten die Bronchoskopie dabei zur allgemeinen Gesundheitskontrolle. Bei der Aufbereitung der Proben wurden allgemein anerkannte Verfahren der Färbung verwendet, die aber auch einige bekannte Nachteile vorweisen. Sowohl für die Lufttrocknung als auch die saure Hydrolyse, die Fixierung mit Böhmschen Reagenzien und auch die Thioninfärbung, konnte in diversen Studien ein, die Proportionalität verfälschender, Effekt auf Zell- und Kernstrukturen nachgewiesen werden (124,123). Es ergeben sich für die verschiedenen Methoden teilweise sehr unterschiedliche Effekte auf Konsistenz und Struktur des untersuchten Gewebes (19,31, 120,121,122,123,125). Da solche Effekte jedoch normales und tumoröses Gewebe gleichermaßen betreffen und ohnehin nicht gänzlich auszuschalten sind, wurden die Methoden mit den am geringsten erscheinenden Nebeneffekten gewählt (107,120,121). Dazu zählten die Lufttrocknung, die saure Hydrolyse und die Anwendung von BöhmSprenger-Fixierlösung sowie Thionin als Farbstoff. Die hier vorgestellte Untersuchung der Proben mit dem Cyto-Savant® gehört neben Sputumuntersuchungen zu den ersten Studien mit diesem Gerät, die Material aus der Lunge bewerten. - 82 - Das Gerät selber hatte sich bei der Untersuchung von Zervixabstrichen bewährt (2,101) und sollte daher auch auf seine Tauglichkeit bei der Bewertung von bronchialen Spülflüssigkeiten untersucht werden. Daher mußten zu Beginn der Studie einige Anpassungen des automatischen Zellklassifizierprogrammes durchgeführt werden. Die Studienergebnisse sollen in Zukunft durch die erstellten Dateien der Bigfiles für die verschiedenen Tumorarten zur Weiterentwicklung des Gerätes genutzt werden. Da die Image-Zytometrie bis heute nur an wenigen Orten angewandt wird, ergab sich auch bei der Beurteilung der Präparate, trotz international festgelegter Rahmenkriterien (11,13,17) ein relativ weiter Ermessensspielraum. Angelehnt wurde die Bewertung dabei prinzipiell an das von Böcking erstellte System der Beurteilung von 5c-Exceeding-Rate und 2c-Deviation-Index (13). Da aber noch zu wenig Studien in diesem Bereich durchgeführt wurden, existieren noch keine international festgelegten Grenzwerte, die es erlauben, standardisiert zwischen gutartig und bösartig differenziertem Gewebe zu unterscheiden. Eine solche Einteilung beruht in den meisten Fällen noch auf individuellen Erfahrungswerten des Untersuchers für die einzelnen Tumorarten und steht damit im großen Widerspruch zu der eigentlichen Intention der Image-Zytometrie, objektive und standardisierte Resultate zu liefern. Nur international zusammengetragene Konventionen könnten in Zukunft zu einer weiteren Standardisierung führen (7,11). Die Untersuchung der, im Vergleich mit Sputumproben in der Regel mehr Material enthaltenden bronchialen Spülungen, sollte unter anderem auch dazu dienen, solche Grenzwerte einzukreisen und neue Kernstrukturen neben dem DNA-Gehalt und der Kerngröße (area) zu finden, die bei der Differenzierung von malignem und normalem Gewebe helfen können. Dazu wurde die Erstellung von sogenannten Bigfiles zur weiteren Untersuchung von Kernstruktureigenschaften ausgewählt. Es handelt sich hierbei um Megadateien, die sich aus - nach dem Zufallsprinzip zusammengestellten Zellkernen aus Präparaten mit derselben Enddiagnose zusammensetzten. Aus solchen Bigfiles können dann repräsentativ für eine Tumorgruppe Kernstrukturparameter ermittelt und verglichen werden. Bei der Erstellung der Bigfiles legten wir strengere Maßstäbe an die Enddiagnose als bei der allgemeinen Auswertung, in welcher die jeweils vorherrschende Tumorart gleich der Enddiagnose gesetzt wurde. - 83 - Hier wurden nur solche Präparate einbezogen, die gänzlich übereinstimmend von Zytologie und Histologie bewertet wurden, um eine möglichst saubere Unterscheidung von Kernstrukturparametern für die einzelnen Tumoren zu ermöglichen. Da die einzelnen Kernstrukturparameter sehr verschiedene Zahlenwerte haben, bildeten wir zur Vereinfachung eines Vergleiches jeweils Quotienten mit den normalen epithelialen Zellkernen aus der Kontrollgruppe. Diese konnten graphisch einfach in Form eines Punktliniendiagramms dargestellt werden und ermöglichten so zusätzlich einen optischen Vergleich. In Zukunft werden weitere genauere Analysen der Kernstrukturparameter mittels Clusteranalysen folgen. - 84 - V.2. Ergebnisse V.2.1. Sensitivität und Spezifität In dieser Studie sollte vor allem die Wertigkeit der image-zytometrischen Untersuchung von bronchialen Spülflüssigkeiten im Vergleich zu den bei der Bronchoskopie gewonnenen histologischen und zytologischen Proben als etablierten Methoden an Hand der sich für alle Methoden ergebenden Sensitivitäten und Spezifitäten bestimmt werden. Dazu wurden diese Parameter sowohl für das Gesamtkollektiv als auch für die Untergruppe, in der in allen drei Methoden auswertbare Präparate vorlagen, ermittelt. Insgesamt zeigte sich die Image-Zytometrie dabei mit einer Sensitivität von 85% bei einer Spezifität von 87% den zytologischen (Sensitivität 93%, Spezifität 98%) und histologischen (Sensitivität 88%, Spezifität 100%) Ergebnissen annähernd vergleichbar. Bei der Auswertung der Untergruppe mit den direkt vergleichbaren Proben ergaben sich für die Zytologie (Sensitivität 95%, Spezifität 95%) und Histologie (Sensitivität 87%, Spezifität 100%) mit dem Gesamtkollektiv übereinstimmende Werte, während bei der Zytometrie die Spezifität sich mit 78% von der des Gesamtkollektivs unterschied. Über die Ursachen des so unterschiedlichen Ergebnis für eine Untergruppe des Gesamtkollektivs kann nur spekuliert werden. Man kann lediglich feststellen, daß der relative Anteil falsch positiv diagnostizierter Proben in dieser Untergruppe mit 22% höher als der der Gesamtgruppe mit 12% ist. In beiden Gruppen stammen die falsch positiven Ergebnisse in der überwiegenden Zahl der Fälle von Patienten mit stark entzündlichen Atemwegserkrankungen (66%) und gleichzeitig ausgeprägtem Rauchverhalten (90%). Aus dieser Gruppe zeigten jedoch nur drei von 21 Präparaten Kerne, welche auch in ihrer 5cER auffällig waren (Stufe III-maligne), während die anderen lediglich eine Abweichung des 2cDI (Stufe II-suspekt) zeigten. Die Spezifität der Image-Zytometrie mit 87% kann dazu führen, daß man in ca. 13% der Fälle mit einer falsch-positiven Diagnose rechnen muß, was in Anbetracht der sich damit ergebenden klinischen Konsequenzen in Form von Aufarbeitungsdiagnostik und besonders auch der seelischen Belastung des Patienten ein Nachteil gegenüber den etablierten Methoden ist. Ob es sich dabei allerdings um wirklich falsch positive Ergebnisse handelte, beeinflußt durch Störfaktoren wie starkes Rauchen oder Entzündungen der Atemwege, welche vor allem die oberen Gewebsschichten - 85 - beeinflussen, oder aber die Image-Zytometrie in der Lage war, prädysplastisches Gewebe bzw. Dysplasien zu entdecken, wo bisher Histologie und Zytologie noch nicht in der Lage waren, ein solches zu sehen, muß ein weiteres Follow-up der Patienten ergeben. Insgesamt legen diese Ergebnisse den Verdacht nahe, daß allein die Betrachtung der Zellkernstrukturen bei entzündlich veränderten Atemwegen, die Gefahr, eine hohe Rate an falsch positiven Ergebnissen zu produzieren, mit sich bringt. Ähnliches Verhalten wird auch in der Literatur beschrieben, so wurde für die zytostatische und radiologische Therapie, den Vitamin B12 Mangel oder Vorgänge wie Apoptose, Autolyse und Nekrose eine starke Veränderung der Zellkernstruktur insbesondere des DNA-Gehaltes nachgewiesen (11,86,141). Diese Faktoren muß man also sowohl bei der kritischen Beurteilung der zytometrischen Ergebnisse zur Zeit noch berücksichtigen, als auch sie als Basis für die weitere Verbesserung des image-zytometrischen Systems nutzen. Bei der Ermittlung der Sensitivität der Zytometrie von 85% fielen in der Gesamtbeurteilung 33 falsch negativ beurteilte Präparate ins Gewicht, diese stammten in 54% der Fälle von Patienten, die bronchoskopisch keine Tumorzeichen zeigten. Lediglich 13% dieser Patienten zeigte radiologische Veränderungen, die auf ein zentrales Tumorwachstum deuteten. Die Qualität der Präparate zeigte nur in einem Viertel der Fälle gut bis sehr gutes Material, Dreiviertel dieser Präparate wiesen zytometrisch mittleres bis schlechtes Material, was die insgesamt untersuchte Zellzahl, betrifft auf. Damit unterscheidet sich die Gruppe der falsch negativen Resultate deutlich von der Gesamtheit der Präparate, bei der der Anteil an guten Präparaten bei den gutartigen Veränderungen bei 50% und bei den Tumoren bei 46% lag. Für die Gruppe der direkt vergleichbaren Präparate ergab sich mit 87% eine dem Gesamtkollektiv sehr ähnliche Sensitivität, aber auch hier zeigen die 21 falsch negativen Präparate, die ebenfalls zum größten Teil aus bronchoskopisch und radiologisch unauffälligen Patienten stammten und durchschnittlich weniger Material aufwiesen, die Schwächen der zytometrischen Untersuchung von bronchialen Spülflüssigkeiten. Tumorlage und exophytisches Wachstum sowie die daraus resultierende Zahl der in Spülungen gewonnenen Zellen haben also starken Einfluß auf die Qualität der zytometrischen Diagnose und können die Zahl der falsch-negativen Präparate beeinflussen. - 86 - Aus der Betrachtung der Sensitivitäten und Spezifitäten der drei Methoden kann man unter Berücksichtigung des sehr unterschiedlich gewonnenen Materials folgern, daß man durch die Untersuchung von bronchialen Spülflüssigkeiten mit dem Cyto-Savant® ohne invasiv Proben zu entnehmen, in den meisten Fällen eine ebenso verläßliche Diagnose, wie durch die invasiven zytologischen und histologischen Techniken der Probeentnahme etablieren kann. Man muß bei der Verwendung der Image-Zytometrie allerdings berücksichtigen, daß sie durch die Untersuchung vorwiegend oberflächlicher, leicht extern beeinträchtigter Zelllagen diagnostische Unsicherheiten für entzündlich verändertes und inhalativ belastetes Gewebe aufweist für welche die etablierten Methoden nicht so störanfällig zu sein scheinen, wobei aber auf die zwei falsch positiven zytologischen Ergebnisse hingewiesen werden muß, welche von Patienten mit schweren Pneumonien stammten. Ferner muß berücksichtigt werden, daß durch Spülflüssigkeiten und Sputumproben nicht in allen Fällen genug exfoliierte Zellen erbracht werden, um eine Diagnose zu ermöglichen. In dieser Hinsicht besteht also ein Risiko für falsch negative Befunde. Insgesamt bietet sich die image-zytometrische Untersuchung somit in Kenntnis ihrer Schwächen als nützliche Ergänzung vor allem in solchen Fällen an, in denen von invasiveren Maßnahmen abgesehen werden muß, wozu z.B. die habituelle aber auch medikamentös induzierte Neigung zu spontanen Blutungen, eine stark eingeschränkte Lungenfunktion, mit der Gefahr durch einen iatrogen gesetzten Pneumothorax eine lebensgefährliche Situation auszulösen zählen. - 87 - V.2.2. Korrelation der Ergebnisse zur Tumorart In den großen amerikanischen Lungenkrebs-Screening-Untersuchungen konnte vielfach gezeigt werden, daß die zytologische Untersuchung von Sputumproben vor allem für die Plattenepithelkarzinome der Lunge ein diagnostisch wertvolles Mittel sein könnte (42,4548). Untersuchungen an bronchialen Spülflüssigkeiten zeigten einen deutlichen Unterschied der Diagnosequaltität zwischen zentralen (Plattenepithelkarzinom und kleinzelliges Karzinom) und peripheren (Adenokarzinomen) Tumoren. So wurden in einer Untersuchung von Truong 80% der Plattenepithelkarzinome, 89% der kleinzelligen Karzinome und lediglich 69% der Adenokarzinome zytologisch aus bronchialen Spülflüssigkeiten erkannt (141). In der hier vorliegenden Untersuchung sollte daher eine genaue Analyse der Diagnosewahrscheinlichkeiten für die einzelnen Tumorarten erfolgen, um eventuelle Schwächen und Stärken der image-zytometrischen Methode hinsichtlich der Tumortypen aufzudecken. Insgesamt waren die Adenokarzinome mit 30% aller Tumoren die größte Untergruppe gefolgt von Plattenepithelkarzinomen und dem kleinzelligen Karzinom mit einer prozentualen Häufigkeit von jeweils 24%. Dies entspricht einer in den letzten Jahren vielfach beobachteten ansteigenden Tendenz der Adenokarzinome (74,75). Da wir das genaue Ausmaß der Tumorausdehnung lediglich durch das bronchoskopische Bild bestimmten, sind die Sensitivitätsraten für die einzelnen Tumoren nur im Zusammenhang mit demselben zu betrachten. Es ergab sich für die Adenokarzinome eine Sensitivität der Image-Zytometrie von 85% bei einem Anteil von 34% nicht sichtbaren Veränderungen, 29% indirekten Tumorzeichen und 35% direkten Tumorzeichen, für die Plattenepithelkarzinome ergab sich als Sensitivität ein Wert von 82% bei einem ProbenAnteil von 14% mit unauffälligem Bronchialsystem, 23% mit indirekten Tumorzeichen und 61% mit direkten Tumorzeichen. Für die kleinzelligen Karzinome wurde eine Sensitivität von 91% ermittelt wobei 8% der Proben ein unauffälliges bronchoskopisches Bild, 48% indirekte Tumorzeichen und 43% direkte Tumorzeichen zeigten. - 88 - In der Gruppe der Metastasen zeigte sich die Image-Zytometrie mit einer Sensitivität von 70% sogar den anderen Untersuchungstechniken (Zytologie 68% und Histologie 44%) leicht überlegen. Plattenepithelkarzinome ließen sich trotz ihrer in der Regel zentralen Lage (84% zeigten bronchoskopisch Tumorzeichen, darunter 61% direkte Tumorzeichen) nicht besser mit image-zytometrischen Methoden diagnostizieren, hier zeigten zytologische und histologische Methoden ihre Überlegenheit. Dies ist um so erstaunlicher als in den großen Screening-Untersuchungen mehrfach darauf verwiesen wurde, daß die Untersuchung von Sputum vor allem für zentrale Plattenepithelkarzinome eine Rolle spielen könnte, während die peripher gelegenen Adenokarzinome nur schwer mit sputumzytologischen Methoden zu diagnostizieren waren (38). Die hier erhaltenen Ergebnisse stimmen auch nicht mit anderen Untersuchungen an bronchialen Spülflüssigkeiten überein, besonders was das Adenokarzinom betrifft, für welches keine schlechtere Diagnostizierbarkeit mittels der zytometrischen Untersuchung von Spülflüssigkeiten festgestellt werden konnte (141). Die Ergebnisse der Zytologie hinsichtlich der einzelnen Tumorarten waren ähnlich indifferent mit jeweils 93% für Adenokarzinome, 92% für Plattenepithelkarzinome und 98% für kleinzellige Karzinome. Bei den histologischen Untersuchungen zeigte sich eine geringere Sensitivität bei den Adenokarzinomen mit 86% im Gegensatz zu einer Sensitivität von 95% bei den Plattenepithelkarzinomen und den kleinzelligen Karzinomen. Dies ist wahrscheinlich am ehesten auf die periphere Lage (nur 64% waren bronchoskopisch sichtbar) der Adenokarzinome zurückzuführen, die damit für die histologische Probengewinnung eine größere Schwierigkeit ergeben. Da die Lage, aber auch die Beschaffenheit der Tumoren zum Teil sehr unterschiedlich sind, hätte man in dieser Hinsicht bei der Image-Zytometrie mit einem anderen Ergebnis gerechnet. Andere Studien an exfoliierten Zellen aus Sputumproben konnten in der Regel im Vergleich zum Adenokarzinom bessere Quoten für zentral wachsende Tumoren wie das Plattenepithelkarzinom und das kleinzellige Karzinom zeigen (29,95,135,141). In dieser Untersuchung scheint auf den ersten Blick keine Differenz der Untersuchungsqualität bei den einzelnen Tumorarten zu existieren, insbesondere scheint die Lage der Tumoren bei der zytometrischen Untersuchung einen nur geringen Einfluß - 89 - auf die Diagnosequalität zu haben. Man kann zusammenfassend sagen, daß sich aus der vorliegenden Studie keine Präferenzen der image-zytometrischen Untersuchung von Lungenspülflüssigkeiten für einzelne Tumorarten erkennen lassen. Sowohl zentral wachsende Tumoren wie kleinzellige Karzinome und Plattenepithelkarzinome, als auch peripher zu findende Karzinome, zeigen gute Ergebnisse bei der Untersuchung bronchialer Spülflüssigkeiten mittels der Image-Zytometrie. Dies ist sicherlich in nicht unerheblichem Maße auf die lokal durchgeführte Probeentnahme zurückzuführen, die auch die Kompartimente der Adenokarzinome erreicht. In Anbetracht der ansteigenden Rate der Adenokarzinome könnte sich dies zum Vorteil für die Image-Zytomertrie entwickeln. V.2.3. Vorbehandelte Patienten Bei den Patienten, die zum Follow-up nach Radio- oder Chemotherapie kamen, zeigten sich 62% der Rezidive und 32% der Vollremissionen als zytometrisch auffällig, wobei die Art der Therapie ebensowenig wie der Zeitpunkt des Therapieendes berücksichtigt wurden. Zytologisch wurden 59% der Rezidive und 15% der Vollremissionen für positiv beurteilt, während die Anzahl der histologischen Proben mit 10/12 tumor-positiven Rezidivproben und 3/14 tumor-positiv befundeten Vollremissionen nur eingeschränkt Aussagen zuläßt Es zeigt sich also ein Unterschied zwischen den Gruppen der Tumorremissionen und der Tumorrezidive, aus dem man folgern könnte, daß es günstig wäre, die Image-Zytometrie als wenig invasive Screening-Methode im Rahmen von Sputumuntersuchungen oder auch bronchialen Spülungen auch für das Follow-Up von Tumorpatienten heranzuziehen - 90 - V.2.4. Korrelation von zytometrischen Ergebnissen und Tumorlage Die Qualität der Tumordiagnose wurde in verschiedenen Studien in Relation zur Tumorlage gesetzt (28,29,95,114,141). In der Regel konnte gezeigt werden, daß periphere Tumoren den Probeentnahmen für zytologische Präparate, egal in welcher Form diese erfolgt, schwerer zugänglich sind als die zentralen Tumoren. Dies konnte Ng für Sputumproben zeigen, bei der Untersuchung derselben er für die peripheren Tumoren in 42% der Fälle eine positive Diagnose ermittelte, während zentrale Tumoren in 87% der Fälle entdeckt werden konnten. Zudem fand er eine Korrelation zwischen zytologischer Diagnostizierbarkeit und Tumorgröße (95). Pyrozinski ermittelte für bronchiale Spülungen eine Sensitivität von insgesamt 64,8% dabei zeigten seine Untersuchungen vor allem bei Adenokarzinomen gute Resultate (106). Sampedro und Cortese zeigten, daß radiologisch okkulte Karzinome in vielen Fällen mittels Sputumproben diagnostiziert werden können, wobei es sich in diesen Fällen in der Regel um zentral gelegene, langsam wachsende Plattenepithelkarzinome handelte, die therapeutisch noch kurativ angegangen werden konnten, was die 5-Jahresüberlebenszeit dieser Patienten auf 90% erhöhte (29,114). Im Hinblick auf spätere Sputumuntersuchungen wurde daher auch in dieser Studie versucht, eine Korrelation zwischen Tumorbeschaffenheit und den image-zytometrischen Ergebnissen zu finden. Dazu wurde das bronchoskopische Bild eingeteilt in solche Befunde, bei denen ein Tumoreinbruch in das Bronchialsystem vorlag (direkte Tumorzeichen) und solche, bei denen Verdacht auf ein submuköses Tumorwachstum bestand (indirekte Tumorzeichen). Zusätzlich gab es noch die Gruppe der bronchoskopisch unauffälligen Patienten, bei denen dennoch ein tumoröses Geschehen vorlag. Beim Vorliegen direkter Tumorzeichen konnte zytometrisch in 89% der Fälle ein tumor-positiver Befund gestellt werden, bei den indirekten Tumorzeichen waren es 92% der Fälle. Man hätte erwarten können, daß die Ergebnisse bei den direkten Tumorzeichen besser sind, da die Tumoren in solchen Fällen in das Bronchialsystem einwachsen und damit mehr Möglichkeiten für die Exfoliation von Tumorzellen im Rahmen bronchialer Spülungen bieten. Ein praktischer Schluß für den Einsatz der image-zytometrischen - 91 - Untersuchung von Spülflüssigkeiten bei einem bestimmten sich bronchoskopisch ergebenden Bild, läßt sich nur insofern ziehen, als daß man sagen kann, daß es sich in jedem Fall lohnt, eine bronchiale Spülung durchzuführen. Die guten Resultate in der Gruppe der bronchoskopisch unauffälligen Patienten, die also den peripheren nicht bronchoskopisch darstellbaren Tumoren entsprechen, mit einer Rate von 86% tumorsuspekten Befunden der Image-Zytometrie weisen jedoch darauf hin, daß sich eine Untersuchung von bronchialen Spülflüssigkeiten in solchen Fällen, in denen man mit keinem Tumorwachstum rechnet, auf jeden Fall lohnt. Man kann Patienten so zunächst invasivere Untersuchungen ersparen und dennoch ein diagnostisch wertvolles Resultat erhalten. Bei der Gegenüberstellung von bronchoskopischem Bild und Tumorart fällt auf, daß die kleinzelligen Karzinome in 91% der Fälle bronchoskopisch Tumorzeichen zeigten, darunter zählten 43% zu den direkten Tumorzeichen. Bei den Plattenepithelkarzinomen waren es 84% der Fälle, darunter 61% mit direkten Tumorzeichen und bei den Adenokarzinomen 64% mit 35% direkten Tumorzeichen. Hieraus hätte folgen müssen, daß die Plattenepithelkarzinome im Rahmen bronchialer Spülungen besonders gut exfoliierte Zellen liefern, dies ist jedoch nicht der Fall. Die kleinzelligen Karzinome zeigen sogar leicht bessere Resultate. Eine genaue Klärung dieses Verhalten kann jedoch nur im Rahmen neuer prospektiver Studien erfolgen, welche die Tumorausdehnung und -beschaffenheit mittels Computertomographie und Analyse der Resektionspräparate genau erfassen sollten und sie in Korrelation zur Zytometrie bringen sollten. Insgesamt brachte die image-zytometrische Untersuchung von Lungenspülflüssigkeiten weitaus bessere Ergebnisse hervor als diejenigen Studien, bei denen Spülflüssigkeiten manuell zytologisch beurteilt wurden, was für die objektive und quantitative Beurteilung von Zellkernen, wie sie mittels der Image-Zytometrie erfolgen kann, spricht (9,50,106). Viele Zellkernveränderungen sind mit dem bloßen Auge kaum wahrnehmbar, die Image-Zytometrie ist jedoch in der Lage, sie zu quantifizieren und damit auch feinere strukturelle Unterschiede aufzudecken. Es fand sich ein Zusammenhang zwischen Tumorlage und Detektionsrate insofern, als zentrale Tumoren zytometrisch besser zu diagnostizieren waren als periphere. Dennoch sprechen die guten Quoten bei den peripheren Tumoren für einen Einsatz der Image-Zytometrie vor allem auch in diesem Bereich. - 92 - V.2.5. Analyse der Kernstrukturparameter Frühere Studien zum DNA-Gehalt verschiedener Tumoren und zum Verhalten von Kernstrukturen im allgemeinen, wie die Untersuchungen von Sandritter, konnten ein vom Tumortyp abhängiges Verhalten der Kernstrukturen zeigen (115-117). In letzter Zeit schreibt man dies ursächlich tumor-typischen Veränderungen der chromosomalen Struktur zu (17). In unseren Untersuchungen interessierte vor allem die Frage, ob sich neben dem DNAGehalt und der Zellkerngröße weitere quantitativ zu messende strukturelle Unterschiede finden lassen, die eine Unterscheidung von normalen Zellen und Tumorzellen erlauben. Ferner waren wir daran interessiert, tumorspezifische Veränderungen zu ermitteln, so sie denn existieren. Bei der Analyse der Kernstrukturparameter wurden für diese Zwecke zunächst sogenannte Bigfiles gebildet, um einen optischen Überblick über das typische Bild der vom Zytometer erstellten Histogramme und Punktwolken bei den einzelnen Tumorarten und der Kontrollgruppe zu gewinnen. Hierbei sah man eine große Ähnlichkeit der jeweiligen Bigfile-Punktwolke zu den Punktwolken der Einzelpräparate, was eine gewisse Regelmäßigkeit der Verteilungen der Punktwolken, wie wir sie für die einzelnen Tumorarten angenommen haben, unterstreicht. Um dann aber auch eine quantitative Aussage zum Verhalten der Kernstrukturen zu ermöglichen, bestimmten wir aus diesen Bigfiles die Mittelwerte der einzelnen Kernstrukturparameter für normale epitheliale Zellkerne, suspekte Zellkerne (1,25<DNA-Index<2,5) und maligne Zellkerne (DNA-Index>2,5) und normierten diese durch Quotientenbildung auf die entsprechenden Werte der normalen epithelialen Zellkerne aus der Kontrollgruppe, um vergleichbare Werte für die einzelnen Features zu erhalten. Bei der Kontrollgruppe normierten wir sämtliche Zellgruppen also auch die des lymphatischen Gewebes auf die normalen epithelialen Zellkerne. Hierbei sah man eine sehr weit gestreute Verteilung der Werte der Granulozyten sowie der Kondensatmakrophagen um die Normwerte. Die Streuung war sogar weitaus größer als die, der in der Kontrollgruppe einzeln gefundenen, suspekten Zellkerne. Dies ist zum einen mit der sehr typischen Struktur der Granulozyten zu erklären, die mit ihren gelappten Kernen nicht den Kernstrukturen der normalen epithelialen Zellkerne entsprechen, zum anderen im Fall der Kondensatmakrophagen - 93 - durch ihre ohnehin großen Kerne, aber auch durch unspezifische Anfärbungen des Zytoplasmas, welche das Zytometer nicht von Kernstrukturen unterscheiden kann. Ein Vergleich dieser Zellgruppen für die verschiedenen Tumorgruppen wäre vielleicht basierend auf der Theorie der „malignancy associated changes“ zu rechtfertigen. Dies hielten wir aber in dieser Studie für nicht angebracht, da es primär relevant erschien, maligne Zellkernstrukturen aus Tumorgewebe gegenüber Zellkernstrukturen aus gesundem Gewebe zu differenzieren. Daher wurden in den Tumorgruppen jeweils nur die als normal klassifizierten Zellkerne sowie die suspekten und malignen Zellkerne im Vergleich betrachtet. Schon in den Darstellungen der Quotienten aus den einzelnen Tumor-Bigfiles ließ sich ein immer wiederkehrendes Bild der Punktlinien erkennen. Es fanden sich Abweichungen der Quotienten der Mittelwerte von den ermittelten Normwerten bei den gleichen Kernstrukturparametern. Nur der Bigfile der kleinzelligen Karzinome zeigte leichte Unterschiede zu den anderen Tumorarten in den Parametern, die die Zellkerngröße (area und maximaler Radius) beschreiben und in den Parametern der Streckenlängeneigenschaften (long-run, gray-level). Diese Unterschiede scheinen beim Übergang von suspekten zu malignen Zellkernen geringer zu werden. Die Zusammenstellung der Quotienten der Mittelwerte von normalen, suspekten und malignen Zellkernen für alle Tumortypen zeigte ein sehr ähnliches Bild der Punktlinien für die jeweiligen Zellkerne relativ unabhängig vom Tumortyp. Der Verlauf der drei Punktlinien für die einzelnen Karzinome fiel von den suspekten zu den malignen Kernen immer mehr zusammen, es zeigte sich für die drei ein sehr ähnliches Verhalten der Kernstrukturparameter. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, daß entartetes Gewebe keine typische Tumorcharakterisierung mehr zeigt, sondern sich nach eigenen Regeln differenziert. Inwieweit sich dennoch tumor-spezifische Kernstrukturen finden lassen, bleibt genaueren nachfolgenden genaueren Untersuchungen vorbehalten. - 94 - Für eine allgemeine Differenzierung von Tumor- und gesundem Gewebe scheinen neben dem DNA-Gehalt und der Zellkerngröße in Form des Parameters area, folgende Kernstrukturparameter eine Rolle spielen zu können: In den Parametern var-radius, gray0/45/90/135-level, med-density-object, high-DNA-compactness, high-density-object, run-length90/135, size-texture-orientation, freq-low-fft und cluster-shade ergeben sich sowohl bei suspekten, als auch bei malignen Zellkernen positive Abweichungen von normalen epithelialen Zellkernen. Die Gruppe um McAulay konnte ähnliche Ergebnisse für die Parameter fractal1/2-area und area mit demselben Gerät bei der Untersuchung von zunehmenden Dysplasien bei Cervixabstrichen zeigen (56). Weiter fand man in diesen Untersuchungen einen mit dem Grad der Dysplasie zunehmenden Anstieg der Kernstrukturparameter low-density-object, low-DNA-amount und med-DNA- compactness. Man muß allerdings beachten, daß es sich hierbei lediglich um Dysplasien und nicht um manifeste Karzinome handelte. Für die harmonischen Ableitungen aus den Fourier Transformationen, darunter besonders die Ableitungen 14/15/16/17/19/20/21/22/23/26 sowie die Parameter low-DNA-area, contrast, freq-high-fft, mean-intensity, med-DNA-area, high-center-mass und med-DNAamount ergaben sich in der hier vorliegenden Studie im Vergleich mit normalen epithelialen Zellkernen negative Abweichungen. Hier decken sich die Ergebnisse bei der Gegenüberstellung mit McAulays Untersuchungen an Dysplasien nur für den Kernparameter med-DNA-amount. Weitere negative Abweichungen aus diesen Studien waren für die Parameter med-density-object, med-DNA-amount; low-DNA-compactness und range_extreme gefunden worden, konnten aber nicht in der vorliegenden Untersuchung der bronchialen Spülflüssigkeiten bestätigt werden (56). Insgesamt beschreiben alle Kernstrukturparameter mathematisch eine unregelmäßige, inhomogene Verteilung der DNA, welche für Tumorzellen im allgemeinen schon lange bekannt ist. Im entferntesten entsprechen sie den schon von Nieburgs formulierten Kriterien der Malignität, fassen diese nur in Zahlenwerte (96,97). Durch die Umwandlung der subjektiv gefundenen Kriterien in mathematische Funktionen, wie es bei den hier bestimmten Kernstrukturelemente im Laufe der Entwicklung des CytoSavants® geschehen ist, ist es gelungen, Kernstrukturveränderungen vergleichbar zu machen. - 95 - In weiteren Studien könnte versucht werden, für die am besten differenzierenden Parameter ähnliche Grenzwerte zu finden, wie sie bereits für den DNA-Gehalt bestehen. In Studien mit demselben Gerät an Zervixabstrichen konnte gezeigt werden, daß alleine die Parameter IOD und area, sowie die aus ihnen abgeleiteten Parameter der fractal_area schon in der Lage sind 95,8% der Zervixpräparate hinsichtlich ihrer Dignität richtig zu klassifizieren, wobei die fractal_dimension den geringsten Variationskoeffizient zeigte (73). Es besteht jedoch noch ein großer Forschungsbedarf hinsichtlich der Bedeutung der anderen Parameter sowie der statistischen Relevanz der Unterschiede der Kernstrukturparameter und ihrer Bedeutung zur Differenzierung zwischen den einzelnen Tumorarten, hervorzuheben wäre hier vor allem die Unterscheidung zwischen Adeno/Plattenepithelkarzinomen und kleinzelligen Karzinomen, für die es einige Hinweise aus dieser Studie zu geben scheint. Andererseits sollte untersucht werden, inwieweit sich solche tumor-spezifischen Unterschiede bei fortschreitender Entdifferenzierung nicht aufheben. Dazu müßten Nachuntersuchungen an Präparaten mit eindeutig bestimmtem Differenzierungsgrad durchgeführt werden. - 96 - V.3. Einsatz der Image-Zytometrie Die Entwicklungen der letzten Jahre haben die Image-Zytometrie zu einer Methode gemacht, die einen diagnostischen Einsatz interessant werden läßt. In welcher Form sich dieser Einsatz ergibt, muß jedoch noch diskutiert werden. Bei der Untersuchung von Zervixabstrichen scheint sich ihr Einsatz bei der Diagnosestellung in vielerlei Hinsicht zu bewähren. Sie kann bei diesen Untersuchungen dazu beitragen, die subjektiv gefällten diagnostischen Schlüsse, die stark von der Erfahrung des Untersuchers abhängen, zu objektiveren und damit ein standardisiertes Ergebnis liefern, welches zudem auch noch jederzeit reproduzierbar ist (14). McAulay zeigte, daß mittels der Image-Zytometrie sogar eine sichere Vorauswahl der zu untersuchenden Präparate getroffen werden kann, so daß nur die durch sie als suspekt eingestuften Präparate manuell nach untersucht werden müssen (2). Dies könnte eine erhebliche Arbeitserleichterung darstellen, was dazu führen könnte, ScreeningUntersuchungen kostengünstiger zu gestalten, ohne dabei einen Verlust an diagnostischer Sicherheit zu haben. Wenn es gelänge, den Einsatzbereich der Image-Zytometrie zu vergrößern, ergäbe sich damit eine völlig neue Situation in der allgemeinen Krebsvorsorge. Tumoren könnten früher entdeckt werden und damit in frühen Stadien auch noch mit Erfolg kurativ therapiert werden. Davon ist die Realität jedoch aus vielen Gründen noch weit entfernt: Zum einen sind bei den bisher durchgeführten Untersuchungen, wie der Analyse von Zervixabstrichen, die Präparate sehr leicht zu gewinnen, was auf die gute Zugänglichkeit der Tumoren in diesem Bereich zurückzuführen ist. Gynäkologische Vorsorgeuntersuchungen sind sehr wenig invasiv und daher sowohl für Patient als auch Arzt leicht durchzuführen. Dies gilt leider jedoch nicht für alle Krebsarten, insbesondere nicht für die Lungentumoren. Das Tumorgebiet sollte idealerweise ohne technische Hilfsmittel und vor allem ohne den Patienten dabei unter Narkose setzen zu müssen, erreicht werden können. Zum anderen muß die diagnostische Effizienz der Image-Zytometrie zur Zeit noch verbessert werden. Es gibt noch zu viele falsch-positive und -negative Befunde, als daß man sich bei einer so wichtigen Fragestellung wie der Tumordiagnose, auf sie alleine - 97 - verlassen könnte. Dennoch sind in vielen Fachgebieten Untersuchungen mit imagezytometrischen Methoden durchgeführt geworden (1,23,26,51,87,118,126,144), ohne dabei jedoch die Image-Zytometrie zu einem Standardverfahren werden zu lassen: Beispiele wären die Untersuchung von Blasenspülungen oder Urin und Speichel oder Sputum, welche zum Teil sehr unterschiedliche Ergebnisse hervorbringen (10,51,52,126). Sogar Abstriche von Hauttumoren wurden von Böcking erfolgreich mit imagezytometrischen Untersuchungen analysiert (12). Dabei wurden jedoch in der Regel keine automatisierten Formen der Image-Zytometrie angewandt, wie in dieser Studie, die Image-Zytometrie wurde vielmehr dazu genutzt, objektivere Resultate bei der Beurteilung von zytologischen Proben zu erhalten. Eine automatisierte Form der ImageZytometrie, soweit sie verläßlich selektioniert, erlaubt aber auch eine Vorauswahl von Präparaten und reduziert die durch einen Untersucher nach zu beurteilenden Präparate in ihrer Anzahl (2,72). Damit könnten Screening-Untersuchungen auf Krebs ermöglicht werden. Man muß dabei berücksichtigen, daß ein Einsatz der Image-Zytometrie als Screening-Methode gegenüber histologischen und zytologischen Proben nur dort sinnvoll ist, wo Softwareprogramme, wie der automatisierte Zell-Classifier des CytoSavants®(TANC) für das jeweilige Gewebe vorhanden sind und mit ihrer Hilfe die Untersuchung von großen Probenkollektiven möglich ist. Die Entwicklung solcher Programme basiert jedoch auf der Erforschung von sich bei malignen Prozessen verändernden Kernstrukturen. Ein erster Schritt wäre also die Analyse eben dieser, unter zu Hilfenahme image-zytometrischer Methoden in verschiedenen Geweben. In einem nächsten Schritt könnten die so gewonnen Erkenntnisse dann als Basis für weitere Zellklassifizierungsprogramme dienen. Ein über die Ergänzung der Standardverfahren hinausgehender Einsatz der Image-Zytometrie wäre denkbar. Die Leistungsfähigkeit der Methode müßte an gleichwertigem Material, wie z.B. Tupfpräparaten nochmals überprüft werden. Bis jetzt ist die automatisierte Image-Zytometrie bronchialer Spülflüssigkeiten, diagnostisch nicht ganz so sicher wie die etablierten Methoden, bietet sich jedoch als sinnvolle Ergänzung vor allem bei der Diagnose peripherer Lungentumoren an. Nicht nur in der Tumordiagnose, sondern auch in der Beurteilung der Prognose des Patienten haben sich Messungen des DNA-Gehaltes bewährt (1,53,113). Auch hier bietet sich für das in dieser Studie genutzte Gerät ein weiterer Einsatzbereich. - 98 - V. Zusammenfassung Die vorliegende Untersuchung sollte die automatisierte Image-Zytometrie durch die Analyse von 569 bronchialen Spülflüssigkeiten im Vergleich mit histologischen und zytologischen Methoden evaluieren und Aufschluß über diskriminierende Kernstrukturparameter bei Tumoren geben. Die für das hier verwandte automatisierte System der Image-Zytometrie, den CytoSavant®, ermittelte Sensitivität von 85% sowie die Spezifität von 87% sprechen für den Einsatz dieses automatisierten Verfahrens als wenig invasive, diagnostische Ergänzung zu den etablierten Methoden. Schwachstellen dieser Methode sind bei entzündlich und inhalativ belastetem Gewebe in Form von falsch positiven Befunden bzw. als Folge zum Teil materialarmer bronchialer Spülflüssigkeiten als falsch negative Ergebnisse zu finden. Es konnte kein signifikanter Unterschied der Diagnosequalität bei den verschiedenen morphologischen Tumorarten festgestellt werden. Die Image-Zytometrie zeigte sich nicht nur für zentrale Tumoren mit einer Sensitivität von 89% bei den direkten Tumorzeichen und 92% bei den indirekten Tumorzeichen sehr effektiv, auch periphere Tumoren wie die Adenokarzinome konnten mit einer Sensitivität von 86% diagnostiziert werden. Die Betrachtung der Gruppe der therapierten Tumoren zeigte, daß sich im Follow-Up von therapierten Tumorpatienten ein weiterer Einsatzbereich der Image-Zytometrie ergeben könnte. Die Kernstrukturanalyse der verschiedenen Tumoren zeigte neben schon bekannten malignitäts-typischen Parametern, weitere tumor-typische Veränderungen der Kernstruktur, welche jedoch bei dem Vergleich maligner Zellkerne aus verschiedenen Tumorgruppen ein in sich sehr homogenes Bild ergaben. Eine Tumorartdiagnostik ist damit mit der automatisierten Image-Zytometrie zu Zeit noch nicht möglich. Die Untersuchung von Lungenspülflüssigkeiten mit der automatisierten ImageZytometrie kann in der Diagnostik manifester Tumoren bei bestehendem Tumorverdacht als wenig invasive Ergänzung zu den etablierten Methoden gesehen werden. Sie eignet sich vor allem als diagnostische Ergänzung bei peripher gelegenen Tumoren. In Zukunft könnte ihre Weiterentwicklung ein generelles Screening auf Lungentumoren mit Hilfe der in dieser Studie für maligne Prozesse gefundenen Zellkernstrukturparameter unter Verwendung von Sputumproben ermöglichen. - 99 - Literaturverzeichniss 1) Abdel-Salam M., Mayall B.H., Chew K., Silvermann S., Greenspan J.S.: Prediction of malignant transformation in oral epithelial lesions by image cytometry, Cancer, 62 (1988): 1981-1987 2) Anderson G., MacAulay C., Matricic J., Garner D., Palcic B.: The use of an automated image cytometer for screening and quantitative assessment of cervical lesions in the British Columbia Cervical Smear Screening Programme, Cytopathology, 8 (1997): 298-312 3) American Thoracic Society: Pretreatment evaluation of non-small cell lung cancer, American Journal of Respiratory and Critical Care Medcine,156 (1997): 320-332 4) Athanassiadou P., Psyhoyou H., Kyrkou K., Athanassiades P., Moulopoulos S.: Expression of keratins and carcinoembryonic antigen in bronchial squamous metaplasia and lung carcinoma, Acta Cytologica, 39-6 (1995): 1161-1166 5) Auffermann W., Böcking A.: Early detection of precancerous lesions in dysplasias of the lung by rapid DNA image cytometry, Analytical and Quantitative Cytology and Histology, 7-3 (1985): 218-226 6) Auer G., Askensteien U., Ahrens O.: Cytophotometry, Human Pathology, 20-6 (1989): 518-527 7) Bartels H., Bibbo M., Hutchinson M.L.: Computerized screening devices and performance assessments: Development of a policy towards automation, Acta Cytologica, 42-1 (1998): 59-68 8) Becker N., Wahrendorf J.: Kapitel 9: Lunge : 306-336 Krebsatlas der BRD 1981-1990, 3.Auflage (1994), Springer Verlag, Berlin 9) Bedrossian C.W.M., Rybak D.L.: Bronchial brushing during fiberoptic bronchoscopy for the cytodiagnosis of lung cancer: Comparison with sputum and bronchial washing, Acta Cytologica, 20-5 (1976): 446-453 - 100 - 10) Blöndal T., Bengstson A.: Diagnostic application of nuclear DNA measurement on bronchial secretions, Analytical and Quantitative Cytology, 4-4 (1982): 269-274 11) Böcking A., Giroud F., Reith A.: Consensus report of the ESCAP task force on standardization of diagnostic DNA image cytometry, Analytical Cellular Pathology, 8 (1995): 67-74 12) Böcking A., Schunk K., Auffermann W.: Exfoliative-cytologic diagnosis of basal-cell carcinoma with the use of DNA image cytometry as a diagnostic aid, Acta Cytologica, 31-2 (1987): 143-149 13) Böcking A., Adler C.P., Common H.H., Hilgarth M., Gransen B., Auffermann W.: Algorithm for a DNA-cytophotometric diagnosis and grading of malignancy, Analytical and Quantitative Cytology, 6-1 (1984): 1-8 14) Böcking A., Chatelain R.: Diagnostic and prognostic value of DNA cytometry in gynecologic cytology, Analytical and Quantitative Cytology and Histology, 11-3 (1989): 177-186 15) Böcking A., Hilgarth M., Auffermann W., Hack C., Werdier D., Fischer-Becker D., v.Kalkreut G.: DNA-cytometric diagnosis of prospective malignancy in borderline lesions of the uterine cervix, Acta Cytologica, 30-6 (1986): 608-615 16) Böcking A.: Abklärung plattenepithelialer Dysplasien mittels DNA-Bildzytometrie, Deutsches Ärzteblatt, 95-12 (1998): 658-662 17) Böcking A.: DNA-Measurement-when and why ?, Compendium on quality assurance, proficiency testing and workload limitations Clinical Cytology (1995): 170-183 18) Böhm N., Sandritter W.: Der Zellkern DNS-Gehalt menschlicher Tumoren, Medizinische Welt, Fortbildung 27-22 (1976): 1073-1076 19) Böhm. 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114 - 153) Zbieranowski I., Demianiuk C., Bell V., Knape W.A., Murray D.: Detection of false DNA aneuploidy and false DNA multiploidy in flow cytometric DNA analysis, Analytical Cellular Pathology, 5 (1993): 69-84 - 115 - Danksagung Ich möchte mich ganz herzlich bei meinem Doktorvater Herrn Privatdozent Dr. Marek sowie Herrn Prof. Dr. Nakhosteen, Direktor der Klinik für Pneumologie der AugustaKranken-Anstalt, Bochum, für die Überlassung des Themas sowie die intensive Betreuung bei der Erstellung der Arbeit bedanken. Ganz besonders möchte ich auch Frau Dr. Khanavkar und Herrn Dr. Muti, Oberärzte der Klinik für Pneumologie, für ihre klinische Hilfestellung bei der Arbeit danken. Ebenso allen anderen Mitarbeitern der Klinik für Pneumologie, die mich sehr warm und freundlich aufnahmen. Mein Dank gilt auch Herrn Prof. Dr. Müller für die vielen fachlichen Tips sowie die Mikrofotogramme der histologischen Präparate. - 116 - Lebenslauf Name : Silke Krampe Geburtsdatum /-ort: 2.Oktober 1973 in Recklinghausen Eltern : Willi Krampe, Architekt BdA Schulausbildung: 1979-1983 1983-1992 1992 Grundschule zum Neuling, Bochum-Weitmar Schiller-Gymnasium, Bochum Abitur Studium: 1992-1994 Studium der Wirtschaftswissenschaften an der Ruhr-Universität Bochum, Abschluß: Vordiplom Studium der Humanmedizin an der Ruhr-Universität Bochum Physikum (Note 1,6) 1.Staatsexamen (Note 2,0) 2.Staatsexamen (Note 2,0) 3.Staatsexamen (Note 1,0) 1994-2000 8/1996 8/1997 8/1999 11/2000 Praktisches Jahr: 10/99-02/00 - Christel Krampe, Kauffrau 1.Tertial : Gynäkologie&Geburtshilfe Universitätsklinik Marienhospital, Herne 2.Tertial : Innere Medizin Universitätsklinik Marienhospital, Herne 3.Tertial : Chirurgie Hôpital St.Roch, Université SophiaAntipolis, Nizza, Frankreich 02/00-05/00 05/00-09/00 Auslandsaufenthalte: 7/1992 - 9/1992 Kaufmännisches Praktikum in der Firma Philips Medical Systems, Crawley, England 7/1995 – 9/1995 Pflegepraktikum in der Herz- und ThoraxChirurgie des Hôpital Pitié- Salpétrière, Paris 6/1998–7/1998 Famulatur in der Gynäkologie „St.Michael`s Hospital“, Toronto, Kanada 8/1998–9/1998 Famulatur in der Pädiatrie, „Hospital for Sick Children“, Toronto, Kanada Außeruniversitäre Aktivitäten : 1994 seit1989 Aushilfspflegekraft in der Ophthalmologie der Universitätsklinik Bochum-Langendreer Mitgliedschaft Leo-Club Bochum-Ruhr: Sekretärin (1990), Activity Master (1991), Vize-Präsidentin (1993), Präsidentin (1994) - 117 -
