Analyse von klinischen Biomarkern durch LC-MALDI

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MET H ODE N & AN WE N DU NGEN
Biomarker
Analyse von klinischen Biomarkern durch
LC-MALDI basierte Top-Down Proteomics
SVEN BRAND, MARKUS MEYER, RALF KETTERLINUS UND DETLEV SUCKAU
BRUKER DALTONIK GMBH, BREMEN
Das Auffinden von neuen Biomarkern in der klinischen Proteomik befindet sich im Spannungsfeld zweier Versuchsansätze, die bei ihrer Kombination maximalen Erfolg bieten können: Erstens, das Hochdurchsatzscreening klinischer Proben wie Serum, Plasma, Zell Lysate oder Urin mit
dem Ziel eine statistisch ausreichende Probenanzahl zu untersuchen, die
mit der Detektion signifikanter Markerkandidaten abschließt. Zweitens,
tiefergehende Analysetechniken zielen darauf ab möglichst viele Proteine
aus wenigen biologischen Proben zu identifizieren.
Das richtige Werkzeug ist der Schlüssel zum Erfolg
Das Ziel der vorliegenden Machbarkeitsstudie war es, mit Hilfe neuester technologischer
Entwicklungen die effektive Kombination beider Ansätze zu evaluieren: Screening und
Charakterisierung von Biomarkerkandidaten
in komplexen Proteomen.
Wir stellen im Folgenden eine Kombination von Techniken vor, die sowohl eine hohe
Trennleistung, als auch eine reproduzierbare,
automatisierbare und rasche Analyse von
intakten Peptiden bzw. Proteinen aus komplexen Proben ermöglicht. Im Gegensatz zur
„Bottom-Up“ Analytik bei der zunächst das
Proteingemisch mit Trypsin in kleine Peptide
verdaut wird, bietet der hier verwendete „TopDown“ Ansatz, der auf einen derartigen proteolytischen Schritt bewusst verzichtet, Informationen über intakte Peptid/Proteinmassen
˚ Abb. 1: LC-MALDI Profil (SurveyView) einer WCX Serum Fraktion. Im Extracted Ion Chromatogram (rechts) ist deutlich die Auftrennung von Komponenten gleicher Masse zu erkennen.
zur Klärung biologischer Zusammenhänge.
Dabei kann es sich z. B. um Degradationsprodukte, proteolytische Prozessierung oder
posttranslationale Modifikationen handeln,
die bei der Biomarkercharakterisierung eine
wichtige Rolle spielen und die nur mit dem
Top-Down Verfahren unterschieden werden
können.
Screening: Hochsensitives ProteomProfiling
In einem ersten Schritt werden typische Proben wie z. B. Serum oder Plasma mit Hilfe
der etablierten CLINPROT™ Beads vorfraktioniert[1, 2]. Hier werden funktionalisierte
magnetische Nanopartikel wie z. B. Anionenoder Kationenaustauscher, IMAC oder hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC)
automatisiert und reproduzierbar eingesetzt.
Durch HPLC Separation der vorfraktionierten Proben werden Proteomprofile
erzeugt, welche auch die Detektion von niedriger-abundanten Proteinen und Peptiden
erlauben als dies ohne LC Separation möglich wäre. Zudem können durch die chromatographische Dimension Komponenten mit
identischer oder sehr ähnlicher Masse unterschieden werden.
Neben der Vorfraktionierung ist auch die
LC-MALDI Fraktionierung[3] vollständig automatisiert: Ein Fraktionensammler setzt Fraktionen des HPLC-Eluats präzise auf einem
MALDI Probenträger für die anschließende
Messung im autoflex MALDI-TOF Massenspektrometer ab. Dabei kommt ein neu entwickelter MALDI Probenträger zum Einsatz:
Der Prespotted AnchorChip™ (PAC) bietet
neben vor-gespotteten Kalibrationspunkten
fertig gespottete Matrixpositionen für den
MALDI-Prozess. Dies garantiert ein hohes
Maß an Reproduzierbarkeit, da Klimaeinflüsse auf die MALDI Probenpräparation ausgeschlossen werden, vermeidet jegliche Art
von Memory Effekt und ist zudem mit den
gespotteten Proben archivierbar – also ideal
zur späteren Nachmessung geeignet.
Nach der Aufnahme von linearen Massenspektren (bis ca. 15.000 Da) werden die Daten
zunächst in der WARP-LC™ Software visuaBIOspektrum | 07.06 | 12. Jahrgang
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˚ Abb. 2: Hauptkomponenten Analyse (PCA) multipler LC-MALDI Profile zur Differenzierung von Markergruppen und Detektion der dafür zuständigen Komponenten.
lisiert. Der hier zum Einsatz kommende
„SurveyViewer“ erlaubt die übersichtliche Begutachtung von kompletten chromatographischen MS Peak-Mustern
zusammen mit dem selektierten MS
Spektrum einer einzelnen Fraktion einerseits und dem EIC (Extracted Ion Chromatogram) einer selektierten Masse
andererseits.
Nach Übergabe vieler derartiger LCMALDI Datensätze von Kontroll und beispielsweise Patientenproben an die ProfileAnalysis™ Software werden Hauptkomponenten Analysen (PCA: Principal
Components Analysis) durchgeführt, um
jene Komponenten der Spektren zu
detektieren, welche zur Unterscheidbarkeit der Gruppen beitragen.
ID: Identifizierung von MarkerKandidaten
Die kombinierte Reduktion der Probenkomplexität mittels Vorfraktionierung
durch Magnetische Partikel und HPLC
Separation ermöglicht nun den Zugang
zur Identifizierung von Biomarkern im
TOF/TOF Modus des autoflex. Da die ProBIOspektrum | 07.06 | 12. Jahrgang
ben sich bereits von der ersten Messung
auf dem MALDI-Probenträger befinden,
kann hier ohne weitere Probenpräparation und ohne Wiederholung der LC-Auftrennung eine MS/MS Analyse zur Marker-Identifizierung erfolgen.
Sollte das Peptid zu groß sein, kann
direkt auf dem Probenträger ein TrypsinVerdau durchgeführt und daraufhin eine
MS und MS/MS Identifizierung durchgeführt werden.
Das Experiment
Zum Nachweis der prinzipiellen Leistungsfähigkeit des Systems wurden
humane Seren mit geringen Mengen von
Peptiden versetzt, die vom System als
Marker im Vergleich zur nicht-gespikten
Kontrollgruppe zu detektieren waren.
Nach Marker-Detektion sollten diese Peptide direkt identifiziert werden.
Eingesetzt wurden: 25 fmol ACTH [117], 50 fmol ACTH [18–39] und 75 fmol
ACTH [7-3] (finale Menge auf der Säule).
Es wurden je 20 Seren dieser Marker
Gruppe und 20 Seren einer ungespikten
Kontrollgruppe verwendet.
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erkennung herangezogen werden können, ist
mitunter die MS/MS Analyse von nur sehr
wenigen Peptiden aus einzelnen archivierten
LC Trennungen völlig ausreichend, um die
relevanten Markerkandidaten zu identifizieren. Auch ist in diesem Ansatz die vorherige
Identifizierung nicht die Grundlage für die
Eignung eines Peptids als Biomarker.
Die LC-MALDI Top-Down Analyse ist somit
auf dem besten Weg ein Standard in der klinischen Proteomik zu werden.
Literatur
˚ Abb. 3: Direkte Identifizierung der detektierten Marker auf achivierten PAC Targets mittels
MALDI-TOF/TOF.
Proben-Vorfraktionierung und HPLC
Separation
Serumproben (5 μl) wurden zunächst mit Hilfe von funktionalisierten magnetischen Partikeln (MB-WCX Kit, Bruker Daltonik) fraktioniert. Durch Wahl der entsprechenden
Funktionalität der magnetischen Partikel ließ
sich das Startmaterial und damit das Subproteom für die spätere Analyse weiter variieren.
Die anschließende Separation der Eluate
erfolgte auf einem CapLC System (Agilent
1200, 2 μl/min) mit einem 20 min Gradienten
(5–45 % Acetonitril). Dabei wurde eine monolithische Säule (Dionex, PS-DVB, 200 μm iD)
verwendet. Fraktionen des LC-Laufs wurden
alle 16 sec auf PAC Probenträger aufgetragen.
MALDI-MS und Datenauswertung
Für die Datenaufnahme wurde ein autoflex
III smartbeam™ MALDI-TOF/TOF Massenspektrometer mit 200 Hz Laserfrequenz im
Linearmodus (m/z 1000–12000) eingesetzt.
Dabei konnten im Profil jeder Probe ca. 1700
unterschiedliche Komponenten detektiert
werden (Abb. 1), eine Trennleistung vergleichbar der 2D Gelelektrophorese.
Die Profile wurden anschließend mit Hilfe
unüberwachter multivariater Verfahren (PCA)
ausgewertet (Abb. 2). Dabei ergab sich eine
eindeutige Unterscheidung in die gespikte
und die ungespikte Gruppe. Zudem wurden
die entsprechenden gespikten Substanzen als
die Komponenten detektiert, die für die Differenzierung verantwortlich sind. Diese Peptide konnten abschließend direkt mit MS/MS
auf den archivierten PAC Targets eindeutig
identifiziert werden, eine Wiederholung der
LC war nicht notwendig (Abb. 3).
[1] Ketterlinus et al. (2005): Fishing for biomarkers: analyzing mass spectrometry data with the new ClinProTools™
software. BioTechniques 38: S37–S40,
[2] Elssner et al., Probenaufbereitung für MALDI-TOF MS mit
Hilfe von magnetischen Mikropartikeln. BIOspektrum 3/05
[3] Brand et al., Protein profiling and identification in complex biological samples using LC-MALDI. DrugPlus international; September 2005
1
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3
Korrespondenzadresse:
Sven Brand1
Markus Meyer2
Detlev Suckau3
Bruker Daltonik GmbH
Fahrenheitstraße 4
D-28359 Bremen
Tel.: 0421-22050
[email protected]
www.bdal.de
Fazit: LC-MALDI verkleinert die Lücke
zwischen Screening und Identifikation von Biomarkern
Die LC-MALDI Analyse von vorfraktionierten
Seren erlaubt die Detektion auch von vielen
Peptiden/kleinen Proteinen in komplexen Proben. Durch die chromatographische Dimension kann zwischen Komponenten mit identischer oder sehr ähnlicher Masse unterschieden werden. Die Top-Down Analyse liefert zudem den für die Biomarkersuche essenziellen Zugang zur intakten Peptid/Proteinmasse und gewährt damit auch Zugang zu
Informationen über mögliche Degradationsprodukte (Apoptose) und posttranslationale
Modifikationen wie z. B. Proteinglycosylierung.
Mit Hilfe der speziellen PAC MALDI Probenträgern können LC-Profile monatelang
archiviert werden – die Identifizierung eines
Markers ist somit zeitlich unkritisch und
erfordert keine neue LC Separation. Bei kleineren Komponenten (< 4,5 kDa) kann die
Identifizierung direkt durch MS/MS erfolgen,
während größere Komponenten direkt auf
dem PAC-target – in situ – tryptisch verdaut
werden.
Das vorgestellte System ermöglicht so einen
non-redundanten Zugang zur Identifizierung
von Biomarker-Kandidaten. Während selbst
hunderte von Profilen mit vielen Tausenden
von Komponenten statistisch zur Biomarker-
BIOspektrum | 07.06 | 12. Jahrgang