Überexpression des Sonic Hedgehog

Überexpression des Sonic Hedgehog Signaltransduktionswegs in Plattenepithelkarzinomen des Kopf‐Hals‐Bereichs DISSERTATION zur Erlangung des akademischen Grades Dr. med. an der Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig eingereicht von: Kamelia Dimitrova Geburtsdatum / Geburtsort: 29.07.1985 / Sofia angefertigt am: Universitätsklinikum Leipzig AöR, Klinik und Poliklinik für Hals‐, Nasen‐, Ohrenheilkunde Direktor: Prof. Dr. med. Andreas Dietz Betreuer: Prof. Dr. med. Andreas Dietz Dr. med. Christian Mozet Dr. rer. nat. Gunnar Wichmann Beschluss über die Verleihung des Doktorgrades vom: 27.01.2015 Inhaltsverzeichnis
Titelblatt
Inhaltsverzeichnis………………………………………………………………………………………………………………….I
Bibliografische Zusammenfassung………………………………………………………………………………………..II
1. Einführung………………………………………………………………………………………………………………………1
1.1. Kopf-Hals-Tumoren………………………………………………………………………………………………….1
1.1.1. Epidemiologie, Risikofaktoren und Prognose der HNSCC…………………….…………1
1.1.2. Therapieoptionen bei HNSCC…………………………………………………………………………3
1.1.3. Zusammenfassung und Aussicht ……………………………………………………………………5
1.2. Hh-Signaltransduktionsweg……………………………………………………………………………………..7
1.2.1. Entdeckung……………………………………………………………………………………………………7
1.2.2. Funktionsprinzip…………………………………………………………………………………………….7
1.2.3. Rolle des Hh-Signaltransduktiosweges in der Embryogenese…………………………9
1.2.4. Hh-Signaltransduktionsweg im adulten Organismus…………………………………….10
1.2.5. Tumorstammzellen und Hh-Signaltransduktionsweg in verschiedenen
Tu-
morentitäten…………………………………………………………………………………………..………11
1.3. Literaturverzeichnis……………………………………………………………………………………………….12
2. Publikation, formatiert………………………………………………………………………………………………….15
3. Zusammenfassung der Ergebnisse und Ausblick……………………………………………………………24
4. Zusammenfassung……………………..…………………………………………………………………………………25
Selbstständigkeitserklärung………………………………………………………………………………………………..29
Lebenslauf………………………………………………………………………………………………………………………….30
Danksagung………………………………………………………………………………………………………………………..31
Bibliografische Beschreibung
Dimitrova, Kamelia
Titel der Arbeit
Überexpression des Sonic Hedgehog Signaltransduktionswegs in Plattenepithelkarzinomen
des Kopf-Hals-Bereichs
Universität Leipzig, Publikationspromotion
38 S., 59 Lit. (Einleitung), 39 Lit. (Publikation), 3 Abb. (Einleitung), 7 Abb. (Publikation), 1 Tab.
(Einleitung), 1 Tab. (Publikation)
Referat
In der vorliegenden Arbeit wurde die Expression des Hedgehog Signaltransduktionsweges
(Hh) in Kopf-Hals-Tumoren (Head and Neck Squamous Cell Carcinoma, HNSCC) im Vergleich
zu gesunder Mukosa immunhistochemisch untersucht und quantitativ analysiert. Dabei
wurde die Expressionsstärke mit Hilfe einer eigens weiterentwickelten objektiven Auswertungsmethode analysiert, die sich auf die Rot-Grün-Blau(RGB)-Farblehre stützte. Untersucht
wurden histologisch gesicherte Proben von Kopf-Hals-Tumoren und gesunde Mukosa der
Mundhöhle. Nach Färbung mittels spezifischen Immunfluoreszenzantikörpern gegen die
Hedgehog Komponenten Sonic Hedgehog (SHH), Patched-1 (PTCH1), Patched-2 (PTCH2),
Smoothened (SMO), Glioma-Associated Oncogene Homolog-1, -2 und -3 (Gli-1, Gli-2 und Gli3) erfolgte die bildanalytische Auswertung der Fluoreszenzsignale. Dabei zeigte sich eine
deutliche Überexpression aller Hh-Komponenten in den Tumorproben gegenüber der gesunden Mukosa. Die Expression des Transkriptionsfaktors Gli-1 erreichte dabei etwa zehnfach höhere Werte als in der Mukosa und die des Liganden SHH etwa vierfach höhere Werte. Die nachgewiesene Überexpression des Hh-Signalwegs in den Tumorproben deuten wir
als potentiellen Kofaktor in der Genese von Kopf-Hals-Tumoren. Eine mögliche Bedeutung
für neue zielgerichtete Therapieansätze in der Zukunft wird diskutiert.
1. Einführung
1.1. Kopf-Hals-Tumoren
Die Kopf-Hals-Tumoren gehören zu den 10 häufigsten Tumorentitäten mit der weltweit
höchsten Mortalitätsrate. Im Jahr 2004 wurden knapp eine halbe Million Neuerkrankungen
und knapp 350 000 Sterbefälle gemeldet 1. Bei über 90% der Tumore handelt es sich um
Plattenepithelkarzinome (Head and Neck Squamous Cell Carcinoma, HNSCC).
1.1.1. Epidemiologie, Risikofaktoren und Prognose der HNSCC
Laut Angaben des Robert-Koch-Institut (RKI) waren 2008 in Deutschland von insgesamt
469 800 Tumorneuerkrankungen 17 130 Tumoren der Mundhöhle, des Rachens oder des
Kehlkopfes. Im gleichen Jahr wurden 9 066 Sterbefälle an den genannten Tumorerkrankungen registriert, was 52,9% aller erfassten Neuerkrankungen ausmacht.
Die durchschnittliche absolute 5-Jahres-Überlebensrate in Deutschland liegt laut Untersuchungen des RKI aktuell bei ca. 55% für maligne Erkrankungen im Kehlkopf- und bei ca.
48% im Mund-Rachen-Bereich (Daten für 2012). In Abhängigkeit von den verschiedenen
anatomischen Lokalisationen des Primärtumors bestehen jedoch große Unterschiede bezüglich der Überlebensraten. Zum Beispiel werden Tumoren im Bereich des Hypopharynx
relativ spät symptomatisch und verursachen eher unspezifische Beschwerden, weshalb die
Erstdiagnose bzw. der Therapiebeginn häufig erst in fortgeschrittenen Tumorstadien mit
bereits vorhandener Metastasierung erfolgen. Die 5-Jahres-Überlebensrate beträgt in solchen Fällen nur ca. 20% 2. Im Gegensatz dazu liegen die Überlebensraten bei den
Nasopharynx- und Larynxkarzinomen bei 55% bzw. 90%. Die klinischen Symptome in diesen
Tumorlokalisationen treten häufig früher auf, was oft zu einem zeitigen Arztkontakt und
somit zur früheren Diagnosestellung führt.
Trotzdem sind bei Erstdiagnose 10% aller HNSCC bereits metastasiert und mehr als 60% im
Union for International Cancer Control (UICC-) Stadium III/IV weit fortgeschritten. 50-60%
davon erleiden innerhalb von 24 Monate nach Primärtherapie ein Rezidiv. Die durchschnittliche Überlebenszeit im palliativen Rezidivfall wird auf 6-10 Monate geschätzt.
Hauptrisikofaktoren2,3 für die HNSCC sind Tabak- und Alkoholkonsum. Als weitere Risikofaktoren2,3 für bestimmte Subtypen von Kopf-Hals-Tumoren gelten schlechte Mundhygiene,
virale Infektionen (v.a. Ebstein-Bar-Virus (EBV), Humanes Papillomavirus (HPV, v.a. 16 und
18) 4,5, Herpes Simplex Virus (HSV), Humanes Immundefizienz-Virus (HIV)), Zement-, Holz-,
Textil- und Asbeststäube sowie polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe 6. Andererseits scheint der regelmäßige Konsum von Obst, Milch und Salat eine tumorprotektive
Wirkung zu haben 7.
Neben dem Nikotin- und Alkoholkonsum sind die HPV immer mehr als bedeutsamer Risikofaktor v.a. für die Entstehung von oropharyngealen Karzinomen angesehen, bei denen eine
Prävalenz von ca. 22% und eine bessere Ansprechrate auf Chemo- oder Radiochemotherapie als bei den HPV-negativ Tumoren beschrieben ist 8. Da es sich im wesentlichen um die
gleichen HPV-Subtypen handelt wie bei den Cervixkarzinomen, sind diese aktuell Gegenstand intensiver Untersuchungen auch in Hinsicht auf mögliche Behandlungs- bzw. Präventionsoptionen.
Inwieweit eine genetische Prädisposition bei der Tumorentstehung und -progression eine
zusätzliche Rolle spielt, ist bis dato nicht bekannt. Man geht aber von einer interindividuell
sehr unterschiedlichen Suszeptibilität aus, wobei die Tumorentstehung als multifaktorieller
Prozess angesehen wird, bei dem auch die Aktivierung von tumorspezifischen
Signaltransduktionswegen eine entscheidende Rolle spielt. Derzeit werden eine Reihe solcher Signaltransduktionswege untersucht. Ihre Fehlregulation scheint sowohl bei Kopf-HalsTumoren als auch bei anderen Tumorentitäten einen wesentlichen Einfluss auf die Tumorentstehung und -entwicklung zu haben. Deshalb stehen diese Signaltransduktionswege als
potentielle Möglichkeit für eine targeted therapy (gezielte Therapie) im Fokus aktueller Untersuchungen. Dabei spielt der EGFR- (epidermal growth fachtor receptor) Signaltransduktionsweg eine entscheidende Rolle als Beispiel für den ersten Signaltransduktionsweg, dessen erhöhte Expression mit der Karzinogenese deutlich assoziiert ist und dessen Blockade
mit dem selektiven Antikörper Cetuximab bereits eine tumorsuppressive Wirkung zeigen
konnten. Damit dient die Cetuximab-Zulassung für die Onkotherapie als vielversprechendes
Vorbild für die Weiterentwicklung im Forschungsbereich der targeted therapy 9.
1.1.2. Therapieoptionen der Primärtherapie bei HNSCC
Derzeit bestehen bei der Behandlung von HNSCC drei Therapieoptionen, die alleine oder in
Kombination angewendet werden: die chirurgische Resektion, die Radiatio und die Chemotherapie. Die Präferenz für die einzelnen Behandlungsregime ist unter anderem auch von
kontinentalen Unterschieden geprägt. Trotz großer Fortschritte sowohl in den chirurgischen
Techniken als auch in der Präzision der Radiotherapie und der raschen Weiterentwicklung
der Chemotherapie haben sich die Überlebensraten bei den Patienten mit Kopf-HalsMalignomen in den letzten Jahren nicht wesentlich verbessert.
Zwei Drittel aller Plattenepithelkarzinome sind zu Behandlungsbeginn bereits in einem fortgeschrittenen Stadium mit zervikalen Lymphknoten(LK-)-Metastasen, so dass die Patienten
meistens komplexe kombinierte Therapieansätze benötigen. Mit der Detektion der spezifischen
Tumorbiologie werden die Therapieoptionen zunehmend präziser und zielgerichteter, was
eine Therapieplanung in Zusammenarbeit von Chirurgen, Pathologen, Strahlentherapeuten
und Onkologen erfordert.
Behandlungsstrategie Grundtherapie
I
Operation
II
III
Primäre Radiochemotherapie
Induktionschemotherapie
IV
Monoklonaler-AK-Therapie
Tabelle 1: Therapiemöglichkeiten bei HNSCC3
Kombinationsmöglichkeiten
+ adjuvante Radiotherapie
+ adjuvante Radiochemotherapie
+ ggf. Salvage-Operation
+ Operation
+ Radiotherapie
+ Radiochemotherapie
+ Radiotherapie
+ Radiochemotherapie
Die derzeit gängigsten Therapiemodelle unter Berücksichtigung von Tumorstadium,
Allgemeinzustand, Begleiterkrankungen und Alter des Patienten sind in Tabelle 1
zusammengefasst. Angestrebt wird eine chirurgische Tumorresektion mit Sicherheitsabstand und ggf. eine Neck Dissektion zur Entfernung von zervikalen LK-Metastasen (Tabelle
1, Behandlungsstrategie I). Vor allem in den frühen Tumorstadien (I und II nach UICC) werden hierdurch funktionelle Störungen durch Spätkomplikationen der Radiotherapie vermieden und ähnliche Erfolgsraten erzielt 10. Im fortgeschrittenen Stadium wird die operative
Behandlung jedoch oft durch zusätzliche Radio- und/oder Chemotherapie ergänzt. Die
Indikationen hierfür sind im Wesentlichen der Resektionsabstand und der Lymphknotenstatus, wobei die Frage nach dem Kapseldurchbruch ein wichtiges Kriterium für eine
adjuvante Behandlung darstellt.2,3
Bei der Behandlung fortgeschrittener Tumorstadien (III und IV nach UICC) werden prinzipiell
multimodale Therapieansätze gewählt (Tabelle 1, Behandlungsstrategie I, II, III). Derzeit
existiert leider noch kein standardisiertes Vorgehen bei der Auswahl der Therapie. Viele
neue Therapiemodelle werden in großen klinischen Studien zur Outcome-Verbesserung
11
untersucht. Die Entscheidung über die Zuteilung eines Patienten in einen Behandlungsarm
wird individuell für jeden Patienten im Rahmen großer Tumorboards getroffen. Daran sind
HNO-Chirurgen, Onkologen und Strahlenterapeuten, aber auch andere Spezialisten, beteiligt. Die Entscheidung berücksichtigt auch die Vor- und Nachteile für den Patienten (funktionelle, ästhetische und ggf. auch soziale Einschränkungen bedingt durch z.B. ein permanentes Tracheostoma, Dysphagie oder eine schlechte Sprachqualität), welche vorgängig mit ihm
besprochen werden.3,12.
Die Radiatio als Monotherapie, welche lange Zeit der Standard für nicht operative Behandlung bei Risikopatienten gewesen ist, wurde von einer kombinierten Radiochemotherapie
abgelöst. Diese scheint einer Induktionschemotherapie überlegen zu sein und spielt v.a. bei
organerhaltender Therapie von Larynxmalignomen früheren Stadiums eine wesentliche Rolle. Auch als postoperative adjuvante Behandlung bei lokal fortgeschrittenen Tumoren hat
sich
v.a.
die
kombinierte
simultane
Radiochemotherapie
mit
signifikant
besseren Ergebnissen gegenüber der alleinigen Bestrahlung oder der Induktionschemotherapie bewährt. Darunter sinkt das lokoregionäre Rückfallrisiko (LRR) und es kommt zu
einer besseren 5-Jahresüberlebensrate (5-JÜR). Die am häufigsten benutzten Zytostatika bei
der neoadjuvanten, adjuvanten und palliativen Chemotherapie sind Cisplatin, Carboplatin,
5-Fluorouracil, Methotrexat und Bleomycin3. Zunehmend werden auch Taxane (Docetaxel
bzw. Paclitaxel) eingesetzt.2,3
Bei all diesen Therapieoptionen ist auch mit Nebenwirkungen wie die Spättoxizität (Lymphödem, Neuropathie, Fibrose der Halsweichteile, Trockenheit der Schleimhäute 13) zu
rechnen, welche ihr Maximum erst bis zwei Jahre nach der Therapie erreichen können.
Zusätzlich entwickeln mehr als 60% der Patienten mit HNSCC in fortgeschrittenen Stadien
lokoregionäre Rezidive und/oder Fernmetastasen 14, die meist nicht mehr kurativ anzugehen
sind. In solchen Fällen werden meist die alleinige Chemotherapie oder Chemotherapiekombinationen angewandt. Obwohl diese meist verbreiterte Therapieoptionen Unterschiede in den lokalen Ansprechraten zeigen, wurde insgesamt keine Verlängerung des
Gesamtüberlebens erreicht. 15
Durch die Erkenntnisse aus molekularbiologischen Untersuchungen kamen in jüngster Zeit
zu den bewährten Behandlungsstrategien auch gezielte Antikörpertherapien zum Einsatz.
Die EGF-Rezeptor-Inhibition mit Cetuximab simultan zu einer Chemotherapie mit Platin und
5-Fluoruracil (5-FU) zeigte zum ersten Mal eine signifikante Verlängerung des Gesamtüberlebens von ca. 3 Monaten bei Rezidiv- und metastasierten HNSCC (EXTREME-Studie), so dass
die European Society of Medical Oncoloy (ESMO) inzwischen diese Kombination als FirstlineRezidivtherapie auf Grund einer signifikanten Lebensverlängerung als Standard empfiehlt .
1.1.3. Zusammenfassung und Aussicht
Die initial vielversprechenden Neuentwicklungen bei der Behandlung von HNSCC sowohl im
Bereich der chirurgischen Techniken als auch im Bereich der Radiochemotherapie haben
leider zu keiner wesentlichen Verlängerung der 5-JÜR geführt. Besonders schlecht ist die
Prognose in Rezidivfällen (ca. 6-12 Monate) oder bei metastasierten Leiden geblieben. Es
werden neue Substanzen benötigt, die einerseits eine genauere, gezieltere Therapie mit
Einfluss auf das Gesamtüberleben erlauben und andererseits einen ärmeres Toxizitätsprofil
besitzen. Aus diesem Grund hat sich die onkologische Forschung in letzter Zeit zunehmend
der Untersuchung der Tumorbiologie gewidmet. In den letzten dreißig Jahren wurden viele
onkogene Signaltrasduktionswege aufgedeckt (siehe Abb. 1), die in der Tumorentstehung
und -entwicklung bedeutend zu sein scheinen. Deren selektive Blockade wird als targeted
therapy bezeichnet.
Ein erstes positives Beispiel dieser Bemühungen ist der EGFR-Antikörper Cefuximab, der
bereits auch bei HNSCC erste positive Ergebnisse mit einer signifikanten Verlängerung der
5-JÜR bei Rezidiv-HNSCC gezeigt hat, so dass die Kombinationstherapie mit Platin und 5-FU
inzwischen als first-line-Therapie empfohlen wird.
Dennoch besteht der Bedarf an weiteren potenten Angriffspunkten in der TumorSignaltransduktion, insbesondere für Fälle, die bereits mit Cetuximab behandelt worden
sind oder unter dieser Therapie eine Progression zeigen, so dass bei ihnen eine CetuximabResistenz zu vermutet ist.
Einen potentiellen Angriffspunkt einer zielgerichteten Tumortherapie scheint der Sonic
Hedghog
(Hh-) Signaltransduktionsweg zu bieten. Nach den neuen wissenschaftlichen
Erkenntnissen kommt diesem Signalweg eine große Bedeutung bei der Entstehung und
Entwicklung solider Tumoren wie z.B. des Basalzellkarzinoms zu, bei dem inzwischen ein
erster Hh-Antikörper die Zulassung für die Therapie metastasierter Leiden erlangt hat.
Außerdem scheint die Cetuximab-Resistenz in HNSCC in Zusammenhang mit einer höheren
Expression vom Hh-Transkriptionsfaktor Gli-1 zu sein. 16
In diesem Zusammenhang stellt sich die Frage, ob die Hh-Signalwegkomponenten auch in
HNSCC exprimiert werden und ob deren Blockade Einfluss auf das Tumorwachstum haben
könnte.
Abb. 1: Onkogene Signaltrasduktionswege in verschiedenen Tumorentitäten 17
1.2.
Hh-Signaltransduktionsweg
Der Hh-Signaltransduktionsweg ist einer der wichtigsten Signalwege mit entscheidendem
Einfluss auf die Gewebedifferenzierung und die Zellproliferation und somit auf die Morphogenese von Zellverbänden. Neben dem Wingless-related integration site (Wnt-) und Notches
(Notch-) spielt der Hh-Signaltransduktionsweg eine ausschlaggebende Rolle in der
Embryonalentwicklung 18,19. Der Hh-Signalweg vermittelt seine Effekte über den Liganden
Sonic Hedgehog (SHH), der für den Signalweg auch namensgebend ist. Störungen in den
Signalabläufen durch Mutation oder Blockade der einzelnen Komponenten führen zu schweren morphologischen Missbildungen sowohl bei Insekten als auch bei Wirbeltieren.
1.2.1. Entdeckung
Der Hh-Signaltransduktionsweg wurde erstmals 1978 von den beiden Nobelpreisträgern Dr.
Christiane Nüsslein-Volhard und Dr. Eric Wieschaus in der Fruchtfliege Drosophila
melanogaster entdeckt und beschrieben 20. Sie fanden heraus, dass Mutationen im Hh-Gen
zu einer abnormalen Form der Fliegenlarven führten, die im Vergleich zu den Wildtyplarven
kürzer, dicker und mit einer Art „Stachel“ bedeckt waren. Da dieses Erscheinungsbild der
fehlgebildeten Larven an die Comic-Figur Sonic the Hegdehog des gleichnamigen SEGASpiels erinnerte, wurde diese Figur auch namensgebend für den Liganden und den gesamten Signaltransduktionsweg.
In nachfolgenden Studien konnte gezeigt werden, dass sowohl SHH als auch seine homologen Liganden Indian Hegdehog (IHH) und Dessert Hegdehog (DHH) einen intrazellulären
Weg verschlüsseln, der eine kritische Rolle nicht nur in der Embryogenese sondern auch in
der Regulation von Stammzellen und der Homöostase im adulten Organismus spielt.
1.2.2. Funktionsprinzip
Bei Säugetieren und damit auch beim Menschen konnten drei Homologen des Liganden
(Sonic Hedgehog – SHH, Indian Hedgehog – IHH und Dessert Hedgehog - DHH) nachgewiesen
werden, wobei SHH die herausragende Rolle spielen soll 21.
Vermittelt
werden
die
extrazellulären
Signale
über
einen
Twelve-pass-
Transmembranrezeptor (PTCH1 oder PTCH2), der nach Bindung des Liganden internalisiert
wird und den nachgeschalteten Seven-pass-, G-Protein gekoppelten Transmembranrezeptor
(SMO) enthemmt 22. (Normalerweise wird SMO durch PTCH in Abwesenheit von SHH
gehemmt.) Daraufhin wird das intrazelluläre Ende vom SMO phosphoryliert 23 und bewirkt
die Aktivierung des eigentlichen Transkriptionsfaktors Gli.
Das Rezeptorprotein PTCH liegt bei Säugetieren in zwei Formen (PTCH1 und PTCH2) vor, die
54% Strukturgleichheit und identische Ligandenaffinität 24 zeigen, aber in den verschiedenen
Gewebetypen unterschiedlich stark exprimiert werden 25. Der Transkriptionsfaktor Gli ist ein
Zinkfinger-Transkriptionsfaktor, der in drei Isoformen (Gli-1, -2 und -3) vorkommt, die wahrscheinlich überlappende Funktionen 26 haben und nach Übertritt in den Zellkern die Transkription an den Promotoren ihrer Zielgene bewirken können.
Neben diesem Haupttransduktionsweg werden auch Kurzschlüsse zwischen den einzelnen
Komponenten
vermutet
(z.B.
zwischen
PTCH1
bzw.
PTCH2
und
den
Gli-
Transduktionsfaktoren), die bis jetzt noch nicht vollkommen entschlüsselt sind. Die Transkriptionsfaktoren regulieren dann im Zellkern die Transkription der Hh-Zielgene, die
vornehmlich die Zelldifferenzierung und Proliferation beeinflussen.
Abb. 2: Hh-Signaltransduktionsweg
1.2.3. Rolle des Hh-Signaltransduktionswegs in der Embryogenese
In der embryonalen Entwicklung ist der Hh-Signaltransduktionsweg sowohl für die regelrechte Proliferation und Differenzierung von Stammzellen als auch für die Entstehung der
Achsensymmetrie und für die Entwicklung der meisten Organsysteme verantwortlich.
SHH wird während der frühen Embryogenese von der Chorda und der Bodenplatte des
Neuralrohres gebildet. Seine Expression spielt schon in der 3. Entwicklungswoche eine
wichtige Rolle bei der Links-Rechts-Achsenbestimmung. Während der Embryonalperiode hat
er Einfluss auf die segmentale Gliederung des Körpers und auf die Bildung von Sklerotomen
aus den Somiten, aus denen Knorpel und Knochen der Wirbelsäule und des Achsenskeletts
gebildet werden. Über der ZPA (Zone mit polarisierender Aktivität) nimmt er auch an der
Musterbildung entlang der anteroposterioren Achse der Extremitäten teil. Auch bei der
Muskelentwicklung ist dem Hh-Signalweg eine partielle Rolle zuzuschreiben. Zusätzlich trägt
er über die Stimulation der Expression von VEGF (vascular endothelial growth factor) auch
wesentlich zur Gefäßbildung und -spezifizierung bei. Bei der Entstehung und Differenzierung
der unterschiedlichen Abschnitte des Magen-Darm-Traktes spielt er eine entscheidende
Rolle. Außerdem fällt dem Hh-Signaltransduktionsweg bei der Entstehung der Organe aus
der zweiten und dritten Schlundtasche (Gaumenmandel, Fossa tonsillaris, Thymus,
Gll. parathyroideae) eine besonders wichtige Rolle zu. Bei der Differenzierung des Rückenmarks, bei der Entstehung des Dienzephalons und bei der Regulation der Gehirn- und
Augenentwicklung ist seine Beteiligung auch zu erwähnen.27
Entsprechend seiner multiplen Funktionen kommt es bei Störungen des Hh-Signaltransduktionswegs während der Embryogenese zu schwerwiegenden Folgen wie z.B. die
Holoprosenzephalie, Anenzephalie oder Cyclopie (siehe Abb. 3, b), anorektale Fehlbildungen
(Analatresie, Analstenose, Rektumatresie, Anal- oder anorektale Agenesie), Greig-Syndrom
(Zephalopolysyndaktylie-Syndrom), Pallister-Hall-Syndrom (zentrale oder postaxiale Polydaktylie) und andere Fehlbildungen von Gesicht, Hirn und Extremitäten.28
Solche Störungen wurden zuerst bei Pflanzenfressern beobachtet, welche die giftige Pflanze
Veratrum californicum (siehe auch Abb. 3, a) gefressen haben. Aus dieser wurde der erste
und bekannteste natürlich vorkommende Hh-Antagonist, Cyclopamin 28 isoliert. Cyclopamin
ist ein steroidales Alkaloid mit stark teratogener Wirkung. Benannt wurde es nach der am
häufigsten beobachteten Missbildung, Cyclopie, die bei den Jungen von Huftieren auftritt,
welche während der Tragezeit diese Pflanze gefressen haben (siehe auch Abb. 3, b). Der
Stoff hemmt das zweite Transmembranprotein in der Hh-Signalkette (SMO) in dem er das
Protein zuerst zur Zellmembran lenkt und dort durch seine Alkaloidstruktur hemmt. Ähnliche Erscheinungen sind bei Mutationen und/oder sonstigen Dysregulationen des
Signaltransduktionswegs auch bei humanen Embryonen zu finden.
Beispiele für synthetische Hh-Antagonisten sind SANT-1 und -2 29,30 und GDC-0449
(Vismodegib)31 als SMO-Inhibitoren oder GANT-61 32,33 als Gli-1-Inhibitor.
a)
b)
Abb. 3: a) Veratrum californicum 34; b) Cyclopie 35
1.2.4. Hh-Signaltransduktionsweg im adulten Organismus
Nach Vollendung der Entwicklung wird der Hh-Signaltransduktionsweg im gesunden ausdifferenzierten Gewebe in der Regel inaktiviert. In gewissen Organen bleibt er jedoch aktiv
und reguliert somit die Aufrechterhaltung der Stammzellpopulationen 36,37,38, das
Gewebsselbsterneuerungspotential 39,40,41,42 und den Zellzyklus 43,44,45.
Eine Reaktivierung des Signaltransduktionswegs oder Mutation bzw. Überexpression
einzelner oder mehrerer seiner Komponenten kann zu einer gestörten Funktion der Stammzellen mit Dysregulation der Zellproliferation und zu einer inadäquaten Regulation des Zellzyklus führen. Dies hat eine ungeordnete Zellteilung zur Folge. Diese Folgen einer gestörten
Regulation des Hh-Signaltransduktionswegs entsprechen den Grundeigenschaften solider
Tumoren. Dies lässt die Vermutung zu, dass eine Dysregulation des Signalwegs im adulten
Gewebe auch bei der Tumorentstehung und -entwicklung eine wesentliche Rolle spielt.
1.2.5. Tumorstammzellen und Hh-Signaltransduktionsweg in verschiedenen Tumorentitäten
In soliden Tumoren sind mehrere histologisch und immunologisch differenzierbare Zellpopulationen zu finden. Dennoch werden diese in Bezug zur klinischen Behandlung als
einheitlicher Zellverband betrachtet, in dem alle Tumorzellen gleichermaßen zum Wachstum des Tumors beitragen. Dementsprechend werden Zytostatika und anderen zytotoxische
Substanzen eingesetzt, welche die schnell proliferierenden Tumorzellen angreifen sollen. Bei
Ansprechen auf diese Therapieart kommt es meistens rasch zu einer Remission mit
Volumenreduktion des Tumors, welcher nicht mehr in der Bildgebung nachgewiesen
werden kann. Trotz dieses beeindruckenden Effektes kommt es oft zu Rezidiven und
Metastasierung der Tumoren, die dann meist resistent gegen die zuvor angewandten Therapeutika sind. Dies lässt sich durch die Existenz von Tumorzellen mit besonderen Eigenschaften erklären, welche das Überleben unter der gängigen Behandlung ermöglichen.
In vielen soliden Tumoren, insbesondere in therapieresistenten Fällen, wurde die deutlich
erhöhte Expression von Komponenten ontogenetisch früh auftretender Signaltransduktionswege bereits beschrieben. Zu diesen in der frühen Embryogenese wichtigen Signalwegen gehört auch der Hh-Signaltransduktionsweg. Er wurde bereits als wesentlicher Faktor
bei der Entstehung vieler Tumorentitäten identifiziert.
In
Pankreaskarzinomen 46,47,
Magenkarzinomen 52,
Prostatakarzinomen 48,49,50,
Lungenkarzinomen 53,
Mammakarzinomen51,
Leberkarzinomen 54,
Hautkarzinomen 55,
Medulloblastomen und Rhabdomyosarkomen konnte die Überexpression der Komponenten
des
Hh-Signaltransduktionswegs bereits nachgewiesen werden. Zusätzlich gelang es, die Entstehung von Basalzellkarzinomen in Hh-exprimierenden Mausmodellen und transgener
humaner
Haut
zu
induzieren 56,57.
Dies
bestätigt
die
wichtige
Rolle
des
Hh-Signaltransduktionswegs nicht nur in der Embryogenese, sondern auch in der Tumorentstehung- und Entwicklung. Für die Therapie von fortgeschrittenen inoperablen Basalzellkarzinomen ist Vismodegib seit Januar 2012 als erster Hh-(SMO-)Inhibitor, in den USA
zugelassen (in Europa seit 07/2013) und zeigt viel versprechende Ergebnisse bei guter
Patientenverträglichkeit 58. Gemäß aktueller Literatur kann Vismodegib die Zellvermehrung
selbst in Cisplatin-resistenten Lungenkarzinomen inhibieren 59. Solche Resistenzen stellen
v.a. auch bei Rezidiv-HNSSC ein Therapieproblem dar.
Durch die Erkenntnisse und dem Nachweis der Bedeutung des Hh-Signalwegs in einer Reihe
von soliden Tumoren ergeben sich für die Kopf-Hals-Tumoren folgende Fragen:
1. Ist der Hh-Signaltransduktionsweg auch bei den Kopf-Hals-Tumoren nachzuweisen und
wie hoch ist seine Expressionsstärke gegenüber gesunder Mukosa ?
2. Gibt es lokalisationsabhängige Unterschiede in der Expressionsstärke ?
3. Wie wirkt sich eine Blockade des Hh-Signalwegs auf das Tumorzellwachstum ex-vivo aus
und könnte dies die Grundlage einer additiven Tumortherapie von den HNSCC in Zukunft
sein?
4. Kann die Kombination von Hh-Antagonisten mit leitlinienkonformen Zytostatika eine
Wirkverstärkung erzielen?
Im folgenden publizierten Artikel werden die Ergebnisse einer Untersuchung des
Hh-Signalwegs
vorgestellt.
Wir
haben
die
Expression
der
Komponenten
des
Hh-Signaltransduktionswegs in HNSCC qualitativ und quantitativ analysiert und diskutieren
anhand der Ergebnisse mögliche Ansatzpunkte für eine gezielte Therapie.
1.3. Literaturverzeichnis
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Bernhard Vanselow · Peter Plinkert · Marcus Niewald · Thomas Kuhnt · Wilfried Budach · Michael Flentje: Induction chemotherapy with
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moderate late toxicity outcome (DeLOS-I-trial). Received: 21 August 2008 / Accepted: 13 October 2008 / Published online: 30 October
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2. Publikation
Eingereicht in:
Onkologie, online publiziert 28. März 2013
Overexpression of the Hedgehog signalling pathway in head and
neck squamous cell carcinoma
Kamelia Dimitrova1, Matthaeus Stoehr1, Faramarz Dehghani2, Andreas Dietz1, Gunnar
Wichmann1, Julia Bertolini3, Christian Mozet1
1
Klinik und Poliklinik für Hals,- Nasen,- Ohrenheilkunde
Universität Leipzig
Direktor: Prof. Dr. med. A. Dietz
2
Institut für Anatomie Leipzig
Universität Leipzig
Direktor: Prof. Dr. med. Ingo Bechmann
3
Institus für Pathologie
Universität Leipzig
Direktor: Prof. Dr. med. Christian Wittekind
Original Article · Originalarbeit
Onkologie 2013;36:279–286
DOI: 10.1159/000350322
Published online: March 28, 2013
Overexpression of the Hedgehog Signalling Pathway
in Head and Neck Squamous Cell Carcinoma
Kamelia Dimitrovaa Matthaeus Stoehra Faramarz Dehghanib Andreas Dietza Gunnar Wichmanna Julia Bertolinic Christian Mozeta
Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, bInstitute of Anatomy, cInstitute of Pathology, University of Leipzig, Germany
Keywords
Schlüsselwörter
Hedgehog signalling pathway · HNSCC ·
­Immunohistochemistry · SHH · Gli1
Hedgehog-Signalweg · Kopf-Hals-Tumoren ·
­Immunhistochemie · SHH · Gli1
Summary
Zusammenfassung
Background: Overexpression of the Hedgehog (HH) signalling
pathway has been described in several malignancies and is
associated with a poor prognosis. HH ­signalling blockade
reduces tumour growth in vitro and in vivo. We aimed to
determine whether head and neck squamous cell carcinomas (HNSCCs) express HH proteins in comparison to
healthy mucosa. Patients and Methods: Formalin-fixed and
paraffin-embedded tissue sections of 10 patients with
HNSCC were stained with fluorescence-labelled antibodies
for cytokeratin and HH proteins (SHH, PTCH1/2, SMO, Gli1–3)
and photographs were taken with a laser scanning microscope. The pixel count and colour intensity were analysed
in RGB (red/green/blue) colour mode, and expression levels
were compared to healthy mucosa. Results: Image analysis
in RGB mode provided objective evidence for the over­
expression of HH signalling components in HNSCC,
­particularly with regard to the transcription factors Gli1 (10fold) and SHH (5-fold) in comparison with healthy mucosa.
The lowest levels were found for Gli3 in HNSCC. Conclusions: We postulate pivotal roles of Gli1 and SHH expression
in the carcinogenesis of HNSCC. HH pathway overexpression appears to be involved in the initiation of tumour
growth and spread due to its stem cell-modulating properties. Detection of HH pathway components, and especially
Gli1 and SHH, in HNSCC might offer a promising target for
further anticancer research in HNSCC.
Hintergrund: Eine Überexpression des Hedgehog (HH)-Signalwegs wurde in einer Vielzahl von humanen Malignomen
beschrieben und gilt als negativer Prognose­faktor. Die
­Blockade dieses Signaltransduktionswegs in anderen
Tumor­entitäten reduzierte das Tumorwachstum in vitro und
in vivo. Ziel dieser Arbeit war der Nachweis von HH-Komponenten in Kopf-Hals-Tumoren im Vergleich zu gesunder
Schleimhaut. Patienten und Methoden: Paraffinschnitte von
10 Patienten mit Kopf-Hals-­Tumoren wurden mit fluoreszenzmarkierten Antikörpern gegen Zytokeratin und HH-Proteine (SHH, PTCH1/2, SMO, Gli1–3) inkubiert und mittels
­Laserscan-Mikroskop fotografiert. Pixelzahl und Farbinten­
sität wurden durch eine RGB (Rot/grün/blau)-Analyse quantitativ ermittelt und mit gesunder Schleimhaut verglichen.
Ergebnisse: Die RGB-Analyse erbrachte eine Überexpression aller HH-Komponenten in den untersuchten Kopf-HalsTumoren im Vergleich zu gesunder Schleimhaut, wobei für
den Transkriptionsfaktor Gli1 und für den Liganden SHH
höchste Expressionssteigerungen beobachtet wurden. Gli3
da­gegen zeigte niedrigste Expressionsraten im Tumor­gewebe.
Schlussfolgerung: Dem HH-Signalweg scheint auch in KopfHals-Tumoren eine große Bedeutung zuzukommen. Die Expressionssteigerung könnte aufgrund seiner stammzellmodulierenden Fähigkeiten zur Tumorentstehung und Ausbreitung beitragen. Einzelne Komponenten des HH-Signalwegs
– insbesondere Gli1 und SHH – könnten aussichtsreiche
Ziele zukünftiger Therapieansätze gegen Kopf-Hals-Tumoren werden.
Introduction
Dr. Eric Wieschaus [1] in the fruit fly Drosophila melanogaster,
while screening for genes required for early embryo development. HH signalling controls stem cell proliferation and differentiation, development of body line symmetry and the for-
Signalling by the Hedgehog (HH) pathway was first described
by the Nobel laureates Dr. Christiane Nüsslein-Volhard und
© 2013 S. Karger GmbH, Freiburg
0378-584X/13/0365-0279$38.00/0
Fax +49 761 4 52 07 14
[email protected]
www.karger.com
Accessible online at:
www.karger.com/onk
Dr. med. Christian Mozet
Klinik und Poliklinik für Hals-, Nasen-, Ohrenheilkunde
Universitätsklinikum Leipzig
Liebigstrasse 10–14, 04103 Leipzig, Germany
[email protected]
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139.18.235.210 - 12/16/2013 9:48:38 AM
a
mation of most organ systems during embryogenesis. In adult
organisms, the activity of this pathway is reduced to coordinate the maintenance of stem cell populations [2–4], the tissue
regeneration potential [5–8] and the cell cycle [9–11].
Recently, several reports on uncontrolled HH signalling
pathway activation with the consequence of cancer formation
and proliferation have been published. In cancer tissue of the
pancreas [12], prostate [13–15], breast [16], stomach [17], lung
[7], liver [18], skin [19], medulloblastoma [20] and rhabdomyo­
sarcoma [21], overexpression and/or mutation of this pathway
has been detected. This correlated predominantly with a poor
prognosis. Inhibition of this pathway has already demonstrated
potential against tumour growth in tumour cell lines and in in
vivo models [22], but in head and neck squamous cell carcinomas (HNSCCs) it is still unclear as to whether HH proteins
are overexpressed and if aberrant HH signalling is relevant or
not. The first report on the poorer prognosis of HNSCC patients with higher levels of Gli1 (glioma-associated oncogene
homolog 1; a transcription factor in the HH signalling pathway) was published in 2010 [23], but verification of the existence or meaning of HH signalling in HNSCC has still not
been provided.
Therefore, the aim of this study was to demonstrate the
­expression of HH components in HNSCC specimens in comparison to healthy mucosa and to discuss any resulting therapeutic options. To the best of our knowledge, we are the first
to quantify the overexpression of all HH components in
HNSCC in comparison to normal mucosa, using objective
methods based on image analysis in standard RGB (red/
green/blue) mode [24].
Materials and Methods
Setting
This investigational study was conducted as approved by the ethics
­committee of the Medical Faculty of the University of Leipzig (votes
no. 201–10–12072010 and no. 202–10–1207210). After receiving informed
consent of the patients to participate in the study, biomarker analyses
were performed using the remaining slices of formalin-fixed paraffin-­
embedded (FFPE) tissue samples after the completion of routine histo­
pathological diagnosis. This was done in collaboration with the Department of Otolaryngology and the Institutes of Anatomy and Pathology.
Patient Characteristics
FFPE specimens of 10 histopathologically confirmed HNSCCs of different locations and stages (table 1) and 5 tumour-free mucosa samples
­(derived from the palatal arch of a patient who underwent uvulopalatoplasty) were analysed. All samples were taken during surgical procedures
under general anaesthesia after obtaining the patient’s informed consent.
No patient received any radiation or chemotherapy before sample collection. All samples were obtained from the Institute of Pathology (Leipzig)
after careful histopathological examination.
Double Immunofluorescence
An immunofluorescence assay was used to detect the HH signalling
­components Sonic Hedgehog (SHH), Patched Homolog 1 (PTCH1),
PTCH2, Smoothened (SMO), Gli1, Gli2 and Gli3. Ethanol/xylene was
used to deparaffinise the tumour samples. Samples for Gli1 screening
were additionally pre-treated for 5 min in 0.1 M citrate buffer at pH 6 at
95 °C in a microwave oven.
The remaining samples were washed in phosphate-buffered saline
(PBS)/Triton X-100 (0.1%; PBS/T) for at least 5 min, as were the pretreated slices after cooling down to room temperature. Tissue parts on all
slices were subsequently encircled with a paraffin stick and incubated in a
moist chamber for 30 min with normal donkey serum for the Gli1 samples
and normal goat serum for all other samples, to avoid unspecific binding.
All primary and secondary antibodies were purchased from Santa Cruz
Biotechnology (Heidelberg, Germany) and diluted in 0.5% bovine serum
albumin (BSA) in PBS/T. The primary antibody/BSA solutions (pancytokeratin (mouse) 1:200; SHH, PTCH1, PTCH2, SMO, Gli2 and Gli3
(goat) 1:250; Gli1 (rabbit) 1:100) were applied to the respective samples
and incubated overnight in the moist chamber.
After 24 h, the samples were incubated for 1 h with the fluorescencelabelled secondary antibodies (for all HH components except Gli1 1:200
(Alexa Fluor® 488-labelled donkey anti-mouse and Alexa Fluor®
594-­labelled donkey anti-goat); for Gli1 1:200 (Alexa Fluor® 488-labelled
donkey anti-mouse and Alexa Fluor® 594-labelled goat anti-rabbit)).
After washing, all samples were incubated in Sudan Black for 20 min,
washed again with distilled water and finally mounted with medium for
immunofluorescence. All necessary negative controls (normal sera as
­primary, normal sera without fluorescent labelling as secondary antibody
control) for the detection of unspecific binding and autofluorescence, as
well as the staining of HH components in healthy mucosa, were performed in order to assure specific staining.
All samples were stored at 4 °C and were protected from light until
analysis by confocal microscope.
Data Collection
All samples were assessed and images were taken with a laser scanning
microscope (LSM, Zeiss HAL 100). The following settings were used:
an argon laser with a wavelength of 488 nm (bandpass filter 505–530 nm)
and a helium-neon laser with a wavelength of 543 nm (bandpass filter
Patient number
Localisation
UICC
TNM
 1
 2
 3
 4
 5
 6
 7
 8
 9
10
larynx carcinoma (recurrence)
tonsil carcinoma
paranasal sinus carcinoma
larynx carcinoma
hypopharynx carcinoma
oropharynx carcinoma
oropharynx carcinoma
oropharynx carcinoma
oropharynx carcinoma
oropharynx carcinoma
III
IB
IVA
IVA
III
IVA
IVA
IVB
IVB
IVB
pT3 pN0 M0, L1 V0 Pn1
pT2 pN0 (0/50) M0, L0 V0 Pn0
pT4a pN0 M0, L0 V0 Pn1
pT4 pN2a M0, L0 V0 Pn1
pT2 pN2a M0, L0 V0 Pn1
cT3c N2bc M0
cT3c N2bc M0
cT4bc N3c M0
cT4bc N3c M0
cT4bc N3c M0
TNM = tumor, node, metastasis; UICC = Union for International Cancer Control.
280
Onkologie 2013;36:279–286
Dimitrova/Stoehr/Dehghani/Dietz/
Wichmann/Bertolini/Mozet
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Table 1. Characteristics of samples included in the study. Paraffin-embedded specimens of 10 histopathologically confirmed HNSCCs from various
locations of different TNM stages according to UICC criteria were analysed
RGB Colour Model
In the RGB (red/green/blue) colour model, each colour is defined by the
mixture of these three primary colours and their intensities. Thus, an
exact differentiation between colour mixtures and intensities can be
made. The values on each colour coordinate axis can vary between
0 (black) and 255 (white).
Analysis System
Representative cropped images with a defined size of 638 × 694 pixels and
the histogram from the image editing program Adobe Photoshop CS5
were used for the analysis. 4 parameters were scaled for each cropped
image: the pixel count (Pix) and the mean intensity (MI) of the green and
the red colour. The pixel count was depicted as a percentage of all image
pixels for a better comparison. A cut-off intensity for autofluorescence
was determined. This was done to control unspecific binding.
Expression of HH components in tumour specimens and control
­(mucosa) were analysed by registering mean red and green colour intensities (MI) and pixel count (Pix).
Since the staining intensity is characterised by 2 variables (MI and
Pix), 1 quotient including both parameters was determined for further
analyses as follows:
The reference sample crops of representative tumour and healthy mucosa
were divided into 16 small slices (fig. 1a) and scaled for the 4 parameters
(MI and Pix for red and green). A diagram for each HH component was
created using multiplication analysis of the respective MI and Pix values.
The 2 point cloud areas (see fig. 6) formed represent the HH component
expression pattern in tumour (red squares) and mucosa (green diamonds). Normal sized cropped images of the remaining 9 HNSCC samples were analysed and respective points, defined as described above,
were then added to the diagram (remaining colour points) and compared
with both point cloud areas.
Likewise, representative cropped images of the remaining 9 tumours
were divided into 16 cropped images each, which were scaled for the
4 colour qualities of both stain colours. These data were used to calculate
the MI and Pix for every HH component based on various tumours and
the multiplication analyses. The calculated mean values and their standard deviations for both colour intensity and pixel count were then represented in a point diagram defining an index and a reference area for HH
component expression in healthy and tumour tissue.
Results
Cut-off Intensity, Controls and HH Staining
in HNSCC and Mucosa
The cut-off values for the colour intensity of red and green
were detected as 3 and 10. The mean colour intensities for the
unspecific binding control were detected as 18 for green (pancytokeratin) and 3 for red (HH components) (fig. 1b).
Fig. 1. (a) Areas of mucosa (left) and tumour
(right) samples used for establishing the reference area. This figure shows the distribution of
the 16 crops on which the reference area definition for each HH component was based. Each
of the 16 small slices was scaled for the 4 para­
meters (mean colour intensity and pixel count
for red and green) and used for building the 2
point cloud areas (fig. 6) representing the HH
component expression pattern in tumour (red
squares) and mucosa (green diamonds). (b) The
original image (left, 2048 × 2048 pixels) and the
crop (marked red on the left and ­magnified on
the right, 638 × 694 pixels) of the unspecific
binding control (mucosa) indicate ­absence of
HH staining (here: cytokeratin staining plus
secondary antibodies to Alexa Fluor® 488-labeled donkey anti-mouse and Alexa Fluor®
594-labelled donkey anti-goat antibody).
Hedgehog Signalling in HNSCC
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560–605 nm), corresponding to green (pancytokeratin) and red (SHH
components), respectively. The image size was 2048 × 2048 pixels, and
­approximately identical intensity scores were adjusted.
Figure 2 shows representative staining for HH components
in healthy mucosa (a–g) and in HNSCC (h–n). The staining of
the mucosa also serves as an expression control for HH components and shows the staining pattern in healthy tissue with
low expression levels of HH proteins.
General Observations of Tumour Staining
Under the microscope, different staining zones could be identified (fig. 3). Collagen fibres and erythrocytes (fig. 3a) bind
all antibodies and Alexa Fluor® dyes and therefore appear
­yellow (secondary colour formed from red and green). Major
parts are formed by cells expressing both the epithelial marker pancytokeratin (green) and the HH components (red).
This pattern was seen in most parts of the tumour tissue and
was described as ‘regular’ (fig. 3b). There were also zones
with smaller cells, expressing less cytokeratin but more intense HH components. This seems to be an intermediate region. This alteration zone (fig. 3c) of less differentiation with
Fig. 3. Different histomorphological and distinct stained zones within a tumour slice stained for Gli2. Yellow – stained erythrocytes,
green – the zone with regular tumour tissue,
lilac – the alteration zone, red – the invasion
zone. These zones were observed in all tested
tumour samples.
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Fig. 2. Standard crops of the HH component
expression control on mucosa tissue (a–g) and
HNSCC samples (h–n) all stained for cytokeratin (green) and HH components (red) as follows: (a, h) SHH, (b, i) PTCH1, (c, j) PTCH2,
(d, k) SMO, (e, l) Gli1, (f, m) Gli2, (g, n) Gli3.
All shown mucosa slides (a–g) were obtained
from 1 healthy patient and all tumour slides
(h–n) from 1 patient’s tumour sample.
loss of the epithelial marker but increased HH staining was
observed in the majority of the analysed HNSCC samples.
­Finally, there was the invasion zone (fig. 3d) with poorly differentiated tumour cells but high HH expression.
Quality Control
A fluorescence control and an unspecific binding control were
performed to exclude staining without significance (p > 0.05).
4 diagrams of the red and green characteristics were made to
compare the controls with the sample values (calculated as
the average from the 16 small cropped images shown above)
(fig. 4a, b).
Overall, figure 4 shows the significance of the sample
­values for all parameters. It illustrates slight but non-significant differences for the green stain scaled values (clearly nonsignificant difference in colour intensity (p = 0.3794) and
slightly significant differences in pixel count (p = 0.0095)) and
highly significant values (p < 0.001; both for colour intensity
(p = 0.0000) and pixel count (p = 0.0007)) for the HH signalling components in tumour cells compared to healthy tissue.
Red and Green Quotient
We observed the highest increase in the expression of HH
proteins for Gli1 in HNSCC (more than 9-fold) and Gli2
(more then 4-fold). The increase of Gli3 expression in tumour
Fig. 5. Ratio of HH
component (SHH,
PTCH1/2, SMO,
Gli1–3) expression in HNSCC correlated
to mucosa using the
quotients between
­tumour and mucosa
staining. All ratios
are significantly
­increased (p < 0.001).
cells was less intense than that for other HH markers (only
1.6-fold). Furthermore, the PTCH2 quotient in mucosa was
< 1 (the lowest of all HH components). The PTCH1 quotient
was approximately 1.5 but did not show as much change in
tumour cells compared to PTCH2.
The HH components with the highest expression levels in
healthy tissue (PTCH1 and Gli3) showed the lowest expression levels in HNSCC (fig. 5). Additionally, the HH components with the highest expression levels in tumour cells (Gli1,
Gli2 and SHH) had the lowest expression in normal mucosa.
Gli2 was highly expressed in both HNSCC and normal mucosa tissue.
Analysis of the Reference Area
Regarding the expression of HH components in the mucosa
(control) and in the HNSCC samples, almost all data were
within a presumed reference area without significant spikes
(fig. 6). The resulting scatter plots are characterised by a clear
distance between the HH expression rates in controls (mucosa) and HNSCC, except for Gli3.
Fig. 4. Quality
c­ ontrol parameters
and signal-to-noise
ratios for each staining characteristic (a, pixel count;
b, colour intensity)
of all HH components (Alexa Fluor®
594) (including
­standard deviation).
(c) The product of
both colour qualities
was used to analyse
the expression ratios
of tumour and
­mucosa. Expression
of all HH proteins (c)
in HNSCC is significantly increased in
comparison to
healthy mucosa (all p < 0.001).
Hedgehog Signalling in HNSCC
Initially, the HH pathway was considered to be confined to
embryological development, but recently numerous studies
have indicated its role in cancer initiation (see Introduction).
So far, data on the expression of the HH signalling pathway
and its role in HNSCC are sparse [23]. HH signalling activation is triggered by ligand binding (SHH) to the transmembrane receptor proteins PTCH1 and/or PTCH2, relieving the
inhibition from another transmembrane protein, SMO. As a
result, the activated signalling cascade ultimately regulates the
expression of the Gli1, 2 and 3 transcription factors [25]. Even
though there are three different ligands (SHH, Desert Hedgehog (DHH) and Indian Hedgehog (IHH)) to activate the HH
pathway, we focussed on SHH, which is known as the most
relevant ligand in human tissues. In prostatic cancer, Azoulay
et al. [13] demonstrated SHH and DHH expression by both
epithelial and stromal cells of prostate tissues, whereas IHH
was only expressed by stromal cell tumours.
There have been numerous reports on HH signalling pathway overexpression in different tumours, and there have been
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Discussion
early publications on the tumour-inhibiting effects of HH signalling blockage in cell lines and in in vivo models, alone and
in combination with gold standard cytostatic drugs [26, 27].
More than a few authors regard this fundamental signalling
pathway as a possible new therapeutic approach in cancer therapy in the near future.
To the best of our knowledge, we are the first to demonstrate the overexpression of all relevant HH components in
HNSCC in comparison to normal mucosa, and to quantify the
results not only based on interpretation and scoring but also
by the use of objective methods based on image analysis in
the standard RGB mode. Recently, Schneider et al. [28] published data on the expression of the HH pathway in squamous
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cell carcinomas of the skin in comparison to HNSCC; however, they used only semiquantitative methods for analysis
and found heterogeneous expression rates in these tumour
entities. Wang et al. [29] only considered SHH, PTCH, and
Gli1 expression in oral squamous cell carcinomas from 40 patients, but found that PTCH overexpression was associated
with lymphatic spread and that Gli1 overexpression was correlated with primary tumour size, lymphatic metastasis and
tumour recurrence.
In comparison to healthy mucosa, we observed significant
overexpression of all HH components (SHH, PTCH1,
PTCH2, SMO, Gli1, Gli2 and Gli3) in HNSCC. With these
results and the known properties of HH signalling from stem
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Fig. 6. Dot plots representing the reference area analyses for each HH component. The cloud of
green points represents mucosa staining and the cloud of red ones represents tumour staining. Both
clouds are compared with the single sample points of the remaining 9 tumours. Almost all single
sample points are located within the presumed reference area of the red tumour stain cloud.
Hedgehog Signalling in HNSCC
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Fig. 7. Expression index for each HH component in both mucosa and
t­ umour and both reference areas (mucosa: green, tumour: red) defined by
the standard deviation as an error indicator of mucosa and tumour points.
Both reference areas show almost no overlap despite the limited sample
number. This indicates that, by using a greater number of samles, the
2 areas could be clearly determined and used for analysing and differentiating tumour from healthy tissue.
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cell research, it seems that HH signalling might be a trigger
for tumour growth and metastasis. The fact that low HH expression is detectable in healthy mucosa is not surprising in
light of the high proliferation rate in this tissue and the ability
of the HH pathway to mediate cell differentiation and self-­
renewal [30]. We observed high Gli3 and PTCH1 expression
levels in healthy mucosa, but low levels in HNSCC. It is
­imaginable that these components mediate the regenerative
properties of the mucosa and are constitutively expressed. In
contrast, Gli1, SHH and PTCH2 were found at high expression levels in HNSCC, but were low in mucosa. Especially
Gli1 seems to have an outstanding function in tumour development, and this is in agreement with the literature where it
has been postulated to be a prognostic factor in HNSCC [23].
In other tumour entities, Gli1 has demonstrated a high potential to induce tumour growth in the skin and the central nervous system (CNS) in vivo [31].
HH signalling activation with high levels of related transcription factors (e.g. Gli1) may result from the mutation of
HH signalling components (e.g. in basal cell carcinoma
(BCC)), but somatic HH mutations with activated components are not regularly found in other tumour entities [26].
Bahra et al. [26] demonstrated an overexpression of PTCH1
and Gli1 target genes in pancreatic adenocarcinomas without
any somatic mutations.
HH activation normally follows the binding of the ligand
(SHH) to PTCH1 and PTCH2, but the transcription factor
Gli1 can also be regulated by non-HH inputs including peptides, growth factors, oncogenes and tumour suppressors
(Ras, Myc, Akt, p53 and PTEN) [32]. We found high expres-
sion of the ligand (SHH, 4.8-fold) in HNSCC in comparison
to healthy mucosa, which might trigger physiological pathway
activation independent of possible mutations in the pathway
(which were not analysed here).
Blockade of SMO with cyclopamin has been found to decrease the tumour size in in vivo endogenous brain cancer
models [33] or in melanoma models in mice [34]. Bahra et al.
[26] reported on the dose-dependent reduction of tumour cell
growth in vitro and in a xenograft model of pancreatic adenocarcinoma, as a consequence of inhibition with cyclopamin
and a small-molecule HH inhibitor. HH antagonists such as
IPI-269609 or GDC-0449 have shown promising effects in
­patients with pancreatic adenocarcinomas. The same applies
to BCC [35, 36]. In vivo, HH antagonists have been able to
inhibit medulloblastoma cells [37]. However, cyclopamine [26,
38, 39], the best-known and most thoroughly evaluated HH
signalling pathway antagonist, has never been tested on tumour cell lines of head and neck origin, or in HNSCC in vivo
models.
Our results indicate the importance of the HH signalling
pathway in HNSCC, particularly with regard to Gli1 and
SHH. It is obvious that HH components in HNSCC are overexpressed in comparison to healthy mucosa, but the degree of
these changes for individual components of the HH pathway
is different. The ligand SHH and the transcription factors Gli1
and Gli2 showed the highest expression levels in HNSCC
­relative to healthy mucosa. In contrast, the expression of
PTCH1 and Gli3 in HNSCC was not comparably increased,
suggesting a physiological role for these components in
healthy tissue.
The postulated duality of this pathway, in terms of controlling tissue stem cells, regeneration and tissue repair on the
one hand and the ability to induce tumour growth on the
other hand is interesting but challenging. In addition to the
detection of overexpressed HH signalling components in
HNSCC, we established reference areas for HH expression
rates in HNSCC and in healthy mucosa, following a RGB
­colour model comparable to another model using inherent
image information [24]. We modified this method and considered pixel count and colour intensity for the present analysis.
Our improved method might allow for the objective comparison of results obtained in future studies whenever digital
­imaging is applied after fluorescent staining for HH components. However, an increased sample size should be investigated in order to validate the reference areas for the expression
of HH components in HNSCC.
Our findings point out new potential targets in HNSCC
and may provide direction to investigate new therapeutic
­options in the near future, especially based on the promising
results from other tumour entities. According to our results,
selective blockade of SHH and/or Gli1 with small molecules
or antibodies should provide the most promising effect in
HNSCC, since it is now clear from this study that these components seem to play an outstanding role in HNSCC.
Disclosure Statement
All authors declare to have no conflicts of interest.
References
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3. Zusammenfassung der Ergebnisse und Ausblick
In der vorliegenden publizierten Studie konnten wir zum ersten Mal die Überexpression aller
Hh-Komponenten in HNSSC im Vergleich zur gesunden Mukosa nicht nur nachweisen
sondern auch anhand einer RGB-Farbanalyse objektiv auswerten.
In unserer Studie hat sich der Transkriptionsfaktor Gli-1 als die Komponente mit der
stärksten Expressionserhöhung (10-fach) in HNSCC in Vergleich zur gesunden Mukosa
und
damit
als
der
potentiell
potenteste
Angriffspunkt
im
gestörten
Hh-Signaltransduktionsweg erwiesen. An zweiter Stelle folgte Gli-2 mit einer 6-fachen
Expressionserhöhung. Zusätzliche potentielle Angriffspunkte für die targeted therapy
scheinen auch die Hh-Komponenten SHH, PTCH2 und SMO zu sein.
Andererseits scheint der Transkriptionsfaktor Gli-3 in Zusammenspiel mit dem Transmembranprotein PTCH1 mit ihrer starken Expression in der gesunden Mukosa und nur
minimaler Expressionserhöhung im Tumorgewebe eine entscheidende Rolle für den Erhalt
der physiologischen Funktionen des Hh-Signaltransduktionswegs, wie des Gewebsselbsterneuerungspotentials, zu spielen.
Zusätzlich konnten wir einen zunehmenden Verlust von Zytokeratin als epithelialen Marker
der Tumorzellen in der Tumorinvasionszone und eine verstärkte Expression der
Hh-Komponenten beobachten. Ein ähnliches Phänomen war auch in der Nähe von
angeschnittenen Gefäßen und Nerven zu sehen. Diese Beobachtung kann ein Hinweis auf
die Rolle des Hh-Signalwegs bei der lokalen Tumorprogression und Metastasierung sein.
Dank des objektiven Analysemodels konnten wir auch Referenzzonen für die Expression der
einzelnen Komponenten im gesunden und im Tumorgewebe herausarbeiten. Diese sollten
jedoch in weiterführenden Untersuchungen mit größeren Probezahlen präzisiert und bekräftigt werden. Auf Grund der vorliegenden Ergebnisse konnte in eigenen weiterführenden
Untersuchungen
auch
gezeigt
werden,
dass
eine
Blockade
des
Hh-Signaltransduktionswegs z.B. mit Cyclopamin nicht nur theoretisch sondern auch praktisch sowohl in Zellkulturen als auch in Tumorgewebe ex vivo möglich ist 1. Somit stellt der
SMO-Rezeptor ein potenzielles Ziel für eine Hh-basierte targeted therapy in einem multi-
modalen Therapiekonzept von HNSCC dar. Es sind weitere Studien nötig, um die Wirksamkeit einer selektiven Inhibition der weiteren potentiellen Hh-Zielkomponente wie z.B. des
Gli-1-Transkriptionsfaktors (z.B. mit GANT-61) und die Anwendung des bereits für Basalzellkarzinome zugelassenen SMO-Antagonisten Vismodegib in HNSCC zu evaluieren.
1
Mozet C, Stoehr M, Dimitrova K, Dietz A, Wichmann G: Hedgehog targeting by cyclopamine suppresses head and neck squamous cell
carcinoma and enhances chemotherapeutic effects. Anticancer Res. 2013 Jun;33(6):2415-24.
Zusammenfassung der Arbeit
Publikationspromotion zur Erlangung des akademischen Grades Dr.med. an der
Medizinischen Fakultät der Universität Leipzig
„Überexpression des Sonic Hedgehog Signaltransduktionswegs in Plattenepithelkarzinomen
des Kopf-Hals-Bereichs“
eingereicht von Kamelia Dimitrova
angefertigt am Universitätsklinikum Leipzig AöR,
Klinik und Polyklinik für Hals-, Nasen-, Ohrenheilkunde
Direktor: Prof. Dr. med. Andreas Dietz
Betreuer:
Prof. Dr. med. Andreas Dietz
Dr. med. Christian Mozet
Dr. rer. nat. Gunnar Wichmann
Juli 2013
Hintergrund: Plattenepithelkarzinome im Kopf-Hals-Bereich (HNSCC) stellen eine besondere
gesundheitliche und wirtschaftliche Herausforderung dar. Mit knapp einer halben Million
Neuerkrankungen und mit knapp 350 000 Sterbefällen weltweit im Jahr 2004 gehören sie zu
den 5 häufigsten Tumorenentitäten mit schlechter Gesamtprognose.
Trotz technischer Fortschritte sowohl im Bereich der operativen Therapie als auch in der
Radiochemotherapie hat sich die Überlebensrate der betroffenen Patienten in den letzten
Jahren nicht wesentlich verändert. Nach wie vor liegt die durchschnittliche absolute
5-Jahres-Überlebensrate (5-JÜR) in Deutschland bei ca. 55% für maligne Erkrankungen im
Kehlkopf- und bei ca. 48% im Mund-Rachen-Bereich (Daten für 2012). Gerade im palliativen
Rezidivfall liegt die durchschnittliche Überlebenszeit mit 6-10 Monaten noch deutlich
niedriger.
In den letzten 50 Jahren wurden viele Signaltransduktionswege entdeckt und intensiv
erforscht, die sowohl in der Embryogenese als auch in der Karzinogenese eine wichtige Rolle
spielen sollen. In jüngerer Vergangenheit konnte durch die Zugabe eines Antikörpers
(Cetuximab®) gegen den endothelial growth factor receptor (EGFR) eine signifikante Überlebensverlängerung in der inoperablen first-line Rezidivtherapie in Kombination mit Chemotherapeutika erzielt werden. Die Methode dieses gezielten Eingreifens in tumorbiologische
Prozesse und Signalkaskaden wird als „targeted therapy“ bezeichnet und hat die Zulassung
des Antikörpers Cetuximab als Vorbild.
Ob weitere zielgerichtete Therapien gegen tumorspezifische Signaltransduktionswege einen
Gewinn für die Patienten erbringen, ist zurzeit Gegenstand aktueller Untersuchungen. Einer
dieser Signaltransduktionswege ist der Hedgehog (Hh) Signaltransduktionsweg. Während
der
embryonalen
Entwicklung
spielt
er
bei
der
Proliferation
und
Differenzierung von Stammzellen, bei der Entstehung der Achsensymmetrie, der segmentalen Entwicklung der Extremitäten und bei der Komponentenformung von Nerven-,
gastrointestinalen und vielen anderen Organsystemen eine fundamentale Rolle.
In adultem Gewebe ist er als Kofaktor bei der Zellteilung und Zellzykluskontrolle von Bedeutung. Die Überexpression seiner Komponenten wurde bereits auch in verschiedenen
Tumorentitäten nachgewiesen und als wichtiger Faktor deren Entstehung angesehen. Inzwischen sind verschiedene natürlich vorkommende und synthetische Hh-Antagonisten bekannt. Erste Erkenntnisse
konnten zeigen,
dass die
spezifische
Blockade
des
Hh-Signaltransduktionswegs zu einer Hemmung des Wachstums verschiedener Malignome
führt. Dies deutet auf die essentielle Rolle der Hh-Aktivität für die Entstehung und der
Progression von Tumorzellen hin.
Folglich stellt sich die Frage, ob die Komponenten dieses Signaltransduktionswegs auch bei
Plattenepithelkarzinomen im Kopf-Hals-Bereich (HNSCC – head and neck squamous cell
carcinoma) exprimiert werden, ob sie eine Rolle in der Karzinogenese spielen und ob ihre
gezielte Blockade einen möglichen Ansatz für eine zielgerichtete Therapie darstellen kann.
Bislang wurde weder die Überexpression von SHH-Komponenten in HNSCC nachgewiesen
oder analysiert, noch wurde über experimentelle Ansätze mit deren Antagonisten berichtet.
Methoden: An Paraffinschnitten von pathologisch gesicherten HNSCC sowie gesunder
Mukosa als Kontrolle wurden die Hh-Komponenten (Sonic Hedgehog (SHH), Patched1
(PTCH1), Patched2 (PTCH2), Smoothened (SMO), Gli-1, Gli-2 und Gli-3) und Zytokeratin
(Marker für epitheliale Zellen) mittels Immunfluoreszenz detektiert und mittels LaserscanMikroskop einheitlich fotografiert. Die Pixelzahl und die Farbintensität wurden anhand eines
auf der RGB-Farblehre gestützten Bild-Auswertungssystems quantitativ ermittelt und miteinander verglichen.
Ergebnisse: Zum ersten Mal konnte in dieser Studie eine deutlich gesteigerte Expression
aller Hh-Komponenten im HNSCC-Tumorgewebe im Vergleich zur gesunden Mukosa objektiv nachgewiesen werden. Dabei war die stärkste Expression der Hh-Komponenten im Bereich der Tumorinvasionsfronten und in der Nähe von Gefäßen bzw. Nerven zu finden.
Gleichzeitig konnte in diesen Bereichen ein zunehmender Verlust von Zytokeratin als
epithelialen Marker der Tumorzellen beobachtet werden. Nach RGB-Farbanalyse zeigten die
Transkriptionsfaktoren Gli-1 und Gli-2 und der Ligand SHH die größte Expressionszunahme
(10.3-fach, 6.2-fach und 4.8-fach) im Vergleich zur gesunden Schleimhaut, Gli-3 dagegen nur
eine geringe Expressionszunahme (2.4-fach).
Zusammenfassung: Die Ergebnisse dieser Studie zeigen, dass der Hh-Signalweg auch bei
HNSCC exprimiert wird und im Vergleich deutlich höhere Expressionswerte als gesunde
Mukosa erreicht. Analog zu anderen Tumorentitäten kann davon ausgegangen werden, dass
der Hh-Signaltransduktionsweg auch in HNSCC ein wichtiger Faktor der Tumorentstehung
und -progression ist. Die höchsten Expressionsstärken in der Tumorinvasionszone sowie in
der Nähe von Nerven- und Gefäßscheiden deuten darauf hin, dass dem HhSignaltransduktionsweg auch eine Rolle in der Progression und der Metastasierung von
HNSCC zukommen könnte.
Die minimale Gli-3-Expressionszunahme verweist auf die mögliche physiologische Funktion
des Signaltransduktionswegs als Kofaktor bei der Zellteilung und bei der Zellzykluskontrolle.
Unter allen Komponenten zeichnet sich vor allem Gli-1 mit seiner 10-fach höheren Expression im Tumorgewebe aus. In der Literatur wurde er bereits als relevanter negativer Prognosefaktor beschrieben. In diesem Zusammenhang scheint die selektive Blockade von
Komponenten des Hh-Signalwegs, insbesondere die des Transkriptionsfaktors Gli-1, einen
neuen versprechenden Ansatz für targeted therapy zu liefern. Zusätzliche potentielle Angriffspunkte scheinen auch die Hh-Komponenten Gli-2, SHH, PTCH2 und SMO zu sein.
Ausblick: In eigenen weiterführenden Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass eine
gezielte Blockade des Hh-Signaltrainsduktionswegs, z.B. mit Cyclopamin in Tumoren ex vivo
zu einer Wachstumshemmung der Zellkolonien führt. Somit stellt auch der SMO-Rezeptor
ein potenzielles Ziel für eine zielgerichtete targeted therapy in einem multimodalen Therapiekonzept von HNSCC dar. In unserer Studie hat sich jedoch der Transkriptionsfaktor Gli-1
mit seiner eindrucksvollen Expressionserhöhung als der potenziell potenteste Angriffspunkt
für targeted therapy im gestörten Signaltransduktionsweg bei HNSCC erwiesen. Es müssen
jedoch Ergebnisse weiterer Studien abgewartet werden, um die Wirksamkeit einer selektiven
Inhibition
des
Gli-1-Transkriptionsfaktors
(z.B.
mit
GANT-61)
und
die
Anwendung von dem bereits für Basalzellkarzinome zugelassenen SMO-Antagonist
Vismodegib in HNSCC zu evaluieren.
Selbständigkeitserklärung
Erklärung über die eigenständige Abfassung der Arbeit
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbständig und ohne unzulässige Hilfe
oder Benutzung anderer als der angegebenen Hilfsmittel angefertigt habe. Ich versichere,
dass Dritte von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für Arbeiten
erhalten haben, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten Dissertation stehen,
und dass die vorgelegte Arbeit weder im Inland noch im Ausland in gleicher oder ähnlicher
Form einer anderen Prüfungsbehörde zum Zweck einer Promotion oder eines anderen Prüfungsverfahrens vorgelegt wurde. Alles aus anderen Quellen und von anderen Personen
übernommene Material, das in der Arbeit verwendet wurde oder auf das direkt Bezug genommen wird, wurde als solches kenntlich gemacht. Insbesondere wurden alle Personen
genannt, die direkt an der Entstehung der vorliegenden Arbeit beteiligt waren.
* Die Betreuung dieser Arbeit erfolgte durch Prof. Dr. med. Andreas Dietz, Dr. med. Christian Mozet und Dr. rer.
nat. Gunnar Wichmann.
Leipzig, den_______________________
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Kamelia Dimitrova
Lebenslauf
PERSÖNLICHE DATEN
Kamelia Dimitrova
Geboren am 29.07.1985 in Sofia
AKADEMISCHE AUSBILDUNG
2004–2012
Universität Leipzig
Studium der Medizin
(Abschluss: 1. und 2. Staatsexamen)
FACHARZTAUSBILDUNG
Seit 11/2012
Spital Emmental, Burgdorf, Schweiz
Assistenzärztin Chirurgie
FAMULATUREN / PRAKTISCHES JAHR
2010/2011
Praktisches Jahr: Chirurgie Bezirksspital Affoltern, Affoltern am Albis,
Schweiz; HNO HNO-Universitätsklinik Leipzig; Innere Medizin
Kantonsspital Bruderholz, Basel, Schweiz
07-08/2009
Famulatur HNO HNO-Universitätsklinik Leipzig
03-04/2009
Famulatur Anästhesie Charité Mitte, Berlin
07-08/2008
Famulatur HNO HNO-Universitätsklinik Leipzig
03-04/2008
Famulatur Chirurgie Kaiser-Franz-Josef-Spital, Wien
PUBLIKATIONEN
Kamelia Dimitrova, Matthaeus Stoehr, Faramarz Dehghani, Andreas Dietz, Gunnar
Wichmann, Julia Bertolini, Christian Mozet: Overexpression of the Hedgehog signalling
pathway in head and neck squamous cell carcinoma. Anticancer Res. 2013 Jun;33(6):241524.
Mozet C, Stoehr M, Dimitrova K, Dietz A, Wichmann G: Hedgehog targeting by cyclopamine
suppresses head and neck squamous cell carcinoma and enhances chemotherapeutic effects.
Anticancer Res. 2013 Jun;33(6):2415-24.
Danksagung
An dieser Stelle möchte ich mich bei allen bedanken, die mich auf die eine oder andere Art
bei der Entstehung dieser Arbeit unterstützt und begleitet haben.
An erster Stelle gilt mein Dank meinen Betreuern, Herrn Dr. med. Christian Mozet und Herrn
Dr. rer. nat. Gunnar Wichmann, die mich stets mit Rat und Tat sowohl menschlich als auch
fachlich auf dem nicht immer leichten Weg der Wissenschaft unterstützen.
Für die tatkräftige Unterstützung im Labor möchte ich auch Frau Anett Reiche danken.
Vielen Dank auch an Prof. Dr. med. Faramarz Dehghani, der viel zum technischen Gelingen
beigetragen und immer ein offenes Ohr für Problemen am Mikroskop hatte.
Bedanken möchte ich mich auch beim Klinikdirektor der HNO-Universitätsklinik Leipzig, Herr
Prof. Dr. med. Andreas Dietz für die Weiterleitung seiner Forschungsbegeisterung an die
nachfolgende Generation und die Möglichkeit, an seiner Klinik diese Arbeit anfertigen zu
können.
Besonderer Dank auch an zwei Freunde, Lars Ihring und Nikolay Pavlov, die in schwierigen
Zeiten stets an meiner Seite waren und meinen Geist wieder aufgebaut, an mich geglaubt
und mich ermutigt haben.
Zuletzt, aber nicht an letzter Stelle möchte ich mich auch bei meinen Eltern bedanken, die
mein Studium möglich gemacht und mich immer unterstützt haben.