Untersuchung des Mechanismus der Denaturierung

Bd. 325 (1961)
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Untersuchung des Mechanismus der Denaturierung
und Renaturierung von löslichem Kollagen
mit der Lichtstreuungsmethode
Von
Jürgen Engel
Aus dem Max-Planck-Institut für Eiweiß- und Lederforschung, München
(Der Schriftleitung zugegangen am 10. August 1961)
Das native Monomere des löslichen Kollagens hat durch seine Struktur, eine
aus drei Helices bestehenden Tripelhelix1, in Lösungen die Form eines verhältnismäßig starren Stäbchens mit einer Länge von etwa 3000 Ä, einem Durchmesser
von etwa 14 A und einem Molekulargewicht von etwa 350000 (s. 1. c.2).
Denaturier ung
Bei der Wärmedenaturierung zerfällt der größte Teil der Moleküle in je eine
a- und ^-Komponente vom Molekulargewicht 115000 ± 10% und 215000 ± 10%.
Etwa jedes 13. Molekül denaturiert in eine sogenannte y-Komponente, die ungefähr
das gleiche Molekulargewicht wie das native Molekül hat3. Die hohe Asymmetrie
des nativen Moleküls ist jedoch völlig verlorengegangen und alle drei Komponenten
liegen in Form fast kugelsymmetrischer, statistischer Knäuel vor.
Doty und Nishihara 2 postulieren aus der etwa gleichschnellen Abnahme
der optischen Drehung und der Viskositätszahl von sauer extrahiertem Kollagen
in 0,15wi Cit/ratpuffer vom pH 3,7 bei 35° einen Einstufenprozeß für die Denaturierung, indem das Molekül gleichzeitig mit dem Zusammenbruch seiner Struktur in
drei Komponenten zerfallen soll.
Wir haben diese Annahme mit der Methode der Lichtstreuung geprüft, die
uns an jedem Punkt der Kinetik sowohl das Gewichtsmittel des Molekulargewichts
(abnehmend von 350000 bis 190000) wie auch in der Anfangsneigung der Winkelabhängigkeit (tg a) der Aufbragung nach Z im m 4 ein Maß für die Länge der Moleküle
lieferte. Der tg nahm im Laufe einer Denaturierung von 9 · 10~e bis 0,5 · 10" ab.
Wir fanden bei verschiedenen Temperaturen, daß das Achsenverhältnis der Moleküle immer viel rascher abnimmt als das Molekulargewicht. So ist z. B. bei 39° der
tg bereits nach 5 Min. auf den Endwert gefallen. Das Gewichtsmittel des Molekulargewichtes beträgt nach 60 Min. noch 200000.
Die Denaturierung ist demnach ein Zweistufenprozeß:
1. Das Molekül bricht zu einem Gebilde zusammen, welches sich wie ein
statistisches Knäuel verhält, in dem die einzelnen Peptidketten aber noch
irgendwie verbunden sind.
2. In einer zweiten, langsameren Reaktion zerfällt diese Zwischenstufe in die
Komponenten.
1
A. Rieh u. F. H. C. Crick in G. Stainsby, Recent Advances in Gelatine
and Glue Research, S. 20, Pergamon Press, London 1958.
2
P. Doty u. T. Nishihara, ebenda, S. 92.
3
W. Graßmann, K. Hannig u. J. Engel, diese Z. 324, 284 [1961].
4
B. H. Zimm, J. ehem. Physics 16, 1093 [1948].
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288 Denaturierung und Renaturierung von löslichem Kollagen
Bd. 325 (1961J
Renaturierung
Es ist bekannt, daß die optische Drehung6und die Viskosität denaturierter
Lösungen in der Kälte langsam wieder ansteigen . Uns interessierte, ob sich dabei.,
wie von verschiedenen Autoren angenommen, wenigstens zu einem gewissen Prozentsatz native Moleküle zurückbilden. Wir konnten jedoch mit Hilfe der Lichtstreuung feststellen, daß ein Anteil von zumindest 95% nicht mehr in die
ursprüngliche native Form übergeführt werden kann.
Dafür sprechen folgende Punkte:
1. Der tg a, der selbst auf sehr wenige Teilchen hoher Asymmetrie sehr empfindlich ist, steigt nur wenig an.
2. Das Gewichtsmittel des Molekulargewichtes läuft nicht in einen konstanten
Wert ein, der dem Molekulargewicht des nativen Materials gleich oder
kleiner als dieses sein müßte, sondern wächst in Abhängigkeit von der
Konzentration weit darüber hinaus. Ein analoges Verhalten zeigt die Viskosität. Daß sich diese durch die Staudinger-Gleichung [ ] = K · M01
mit ^ 0,8 mit dem Molekulargewicht verbinden läßt, bedeutet, daß die
Moleküle während der Zunahme von Mw ihre Gestalt nicht wesentlich
ändern.
3. Bei der Denaturierung von „renaturiertem" Material setzt die Abnahme
der Viskositätszahl nicht wie beim nativen Material sehr scharf bei einer
bestimmten Temperatur ein, sondern verläuft über einen Temperaturbereich von etwa 30° stetig.
Diese Ergebnisse deuten ein mehr oder weniger statistisches Zusammenfinden
der Einzelketten an, wobei die Zunahme der optischen Drehung anzeigt, daß teilweise die Helixkonfiguration zurückgebildet wird. Eventuell bilden sich sogar kurze
Stücke der Tripelhelix zurück.
Summary
The heat denaturation of soluble Collagen and its "renaturation"5 were
followed by the light diffraction method. Denaturation occurs in two stages. At
least 95% of the product after "renaturation" is not identical with the original native
collagen.
Dr. Jürgen Engel, Max-Planck-Institut für Eiweiß- und Lederforschung,
München 15, Schillerstr. 46.
6
W. F. Harrington u. P. fit. v. Hippel, Arch. Biochem. Biophysics 92,
109 [1961].
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