Dokument_40

Aus der Chirurgischen Klinik mit Poliklinik der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Direktor: Prof. Dr. Dr. h.c. W. Hohenberger
durchgeführt in der
Transfusionsmedizinischen und Hämostaseologischen Abteilung
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Leiter: Prof. Dr. R. Eckstein
Von-Willebrand-Faktor-Aktivität und von-Willebrand-FaktorMultimerenverteilung bei Patienten mit kolorektalem
Karzinom
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
an der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
vorgelegt von
Christian Eiche
aus Bad Hersfeld
Gedruckt mit Erlaubnis der
Medizinischen Fakultät der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Dekan:
Prof. Dr. med. Dr. h.c. J. Schüttler
Referent:
Prof. Dr. med. R. Zimmermann
Koreferent:
Prof. Dr. med. Dr. h.c. W. Hohenberger
Tag der mündlichen Prüfung: 01.08.2012
Gewidmet meinen Eltern
Inhaltsverzeichnis
1
Zusammenfassung und Summary..................................................... 1
1.1
Zusammenfassung ............................................................................ 1
1.2
Summary ........................................................................................... 3
2
Einleitung .......................................................................................... 4
2.1
Kolorektales Karzinom ...................................................................... 4
2.2
Von-Willebrand-Faktor und ADAMTS13............................................ 8
2.2.1
Historisches ................................................................................ 8
2.2.2
Biosynthese des von-Willebrand-Faktors.................................... 9
2.2.3
Funktionen des von-Willebrand-Faktors ................................... 11
2.2.4
ADAMTS13 ............................................................................... 11
2.2.5
Veränderung der vWF-Multimeren-Verteilung bei
verschiedenen Krankheiten ...................................................... 13
2.3
Faktor VIII........................................................................................ 15
2.4
Ristocetin-Cofaktor .......................................................................... 16
2.5
Von-Willebrand-Faktor und kolorektales Karzinom ......................... 16
2.6
Zielsetzung der vorliegenden Studie ............................................... 19
3
Material und Methoden.................................................................... 20
3.1
Patienten ......................................................................................... 20
3.2
Gelelektrophorese ........................................................................... 20
3.3
ADAMTS13-ELISA .......................................................................... 24
3.4
Bestimmung des Von-Willebrand-Faktor-Antigens,
des Faktor VIII und des Ristocetin-Cofaktors .................................. 26
3.5
Statistik............................................................................................ 27
4
Ergebnisse ...................................................................................... 28
4.1. Vergleich zwischen den UICC-Stadien............................................ 28
4.1.1
Faktor VIII ................................................................................. 28
4.1.2
Von-Willebrand-Faktor .............................................................. 30
4.1.3
Ristocetin-Cofaktor ................................................................... 31
4.1.3
ADAMTS13 ............................................................................... 32
4.2
Korrelation der vWF- und der Faktor-VIII-Aktivität zu
Werten des Blutbilds ...................................................................... 33
4.3
Korrelation der vWF- und der Faktor-VIII-Aktivität zum
ADAMTS13-Spiegel ........................................................................ 34
4.4
Multimerenanalyse .......................................................................... 34
4.4.1
Gerinnungsanalysen bei den Patienten der
Multimerenanalyse .................................................................... 35
4.4.2
Elektrophorese-Abbildungen ..................................................... 37
5
Diskussion ....................................................................................... 46
6
Literaturverzeichnis ......................................................................... 52
7
Abkürzungsverzeichnis ................................................................... 63
8
Verzeichnis der Vorveröffentlichungen ............................................ 64
9
Danksagung .................................................................................... 65
1
1
Zusammenfassung und Summary
1.1
Zusammenfassung
Hintergrund
Bei Patienten mit kolorektalen Karzinomen wurde in mehreren Studien ein
erhöhter Wert der von-Willebrand-Faktor-Aktivität beschrieben. Sogar ein
Nutzen der von-Willebrand-Faktor-Aktivität als Prognosefaktor für diese
Tumorentität wurde diskutiert.
Wie es zu diesem Anstieg kommt und ob eine Veränderung in der Multimerenverteilung auftritt, ist bisher allerdings völlig ungeklärt. In der
vorliegenden Studie wurden deshalb die Aktivität des Gerinnungsfaktors VIII,
die Konzentration und die Aktivität des von-Willebrand-Faktors, die Multimerenverteilung des von-Willebrand-Faktors und die Konzentration der
ADAMTS13, einer Protease, die die großen Multimere spaltet, in den
unterschiedlichen Tumorstadien des kolorektalen Karzinoms untersucht.
Studiendesign und Methoden
Bei insgesamt 126 Patienten wurde die Aktivität des von-Willebrand-Faktors,
seine Aktivität, bestimmt als Ristocetin-Cofaktor, und die Aktivität des Gerinnungsfaktors VIII bestimmt. Bei 9 Patienten pro UICC Stadium, also insgesamt bei 36 Patienten, erfolgte zusätzlich die Untersuchung der Multimerenverteilung mittels einer speziellen Gelelektrophorese. Hierzu wurden die den
einzelnen Tumorstadien zugehörenden Plasmen gepoolt und in mehreren
Elektrophoreseläufen untersucht. Zusätzlich erfolgte die Bestimmung der
Konzentration der ADAMTS13 in den Einzelplasmen mittels ELISA.
2
Ergebnisse
Wie in einigen anderen Studien zeigen die Aktivitäten des von-WillebrandFaktors, des Ristocetin-Cofaktors und des Faktors VIII die Tendenz, mit
höheren Tumorstadien anzusteigen. Signifikant war dieser Zusammenhang
bei einer sehr großen Streubreite der Werte jedoch nicht. Die Verteilung der
Multimeren sowie die Konzentration der ADAMTS13 zeigten keinen Unterschied zwischen den verschiedenen Stadien des kolorektalen Karzinoms.
Auch ein Zusammenhang zwischen ADAMTS13 und der Konzentration des
von-Willebrand-Faktors konnte nicht gezeigt werden. Das Verfahren der
Multimerenanalyse an Probenpools erwies sich als der Multimerenanalyse an
jedem Einzelplasma überlegen, da der Vergleich von einzelnen Plasmen in
der Gelelektrophorese zu sehr durch technische Variabilität gestört wird.
Schlussfolgerung
Aufgrund der starken interindividuellen Streubreite der von-WillebrandFaktor-Aktivität ist dieser nicht als Prognosemarker bei Patienten mit
kolorektalem Karzinom geeignet. Bei dauerhaft erhöhten Werten sollte
allerdings differentialdiagnostisch an das Vorliegen einer Tumorerkrankung
gedacht werden. Die Multimerenanalyse des von-Willebrand-Faktors sowie
die Bestimmung der ADAMTS13 bringen keinen zusätzlichen Nutzen bei
Patienten mit kolorektalem Karzinom.
3
1.2
Summary
Background
Many studies observed elevated levels of von Willebrand factor in patients
with colorectal cancer (CRC). Some authors even suggested that elevated
levels of von Willebrand factor can be used as an indicator for estimating
survival probability. Why von Willebrand factor is elevated in patients with
CRC is absolutely unclear. In this study we measured the vWF multimer
distribution, and the concentration of the vWF-cleaving protease ADAMTS13
as well as factor VIII and ristocetin-cofactor levels.
Study design an methods
In 126 Patients vWF activity, ristocetin-cofactor and factor VIII were
measured. In nine patients of each UICC stage we visualised the distribiution
of vWF multimers using electrophoretic multimer analysis. This is the first
study to use pooled patient samples for multimer analysis, so we could
compare all 36 patients in a single run of electrophoresis. ADAMTS13 levels
were measured by using an ELISA.
Results
We found higher levels of vWF in higher UICC stages. Ristocetin-cofactor
and factor VIII were also elevated. However, because of the remarkable
interindividual variability of these coagulation factors, the diffeneces between
the stages were not significant. In electrophoresis we found no differences
between the UICC stages. The concentration of ADAMTS13 also did not
show any differences and there was no association to vWF levels.
Conclusions
Because of the large interindividual variability vWF levels are not appropriate
for staging colorectal cancer. Also it is not helpful as an prognostic indicator.
The distribution of vWF multimers was not different in all UICC stages of
CRC. There was therefore no evidence of acquired von Willebrand disease
type 2 in these patients.
4
2 Einleitung
2.1
Kolorektales Karzinom
Dickdarmkrebs stellt in Deutschland die häufigste Krebserkrankung dar. 2006
wurden 68.740 neue Fälle diagnostiziert. Im selben Zeitraum entfielen 27.225
Todesfälle auf diese Erkrankung [59].
Die meisten kolorektalen Karzinome entwickeln sich aus Adenomen. Eine
Erklärung hierfür liefert die so genannte Adenom-Karzinom-Sequenz [49].
Diese besagt, dass ein Karzinom dadurch entsteht, dass mehrere Genveränderungen in einer Zelle zusammentreffen. Durch den Verlust oder eine
Mutation des Adenomatous-polyposis-coli-Gens (APC-Gens), eines Tumorsuppressorgens auf dem langen Arm von Chromosom 5, wird das normale
Epithel zu hyperproliferativem Epithel. Hypomethylierungen der DNS
induzieren nun ein frühes Adenom, ras-Mutationen das intermediäre Adenom
und der Verlust des 18q Allels das späte Adenom. Durch den Verlust von
p53 auf dem langen Arm von Chromosom 17 entsteht schließlich ein
Karzinom. Weitere Mutationen führen zur Metastasierung [20,63].
Das Risiko, an einem kolorektalen Tumor zu erkranken, ist bei Vorhandensein von Adenomen enorm gesteigert. Hierbei kann nicht nur aus den Adenomen direkt ein Karzinom entstehen, sondern auch nach Abtragung auffindbarer Adenome bleibt das individuelle Risiko, ein Karzinom zu entwickeln, circa
um den Faktor 4 erhöht [2]. Einen anderen Risikofaktor stellt das Alter dar.
So sind Erkrankungsfälle bei Personen unter 50 Jahren noch relativ selten,
nehmen aber tendenziell zu. Danach nimmt die Inzidenz stark zu und erreicht
bei Männern zwischen 80 und 84 Jahren ein Maximum von über 500
Neuerkrankungen pro 100.000 Personen pro Jahr [59]. Auch die Ernährung
spielt bei der Entwicklung von kolorektalen Karzinomen eine wichtige Rolle.
Eine hohe Zufuhr an Ballaststoffen sowie der Verzehr von Obst und Gemüse
reduzieren das Risiko, an einem Kolonkarzinom zu erkranken [4,74].
5
Neben den erworbenen Risiken bestehen erbliche Risiken mit nicht genau
nachgewiesenen genetischen Grundlagen. So haben Verwandte ersten
Grades von Patienten mit kolorektalen Tumoren ein zwei- bis dreifach
erhöhtes Risiko, ebenfalls an einem Kolonkarzinom zu erkranken [35]. Aber
auch genetisch genau definierte, monogene Defekte spielen eine Rolle. Bei
der familiären adenomatösen Polyposis (FAP) entstehen durch einen Defekt
am APC-Gen über 100 Adenome im Dickdarm, was zu einer nahezu
hundertprozentigen Wahrscheinlichkeit führt, einen malignen Tumor zu
entwickeln. Da diese Mutation mit ein bis zwei Patienten pro 10.000
Personen aber relativ selten ist, entstehen insgesamt gesehen nur etwa 5
Prozent der kolorektalen Tumore bei Patienten mit FAP.
Neben dieser phänotypisch leicht zu identifizierenden Krankheit stellt das
hereditäre nicht-polypöse kolorektale Karzinom (HNPCC) eine diagnostische
Herausforderung dar. 80 Prozent der Patienten mit HNPCC entwickeln ein
kolorektales
Karzinom
[35].
Definiert
wird
die
Erkrankung
durch
anamnestische Kriterien.
Eine dritte große Patientengruppe mit hohem Risiko für die Entwicklung
eines kolorektalen Karzinoms stellen Patienten mit chronisch entzündlichen
Darmerkrankungen dar. Besonders zu erwähnen ist die Colitis ulcerosa, wo
bei einer Pancolitis das Karzinomrisiko bei 18 Prozent nach 30 Jahren liegt
[17]. Bei Morbus Crohn ist die Datenlage uneinheitlich, es liegt aber wohl
ebenfalls ein erhöhtes Risiko für kolorektale Karzinome vor [67,68].
Um kolorektale Tumore möglichst frühzeitig zu entdecken, sollte ab einem
Alter von 50 Jahren auch bei asymptomatischen Personen ohne besondere
Risikofaktoren ein Screening angeboten werden. Hierzu eignet sich der
fäkale
okkulte
Bluttest
(FOBT,
Guaiak
Test),
welcher
in
einem
systematischen Review eine durchschnittliche Reduktion der Sterblichkeit um
23 Prozent zeigen konnte [68,75]. Den Goldstandard zur frühen Erkennung
von kolorektalen Tumoren stellen allerdings endoskopische Verfahren dar.
Diese sind dem Test auf Blut im Stuhl in Sensitivität und Spezifität deutlich
überlegen und bieten die Möglichkeit, entdeckte Adenome sogleich
abzutragen und so die Entstehung von Karzinomen zu verhindern. Da durch
6
die Koloskopie alle Darmabschnitte eingesehen werden können, ist diese der
Sigmoidoskopie vorzuziehen und sollte als Standardverfahren empfohlen
werden. Die Vorsorgekoloskopie wird in Deutschland derzeit ab dem 56.
Lebensjahr von den gesetzlichen Krankenkassen bezahlt. So kann die
Inzidenz von malignen Tumoren durch Polypektomie um 66 bis 90% gesenkt
werden. Eine einmalige Wiederholung der Untersuchung wird nach 10
Jahren empfohlen [8,68,87]. Bei familiären Formen des kolorektalen
Karzinoms ist die erste Vorsorgekoloskopie bereits vor dem 20. Lebensjahr
sinnvoll. In diesen Fällen sind auch häufigere Wiederholungen angebracht. In
jüngster Zeit wird wegen steigender Erkrankungszahlen im Alter zwischen 40
und 50 Jahren diskutiert, ob die Altersgrenze
für die erstmalige
Screeningrekto-, -sigmoido- oder -koloskopie auf 40 Jahre gesenkt werden
sollte [16,64].
Die Stadieneinteilung des kolorektalen Karzinoms erfolgt nach Dukes oder
nach der TNM-Klassifikation der UICC (Union International Contre le
Cancer). Hierbei stehen die Buchstaben T für die Tiefe der Tumorinfiltration
in die Darmwand, N für den Lymphknotenstatus und M für das
Vorhandensein von Fernmetastasen (Tab. 1) [80,89]. Aus dem TNM System
lässt sich eine Stadiengruppierung ableiten, welche die Prognose der
Erkrankung maßgeblich beeinflusst (Tab. 2) [77].
Vor der Therapie des Tumors erfolgt das so genannte Staging. Hierbei wird
die Ausdehnung des Tumors möglichst genau bestimmt. Zunächst wird
zwischen Kolon- und Rektumkarzinomen unterschieden. Die Grenze
zwischen beiden verläuft nach UICC 16cm oral der Anokutanlinie, gemessen
mit einem starren Rektoskop [89]. Zur präoperativen Ausbreitungsdiagnostik
des Tumors werden folgende Untersuchungen als essentiell angesehen:
digital-rektale Untersuchung, komplette Koloskopie mit Biopsie, im Falle einer
nicht passierbaren Stenose eine Koloskopie 3-6 Monate postoperativ,
Abdomensonographie, Röntgen Thorax in 2 Ebenen und CEA Bestimmung.
Im Einzelfall werden die Untersuchungen durch ein Spiral-CT oder MRT des
Abdomens und ein Spiral-CT der Lunge ergänzt [67].
7
Tabelle 1:
TNM-Klassifikation der kolorektalen Karzinome
T
TX
Primärtumor
Primärtumor kann nicht beurteilt werden
T0
Tis
Kein Anhalt für einen Primärtumor
Carcinoma in situ
T1
T2
Tumor infiltriert die Submukosa
Tumor infiltriert die Muscularis propria
T3
Tumor infiltriert die Subserosa bzw. das nicht peritonealisierte
parakolische bzw. pararektale Gewebe
T4
Tumor perforiert das viszerale Peritoneum und / oder infiltriert direkt
andere Organe
N
NX
Regionale Lymphknoten
Regionale Lymphknoten können nicht beurteilt werden
N0
N1
Keine regionalen Lymphknotenmetastasen
Metastasen in 1-3 parakolischen bzw. pararektalen Lymphknoten
N2
Metastasen in 4 oder mehr parakolischen bzw. pararektalen
Lymphknoten
M
Fernmetastasen
MX
M0
Vorliegen von Fernmetastasen kann nicht beurteilt werden
Keine Fernmetastasen
M1
Fernmetastasen
Tabelle 2:
TNM-Stadieneinteilung der kolorektalen Karzinome
Stadium
T-Stadium
N-Stadium
M-Stadium
0
Tis
N0
M0
I
T1, T2
N0
M0
IIA
T3
N0
M0
IIB
T4
N0
M0
IIIA
T1, T2
N1
M0
IIIB
T3,T4
N1
M0
IIIC
Jedes T
N2
M0
IV
Jedes T
Jedes N
M1
5-JÜR*
92%
85%
64%
12%
*5-JÜR = relative 5-Jahresüberlebensrate im Vergleich zur Normalbevölkerung
8
Bei Patienten mit Rektumkarzinom kommen noch die starre Rektoskopie
sowie die Endosonografie hinzu. Durch diese Maßnahmen lassen sich die
Tumorausdehnung und eventuell vorhandene Metastasen bereits vor der
Operation erkennen. Der Eingriff kann dann dementsprechend geplant und
durchgeführt werden [68].
Die Therapie des kolorektalen Karzinoms hängt wesentlich vom Tumorstadium zum Zeitpunkt der Erstdiagnose ab. Das Ziel besteht immer in einer
kompletten Resektion des Tumors. Bei sehr kleinen Tumoren (T1) mit
niedrigem Risiko für Lymphknotenmetastasen ist eine lokale endoskopische
Resektion ausreichend. Bei größeren Tumoren ist ein standardisiertes
operatives Vorgehen indiziert [29,30]. Hierbei sollte nicht nur der lokale
Tumor reseziert werden, sondern ebenfalls das Lymphabflussgebiet. Hieraus
ergibt sich ein notwendiger Sicherheitsabstand vom Tumor von 10 cm oral
und aboral.
Eine adjuvante Chemotherapie ist bei allen Patienten mit Kolonkarzinom im
Stadium III indiziert. Hierbei sollte ein Oxiplatin-haltiges Therapieschema
eingesetzt werden. Im Stadium II kann eine adjuvante Chemotherapie
durchgeführt werden, wobei hier nur ein geringer Überlebensvorteil besteht
und der Nutzen genau abgewogen werden muss.
Die Therapie von Patienten mit Rektumkarzinom unterscheidet sich
dahingehend,
dass
hier
eine
neoadjuvante
Radio/-Chemotherapie
durchgeführt werden sollte. Hierdurch kann eine signifikante Reduzierung
von Lokalrezidiven erreicht werden [67,68].
2.2
Von-Willebrand-Faktor und ADAMTS13
2.2.1 Historisches
1924 beschrieb der finnische Arzt Erik von Willebrand eine Blutungsneigung
bei einem 5-jährigen Mädchen [82]. Nach der Untersuchung der gesamten
9
Familie erkannte er, dass einige Unterschiede zu der bis dahin bekannten
Hämophilie bestanden:
-
Die Patienten hatten insbesondere Schleimhautblutungen.
-
Gelenkblutungen und Blutungen in die Muskulatur waren selten
-
Der Erbgang war autosomal-dominant und nicht X-chromosomal
rezessiv wie bei der Hämophilie
-
Die Blutungszeit war im Gegensatz zur Hämophilie verlängert
Deshalb schloss von Willebrand auf eine bis dahin unbekannte Krankheit. Er
fand heraus, dass die Thrombozytenkonzentration der Patienten normal war,
und folgerte daraus, dass ein qualitativer Defekt in der Thrombusbildung
vorliegen müsse.
In den 50er Jahren des 20. Jahrhunderts konnte gezeigt werden, dass bei
einigen
Patienten
mit
dem
heute
„von-Willebrand-Syndrom“
(vWS)
genannten Krankheitsbild ein Mangel an Faktor VIII besteht [41].
Interessanterweise konnten die Symptome des vWS allerdings durch die
Gabe von Plasma von Hämophilie-A-Patienten gebessert werden. Dies
lieferte erste Hinweise auf das Vorhandensein eines eigenständigen „vonWillebrand-Faktors“ (vWF) [52,53]. Isoliert werden konnte der vonWillebrand-Faktor erst in den 1970er Jahren. 1986 wurde schließlich über
DNS-Sequenzierung erkannt, dass vWF und Faktor VIII zwei völlig
verschiedene Proteine sind [62].
2.2.2 Biosynthese des von-Willebrand-Faktors
Der von-Willebrand-Faktor ist ein großes Glykoprotein, das in Endothelzellen,
die im gesamten Körper verteilt sind, und in Megakaryozyten synthetisiert
wird [31,50]. Das primäre Translationsprodukt ist der Prä-pro-von-WillebrandFaktor, ein Monomer aus 2813 Aminosäuren. Nach verschiedenen
Umbauvorgängen, insbesondere der Glykosylierung, erfolgt der Transport in
das
endoplasmatische
Retikulum,
wo
eine
Dimerisierung
durch
Disulfidbrücken stattfindet [44,83]. Im Anschluss werden die Dimere (ProvWF-Dimer) im Golgi-Apparat zu Multimeren zusammengesetzt und das
10
vWF-Propeptid entfernt. Ein Multimer besteht aus bis zu 20 Dimeren, so dass
lange Ketten von bis zu 2mm Länge und einem Gewicht von bis zu
20.000.000 Da entstehen (siehe Abb. 1). Damit ist der vWF das größte
lösliche Protein im menschlichen Körper [61]. Die fertig zusammengesetzten
Multimere werden nun entweder direkt sezerniert (etwa 95%) oder in den so
genannten Weibel-Palade-Körperchen des Endothels [71,84] oder in den
Alpha-Granula
der
Thrombozyten
gespeichert
[14].
Die
normale
Konzentration im Blut beträgt ca. 10 µg/ml [7].
Abbildung 1: Biosynthese des von-Willebrand-Faktor. Modifiziert nach [69]
11
2.2.3 Funktionen des von-Willebrand-Faktors
Der von-Willebrand-Faktor spielt eine äußerst wichtige Rolle bei der
Blutstillung. Hierbei bestehen die zentralen Funktionen in der Ermöglichung
der Plättchenadhäsion an verletztem Endothel über das ThrombozytenOberflächenglykoprotein Ib (Gp Ib) und in deren Aggregation unter hohen
Scherkräften über GPIIb/IIIa [60]. Des Weiteren handelt es sich um ein
Trägerprotein für den Gerinnungsfaktor VIII, welcher so vor einem zu
schnellen Abbau geschützt wird [22]. Für die Vernetzung der Thrombozyten
sind die großen Multimere essentiell. Durch die Verbindung vieler Dimere
entsteht ein multiplikativer Effekt, da jede Einheit Bindungsstellen für
subendotheliales Kollagen einerseits und Thrombozyten andererseits besitzt.
Als Träger von Faktor VIII können auch einzelne Dimere dienen [23].
2.2.4 ADAMTS13
Abgebaut wird der von-Willebrand-Faktor durch die vWF-spaltende Protease
ADAMTS13 (A disintegrin-like and-metalloprotease with thrombospondin
type 1 motif 13) [70]. ADAMTS13 spaltet die Verbindung zwischen den
Aminosäuren Tyr1605 und Met1606 in der A2-Domäne des vWF. Hierdurch
werden aus sehr großen Multimeren Einheiten aus kleineren Multimeren.
Das erworbene Fehlen dieser Protease löst die thrombotisch-thrombozytopenische Purpura, auch Moschcowitz-Syndrom genannt, aus [24]. Bei dieser
seltenen und lebensbedrohlichen Erkrankung entstehen thrombozytenreiche
Blutgerinnsel, die Kapillaren besonders von Gehirn und Niere verlegen und
zu schwerwiegenden Organschäden führen.
Der Hauptsyntheseort von ADAMTS13 sind die Sternzellen in der Leber [78].
Die Verteilung der unterschiedlich großen Multimere des von-WillebrandFaktors im Blut lässt sich besonders gut mittels Gelelektrophorse darstellen
(siehe Abb. 2). Die Multimere werden hierbei in einem Gel mittels elektrischer
Spannung ihrer Größe nach aufgeteilt und lassen sich anschließend
anfärben. So lässt sich darstellen, ob eine gleichmäßige Verteilung der
verschieden großen Multimere vorliegt [86].
12
Schwere Multimere
Mittelschwere Multimere
Leichte Multimere
Abbildung 2: vWF-Gelelektrophorese mit nach Größe aufgetrenntem vWF
In Abhängigkeit von der Anzahl an Dimeren lassen sich die Multimere in
folgende Gruppen einteilen: (Abb. 2)
-
niedermolekularer / leichter vWF aus bis zu 5 Dimeren
-
mittelschwerer vWF aus 6-10 Dimeren
-
hochmolekularer / schwerer VWF aus 11-16 Dimeren.
-
Multimere aus mehr als 16 Dimeren (Ultra Large Von-WillebrandFaktor ULVWF)
Das Vorhandensein von ULVWF-Multimere weist auf eine Störung des
Abbaus durch ADAMTS13 hin. Die Multimere sollten im Blut relativ
gleichmäßig verteilt sein. Eine ungleichmäßige Verteilung findet sich bei
verschiedenen Erkrankungen.
13
2.2.5 Veränderung der vWF-Multimeren-Verteilung bei verschiedenen
Krankheiten
Das von-Willebrand-Syndrom (vWS) zeichnet sich durch eine verminderte
Aktivität des vWF aus. Es lässt sich in 3 Hauptgruppen einteilen [69]. Beim
von-Willebrand-Syndrom Typ 1 besteht eine erniedrigte Konzentration des
qualitativ normalen vWF. Bei Typ 3 fehlt der vWF praktisch komplett. Die
Subtypen 1 und 3 des vWS sind also vorrangig quantitative Störungen. Beim
Subtyp 2 des vWS, von dem es mehrere Unterformen, die Typen 2A, 2B, 2M
und 2N, gibt, ist vorwiegend durch qualitative Veränderungen des vWF
gekennzeichnet. Bei Typ 2A ist vor allem die primäre Hämostase
beeinträchtigt, da die großen von-Willebrand-Faktor-Multimere fehlen (siehe
Abb. 3). Varianten mit einer erhöhten Affinität für Glykoprotein-Ib (Gp1b)
gehören zum Typ 2B des vWS und umfassen Phänotypen mit einem Verlust
großer Multimere, aber auch solche mit einem normalen Multimerenmuster.
Durch
die
erhöhte
Affinität
zu
Gp1b
kommt
es
zu
erhöhtem
Thrombozytenumsatz und oft zur Thrombozytopenie. Der Typ 2M des vWS
beruht auf plättchenabhängigen funktionellen Defekten des vWF. Eine
defekte Faktor-VIII-Bindung des vWF kennzeichnet den Subtyp 2N des vWS
[69].
Abbildung 3: Multimerenverteilung des von vWF bei den 3 Subtypen des
vWS (Nach [1])
14
Bei der so genannten thrombotisch-thrombozytopenischen Purpura (TTP)
kommt es durch einen Mangel von ADAMTS13 zu einer starken Zunahme
der ULVWF und in Folge dessen zu einer pathologischen Steigerung der
Thrombozytenadhäsion und -aggregation (siehe Abb. 4) [46,47]. Zahlreiche
thrombozytenreiche Blutgerinnsel verlegen insbesondere die Kapillaren von
Gehirn und Niere und verursachen dort schwerwiegende Organschäden. Ein
eng verwandtes Krankheitsbild ist das hämolytisch-urämische Syndrom
(HUS), bei dem thrombozytenreiche Blutgerinnsel vorwiegend in der Niere
auftreten, so dass die Niereninsuffizienz ausgeprägter, neurologische
Schäden dagegen oft geringer sind als bei TTP. Während die ADAMTS13Spiegel bei HUS meist nicht erniedrigt sind, spielt hier die gesteigerte
Freisetzung von ULVWF und die Verzögerung ihres Abbaus durch Toxine
bestimmter enterohämorrhagischer Bakterien die Schlüsselrolle [47].
Abbildung 4:
Zunahme der sehr großen vWF Multimere bei TTP.
Modifiziert aus [10]
15
2.3
Faktor VIII
Bei Faktor VIII (Antihämophiler Faktor A) handelt es sich um einen
essentiellen Blutgerinnungsfaktor. Faktor VIII bildet nach Aktivierung durch
Thrombin zusammen mit Faktor IX einen als Tenase bezeichneten Komplex,
welcher Faktor X zu Faktor Xa aktiviert [19].
Die Primärstruktur des Faktor VIII wurde 1984 aufgeklärt [27,28,81]. Das
Hauptprotein besteht aus einer Kette von 2332 Aminosäuren [42]. Der
Hauptsyntheseort für Faktor VIII ist
die Leber, wobei über den genauen
Produktionsort noch immer Uneinigkeit herrscht [72,88].
Im Blut besteht eine enge Verbindung zwischen Faktor VIII und dem vonWillebrand-Faktor, weshalb der Faktor VIII in der vorliegenden Studie mit
untersucht wurde. Zwischen vWF und Faktor VIII bildet sich ein nicht
kovalenter Komplex. So wird Faktor VIII vor zu schnellem Abbau geschützt.
Besonders eindrücklich zeigt sich dies bei Patienten mit von-WillebrandSyndrom Typ 3 mit fast vollständigem Fehlen des von-Willebrand-Faktors.
Betroffene Patienten haben auch ganz niedrige Faktor-VIII-Spiegel. Auch die
Halbwertszeit von infundiertem Faktor VIII ist stark erniedrigt, sie beträgt bei
vWS Typ 3 nur ca. 2,5 Stunden. Bei Patienten mit Hämophilie A, also
Patienten mit vorhandenem von-Willebrand-Faktor, beträgt die Halbwertszeit
des infundierten Faktor VIII ca. 12 Stunden [76]. Inaktiviert wird Faktor VIII
insbesondere durch aktiviertes Protein C [39,73].
Bekannt ist der Faktor VIII durch seine Rolle bei der Hämophilie A, wo infolge
eines Gendefekts die Faktor-VIII-Synthese gestört ist. Kodiert wird Faktor VIII
auf dem X-Chromosom (Xq28), das Gen macht 0,1% der Erbinformation auf
diesem Chromosom aus [28]. Das Gen besteht aus 186.000 Basenpaaren,
wobei 95% zu Introns gehören. Die Exons kodieren für ein Protein, welches
aus 2351 Aminosäuren besteht und eine Molekularmasse von ca. 400 kDa
hat [81]. Die Mutationen, welche zur Hämophilie A führen, sind sehr
heterogen.
So
gibt
es
viele
unterschiedliche
Schweregrade der Hämophilie A [13].
Ausprägungen
und
16
2.4
Ristocetin-Cofaktor
Bei Ristocetin handelt es sich um ein mit Vancomycin verwandtes
Antibiotikum. Klinische Verwendung findet es allerdings nur noch bei der
Differentialdiagnostik des von-Willebrand-Faktors, da die Wirkung gegen
Staphylokokken von vielen Nebenwirkungen begleitet war.
Ristocetin führt über den GP-1b-Komplex zu einer Bindung des vonWillebrand-Faktors an aktivierte Thrombozyten. Hierdurch kommt es zur
Agglutination.
Fehlt nun von-Willebrand-Faktor wie beim von-Willebrand-
Syndrom, bleibt diese Agglutination aus. Somit lassen sich durch Messung
der Ristocetin-Cofaktor-Aktivität (vWF:RCo) Rückschlüsse auf die Affinität
des vWF zum Thrombozytenglykoprotein Ib ziehen [69,79].
2.5
Von-Willebrand-Faktor und kolorektales Karzinom
Thrombozyten spielen eine entscheidende Rolle bei der Angiogenese. So
werden im Falle einer Verletzung bereits bei der Aggregation der
Thrombozyten
unterschiedlichste
Wachstumsfaktoren
ausgeschüttet.
Insbesondere sind dies: Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF),
Platelet-Derived Growth Factor (PDGF), Insulin Like Growth Faktor (IGF) und
Transforming Growth Factor (TGF-β) [9,12]. Diesen bei der Wundheilung
unerlässlichen Prozess machen sich allerdings auch maligne Tumoren
zunutze, welche für ein Wachstum über 2 mm unbedingt eine eigene
mitwachsende Gefäßversorgung benötigen [21]. Wie wichtig hierbei die
Thrombozyten sind, demonstrierten mehrere Tierversuchsstudien. Diese
zeigten, dass bei schwerer Thrombozytopenie der Primärtumor und
Metastasen nicht weiter proliferieren konnten [51]. Ein direkter Zusammenhang mit den Thrombozyten konnte bestätigt werden, da die Tumore durch
eine Thrombozyteninfusion wieder weiter wachsen konnten [56]. Die aus den
Thrombozyten freigesetzten Wachstumsfaktoren spielen hierbei eine ganz
entscheidende Rolle, da sie durch gezielte Interaktion der Tumorzellen mit
den Thrombozyten eine Vaskularisierung induzieren [32,36,37]. Aber auch
17
der von-Willebrand-Faktor spielt eine wichtige Rolle. So konnte gezeigt
werden, dass sich durch Antikörper gegen vWF und den Rezeptor GP IIb/IIIa
die metastasierungsbegünstigende Wirkung der Thrombozyteninfusion stark
vermindern lässt [37].
Im Jahre 2002 publizierten Damin et al., dass die Plasmakonzentration des
von-Willebrand-Faktors bei Patienten mit kolorektalem Karzinom höher sei
als bei einer Kontrollgruppe [15]. Des Weiteren konnten sie zeigen, dass das
Tumorstadium nach Dukes einen signifikanten Einfluss auf die vWFKonzentration hat. Patienten im Stadium Dukes D mit Fernmetastasen hatten
die höchsten vWF-Konzentrationen im Blut. Ein solcher Effekt ist auch bei
anderen Krankheiten, wie zum Beispiel der hypertrophen Kardiomyopathie
zu beobachten [11]. 2005 publizierten Wang et al., dass die Konzentration
des
vWF
bei
Patienten
mit
metastasiertem
Kolonkarzinom
als
Prognosemarker anzusehen sei und Patienten mit hoher Konzentration (Cutoff Wert: 160%) signifikant kürzer leben [85]. Allerdings war diese Studie
umstritten. So bemängelten Gil-Bazo et al. in einem Leserbrief, dass
Thrombozytenzahlen, aber auch Einflussgrößen wie Begleitkrankheiten,
Geschlecht und Alter nur unzureichend betrachtet wurden [26].
Die Ursache der Erhöhung des von-Willebrand-Faktors ist weitestgehend
ungeklärt. Auch über eventuelle Änderungen in der Multimerverteilung oder
ADAMTS13 Konzentration gibt es nur wenige Daten. In einigen Studien
wurden einzelne Patienten untersucht, was aufgrund der heterogenen
Multimerverteilung und schlechter Vergleichbarkeit der Gelelektrophorese als
zweifelhaft erscheint.
Es könnte sich bei der Erhöhung der von-Willebrand-Faktor Aktivität also um
paraneoplastische Erhöhungen handeln, welche in erster Linie dadurch
zustande kommen, dass es sich bei dem von-Willebrand-Faktor um ein AkutPhase-Protein handelt, welches ähnlich wie das CRP unspezifisch auch bei
verschiedenen Infektionen erhöht ist [26,57].
Ein möglicher Faktor mit Einfluss auf die Multimerenverteilung stellt die
Stimulation der Endothelzellen dar, wodurch insbesondere sehr große
Multimere ausgeschüttet werden [71]. Auch ein Einfluss der Aktivierung von
18
Thrombozyten, welche von-Willebrand-Faktor speichern, ist denkbar. Wie
bereits erwähnt, interagieren Tumorzellen stark mit Thrombozyten und
sorgen so für eine Angioneogenese durch Ausschüttung von Wachstumsfaktoren aus thrombozytären Granula. Andere Erklärungen wären, dass die
erhöhte Konzentration des von-Willebrand-Faktors durch eine vermehrte
Synthese in Endothelzellen während der Angiogenese zustande kommt [90].
Außerdem wurde gezeigt, dass Zellen von kolorektalen Tumoren die
Freisetzung von vWF aus kultivierten Endothelzellen in vitro stimulieren
können [48].
Von einer südkoreanischen Arbeitsgruppe wurden die vWF-Multimere und
die Aktivität der vWF-spaltenden Protease ADAMTS13 bei Patienten mit
unterschiedlichen Tumorerkrankungen untersucht [40]. Hierbei zeigten sich
erniedrigte Spiegel der ADAMTS13 und erhöhte Spiegel großer vWFMultimere insbesondere in fortgeschrittenen Tumorstadien. Eine weitere
Arbeitsgruppe
beschrieb
ebenfalls
eine
diskrete
Verminderung
der
ADAMTS13-Aktivität bei einem kleinen Teil untersuchter Tumorpatienten.
Hierbei wurde allerdings nicht die tatsächliche Konzentration der ADAMTS13
gemessen, sondern aus erhöhter Ristocetin-Cofaktor-Aktivität in verdünnten
Plasmaproben auf verminderte ADAMTS13-Aktivität zurückgeschlossen [6].
Inwieweit dieser Ansatz durch starke Erhöhungen des vWF gestört wird, ist
unklar. Bei einem Patienten mit Nebennierenkarzinom wurde eine entgegengesetzte Veränderung der Multimerenverteilung des vWF beschrieben [18].
In diesem Fall kam es durch Anreicherung der sehr großen von-WillebrandMultimere im Tumor zu erniedrigten zirkulierenden Spiegeln dieser Multimere
mit der klinischen Symptomatik eines erworbenen von-Willebrand-Syndroms.
19
2.6
Zielsetzung der vorliegenden Studie
Der Stand des Wissens zum Zusammenhang zwischen kolorektalen
Karzinomen und Veränderungen der zirkulierenden Spiegel des vWF und
des Faktor VIII sowie der Multimerenverteilung des vWF und der Aktivität der
vWF-spaltenden Protease ADAMTS13 ist nach wie vor äußerst lückenhaft.
Publizierte Studienergebnisse sind zum Teil widersprüchlich. Ob sich Messungen dieser Proteine für Aussagen zum Tumorstadium und zur Prognose
im Einzelfall eignen, ist völlig offen.
Im Zuge der aktuellen Studie sollten deshalb die Multimerenverteilung des
vWF bei einer Serie von Patienten mit kolorektalen Karzinomen in verschiedenen Tumorstadien nach UICC untersucht sowie der Zusammenhang
zwischen Thrombozytenzahl, der Ristocetin-Cofaktor-Aktivität und den vonWillebrand-Faktor-, Faktor-VIII- und ADAMTS13-Spiegeln beleuchtet werden.
20
3 Material und Methoden
3.1
Patienten
Die Blutentnahme erfolgte bei Patienten der Chirurgischen Universitätsklinik
Erlangen, welche durch Frau Dr. Vera Schellerer ausgewählt und über die
Studie aufgeklärt wurden. Es handelte sich um Patienten mit der
Erstdiagnose eines kolorektalen Karzinoms vor Beginn der Therapie. Die
Studie erfolgte mit Zustimmung der Ethikkommission der Medizinischen
Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg. Es wurden
folgende Proben mit S-Monovetten® der Firma Sarstedt AG & Co.,
Nürmbrecht, Deutschland entnommen (Tab. 3)
Tabelle 3:
Citratblut
Für die Studie entnommene Blutproben
Zentrifugieren und sofortige Testung im Gerinnungslabor auf
Faktor VIII, vWF und Ristocetin-Cofaktor im Citratplasma
Citratblut
Zentrifugieren und Überstand einfrieren für Multimerenanalyse
im Citratplasma
Citratblut
Zentrifugieren und Überstand einfrieren für ADAMTS13-ELISA
im Citratplasma
Das Tumorstadium nach UICC sowie der TNM-Status wurden aus der
Datenbank des Tumorzentrums Erlangen-Nürnberg entnommen. Die Werte
des Blutbildes wurden routinemäßig mit einer präoperativen Blutentnahme
angefertigt. Insgesamt wurden 124 Patienten getestet. Einige Daten wurden
allerdings nur bei Subgruppen erhoben.
3.2
Gelelektrophorese
Die Multimerenanalyse erfolgte mittels Gelelektrophorese als Western Blot,
grundlegend beschrieben von Raines [58], modifiziert nach Weiss [86].
21
Zunächst wurden die Proben der einzelnen Patienten getrennt voneinander
untersucht. Dabei zeigte sich allerdings, dass ein Vergleich der Patienten nur
schwer möglich war. Es waren keine offensichtlichen Unterschiede zwischen
den einzelnen UICC-Stadien sichtbar. Ein genauer Vergleich zwischen allen
Patienten war verfahrensbedingt nicht durchführbar. Dies lag zum Beispiel an
der immer etwas unterschiedlichen Anfärbbarkeit der Banden, Laufunregelmäßigkeiten resultierend aus der Gelbeschaffenheit und anderen physikalischen Faktoren.
Deshalb wurde das Citratplasma der Patienten für weitere Multimerenanalysen gemischt. Jeweils 9 Patientenproben aus dem gleichen UICC-Stadium I,
II, III oder IV wurden zusammengegeben und mit einer Standardprobe auf
die 20 Fächer des Gelelektrophoresegerätes verteilt. Somit erfolgten für jede
Mischung 4 Einzelläufe, welche zusätzlich miteinander verglichen wurden.
Die benötigten Stoffe und Materialien sind in Tabelle 4 angegeben.
Zunächst wurden 200 ml Trenngel (siehe Tab. 4) zubereitet und aufgekocht,
bis keine Schlieren mehr sichtbar waren, und in den Apparat für die horizontale Gelelektrophorese gegeben (Horizon 20-25, Life technologies inc.,
Gaithersburg, MD, USA). Nachdem das Gel ausgehärtet war, wurden 50ml
gekochtes Auftragungsgel hinzugefügt, in welchem durch Einsatz eines
Kammes 20 Taschen für die Proben frei gelassen wurden. Über die gesamte
Masse wurden nun 200 ml Isolationsgel gegeben. Anschließend wurden die
gemischten Plasmaproben der Patienten im Verhältnis 1:2 mit Probenpuffer
verdünnt und jeweils 3µl in die vorgefertigten Taschen gegeben. (siehe Abb.
5) Nun wurde bis knapp unter den Gelrand Elektrodenpuffer eingefüllt und
die Elektrophorese mit einer Elektrodenspannung von 110V gestartet. Nach
ca. 10 Minuten waren die Proben weit genug in das Trenngel gewandert.
Nun wurde das gesamte Gel mit kaltem Elektrodenpuffer überschüttet und
über einen Kühlkreislauf durch eiskaltes Wasser geführt. Nachdem die
Proben, erkennbar an der blauen Front, nach ungefähr 60 Minuten circa
einen Zentimeter in das Trenngel gewandert waren, konnte die Spannung
auf 200V erhöht werden. Die gesamte Elektrophorese dauerte circa 3
Stunden.
22
Tabelle 4:
Benötigte Gels und Lösungen [86]
Trenngelpuffer
200mM Tris, 100mM Gylcin, 0,4%SDS w/v, pH 9,0
(ergibt sich spontan)
Trenngel
1,2% Agarose w/v mit niedriger Elektroendosmose in
Trenngelpuffer
Auftragsgelpuffer
70mM Tris, 0,4% SDS w/v, 4mM EDTA.Na2.2H2O, pH
6,7 mit HCl einstellen
Auftragsgel
0,8% Agarose w/v mit niedriger Elektroendosmose in
Auftragsgelpuffer
Isoliergel
1% Agarose w/v mit niedriger Elektroendosmose in
destilliertes Wasser
Elektrodenpuffer
200mM Tris, 200mM Glycine, 0,4% SDS w/v, pH 9,2
(ergibt sich spontan)
Probenpuffer
4,5ml Auftragsgelpuffer, 5,5 ml 87% Glycerol, 50 mg
Bromphenolblau
Blottingpuffer
(nach Towbin)
25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,1% SDS w/v, 20%
Methanol v/v pH 9,2 (ergibt sich spontan)
Phosphate buffe- 140 mM NaCl, 5 mM NaH2PO4, 1mM MgCl2, pH 7,4
red saline (PBS)
mit NaOH einstellen
PBS-BSA
PBS mit 1% w/v bovinem Serumalbumin, 0,1% w/v
NaN3
Färbelösung
100 mM Tris, 100 mM NaCl, 5mM MgCl2, 3 mM
Levamisol, pH 9,5 einstellen.
Direkt vor Gebrauch:
200µl 4-Nitroblau-Tetrazolium Lösung (100 mg/ml in
70% Dimethylfomamid) und 200µl 5-bromo-4chloro-3indolyl-phosphat
(50
mg/ml
in
100%
Dimethylfomamid) in 80ml der Grundlösung geben
23
Abbildung 5:
Aufbau der Gelelektorphorese (nach [86])
Im Anschluss an die Elektrophorese folgte das Blotting. Hierbei wurden die
Proteine auf eine Nitrozellulose-Membran übertragen (0,45µm, Protran BA
85, Whatman GmbH, Dassel, Germany). Die Nitrozellulose wurde auf das
Gel geklebt, indem ein noch flüssiges „Klebegel“ (0,8% Agarose w/v in 100ml
Trenngelpuffer) auf die Unterseite der gedrehten Gelplatten geschüttet und
sofort Nitrocellulose unter strenger Vermeidung von Luftblasen aufgedrückt
wurde (siehe Abb. 6).
Abbildung 6:
Vorbereitung zum Blotting (nach [86])
Nachdem das Gel ausgehärtet war, wurde die gesamte Platte für 25 Minuten
in Towbinpuffer + 70µl Mercaptoethanol eingelegt. Durch diesen Schritt
depolimerisiert der vWF, die großen Multimere lassen sich leichter auf die
24
Nitrozellulose übertragen [34]. Im Anschluss wurde die Gelplatte noch 5
Minuten in reinem Towbinpuffer inkubiert.
Sodann wurde die Gelplatte bei einer Spannung von 6V für 6 Stunden in das
Blottinggerät (Perfect Blue Web M, peqLab Biotechnologie GmbH, Erlangen,
Germany) eingelegt. Hierbei wurden die Proteine in die Nitrozellulose übertragen. Nach Ablauf der Zeit wurde die Nitrozellulose von der Agarosegelplatte abgezogen und für eine Stunde in eine Wanne mit PBS-BSA gelegt.
Nun war es wichtig, die verbliebenen Gelreste möglichst vollständig zu entfernen. Die Nitrozellulose wurde hierzu eine kurze Zeit in kochende 0,9%ige
NaCl-Lösung gegeben und anschließend mit heißer 0,9%iger NaCl-Lösung
abgewaschen. Nun folgte die Färbung. Zunächst wurde für circa ein bis zwei
Stunden mit Hase-Anti-Human-vWF-Antikörpern (Sigma, St. Louis, MO,
USA) inkubiert. Nach einer Waschung wurden mit alkalischer Phosphatase
konjugierte Anti-Hasen-IgG-Antikörper zugegeben, um die Anti-vWF-Antikörper zu markieren. Nach einer weiteren Waschung wurde die Färbelösung
zugegeben und so lange inkubiert, bis die vWF-Banden deutlich sichtbar
waren. Die so entstandenen Abbildungen wurden eingescannt und am
Computer mittels Software ausgewertet. (Phoretix 1D software, Version 10.4,
biostep, Jahnsdorf, Deutschland)
3.3
ADAMTS13-ELISA
Die Konzentrationsbestimmung der ADAMTS13 wurde mit dem „Imubind®
ADAMTS13-ELISA“
(Product
No.813,
American
diagnosica
GmbH,
Pfungstadt, Deutschland) nach Anleitung des Herstellers durchgeführt. Für
den Test wurde Blut in S-Monovetten® (Sarstedt AG & Co., Nürmbrecht,
Deutschland) abgenommen. Diese enthielten 0,5 ml Tri-Natriumcitratlösung
(0,106 M) und wurden mit 4,5 ml Blut aufgefüllt. Im Anschluss wurden die
Proben mit 10.000 x g für 15 Minuten scharf zentrifugiert. Sodann wurde das
Citratplasma abpipettiert und bis zur Testung tiefgefroren gelagert.
Durch die Anwendung eines ELISA (Enzyme Linked Immunoabsorbent
Assay) lassen sich sehr geringe Konzentrationen eines Stoffes nachweisen.
25
Dies geschieht auf Basis einer immunologischen Reaktion. Hierzu wird die
zu untersuchende Probe auf eine mit monoklonalen Fängerantikörpern
gegen ADAMTS13 beschichtete Mikrotiterplatte gegeben. Parallel hierzu wird
eine Standardlösung mit vorgegebener Konzentration von ADAMTS13
angesetzt. Durch mehrfache Verdünnung erhält man Proben mit 100 ng/ml,
50 ng/ml, 25 ng/ml, 12,5 ng/ml, 6,25 ng/ml und 3,12 ng/ml. Diese werden
ebenfalls in die Vertiefungen der Mikrotitterplatte gegeben, sowie reiner
Testpuffer ohne ADAMTS13 als Nullwert.
Die zu untersuchenden Plasmaproben werden mit einem Testpuffer im
Verhältnis 1 auf 20 verdünnt und in die Vertiefungen pipettiert. Dieser Ansatz
wird eine Stunde inkubiert. In dieser Zeit heftet sich vorhandene Protease
ADAMTS13 an die fest mit der Platte verbundenen Antikörper. Im Anschluss
wird das Plasma entfernt und die Platte gründlich gewaschen. ADAMTS13
haftet weiterhin an den Antikörpern auf der Platte.
Nun wird ein biotinylierter polyklonaler Kaninchen-Detektionsantikörper,
welcher ebenfalls gegen ADAMTS13 gerichtet ist, zugegeben. Während
einer 30 minütigen Inkubationszeit bindet der Antikörper an das an die Platte
gebundene ADAMTS13. Der Überstand wird wieder gründlich von der Platte
gewaschen. Übrig bleiben die an ADAMTS13 gebunden Detektionsantikörper. Anschließend wird der biotinylierte Zweitantikörper durch ein
Streptavidin – Meerrettichperoxidase- (SA-HRP-)Konjugat nachgewiesen.
Dieses bindet sich während einer weiteren 30-minütigen Inkubationsphase
an den Detektionsantikörper. Nach einem weiteren Waschschritt wird das
Substrat 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin Perborat (TMB) zugegeben. Dieses
wird durch die Meerrettichperoxidase umgesetzt, was zu einer Blaufärbung
führt. Dies geschieht sowohl bei den zu untersuchenden Plasmaproben als
auch bei den parallel untersuchten Standardproben mit den definierten
ADAMTS13-Konzentrationen. Durch Zugabe von Schwefelsäure wird die
Reaktion gestoppt und die Färbung schlägt von blau nach gelb um. Aus dem
Grad der Färbung lässt sich in einem Photometer durch Messung der
optischen Dichte bei 450 nm eine Standardkurve ermitteln, und so die
Konzentration von ADAMTS13 in den Proben bestimmen. Im Anschluss wird
die ermittelte Konzentration noch mit 20 multipliziert, um die vorher
26
durchgeführte Verdünnung herauszurechnen, und so die tatsächliche
Konzentration im Plasma zu erhalten.
3.4
Bestimmung des Von-Willebrand-Faktor-Antigens,
des Faktor VIII und des Ristocetin-Cofaktors
Die Messung des von-Willebrand-Faktor-Antigens, des Faktor VIII und des
Ristocetin-Cofaktors erfolgte im Labor der Transfusionsmedizinischen und
Hämostaseologischen Abteilung des Universitätsklinikums Erlangen.
Die
immunologische
erfolgte
mit
Bestimmung
Latexpartikeln
in
des
einem
von-Willebrand-Faktor-Antigens
so
genannten
Liatest
am
Gerinnungsautomaten STA (Fa. Roche Diagnostics GmbH, Mannheim).
Diese immunturbidimetrische Methode basiert auf der Agglutination von
Latexpartikeln, die mit einem polyklonalen Antikörper gegen humanen vWF
beschichtet sind. Die Agglutination der Latexpartikel in Abhängigkeit von der
Menge vorhandenen vWFs führt zu einer stärkeren Lichtstreuung, die als
Zunahme der optischen Dichte gemessen wird. Innerhalb des Messbereichs
ist die Änderung der optischen Dichte direkt dem Gehalt der Probe an vWFAntigen proportional.
Die Bestimmung des funktionell aktiven vWF als Ristocetin-Cofaktor erfolgte
am Gerinnungsautomaten BCS (Fa. Siemens, Erlangen). Der vWF in der
Untersuchungsprobe verursacht in Gegenwart des Antibiotikums Ristocetin
eine Agglutination der im Reagenz enthaltenen Thrombozyten. Die
ablaufende Agglutinatbildung vermindert die durch nicht agglutinierte
Thrombozyten bedingte Trübung des Reagenzes. Das Analysegerät misst
die Veränderung der optischen Dichte (OD) und bestimmt unter Bezug auf
eine
mit
verschiedenen
Verdünnungen
von
Normalplasma
erstellte
Bezugskurve automatisch die Ristocetin-Kofaktor-Aktivität der Probe in % der
Norm.
Die Bestimmung der Faktor-VIII-Aktivität erfolgt wie die Bestimmung der
Aktivitäten aller endogenen Gerinnungsfaktoren, also der Faktoren VIII, IX, XI
und XII anhand von Clotting-Tests am Gerinnungsautomaten STA-R (Fa.
27
Roche
Diagnotics
GmbH,
Mannheim).
Der
Mangel
jedes
dieser
Gerinnungsfaktoren des intrinsischen Systems führt zu einer verlängerten
partiellen Thromboplastinzeit (aPTT). Zur Einzelfaktorbestimmung wird die
aPTT einer Mischung des entsprechenden Mangelplasmas mit dem
Patientenplasma gemessen. Ein Patientenplasma, dem der entsprechende
Faktor fehlt, ist nicht in der Lage, die Abwesenheit dieses Faktors im
Mangelplasma auszugleichen. Es resultiert eine verlängerte aPTT. Die
Aktivität des Gerinnungsfaktors in % der Norm wird über eine Bezugskurve
ermittelt, die mit Verdünnungen von Standard-Humanplasma in Mischung mit
diesem
Mangelplasma
erstellt
wird.
Der
Verfahrensablauf
für
die
Untersuchung der endogenen Gerinnungsfaktoren VIII, IX, XI und XII ist im
Ablauf nahezu identisch. Die Untersuchungen entsprechen dem Prinzip der
aPTT- Bestimmung und werden mit den entsprechenden Mangelplasmen
durchgeführt. Die Kalibrierung erfolgt mit Standard-Human-Plasma (Fa.
Siemens, Erlangen).
3.5
Statistik
Die erhobenen Messwerte wurden in das Tabellenkalkulationsprogramm
Microsoft Office Excel 2010 für Windows eingegeben. Die statistische
Auswertung der Daten erfolgte mittels einer Analyse-Software für Windows
(PASW Statistics, Version 19, IBM® SPSS®; Chicago, IL, USA). Zuerst
wurden die Ergebnisse mit Hilfe des Shapiro-Wilk-Tests auf Normalverteilung
untersucht.
Waren
die
Werte
nicht
normalverteilt,
wurden
für
Gruppenvergleiche nichtparametrische Methoden angewendet und der
Vergleich der Mittelwerte erfolgte mit dem Mann-Whitney-U-Test. Ergab sich
aus den oben genannten Tests eine Normalverteilung der Werte in beiden zu
vergleichenden Gruppen, so wurde für den Vergleich der verschiedenen
Gruppen je nach Eignung der t-Test für verbundene bzw. unverbundene
Stichproben herangezogen. Die Korrelation zwischen zwei Variablen wurde
mit dem Pearson-Test überprüft. Als P-Wert zur Erkennung signifikanter
Gruppenunterschiede
festgelegt.
bzw.
signifikanter
Korrelationen
wurde
p<0,05
28
4 Ergebnisse
4.1.
Vergleich zwischen den UICC-Stadien
Zur Untersuchung der Frage, ob sich die Aktivität von vWF, Faktor VIII und
Ristocetin-Cofaktor in Abhängigkeit vom UICC-Stadium verändert, wurden in
der vorliegenden Arbeit Daten von 126 Patienten ausgewertet. 30 von ihnen
befanden sich im Tumorstadium I nach UICC, 36 im Tumorstadium II, 33 im
Stadium III und 25 hatten einen metastasierten Tumor und somit Stadium IV.
Bei allen Patienten wurde die Aktivität des von-Willebrand-Faktors, des
Faktor VIII und des Ristocetin-Cofaktors untersucht. Die Konzentration der
Metalloprotease
ADAMTS13
wurde
bei
47
Patienten
aus
diesem
Gesamtkollektiv untersucht.
Des Weiteren wurde bei jeweils 9 Patienten der einzelnen UICC-Stadien,
also insgesamt bei 36 Patienten die aufwendige Multimerenanalyse des vWF
durchgeführt.
4.1.1 Faktor VIII
Die Konzentration des Faktor VIII war in den Tumorstadien 2, 3 und 4 nach
UICC signifikant höher als im frühen, wenig fortgeschrittenen Tumorstadium
1. Am höchsten lagen Mittelwert und Medianwert der gemessenen FaktorVIII-Spiegel im UICC-Stadium 4. Allerdings waren die Unterschiede
zwischen den UICC-Stadien 2, 3 und 4 nicht signifikant (siehe Tab. 5).
29
Tabelle 5:
Faktor-VIII-Aktivität in [%] in den jeweiligen UICC Stadien
UICC 1
UICC 2
§ || ¶
‡
‡
‡
126
30
36
33
25
166,14
138,63
175,47
166,03
186,0
Median
158,5
129,00
160,50
161,00
202,0
Standardabweichung
60,64
44,98
68,1
44,38
74,18
Minimum
56
56
67
91
78
Maximum
420
250
410
258
420
Faktor VIII
Gesamt
N
Mittelwert
UICC 3 UICC 4
‡ = Signifikant zu Stadium 1
§ = Signifikant zu Stadium 2
|| = Signifikant zu Stadium 3
¶ = Signifikant zu Stadium 4
Abbildung 7:
Mittelwerte der Faktor-VIII-Aktivität in den
unterschiedlichen Tumorstadien nach UICC
30
4.1.2 Von-Willebrand-Faktor
Die Aktivität des von-Willebrand-Faktors steigt tendenziell mit fortschreitendem Tumorstadium. Die höchsten Mittel- und Medianwerte fanden sich im
Stadium IV, die niedrigsten im Stadium I. Die Unterschiede waren aber nicht
signifikant (siehe Tab. 6).
Tabelle 6: von-Willebrand-Faktor-Aktivität in [%] in den vier UICC-Stadien
Von-WillebrandFaktor
Gesamt
UICC 1
UICC 2
UICC 3
UICC 4
126
30
36
33
25
Mittelwert
166,32
152,77
170,31
163,12
182,20
Median
159,50
143,00
164,00
161,00
173,00
62,22
57,57
68,29
47,51
74,89
Minimum
57
66
57
81
68
Maximum
405
293
405
289
367
N
Standardabweichung
Abbildung 8:
Mittelwert der von-Willebrand-Faktor Aktivität in den
unterschiedlichen Tumorstadien nach UICC
31
4.1.3 Ristocetin-Cofaktor
Auch der Ristocetin-Cofaktor lag in fortgeschrittenen UICC-Stadien höher,
am höchsten im Stadium IV. Allerdings war hier die Standardabweichung der
Messwerte relativ groß. Deshalb waren die Unterschiede der RistocetinCofaktor-Aktivität nur zwischen den UICC- Stadien I und II sowie I und III
signifikant (siehe Tab. 7).
Tabelle 7:
Ristocetin-Cofaktor-Aktivität in [%] in den vier UICC-Stadien
Ristocetin-CofaktorAktivität
Gesamt
UICC 1
§ ||
UICC 2
‡
UICC 3
‡
UICC 4
126
30
36
33
25
145,4
126,60
148,00
152,18
154,80
119,50
106,50
124,00
141,00
123,00
64,95
58,71
63,10
55,13
84,97
Minimum
48
48
61
82
70
Maximum
427
299
320
299
427
N
Mittelwert
Median
Standardabweichung
‡ = Signifikant zu Stadium 1
§ = Signifikant zu Stadium 2
|| = Signifikant zu Stadium 3
¶ = Signifikant zu Stadium 4
Ristocetin-Cofaktor in [%]
200
190
180
170
160
150
140
130
120
110
100
Gesamt
Abbildung 9:
UICC 1
UICC 2
UICC 3
UICC 4
Mittelwert der Ristocetin-Cofaktor-Aktivität in den
unterschiedlichen Tumorstadien nach UICC
32
4.1.3 ADAMTS13
Die gemessenen Konzentrationen der Protease ADAMTS13 zeigten in allen
vier UICC-Stadien zeigte eine relativ große Spannbreite sowie eine hohe
Standardabweichung. Signifikante Unterschiede zwischen den einzelnen
Stadien fanden sich nicht (siehe Tab. 8).
Tabelle 8:
ADAMTS13-Konzentrationen [ng/ml] in den vier UICC-Stadien
ADAMTS13
Gesamt
UICC 1
UICC 2
UICC 3
UICC 4
47
15
11
9
11
Mittelwert
841,11
964,76
765,29
895,52
745,71
Median
814,14
921,46
711,40
995,48
809,86
Standardabweichung
313,52
342,15
347,90
280,17
203,08
Minimum
239,22
466,12
239,22
346,54
395,60
Maximum
1628,0
1628,0
1460,9
1191,98
1036,44
N
Abbildung 10:
Mittelwert der ADAMTS13-Konzentrationen
in den unterschiedlichen Tumorstadien nach UICC
33
4.2
Korrelation der vWF- und der Faktor-VIII-Aktivität zu Werten
des Blutbilds
Da bei Patienten mit kolorektalem Karzinom verschiedene Veränderungen im
Blutbild wie Thrombozytose, Leukozytose oder Tumoranämie vorkommen,
wurde der Zusammenhang zwischen Faktor VIII, vWF, Ristocetin-Cofaktor
und den Werten des Blutbildes untersucht. Die Faktor-VIII-Spiegel und der
immunologisch bestimmte vWF sind positiv mit Leukozytenzahl und
Thrombozytenzahl korreliert und negativ mit Erythrozytenzahl, Hämoglobin
und Hämatokrit, also positiv mit Anämiezeichen. Allerdings ist der
Zusammenhang schwach.
Tabelle 9:
Korrelation zwischen Faktor VIII, vWF und Ristocetin-Cofaktor
(RiCoF) und Werten des Blutbildes
Leukozyten
Faktor VIII
vWF
RiCoF
Korrelation
nach Pearson
0,276
0,193
0,064
p-Wert
0,002
0,030
0,480
126
126
126
-0,244
-0,209
-0,139
0,006
0,019
0,120
126
126
126
Korrelation
nach Pearson
0,305
0,019
-0,083
p-Wert
0,001
0,829
0,357
126
126
126
-0,329
-0,247
-0,023
0,000
0,005
0,794
126
126
126
-0,302
-0,239
-0,038
0,001
0,007
0,674
126
126
126
N
Erythrozyten
Korrelation
nach Pearson
p-Wert
N
Thrombozyten
N
Hämoglobin
Korrelation
nach Pearson
p-Wert
N
Hämatokrit
Korrelation
nach Pearson
p-Wert
N
34
4.3
Korrelation der vWF- und der Faktor-VIII-Aktivität zum
ADAMTS13-Spiegel
Die Konzentration von ADAMTS13 zeigt keinerlei signifikanten Zusammenhang zur Aktivität des vWF oder des Gerinnungsfaktors VIII. (Tab. 10)
Tabelle 10:
Korrelation zwischen Faktor VIII, vWF und RistocetinCofaktor (RiCoF) und der ADAMTS13
ADAMTS13
Faktor VIII
vWF
RiCoF
-0,086
-0,012
-0,240
0,565
0,937
0,105
47
47
47
Korrelation
nach Pearson
p-Wert
N
4.4
Multimerenanalyse
Bei jedem Lauf der Gelelektrophorese des von-Willebrand-Faktors treten
verfahrensbedingt Schwankungen im Aussehen der Banden auf. Dies liegt
unter anderem an immer etwas unterschiedlicher Gelbeschaffenheit, Unterschieden in der Laufdauer und unterschiedlicher Anfärbbarkeit der Banden.
Dies macht den Nachweis kleiner Unterschiede der Multimerenverteilung
schwierig. Daher wurden verschiedene Möglichkeiten getestet, um möglichst
gute Vergleichbarkeit zu ermöglichen. Als die beste Möglichkeit stellte es
sich heraus, die Proben mehrerer Patienten vor dem Lauf zu mischen und so
die Patienten im gleichen Tumorstadium nach UICC auf physikalischem
Wege zu mitteln. Deshalb wurden jeweils gleiche Plasmamengen von 9
verschieden Patienten gleichen Tumorstadiums gemischt. Die so gepoolten
Proben wurden zusammen mit einer Standardprobe eines gesunden
Probanden auf die 20 Taschen des Gelelektrophoresegerätes verteilt.
Hieraus ergibt sich, dass jede Probe 4-mal untersucht wurde und so weitere
Schwankungen eliminiert werden konnten.
Die einzelnen Banden wurden mit dem Programm „Phoretix 1D Software
Version 10.4“ (biostep, Jahnsdorf, Deutschland) analysiert. Bande eins bis
vier wurden aufgrund der starken Artefakte nicht berücksichtigt (Abb. 11).
35
In den einzelnen Läufen wurden die unterschiedlich großen Multimere
markiert und die Stärke ihrer Färbung gemessen. Pro Stadium eigneten sich
3 Einzelläufe zur Auswertung.
4.4.1 Gerinnungsanalysen bei den Patienten der Multimerenanalyse
Da die Untersuchung der von-Willebrand-Faktor-Multimere nicht bei allen
Patienten vorgenommen wurde, sondern nur an einer Gruppe von jeweils 9
zufällig
ausgewählten
Patienten
pro
UICC-Stadium,
wurden
die
Konzentrationen der unterschiedlichen Faktoren erneut aus den bekannten
Werten berechnet.
Faktor VIII
Die
Konzentration
von
Faktor
VIII
in
der
Gruppe
der
für
die
Gelelektrophorese genutzten Patienten war ähnlich wie im Gesamtkollektiv.
Es ließ sich wiederum eine Tendenz zu höheren Werten mit steigendem
Tumorstadium feststellen, die Unterschiede zwischen den vier UICC-Stadien
waren allerdings nicht signifikant.
Tabelle 11: Faktor-VIII-Aktivität in % in den unterschiedlichen UICC-Stadien
bei den für die Gelelektrophorese verwendeten Patienten.
Faktor VIII
Gesamt
UICC I
UICC II
UICC III
UICC IV
36
9
9
9
9
Mittelwert
147,75
124,78
152,89
151,22
162,11
Median
138,00
125,00
137,00
154,00
140,00
Standardabweichung
45,698
44,319
44,815
38,774
52,833
Minimum
56
56
100
91
96
Maximum
261
208
242
234
261
N
36
Von-Willebrand-Faktor
Die Konzentration des vWF war im Stadium IV deutlich höher als bei
Patienten im Stadium I. Stadium II und III hatten ähnlich hohe Werte, welche
zwischen Stadium I und IV lagen. Signifikant war aber keiner der Unterschiede.
Tabelle 12: von-Willebrand-Faktor Aktivität in % in den unterschiedlichen
UICC Stadien bei den für die Gelelektrophorese verwendeten Patienten.
Von-WillebrandFaktor
Gesamt
UICC I
UICC II
UICC III
UICC IV
36
9
9
9
9
Mittelwert
165,06
151,11
166,33
165,00
177,78
Median
154,00
137,00
149,00
174,00
206,00
Standardabweichung
54,835
57,460
59,605
40,209
65,433
Minimum
66
66
101
94
80
Maximum
267
257
267
229
248
N
Ristocetin-Cofaktor
Wie bei den anderen Faktoren war die Aktivität des Ristocetin-Cofaktors im
Stadium IV höher als in den anderen Stadien. Auch hier war der Unterschied
allerdings nicht signifikant.
Tabelle 13: Ristocetin-Cofaktor Aktivität in % in den unterschiedlichen UICC
Stadien bei den für die Gelelektrophorese verwendeten Patienten.
Ristocetin-Cofaktor
Gesamt
UICC I
UICC II
UICC III
UICC
IV
36
9
9
9
9
112,81
100,89
102,89
121,11
126,33
98,00
96,00
96,00
112,00
98,00
42,143
34,556
16,647
42,859
62,516
Minimum
48
48
82
82
72
Maximum
279
180
140
217
279
N
Mittelwert
Median
Standardabweichung
37
ADAMTS13
Bei der ADAMTS13 war die Konzentration im UICC Stadium I am höchsten.
Allerdings war die Standardabweichung recht groß, die Unterschiede
zwischen den UICC-Stadien waren nicht signifikant.
Tabelle 14: ADAMTS13 Konzentration in ng/ml in den unterschiedlichen
UICC Stadien bei den für die Gelelektrophorese verwendeten Patienten.
ADAMTS13
Gesamt
UICC I
UICC II
UICC III
UICC
IV
36
9
9
9
9
841,5708
928,137
782,65
895,52
759,98
818,74
921,46
711,40
995,48
809,86
297,2148
322,80
382,48
280,17
185,46
Minimum
239,22
466,12
239,22
346,54
395,60
Maximum
1535,7
1535,7
1460,9
N
Mittelwert
Median
Standardabweichung
1191,98 1036,44
4.4.2 Elektrophorese-Abbildungen
Die Multimerenanalyse wurde eingescannt und die einzelnen Banden wurden
markiert und nach Intensität der Färbung ausgewertet. Hieraus ließen sich
Rückschlüsse auf die Verteilung der einzelnen Multimerengrößen ziehen.
Von jedem Stadium eigneten sich 3 Einzelläufe zur Auswertung. (Abb. 11)
Die einzelnen Banden der Multimerenanalyse wurden nun getrennt voneinander mit Hilfe der Software ausgewertet, indem die Intensität der Färbung
gemessen wurde. Aufgrund starker Artefakte konnten die Banden 1 bis 5
nicht zur Auswertung herangezogen werden. Somit blieben 3 Einzelläufe pro
UICC-Stadium, welche untereinander verglichen werden konnten. Hierbei
zeigten sich keine gravierenden Unterschiede zwischen den einzelnen
Läufen und keine Unterschiede zwischen den unterschiedlichen Stadien.
Somit liegt bei den untersuchten Patienten keine Veränderung der
Multimerverteilung des von-Willebrand-Faktors vor. (Abb. 12 – Abb. 23).
38
Bande 1*
Stadium 1
Bande 2*
Stadium 2
Bande 3*
Stadium 3
Bande 4*
Stadium 4
Bande 5*
Standard
Bande 6
Stadium 1
Bande 7
Stadium 2
Bande 8
Stadium 3
Bande 9
Stadium 4
Bande 10
Standard
Bande 11
Stadium 1
Bande 12
Stadium 2
Bande 13
Stadium 3
Bande 14
Stadium 4
Bande 15
Standard
Bande 16
Stadium 1
Bande 17
Stadium 2
Bande 18
Stadium 3
Bande 19
Stadium 4
Bande 20
Standard
Abbildung 11: Eingescannte Multimerenanalyse mit Beschriftung der
Banden *=aufgrund starker Artefakte nicht zur Auswertung geeignet.
39
UICC Stadium I:
Abbildung 12:
Analyse der von-Willebrand-Faktor Multimere im
UICC Stadium I, Bande 6
Abbildung 13:
Analyse der von-Willebrand-Faktor Multimere im
UICC Stadium I, Bande 11
40
Abbildung 14:
Analyse der von-Willebrand-Faktor Multimere im
UICC Stadium I, Bande 16
UICC Stadium II:
Abbildung 15: Analyse der von-Willebrand-Faktor Multimere im UICC
Stadium II, Bande 7
41
Abbildung 16: Analyse der von-Willebrand-Faktor Multimere im UICC
Stadium II, Bande 12
Abbildung 17: Analyse der von-Willebrand-Faktor Multimere im UICC
Stadium II, Bande 17
42
UICC Stadium III:
Abbildung 18: Analyse der von-Willebrand-Faktor Multimere im UICC
Stadium III, Bande 8
Abbildung 19: Analyse der von-Willebrand-Faktor Multimere im UICC
Stadium III, Bande 13
43
Abbildung 20: Analyse der von-Willebrand-Faktor Multimere im UICC
Stadium III, Bande 18
UICC Stadium IV:
Abbildung 21: Analyse der von-Willebrand-Faktor Multimere im UICC
Stadium IV, Bande 9
44
Abbildung 22: Analyse der von-Willebrand-Faktor Multimere im UICC
Stadium IV, Bande 14
Abbildung 23: Analyse der von-Willebrand-Faktor Multimere im UICC
Stadium IV, Bande 19
45
Zur besseren Übersicht und Vergleichbarkeit wurden jeweils ein Lauf der
unterschiedlichen Stadien, sowie ein Kontrolllauf, in demselben Bild
aufgetragen (Abb. 24). Hierbei zeigt sich besonders deutlich, dass
hinsichtlich der Multimerenverteilung keine Unterschiede zwischen den
Probenpools mit Plasma von je 9 Patienten eines jeden der vier UICCStadien des kolorektalen Karzinoms bestehen.
Abbildung 24:
Zusammenfassung der Multimerenanalysen der
verschiedenen Tumorstadien
46
5
Diskussion
Die Konzentration, Aktivität und Multimerenverteilung des von-WillebrandFaktors bei Patienten mit kolorektalem Karzinom ist seit längerer Zeit
Gegenstand der Forschung. Die Ergebnisse sind jedoch zum Teil
widersprüchlich. Damin et al. beschrieben im Jahr 2002, dass die Plasmakonzentration des vWF bei Patienten mit kolorektalem Karzinom höher ist als
bei gesunden Patienten [15]. Auch das Tumorstadium nach Dukes habe
einen Einfluss auf die Konzentration des vWF. Patienten mit Fernmetastasen
hatten in dieser Arbeit die höchsten vWF-Werte. Wang et al. schlugen auf
der Basis gleicher Befunde 2005 vor, die Plasmakonzentration des vWF als
Prognoseparameter zu verwenden [85]. In einer ersten kleineren Fallserie
aus dem Universitätsklinikum Erlangen wurde wie von Danin et al. und Wang
et al. auch gesehen, dass Patienten mit kolorektalen Karzinomen höhere
Plasmakonzentrationen des vWF und des Faktor VIII aufweisen [65,66].
Allerdings beeinflussen Begleitkrankheiten, Alter und die AB0-Blutgruppe
diese Laborwerte, so dass zwar Aussagen über Patientenkollektive getroffen
werden können, der Einzelwert beim individuellen Patienten dagegen schwer
zu interpretieren ist [26,54]. Vor diesem Hintergrund ist eine Wiederholung
der Untersuchung mit größeren Fallzahlen sinnvoll.
Auch bei anderen fortgeschrittenen Tumoren, zum Beispiel Prostata-, Zervixund Ovarialkarzinomen sowie Tumoren des Hals-Nasen-Ohren-Bereichs
wurden erhöhte Aktivitäten des vWF beschrieben [5]. Lediglich bei etlichen
Fällen mit fortgeschritten Bronchialkarzinom fanden sich nicht erhöhte, sondern im Gegenteil deutlich erniedrigte Plasmakonzentrationen des vWF [45].
Bei den in die vorliegende Arbeit eingeschlossenen 126 Patienten mit
kolorektalen Karzinomen konnte erneut gezeigt werden, dass der vWF mit
fortschreitendem Tumorstadium tendenziell ansteigt. Bei Patienten im
Stadium I nach UICC betrug der vWF durchschnittlich im Mittel 153 %, im
Stadium II 170 %, in Stadium III 163 % und im Stadium IV 182 %. Statistisch
signifikant waren diese Unterschiede allerdings nicht. Besonders zu
beachten ist, dass die gemessene Variabilität des vWF sehr hoch war. So
47
fanden wir den höchsten in dieser Fallserie gemessenen vWF-Wert von 405
% bei einem Patienten im UICC-Stadium 2. Der niedrigste gemessene Wert
bei Patinten im UICC-Stadium IV lag bei 68 %, den niedrigsten in der ganzen
Fallserie gemessenen vWF-Wert gab es mit 57% ebenfalls in einem Fall im
UICC-Stadium 2. Da der vWF ein Akut-Phase-Protein ist und eine so
ausgeprägte interindividuelle Bandbreite der Konzentration besteht, scheint
der vWF als Prognosemarker oder als Screeningparameter für Patienten mit
kolorektalem Karzinom nicht geeignet.
Die Untersuchung des Faktor VIII zeigte ebenfalls in den fortgeschritteneren
Tumorstadien tendenziell höhere Werte. Die Aktivität des Faktor VIII betrug
im Mittel 139 % im Stadium I nach UICC, 175 % im Stadium II, 166 % im
Stadium III und 186 % im Stadium IV. Des Weiteren fand sich der niedrigste
insgesamt gemessene Wert mit 56% im Stadium I, der höchste insgesamt
gemessene Wert mit 420% im Stadium IV. Allerdings fanden sich auch im
Stadium II mit 410 % sehr hohe Werte sowie im Stadium IV mit 78% recht
niedrige Werte. Faktor VIII zeigt somit einen etwas engeren Zusammenhang
zum Tumorstadium als der von-Willebrand-Faktor. Von einer anderen
Arbeitsgruppe konnte ebenfalls gezeigt werden, dass die Konzentration von
Faktor VIII bei Patienten mit kolorektalem Karzinom erhöht ist [3]. Eine
Aufschlüsselung nach Tumorstadium fand dort aber nicht statt.
Die Messung des Ristocetin-Cofaktors, also die indirekte Aktivitätsmessung
des von-Willebrand-Faktors, zeigte ebenfalls eine Tendenz zu höheren
Werten in höheren Tumorstadien, allerdings war auch diese nicht signifikant.
Im Stadium I betrug der mittlere Ristocetin-Cofaktor 127 %, im Stadium II 148
%, im Stadium III 152 % und im Stadium IV 155 %. Die höchste
Konzentration wurde mit 427 % bei einem Patienten im Stadium IV
gemessen, die niedrigste Konzentration mit 48% bei einem Patienten im
Stadium I.
Aufgrund der großen Streubreite der Werte und dem Vorkommen von
niedrigen Werten in fortgeschrittenen Stadien des kolorektalen Karzinoms
und hohen Werten in niedrigen Stadien ist die Verwendung als Screeningoder Prognoseparameter für den einzelnen Patienten sehr kritisch zu sehen.
48
Allerdings sollte bei hohen Werten an das Vorhandensein von Tumoren
gedacht werden.
In der vorliegenden Untersuchung wurden die Plasmakonzentrationen der
genannten Faktoren vor Beginn einer Therapie gemessen. Bekannt ist, dass
die Operation eines kolorektalen Karzinoms zu einem signifikanten Anstieg
des vWF führt, was typisch ist für ein Akut-Phase-Protein [25]. Ob
Polychemotherapie die Plasmakonzentrationen des vWF erhöht oder im
Gegenteil erniedrigt, ist völlig unklar. Beides ist beschrieben worden [25,33].
Erschwert werden Aussagen über die mögliche klinische Bedeutung erhöhter
Plasmakonzentrationen des vWF oder des Gerinnungsfaktors VIII auch noch
von unterschiedlichen Normbereichsangaben der Labors, auf die sich der
Kliniker natürlich zu beziehen hat. So finden sich zum Beispiel bei Damin et
al. in allen Stadien des kolorektalen Karzinoms wesentlich höhere Mittelwerte
der vWF-Plasmakonzentration [15]. Diese sind allerdings sehr kritisch zu
sehen, da in der gleichen Arbeit die mittlere vWF-Plasmakonzentration bei 87
Kontrollpersonen, als welche gesunde Blutspender fungierten, mit 150,2 ±
58,1 U/dl angegeben wird. Das ist aber Unsinn, da die Untersuchung von
Normalpersonen den Normalwert der vWF-Plasmakonzentration des Labors
ergeben müsste, also in etwa 1 U/ml oder 100 U/dl. Vor dem Hintergrund
solcher Bezugsfehler ist es doppelt kritisch, wie Wang et al. vorzuschlagen,
vWF-Plasmaspiegel über 160 % als prognostisch ungünstig bei kolorektalem
Karzinom zu werten [85].
Eine Analyse des Multimerenmusters bei maligenen Erkrankungen fand
bisher nur bei wenigen Patienten beziehungsweise an kleinen Fallserien statt
[6,40,43,55]. Bei vielen Erkrankungen wie dem erworbenen vWS oder der
thrombotisch-thrombozytopenischen Purpura (TTP) kommt es zu Veränderungen der Verteilung der Multimere des von-Willebrand-Faktors [69].
Erworbene Formen des vWS können auf Autoantikörper zurückgehen, die
maligne immunkompetente Zellen bilden. Andere erworbene Formen
zeichnen sich durch eine Verminderung schwerer vWF-Multimere aus.
Adsorption dieser großen Multimere an Tumorzellen ist hierbei der
angenommene pathophysiologische Mechanismus [38]. Sollte bei einem
49
erworbenen vWS mit Verlust großer Multimere allerdings auch eine
Veränderung der ADAMTS13 eine Rolle spielen, so müsste diese
Metalloprotease tendenziell erhöht sein.
Bei der thrombotisch-thrombozytopenischen Purpura (TTP) sind dagegen
ultragroße Multimere des vWF vermehrt vorhanden, weil die Aktivität der
diese spaltenden Protease ADAMTS13 stark vermindert ist.
Die wenigen Berichte über Multimerenanalysen und ADAMTS13-Messungen
ergeben hier kein klares Bild. Zum Teil werden verminderte große vWFMultimere und erniedrigte ADAMTS13-Spiegel bei denselben Patienten
gefunden [40]. In einer anderen kleinen Serie wurde, was konsistenter ist,
eine Erhöhung der großen vWF-Multimere bei erniedrigter ADAMTS13
gefunden [43]. In einer weiteren Studie bei Patienten mit Hirn- und ProstataTumoren wurde eine reduzierte Aktivität der ADAMTS13 beschrieben, die
aber nicht mit erhöhten großen vWF-Multimeren assoziiert war [6]. Typische
Fallberichte eines erworbenen VWS mit Blutungsneigung und Assoziation zu
einem kolorektalen Karzinom sind dagegen gar nicht beschrieben.
Viele dieser vorangegangenen Studien weisen methodische Schwächen auf,
da nie eine tatsächliche Konzentration der ADAMTS13 gemessen wurde,
sondern nur aufgrund von Gelelektrophoresen oder anderer Methoden
indirekte Rückschlüsse auf die ADAMTS13-Aktivität gezogen wurden
[6,40,43]. In der aktuellen Studie wurde die Konzentration von ADAMTS13
mittels ELISA direkt bestimmt. Die ADAMTS13-Konzentration in Citratplasma
von 49 Normalspendern betrug bei Verwendung des in der vorliegenden
Studie eingesetzten Elisa-Verfahrens nach nicht publizierten Angaben des
Herstellers American Diagnostika 740 ± 110 ng/mL. Im Vergleich dazu
fanden wir eine nicht bis gering erhöhte Gesamtkonzentration der
ADAMTS13 in verschiedenen Tumorstadien. Am höchsten war sie im
Stadium I nach UICC mit durchschnittlich 965 ng/ml. Im Stadium II betrug die
mittlere Konzentration 765 ng/ml, im Stadium III 896 ng/ml und im Stadium IV
746 ng/ml. Signifikant waren diese Unterschiede nicht, und es ist auch nicht
anzunehmen, dass die geringe Erhöhung gegenüber Gesunden klinisch von
Bedeutung ist.
50
Wie bei den anderen untersuchten Parametern sind die interindividuellen
Unterschiede der ADAMTS13-Werte innerhalb der vier UICC-Stadien
wesentlich größer als die Unterschiede der Mittelwerte zwischen den UICCGruppen. Wir fanden ADAMTS13-Konzentrationen mit einer Spannweite im
von 466 ng/ml bis 1628 ng/ml im Stadium I und zwischen 396 ng/ml und
1036 ng/ml im Stadium IV.
Bei Patienten mit malignen Erkrankungen sind nicht nur quantitative, sondern
auch qualitative Veränderungen des vWF beschrieben, wie bereits
ausgeführt. In der Studie von Koo et al. findet sich aber nur ein einziger
Patient mit einem kolorektalen Karzinom [40]. Bei ihm zeigte sich eine
geringe Verminderung der großen vWF-Multimere. Eine systematische
Untersuchung der vWF-Multimere bei einer größeren Serie von Patienten mit
kolorektalen Tumoren fehlt bisher.
Die Beschreibungen einzelner Fälle sind nur wenig hilfreich. Des Weiteren
sind einzelne Läufe der Gelelektrophorese des von-Willebrand-Faktors sehr
heterogen und machen den Vergleich zwischen verschiedenen Läufen nur
schwer möglich. Dieses methodische Problem wurde in der vorliegenden
Arbeit innovativ durch das Mischen von jeweils gleichvolumigen Plasmaaliquots von 9 Patienten im selben UICC-Stadium behoben. Dies ermöglichte
einen optimalen Vergleich zwischen Proben der verschiedenen UICCStadien, da alle Proben in demselben Lauf untersucht werden konnten.
Hierbei konnten keine stadienabhängigen Veränderungen der Multimerenverteilung beobachtet werden. Der direkte Vergleich in einem einzigen
Diagramm zeigte, dass die Darstellung der Färbeintensität in allen Stadien
parallel verlief. Dies zeigt, dass die Verteilung der Multimere sowohl
zwischen den einzelnen UICC Stadien sowie im Vergleich zu einer gesunden
Referenzperson keinerlei ungewöhnliche Merkmale aufweist. Insbesondere
das Auftreten von sehr schweren Multimeren hätte mit dieser Methode gut
nachgewiesen werden können, da diese sich so gut von den restlichen
Banden
abgehoben
hätten.
Schwächen
zeigt
die
Mischung
der
Patientenproben eventuell im Nachweis von geringen Veränderungen bei
einzelnen Patienten, da diese durch Mittelung der Ergebnisse ausgeglichen
51
werden.
Allerdings
gab
es
hierfür
in
den
parallel
durchgeführten
Untersuchungen der Einzelplasmen keine Hinweise.
Zusammenfassend ließ sich bestätigen, dass die Plasmakonzentrationen des
von-Willebrand-Faktors und auch des Gerinnungsfaktors VIII bei Patienten
mit kolorektalen Karzinomen erhöht sind. Das Ausmaß der Erhöhung
korreliert jedoch nicht mit dem Stadium der Erkrankung und ist beim
individuellen Patienten nicht für prognostische Aussagen verwendbar.
Darüber hinaus ist die erhöhte vWF-Konzentration nicht mit einer Änderung
der vWF-Multimeren-Verteilung bei kolorektalem Karzinom assoziiert.
Schließlich ist das kolorektale Karzinom auch keine Tumorentität, bei der
sich Zeichen eines erworbenen von-Willenbrand-Syndroms finden. Bei
dauerhaft erhöhter Plasmakonzentration des von-Willebrand-Faktors und
auch des Gerinnungsfaktors VIII sollte differentialdiagnostisch auch an ein
malignen Geschehens gedacht werden. Speziellen Vorhersagewert im
Screening auf kolorektale Karzinome oder im Staging bei diagnostiziertem
kolorektalem Karzinom haben aber weder der vWF, der Faktor VIII oder der
Ristocetin-Cofaktor noch die Metalloprotease ADAMTS13. Und eine
Multimerenanalyse bringt bei kolorektalen Karzinomen keine relevante
Zusatzinformation.
52
6
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7
Abkürzungsverzeichnis
ADAMTS13:
A disintegrin-like and-metalloprotease with thrombospondin
type 1 motif 13
APC-Gen:
Adenomatous-polyposis-coli Gen
CTAD:
Zitrat/Theophyllin/Adenosin/Dipyridamol
DNS:
Desoxyribonukleinsäure
ELISA:
Enzyme-linked Immunosorbent Assay
FAP:
Familiäre adenomatöse Polyposis
FOBT:
fäkaler okkulter Bluttest
HNPCC:
Hereditäres nicht-polypöses kolorektales Karzinom
IGF:
Insulin Like Growth Faktor
UICC:
Union internationale contre le cancer
KRK:
kolorektales Karzinom
PDGF:
Platelet-Derived Growth Factor
TGF:
Transforming Growth Factor
TNM:
Tumor, Node (Lymphknoten), Metastasen
TTP:
Thrombotisch-thrombozytopenische Purpura
VEGF:
Vascular Endothelial Growth Factor
vWF:
von-Willebrand-Faktor
vWS:
von-Willebrand-Syndrom
64
8
Verzeichnis der Vorveröffentlichungen
1.
Weiss DR, Eiche C, Hupke C, Schellerer VS, Keller AK, Strasser EF,
Ringwald J, Zimmermann R, Eckstein R. The structure of the vonWillebrand factor is not altered in patients with colorectal carcinoma.
Colorectal Dis. 2012 Apr 16. doi: 10.1111/j.1463-1318.2012.03049.x.
[Epub ahead of print]
2.
Weiss DR, Eiche C, Hupke C, Schellerer V, Zimmermann R, Eckstein
R. Von-Willebrand-factor elevation and multimeric pattern in colorectal
carcinoma do not significantly correlate with UICC stage. 54. Jahreskongress der Gesellschaft für Thrombose- und Hämostaseforschung
(GTH) Wiesbaden, 2011. Abstract in: Hämostaseologie 2011; 31(1):
A67
65
9
Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Zimmermann für die Bereitstellung
des Themas sowie die wertvolle Unterstützung während der gesamten Zeit
der Arbeit. Herrn Prof. Eckstein danke ich dafür, dass ich diese Arbeit in
seiner Abteilung durchführen durfte.
Frau Dr. Schellerer danke ich für die Organisation der Blutentnahmen sowie
die Aufklärung der Patienten, Herrn Prof. Dr. Dr. h.c. Hohenberger für die Erlaubnis, Patienten seiner Klinik zu untersuchen.
Herrn Dr. Weiss danke ich für die Einarbeitung in die Gelelektrophorese zur
Auftrennung und Analyse der Multimere des von-Willebrand-Faktors sowie
die Zusammenarbeit bei der Erstellung der Publikation.
Insbesondere bedanken möchte ich mich bei den Patienten, welche sich
bereiterklärt haben, trotz ihrer schweren Erkrankung an dieser Studie mitzuwirken.
Ebenfalls danke ich allen Mitarbeitern der Transfusionsmedizinischen und
Hämostaseologischen Abteilung, insbesondere den medizinisch-technischen
Laborangestellten, die immer ein offenes Ohr für Fragen zur Gelelektrophorese oder zu den ELISAs hatten und mit kompetentem Rat zur Seite standen.