Keimidentifizierung mit dem VITEK MS im pharmazeutischen Umfeld

Mikrobiologie in der Pharmaindustrie
Kassel
Keimidentifizierung mit dem VITEK MS im
pharmazeutischen Umfeld –
Erfahrungen eines Dienstleistungslabors
Frank Kugler
Labor L+S AG
DAS LABOR, DAS MITDENKT
Bad Bocklet | Germany | [email protected] | +49 (0)97 08/91 00-340 | www.Labor-LS.de
25.04.2017
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Seit der Ausbildung 1983 bei der Labor L+S AG beschäftigt.
Referentenvorstellung
Mitglied der Operativen Geschäftsleitung und Leiter des
Geschäftsfeldes „Mikrobiologische Dienstleistungen:
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Keimidentifizierung
Stammhaltung
Betriebshygiene
Nährmedienherstellung und –prüfung
Molekularbiologie
Desinfektionsmittelprüfung
Sonderprüfungen
Probenmanagement
Zusätzlich Ausbilder und Sicherheitsfachkraft.
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Kennzahlen der Identifizierung bei L+S
•
Durchschnittl. 200 Identifizierungen pro Tag/11 Mitarbeiter
•
Identifizierung von Bakterien, Hefen und Schimmelpilzen
•
Identifizierungssysteme:
VITEK® MS
VITEK® 2 compact und API/ATB
MicroSEQ®
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Keimidentifizierung mit dem VITEK MS im
pharmazeutischen Umfeld
Inhalte
VITEK MS
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•
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Methode
Durchführung
Ergebnisdarstellung
Erfahrungen eines Dienstleistungslabors
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•
•
Studie mit Hygienemonitoring-Keimen
Ergebnisse
Vor- und Nachteile
Datenbank-Update V3.1
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Einleitung
Herausforderungen der Keimidentifizierung in einem
Dienstleistungslabor für die pharmazeutische Industrie
 Schnelle, zuverlässige Ergebnisse (→ freigaberelevante Prozesse)
 Umweltisolate
 Gesetzliche Anforderungen an computergestützte Systeme
(→ CFR 21 part 11)
 Ressourcen schonen (Umweltmanagement)
 Kosten
 Speziell für L+S: hohes Probenaufkommen
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Einleitung
Die MALDI TOF Massenspektrometrie hält seit mehreren Jahren
Einzug in die Keimidentifizierung für die pharmazeutischen Industrie
und ist mittlerweile aus der Laborroutine nicht mehr wegzudenken
(seit 2011 in der Laborroutine bei L+S eingesetzt  SARAMIS;
2013: Einführung der Myla-Software;
seit 2015 Einsatz im kompletten GMP-Bereich).
• Wie steht es aktuell um die MALDI TOF Methode (VITEK MS)?
• Kann sie mit den traditionellen Identifizierungssystemen mithalten
oder diese gar ersetzen?
• Wo liegen die Stärken und Schwächen des Systems?
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Wofür steht MALDI TOF MS?
Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation
Matrix unterstützte Laser Desorption/Ionisation
Time Of Flight Mass Spectrometry
Flugzeit Massenspektrometrie
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Woraus besteht das VITEK MS-System?
• Massenspektrometer
• Software-Programme
 Eingabe der Probeninformation
 Steuerung des Gerätes
 Auswertung, Datenbank
Quelle: bioMerieux
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Prinzip der Methode
• Bei MALDI ionisiert man den Analyten mittels
Laserbeschuss über eine Matrix, in welche die
eigentlichen Analyten eingebettet sind.
Dazu wird der zu untersuchende Analyt und die Matrix
auf einem metallischen Träger cokristallisiert.
• Durch Laserbeschuss verdampft die Matrix
explosionsartig und die zu untersuchenden AnalytMoleküle werden mitgerissen.
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Prinzip der Methode
• Dabei findet üblicherweise gleichzeitig eine Ionisierung
des Analyten statt. Die entstandenen Ionen werden in
einem elektrischen Feld beschleunigt.
• Ein Ionendetektor wandelt die ankommenden Ionen in
ein elektrisches Signal um.
• Messung der Ribosomenproteine in Abhängigkeit von
der Flugzeit (m/z = 2.000 bis 20.000 Da)
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Prinzip der Methode
Spektrum
Detektion
Auftrennung
Beschleunigung
Ionisation
Desorption
Quelle: bioMerieux
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Mikroorganismen unterscheiden sich in ihren Massenspektren
Quelle: bioMerieux
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Praktische Durchführung
Foto: Labor L+S AG
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• gleicher Probenansatz für alle Bakterien
→ Auftragen der Bakterienkultur auf eine Position auf dem Target
mittels Schmiermethode (L+S  Doppelansatz)
→ Hefen: Aufschluss mit 0,5µl 25%iger Ameisensäure
→ Zugabe von 1µl Matrix (Alpha-cyano)
Fotos: Labor L+S AG
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• Eingeben der Targets in das Gerät
Foto: Labor L+S AG
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• Automatische Messung der Proben
►
Durchschnittlich 500 Laserschüsse pro Probe
►
100 Einzelspektren zur Erfüllung der Qualitätskriterien nötig
►
daraus ergibt sich ein Summenspektrum („Roh-Spektrum“)
►
Qualitätskontrolle des Spektrums (Rauschen entfernen, usw.)
• Abgleich des Spektrums gegen die Datenbank
• Anzeigen des Ergebnisses innerhalb von Minuten
Quelle: ClipArt
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Ergebnisdarstellung
Konfidenzlevel
Symbol
Anzahl der
Nennungen
% Wahrscheinlichkeit
Bemerkung
Gut
1
60 – 99,9
-
Geringe
Selektivität
2 bis 4
Summe = 100
Weitere Trennung durch
zusätzliche Tests
Keine ID
>4
Summe < 100
Nicht eindeutige
Identifizierung
Kein Ergebnis
-
-
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Plausibilitätskontrolle bei L+S
• Bakterien: ein Grampräparat und eine Subkultur auf MacConkeyAgar werden angelegt, deren Ergebnis Hilfestellung bei nicht
eindeutigem Gramverhalten leisten kann.
• Beurteilung der Kulturmorphologie
Fotos: Labor L+S AG
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Plausibilitätskontrolle
• Das Identifizierungsergebnis wird zusammen mit den Ergebnissen
der dokumentierten zusätzlichen Untersuchungen auf Plausibilität
überprüft
 Mikrobiologisches Know-How notwendig!
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Wo steht MALDI TOF MS im Vergleich zu biochemischen und
molekularbiologischen Methoden?
L+S-interne Studie (publiziert in der Pharm. Ind. 77, Nr. 4, 550-561 (2015)):
Es wurden 849 Proben aus dem Hygienemonitoring, die über ein Jahr
gesammelt wurden, mittels VITEK MS (V2.0), VITEK 2 compact und
MicroSEQ identifiziert und die Ergebnisse verglichen.
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Identifizierung von Mikroorganismen im Vergleich
VITEK 2 compact
MicroSEQ
2,1
0,7
1,4
VITEK MS
5,1
0,5
93,5
97,2
Spezies
Gattung
6,7
92,8
kein Ergebnis
(Quelle: Pharm. Ind. 77, Nr. 4, 550-561 (2015)
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Resultate der Studie allgemein:
• 78,4 % der Isolate konnten mit allen drei Methoden bis auf SpeziesEbene gleich identifiziert werden.
• Mit MicroSEQ konnten die meisten zuverlässigen Ergebnisse bis
Spezies bestimmt werden (→ „Goldener Standard“).
• Die biochemische Methode weist die höchste Fehlerrate auf (30 nicht
plausible Ergebnisse).
• MALDI TOF MS mit den meisten „No-ID“-Resultaten.
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Welche Keime identifiziert VITEK MS zuverlässig?
•
•
•
•
•
Staphylokokken
Mikrokokken
Pseudomonaden (Ausnahme: Wasserkeime)
Enterobakterien
einige coryneforme Bakterien (besser als VITEK 2 compact)
Voraussetzung: Datenbank-Eintrag!!!
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Wo besteht Handlungsbedarf?
• fehlende Datenbank-Einträge führten zu Fehlidentifizierung,
z. B. Kocuria sp.:
K. rhizophila → identifiziert als Rothia mucilaginosa
K. palustris → identifiziert als Lactobacillus jensenii / Propionibacterium
propionicum / Citrobacter farmeri
Beide Spezies in V3.1 hinterlegt!
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Wo besteht Handlungsbedarf?
• z.B. Microbacterium sp. → wurde oft falsch identifiziert als
Paenibacillus sp.
 nach Update mit V3.1 noch nicht vorgekommen
• Schwierige Bakterien aufgrund von besonderen Wachstumseigenschaften (z.B. schleimig, wässrige Bazillen;
feine Corynebakterien)
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Fazit der Studie
MALDI TOF MS ist durch Schnelligkeit der Ergebnisgenerierung,
Einfachheit der Anwendung und bei weiterer Expansion der Datenbank
durch Umwelt- und Wasserkeime System „erster Wahl“!
Effektivste Herangehensweise in Zukunft:
Initiale Identifizierung mittels VITEK MS
→ wenn kein/kein plausibles Ergebnis: Sequenzierung
→ weitere Differenzierung von ähnlichen Keimen, die mit der MALDI TOFMethode schwer zu unterscheiden sind, z. B. mittels biochemischen
Zusatztests
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Vorteile
+ schnelle Identifizierung
→ ein einzelnes Identifizierungsergebnis liegt innerhalb von Minuten vor
(Vorbereitung und Messen eines ganzen Targets dauert ca. 1,5h)
→ keine Verdachtsdiagnose nötig, da gleicher Probenansatz
(ABER begrenzt: da z. B. bei Hefen zusätzlicher Aufschluss +
Datenbankauswahl notwendig;
Nachteil: Mitarbeiter beschäftigt sich vorher nicht mit der Kultur!)
→ wenige Bearbeitungsschritte
→ bis zu 192 Proben (d.h. 4 Targets) pro Lauf möglich
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Vorteile
+ Benutzerfreundliche Software
→ Einfache Anwendung
→ zügige Qualifizierung von neuen Mitarbeitern
+ CFR 21 part 11 kompatibel
(Usermanagement, Audittrail, geschlossene DB)
+ wenig Verbrauchs- und Verpackungsmaterial
→ 3 Kalibrationsspots pro Target
→ wiederverwendbar, wenn freie Acquisition groups
→ alle 48 spots können für Proben genutzt werden
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Vorteile
+ Medienunabhängig und unabhängig vom Alter der Kultur
z. B. E. coli: Medien: Columbia Blutagar, Caso-Agar, MacConkey-Agar
Zeit: 24h, 48h, 72h
→ bei älteren Kulturen dauert die Messung länger
+ Datenbank mit Hauskeimen erweiterbar
→ VITEK MS Plus (Myla + SARAMIS)
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Nachteile
 Anschaffungs- und Wartungskosten
 Regelmäßiges Finetuning notwendig
→ sonst keine/schlechte Ergebnisse
 Trennen der Datenbank in Bakterien und Pilze
 Erkennt keine Mischkulturen
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Nachteile
 Begrenzte Leistungsfähigkeit des Servers
→ ab 60.000 gespeicherten Ergebnissen/Spektren (bei L+S = 30.000 Isolate!)
→ Myla arbeitet langsam, Programm „hängt“ sich auf
→ gleichzeitiges Nutzen von Acquisition- und Myla-Software auf
einem Rechner führt zu Abbruch der Messung
 VITEK MS Plus → zwei Messungen notwendig zur Identifizierung eines
Isolates mit beiden Datenbanken
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Datenbank-Update (V3.1) seit Ende März 2017 bei L+S
Einträge
Datenbank
V2.0
V3.1
Bakterien
649 (576*)
965 (862*)
Hefen/Schimmelpilze
111 (109*)
198 (191*)
Gesamt
760 (685*)
1163 (1053*)
* Letztendlich mögliche Identifizierungsergebnisse, da auch Keime zu Gruppen
zusammengefasst und lediglich zur Information enthalten sind, z. B. Acinetobacter
baumannii complex, Bacillus cereus group, Brevibacillus spp., u.a.)
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Datenbank-Update (V3.1) seit Ende März 2017 bei L+S
Erste Erfahrungen/Eindrücke:
- Verbesserung der Quote von plausiblen Identifizierungsergebnissen mittels
VITEK MS
 Datenbank-Eintrag essentiell für plausible Identifizierungsergebnisse!
 Beseitigung von Diskrepanzen zw. VITEK MS und Vitek 2 compact-DB
(z. B. Kocuria sp./Micrococcus sp.)
- Weitere Datenbank-Einträge notwendig  regelmäßige Updates!
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Datenbank-Update (V3.1) seit Ende März 2017 bei L+S
Weiteres Potential durch Schimmelpilz-Identifikation
Zusätzliche Schimmelpilz-Einträge in der Datenbank und spezielles
Aufschluss-Verfahren bieten Grundlage für weiteres Potential der
MALDI-TOF-Methode!
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Fazit:
VITEK MS – Identifizierungen zuverlässig,
wenn Keim in der Datenbank hinterlegt ist!
 Wünschenswert jährlich ein Datenbank-Update!
Quelle: ClipArt
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Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit!
Quelle: ClipArt
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Frank Kugler
Operative Geschäftsleitung
Geschäftsfeld Mikrobiologie
[email protected]
+49 (0)97 08/91 00-340
www.labor-ls.de
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