ZIP - Albert-Ludwigs
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FTIR-spektroskopische Untersuchung der Interaktionen zwischen dem Photorezeptor Sensory Rhodopsin II aus Natronobacterium pharaonis und seinem Transducer Inauguraldissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Fakultät für Chemie, Pharmazie und Geowissenschaften der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau vorgelegt von Sven Reisdorf aus Frankfurt/Main 2009 Dekan: Prof. Dr. H. Hillebrecht Vorsitzender des Promotionsausschusses Prof. Dr. R. Schubert Referent: Prof. Dr. P. Gräber Korreferent: Prof. Dr. F. Siebert Tag der Bekanntgabe des Prüfungsergebnisses: 5.11.09 Danksagung An dieser Stelle möchte ich gerne denjenigen Menschen danken, die mich während meiner Doktorarbeit unterstützt haben. Zunächst danke ich Herrn Prof. Dr. Peter Gräber sehr herzlich dafür, dass er die Betreuung dieser Arbeit übernommen hat. Besonders herzlich möchte ich mich für die Bereitstellung des Themas der Doktorarbeit bei Prof. Dr. Friedrich Siebert bedanken, der mir die Möglichkeit gab, in seiner Arbeitsgruppe auf dem Gebiet der Sensorischen Rhodopsine zu forschen. Weiterhin danke ich ihm für die zahlreichen anregenden Gespräche und hilfreichen Diskussionen, die für den Fortschritt meiner Arbeit sehr wichtig waren. Besonderer Dank gilt auch Prof. Dr. Martin Engelhard am MPI für molekulare Physiologie in Dortmund dafür, dass er es mir ermöglicht hat, in seinem Institut die Proteine zu exprimieren, ohne die meine Arbeit nicht möglich gewesen wäre. Auch den Mitarbeitern seiner Arbeitsgruppe bin ich sehr dankbar für die geleistete Unterstützung. Insbesondere danke ich Jörg Sauermann für die Hilfe während meiner Zeit in Dortmund sowie für die Herstellung zahlreicher weiterer Proben. Auch Swetlana Martell und Nadine Mennes bin ich für die Herstellung der isotopenmarkierten Proben sehr dankbar. Prof. Dr. Matthias Ullmann am Lehrstuhl für Biopolymere an der Universität Bayreuth danke ich für die Hilfe bei den strukturellen und elektrostatischen Berechnungen. PD Dr. Reiner Vogel bin ich dankbar für die Unterstützung bei allen messtechnischen Fragestellungen. Auch meinen Arbeitskollegen Ionela Radu, Daniel Winter, Pascal Schwinté, Mischa Schmidt und Mohana Mahalingam bin ich für die angenehme Arbeitsatmosphäre sehr dankbar. Für ihre Hilfe im Labor sowie für zahlreiche aufmunternde Gespräche danke ich Bettina Mayer. Wolfgang Sevenich danke ich für seine Hilfe bei Computerproblemen, den Mitarbeitern der Feinmechaniker- bzw. Elektronikwerkstatt Paul Merkt, Konrad Zander und Wolf-Dieter Schielin für ihre Hilfe bei der Behebung von apparativen Problemen. Abkürzungsverzeichnis I Abkürzungsverzeichnis 4-MBN 4-Mercaptobenzonitril ATP Adenosintriphosphat BR Bacteriorhodopsin BTP Bis-Tris-Propan cAMP cyclisches Adenosinmonophosphat DDM Dodecyl-Maltosid DFT diskrete Fourier-Transformation DTGS Deuteriertes Triglycinsulfat EPR Spektroskopie Elektronenspinresonanz Spektroskopie FTIR Spektroskopie Fourier-Transformations-Infrarot Spektroskopie GPCRs G-Protein-gekoppelte Rezeptoren GTP Guanosintriphosphat HAMP Histidinkinasen, Adenylatcyclasen, Methyl-akzeptierende Chemotaxisproteine sowie Phosphatasen HR Halorhodopsin HsSRII Sensory rhodopsin II aus Halobacterium salinarium Htr halobakterielles Transducer Protein IPTG Isopropyl-ß-d-Thiogalactopyranosid JAK Januskinase MAPK Mitogen-aktivierte Proteinkinase MCP Methyl-akzeptierendes Chemotaxisprotein MCT mercury cadmium telluride NpHtrII halobakterielles Transducer Protein aus Natronobacterium pharaonis NpSRII Sensory Rhodopsin II des Archaebakteriums Natronobacterium pharaonis OD optische Dichte PDB Protein Datenbank PLC Phospholipase C PML Purpurmembran-Lipide SRI Sensory Rhodopsin I SRII Sensory Rhodopsin II STAT Signal Transducers and Activators of Transcription THF Tetrahydrofuran II Abkürzungsverzeichnis Aminosäurecode Aminosäure Dreibuchstabencode Einbuchstabencode Alanin Ala A Arginin Arg R Asparagin Asn N Asparaginsäure Asp D Cystein Cys C Glutamin Gln Q Glutaminsäure Glu E Glycin Gly G Histidin His H Isoleucin Ile I Leucin Leu L Lysin Lys K Methionin Met M Phenylalanin Phe F Prolin Pro P Serin Ser S Threonin Thr T Tryptophan Trp W Tyrosin Tyr Y Valin Val V Inhaltsverzeichnis III Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung ............................................................................................................................. 1 1.1 Signalübertragungsprozesse in der Zelle ...................................................................... 1 1.2 Funktion und Aufbau von Signaltransduktionswegen .................................................. 2 1.3 2-Komponenten Signalwege in Bakterien..................................................................... 5 1.3.1 Der Signaltransduktionsweg der bakteriellen Chemotaxis .................................. 7 1.4 Funktion und Struktur der archaebakteriellen Rhodopsine......................................... 11 1.5 Die Photochemie der archaebakteriellen Rhodopsine Sensory Rhodopsin II und Bacteriorhodopsin ....................................................................................................... 16 1.6 Der Photozyklus von Bacteriorhodopsin .................................................................... 19 1.7 Der Photozyklus von NpSRII...................................................................................... 24 1.7.1 Das K-Intermediat von NpSRII ......................................................................... 26 1.7.2 Das M-Intermediat von NpSRII ........................................................................ 29 1.8 Interaktionen zwischen NpSRII und NpHtrII ............................................................. 32 1.9 Signalamplifikation in der HAMP-Domäne ............................................................... 37 2. Ziele .................................................................................................................................... 42 3. Materialien und Methoden............................................................................................... 43 3.1 Grundlagen der IR-Spektroskopie............................................................................... 44 3.2 Fourier-Transformations Infrarotspektroskopie (FTIR-Spektroskopie) ..................... 47 3.3 Messverfahren ............................................................................................................. 52 3.3.1 Absorptionsmessungen ...................................................................................... 52 3.3.2 Reaktionsinduzierte Differenzspektroskopie ..................................................... 54 3.4 Isotopenmarkierung..................................................................................................... 59 3.5 Aromatische Nitrile als Infrarotsonden ....................................................................... 61 3.5.1 Grundlagen......................................................................................................... 61 3.5.2 Der Stark Effekt ................................................................................................. 63 3.5.3 Aufspüren lokaler elektrostatischer Felder in Proteinen unter Ausnutzung des Stark Effekts ...................................................................................................... 67 3.5.4 Wechselwirkungen von 4-MBN mit Lösungsmittelmolekülen ......................... 70 3.6 Herstellung der gelabelten NpSRII- und NpHtrII-Mutanten ...................................... 74 3.6.1 Expression der NpSRII- und NpHtrII-Mutanten ............................................... 74 3.6.2 Aufreinigung der NpSRII- und NpHtrII-Mutanten ........................................... 75 3.6.3 Labeln der NpSRII- sowie NpHtrII-Mutanten mit 4-Mercaptobenzonitril (4-MBN)............................................................................................................ 76 3.6.4 Rekonstitution in Purpurmembran Lipide von Halobacterium salinarium....... 76 IV Abkürzungsverzeichnis 3.7 Herstellung der Infrarotproben.................................................................................... 78 3.8 Messapparatur ............................................................................................................. 79 3.8.1 Steady-State Messungen .................................................................................... 78 3.8.2 Tieftemperaturmessungen.................................................................................. 80 4. Ergebnisse und Diskussion ............................................................................................... 82 4.1 K-Intermediat .............................................................................................................. 82 4.1.1 Ergebnisse.......................................................................................................... 82 4.1.2 Diskussion.......................................................................................................... 90 4.2 M-Intermediat ............................................................................................................. 94 4.2.1 Ergebisse............................................................................................................ 94 4.2.2 Schlussfolgerungen.......................................................................................... 107 4.3 4-Mercaptobenzonitril als Infrarotsonde................................................................... 109 4.3.1 Absorptionsmessungen in verschiedenen organischen Lösungsmitteln .......... 109 4.3.2 Kopplung der IR-Sonde an den NpSRII/NpHtrII Komplex ............................ 114 4.3.3 Absorptionsspektren der NpSRII- sowie NpHtrII-Mutanten........................... 119 4.3.4 Differenzspektren der gelabelten NpSRII- sowie NpHtrII-Mutanten ............. 131 4.3.4.1 K-Intermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren ................... 131 4.3.4.2 M-Intermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren .................. 133 4.3.5 Schlussfolgerungen ........................................................................................ 142 4.4 Untersuchung des Einflusses elektrostatischer Felder auf die CN-Streckschwingungsmode von 4-MBN mit Hilfe der gelabelten Gegenionmutante D75N-NpSRII. 144 4.4.1 Absorptionsspektren der gelabelten Doppelmutanten ..................................... 144 4.4.2 K-Intermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren ................................ 149 4.4.3 Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren bei 263K ........... 151 4.4.4 Temperaturabhängigkeit der Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren bei den verschiedenen gelabelten NpSRII-Mutanten ............. 154 4.4.5 Schlussfolgerungen und Ausblick ................................................................... 159 5. Zusammenfassung.......................................................................................................... 162 Literaturverzeichnis 1.1 Signalübertragungsprozesse in der Zelle 1 1. Einleitung 1.1 Signalübertragungsprozesse in der Zelle Bei zahlreichen Prozessen in der Natur ist es erforderlich, dass externe Signale an der äußeren Zellmembran empfangen, umgewandelt und in das Zellinnere weitergeleitet werden, um so eine zelluläre Antwort auf diese Signale zu ermöglichen. Auf diese Weise gelingt es Lebewesen, auf äußere Lichtreize zu reagieren, Geruchsstoffe wahrzunehmen oder unterschiedliche Geschmacksrichtungen zu unterscheiden. Aber nicht nur bei unseren Sinnesorganen spielen Signalprozesse eine entscheidende Rolle: Mit Hilfe von Hormonen oder anderen Botenstoffen können Zellen über große Entfernungen miteinander kommunizieren, wodurch den Empfängerzellen wichtige Befehle zur Anpassung an veränderte Lebensbedingungen erteilt werden. So werden Zellen beispielsweise durch Signalmoleküle veranlasst, sich zu teilen, vermehrt Energie in Form von Zuckermolekülen bereitzustellen oder sogar „Selbstmord“ zu begehen, wie dies beim programmierten Zelltod, der Apoptose, der Fall ist. Auch einzellige Lebewesen wie Bakterien benötigen Mechanismen, um unterschiedliche Umweltbedingungen wie plötzliche Temperaturwechsel, ein verändertes Nährstoffangebot oder starke Lichteinstrahlung zu detektieren und sich daran anzupassen. So unterschiedlich die genannten Beispiele auch sein mögen, so gibt es doch bei allen Signalprozessen ein gemeinsames Grundproblem: Die äußere Zellmembran stellt eine Barriere dar, die zwar auf der einen Seite die Zelle vor dem Eindringen von Schadstoffen schützt, auf der anderen Seite aber auch dafür sorgt, dass die äußeren Reize, auf die die Zelle reagieren soll, nicht ungehindert ins Zellinnere gelangen können. Die Natur hat zur Lösung dieses Problems eine Klasse von Proteinen entwickelt, die in der äußeren Biomembran lokalisiert sind und zumeist extrazellulär aus ihnen herausragen. Jeder dieser so genannten Rezeptoren kann einen spezifischen äußeren Reiz aufnehmen, prozessieren und ins Innere der Zelle weiterleiten. Membranrezeptoren spielen also bei solchen Signalprozessen in der Natur eine Schlüsselrolle. Auch das in der vorliegenden Arbeit untersuchte bakterielle Membranprotein Sensory Rhodopsin II (SRII) des Archaebakteriums Natronobacterium pharaonis ist als so genannter Photorezeptor an einem Prozess beteiligt, der es dem Bakterium ermöglicht, auf zu starke Lichteinstrahlung zu reagieren und sich mit Hilfe der Geißel in Richtung geringerer Lichtintensität zu bewegen, ein Vorgang den man auch als negative Phototaxis bezeichnet. Um diesen Reaktion der Zelle auf den Umweltreiz zu ermöglichen, ist es nötig, dass der äußere Reiz - in diesem Fall die elektromagnetische Strahlung - zunächst an der äußeren 2 1.2 Funktion und Aufbau von Signaltransduktionswegen Zellmembran detektiert und in Konformationsänderungen des Rezeptors umgesetzt wird, so dass das Signal letztlich ins Innere der Zelle bis zum molekularen Motor gelangt, der die Geißelbewegung steuert. Der genaue molekulare Mechanismus dieser Signalprozesse in der Zellmembran wird in der vorliegenden Arbeit untersucht. Um die genauen Mechanismen, die hierbei eine Rolle spielen, verstehen zu können, ist es zunächst erforderlich, die verschiedenen Komponenten, die bei derartigen Signalprozessen eine Rolle spielen, zu beschreiben. 1.2 Funktion und Aufbau von Signaltransduktionswegen Um einen Überblick zu erhalten, auf welche Weise in Zellen äußere Stimuli aufgenommen, prozessiert und weitergeleitet werden, erfolgt zunächst eine kurze Darstellung wichtiger Elemente von Signaltransduktionswegen. Signalübertragungsprozesse werden immer durch extrazelluläre oder intrazelluläre Stimuli eingeleitet. Während einzellige Organismen direkt auf Umwelt- und Umgebungseinflüsse wie z.B. Licht, Hitze, Lock- oder Hemmstoffe reagieren und sich beispielsweise durch Veränderung des Stoffwechsels, der Expression bestimmter Gene oder der Geißelbewegung den Umweltbedingungen anpassen können, spielt bei mehrzelligen Organismen darüber hinaus die Kommunikation zwischen Zellen eine wichtige Rolle. Als Signalstoffe für die interzellulare Kommunikation sind hierbei unter anderem Hormone (z. B. Insulin, Adrenalin), Cytokine (z.B. Interferone oder Interleukine), Wachstumsfaktoren aber auch Neurotransmitter zu nennen. Wichtige Vorgänge, die auf diese Weise gesteuert werden, sind beispielsweise die Zellproliferation, der programmierte Zelltod (Apoptose), die Immunantwort oder der Sehvorgang. Sowohl bei ein- als auch bei mehrzelligen Organismen erfolgt anschließend die Verarbeitung der Signale durch Signalübertragungskaskaden, bei denen die Signale zunächst durch Proteine in der Zellmembran oder innerhalb der Zelle, den so genannten Rezeptoren, aufgenommen werden. Es gibt verschiedene Klassen von Rezeptorproteinen, die sich hinsichtlich ihrer Funktion, Lokalisation sowie ihrer Struktur unterscheiden. Aufgrund ihrer unterschiedlichen Lokalisation kann zunächst zwischen cytosolischen und membranständigen Rezeptoren unterschieden werden. Cytosolische Rezeptoren befinden sich ausschließlich im Zellinneren, so dass die Signalmoleküle, die an sie binden – die so genannten Liganden – durch die äußere Zellmembran diffundieren müssen. Daher müssen die Liganden relativ klein und hydrophob sein. 1.2 Funktion und Aufbau von Signaltransduktionswegen 3 Membranständige Rezeptoren bestehen dagegen aus einer extrazellulären Domäne, an der die Ligandenbindung erfolgt, wodurch Konformationsänderungen in der so genannten Transmembran Domäne ausgelöst und an die cytosolische Domäne übertragen werden. Daher wird das extrazelluläre Signal ins Zellinnere übertragen, ohne dass der Ligand selbst die Zellmembran durchquert. Aufgrund unterschiedlicher Signalübertragungs-Mechanismen können membranständige Rezeptoren in unterschiedliche Gruppen unterteilt werden: Ionenkanal-gekoppelte Rezeptoren, G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sowie Enzym-gekoppelte Rezeptoren. Abb. 1.1 zeigt schematisch die unterschiedliche Funktionsweise dieser drei Klassen. a) Ion channel-coupled receptor Inactive Exterior Cytosol b) GPCRs Active Ligand binding-site Ligand Amino Active Inactive Ion α β γ Receptor protein c) Tyrosine kinase receptor (enzymatic receptor) Inactive β γ Inhibits adenylate cyclase and ↓ cAMP αl Actvates adenylate cyclase and ↑ cAMP αS Actvates PLC αq d) Cytokine receptor (enzyme-linked receptor) Active Active Inactive P P Signalling cascade, MAPK, Akt and JNK pathway activation JAK JAK P P JAK JAK P Stat P P Stat P Signalling cascade, JAK/STAT pathway activation Abb. 1.1: Funktionsprinzip der 4 verschiedenen Klassen membranständiger Rezeptoren (nach Dorsam und Gutkind., 2007) Bei den Ionenkanal-gekoppelten Rezeptoren handelt es sich um Transmembranproteine, die aufgrund der Ligandenbindung die Permeabilität der Plasmamembran für bestimmte Ionen verändern. Diese Klasse von Rezeptoren spielt überwiegend bei der Übertragung elektrischer Signale zwischen Neuronen über Synapsen oder bei der Übertragung des Nervensignals auf den Muskel eine Rolle. 4 1.2 Funktion und Aufbau von Signaltransduktionswegen G-Protein-gekoppelte Rezeptoren sind an zahlreichen wichtigen physiologischen Prozessen wie dem Sehvorgang, bei der Weiterleitung von Geruchsreizen, bei Entzündungsprozessen sowie beim Zellwachstum und der Zelldifferenzierung beteiligt (Rockmann, 2002). Trotz der enormen funktionellen Vielfalt der GPCRs sind sie sich strukturell sehr ähnlich. Alle GPCRS besitzen eine extrazelluläre Domäne, in der sich häufig die Ligandenbindungsstelle befindet. Die Transmembran-Domäne besteht - als gemeinsames Strukturmerkmal aller GPCRs - aus 7 Helices, die die Membran durchspannen; ein Strukturmotiv, das auch im untersuchten bakteriellen Photorezeptor SRII vorliegt. In der cytoplasmatischen Domäne befindet sich schließlich die Bindungsstelle für die so genannten GTP-bindenden Regulatorproteine (GProteine). Durch die Aktivierung zerfällt das heterotrimere G-Protein, wodurch die αUntereinheit sich vom Rezeptor lösen, an das Zielprotein binden und dadurch die Aktivität dieses Proteins modulieren kann. Bei der dritten Klasse von membrangebundenen Rezeptorproteinen handelt es sich um Enzymgekoppelte-Rezeptoren. Eine besondere Bedeutung für Zellwachstum und Differenzierung in Eukaryoten haben die so genannten Rezeptor-Tyrosinkinasen (siehe Abb. 1c). Bei diesen erfolgt durch die Bindung von Peptidhormonen und Wachstumsfaktoren an die extrazelluläre Domäne eine Dimerisierung des Rezeptors sowie eine Phosphorylierung der jeweils anderen Polypeptidkette. Diese autophosphorylierten Tyrosinreste dienen anschließend als Bindungsstellen für weitere Proteine des Signalwegs, die ihrerseits durch die katalytische Domäne des Rezeptors phosphoryliert und dadurch aktiviert werden. Manche Rezeptoren für lokal wirkende Signalpeptide (Cytokine) besitzen keine intrinsische enzymatische Aktivität sondern aktivieren Signalproteine über assoziierte Enzyme. In eukaryotischen Zellen handelt es sich dabei ausschließlich um Tyrosin- sowie Serin- oder Threoninkinasen, bei Bakterien sind dagegen häufig Histidinkinasen am Rezeptor assoziiert. Auch der in dieser Arbeit untersuchte bakterielle Photorezeptor SRII leitet das Signal über eine Histidinkinase ins Zellinnere weiter. Daher wird im folgenden Abschnitt genauer auf über Histidinkinasen vermittelte Signalwege in Bakterien eingegangen. 1.3 2-Komponenten Signalwege in Bakterien 5 1.3 2-Komponenten Signalwege in Bakterien In Bakterien werden eine Vielzahl von Reizen mit Hilfe zweier Familien von Signalproteinen verarbeitet und in eine zelluläre Antwort umgewandelt: Die eine Familie wird durch eine homologe Domäne charakterisiert, die eine Histidinkinase-Aktivität besitzt und häufig zu einer intrazellulären Domäne eines Membranrezeptors gehört, bei der anderen Familie handelt es sich um homologe cytoplasmatische Proteine, die als so genannte Antwort-Regulatoren (response regulators) fungieren (Stock et al. 1989). In einem typischen 2-Komponenten Signalweg autophosphoryliert die durch den externen Reiz aktivierte Histidinkinase zunächst eine Histidin-Seitenkette, wodurch eine energiereiche Phosphoamidat-Bindung gebildet wird. Die Rezeptoren liegen dabei im inaktiven Zustand normalerweise als Monomere vor und dimerisieren infolge der Aktivierung des Rezeptors, wodurch die Autophosphorylierung durch die Kinase ermöglicht wird. Sowohl Struktur als auch Aktivierungsmechanismus dieser Rezeptoren erinnern daher an Rezeptor-Tyrosinkinasen in Eukaryoten (siehe Kapitel 1.2). In einem zweiten Schritt wird der Phosphorylrest anschließend auf eine Aspartat-Seitenkette des Antwort-Regulators übertragen, der durch die daraufhin erfolgenden Konformationsänderungen aktiviert wird und die zelluläre Antwort einleitet. Die im ersten Schritt gebildeten Phosphoamidat-Bindungen sind dabei wesentlich energiereicher als die Phosphoesterbindungen von phosphorylierten Serin- oder Threonin-Seitenketten, so dass sie hervorragend zur Übertragung von Phosphorylresten geeignet sind, während die Energie der Phosphoacylbindungen stark von der Proteinumgebung abhängig sind, so dass phosphorylierte Aspartat-Seitenketten vermutlich weit reichende Konformationsänderungen im Antwort-Regulator vermitteln können (Stock et al., 2000). Die beiden beteiligten Proteinfamilien steuern dabei eine Vielzahl von zellulären Prozessen wie beispielsweise die Synthese von porenformenden Membranproteinen - den so genannten Porinen - als Antwort auf Veränderungen der Osmolarität des Mediums oder die Chemotaxis, bei der die Bewegungsrichtung des Bakteriums als Folge eines Gradienten von Lock- oder Hemmstoffen verändert wird (Stock et al., 1990). Die Antwortregulatoren können dabei als Transkriptionsfaktoren die Genexpression steuern, als Enzyme chemische Reaktionen katalysieren oder über Protein-Protein Wechselwirkungen weitere Proteine aktivieren. Die große Vielfalt der zellulären Antworten, trotz des sehr einfachen Grundprinzips des Signalwegs, wird durch den modularen Aufbau des 2-Komponenten Systems möglich. Die 6 1.3 2-Komponenten Signalwege in Bakterien bakteriellen Signaltransduktions-Proteine bestehen in der Regel aus verschiedenen Domänen, so dass durch unterschiedliche Kombinationen der begrenzten Zahl von Modulen eine große Vielfalt der regulatorischen Systeme möglich wird (Galperin und Gomelsky, 2005). Abbildung 1.2a zeigt schematisch das Prinzip eines einfachen 2 Komponenten Systems, Abb. 1.2b einige Beispiele, wie durch unterschiedliche Kombinationen der Module verschiedene zelluläre Antworten erreicht werden. Histidine kinase Response regulator P H Input domain ATP receiver output domain domain Autokinase Phospho- ATPtransfer binding domain domain a Osmolarity sensing P P Ham HNGF EnvZ P b Oxygen sensing a) PAS D OmpR P P P HNGF D ArcB H D ArcA H KinA Periplasm PAS PAS P Motility D Receptor adaption CheB P D KinB CheY P P HNGF PAS D P2 P3 NGFG P5 CheA P d Sporulation regulation Transcription P P c Chemosensoring Transcription Spo0F HNGF inner membrane Cytoplasm D H Spo0B Spo0A Transcription b) Abb. 1.2: a) Prinzip des 2-Komponenten Wegs in Bakterien: ein äußeres Signal wird durch einen Membranrezeptor erkannt, wodurch die Kinaseaktivität der cytoplasmatischen Domäne oder der assoziierten Proteinkinase aktiviert wird. Die Phosphorylgruppe wird anschließend auf die Empfängerdomäne des Antwort-Regulators übertragen, der die zelluläre Antwort einleitet (nach Jensen et al., 2002). b) Unterschiedliche Kombinationen von Modulen in verschiedenen 2-Komponenten Signalwegen ermöglichen verschiedene Zellantworten (nach Wadhams und Armitage, 2004). Durch den modularen Aufbau können zudem verschiedene Signale integriert werden, da ein Antwortregulator in einigen Fällen durch verschiedene Histidinkinasen aktiviert werden kann. Dies ist beispielsweise bei der zuvor erwähnten Chemotaxis der Fall (siehe Kapitel 1.3.1). Da bei diesem Signaltransduktionsweg auch viele Komponenten eine Rolle spielen, die auch bei der durch den Photorezeptor SRII vermittelten negativen Phototaxis wichtig sind, folgt anschließen eine etwas genauere Beschreibung der Bestandteile dieses Signalwegs. 1.3 2-Komponenten Signalwege in Bakterien 7 1.3.1 Der Signaltransduktionsweg der bakteriellen Chemotaxis Die Chemotaxis ist ein Mechanismus, durch den Bakterien schnell und effizient auf Veränderungen in der chemischen Zusammensetzung ihrer Umgebung reagieren können. Die chemotaktischen Rezeptoren detektieren bestimmte Lock- oder Hemmstoffe, wodurch bei letzteren eine Veränderung der Rotationsrichtung des Flagellums erfolgt, so dass das Bakterium von einer geradlinigen Bewegung in eine zufällige Taumelbewegung übergeht, bis sich die Rotationsrichtung erneut ändert, das Bakterium nun aber in eine andere Richtung schwimmt (Bren und Eisenbach, 2000). Auf diese Weise können sie eine günstige chemische Umgebung erreichen und unvorteilhafte Umweltbedingungen mit hohen Konzentrationen an schädlichen Stoffen vermeiden. Um eine einheitliche Rotationsrichtung des Flagellums zu ermöglichen, müssen viele Signale, die von den unterschiedlichen Rezeptoren für die einzelnen Lock- oder Hemmstoffe detektiert werden, in einen einheitlichen Signalweg integriert werden. Auch die zelluläre Antwort einiger Photorezeptoren von Archaebakterien wie unter anderem von SRII - besteht in einer Änderung der Rotationsrichtung des Flagellums. Neben der Chemo- und Phototaxis werden in manchen Bakterien auch taktische Antworten auf weitere physikalische Reize wie Temperatur (Thermotaxis), Salzgehalt (Osmotaxis), Sauerstoffgehalt (Aerotaxis), pH-Wert und sogar auf elektrische oder magnetische Felder vermittelt (Bourret und Stock, 2002). Dabei stellt sich die Frage nach einem einheitlichen Funktionsprinzip, um die beteiligten Signaltransduktionswege eines Bakteriums aufeinander abzustimmen. Die wesentlichen Komponenten dieser Signalwege von der Rezeption des extrazellulären Signals bis zur Transduktion zum molekularen Motor, der die Geißelbewegung steuert, sind in Abb. 1.3 dargestellt: Flagellar motor CheZ Inner membran Cytoplasm CheA MCP P MCP FliM P CheR CheB Periplasm MCP MCP CheY P CheW + CH3 PBP - CH3 Abb. 1.3: Vereinfachendes Schema zur Darstellung der an der bakteriellen chemotaktischen Signaltransduktion beteiligten Komponenten (nach Wadhams und Armitage, 2004). 8 1.3 2-Komponenten Signalwege in Bakterien Das Signal muss dabei zwischen zwei supramolekularen Komplexen übertragen werden: Das äußere Signal wird zunächst von einem Rezeptor Komplex empfangen - im Fall der Chemotaxis befinden sich diese überwiegend an den Polen der Zelle. Die Zellantwort erfolgt anschließend durch einen Flagellum-Motor Komplex, von dem jede Zelle etwa 5 bis 10 Stück besitzt und die in der äußeren Zellemembran verteilt sind (Bren und Eisenbach, 2000). Die Übertragung zwischen den beiden Komplexen wird durch ein einziges Signalprotein vermittelt, dem Antwort-Regulator CheY. Wie beim typischen 2-Komponenten Signalweg erfolgt die Aktivierung des Antwort-Regulators durch eine Phosphorylierung einer AspartatSeitenkette, wodurch auf der einen Seite die Affinität des Proteins für den Rezeptor Komplex verringert, andererseits die Affinität für das Protein FliM des Flagellum-Motor Komplexes erhöht wird (Falke et al., 1997). Durch die Bindung von CheY an das Schalterprotein FliM wird die Richtung der Rotation des Motors umgekehrt. Beendet wird das Signal durch eine Dephosphorylierung des Antwortregulators, die durch die Phosphatase CheZ katalysiert wird. Hierdurch ist eine schnelle Signalterminierung möglich (Wadhams und Armitage, 2004). Neben dem Antwortregulator CheY kann noch ein zweiter Antwort-Regulator infolge der Phosphorylierung durch die Kinase aktiviert werden. Dabei handelt es sich um die Methylesterase CheB, die bei der Signaladaption beteiligt ist. Obwohl die Signaltransduktion also durch eine Histidin-Aspartat-Phosphoryl-Übertragung geschieht, gibt es einige Unterschiede zum prototypischen 2-Komponenten Signalweg, die vor allem in der Struktur und Funktionsweise der Rezeptorkomplexe begründet liegen: Während in einem 2-Komponenten Signalweg die Rezeptoren normalerweise über eine intrinsische enzymatische Aktivität verfügen, wird im chemotaktischen Signalweg der Phosphorylrest durch eine assoziierte Histidinkinase auf den Antwortregulator CheY übertragen. Diese Histidinkinase wird mit CheA bezeichnet und ist über mehrere Adaptorproteine, CheW, an verschiedene Chemorezeptoren gebunden. Durch die räumliche Trennung der Rezeptor- und der Kinasefunktion, wird es der Zelle ermöglicht, verschiedene teils gegensätzliche Signale auf der Ebene der Histidinkinase zu integrieren. Die Umweltbedingungen werden in der Zelle folglich durch die Konzentration von aktivierter, autophosphorylierter Histidinkinase CheA zusammengefasst (Bourret und Stock, 2002). Im Unterschied zu Histidinkinase-Rezeptoren liegen die Chemorezeptoren bereits im inaktiven Zustand als Dimere vor; die Aktivität der assoziierten Histidinkinase wird also nicht über die Verschiebung des Gleichgewichts zwischen Monomeren und Dimeren wie bei Histidinkinase-Rezeptoren reguliert (vgl. Kapitel 1.3). Darüber hinaus können die Rezeptoren in der 1.3 2-Komponenten Signalwege in Bakterien 9 Zellmembran durch Interaktion mit anderen Homodimeren höhere supramolekulare Komplexe bilden (Liu et al., 1997). Abbildung 1.4 zeigt den typischen Aufbau eines bakteriellen Chemorezeptors, dem Aspartat-Rezeptor Tar aus escherichia coli, sowie die mit dem Rezeptor assoziierten Proteine: Maltose Binding Protein Aspartate Binding Domain TransMembrane Region Linker Region Aspartate Receptor Periplasm Maltose binding protein TransMembrane Signaling Domain Periplasm Inner membrane Cytoplasm MCP dimer Cytoplasm CheR Methylation Region CheR Cytoplsmic Domain CheW CheW Signaling Domain CheW CheA dimer CheY/ CheA Histidine Kinase CheB a) CheY b) CheZ Abb. 1.4 a) Architektur eines typischen bakteriellen Rezeptor-Kinase Signalkomplexes: Der stabile ternäre Kernkomplex besteht aus dem Dimer des bakteriellen Aspartatrezeptor Tar von Escherichia coli, dem Adapterprotein CheW sowie der Histidinkinase CheA (nach Falke et al., 1997). b) Strukturen der Komponenten des chemosensorischen Systems in Escherichia coli (aus Wadhams und Armitage, 2004). Die Ligandenbindung an den Chemorezeptoren erfolgt an der extrazellulären Domäne der Rezeptoren. Häufig können chemotaktische Rezeptoren zwei verschiedene Liganden binden: Einen direkt im Interface des Dimers, den anderen über ein assoziiertes Bindungsprotein, im Fall des Chemorezeptors Tar das Maltose-bindende Protein. Die Transmembrandomäne jedes Monomers eines Chemorezeptors besteht in der Regel aus zwei Helices, die die Membran durchspannen. Infolge der Ligandenbindung werden Konformationsänderungen im 4-Helixbündel des Dimers ausgelöst, die für die Signalübertragung durch die Membran von Bedeutung sind. Durch die ebene Membran sind die Transmembranhelices auf translatorische Bewegungen senkrecht oder parallel zur Membranebene oder auf 10 1.3 2-Komponenten Signalwege in Bakterien Rotationsbewegungen beschränkt, bei denen die Drehachse entweder senkrecht oder parallel zur Membranebene liegt. Basierend auf diesen Freiheitsgraden sind verschiedene Modelle für die Signalübertragung durch die Membran vorgeschlagen worden: Nach einem Modell wird die Signalübertragung durch konzertierte Rotationen der Transmembranhelices beider Monomere vermittelt, wobei die Drehachse senkrecht zur Membran verläuft (Yeh et al., 1996). Ein anderes Modell beschreibt hingegen eine geringfügige Rotation einer Transmembranhelix relativ zur anderen, so dass eine Kippbewegung der Helix entsteht, die zudem von einer Translationsbewegung überlagert wird (Chervitz und Falke, 1996). Neben der Kristallstruktur des aktivierten Aspartatrezeptors Tar deuten auch EPR-Messungen auf eine signifikante translatorische Bewegung einer Transmembranhelix relativ zur anderen hin. Durch eine solche kolbenartige Bewegung wird möglicherweise der Signaltransfer durch die Membran vermittelt (Ottemann et al., 1999). Auch durch eine Verschiebung des Gleichgewichts zwischen einer geordneten und einer weniger strukturierten Konformation der cytoplasmatischen Domäne infolge der Aktivierung durch den Rezeptor, könnte beim Signaltransfer von der extrazellulären Bindungsdomäne zur Signaldomäne eine Rolle spielen, so dass dort die Histidinkinase CheA aktiviert wird (Kim et al., 2002). Derartige Modelle sind auch im Bezug auf die Signalweiterleitung beim Transducer des untersuchten Photorezeptors SRII interessant. Die Transmembranhelices sind über eine Linker-Region, die eine so genannte HAMPDomäne enthalten, mit der cytoplasmatischen Signaldomäne verbunden. HAMP-Domänen sind in einer Reihe von Proteinfamilien mit unterschiedlichen Funktionen wie Histidinkinasen, Adenylatcyclasen, Methyl-akzeptierende Chemotaxisproteine sowie Phosphatasen konserviert und spielen in allen Fällen bei Signalübertragungsprozessen eine entscheidende Rolle. Vermutlich wird durch den Wechsel zwischen zwei unterschiedlichen Konformationen der HAMP-Domäne das Signal von der Transmembrandomäne verstärkt und an die cytoplasmatische Signaldomäne weitergeleitet (Aravind et al., 1999). Auch beim Signalkomplex des Photorezeptors SRII sind HAMP-Domänen an der Signalverstärkung beteiligt, so dass bei der Beschreibung des Photorezeptors noch einmal genauer auf Modelle zur Beschreibung der Funktion dieser Domäne eingegangen wird (vgl. Kapitel 1.9). Die folgende Methylierungsdomäne spielt bei der Signaladaption eine entscheidende Rolle: Der Rezeptor kann an verschiedenen Glutamat-Seitenketten durch die Methyl-Transferase CheR methyliert werden. Daher werden die Chemorezeptoren auch als Methyl-akzeptierende Proteine bezeichnet. Aufgrund der Veränderung der Nettoladung infolge der Methylierung erhöht sich die Aktivität der assoziierten Histidinkinase. Der Antwort-Regulator CheB, der durch die Histidinkinase aktiviert wird, kann hingegen als Methylesterase fungieren und die 1.3 2-Komponenten Signalwege in Bakterien 11 Glutamat-Seitenketten wieder demethylieren, so dass die Aktivität des Rezeptors wieder verringert wird. Auf diese Weise wird ein negativer Rückkopplungsmechanismus gebildet. Durch die Regulierung des Methylierungslevels dieser Domäne wird die Kinase-Aktivität bei gleich bleibender Konzentration der Liganden daher nach einer gewissen Zeit auf das Ursprungsniveau zurückgesetzt und der Rezeptor somit für eine bestimmte Reizstärke desensibilisiert. Stattdessen kann er aber auf eine geringfügige Veränderung in der Konzentration der Lock- oder Hemmstoffe erneut reagieren (Sourjik und Berg, 2002). Bakterienzellen besitzen also ein zeitliches Adaptionssystem, welches ihnen ermöglicht, sich entlang eines Konzentrationsgradienten zu bewegen, eine räumliche Wahrnehmung dieses Gradienten wäre ihnen aufgrund der geringen Größe einer Bakterienzelle auch nicht möglich. Der Methylierungsdomäne folgt schließlich die Signaldomäne, die den ternären Kernkomplex mit CheW und CheA bildet und für die Regulation der gebundenen Histidinkinase verantwortlich ist. Auch die anderen Komponenten des Signalwegs wie die Phosphatase CheZ können in Form eines Multiproteinkomplexes an den Signalkomplex binden. Solche großen Proteinkomplexe sind im Gegensatz zu Netzwerken von löslichen Proteinen ein häufig vorkommendes Merkmal von Signaltransduktionswegen. Vermutlich kann auf diese Weise ein unerwünschter „cross-talk“ zwischen unterschiedlichen Signalwegen vermieden werden. 1.4 Funktion und Struktur der archaebakteriellen Rhodopsine Anhand des Signalwegs der Chemotaxis konnte gezeigt werden, mit Hilfe welcher Komponenten Bakterienzellen auf spezifische äußere Reize reagieren und ihre Bewegungsrichtung dementsprechend anpassen können. An erster Stelle des Signalwegs stehen dabei die Chemorezeptoren, die die Aktivität der assoziierten Histidinkinase infolge von Ligandenbindung regulieren. Wie aber kann eine Bakterienzelle auf Licht bestimmter Wellenlänge reagieren? Es dürfte klar sein, dass die entsprechenden Photorezeptoren, die für die Detektion der Photonen und die Umwandlung des Lichtreizes in ein chemisches Signal zuständig sind, eine ganz andere Struktur und Funktionsweise als die Chemorezeptoren haben. Im halophilen Archaeon Halobacterium salinarium wird die Phototaxis durch zwei Rezeptoren vermittelt – Sensory Rhodopsin I und II (SRI und SRII) - die zur Klasse der archaebakteriellen Rhodopsine gehören. Diese Klasse von Membranproteinen besteht ähnlich wie der Photorezeptor Rhodopsin in der Retina von Wirbeltieren aus 7 Transmembranhelices, die eine innere Bindungstasche für den kovalent gebundenen Chromophor Retinal, einem Vitamin A-Derivat, bilden. Neben der sensorischen Funktion bei der Phototaxis können Mitglieder dieser Proteinfamilie auch als 12 1.4 Funktion und Struktur der archaebakteriellen Rhodopsine Energieumwandler fungieren: In H. salinarium dienen die beiden Photorezeptoren Bacteriorhodopsin und Halorhodopsin dabei als Transportproteine, die einen lichtinduzierten, elektrogenen Transport von geladenen Teilchen durch die Membran ermöglichen. Die Protonenpumpe Bacteriorhodopsin wandelt durch den Transport von Protonen aus der Zelle die Lichtenergie in einen elektrochemischen Gradienten um, der zur Synthese der energiereichen Verbindung Adenosintriphosphat (ATP) genutzt wird. Die Energie der absorbierten Photonen wird somit letztlich in chemische Energie umgewandelt. Statt Protonen transportiert Halorhodopsin Chloridionen mit Hilfe der Energie der absorbierten Photonen gegen das Membranpotential in die Zelle hinein, wodurch das osmotische Gleichgewicht beim Zellwachstum besser gewahrt bleiben kann. Um effizient Energie gewinnen zu können, müssen die Zellen allerdings in Regionen mit optimaler Beleuchtungsstärke gelangen: Mit Hilfe des Photorezeptors SRI, der orangefarbenes Licht detektiert, wodurch letztlich die Geißelbewegung beeinflusst wird, können H. salinarium Zellen Gebiete erreichen, in denen die Ionenpumpen optimal arbeiten. Dieser Prozess wird mit positiver Phototaxis bezeichnet. Bei zu hoher Lichtintensität und einem gleichzeitig hohen Sauerstoffgehalt der Umgebung, ist es für die Zelle bei ausreichender Energieversorgung hingegen günstiger, in Gebiete mit geringerer Lichteinstrahlung zu gelangen, um photooxidative Schäden zu vermeiden. Diese negative Phototaxis wird durch Absorption von blau-grünem Licht durch den Photorezeptor SRII eingeleitet. Der detektierte Spektralbereich liegt also im Bereich des Energiemaximums des Sonnenlichts, so dass die Zellen sehr sensitiv auf Sonneneinstrahlung reagieren können. Die Reaktion des Archaeons wird wie bei der Chemotaxis durch eine Änderung der Rotationsrichtung des Flagellums bewirkt, wodurch das Bakterium vorübergehend in eine zufällige Taumelbewegung übergeht, bevor es sich wieder geradlinig in eine neue Richtung bewegt. Abbildung 1.5 zeigt die 4 verschiedenen archaebakteriellen Rezeptoren, die in den Zellmembranen von H. salinarium identifiziert werden konnten. 1.4 Funktion und Struktur der archaebakteriellen Rhodopsine SRI HtrI 13 SRII HtrII Membrane Cytoplasm HR methylation sites - Cl his-kinase his-kinase BR H + phosphoregulator FLAGELLAR MOTOR SWITCH Abb. 1.5: Unterschiedliche Funktionen der 4 verschiedenen archeabakteriellen Rhodopsine in H. salinarium (nach Hoff et al., 1997). Die 4 Beispiele zeigen, dass archaebakterielle Rhodopsine völlig unterschiedliche Funktionen haben können, obwohl sich die Rezeptoren selbst in ihrer dreidimensionalen Struktur kaum unterscheiden. Der Unterschied zwischen den Ionenpumpen und den sensorischen Rezeptoren wird unter anderem durch die so genannten halobakteriellen Transducer Proteinen (Htr) bewirkt, die an die sensorischen Rhodopsine binden und das vom Rezeptor empfangene Signal über die Membran ins Zellinnere übertragen. Die Transducer haben eine strukturelle und funktionelle Ähnlichkeit zu den Chemorezeptoren in Eubakterien: Wie bei diesen durchspannen zwei α-Helices die Membran, die über eine unterschiedlich große periplasmatische Schleife miteinander verbunden sind, in der im Fall der Chemorezeptoren die Ligandenbindung erfolgt. Die Homologie zu den chemotaktischen Rezeptoren wird besonders im Fall des Transducers HtrII von H. salinarium deutlich, da dieser in der extrazellulären Domäne ebenfalls eine Ligandenbindungsstelle für Serinmoleküle besitzt und somit neben seiner Rolle als Transducer für den Photorezeptor SRII auch als Chemorezeptor fungieren kann (Hou et al., 1998). Auf die Transmembrandomäne folgt eine Linker-Region mit zwei HAMPDomänen, die vermutlich bei der Signalweiterleitung und Amplifikation eine entscheidende Rolle spielen. Die Adaption an eine bestimmte Reizstärke erfolgt ebenfalls an der folgenden Methylierungsregion, das Signal wird schließlich über die Signaldomäne an eine assoziierte Histidinkinase weitergeleitet. Die Transducerproteine bilden dabei wie die Chemorezeptoren Homodimere. Da ein Transducermolekül zudem an jeweils einen Photorezeptor bindet, 14 1.4 Funktion und Struktur der archaebakteriellen Rhodopsine entsteht insgesamt ein Komplex, der aus 2 Rezeptor- und zwei interagierenden Transducerproteinen besteht. Genaue strukturelle Informationen liegen mittlerweile vom Komplex des Photorezeptors NpSRII vor, eines zu SRII homologen Proteins des haloalkaliphilen Archaeon Natronobacterium pharaonis mit seinem Transducer NpHtrII. Das Protein ist weniger empfindlich gegenüber einer Verringerung der Ionenstärke des umgebenden Lösungsmittels als dies bei SRII von H. salinarium der Fall ist und eignet sich daher besser für spektroskopische und kristallographische Untersuchungen als SRII. Neben der Protonenpumpe BR ist NpSRII mittlerweile das wohl am häufigsten untersuchte archaebakterielle Rhodopsin, so dass neben zahlreichen spektroskopischen Daten auch hoch aufgelöste Kristallstrukturen des Rezeptors alleine sowie im Komplex mit einem gebundenen Transducermolekül vorliegen. Abbildung 1.6 zeigt schematisch die Architektur des Signalkomplexes vom Photorezeptor NpSRII mit seinem Transducer NpHtrII. SRII TM domain HAMP domains Methylation & Signalling domain HtrII CheW CheA CheY P CheY P Flagellar motor Abb. 1.6: Architektur des Komplexes aus NpSRII und dem zugehörigen Transducer NpHtrII: Das Homodimer des Transducers NpHrII wird in der Transmembrandomäne von zwei Untereinheiten des Photorezeptors NpSRII flankiert. Die Transmembrandomäne des Transducers ist über einen aus zwei HAMP-Domänen bestehenden Linkerbereich mit der Methylierungs- sowie der Signaldomäne verbunden (nach Sasaki und Spudich, 2008). 1.4 Funktion und Struktur der archaebakteriellen Rhodopsine 15 Die Abbildung veranschaulicht, dass durch die Bindung der Transducerproteine an die Photorezeptoren in Archaebakterien die gleichen Signalwege aktiviert werden können wie durch chemotaktische Rezeptoren, so dass eine einheitliche zelluläre Antwort auf verschiedene Reize erhalten werden kann. Die Abbildung erklärt allerdings nicht, wie der Photorezeptor zuvor den „Lichtreiz“ detektieren, in ein biochemisches Signal umwandeln und an den Transducer weiterleiten kann. Weiterhin stellt sich die Frage, wieso Bacteriorhodopsin trotz nahezu gleicher dreidimensionaler Struktur und des gleichen gebundenen Chromophors wie die sensorischen Rhodopsine die Energie der absorbierten Photonen dazu verwenden kann, um Protonen durch die Zellmembran nach außen zu transportieren, während SRII stattdessen die Lichtenergie nutzt, um mit einem gebundenen Transducer zu interagieren und dadurch die Aktivität einer assoziierten Histidinkinase im Zellinneren zu beeinflussen. Wie im folgenden deutlich werden wird, sind einige der photochemischen Reaktionen der beiden archaebakteriellen Rhodopsine NpSRII und BR sehr ähnlich, so dass lediglich kleine mechanistische Unterschiede eine andere Funktion bewirken können. Tatsächlich ist es gelungen, durch Mutation von lediglich drei Aminosäuren, die Protonenpumpe Bacteriorhodopsin in einen Photosensor zu verwandeln (Sudo und Spudich, 2006). Umgekehrt kann auch SRII in Abwesenheit seines Transducers HtrII in geringem Maße Protonen durch die Membran transportieren (Spudich, 1994). Um diese Zusammenhänge verstehen zu können, ist es notwendig, die photochemischen Reaktionen von NpSRII und BR auf atomarer Ebene zu betrachten. Dies ist möglich, weil mittlerweile von beiden Rezeptoren neben zahlreichen biochemischen und spektroskopischen Daten einige hoch aufgelöste Kristallstrukturen vorliegen. Insbesondere bei BR konnten auf diese Weise die wichtigsten strukturellen Veränderungen des Rezeptors nach der Photoaktivierung erforscht werden. Bei NpSRII hingegen sind trotz dieser jahrelangen Bemühungen nach wie vor einige wichtige Fragen vor allem im Hinblick auf die Funktionsweise des NpSRII/NpHtrII-Signalkomplexes ungeklärt und somit Aufgabe aktueller und zukünftiger Forschungen, wie die Ausführungen in den nächsten Kapiteln zeigen werden. 16 1.5 Die Photochemie der archaebakteriellen Rhodopsine SRII und BR 1.5 Die Photochemie der archaebakteriellen Rhodopsine Sensory Rhodopsin II und Bacteriorhodopsin Alle archaebakteriellen Rhodopsine besitzen denselben Chromophor, das Vitamin A-Derivat Retinal, und werden daher auch als Retinalproteine bezeichnet. Das Retinal ist jeweils über eine protonierte Schiff-Base an einen Lysylrest der C-terminalen Helix (Helix G) des Proteins gebunden. Die protonierte Schiff-Base wird durch eine Salzbrücke mit einem Gegenion, einer negativ geladenen Seitenkette auf der dritten Transmembranhelix (Helix C) der Photorezeptoren, stabilisiert. Zusammen mit weiteren polaren Seitenketten sowie Wassermolekülen bilden die protonierte Schiff Base und das Gegenion ein ausgedehntes Wasserstoffbrückennetzwerk. Der Chromophor selbst findet in einer in allen archaebakteriellen Rhodopsinen weitgehend konservierten Bindungstasche innerhalb des Proteins Platz. Durch die Geometrie der Bindungstasche liegt der Chromophor im Dunkelzustand bei allen archaebakteriellen Rhodopsinen in der Regel in einer bestimmten Konformation, der so genannten all-trans Konfiguration vor. Im Vergleich zur Konformation von Retinal in Lösung wird der Chromophor dabei durch die Position und Orientierung der Seitenketten, die die Bindungstasche bilden, in einer gestreckten, nahezu planaren Geometrie gehalten. Durch die festgelegte Geometrie entstehen im Vergleich zum freien Retinal Spannungen im ausgedehnten konjugierten Elektronensystem des Chromophors (Spudich und Luecke, 2002). Durch diese Störungen und aufgrund von Wechselwirkungen der protonierten Schiff Base mit dem Gegenion sowie mit weiteren polaren oder geladenen Gruppen im Protein, ist die Energiedifferenz zwischen dem elektronischen Grundzustand und den angeregten Zuständen eines an das Apoprotein gebundenen Retinalmoleküls deutlich geringer als bei demselben Chromophor in Lösung (Yan et al., 1995). Das Absorptionsspektrum des Chromophors ist daher im Protein gegenüber dem Modellsystem in Lösung deutlich rot verschoben, ein Effekt der auch als „Opsin Shift“ bezeichnet wird. Abbildung 1.7a zeigt anhand einer Strukturüberlagerung die Geometrie des Chromophors im Dunkelzustand von NpSRII und BR, sowie einige der beteiligten Seitenketten, die die Bindungstasche für das Retinal bilden; Abbildung 1.7b stellt zudem das Wasserstoffbrückennetzwerk aus 4 polaren Seitenketten und einigen Wassermolekülen bei beiden Membranproteinen dar, durch das jeweils die protonierte Schiff Base komplexiert wird. 1.5 Die Photochemie der archaebakteriellen Rhodopsine SRII und BR 17 Wat404 Trp171 Thr204 Val108 Asp201 Lys205 Gly130 Wat400 Wat402 Retinal Wat404 Lys205 Wat403 Arg72 Tyr174 Phe127 Wat402 Trp76 Thr79 Asp75 Trp178 Retinal Abb. 1.7: a) Vergleich der Retinal-Bindungstaschen von NpSRII und BR. Das Retinal sowie nicht konservierte Seitenketten der Bindungstasche von SRII sind in rot, die entsprechenden Seitenketten und das Retinal von BR in blau dargestellt. Die in archaebakteriellen Rhodopsinen konservierten Seitenketten der Bindungstasche von NpSRII sind grau dargestellt (aus Royant et al., 2001). b) Wasserstoffbrückennetzwerk des aktiven Zentrums von NpSRII und BR: Das Retinal und Wassermoleküle sind in rot, Seitenketten von NpSRII in blau, Seitenketten von BR in schwarz dargestellt (aus Royant et al., 2001). Die Abbildung verdeutlicht, dass das Retinal in der Bindungstasche von NpSRII etwas weniger gekrümmt und damit weniger gespannt als in der Bindungstasche von BR ist. Dies könnte eine Erklärung dafür sein, warum das Absorptionsmaximum von NpSRII (ca. 500 nm) im Vergleich zum Absorptionsmaximum von BR, das bei ca. 560 nm liegt, deutlich blau verschoben ist. Allerdings bewirkt auch ein Austausch von 10 Aminosäuren der Bindungstasche von NpSRII zu den entsprechenden Aminosäuren von BR nur eine Verschiebung des Absorptionsmaximum um 24 nm zu höheren Wellenlängen (Shimono et al., 2001), so dass vermutlich teilweise weiter reichende Wechselwirkungen für die spektrale Verschiebung verantwortlich sind. Im Vergleich zu BR ist die Helix G von NpSRII, an die der Chromophor gebunden ist, geringfügig in Richtung der cytoplasmatischen Seite verschoben. Dadurch ist die Entfernung zwischen der protonierten Schiff Base und dem Gegenion auf Helix C geringer als bei BR. Die stärkere Salzbrücke zwischen der Schiffbase und dem Gegenion bei NpSRII ist vermutlich eine weitere wichtige Ursache für das verschobene Absorptionsmaximum von NpSRII im Vergleich zu BR (Kandori et al., 2001). Auch eine unterschiedliche Orientierung der Guanidinium-Seitenkette von Arginin 72 im Vergleich zum entsprechenden Arginin in BR (Arg 82) hat laut quantenchemischen Berechnungen einen starken Einfluss auf das unterschiedliche Absorptionsmaximum der beiden Proteine (Ren et al., 2001). Durch eine genaue Analyse der Struktur der aktiven Zentren von verschiedenen Retinalproteinen im Dunkelzustand kann man also verstehen, warum die archaebakteriellen Rhodopsine Licht unterschiedlicher Wellenlängen absorbieren und somit gewissermaßen Farben „erkennen“ 18 1.5 Die Photochemie der archaebakteriellen Rhodopsine SRII und BR können. Als nächstes ist zu klären, welche photochemischen Reaktionen in einem archaebakteriellen Rhodopsin ablaufen, wenn ein gebundenes Retinalmolekül Licht der entsprechenden Wellenlänge absorbiert. Durch die Absorption eines Photons geht das Retinalmolekül in einen angeregten Zustand über, beim Rückfall in den Grundzustand erfolgt zum Teil eine Rotation der π-Bindung zwischen dem 13. und 14. Kohlenstoffatom des Retinals, so dass eine Isomerisierung des Chromophors von der all-trans zur 13-cis Konfiguration stattfindet. Im Vergleich zur gestreckten Konformation des all-trans Isomers, liegt der Chromophor nun in einer gekrümmten Geometrie vor. Die unterschiedliche Struktur des Chromophors vor und nach der Photoisomerisierung verdeutlicht Abbildung 1.8: 9 11 13 15 + N hν 9 11 13 15 + N Abb. 1.8: Unterschiedliche Geometrie des all-trans Retinals im Vergleich zur 13-cis Form nach der Photoisomerisierung. Das Retinal in der 13-cis Konfiguration passt nun nicht mehr in derselben Weise in die Bindungstasche wie das planare all-trans Retinal, so dass Spannungen innerhalb des Chromophors auftreten. Diese Spannungen können strukturelle Umorientierungen in der Bindungstasche des Chromophors bewirken. Zusätzlich gelangt die protonierte Schiff Base in Folge der Isomerisierung in eine neue chemische Umgebung, wodurch Veränderungen im Wasserstoffbrückennetzwerk des aktiven Zentrums hervorgerufen werden. In einer Reaktionskette lösen diese zunächst relativ kleinen Umorientierungen einzelner Gruppen strukturelle Veränderungen im ganzen Protein – im Fall der Sensorischen Rhodopsine auch im Transducer - aus, bevor der Rezeptor wieder in den Grundzustand zurückkehrt. Die molekularen Reaktionen bei diesen Photozyklen werden im Folgenden am Beispiel von BR sowie NpSRII beschrieben. 1.6 Der Photozyklus von Bakteriorhodopsin 19 1.6 Der Photozyklus von Bacteriorhodopsin Durch die Kombination von spektroskopischen, biochemischen und kristallographischen Studien ist es möglich geworden, ein genaues Bild von den molekularen Mechanismen und Konformationsänderungen im Protein zu erhalten, durch die es der Protonenpumpe ermöglicht wird, ein Proton durch die Membran zu transportieren. Nach der Photoaktivierung und der Isomerisierung des gebundenen Retinals von der all-trans zur 13-cis Form durchläuft BR eine Sequenz von Reaktionen, durch die nacheinander die 6 Intermediate K, L, M1, M2, N und O gebildet werden, bevor es wieder in den Grundzustand zurückkehrt. Im Verlauf dieses Zyklus wird zunächst ein Proton an das extrazelluläre Medium abgegeben, bevor ein weiteres Proton von der cytosolischen Seite aufgenommen wird, so dass insgesamt ein Proton von der Zelle ans äußere Medium abgegeben wird. Die Intermediate unterscheiden sich mit Ausnahme des M1- und M2-Intermediats alle in ihren Absorptionsmaxima, so dass der grundlegende Photozyklus zunächst mit Hilfe optischer Spektroskopie beobachtet werden konnte (Lozier et al., 1975). Die zeitliche Abfolge der verschiedenen Intermediate nach der Photoaktivierung des Proteins ist in Abbildung 1.9 dargestellt: # Deprotonierung von Asp 85 # Reisomerisierung des Retinals 0,8 ms # 13cis Isomerisierung des Retinals BR568 5 ps O660 # Reprotonierung von Asp 96 durch Proton aus dem Cytoplasma 1,2 ms K590 H+ # Reprotonierung der Schiffschen Base durch Asp 96 2 μs N550 L550 # Deprotonierung der Schiffschen Base 5 ms M II 412 I M 412 70 μs # Protonierung von Asp 85 # Protonenabgabe an extrazelluläre Oberfläche - Abgabe an Bulk bei Æ BR wenn pH<5,8 - Abgabe an Bulk nach 1 ms, wenn pH>5,8 H+ Abb. 1.9: Photozyklus von Bacteriorhodopsin. Die Indizes kennzeichnen das jeweilige Absorptionsmaximum der verschiedenen Photointermediate (nach Heßling et al., 1997). Der erste Schritt ist die Isomerisierung des Chromophors von der all-trans in eine verdrillte 13-cis Konfiguration, die auf der Zeitskala von einigen Picosekunden abgeschlossen ist. Als Folge bildet sich das K-Intermediat, das erste bei tiefen Temperaturen stabilisierbare Zwischenprodukt. Die Bindungstasche des Retinals ist in BR etwas flexibler als in NpSRII. Daher treten infolge der Isomerisierung im K-Intermediat zunächst nur geringe Konformationsänderungen in der näheren Umgebung des Retinals auf. Durch die Isomerisierung wird aber 20 1.6 Der Photozyklus von Bakteriorhodopsin die Orientierung der protonierten Schiff Base geringfügig verändert, so dass das Wasserstoffbrückennetzwerk des aktiven Zentrums beeinflusst wird. Das an die Schiff Base gebundene Proton gerät dadurch in eine energetisch ungünstigere Umgebung, so dass die Übertragung des Protons auf das Gegenion Aspartat 85 (Asp85) begünstigt wird (Edman et al., 1999). Das L-Intermediat wird anschließend in einigen Mikrosekunden durch thermischen Zerfall des K-Intermediats gebildet. Durch die hierbei eintretenden geringfügigen strukturellen Veränderungen wird die Übertragung des an den Lysylrest der Schiff Base gebundenen Protons auf das Gegenion Asp85 vorbereitet. Vermutlich erfolgt dabei ein geringfügiges Abknicken der Helix C, so dass die Distanz der protonierten Schiff Base zum Gegenion verringert wird (Royant et al., 2000). Die weiteren Umorientierungen des Wasserstoffbrückennetzwerks dienen dazu, einen Weg für die Abgabe eines Protons an das extrazelluläre Medium zu bilden. Vermutlich erfolgt dabei eine Umorientierung des Guanidinium-Rests von Arginin 82 (Arg82) zum extrazellulären Medium (Luecke et al., 1999). Dadurch wird ebenfalls die elektrostatische Umgebung des Gegenions so verändert, so dass das Proton der Schiff Base leichter aufgenommen werden kann. Wie ursprünglich von Janos Lanyi und Dieter Oesterhelt vorgeschlagen und später mit Hilfe von Infrarotspektroskopie (Perkins et al., 1992; Rödig et al., 1999) und zeitaufgelöste elektronenkristallographische Studien (Subramaniam und Henderson, 1999) nachgewiesen wurde, kann das M-Intermediat in zwei Unterzustände mit identischen Absorptionsmaxima aber signifikant unterschiedlichen Proteinkonformationen unterteilt werden. Die Licht induzierten Umorientierungen des Retinals und die Veränderungen in der unmittelbaren Proteinumgebung führen im frühen M-Intermediat zunächst dazu, dass die Schiff Base deprotoniert und das Gegenion Asp85 protoniert wird. Zudem wird ein Proton durch einen von den 7 Transmembranhelices gebildeten Kanal an das extrazelluläre Medium abgegeben. Dieses Proton stammt vom Wasserstoffbrückennetzwerk zwischen dem Gegenion Asp85 und der extrazellulären Hälfte des Proteins, an dem unter anderem die Seitenketten von Arg82, Glu194 und Glu204 sowie einige Wassermoleküle beteiligt sind. Nachdem die elektrostatischen Veränderungen in der Nähe des Chromophors abgeschlossen sind, werden beim Übergang vom frühen zum späten M-Intermediat die wichtigsten Konformationsänderungen im Protein eingeleitet, die für die Wirkungsweise von BR als Protonenpumpe essentiell sind. Diese globalen Konformationsänderungen gehen ebenfalls vom Chromophor aus: Das direkt nach der Isomerisierung zur 13-cis Konfiguration noch verdrillte Retinal relaxiert in der Folge in eine energetisch günstigere weniger gespannte 1.6 Der Photozyklus von Bakteriorhodopsin 21 Konfiguration; die freiwerdende Energie wird dabei sukzessive in Konformationsänderungen des Proteins übertragen. Auf diese Weise wird infolge eines sterischen Konflikts zwischen einer Methylgruppe des relaxierten 13-cis Retinals mit einer aromatische Seitenkette der Helix F eine Auswärtsbewegung der cytoplasmatischen Hälfte von Helix F eingeleitet. Dabei dient ein benachbartes Prolin als „Scharnier“ für die Helixbewegung. Zeitgleich mit diesem „Abknicken“ der Helix F erfolgt eine Einwärtsbewegung des cytoplasmatischen Endes von Helix G, wie sowohl anhand von Elektronenspinnresonanz-Spektroskopie (EPR- Spektroskopie) (Steinhoff et al., 2000; Rink et al., 2000; Radzwill et al., 2001) als auch durch elektronenkristallographische Studien an 2D-Kristallen von im M2-Intermediat angereicherten BR-Mutanten (Subramaniam und Henderson, 2000) nachgewiesen werden konnte. Durch die Bewegungen der beiden Helices wird der cytoplasmatische Halbkanal geöffnet, der zuvor durch einige Seitenketten versperrt wurde. Hierdurch wird der Eintritt eines Protons vom Cytoplasma ins Proteininnere ermöglicht. Neben den Konformationsänderungen der beiden Helices erfolgt beim Übergang zum M2-Intermediat auch eine Umorientierung des Stickstoffatoms der Schiff Base, die nach der zuvor erfolgten Deprotonierung zur cytoplasmatischen Seite rotiert. Die Verbindung der Schiff Base zum extrazellulären Wasserstoffbrückennetzwerk wird dadurch unterbrochen und durch eine Wasserstoff- brückenbindung zur Asparaginsäure 96, die zum Protoneneintrittskanal auf der cytoplasmatischen Seite gehört, ersetzt (Kühlbrandt, 2000). Durch die erfolgten Konformationsänderungen gelangt die Seitenkette von Asp96 von einer relativ unpolaren in eine polarere Umgebung. Dadurch wird die Säurestärke der Carboxylfunktion erhöht, so dass beim Übergang vom späten M-Intermediat zum NIntermediat eine Protonenübertragung von Asp96 auf die Schiff Base erfolgen kann. Im darauf folgenden O-Intermediat erhält auch Asp96 durch Aufnahme eines Protons von einem im cytoplasmatischen Halbkanal fluktuierenden Wassermolekül den ursprünglichen Protonierungszustand wieder zurück (Sass et al., 2000). Schließlich wird auch Asp85 - der primäre Protonenakzeptor der Schiff Base - wieder deprotoniert, indem das Proton an das extrazelluläre Wasserstoffbrückennetzwerk weitergegeben wird (Luecke et al. 1999). Durch die thermische Relaxation des Retinals in die all-trans Konfiguration und das Rückschwingen der Helices F und G in ihre ursprünglichen Positionen erreicht das Protein wieder den Grundzustand und der Photozyklus ist abgeschlossen. 22 1.6 Der Photozyklus von Bakteriorhodopsin Die während des Photozyklus erfolgten Protonentransferschritte sind in Abbildung 1.10 zusammengefasst. H+ + Asp 96 Retinal Cytoplasma Proteinoberfläche NÆO MÆN Lys 216 L ÆM Asp 85 Asp 212 O Æ BR Arg 82 Glu 194 Glu 204 LÆM Proteinoberfläche Extrazellulär nach 1mm O Æ BR H+ + Abb. 1.10: Translokation eines Protons vom Cytoplasma über die Asparaginsäure 96 zur Schiff Base sowie von der Schiff Base über ein Wasserstoffbrückennetz zum extrazellulären Medium. Im Verlauf des Photozyklus ist folglich infolge der Isomerisierung des Retinals auf der extrazellulären Seite zunächst ein Proton von der Schiff Base auf das Gegenion und weiter über das Wasserstoffbrückennetzwerk an das extrazelluläre Medium übertragen worden, während auf der intrazellulären Seite ein Protonentransfer vom Cytoplasma über Asp96 auf die Schiff Base erfolgte. Ein Schlüsselereignis in diesem Mechanismus sind die Konformationsänderungen der Helices F und G im Verlauf des Photozyklus, wodurch die Verbindung der Schiff Base mit dem extrazellulären Medium durch eine Verbindung zum nun geöffneten Halbkanal auf der cytoplasmatischen Seite ersetzt wird. Durch diesen „molekularen Schalter“ wird folglich der gerichtete Transport eines Protons von der cytoplasmatischen zur extrazellulären Seite - also die Vektorialität des Protonentransfers - gewährleistet. 1.6 Der Photozyklus von Bakteriorhodopsin 23 Der Mechanismus dieses Schalters ist in Abbildung 1.11 schematisch dargestellt: a Ground state all-trans retinal protonated A G B C F D G F Inside C Asp96 Light Membrane E b L-intermediate 13-cis retinal protonated Asp85 Arg82 Outside F G C d N intermediate 13-cis retinal protonated F G c Late M intermediate 13-cis retinal neutral Abb. 1.11: Molekularer Mechanismus des gerichteten Protonentransports vom Cytoplasma zum extrazellulären Medium. Durch das Abknicken der Helix C nach der Isomerisierung des Retinals wird die Übertragung des Protons von der Schiff Base zum Gegenion Asp85 erleichtert. Aufgrund der bis zum späten M-Intermediat erfolgten Bewegungen der Helices F und G wird der cytoplasmatische Halbkanal geöffnet, so dass im darauf folgenden N-Intermediat ein Proton vom Cytoplasma aufgenommen und über Asp96 an die Schiff Base weitergeleitet werden kann. Nach der Abgabe eines Protons von Asp85 an das Wasserstoffbrückennetzwerk auf der extrazellulären Seite, dem Rückschwingen der Helices F und G in ihre Ausgangspositionen und der thermischen Rückisomerisierung des Retinals kehrt das Protein in den Grundzustand zurück (aus Kühlbrandt, 2000). Nachdem nun der Photozyklus von BR ausführlich beschrieben worden ist, bleibt die Frage zu klären, welche Reaktionsschritte in NpSRII identisch ablaufen und wo die Unterschiede zum Photozyklus von BR liegen, so dass BR als Protonenpumpe, NpSRII hingegen als Signalprotein fungieren kann. Eine ähnliche Reaktionsfolge wie bei BR ist auch deshalb zu erwarten, weil NpSRII in der Abwesenheit des Transducers ebenfalls Protonen durch die Membran pumpen kann, wenn auch nur mit sehr geringer Effizienz (Schmies et al., 2000). Bei Bindung von NpHtrII wird die Protonenpumpen-Aktivität allerdings vollkommen unterdrückt (Sudo et al., 2001), die Aufnahme und Abgabe von Protonen erfolgt dann jeweils von der extrazellulären Seite. Auch im Fall von NpSRII sind in den letzten Jahren große Anstrengungen unternommen worden, um beispielsweise mit Hilfe von Infrarot- oder EPR-Spektroskopie sowie mittels Röntgenstrukturanalyse den Aktivierungsmechanismus des Rezeptors zu erforschen. 24 1.6 Der Photozyklus von Bakteriorhodopsin Obwohl mittlerweile - neben den hoch aufgelösten Kristallstrukturen des Dunkelzustands vom Rezeptor alleine (Luecke et al., 2001; Royant et al., 2001) und im Komplex mit seinem Transducer (Gordeliy et al., 2002) - auch Strukturen von zwei verschiedenen Photointermediaten von NpSRII (Edman et al., 2002) bzw. dem NpSRII/HtrII-Komplex (Moukhametzianov et al., 2006) vorliegen, sind nach wie vor viele mechanistische Details der photochemischen Reaktionen nach der Aktivierung des Rezeptors ungeklärt, wie in den folgenden Kapitel ausgeführt wird. 1.7 Der Photozyklus von NpSRII Wie bei BR beginnt der Photozyklus von NpSRII mit der Photoisomerisierung des gebundenen Retinals von der all-trans zur 13-cis Konfiguration, woraufhin in einer Reaktionskette nacheinander die Photointermediate K, L, M1, M2, N und O gebildet werden, bevor der Rezeptor wieder in den Grundzustand zurückkehrt. Bereits die unterschiedlichen Absorptionsmaxima der einzelnen Intermediate deuten darauf hin, dass im Bereich des Chromophors ähnliche Reaktionen wie bei BR ablaufen. Die geringfügigen Verschiebungen der Absorptionsmaxima im K- sowie im L-Intermediat im Vergleich zum Grundzustand sind durch kleine strukturelle Veränderungen im Bereich des aktiven Zentrums zu Beginn des Photozyklus zu erklären, wodurch die Stärke der Salzbrücke zwischen der Schiff Base und dem komplexierten Gegenion Asp75 beeinflusst wird. Die deutliche Blauverschiebung des Absorptionsmaximums im M-Intermediat im Vergleich zum Grundzustand zeigt die erfolgte Deprotonierung der Schiff Base durch das Gegenion Asp75 beim Übergang zum frühen M-Intermediat an (Engelhard et al., 1996), wodurch die Verbindung der Schiff Base zum Wasserstoffbrückennetzwerk des aktiven Zentrums unterbrochen wird. Beim Übergang vom M1- zum M2-Intermediat sind die elektrostatischen Veränderungen im Bereich der Schiff Base zunächst abgeschlossen, so dass keine Veränderung des Absorptionsmaximums zu beobachten ist. Der Übergang kann daher nicht durch UV-Vis Spektroskopie, sondern nur mit Hilfe zeitaufgelöster Schwingungsspektroskopie beobachtet werden (Hein et al., 2003; Rivas et al., 2003). Mit dieser Methode können beim Übergang zum M2-Intermediat nämlich die wesentlichen Konformationsänderungen beobachtet werden, die im Fall von NpSRII zur Aktivierung des Transducers führen. Dieses Intermediat sowie die folgenden Intermediate konnten anhand von in vivo Versuchen bereits 1991 als die aktiven Signalzustände identifiziert werden (Yan et al., 1991). Im Vergleich zum M-Intermediat weist das folgende N-Intermediat wiederum ein deutlich zu größeren Wellenlängen verschobenes Absorptionsmaximum auf, was anzeigt, dass die Schiff Base wieder reprotoniert ist. Der Zerfall des M-Intermediats erfolgt allerdings 1.7 Der Photozyklus von NpSRII 25 ziemlich genau mit derselben Kinetik wie die Bildung des O-Intermediats, so dass das N-Intermediat nur im Gleichgewicht mit dem M- und O-Intermediat erhalten werden kann. Dennoch konnte die Existenz des N-Intermediats mit Hilfe von zeitaufgelöster Resonanz Raman Spektroskopie nachgewiesen werden (Gellini et al., 2000). Bei BR erfolgt die Reprotonierung der Schiff Base durch eine Asparaginsäure auf der cytoplasmatischen Seite, wodurch die Vektorialität der Protonenpumpe gewährleistet wird. Eine entsprechende Aminosäure fehlt allerdings an dieser Position bei NpSRII, so dass die Protonenübertragung von der extrazellulären Seite erfolgt, was zu einer intramolekularen Protonenzirkulation ohne nennenswerten Transport durch die Membran führt (Sasaki und Spudich, 1998; Sineschekov und Spudich, 2004). Im O-Intermediat besitzt das gebundene Retinal wieder die all-trans Konfiguration (Hein et al., 2003), allerdings in einer verglichen mit dem Grundzustand verdrillten Geometrie (Furutani et al., 2004). Vor Beendigung des Photozyklus erfolgt dann die Deprotonierung von Asp75, vermutlich über ein extrazelluläres Wasserstoffbrückennetzwerk, das verglichen mit BR aber eine geringere Konnektivität besitzt. Nach erfolgter Deprotonierung nimmt der Photorezeptor wieder den Grungzustand ein und ist bereit für einen neuen Photozyklus. Der Ablauf des Photozyklus offenbart also – zumindest im Bereich der Schiff Base - viele Gemeinsamkeiten mit dem Photozyklus von BR. Erste Unterschiede werden deutlich, wenn man die Kinetik der beiden Photozyklen vergleicht. Die Kinetik des Photozyklus von NpSRII wurde durch Laserblitzlicht-spektroskopische Untersuchungen unter verschiedenen Bedingungen untersucht (Chizhov et al., 1998). Abbildung 1.12 zeigt das aus diesen Experimenten abgeleitete Reaktionsmodell aus insgesamt 8 unterscheidbaren Proteinzuständen mit unterschiedlichen Gleichgewichten der 5 verschiedenen Photointermediate: 1,2s pSRII500 hυ pSRII500 400ms K500 O535 P8 M400 O535 N485 200ms 1μs P0 P1 P7 P2 P6 M400 U O 535 100ms L495 10μs P3 P5 P4 M400 U L 495 M400 M400 30μs 2ms Abb. 1.12: Modell des Photozyklus von NpSRII als Abfolge von 8 unterscheidbaren Gleichgewichtszuständen der 5 verschiedenen Intermediate (nach Chizhov et al., 1998) . 26 1.7 Der Photozyklus von NpSRII Die Abbildung verdeutlicht, dass der erste Teil des Photozyklus noch mit ähnlicher Kinetik, der zweite Teil des Photozyklus etwa um 2 Größenordnungen langsamer abläuft als in BR. Diese unterschiedliche Kinetik lässt sich durch die unterschiedliche Funktion der beiden Proteine erklären: Während bei BR der Photozyklus möglichst schnell abgeschlossen sein muss, um eine hohe Effizienz als Protonenpumpe zu gewährleisten, ist es bei NpSRII dagegen erforderlich, den Signalzustand länger aufrecht zu erhalten, um eine Übertragung des Signals auf den Transducer sicherzustellen. Die Grundlagen für diese unterschiedliche Wirkungsweise werden bereits im K-Intermediat gelegt, wie die folgenden Ausführungen zeigen. 1.7.1 Das K-Intermediat von NpSRII Eine genaue Kenntnis der strukturellen Veränderungen beim Übergang zum K-Intermediat ist wichtig, um zu verstehen, wie die Energie des absorbierten Photons im Chromophor und der Bindungstasche gespeichert wird, um damit im weiteren Verlauf des Photozyklus im Protein weit reichende strukturelle und elektrostatische Veränderungen auszulösen. Sowohl bei BR als auch bei NpSRII nimmt der zur 13-cis Konfiguration isomerisierte Chromophor in der Bindungstasche im K-Intermediat zunächst eine teilweise verdrillte Geometrie ein. Während bei BR der Chromophor vor allem im Bereich der Schiff Base verdrillt ist, sind bei NpSRII die Spannungen entlang der ganzen Polyen Kette und des ß-Ionon Rings im Retinal verteilt (Kandori et al., 2001), was durch die geringere Flexibilität der Bindungstasche von NpSRII im Vergleich zu BR erklärt werden kann (siehe Kapitel 1.5). Aufgrund der Relaxation des Chromophors in einen energetisch günstigeren Zustand wird bei NpSRII bereits im K-Intermediat ein Teil dieser Spannungen abgebaut, so dass im Vergleich zu BR größere Konformationsänderungen im Bereich der Bindungstasche ausgelöst werden. Diese strukturellen Unterschiede konnten durch einen Vergleich von Infrarotspektren der K-Intermediate von BR (Siebert und Mäntele, 1983) und NpSRII (Engelhard et al., 1996) aufgezeigt werden. Ein Vergleich der Kristallstrukturen des K-Intermediats beider Proteine (Schobert et al., 2002; Edman et al., 2002) zeigt, dass strukturelle Unterschiede im Bereich der Schiff Base auftreten, die eventuell für die unterschiedliche Funktion der beiden Proteine wichtig sind: Die Verdrillung der Schiff Basen-Bindung bei BR bewirkt eine Umorientierung der LysinSeitenkette der Schiff Base, wodurch die lokale Umgebung der Schiff Base hydrophiler wird. Im späteren Verlauf des Photozyklus könnte nach der Umorientierung des Stickstoffatoms dadurch eine schnellere Reprotonierung der Schiff Base von der cytoplasmatischen Seite und somit eine höhere Effizienz der Protonenpumpe gefördert werden. Bei NpSRII ist die Schiff Basen Bindung im K-Intermediat bereits teilweise wieder relaxiert (Furutani et al., 2006), was 1.7 Der Photozyklus von NpSRII 27 eine Bewegung des Retinals in der Bindungstasche und somit zusätzliche Spannungen verursacht. Eine Umorientierung des Lysylrestes und somit eine Veränderung der lokalen elektrostatischen Umgebung der Schiff Base wie bei BR erfolgt bei NpSRII daher nicht, wodurch später im Photozyklus eventuell eine schnelle Reprotonierung der Schiff Base unterbunden und somit eine längere Lebensdauer des Signalzustandes gewährleistet wird. Bei BR sind die wesentlichen strukturellen Veränderungen also in der Schiff Basen Region lokalisiert, während bei NpSRII zusätzliche Spannungen im gesamten Chromophor und zudem größere Konformationsänderungen in der Bindungstasche entstehen. Dies lässt vermuten, dass bei NpSRII ein höherer Anteil der Energie des absorbierten Photons im Protein gespeichert wird als bei BR. Den größeren Zuwachs an freier Enthalpie im K-Intermediat von NpSRII im Vergleich zu BR konnte tatsächlich mit Hilfe opto-akustischer Spektroskopie experimentell belegt werden (Losi et al., 1999). Doch wo genau ist diese Energie gespeichert, so dass sie im weiteren Verlauf des Photozyklus in weit reichende Konformationsänderungen des Proteins umgewandelt und dadurch der Transducer aktiviert werden kann? Eine Antwort darauf könnte in den letzten Jahren näher gerückt sein: Mit Hilfe der Infrarotspektroskopie konnte gezeigt werden, dass infolge der Isomerisierung des Retinals ein sterischer Konflikt zwischen dem Wasserstoffatom des C14-Atoms der Polyenkette und einer Seitenkette des Proteins auftritt, wodurch offenbar die größeren Verformungen der Bindungstasche im K-Intermediat von NpSRII im Vergleich zu BR verursacht werden. (Sudo et al., 2005). Durch Mutationsstudien wurde bewiesen, dass der sterische Konflikt mit der Seitenkette von Threonin 204 (Thr204) auf Helix G besteht (Ito et al., 2008). Diese Seitenkette bildet mit Tyrosin 174 (Tyr174) auf Helix F eine Wasserstoffbrückenbindung, wodurch die Schiff Basen Region mit der Region des Proteins, in der die Transducerbindung erfolgt, verbunden wird. Diese Wasserstoffbrückenbindung wird im K-Intermediat in Gegenwart des Transducers verstärkt, während ohne gebundenen Transducer die Wasserstoffbrückenbindung zu Beginn des Photozyklus unverändert bleibt (Sudo et al., 2003). Dieser Einfluss des Transducers auf die Wasserstoffbrückenbindung zwischen Thr204 und Tyr174 und damit auch auf die Schiff Basen Region bereits in diesem frühen Intermediat lässt vermuten, dass Veränderungen dieser Wasserstoffbrückenbindung im weiteren Verlauf des Photozyklus eine wichtige Rolle bei der Signalweiterleitung spielen. Mutationsstudien haben in der Tat gezeigt, dass die beiden an der Wasserstoffbrückenbindung beteiligten Seitenketten essentiell für eine funktionierende Phototaxis sind (Sudo et al., 2006). Noch deutlicher konnte die Bedeutung dieser Wasserstoffbrückenbindung anhand von BR-Mutanten gezeigt werden, bei denen durch die Einführung einer Threonin Seitenkette an entsprechender Position (Thr215) bei Anbindung eines Trans- 28 1.7 Der Photozyklus von NpSRII ducerproteins eine phototaktische Antwort in H. salinarium ausgelöst werden konnte (Sudo und Spudich, 2006). Ähnlich wie bei NpSRII wird die Stärke der Wasserstoffbrückenbindung zwischen Thr215 und der in archaellen Rhodopsinen konservierten Tyrosinseitenkette (Tyr185) im K-Intermediat stark verändert, zudem treten im Vergleich zum BR-Wildtyp ähnlich wie bei NpSRII zusätzliche Spannungen im Chromophor auf (Sudo et al., 2007). Zusammengenommen ergeben diese Experimente ein Bild, welche kausale Verbindung zwischen der Photoisomerisierung des Chromophors und den späteren Konformationsänderungen im Protein, die zur Aktivierung des Transducers führen, besteht. Dieses Modell verdeutlicht Abb. 1.13: retinal HtrII SRII Tyr174 Isomerisation Leu200 H Steric constraint Tyr199 Asn74 Thr204 Signal Transduction Abb. 1.13: Schematische Darstellung der ersten Schritte der lichtinduzierten Signaltransduktion von NpSRII zu NpHtrII: Die Lichtenergie, die im sterischen Konflikt zwischen der C14HGruppe und Thr204 im K-Intermediat gespeichert ist, wird später verwendet, um strukturelle Änderungen im Bereich des Rezeptor/Transducer-Interface auszulösen (nach Ito et al., 2008). Infolge des sterischen Konflikts des Wasserstoffatoms vom C14-Kohlenstoffatom des Retinals mit Thr204 nach der Photoisomerisierung wird die Wasserstoffbrückenbindung zwischen Thr204 und Tyr174 beeinflusst und somit ein Teil der Energie des absorbierten Photons gespeichert. Bei der Relaxation des Chromophors wird die dann frei werdende Energie dazu genutzt, um im weiteren Verlauf des Photozyklus Konformationsänderungen im Bereich des Interfaces zwischen Helices F, G und dem Transducer auszulösen. Doch wie sehen diese Konformationsänderungen aus und wie wird dadurch der Transducer aktiviert? Um diese Fragen beantworten zu können, ist es erforderlich, die molekularen Vorgänge im Rezeptor beim Übergang von frühen zum späten M-Intermediat näher zu betrachten. 1.7 Der Photozyklus von NpSRII 29 1.7.2 Das M-Intermediat von NpSRII Die Ähnlichkeit der photochemischen Reaktionen bei NpSRII und BR lässt vermuten, dass beide Proteine auch ähnliche Konformationsänderungen nach der Deprotonierung der Schiff Base durchlaufen. Im Fall von BR wird beim Übergang von frühen zum späten M-Intermediat nach der Deprotonierung der Schiff Base durch das Abknicken der Helix F und der Einwärtsbewegung des cytoplasmatischen Endes von Helix G der cytoplasmatische Halbkanal geöffnet und so die Zugänglichkeit der Schiff Base zur cytoplasmatischen Seite „umgeschaltet“. Da diese Konformationsänderungen für einen vektoriellen Protonentransport erforderlich sind und auch bei transducerfreien NpSRII-F86D-Mutanten, bei denen eine Reprotonierung der Schiff Base von der cytoplasmatischen Seite möglich ist, ein elektrogener Protonentransport nachgewiesen werden konnte (Schmies et al., 2001; Iwamoto et al., 2003), erscheint ein ähnlicher Mechanismus auch bei der Aktivierung von NpSRII wahrscheinlich. Eine der Antriebskräfte, die diese Konformationsänderungen in BR auslöst, ist die Unterbrechung der Salzbrücke zwischen Schiff Base und Gegenion bei der Entstehung des frühen M-Intermediats, wie Untersuchungen an D85N-BR Mutanten belegen. Bei dieser BRMutante kann die Salzbrücke durch Veränderung des pH-Wertes bereits im Dunkelzustand unterbrochen werden, wodurch ähnliche Konformationsänderungen wie beim Wildtypprotein ausgelöst werden (Kataoka et al., 1994). Auch in-vivo Studien an HsSRII-Mutanten, bei denen die Salzbrücke bereits im Dunkelzustand unterbrochen ist, belegen aufgrund einer konstituiven Aktivität der Rezeptoren, die sich durch ein verändertes Schwimmverhalten der Bakterienzellen äußert, die Bedeutung der Unterbrechung dieser Salzbrücke bei der Photoaktivierung archaebakterieller Rhodopsine (Spudich et al., 1997; Sasaki et al., 2007). Die Zellantwort ist bei diesen Mutanten allerdings nicht so intensiv wie beim Wildtyprezeptor, kann aber durch Licht-Induzierung weiter gesteigert werden, obwohl die Mutanten infolge der unterbleibenden Deprotonierung der Schiff Base einen völlig veränderten Photozyklus – ohne ein M-ähnliches Intermediat - besitzen. Auch bei NpSRII konnte mittlerweile nachgewiesen werden, dass eine Mutation des Gegenions nicht zwangsläufig eine normale phototaktische Antwort verhindert (Sasaki et al., 2007). Infrarotspektroskopische Messungen haben zudem gezeigt, dass in der D75N-NpSRII Mutante infolge der Phtoaktivierung ähnliche Konformationsänderungen wie beim Wildtyp Rezeptor ablaufen (Hein et al., 2004). Diese Studien belegen daher, dass die infolge der Photoisomerisierung des Retinals auftretenden Konformationsänderungen nicht ausschließlich durch den Protonentransfer von der Schiff Base zum Gegenion verursacht werden. 30 1.7 Der Photozyklus von NpSRII Ein möglicher Mechanismus, wie infolge der Isomerisierung des Retinals Konformationsänderungen im Protein ausgelöst werden können, ist bereits am Beispiel von BR vorgestellt worden: Nach diesem Modell wird bei BR das „Abknicken“ der Helix F durch einen sterischen Konflikt einer Methylgruppe des isomerisierten Retinals mit einer aromatischen Seitenkette der Helix F ausgelöst, wobei vermutlich ein benachbartes Prolin als „Scharnier“ für die Helixbewegung dient (vgl. Kapitel 1.6). Beide Aminosäuren sind in NpSRII konserviert, so dass eine Öffnung des cytoplasmatischen Halbkanals durch denselben Mechanismus ausgelöst werden könnte. Tatsächlich lassen zeitaufgelöste EPR-spektroskopische Messungen an in Pupurmembran-Lipiden rekonstituierten NpSRII-Rezeptoren auf eine Auswärtsbewegung der Helix F schließen, während im Bereich der Helix G offenbar nur kleine Konformationsänderungen auftreten (Wegener et al., 2000). Aufgrund dieser Konformationsänderungen ist wie bei BR die Aufnahme eines Protons über den cytoplasmatischen Halbkanal möglich, wodurch der gerichtete Protonentransport bei den transducerfreien NpSRIIF86D-Mutanten durch die Membran erklärt werden kann. In Gegenwart des Transducers wird die Protonenpumpenaktivität allerdings unterbunden, was darauf schließen lässt, dass der cytoplasmatische Halbkanal in Gegenwart des Transducers geschlossen bleibt (Sudo et al., 2001). Eine Bindung von NpHtrII könnte daher die Auswärtsbewegung von Helix F unterbinden. Die verschiedenen spektroskopischen und kristallographischen Studien der letzten Jahre ergeben allerdings ein uneinheitliches Bild, welche Konformationsänderungen im NpSRII/NpHtrII-Komplex erfolgen: Während EPR-spektroskopische Messungen auf eine Auswärtsbewegung der Helix F im NpSRII/NpHtrII-Komplex hindeuten (Wegener et al., 2001; Bordignon et al., 2007), werden diese Ergebnisse durch eine röntgenkristallographische Studie des belichteten Komplexes in Zweifel gezogen, die anstelle eines Abknickens des cytoplasmatischen Teils von Helix F eher auf eine Bewegung von Helix G im aktiven Zustand hindeuten (Moukhametzianov et al., 2006). Dabei muss aber berücksichtigt werden, dass bestimmte Konformationsänderungen infolge von Wechselwirkungen des Proteins mit anderen Rezeptormolekülen im Kristall unterbunden sein könnten. Allerdings lassen auch neuere FTIR-Messungen darauf schließen, dass das Öffnen des cytoplasmatischen Halbkanals in Gegenwart des Transducers unterbunden wird (Kamada et al., 2006). Diese spektroskopischen Daten stehen allerdings im Widerspruch zu FTIRspektroskopischen Untersuchungen der Arbeitsgruppe von J. Spudich, die strukturelle Veränderungen des Rezeptors im Bereich der Bindungsregion des Transducers aufzeigen und daher konsistent mit einer Auswärtsbewegung von Helix F im NpSRII/NpHtrII-Komplexim photoaktiven Zustand sind (Bergo et al., 2003). 1.7 Der Photozyklus von NpSRII 31 Obwohl die unterschiedlichen Experimente also teilweise widersprüchliche Resultate ergeben haben, so besteht dennoch Übereinstimmung, dass die wesentlichen Konformationsänderungen, die zur Aktivierung des Transducers führen, im Bereich des Interface der Helices F und G mit den beiden Transmembranhelices von NpHtrII auftreten. Trotz der immer noch bestehenden Unsicherheiten spricht doch viel für einen zumindest ähnlichen Mechanismus bei der Aktivierung wie bei BR. Dies wird vor allem durch die Tatsache untermauert, dass die BRDreifachmutante P200T/V210T/A215T bei Anbindung von NpHtrII eine phototaktische Antwort vermitteln kann (Sudo und Spudich, 2006). Daraus darf allerdings nicht direkt gefolgert werden, dass identische Reaktionen für die Transport- und die Signaleigenschaften verantwortlich sind: Durch die Einführung der Wasserstoffbrückenbindung zwischen Thr215 und Tyr185 und damit einer zusätzlichen Verbindung der Helices F und G (vgl. Kapitel 1.7.1), könnten die späteren Bewegungen der beiden Helices in der BR-Dreifachmutante im Vergleich zum BR-Wildtyp Protein verändert werden. Die Veränderung der Stärke der entsprechenden Wasserstoffbrückenbindung zwischen Thr204 und Tyr174 in NpsRII im Verlauf des Photozyklus könnte eine Schlüsselrolle bei der Kontrolle der Signalweiterleitung einnehmen. Mit Hilfe von zeitaufgelöster FTIR-Spektroskopie konnte kürzlich gezeigt werden, dass diese im K-Intermediat umgeformte Wasserstoffbrückenbindung im MIntermediat wieder rückgebildet wird, woraufhin auch Kontakte mit dem Transducer verändert werden (Furutani et al., 2005). Die Wasserstoffbrückenbindung zwischen Thr204 und Tyr174 könnte also die Protein-Protein Wechselwirkung innerhalb der Membran regulieren, während Konformationsänderungen des cytoplasmatischen Endes von Helix F strukturelle Veränderungen im Transducer auslösen könnten, wie im nächsten Abschnitt anhand der Beschreibung des Interface zwischen NpSRII und NpHtrII deutlich werden wird. 32 1.8 Interaktionen zwischen NpSRII und NpHtrII 1.8 Interaktionen zwischen NpSRII und NpHtrII Durch die Veröffentlichung einer Kristallstruktur des Rezeptors im Komplex mit einem 114 Aminosäure langen N-terminalen Fragment des Transducers konnten erste Einblicke in mögliche Interaktionen der Helices F und G von NpSRII mit den beiden Transmembranhelices von NpHtrII gewonnen werden (Gordeliy et al., 2002). Neben der Transmembrandomäne umfasst das Transducerfragment allerdings auch die cytoplasmatische Linker-Region und eine amphipatische Helix der ersten HAMP-Domäne von NpHtrII (vgl. Kapitel 1.9). Die Länge dieses Fragments ist damit gerade ausreichend, um eine feste Bindung an den Rezeptor zu gewährleisten, wie thermodynamische Messungen belegen (Hippler-Mreyen et al., 2003). Elektrophysiologische Studien zeigen zudem, dass der cytoplasmatische Teil dieses Fragments erforderlich ist, um bei Bindung an den Rezeptor die Öffnung des cytoplasmatischen Halbkanals zu verhindern, so dass die Protonenpumpenfunktion der NpSRII_F86D-Mutante (vgl. Kapitel 1.7.2) dadurch verloren geht (Hippler-Mreyen et al., 2003). Diese Untersuchungen belegen also, dass der cytoplasmatische Teil des Transducers an Wechselwirkungen mit dem Rezeptor beteiligt und für eine feste Bindung notwendig ist. Leider ist dieser Bereich des Transducers in der Kristallstruktur nur schlecht aufgelöst. Anhand von in-vivo Studien mit verschiedenen Chimären des Transducers konnte allerdings gezeigt werden, dass nur die Wechselwirkungen des Rezeptors mit den beiden Transmembranhelices essentiell für eine funktionierende Phototaxis sind (Zhang et al., 1999; Sasaki et al., 2007). Die Signalübertragung vom Rezeptor zum Transducer erfolgt also offenbar überwiegend innerhalb der Transmembrandomäne, so dass eine nähere Betrachtung der Wechselwirkungen zwischen NpSRII und NpHtrII in diesem Bereich lohnend ist. Wie in Membranlipiden liegt der Protein-Transducerkomplex im Kristall als Dimer mit einer zweizähligen Rotationssymmetrie vor. Die Symmetrieachse befindet sich dabei im Inneren des 4 Helixbündels des Transducerdimers. Die TM2-Helices der beiden Transducermoleküle stehen in Kontakt mit beiden Transmembranhelices der anderen Untereinheit, wodurch die Dimerisierung gewährleistet wird. Auch die Interaktionen mit dem Rezeptor wird vor allem durch die TM2-Helix vermittelt, die in einer durch die Helices F und G des Rezeptors gebildeten Furche Platz findet. 1.8 Interaktionen zwischen NpSRII und NpHtrII 33 Abb. 1.14a zeigt eine Frontalaufsicht auf den Komplex, Abb. 1.14b eine Detailansicht des Interface zwischen einer Rezeptor- und einer Transducer-Untereinheit: helix D helix E helix F TM2 helix A´ TM1´ helix G´ helix C helix B´ helix B TM1 a) helix A SRII Thr189 helix C´ TM2´ helix G helix F´ helix D´ helix E´ Glu43 Ser62 HtrII helix G Tyr199 Asn74 b) helix A helix F TM1 TM2 Abb. 1.14: a) Aufsicht auf den Rezeptor-Transducer Komplex von der cytoplasmatischen Seite. b) Seitenansicht des Interface zwischen den beiden Transmembranhelices von NpHtrII und den Helices F und G von NpSRII (PDB-Code 1H2S). Neben den vielen van-der-Waals Kontakten, die insbesondere zwischen Helix G von NpSRII und TM2 von NpHtrII bestehen, stabilisieren insgesamt 4 Wasserstoffbrückenbindungen den Komplex innerhalb der Membran. Während die Wasserstoffbrücken zwischen Thr189 des Rezeptors und Glu43 sowie Ser62 des Transducers wichtig für eine feste Bindung des Transducers an den Rezeptor sind, leistet der zweite „Ankerpunkt“ - die Wasserstoffbrückenbindung zwischen Tyr199 der Helix G und Asn74 von NpHtrII - in der Mitte der Membran offenbar nur einen kleinen Beitrag für die Komplexbildung, wie Peptidbindungsstudien belegen (Hippler-Mreyen et al., 2003; Sudo et al., 2006). Stattdessen könnte die Wasserstoffbrückenbindung eine wichtige Rolle bei der Signaltransduktion spielen: Mit Hilfe der FTIRSpektroskopie konnte gezeigt werden, dass die Stärke dieser Wasserstoffbrückenbindung bei 34 1.8 Interaktionen zwischen NpSRII und NpHtrII der Bildung des M-Intermediats verändert wird. Dies legt erneut einen Signalweg von der Schiff Basen Region über die Wasserstoffbrückenbindung zwischen Thr204 und Tyr174 bis hin zum Interface zwischen Rezeptor und Transducer nahe (vgl. Kapitel 1.7.1). Zwar herrscht mittlerweile weitgehend Einigkeit über die Bedeutung dieses Aktivierungsmechanismus, allerdings wird in verschiedenen Studien sowohl von einer Stärkung (Furutani et al., 2005) als auch einer Schwächung der Wasserstoffbrückenbindung zwischen Tyr199 und Asn74 im aktiven Zustand berichtet (Bergo et al., 2005). Infolge einer Schwächung der Wasserstoffbrückenbindung könnte der Komplex geringfügig destabilisiert werden und so Konformationsänderungen im Transducer ermöglichen. Tatsächlich konnte anhand thermodynamischer Messungen eine schwächere Bindung des Transducers an den Rezeptor im aktiven Zustand beobachtet werden (Sudo et al., 2001; Sudo et al., 2002). Auch wenn eine Änderung der Bindungskonstante tatsächlich für die Aktivierung des Transducers erforderlich ist, verbleibt die Frage, welche Konformationsänderungen im Transducer daraufhin erfolgen und wie diese durch Interaktionen mit dem Rezeptor ausgelöst werden. Bereits anhand von zeitaufgelösten EPR-Messungen konnte eine Rotationsbewegung der TM2-Helix des Transducers infolge der Photoaktivierung beobachtet werden (Wegener et al., 2001). Diese Experimente konnten mittlerweile sowohl durch biochemische als auch durch kristallographische Studien untermauert werden (Yang und Spudich, 2001; Moukhametzianov et al., 2006). Ein Vergleich der Kristallstruktur des Komplexes im aktiven Zustand mit dem Grundzustand zeigt zudem eine geringe Translationsbewegung von 0,9 Ångström der TM2Helix infolge der Photoaktivierung an. Insgesamt kann also von einer schraubenartigen Bewegung der TM2-Helix ausgegangen werden. Dies ist durchaus überraschend, da beim eubakteriellen Chemorezeptor Tar eine signifikante „kolbenartige“ Translationsbewegung der TM2-Helix nach der Bindung des Liganden beobachtet werden konnte (Ottemann et al., 1999), so dass sich der Mechanismus der Signalübertragung durch die Membran bei NpHtrII trotz der Homologie zu den Chemorezeptoren eventuell unterscheidet (vgl. Kapitel 1.3.1). Eine mögliche Ursache für die Rotation der TM2-Helix könnte in einer Auswärtsbewegung der Helix F des Rezeptors liegen, die dabei die TM2-Helix tangential berührt und so die Drehbewegung auslöst (Wegener et al., 2001; Klare et al., 2004a). Aufgrund des engen Kontakts von TM2 und Helix F ist eine solche gekoppelte Bewegung der beiden Helices sehr wahrscheinlich, so dass erstmals ein Modell entwickelt werden konnte, durch welchen Mechanismus Konformationsänderungen des Rezeptors im aktiven Zustand auf den Transducer übertragen werden. Dieses Modell ist allerdings in den letzten Jahren in Zweifel gezogen worden, da einige biochemische und spektroskopische Studien darauf hindeuten, dass die 1.8 Interaktionen zwischen NpSRII und NpHtrII 35 Auswärtsbewegung der Helix F durch die Bindung des Transducers verhindert wird (vgl. Kapitel 1.7.2). Auch die Kristallstruktur des Komplexes im aktiven Zustand weist auf keine signifikanten Konformationsänderungen der Helix F im Vergleich zum Dunkelzustand hin (Moukhametzianov et al., 2006). Falls die Auswärtsbewegung der Helix F in Anwesenheit des Transducers tatsächlich unterbleiben sollte, sind vermutlich Interaktionen des cytoplasmatischen Endes der Helix F sowie der Schleife zwischen den Helices E und F mit der Linker-Region des Transducers für die eingeschränkte Konformationsfreiheit des cytoplasmatischen Endes von Helix F verantwortlich (Kamada et al., 2006). Mit Hilfe von Förster Resonanz Energie Transfer(FRET), Kernspinresonanz- (NMR) sowie EPR-Messungen konnte gezeigt werden, dass das cytoplasmatische Ende von Helix F mit der ersten HAMP-Domäne des Transducers wechselwirkt und der Kontakt nach der Photoaktivierung sogar enger wird (Yang et al., 2004; Sudo et al., 2005; Bordignon et al., 2005). Wechselwirkungen des Rezeptors mit der cytoplasmatischen Domäne des Transducers können daher einen Einfluss auf Konformationsänderungen des Rezeptors sowie des Transducers während des Photozyklus haben. Die Signalübertragung vom Rezeptor zur cytoplasmatischen Domäne des Transducers erfolgt allerdings nicht direkt über die Wechselwirkungen der EF-Schleife von NpSRII mit der ersten HAMP-Domäne von NpHtrII, da auch ohne diese Interaktionen eine robuste Signaltransduktion erhalten bleibt, wie in-vivo Versuche mit NpSRII-Mutanten belegen (Sasaki et al., 2007). Stattdessen spielen die Wechselwirkungen der TM2-Helix mit den Helices F und G des Rezeptors vermutlich die Schlüsselrolle beim Signaltransfer vom Rezeptor zum Transducer. 36 1.8 Interaktionen zwischen NpSRII und NpHtrII Die zuvor beschriebenen Mechanismen, die eventuell dabei eine Rolle spielen, sind in Abbildung 1.15 zusammengefasst: HtrII SRII Glu43 Thr189 Membranoberfläche helix F Ser62 retinal Tyr174 Tyr199 Asn74 TM2 TM1 Thr204 helix G TM2 Membranoberfläche helix F Abb. 1.15: Schematische Darstellung möglicher Mechanismen der Signalübertragung vom Rezeptor zum Transducer. Nach der Photoisomerisierung des Retinals wird vermutlich infolge der Umbildung der Wasserstoffbrückenbindung zwischen Thr204 und Tyr174 auch die Interaktion des Rezeptors mit dem Transducer im Bereich der Wasserstoffbrücke zwischen Tyr199 und Asn74 beeinflusst (unterer roter Kasten). Auch die Stärke der Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Thr189 und Glu43 sowie Ser62 könnte sich infolge der Photoaktivierung ändern, wodurch eine weniger feste Bindung von NpHrII an NpSRII im aktiven Zustand erfolgen würde (oberer roter Kasten). Die Rotation der TM2Helix des Transducers wird eventuell durch ein Abknicken der Helix F verursacht. Dieser Mechanismus ist in der Detailansicht vom Cytoplasma aus gesehen dargestellt (nach Klare et al., 2004b). Einige Studien deuten allerdings darauf hin, dass eine Auswärtsbewegung der Helix F im Komplex mit dem Transducer unterdrückt wird. Eine mögliche Ursache hierfür sind Wechselwirkungen des cytoplasmatischen Endes der Helix F mit der cytoplasmatischen Domäne von NpHtrII (rote Pfeile). 1.9 Signalamplifikation in der HAMP-Domäne 37 1.9 Signalamplifikation in der HAMP-Domäne Die Ausführungen im letzten Kapitel haben gezeigt, dass noch nicht endgültig geklärt ist, durch welchen Mechanismus das Signal vom Rezeptor zum Transducer übertragen wird. Gesichert erscheint nur, dass die TM2-Helix eine Rotationsbewegung von etwa 15° und eine geringe Translationsbewegung von etwa 0,9 Ångström infolge der Aktivierung durch den Rezeptor durchläuft. Dies lässt sofort die Frage aufkommen, wie diese relativ kleinen Konformationsänderungen über eine Distanz von etwa 260 Ångström bis zur cytoplasmatischen Signaldomäne übertragen werden können. Um letztlich eine an die Signaldomäne assoziierte Histidinkinase aktivieren zu können, muss das Signal auf dem Weg dorthin umgewandelt und amplifiziert werden, wobei den beiden HAMP-Domänen des Transducers vermutlich eine Schlüsselrolle zukommt. Erstmals wurde eine HAMP-Domäne von der Arbeitsgruppe von J. Inouye in Chemorezeptoren von Escherischia coli entdeckt (Jin und Inouye, 1994). Seitdem wurden homologe Sequenzen in über 7500 Proteinen verschiedener Proteinfamilien gefunden (vgl. Kapitel 1.3.1). Trotz der vielfältigen Funktionen dieser Proteine dienen HAMP-Domänen dabei immer als „Relaisstation“ zwischen einem Eingangs- und einem Ausgangssignal. Da HAMPDomänen zwischen verschiedenen Rezeptoren derselben Spezies ausgetauscht werden können, ohne dass die Funktion der Proteine dadurch beeinträchtigt wird (Zhu und Inouye, 2003), kann von einem einheitlichen Funktionsprinzip unterschiedlicher HAMP-Domänen ausgegangen werden. Im Fall von NpHtrII konnte sogar gezeigt werden, dass ein chimäres Fusionsprotein von NpSRII und NpHtrII, in dem die cytoplasmatische Domäne des Transducers durch die eines eubakteriellen Chemorezeptors ausgetauscht worden ist, eine phototaktische Antwort in E. coli auslösen kann (Jung et al., 2001; Trivedi und Spudich, 2003). Die HAMP-Domänen gewährleisten dabei offenbar, dass das Eingangssignal des archaebakteriellen Transducermoleküls genauso verarbeitet wird, wie das eines eubakteriellen Chemorezeptors. Trotz der offensichtlich großen Bedeutung dieses Moduls bei einer Vielzahl von Signalprozessen, lagen bis vor kurzem noch keine strukturellen Daten über eine HAMP-Domäne vor. Bekannt war lediglich, dass die Sequenz von HAMP-Domänen auf zwei amphipatische Helices hindeutet, die durch eine kurze Konnektorsequenz unbekannter Sekundärstruktur miteinander verbunden sind. Erst 2006 konnte anhand der NMR-Struktur einer HAMP-Domäne des Proteins Af1503 des Archaeons Archaeglobus fulgidus ein genauerer Einblick in die dreidimensionale Faltung von HAMP-Domänen erhalten werden (Hulko et al., 2006). Die Struk- 38 1.9 Signalamplifikation in der HAMP-Domäne tur zeigt ein Homodimer bestehend aus einem 4-helikalen parallelen coiled-coil mit einer ungewöhnlichen interhelikalen Packung. Die Topologie entspricht damit dem Helix-Loop-Helix Motiv vieler Transkriptionsfaktoren. Allerdings erfolgt bei coiled-coil Strukturen die Interaktion der Helices normalerweise, indem die hydrophoben Seitenketten, die sich an erster sowie vierter Position der sich wiederholenden Heptadensequenz einer amphipatischen Helix befinden, jeweils in ein Loch ragen, das von 4 Seitenketten der gegenüberliegenden Helix gebildet wird (knobs-into-hole Packung). Die Seitenketten sind deshalb immer neben den symmetrieäquivalenten Resten der gegenüberliegenden Helix im Inneren des 4-Helixbündels angeordnet. In der HAMP-Domäne ragen die Seitenketten gegenüberliegender Helices hingegen entweder direkt aufeinander zu (x-Geometrie) oder sie zeigen zur Seite weg (da-Geometrie). Sterische Konflikte werden vermieden, indem die Seitenketten von zwei diagonal gegenüberliegenden Helices immer in einer unterschiedlichen Geometrie im Vergleich zu den Seitenketten der beiden anderen Helices angeordnet sind (siehe Abb. 1.16b). Eine derartige Packungsform ist bei coiled-coil-Strukturen mit einer parallelen Ausrichtung der interagierenden Helices zuvor noch nicht beobachtet worden. Auf der Grundlage dieser Struktur haben die Autoren daher ein Modell entwickelt, nach dem HAMP-Domänen infolge konzertierter Rotationen aller 4 Helices zwischen der beobachteten Geometrie und einem kanonischen coiled-coil mit einer gewöhnlichen Helixpackung (knobsinto-hole Packung) wechseln können, wobei jede dieser Strukturen einem definiertem Signalzustand entspricht. Benachbarte Helices müssten jeweils in die entgegengesetzte Richtung rotieren, so dass der Mechanismus an das Funktionsprinzip eines Uhrwerks oder Getriebes erinnert. Voraussetzung für ein derartiges Modell ist allerdings, dass die beiden Strukturen nahezu isoenergetisch sind. Tatsächlich konnte anhand von Mutationsstudien gezeigt werden, dass bei Transkriptionsfaktoren durch den Austausch einer einzelnen Aminosäure ein Wechsel zwischen den beiden Packungsformen erfolgen kann (Albertini et al., 1993; Deng et al., 2006, Yadav et al., 2006), der in diesen Fällen zusätzlich von einer Umorientierung der interagierenden Helices von einer parallelen zu einer antiparallelen Ausrichtung begleitet ist. Bei den unersuchten HAMP-Domänen ist eine solche Umorientierung der Helices allerdings nicht erforderlich, da die Helices bereits antiparallel ausgerichtet sind. Daher könnte ein Wechsel zwischen den Packungsformen umso einfacher erfolgen. Aufgrund der offenbar geringen Energiedifferenz zwischen den beiden Konformationen könnten HAMP-Domänen daher als Umwandler von verschiedenen Eingangssignalen in ein einheitliches Ausgangssignal in Form einer definierten Rotationsbewegung der folgenden Helices fungieren. 1.9 Signalamplifikation in der HAMP-Domäne 39 Auch wenn dieses Modell durchaus plausibel erscheint, gibt es bisher keine experimentellen Belege, dass beim Signaltransfer derartige Rotationsbewegungen der Helices von HAMPDomänen tatsächlich auftreten. Im Fall von NpHtrII deuten einige spektroskopische und thermodynamische Daten stattdessen eher darauf hin, dass größere Konformationsänderungen erfolgen, die mit einer veränderten Faltung der HAMP-Domänen einhergehen könnten. Zwar konnte anhand von EPR-Messungen gezeigt werden, dass die erste HAMP-Domäne von NpHtrII eine identische Faltung wie die HAMP-Domäne des Proteins Af1503 von Archaeglobus fulgidus einnehmen kann. Eine veränderte Mobilität der in die HAMP-Domäne eingeführten Spinlabel bei geringerer Salzkonzentration lässt allerdings darauf schließen, dass zudem eine Konformation existiert, in der die Seitenketten der Domäne eine größere Dynamik besitzen (Bordignon et al., 2005). Diese Daten weisen somit auf eine moltenglobule ähnliche Struktur der Domäne bei geringerem Salzgehalt hin. Eine Untersuchung des Gleichgewichts zwischen diesen beiden Zuständen der Domäne in Abhängigkeit vom Salzgehalt des Lösungsmittels sowie der Temperatur hat zudem ergeben, dass beide Konformationen physiologische Relevanz besitzen könnten (Doebber et al., 2008). Die Autoren haben daher ein Modell vorgeschlagen, nachdem infolge der Photoaktivierung des Transducers dieses Gleichgewicht auf die Seite des molten-globule ähnlichen Zustands verschoben wird. Ein Signaltransfer von der Transmembrandomäne von NpHtr zur Signaldomäne würde demnach durch eine Veränderung der Faltung der cytoplasmatischen Domäne des Transducers erfolgen. Auch bei Chemorezeptoren wird darüber diskutiert, ob beim Signaltransfer eine Verschiebung des Gleichgewichts zwischen einer geordneten und einer weniger strukturierten Konformation der cytoplasmatischen Domäne eine Rolle spielt (vgl. Kapitel 1.3.1). 40 1.9 Signalamplifikation in der HAMP-Domäne Die beiden in diesem Kapitel vorgestellten Modelle für die Wirkungsweise der HAMPDomäne beim Signaltransfer sind in Abb. 1.16 dargestellt. a) cHAMP dHAMP b) Abb. 1.16: a) Gleichgewicht zwischen einer „kompakten“ Konformation der HAMP-Domäne (cHAMP) und einer molten-globule ähnlichen Struktur (dHAMP). Das Modell ist von der Kristallstruktur des NpSRII/NpHtrII-Komplexes sowie der NMR-Struktur der HAMP-Domäne des Proteins Af1503 von Archaeglobus fulgidus abgeleitet. Das Gleichgewicht könnte infolge der Photoaktivierung des Rezeptors in Richtung der molten-globule ähnlichen Konformation verschoben werden (aus Doebber et al., 2008). b) Darstellung der beiden möglichen unterschiedlichen Packungsformen der Helices einer HAMP-Domäne. Bei der NMR-Struktur der HAMP-Domäne des Proteins Af1503 von Archaeglobus fulgidus ragen die hydrophoben Seitenketten von zwei interagierenden Helices entweder direkt aufeinander zu (x-Geometrie) oder alternierend zur Seite weg (da-Geometrie). Durch konzertierte Rotationen benachbarter Helices um 26° in entgegengesetzten Richtungen könnte die beobachtete Konformation in die gewöhnliche Packungsform (knobs-into-holes Packung) eines kanonischen coiled-coils umgewandelt werden (aus Hulko et al., 2006). 1.9 Signalamplifikation in der HAMP-Domäne 41 Wie bereits erwähnt lassen verschiedene Experimente darauf schließen, dass beide in Abb. 1.16a dargestellte Gleichgewichte zwischen unterschiedlichen Konformationen in HAMP-Domäne tatsächlich existieren. Daher stellt sich natürlich die Frage, welche der beiden Reaktionen für die Signalamplifikation in HAMP-Domänen verantwortlich sind. Thermodynamische Messungen deuten zwar darauf hin, dass eine signifikante Volumenveränderung in der Linker-Region des Transducers nach der Aktivierung durch die D75N-NpSRII-Mutante erfolgt, was auf größere Konformationsänderungen in den HAMP-Domänen schließen lässt (Inoue et al., 2008). Aufgrund von in-vivo Versuchen an verschiedenen Mutanten eines eubakteriellen Chemorezeptors kann hingegen darauf geschlossen werden, dass bereits geringe strukturelle Veränderungen in der HAMP-Domäne für den Wechsel zwischen dem inaktiven und dem aktiven Zustand der cytoplasmatischen Signaldomäne ausreichend sind (Ames et al., 2008). Es ist somit nach wie vor unklar, welche der in den beiden Modellen beschriebenen Reaktionen tatsächlich bei Signalprozessen in HAMP-Domänen stattfinden. Trotz jahrelanger intensiver Forschungen sind also nach wie vor viele Fragestellungen beim Signaltransfer vom Photorezeptor NpSRII zur cytoplasmatischen Domäne des Transducers NpHtrII ungeklärt. Die Erforschung der molekularen Mechanismen, die für die Signalübertragung vom Rezeptor zum Transducer verantwortlich sind, könnte auch für das Verständnis von Signalübertragungsprozessen bei anderen Rezeptoren wichtig sein. Auch die Untersuchung der molekularen Prozesse bei der Signalamplifikation in der Linker-Region von NpHtrII ist aufgrund der großen Verbreitung von HAMP-Domänen in vielen verschiedenen Proteinfamilien für eine Vielzahl biologischer Systeme von Bedeutung. In der vorliegenden Arbeit stellt deshalb der Signalkomplex aus NpSRII und einem Fragment des Transducers, das neben der Transmembrandomäne auch die erste HAMP-Domäne der Linker-Region umfasst, das untersuchte „Forschungsobjekt“ dar. Um einen genaueren Einblick in molekulare Abläufe dieses Systems zu erhalten, war es erforderlich, Infrarotsonden an verschiedenen Positionen in den Komplex einzubringen und somit die Methode der herkömmlichen reaktionsinduzierten Infrarotdifferenzspektroskopie zu ergänzen. Diese Methode konnte am vorgestellten Modellsystem erfolgreich getestet werden und stellt somit ein geeignetes Werkzeug dar, strukturelle Änderungen in Makromolekülen auf molekularer Ebene zu untersuchen, wie die Ausführungen im experimentellen Teil zeigen werden. 42 2. Ziele 2. Ziele Im Rahmen dieser Doktorarbeit sollten die Interaktionen des Photorezeptors NpSRII mit seinem Transducer NpHtrII mit Hilfe der FTIR-Spektroskopie untersucht werden. Trotz jahrelanger Forschung am NpSRII/NpHtrII-Komplex in verschiedenen spektroskopischen, biochemischen und kristallographischen Studien, ist nach wie vor ungeklärt, wie das Signal nach der Photoaktivierung des Rezeptors zum Transducer und anschließend zur cytoplasmatischen Domäne des Transducers übertragen wird. Offen ist dabei insbesondere die Frage, ob die Aktivierung des Transducers durch eine Auswärtsbewegung der Helix F erfolgt oder ob diese Konformationsänderung des Rezeptors durch die Bindung des Transducers unterdrückt wird. Neuere Studien deuten darauf hin, dass die Aktivierung des Transducers durch die Schwächung von spezifischen Wechselwirkungen zwischen Seitenketten des Rezeptors und des Transducers erfolgt. Neben dem ungeklärten Aktivierungsmechanismus des Transducers ist zudem nach wie vor unklar, nach welchem Modell die Signalamplifikation in der HAMP-Domäne des Transducers erfolgt. Solche offenen Fragestellungen waren natürlich auch eine wichtige Motivation für diese Doktorarbeit. Eine Schwierigkeit bei der Untersuchung solcher Fragestellungen mittels der FTIR-Spektroskopie besteht darin, die Banden im Infrarotspektrum bestimmten Gruppen des untersuchten Proteins zuzuordnen. Mit Hilfe der Isotopenmarkierung des Rezeptors oder des Transducers können erste Informationen darüber gewonnen werden, ob die beobachteten Banden in den Infrarotspektren des Proteinkomplexes Konformationsänderungen von NpSRII oder NpHtrII reflektieren. Allerdings ist es ohne aufwendige Mutationsstudien mit der herkömmlichen FTIR-Spektroskopie nicht möglich, positionsspezifische Informationen über strukturelle Veränderungen innerhalb des Proteinkomplexes zu erhalten. Ein wichtiges Ziel im Rahmen dieser Doktorarbeit war es daher, zunächst ein neues Verfahren zu entwickeln und zu testen, mit dem Konformationsänderungen sowie elektrostatische Veränderungen im Proteinkomplex mittels FTIR-Spektroskopie genau lokalisiert werden können. Hierzu sollte eine infrarotaktive Verbindung an verschiedene Positionen des Rezeptors sowie des Transducers gebunden und die Auswirkungen von strukturellen sowie elektrostatischen Veränderungen innerhalb des NpSRII/NpHtrIIKomplexes auf die Schwingungsfrequenz der IR-Sonde analysiert werden. Letztlich sollte das Verfahren soweit entwickelt werden, dass hiermit auch Erkenntnisse in Bezug auf die zuvor angesprochenen offenen Punkte bei der Signalübertragung vom Rezeptor zur cytoplasmatischen Domäne des Transducers erhalten werden können. Nach einer Einführung in grundlegende Aspekte der FTIR-Spektroskopie werden im nächsten Kapitel einige theoretische sowie praktische Aspekte des entwickelten Verfahrens erläutert. 3. Materialien und Methoden 43 3. Materialien und Methoden Die Infrarot Spektroskopie ist eine der klassischen Methoden zur Strukturbestimmung kleiner organischer Moleküle. Aufgrund des hohen Informationsgehaltes eines Infrarotspektrums ist die Methode aber auch für die Untersuchung biologischer Systeme von großer Bedeutung. So können mit Hilfe der IR-Spektroskopie Aussagen über die Sekundärstruktur von Proteinen sowie über die molekularen Mechanismen von Proteinreaktionen gewonnen werden. Aufgrund des zweiten Aspekts ist die IR-Spektroskopie zu einer wichtigen Methode zur Erforschung der Funktion von Proteinen geworden. Insbesondere wenn die Struktur des untersuchten Proteins aufgrund von NMR- oder Kristallstrukturen bekannt ist, kann mit Hilfe der reaktionsinduzierten IR-Spektroskopie aufgrund der hohen Sensitivität der Methode für Veränderungen der Proteinstruktur sowie intermolekularer Interaktionen ein guter Einblick in den molekularen Mechanismus der untersuchten Proteinreaktion erhalten werden (Vogel und Siebert, 2000). Besonders einfach ist die Untersuchung lichtinduzierbarer Prozesse, so dass der Photorezeptor NpSRII sehr gut mit Hilfe der reaktionsinduzierten IR-Spektroskopie untersucht werden kann. Ein Nachteil der Methode ist allerdings die normalerweise geringe Selektivität, da aufgrund der Größe des Proteins sehr viele Banden überlagern, so dass kaum strukturelle Aussagen aus einem Absorptions- oder Einkanalspektrum getroffen werden können. Ein erster Schritt, um die Selektivität zu erhöhen, ist die Bildung von Differenzspektren aus den Einkanalspektren von zwei unterschiedlichen Proteinzuständen während der untersuchten Reaktion. Auf diese Weise sind nur die Banden derjenigen Gruppen im Differenzspektrum vorhanden, die während der Reaktion eine strukturelle Veränderung durchlaufen. Das Differenzspektrum kann zudem durch selektive Isotopenmarkierung verändert werden, so dass die dadurch verschobenen Differenzbanden einzelnen Gruppen im Protein zugeordnet werden können. Auch durch die Einführung von Punktmutationen im Protein kann die Umgebung verschiedener Gruppen im Molekül so beeinflusst werden, dass die Differenzbanden dieser Gruppen gegenüber dem Wildtypprotein verändert werden und so eine Bandenzuordnung möglich ist. In der vorliegenden Arbeit wurde zudem eine weitere Methode getestet, um positionsspezifische Informationen mit Hilfe der reaktionsinduzierten Infrarotspektroskopie zu erhalten: Durch die Einführung eines aromatischen Nitrils als IR-Sonde an verschiedene Positionen des untersuchten Proteins können Veränderungen in der elektrostatischen Umgebung der Sonde beobachtet werden und so Rückschlüsse über mögliche strukturelle Veränderungen des Proteins in dieser Region getroffen werden. Bevor allerdings genauer auf diese Methode eingegangen wird, erfolgt zunächst eine kurze Einführung in die Grundlagen der Infrarotspektroskopie. 44 3.1 Grundlagen der IR-Spektroskopie 3.1 Grundlagen der IR-Spektroskopie Bei der Infrarotspektroskopie wird wie bei allen optischen spektroskopischen Methoden die Interaktion elektromagnetischer Strahlung mit Materie untersucht. Wenn elektromagnetische Strahlung der richtigen Wellenlänge mit einem Molekül wechselwirkt, können Übergänge zwischen verschiedenen Energieniveaus auftreten. Die Gesamtenergie eines Moleküls setzt sich aus der Energie der Elektronen Eel, der Schwingungsenergie Evib der Atome, die relativ zueinander schwingen, der Rotationsenergie Erot. der Atome, die um eine gemeinsame Achse rotieren sowie aus den magnetischen Eigenschaften der Kerne und der Elektronenhülle Emag zusammen: Eges = Eel + Evib + Erot + Emag Gl. 3.1 Je nach Energie des absorbierten Photons können verschiedene Arten von Übergängen erfolgen. Absorption von Photonen im Infrarotbereich regen Rotations- und Schwingungsübergänge innerhalb des elektronischen Grundzustands an. Rotationsübergänge treten dabei überwiegend im Bereich des fernen Infrarots im Wellenlängenbereich zwischen 30 μm und 1000 μm auf, die Schwingungsübergänge sind dagegen vor allem im Wellenlängenbereich von 3 μm bis 30 μm also im Bereich des mittleren Infrarots zu beobachten. Im Bereich des nahen Infrarots von 760 nm bis 3000 nm, der sich an den sichtbaren Spektralbereich des Lichts anschließt, liegen die Oberwellen von Schwingungsübergängen sowie sehr niederenergetische elektronische Übergänge. Da Rotationsübergänge nur in der Gasphase aufgelöst werden können, sind für die Infrarotspektroskopie von Makromolekülen ausschließlich die Schwingungsübergänge von Bedeutung. Der Spektralbereich wird bei der Infrarotspektroskopie allerdings üblicherweise nicht mit Hilfe der Wellenlänge sondern durch die reziproke Wellenlänge 1/λ – der so genannten Wellenzahl ν~ – charakterisiert, die die Zahl der Wellenzüge pro cm angibt. Über die Lichtgeschwindigkeit ist die Wellenzahl mit der Frequenz ν der elektromagnetischen Wellen verknüpft. ν 1 ν = = c λ Gl. 3.2 Die Wellenzahl des absorbierten Photons ist also direkt proportional zu seiner Schwingungsfrequenz und aufgrund der Beziehung von De Broglie E = h*ν (h ist das Plancksche Wirkungsquantum, 6,62 * 10-34 Js) auch zu seiner Energie. Die Absorption eines Photons findet nur dann statt, wenn die Energie des eingestrahlten Photons der Differenz zwischen zwei Energieniveaus des Moleküls entspricht. Daher kann aus der Wellenzahl des absorbierten 3.1 Grundlagen der IR-Spektroskopie 45 Photons auch darauf geschlossen werden, um welchen Energiebetrag das Molekül durch das absorbierte Photon vom Grundzustand angehoben worden ist. Um das Potential eines Schwingungsmodus beschreiben zu können, kann zunächst auf ein einfaches Modell zurückgegriffen werden, nachdem die Atome aufgrund gegenseitiger anziehender und abstoßender Wechselwirkungen einen Gleichgewichtsabstand r0 zueinander haben, der sich im Minimum der Potentialkurve befindet. Bei einem Schwingungsübergang wird die Energie des absorbierten Photons dazu verwendet, ein Atom aus diesem Gleichgewichtsabstand r0 heraus auszulenken. Durch diese Anregung fangen die Atome an zu schwingen. Bei einer quantenmechanischen Betrachtung sind im Gegensatz zu einem klassischen Modell nur diskrete Energieniveaus möglich. Durch Lösen der Schrödinger Gleichung ergibt sich ein Zusammenhang zwischen der für den Schwingungsübergang benötigten Energie, der Bindungskonstante k und der reduzierten Masse μ: k 1 mit μ = m1∗m2/(m1+m2) Eν = ( v + ) = μ 2 Gl. 3.3 Hierbei ist v die Schwingungsquantenzahl und = das reduzierte Plancksche Wirkungsquantum (h/2π). Aus der Gleichung ergibt sich für v = 0 die Nullpunktsenergie E = ½ h*νvib. Nach dem Modell des harmonischen Oszillators sind Schwingungsübergänge immer nur zum nächsten benachbarten Energieniveau möglich, so dass gilt Δν = ±1 . Da bei einer Verringerung des Abstands aufgrund der starken elektrostatischen Abstoßung der Atomkerne der Anstieg der Potentialkurve steiler als bei einer Parabel verläuft und bei einer Vergrößerung des Abstands immer flacher wird, da bei einem bestimmten Abstand die Dissoziation des Moleküls erfolgt, muss in der Realität das Modell des harmonischen Oszillators durch einen anharmonischen Oszillator ersetzt werden. Bei diesem sind die Energieniveaus nicht mehr äquidistant und Übergänge sind nicht nur zum nächsten sondern auch zu höheren Niveaus erlaubt ( Δν = ±1, ± 2 , ± 3... ). Abbildung 3.1 zeigt die Potentialkurve des harmonischen sowie des anharmonischen Oszillators. 46 3.1 Grundlagen der IR-Spektroskopie E E Dissoziationsenergie v=3 v=2 v=1 v=3 v=2 v=1 v=0 a) r0 v=0 b) r r0 r Abb. 3.1: Potentialkurve eines harmonischen Oszillators (a) und eines anharmonischen Oszillators (b) mit den jeweils erlaubten Übergängen zwischen den einzelnen Energieniveaus (nach Atkins, 2000). Bei einem Übergang von einem Energieniveau in ein anderes muss die Energie des Photons exakt der Energiedifferenz zwischen den beiden Schwingungszuständen entsprechen. Diese Bedingung ist allerdings nicht ausreichend für einen Übergang in einen höheren Schwingungszustand. Um die Energie des Photons aufzunehmen, ist es zudem erforderlich, dass sich das Dipolmoment des Moleküls während der Normalschwingung ändert, so dass der elektrische Feldvektor mit dem molekularen Dipol interagieren kann. Die Schwingung, bei denen diese Voraussetzung erfüllt ist, bezeichnet man auch als infrarot-aktiv. Übergänge können bei zwei verschiedenen Schwingungsformen erfolgen: Bei den so genannten Valenz- oder Streckschwingungen schwingen die miteinander verbundenen Atome in Valenzrichtung, so dass eine Änderung der Atomabstände erfolgt. Bei den Deformationsschwingungen oder Biegeschwingungen bleibt der Atomabstand hingegen gleich, stattdessen ändert sich der Bindungswinkel. Bei mehratomigen Molekülen kann zudem zwischen Streckschwingungen in Phase und in Gegenphase unterschieden, je nachdem ob die äußeren Atome in die gleiche Richtung oder ob die Atome in die entgegengesetzte Richtung ausgelenkt werden. Abb. 3.2 zeigt die Normalschwingungsmoden eines Wassermoleküls. O H O O H Streckschwingung in Phase H H Streckschwingung in Gegenphase Abb. 3.2: Normalschwingungsmoden eines Wassermoleküls. H H Biegeschwingung 3.1 Grundlagen der IR-Spektroskopie 47 In einem planaren Molekül können Biegeschwingungen dadurch unterschieden werden, ob die Auslenkung in der Ebene des Bindungswinkels zwischen den schwingenden Atomen (inplane) oder aus der Ebene dieses Bindungswinkels heraus (out-of-plane) erfolgt. Für jedes Atom sind insgesamt drei Richtungen möglich, in die es ausgelenkt werden kann. Bei N Atomen ergeben sich daher in einem nichtlinearen Molekül 3N-6 Normalschwingungsmoden, da jeweils 3 Freiheitsgrade für die Translation und die Rotation des Gesamtmoleküls abgezogen werden müssen, durch die die Bindungswinkel und Bindungslängen der einzelnen Atome nicht beeinflusst werden. Neben diesen Normalschwingungen existieren für jedes Molekül noch Übergänge zu Oberschwingungen sowie Kombinationssschwingungen, bei denen sich mehrere Normalschwingungen überlagern. Besitzt eine Normalschwingung dieselbe Frequenz wie eine Oberschwingung tritt Fermi-Resonanz auf. Die Frequenz jeder Schwingung hängt nicht nur von den direkt an der jeweiligen Schwingung beteiligten Atomen ab, sondern auch von ihrer chemischen Umgebung. Durch Wechselwirkungen mit räumlich entfernten Atomen oder Gruppen wird die Kraftkonstante der chemischen Bindung beeinflusst, so dass sich die Frequenz gleichartiger Normalschwingungen aufgrund einer veränderten chemischen Umgebung unterscheidet. Daher können aus der Lage einer Bande in einem IR-Spektrum auch strukturelle Informationen über die Geometrie räumlich benachbarter Gruppen sowie über Wechselwirkungen mit dem umgebenden Lösungsmittel geschlossen werden. 3.2 Fourier-Transformations Infrarotspektroskopie (FTIR-Spektroskopie) In der modernen Infrarotspektroskopie werden in der Regel Fourier Transformations Infrarot (FTIR) Spektrometer verwendet. Im Gegensatz zu einem herkömmlichen dispersiven IRSpektrometer, bei dem ein Monochromator aus der einfallenden elektromagnetischen Strahlung bestimmte, möglichst kleine Frequenzbereiche selektiert, wird bei diesem Messverfahren die Probe vom gesamten Spektrum der IR-Strahlungsquelle durchleuchtet. Ein MichelsonInterferometer ermöglicht es, dennoch spektrale Informationen zu erhalten. Es besteht aus einem halbdurchlässigen Spiegel, dem Strahlteiler, sowie aus einem fixierten und einem beweglichen Spiegel. Abb. 3.3 zeigt schematisch den Aufbau eines Michelson-Interferometers. 48 3.2 Fourier-Transformation Infrarotspektroskopie (FTIR-Spektroskopie) coherent light source (globar) fixed mirror beam splitter sample detector movable mirror mirror position x Abb. 3.3: Aufbau und Funktionsprinzip eines Michelson-Interferometers (nach Siebert und Hildebrandt, 2007). Das von der IR-Strahlungsquelle - dem so genannten Globar - emittierte Licht, wird zunächst durch den Strahlteiler aufgeteilt, so dass etwa die Hälfte der Strahlung auf den festen Spiegel reflektiert, die andere Hälfte auf den beweglichen Spiegel durchgelassen wird. An beiden Spiegeln wird das Licht wieder reflektiert und gelangt anschließend zurück zum Strahlteiler, an dem beide Teilstrahlen wieder vereinigt werden. Bei diesem Zusammentreffen der beiden Teilstrahlen kommt es zur Interferenz zwischen den beiden Wellen. Der Gangunterschied zwischen beiden Wellen variiert allerdings ständig, da die Weglänge des am beweglichen Spiegel reflektierten Teilstrahls fortlaufend verändert wird. Daher kommt es in Abhängigkeit von der Position des beweglichen Spiegels und der Wellenlänge der Strahlung teilweise zu konstruktiver und teilweise zu destruktiver Interferenz. Ein Teil dieses interferierenden Strahlenbündels wird dann zur Probe und anschließend zum Detektor geleitet. Der Detektor misst daraufhin die Intensität des einfallenden Lichts in Abhängigkeit von der Position des beweglichen Spiegels, das resultierende Diagramm wird als Interferogramm bezeichnet. Würde ausschließlich monochromatisches Licht durch das Michelson-Interferometer auf den Detektor geleitet, ergebe sich aufgrund der wegabhängigen Interferenz eine cosinusförmige Intensitätsfunktion am Detektor mit der Intensität des eingestrahlten Lichts als maximale Amplitude. Die Cosinusfunktion in Abhängigkeit vom Gangunterschied x der beiden Teilstrahlen und damit der Spiegelposition sowie der Frequenz des monochromatischen Lichts lautet: I ( x) = S (ν ) cos (2π ν x) Gl. 3.4 In dieser Gleichung bezeichnet I(x) die Intensität in Abhängigkeit vom Gangunterschied x und S(ν ) die Intensität des eingestrahlten monochromatischen Lichts der Wellenzahlν . Im Fall der FTIR-Spektroskopie wird allerdings kein monochromatisches Licht sondern ein breites Spektrum von Infrarotlicht durch das Michelson-Interferometer auf den Detektor geleitet. 3.2 Fourier-Transformation Infrarotspektroskopie (FTIR-Spektroskopie) 49 Zusätzlich zu den interferierenden Teilstrahlen der Wellen einer Frequenz überlagern sich daher die Interferenz-Intensitäten verschiedener im Infrarotlicht enthaltener Wellenlängen, intensity I(x) wie in Abb. 3.4 dargestellt ist. mirror position x Abb. 3.4: Überlagerung von verschiedenen Interferenz-Intensitätsfunktionen zur am Detektor empfangenen Gesamtintensität in Abhängigkeit von der Spiegelposition x. Am Nullpunkt des Spiegelwegs sind die Wege der Teilstrahlen jeweils gleich, so dass alle Wellen die Phasendifferenz Null besitzen und deshalb konstruktiv interferieren. Daher ist bei dieser so genannten Weißlichtposition die Intensität maximal (aus Griffith, 1986). Überlagern sich verschiedene Wellen mit unterschiedlichen Wellenlängen lässt sich das Intensitätssignal am Detektor durch Integration der einzelnen Intensitäten über die gesamte Bandbreite des am Detektor ankommenden Frequenzbereichs berechnen: I ( x) = ∫ S (ν ) cos ( 2πν x) dν Gl. 3.5 B Diese Funktion kann durch ein Integral über den unendlichen Wellenzahlbereich ersetzt werden, das eine Fensterfunktion D(ν ) enthält, die innerhalb der Bandbreite den Wert 1 und außerhalb den Wert Null annimmt: +∞ I ( x) = ∫ S (ν ) D (ν ) cos (2 π ν x) dν Gl. 3.6 −∞ Gleichung 3.6 entspricht der Fourier-Kosinustransformation. Durch die Bildung der inversen Fourier-Kosinustransformation kann aus dem Intensitätssignal I(x) die Intensität in Abhängigkeit von der Wellenzahl ν berechnet werden. Die inverse Fourier-Kosinustransformation ist definiert durch: +∞ D(ν )S(ν ) = ∫ I( x )cos( 2 π ν x ) dx −∞ Gl. 3.7 50 3.2 Fourier-Transformation Infrarotspektroskopie (FTIR-Spektroskopie) Die Gleichung kann außerdem in komplexer Schreibweise dargestellt werden: D(ν )S(ν ) = +∞ ∫ I( x ) e i 2πν x dx Gl. 3.8 −∞ Der Detektor misst also die Intensität in Abhängigkeit von der Spiegelposition, mit Hilfe des Computers kann aus dem gemessenen Interferogramm anschließend durch Bildung der inversen Fouriertransformation das so genannte Einkanalspektrum S(ν ) berechnet werden. Aus dem Interferogramm kann daher durch Bildung der inversen Fouriertransformatiom auf die im Ausgangssignal enthaltenen Wellenlängen geschlossen werden, wie in Abbildung 3.5 ver- I(x) S(ν) deutlicht ist. x I(x) S(ν) ν ν mirror position x Abb. 3.5: Durch Bildung der inversen Fouriertransformation kann aus der am Detektor gemessenen Intensitätsfunktion in Abhängigkeit von der Spiegelposition ein Spektrum berechnet werden, das die Intensität in Abhängigkeit von der Wellenzahl des eingestrahlten Lichts widerspiegelt (aus Günzler und Heise, 1996). Um zu jedem Zeitpunkt die genaue Spiegelposition bestimmen zu können, wird parallel zum Infrarotstrahl ein Helium/Neon Laserstrahl genau definierter Wellenlänge durch das Michelson-Interferometer auf einen separaten Detektor geleitet. Bei FTIR-Spektrometern wird somit während der Messung automatisch eine sehr genaue Wellenzahlkalibrierung durchgeführt. Die dadurch im Vergleich zu dispersiven Spektrometern wesentlich höhere Wellenzahlpräzision von etwa 0,01 cm-1 wird auch als Connes-Vorteil bezeichnet. Die Spiegelposition wird allerdings nicht kontinuierlich sondern nur an diskreten Positionen gemessen. Als Kontrollpunkte werden die Nulldurchgänge der Intensitätsfunktion des monochromatischen Lichts des He-Ne-Lasers verwendet, an denen die Spiegelposition jeweils exakt ge- 3.2 Fourier-Transformation Infrarotspektroskopie (FTIR-Spektroskopie) 51 messen wird. Da nur diskrete Werte der Intensitätsfunktion vorliegen, wird vom Computer eine so genannte diskrete Fourier-Transformation (DFT) durchgeführt. Zur Durchführung dieser Transformation wird ein sehr schneller Algorithmus verwendet, der auch als schnelle Fourier-Transformation bezeichnet wird (Cooley und Tukey, 1965). Um eine eindeutige Annäherung an die exakte Fourier-Transformation zu erhalten, muss nach dem NyquistShannonschen Abtasttheorem die höchste im Ausgangssignal enthaltene Frequenz kleiner als die doppelte Abtastfrequenz sein. Höhere Frequenzen im Eingangssignal können Störungen verursachen, die auch als Alias-Effekte bezeichnet werden. Daher ist der Messbereich aufgrund der Wellenlänge des Helium/Neon Lasers und der ausschließlichen Verwendung der Nulldurchgänge der Intensitätsfunktion als Digitalisierungspunkte auf 632 nm oder 15800 cm-1 begrenzt. Höhere Wellenzahlbereiche im Eingangssignal müssen aufgrund möglicher Alias-Effekte durch Tiefpassfilter unterdrückt werden. Neben der maximal messbaren Frequenz ist auch die spektrale Auflösung eines FTIR-Spektrometers durch apparative Gegebenheiten begrenzt. Damit zwei diskrete Linien mit einer Wellenzahldifferenz Δν unterschieden werden können, muss der vom beweglichen Spiegel zurückgelegte Weg Δ x mindestens so groß sein wie die reziproke Wellenzahldifferenz der beiden Signale. ν 2 −ν 1 = Δν = 1 Δx Gl. 3.9 Für eine Auflösung von 4 cm-1 muss der Spiegelweg daher 0,25 cm betragen. Ein längerer Spiegelweg verbessert zwar die Auflösung, erhöht allerdings auch das Rauschen und verschlechtert somit das Signal-Rausch-Verhältnis. Neben der spektralen Auflösung ist für ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis zudem die Messzeit ausschlaggebend. Da bei FTIRSpektrometern der gesamte Spektralbereich gleichzeitig gemessen werden kann und sich daher gegenüber dispersiven Spektrometern wesentlich kürzere Messzeiten ergeben, kann ein besseres Signal-Rausch-Verhältnis erzielt werden (Fellgett- oder Multiplex-Vorteil). Durch die Verwendung von runden Blenden im Vergleich zu den schmalen Spalten der Gitter von dispersiven Spektrometern wird zudem der Lichtdurchsatz erhöht (Jaquinot-Vorteil). Insgesamt äußern sich die erwähnten Vorteile in einem höheren Signal/Rausch-Verhältnis bzw. einer verkürzten Messzeit. 52 3.3 Messverfahren 3.3 Messverfahren 3.3.1 Absorptionsmessungen Beim beschriebenen Versuchsaufbau wird der Infrarotstrahl nach dem Verlassen des Michelson-Interferometers mit der Intensität I0 auf die Probe eingestrahlt. Ein Teil des Lichts wird dann von der Probe absorbiert, so dass nur das transmittierte Licht der Intensität I die Probe wieder verlässt und auf den Detektor fällt. Die Wahrscheinlichkeit für die Absorption von Strahlung einer bestimmten Wellenlänge ist bei homogenen Proben überall gleich. Wie stark die Probe das Infrarotlicht absorbiert, hängt daher von der Konzentration der Probe, der Schichtdicke der vom Infrarotstrahl durchlaufenden Lösung und dem so genannten Extinktionskoeffizienten der absorbierenden Substanz ab. Er gibt an, wie viel Licht eine Substanz in molarer Konzentration bei einer Weglänge von einem cm und einer bestimmten Wellenlänge absorbiert. Für monochromatisches Licht gilt dann unter der zusätzlichen Voraussetzung, dass keine Lichtstreuung stattfindet, das Lambert-Beersche Gesetz: A = − log I = ελ ⋅ c ⋅d I0 Gl. 3.10 Am Detektor wird allerdings nur die Intensität I des transmittierten Lichts in Abhängigkeit von der Position des beweglichen Spiegels gemessen. Das durch Bildung der inversen Fouriertransformation aus dem Interferogramm abgeleitete Spektrum S (ν ) wird auch als Einkanalspektrum bezeichnet. Neben dem Absorptionsverhalten der untersuchten Probe haben auch noch viele Geräteeigenschaften wie beispielsweise die Energieverteilungsfunktion der Infrarotquelle und die Empfindlichkeit des Detektors einen Einfluss auf dieses Spektrum. Erst durch zusätzliche Messung eines Referenzspektrums S 0 (ν ) , das die Intensität des Infrarotlichts ohne Probe wiedergibt, kann das von den Geräteeigenschaften unabhängige Transmissionsspektrum der Probe berechnet werden: T (ν ) = S (ν ) S 0 (ν ) Gl. 3.11 Auch das Absorptionsspektrum der Probe kann aus dem Einkanalspektrum S (ν ) sowie dem Referenzspektrum S 0 (ν ) erhalten werden: A(ν ) = − log S (ν ) = − log T (ν ) S 0 (ν ) Gl. 3.12 3.3 Messverfahren 53 In der vorliegenden Arbeit wurden auf diese Weise Absorptionsspektren des Photorezeptors NpSRII gemessen. Das Protein wurde hierzu auf BaF2-Fenstern aufgetrocknet und anschließend hydratisiert (siehe Kapitel 3.6), so dass die aufgenommenen Spektren neben den Absorptionsbanden des Proteins auch noch die Absorptionsbanden von Wasser enthalten. Nimmt man getrennt auch das Absorptionsspektrum von Wasser auf, kann durch Differenzbildung das Absorptionsspektrum des Proteins berechnet werden: A(ν )Pr otein = A(ν )Pr obe − A(ν )Wasser Gl. 3.13 Abbildung 3.6 zeigt beispielhaft ein aus den Einkanalspektren der sw-Probe, des Wassers und einer Referenz abgeleitetes Absorptionsspektrum von NpSRII. S 0 (ν ) intensity S(ν) absorption A(ν) S (ν )Wasser S (ν ) sw− Pr obe A(ν ) sw− Pr obe = − log A(ν )Wasser = − log S (ν ) sw− Pr obe S 0 (ν ) S (ν )Wasser S 0 (ν ) APr otein = APr obe − AWasser 2600 2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 -1 wavenumber [cm ] Abb. 3.6: Berechnung eines Absorptionsspektrums von NpSRII aus den gemessenen Einkanalspektren der sw-Probe sowie einer Wasserprobe. Die daraus resultierenden Absorptionsspektren A(ν ) sw−Pr obe sowie A(ν )Wasser wurden zunächst auf die breite Absorptionsbande des Wassers bei 2127 cm-1 normiert, bevor aus den beiden Spektren A(ν )Pr obe und A(ν )Wasser durch Differenzbildung das Absorptionsspektrum A(ν ) Pr otein gebildet wurde. Im Absorptionsspektrum sind deutlich die sich überlagernden Schwingungsmoden der Amidgruppen des Proteinrückgrats von NpSRII zu erkennen, die als Amid-Moden bezeichnet werden. Die Amid I-Mode absorbiert Infrarotlicht bei etwa 1650 cm-1 und wird vor allem durch die C=O Streckschwingung verursacht. Kleinere Beiträge stammen von der antisymmetrischen C-N Streckschwingung, der C-C-N Deformations- und der NH Biegeschwingung 54 3.3 Messverfahren in der Ebene der Peptidgruppe. Die genaue Frequenz hängt weniger von den beteiligten Seitenketten als von der Sekundärstruktur des Proteinrückgrats ab, so dass diese Schwingung zur Sekundärstrukturbestimmung von Proteinen verwendet werden kann (Krimm und Bandekar, 1986). Die Amid II Mode absorbiert bei etwa 1550 cm-1 und besteht aus kombinierten NHBiege- und C-N Streckschwingungen der Peptidbindungen. Kleinere Anteile stammen von C=O Biegeschwingungen sowie von CC- und NC Streckschwingungen. Die Amid III Mode besteht aus der entgegengesetzten Kombination der NH Biege- und der C-N Streckschwingungen der Peptidbindungen. Aufgrund von Beiträgen der Seitenketten ist die genaue Identifikation der Amid III Mode relativ schwierig. Aufgrund der Überlagerung vieler Banden können aus dem Absorptionsspektrum eines Proteins keine positionsspezifischen strukturellen Informationen gewonnen werden. Da die Frequenz der Amidmoden von der Sekundärstruktur des Proteinrückgrats abhängt, können durch Dekonvolution der Amidbanden lediglich die prozentualen Anteile der verschiedenen Sekundärstrukturelemente anhand eines Absorptionsspektrums ermittelt werden. Durch gruppenspezifische Isotopenmarkierung sowie durch positionsspezifisches Labeln des Rezeptors mit Infrarotsonden, deren Absorptionsbande nicht durch die Proteinbanden überlagert wurde, konnten in der vorliegenden Arbeit zusätzliche Informationen anhand der Absorptionsspektren gewonnen werden (siehe Kapitel 3.4 und 3.5). 3.3.2 Reaktionsinduzierte Differenzspektroskopie Der limitierte Informationsgehalt des Absorptionsspektrums eines Proteins aufgrund der zahlreichen sich überlagernden Banden kann durch die Methode der reaktionsinduzierten Differenzspektroskopie gesteigert werden. Durch Bildung eines Differenzspektrums aus zwei Einkanalspektren zweier unterschiedlicher Proteinzustände wird die Zahl der Gruppen des Proteins, die zum Spektrum beitragen, reduziert, so dass aus dem Spektrum detaillierte strukturelle Informationen gewonnen werden können. Lediglich diejenigen Gruppen des Proteins, die an der Reaktion des Proteins beteiligt sind, verursachen eine Differenzbande im Spektrum. Dadurch können Konformationsänderungen im untersuchten Protein, aber auch Veränderungen des Protonierungszustands einzelner Aminosäuren beobachtet werden. Die Veränderungen der Absorptionsbanden dieser Gruppen sind in der Regel allerdings ziemlich klein und liegen normalerweise in der Größenordnung von etwa 0,1 Prozent der maximalen Absorption. Aufgrund dieser geringen Unterschiede ist eine sehr genaue Reproduktion der Messbedingungen erforderlich, um ein Differenzspektrum zwischen zwei verschiedenen Proteinzuständen zu erhalten. Dies wird erreicht, indem die untersuchte Proteinreaktion direkt in der Messküvette 3.3 Messverfahren 55 initiiert wird, so dass nicht zwei Spektren von zwei unterschiedlichen Proben miteinander verglichen werden müssen. Beim untersuchten Photorezeptor NpSRII kann die Photoreaktion durch Bestrahlung der Probe mit Licht geeigneter Wellenlänge ausgelöst werden. Das Differenzspektrum kann dann aus den Einkanalspektren, die vor und während der Belichtung gemessen wurden, folgendermaßen berechnet werden: Δ A (ν ) = A (ν ) Photoprodukt − A (ν ) Dunkelzustand = − log S (ν ) Photoproduk S (ν ) Dunkelzustand Gl. 3.14 Abb. 3.7 zeigt exemplarisch, wie nach dieser Methode aus zwei Einkanalspektren, die vor und während der Belichtung aufgenommen wurden, ein Differenzspektrum berechnet werden kann. S(ν)photoproduct S(ν)dark state Intensity S(ν) absorption change ΔA(ν) Δ A (ν ) = − log 2600 S(ν ) Photoproduk S(ν ) Dunkelzustand 2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 -1 wavenumber [cm ] Abb. 3.7: Berechnung eines Photoprodukt-minus-Dunkelzustand Differenzspektrums aus den entsprechenden Einkanalspektren. Die Abbildung verdeutlicht, wie gering die Intensitätsunterschiede zwischen den beiden Einkanalspektren vor und während der Belichtung bei einer gleichzeitig hohen Hintergrundabsorption vieler weiterer nicht an der Photoreaktion beteiligter Gruppen sind. Daher sind hohe Anforderungen an die Sensitivität und die zeitliche Stabilität des Messsystems notwendig. 56 3.3 Messverfahren Abbildung 3.8 zeigt eine vergrößerte Darstellung des Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektrums vom Photorezeptor NpSRII. Amide I region Amide II region photoproduct dark state absorption change COOH Fingerprint region C=C C=N+-H C=C C14-H COO- C10-C11 protonated Asp 75 C12-C13 deprotonated carboxylic acids C14-C15 10 12 14 C=N Ethylenic stretch C=C C=N stretch protonated Schiff Base 1900 1800 1700 1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000 -1 wavenumber [cm ] Abb. 3.8: Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektrum des Photorezeptors NpSRII. Hervorgehoben sind zudem einige Spektralbereiche, die den dargestellten Schwingungsmoden zugeordnet werden können. Bei der verwendeten Messmethode sind die Einkanalspektren des Photoprodukts während einer kontinuierlichen Belichtung aufgenommen worden, so dass sich ein Gleichgewicht zwischen verschiedenen Intermediaten des Photozyklus von NpSRII einstellt. Im Photoprodukt liegt also eine Mischung verschiedener Intermediate vor, wobei die beiden späten, langlebigen Intermediate M und O überwiegen. Die genauen Anteile hängen von experimentellen Parametern wie der Temperatur, dem Wassergehalt der Probe sowie der Anregungswellenlänge des auf die Probe gestrahlten Lichts ab. Das dargestellte Spektrum enthält sowohl Banden von einzelnen Gruppen des Proteins als auch des Chromophors Retinal. Positive Banden stammen dabei vom Photoprodukt, während die negativen Banden durch Absorptionsbanden des Dunkelzustandes verursacht werden. Im Bereich zwischen 1800 cm-1 und 1700 cm-1 absorbieren die C=O Streckschwingungsmoden der protonierten Carbonsäuren. Die positive Bande bei 1765 cm-1 stammt von der 3.3 Messverfahren 57 C=O Streckschwingung des Protonenakzeptors Asp75 (Engelhard et al., 1996), der beim Übergang zum frühen M-Intermediat das Proton von der Schiff Base übernimmt (siehe Kapitel 1.7). Im O-Intermediat ist die Position der Bande geringfügig zu niedrigeren Wellenzahlen verschoben, wie im Photintermediat-minus-Dunkelzustand durch die Schulter der Bande bei etwa 1757 cm-1 verdeutlicht wird (Furutani et al., 2004). Die asymmetrischen Streckschwingsmoden der deprotonierten Carbonsäuren absorbieren im Wellenzahlbereich zwischen 1600 cm-1 und 1550 cm-1, wo sie allerdings von den intensiveren Amidbanden des Proteins überlagert werden. Die symmetrischen Streckschwingungsmoden der Carboxylatgruppen absorbieren im Wellenzahlbereich zwischen 1430 cm-1 und 1300 cm-1, die negative Bande bei 1423 cm-1 kann dem deprotonierten Gegenion Asp75 zugeordnet werden. Die Amid I-Banden werden ebenfalls hauptsächlich durch C=O Streckschwingungsmoden verursacht (siehe Kapitel 3.3.2). Aufgrund des höheren Einfachbindungscharakters der Carbonylbindungen der Amidgruppen und der daher geringeren Kraftkonstanten absorbieren die Amid I-Schwingungsmoden bei einer Wellenzahl von etwa 1650 cm-1 und damit etwa 100 Wellenzahlen niedriger als die C=O Streckschwingungen der protonierten Carbonsäuren. Verschiebungen dieser Bande werden vor allem durch Kopplungsänderungen des Übergangsdipolmoments der einzelnen Amidgruppen verursacht (Krimm und Abe, 1972). Bei diesen so genannten Übergangs Dipolkopplungen handelt es sich um Resonanz Interaktionen zwischen oszillierenden Dipolen benachbarter Amidgruppen, die stark von der relativen Orientierung und dem Abstand dieser Gruppen abhängt (Barth und Zscherp, 2002; Barth, 2007). Die Differenzbanden der Amid I-Schwingungsmoden zeigen daher Konformationsänderungen des Proteinrückgrats beim Übergang vom Grundzustand zum aktiven Photoprodukt an. Auch die Amid II-Schwingungsmoden, die bei etwa 1550 cm-1 absorbieren, reagieren sensitiv auf eine Veränderung der Sekundärstruktur des Proteinrückgrats. Die Amid I- und Amid II Differenzbanden werden allerdings zum Teil von Differenzbanden des Chromophors überlagert. Die C=N Streckschwingung der Schiff Base absorbiert im Bereich zwischen 1660 cm-1 und 1600 cm-1 und damit im Bereich der Amid I Moden. Das Absorptionsmaximum der Schwingungsmode liegt im Grundzustand bei 1657 cm-1 (Shimono et al., 2003) und bei 1639 cm-1 im O-Intermediat. Durch positionsspezifische Isotopenmarkierung des Stickstoffatoms der Schiff Base verschiebt sich die Absorptionsbande der C=N Streckschwingung, so dass keine Überlagerung mit den Banden der Amid I Moden mehr stattfindet und daher eine Identifikation der Differenzbande der C=N Streckschwingung beim Photoprodukt möglich ist (siehe Kapitel 3.4). 58 3.3 Messverfahren Im Bereich der Amid II Moden absorbieren auch die Ethylenmoden des Chromophors. Bei diesen handelt es sich um Streckschwingungsmoden der delokalisierten Doppelbindungen des Retinals. Sowohl die Intensität als auch die Position der Bande hängt stark vom Protonierungszustand der Schiff Base ab. Die Intensitäten der Banden der späten Photointermediate sind dabei geringer als die Intensität der Bande des Grundzustands, in dem die Schiff Base protoniert ist. Durch Vergleich von Raman- und FTIR-spektroskopischen Messungen konnte die Position der Ethylenbanden in den verschiedenen Photointermediaten trotz Überlagerung mit Banden der Amid II Moden exakt bestimmt werden. Im Dunkelzustand liegt das Absorptionsmaximum des Schwingungsmodes bei 1547 cm-1, im M-Intermediat bei 1577 cm-1 und im O-Intermediat bei 1536 cm-1. Der Wellenzahlbereich zwischen 1300 cm-1 und 1100 cm-1 wird auch als so genannter Fingerprint-Bereich des Chromophors bezeichnet. Die Banden dieses Bereichs sind charakteristisch für die Konformation der Polyen-Kette des Retinals. Sie werden durch CC Streckschwingungen in Kombination mit CH Biegeschwingungen verursacht. Die Wasserstoffatome schwingen dabei in der Ebene, die durch die Polyenkette definiert wird. Die Schwingungsmoden werden daher auch als hydrogen-in-plane Moden bezeichnet. In der Fingerprint-Region weisen die Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren von BR und NpSRII große Übereinstimungen auf. Daher konnten die negativen Banden bei 1242 cm-1, 1202 cm-1 und 1164 cm-1 den verschiedenen CC Streckschwingungen der Polyenkette zugeordnet werden (Furutani et al., 2002). Die Banden bei 1242 cm-1 und 1202 cm-1 enthalten darüber hinaus Anteile der gekoppelten NH Biegeschwingung der protonierten Schiff Base. Eine wichtige Bedeutung in der Fingerprint-Region hat auch die positive Bande bei 1190 cm-1, die nur Photoprodukte mit einer protonierten Schiff Base aufweisen (Siebert et al., 1983). Daher zeigt die Bande auch den Anteil des O-Intermediats im Photoprodukt an, da erst beim Übergang vom späten M-Intermediat zum O-Intermediat die Schiff Base wieder reprotoniert wird (siehe Kapitel 1.7). 3.4 Isotopenmarkierung 59 3.4 Isotopenmarkierung In der vorliegenden Arbeit sollte die Interaktion von NpSRII mit seinem Transducer NpHtrII untersucht werden. Hiefür wurde ein 157 Aminosäuren langes N-terminales terminales Fragment des Transducers zusammen mit dem Rezeptor in Purpurmembran-Lipiden rekonstituiert. Die Länge des Transducerfragments ist dabei ausreichend, um eine feste Bindung an den Rezeptor zu gewährleisten (siehe Kapitel 1.8); in den Purpurmembran-Lipiden liegt der Komplex zudem wie in den Zellmembranen von Natronobacterium pharaonis in einer Stöchiometrie von 2:2 vor (Wegener et al., 2001). Im Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektrum des NpSRII/NpHtrII-Komplexes können die beobachteten Differenzbanden der Amid I-Schwingungsmoden sowohl durch Konformationsänderungen des Rezeptors als auch des Transducers ausgelöst werden. Durch einen Vergleich der Differenzspektren des NpSRII/NpHtrII-Komplexes mit denjenigen von NpSRII können erste Informationen darüber gewonnen werden, welche Differenzbanden durch Schwingungsmoden des Transducers verursacht oder durch die Gegenwart des Transducers beeinflusst werden. Um die Unterschiede besser aufzulösen, können die beiden Spektren voneinander abgezogen werden und ein Doppeldifferenzspektrum gebildet werden (Hauser et al., 2002). Eine eindeutige Zuordnung der Differenzbanden zu Schwingungsmoden des Transducers oder des Rezeptors ist allerdings erst durch eine vollständige Markierung des Rezeptors oder des Transducerfragments mit den stabilen Isotopen 15N sowie 13C möglich. Aufgrund der höheren Masse dieser beiden Isotope verglichen mit den natürlicherweise überwiegend vorkommenden Isotopen 14 N und 12 C verschiebt sich gemäß Gleichung 3.15 die Schwingungsfrequenz derjenigen Gruppen, bei denen die Kohlenstoff- oder Stickstoffatome durch ihre jeweiligen Isotope ausgetauscht worden sind und somit eine Änderung der reduzierten Massen des Oszillators erfolgt. 1 1 ⎛ k k ⎞ Δν = (v + ) ⎜ − ⎟ 2 2π ⎜⎝ μ1 μ2 ⎟⎠ Durch eine 15 Gl. 3.15 N,13C-Isotopenmarkierung von NpHtrII_1-157 werden daher die Frequenzen aller Schwingungsmoden des Transducers verringert, die Schwingungsmoden des Rezeptors bleiben dagegen unbeeinflusst. Durch eine vollständige 13 C,15N-Isotopenmarkierung von NpSRII kann in einem zweiten Experiment auch die Frequenz dieser Schwingungsmoden verändert werden. Um die Konformationsänderungen zu untersuchen, die die Signalübertragung vom Rezeptor zum Transducer vermitteln, sind insbesondere die Amid I Banden von Bedeutung. Im Spekt- 60 3.4 Isotopenmarkierung ralbereich um 1650 cm-1 absorbieren allerdings nicht nur die Amid I Schwingungsmoden sondern auch die C=N Streckschwingungsmode der Schiff Base (siehe Kapitel 3.3.2). Um die Banden besser den jeweiligen Schwingungsmoden zuordnen zu können und die spektrale Überlappung zu vermeiden, wurde die Methode der gruppenspezifischen Isotopenmarkierung (Sonar et al., 1994) angewandt. Durch die Inkorporation von 15Nε-markierten Lysinen in den Photorezeptor NpSRII wird die Frequenz der C=N Streckschwingung der Schiff Base so beeinflusst, dass im Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektrum eine Trennung der Banden der Amid I Schwingungsmoden von den Banden der C=N Streckschwingungsmode erfolgt. Durch die Methode der gruppenspezifischen Isotopenmarkierung sowie der uniformen Isotopenmarkierung sollten letztlich die Amid I Schwingungsmoden des Transducers sowie des Rezeptors identifiziert werden, deren Frequenzen beim Signalübertragungsprozess aufgrund von Konformationsänderungen beeinflusst werden. In Tabelle 3.1 sind die unterschiedlichen isotopenmarkierten Proben aufgeführt, die zur Untersuchung dieser Fragestellung gemessen wurden. Tabelle 3.1: Ungelabelte sowie isotopenmarkierte Proben von NpSRII sowie vom NpSRII/NpHtrIIKomplex, die in dieser Arbeit spektroskopisch untersucht wurden. Alle Proben wurden in Purpurmembran-Lipiden (PML) von Halobacterium salinarium rekonstituiert. Rezeptor Komplex NpSRII NpSRII/NpHtrII_1-157 NpSRII/15N,13C-NpHtrII_1-157 15 15 Nε-Lys-NpSRII Nε-Lys-NpSRII/NpHtrII_1-157 15 Nε-Lys-NpSRII/15N,13C-NpHtrII_1-157 15 N,13C-NpSRII 15 N,13C-NpSRII/NpHtrII_1-157 15 N,13C-NpSRII/15N,13C-NpHtrII_1-157 Hergestellt wurden die Proben von Swetlana Martell und Nadine Mennes aus der Arbeitsgruppe von Prof. Martin Engelhard am Max-Planck Institut für molekulare Physiologie in Dortmund. 3.5 Aromatische Nitrile als Infrarotsonden 61 3.5 Aromatische Nitrile als Infrarotsonden 3.5.1 Grundlagen Mit Hilfe der uniformen Isotopenmarkierung ist es möglich zu unterscheiden, ob Differenzbanden vom Transducer oder vom Rezeptor verursacht werden. Darüber hinaus kann allerdings ohne weitere Informationen nichts darüber ausgesagt werden, in welchen Regionen des Proteins die strukturellen oder elektrostatischen Veränderungen auftreten, die diese Differenzbanden verursachen. Bisher konnten positionsspezifische Informationen ausschließlich durch gruppenspezifische Isotopenmarkierung oder ortsspezifische Mutagenesen erhalten werden. Diese Experimente sind allerdings sehr aufwendig und zudem häufig nicht eindeutig, da sich im untersuchten Spektralbereich viele Banden überlagern. Durch Einbringung einer spezifischen funktionellen Gruppe in das Protein, deren Schwingungsmode in einem Spektralbereich liegt, in dem sich keine weiteren Absorptionsbanden von Schwingungsmoden des Proteins befinden, wurde im Rahmen dieser Doktorarbeit eine weitere Möglichkeit getestet, um positionsspezifische Informationen mit Hilfe der Infrarotspektroskopie zu erhalten. Um die Gruppe als Infrarotsonde verwenden zu können, sollte die Frequenz der untersuchten Schwingung zudem eine hohe Sensitivität für Änderungen in der lokalen Umgebung der Sonde aufweisen. Eine ideale Sonde sollte zudem einen möglichst hohen Extinktionskoeffizienten aufweisen, um ein gutes Signal-zu-Rausch Verhältnis zu erhalten. Tabelle 3.2 stellt für verschiedene als Infrarotsonde für biologische Systeme in Frage kommende Bindungstypen die wichtigsten spektralen Parameter zusammen, die die Eignung der jeweiligen Gruppe als Infrarotsonde widerspiegelt. Tabelle 3.2: Bindungstypen, Frequenzen, Intensitäten sowie Stark Tuning Raten einiger funktioneller Gruppen, die als Infrarotsonde in Frage kommen. Bindungstyp Spektralbereich ν -1 [cm ] Intensität Stark Tuning Rate [cm-1/(MV/cm)] -C-H 2850-3100 schwach 0,2-0,6 -C-D 2000-2200 schwach 0,4-1,5 -C-F 1100-1300 stark 0,4-0,9 -C=O (Carbonyl) 1600-1750 stark 0,6-1,8 -C≡N (Nitril) 2050-2270 stark 0,4-2,9 -N=N =N (Azid) 2080-2170 sehr stark klein -N=C=O (Isocyanat) 2250-2300 sehr stark klein N=O (Nitro) 1490-1600 sehr stark ~1,3 + - aus [Boxer, 2009] 62 3.5 Aromatische Nitrile als Infrarotsonden Die Tabelle verdeutlicht, dass vor allem Nitrilverbindungen gut als Infrarotsonden geeignet sind. Das Absorptionsmaximum der C≡N Streckschwingung liegt im Wellenzahlbereich von etwa 2230 cm-1 und somit in einem Spektralbereich, in dem keine weiteren Schwingungsmoden des Proteins absorbieren (siehe Kapitel 3.3.2), so dass keine Überlagerung der Bande der Infrarotsonde mit Proteinbanden zu erwarten ist. Zwar absorbieren auch Isocyanat- sowie Azidverbindungen in diesem Spektralbereich, allerdings sind deren Spektren häufig schwieriger zu interpretieren. Im Unterschied zu diesen beiden Gruppenschwingungen wird die Frequenz der C≡N Streckschwingung zudem stark durch äußere elektrostatische Felder beeinflusst (Andrews und Boxer, 2000; Andrews und Boxer, 2002), wie die relativ hohen Werte der so genannten Stark Tuning Rate verdeutlichen. Variationen lokaler elektrostatischer Felder können innerhalb eines Proteins z.B. durch Konformationsänderungen oder durch Veränderungen im Protonierungszustand funktioneller Gruppen verursacht werden. Aufgrund der Sensitivität der Frequenz der C≡N Streckschwingung für diese elektrostatischen Felder sollten solche Veränderungen in der Umgebung der ins Protein eingebrachten Sonde daher eine Frequenzverschiebung der C≡N Streckschwingung zur Folge haben und somit mit Hilfe der reaktionsinduzierten Infrarotspektroskopie nachweisbar sein. Die Frequenz der C≡N Streckschwingung reagiert allerdings nicht nur sensitiv auf äußere elektrische Felder sondern wird auch durch direkte Wechselwirkungen der Nitrilfunktion mit funktionellen Gruppen des Proteins oder dem umgebenden Lösungsmittel wie z.B. durch Wasserstoffbrückenbindungen beeinflusst. Da die Lösungsmittelzugänglichkeit der Infrarotsonde durch Konformationsänderungen des Proteins beeinflusst werden kann, deuten hierdurch verursachte Frequenzverschiebungen der C≡N Streckschwingung auf strukturelle Veränderungen des untersuchten Proteins hin. Beide Effekte wurden im Rahmen dieser Doktorarbeit am Beispiel des aromatischen Nitrils 4-Mercaptobenzonitril (4-MBN) untersucht. Hierzu wurden zunächst Absorptionsspektren von 4-MBN in verschiedenen aprotischen sowie protischen Lösungsmitteln mit unterschiedlichen Dielektrizitätskonstanten gemessen. Anschließend wurden verschiedene Positionen des Photorezeptors NpSRII sowie des Transducers NpHtrII mit der IR-Sonde markiert und sowohl Absorptionsspektren als auch Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren der gelabelten Proteine gemessen. Bevor auf die durchgeführten Experimente näher eingegangen wird, werden zunächst einige theoretische Aspekte der beiden verschiedenen Einflussgrößen auf die Frequenz der C≡N Streckschwingung beschrieben. 3.5 Aromatische Nitrile als Infrarotsonden 63 3.5.2 Der Stark Effekt Der so genannte Stark Effekt beschreibt spektrale Veränderungen in der Gegenwart von elektrischen Feldern. Der Effekt wurde bereits 1913 von Johannes Stark entdeckt, der eine Aufspaltung der Spektrallinien im elektronischen Emissionsspektrum des Wasserstoffatoms bei Anlegen eines äußeren elektrischen Feldes nachweisen konnte (Stark, 1914). Die Aufspaltung oder Verschiebung von Spektrallinien bei Anlegen eines äußeren elektrischen Feldes erfolgt allerdings nicht nur bei elektronischen sondern auch bei Schwingungsübergängen, da sich sowohl die Energieniveaus der verschiedenen Schwingungszustände als auch die Übergangsdipole zwischen den Niveaus durch ein äußeres Feld ändern. Durch den Stark Effekt kann daher auch die spektrale Verschiebung der Absorptionsbande der C≡N Streckschwingung bei Anlegen eines äußeren elektrischen Feldes erklärt werden. Bei einer quantenmechanischen Betrachtungsweise führt die Interaktion des externen elektriG schen Feldes E mit der Ladungsverteilung des betrachteten Moleküls zu einem zusätzlichen Term im Hamilton-Operator Ĥ, mit dem die möglichen Energieniveaus des betrachteten physikalischen Systems bestimmt werden können. Der Term hat die Form G G Hˆ = μ * E G Hierbei ist Ĥ der zusätzliche Term des Hamiltonoperators, μ das elektrische Dipolmoment G und E der elektrische Feldvektor. Dieser zeitunabhängige Operator kann verwendet werden, um mit Hilfe der Störungstheorie die neuen Energieeigenwerte des Systems nach Anlegen des elektrischen Feldes zu bestimmen. Dadurch kann der so genannte lineare sowie quadratische Stark Effekt berechnet werden. Der lineare Stark Effekt kann nur bei Molekülen beobachtet werden, die ein permanentes Dipolmoment aufweisen. Bei Anlegen eines elektrischen Feldes ist die Energie des Dipols proportional zur angelegten Feldstärke. G G E = −μ * E Gl. 3.16 Zusätzlich zum permanenten Dipol wird bei allen Molekülen durch das äußere elektrische Feld ein elektrischer Dipol induziert, dessen Stärke von der Polarisierbarkeit α des Moleküls abhängt, die die Verschiebbarkeit von Ladungen innerhalb des Moleküls widerspiegelt. G G G μ (E) = α E Gl. 3.17 Die Energie des induzierten Dipols lässt sich durch Integration über den elektrischen Feldvektor berechnen: 64 3.5 Aromatische Nitrile als Infrarotsonden G E G G G 1 G E = − ∫ μ ( E ) dE = − α E 2 2 0 Gl. 3.18 Diese beiden zusätzlichen Energieterme haben die Verschiebung einer Absorptionsbande zur Folge, wenn sich das Dipolmoment oder die Polarisierbarkeit des Moleküls während des betrachteten Übergangs ändert. Die Frequenzverschiebung kann dann folgendermaßen berechnet werden: Δν = − G G G G 1 (Δμ * E + E * Δ a * E ) hc Gl. 3.19 Hierbei bezeichnet Δν die Frequenzverschiebung des Absorptionsmaximums des untersuchten Schwingungsmodes, h das Plancksche Wirkungsquantum, c die Lichtgeschwindigkeit, G Δμ die Änderung des Dipolmoments und Δ a die Änderung der Polarisierbarkeit zwischen dem Grundzustand und dem angeregten Zustand. Der erste Summand wird auch als linearer G Stark Effekt, der zweite als quadratischer Stark Effekt bezeichnet, da Δμ eine Frequenzverschiebung proportional zur angelegten Feldstärke, Δ a hingegen eine Frequenzverschiebung proportional zum Quadrat der Feldstärke bewirkt. Häufig ist die Veränderung der Polarisierbarkeit bei einem Schwingungsübergang sehr klein, so dass der zweite Term vernachlässigt werden kann (Brewer und Francen, 2003; Suydam und Boxer, 2003). Daher wird experimentell zumeist eine lineare Abhängigkeit der Frequenzverschiebung von der angelegten Feldstärke beobachtet, der Proportionalitätsfaktor wird häufig auch als Stark Tuning Rate bezeichnet. Im Wesentlichen gibt es zwei verschiedene Beiträge zum linearen Stark Effekt: Die erste Komponente wird durch die Anharmonizität des Oszillators, die zweite durch die Feldabhängigkeit der Kraftkonstanten aufgrund der elektronischen Polarisierbarkeit der betrachteten Bindung verursacht (Park und Boxer, 2002). Die Stark Tuning Rate kann als Summe dieser zwei Komponenten beschrieben werden: Δν = − G G 1 G G 1 Δμ * E = − (Δμ Anh. + Δμ Bind . ) hc hc Gl. 3.20 Um den Einfluss der Anharmonizität auf die Veränderung des Dipolmoments zwischen dem Grundzustand und den angeregten Zuständen zu verstehen, muss die Ladungsverteilung in den verschiedenen Zuständen betrachtet werden. Bei einem harmonischen Oszillator ist die mittlere Position des Oszillators im Grundzustand dieselbe wie in allen angeregten Zuständen. Daher ergibt sich bei einem Schwingungsübergang eines harmonischen Oszillators keine Ladungsverschiebung und somit keine Änderung des Dipolmoments. In der Realität sind chemi- 3.5 Aromatische Nitrile als Infrarotsonden 65 sche Bindungen allerdings anharmonische Oszillatoren, so dass sich die mittlere Position des Oszillators im Grundzustand von der in den angeregten Zuständen unterscheidet. Die Größe der Veränderung des Dipolmoments beim Übergang spiegelt in diesem Fall die Verschiebung der effektiven Ladung q um eine Distanz Δx wider, die durch die Anharmonizität des Oszillators verursacht wird. G Δμanh = q * Δx Gl. 3.21 Die Größe des Stark Effekts hängt somit zu einem großen Anteil von der Anharmonizität des betrachteten Oszillators ab, die durch die so genannte Anharmonizitätskontante xe quantifiziert werden kann (Park und Boxer, 2002). Aus dem Betrag des Übergangsdipolmoments G M der Schwingung, die sich durch die Intensität der Absorptionsbande ergibt, kann auch die effektive Ladung q berechnet werden: G 3ε 0 hc ln10 q M = ε (ν ) dν = 2 ∫ 2π N A ν 2π h 2cμν Gl. 3.22 Hierbei ist ε0 die elektrische Permittivität des Vakuums, h das Plancksche Wirkumsquantum, c die Lichtgeschwindigkeit, NA die Avogadrokonstante, ν die Wellenzahl des absorbierten Lichts, ε (ν ) der Extinktionskoeffizient und μ die reduzierte Masse. Aus der Höhe des Übergangsdipolmoments und der Anharmonizitätskonstanten xe kann der gesamte Beitrag der Bindungsanharmonizität für die Veränderung des Dipolmoments beim Übergang berechnet werden (Park und Boxer, 2002). G G Δμ anh = q* Δx = 3 M * xe Gl. 3.23 Die durch die Anharmonizität eines Oszillators bedingte Veränderung des Dipolmoments in den verschiedenen Schwingungszuständen und der daraus resultierende Einfluss eines äußeren elektrischen Feldes auf die Übergangsenergie des betrachteten Schwingungsübergangs wird noch einmal in Abbildung 3.9 veranschaulicht. 66 3.5 Aromatische Nitrile als Infrarotsonden Anharmonicity ( Δμ anh = q ⋅ Δx ) E No Field Field ΔE1 = −( μ 0 + qΔx ) ⋅F ΔE0 = − μ0 ⋅ F Δx x Abb. 3.9: Einfluss eines äußeren elektrischen Feldes auf die Übergangsenergie infolge der Verschiebung der effektiven Ladung um die Distanz Δx aufgrund der Anharmonizität des Oszillators. Der zweite Beitrag zum linearen Stark Effekt - die Beeinflussung der Kraftkonstante einer Bindung durch das äußere elektrische Feld - kann besonders leicht mit Hilfe der möglichen Resonanzstrukturen des untersuchten Moleküls verstanden werden, die in einem elektrischen Feld je nach Orientierung des Feldvektors entweder stabilisiert oder destabilisiert werden. Aufgrund der unterschiedlichen Relevanz der möglichen Resonanzstrukturen werden somit auch die Bindungslänge und damit die Kraftkonstante der betrachteten Bindung beeinflusst. Abbildung 3.10 verdeutlicht den Einfluss eines äußeren elektrischen Feldes auf die Kraftkonstante der C≡N Bindung der untersuchten Infrarotsonde 4-MBN. Field effect (Stark effect) C C N 1,16Å 1,26 Å HS E C N N HS δ+ δ− C N C N HS G F No field G F Field No field Field Field dependent Force constant (Δμbond) Abb. 3.10: Einfluss eines äußeren elektrischen Feldes auf die C≡N-Bindung bei Orientierung der C≡N Funktion parallel oder antiparallel zum angelegten Feld. Aufgrund der Veränderung der Kraftkonstante im elektrischen Feld verändert sich die Übergangsenergie. Die Abbildung verdeutlicht den Einfluss des äußeren elektrischen Feldes auf die Ladungsverteilung von 4-MBN. Ist die C≡N Bindung antiparallel zum elektrischen Feld orientiert, erfolgt 3.5 Aromatische Nitrile als Infrarotsonden 67 aufgrund des negativen mesomeren Effekts eine Ladungsumverteilung zum Stickstoff und die C≡N Bindung bekommt einen höheren Doppelbindungscharakter. Umgekehrt wird bei einer Orientierung der C≡N Bindung parallel zum elektrischen Feld die Delokalisation der Ladung verringert, so dass die Bindung kürzer und die Kraftkonstante erhöht wird. Durch die Veränderung der Bindungskonstante in Gegenwart des Feldes wird auch die Übergangsenergie zwischen den Schwingungszuständen beeinflusst. Auch dieser Beitrag zum linearen Stark Effekt kann quantifiziert werden: hν ν 2′ G Δμ Bind . = k2 Gl. 3.24 Hierbei ist h das Plancksche Wirkungsquantum, ν die Frequenz und k2 die Kraftkonstante der untersuchten Bindung. Der Term ν 2′ wird auch als „Dipol-Nichtlinearitätsfaktor“ bezeichnet und gibt die Sensitivität der Kraftkonstante für ein elektrisches Feld aufgrund des Einflusses des Feldes auf die Elektronenverteilung im Molekül an (Andrews und Boxer, 2002). 3.5.3 Aufspüren lokaler elektrostatischer Felder in Proteinen unter Ausnutzung des Stark Effekts Häufig erfolgen Messungen des Stark Effekts mit dem Ziel, verschiedene Parameter wie die Veränderung des Dipolmoments oder der Polarisierbarkeit sowie die Veränderung der Kraftkonstante der untersuchten Bindung durch Anlegen eines definierten äußeren Feldes quantitativ zu bestimmen. Innerhalb eines Proteins sind die elektrischen Felder an den verschiedenen Positionen des Proteins, an die die Infrarotsonde eingebracht wurde, zunächst unbekannt und sollen unter Ausnutzung des Stark Effekts detektiert werden. Um mit Hilfe des Stark Effekts in Proteinen Veränderungen dieser lokalen elektrostatischen Felder zu messen und quantitative Informationen über Veränderungen der Feldstärken zu erhalten, muss die Sensitivität der Schwingungsfrequenz der verwendeten Sonde zunächst kalibriert werden. In der Arbeitsgruppe von Steven G. Boxer wurden zu diesem Zweck Schwingungsspektren einer Reihe verschiedener Nitrilverbindungen unter dem Einfluss eines definierten äußeren elektrostatischen Feldes gemessen, das an die gefrorene, die Proben enthaltende Glasküvette angelegt wurde, (Suydam und Boxer, 2003). Die Veränderung der Absorption ΔA durch das elektrische Feld kann durch Subtraktion der unter Einfluss des Feldes aufgenommenen Spektren von den Spektren, die ohne ein angelegtes Feld gemessen wurden, erhalten werden. Die erhaltenen Differenzspektren (Stark-Spektren) können als Summe der verschiedenen Ableitungen des Absorptionsspektrums nach der Wellenzahl beschrieben werden (Bublitz und Boxer, 1997). 68 3.5 Aromatische Nitrile als Infrarotsonden Die zweite Ableitung des Absorptionsspektrums mit dem Koeffizienten Cχ ist dabei eine G Funktion des Betrags des Differenzdipolmoments Δμ , des experimentellen Winkels χ zwischen der Richtung der Polarisation des Lichtes und dem Feldvektor sowie dem Winkel ξ G G zwischen dem Differenzdipolmoment Δμ und der Richtung des Übergangsdipolmoments M . G Cχ = Δμ * ⎣⎡5 + ( 3 cos 2 χ − 1 )* ( 3 cos 2 ξ − 1 )⎦⎤ Gl. 3.25 G Bei Nitrilverbindungen ist das Differenzdipolmoment Δμ genauso wie das Übergangsdipolmoment parallel zur Achse der C≡N Bindung orientiert, so dass sich für ξ ein Winkel von 0° G ergibt (Boxer, 2009). Aus den übrigen Größen kann dann Δμ berechnet werden. Die erhaltenen Werte für den Betrag der Dipolmomentänderung können auch als Stark Tuning Raten ausgedrückt werden, die die Wellenzahlverschiebung pro Einheit des angelegten Feldes widerspiegeln. Das experimentelle Vorgehen bei der Bestimmung der Stark Tuning Raten ist ausführlich in der Veröffentlichung von Bublitz und Boxer beschrieben (Bublitz und Boxer, 1997). In Tabelle 3.3 sind die experimentell bestimmten Stark Tuning Raten einiger Nitrilsowie Azidoverbindungen aufgeführt, die als Infrarotsonden in Frage kommen. Tabelle 3.3: Spektroskopische Daten für Nitril- und Azidoverbindungen gelöst in Methyltetrahydrofuran. Aufgeführt sind das Absorptionsmaximum, die Halbwertsbreite (fwhm), der Extixtionskoeffizient G (εmax) sowie die Stark Tuning Rate Δμ der jeweiligen Verbindung. Absorptionsmaximum [cm-1] fwhm [cm-1] εmax [M-1cm-1] G Δμ [cm-1/(MV/cm)] 4,4´-Dithiobis(benzonitril) 2227,9 6,1 420 0,74 p-Toluidin 2227,2 6,5 300 0,71 5-Cyanindol 2217,3 7,5 450 0,86 Dicyanomethylen Polyen 2205,8 9,3 470 2,9 2202,1 7,4 1900 1,4 p-Azidophenylalanin 2124,5 40 680 (0) Phenethylazid 2099.6 26,8 1300 Verbindung Nitrilverbindungen Azido-Verbindungen (0) aus [Suydam und Boxer, 2003] Die Verbindung 4,4´-Dithiobis(benzonitril) dient hierbei als Modellverbindung für ein aromatisches Nitril, welches über eine Disulfidbindung an das Protein gebunden ist. Die Verbindung weist sowohl ein vergleichsweise hohes Absorptionsmaximum als auch eine relativ hohe Stark Tuning Rate auf. Der erhaltene Wert ist eine intrinsische Eigenschaft des betrachteten Oszillators. Durch Analyse der spektralen Verschiebung können mit Hilfe der kalibrierten Sonde daher auch inner- 3.5 Aromatische Nitrile als Infrarotsonden 69 halb eines Proteins Informationen über Größe und Richtung von lokalen elektrostatischen Feldern gewonnen werden. Dabei können allerdings keine Absolutwerte der elektrischen Feldstärke gemessen werden, sondern nur Änderungen des Feldes festgestellt werden, nachdem eine Störung, wie z.B. eine Aminosäure-Mutation in das Protein eingeführt wurde (Webb und Boxer, 2008). Elektrostatische Berechnungen haben ergeben, dass sich bei diesen Veränderungen die elektrische Feldstärke in Proteinen um bis zu 30 MV/cm ändert (Nicholls et al., 1991), so dass sich bei einer Stark Tuning Rate von 0,74 cm-1/(MV/cm) eine signifikante Verschiebung des Absorptionsmaximums ergeben sollte. Die Frequenzverschiebung hängt allerdings nicht nur von der Stärke sondern auch von der Richtung des elektrischen Feldvektors ab. G ΔE = −hc Δν Messung G ΔμCN * cos θ Gl. 3.26 G Hierbei ist θ der Winkel zwischen dem Differenzdipolmoment Δμ und der Veränderung des G elektrischen Feldvektors ΔE . Um quantitative Aussagen über die Größe und Richtung eines lokalen elektrostatischen Feldes treffen zu können, das die Frequenz der C≡N Streckschwingung der IR-Sonde beeinflusst, ist es notwendig, ein eindeutiges Koordinatensystem zu definieren, dass die Richtungen der verschiedenen Vektoren festlegt. Eine Koordinatenachse wird hier analog zu Webb und Boxer so definiert, dass sie vom Kohlenstoff- zum Stickstoffatom der Nitrilfunktion zeigt (Webb und Boxer, 2008). In diesem Koordinatensystem ist die DiG polmomentsänderung negativ, da Δμ von der partiell positiven Ladung des Kohlenstoffatoms zur partiell negativen Ladung des Stickstoffatoms zeigt. Dieser Konvention folgend kann eine Verschiebung des Absorptionsmaximums der C≡N Streckschwingung um 0,74 cm-1 als ein Anstieg der elektrischen Feldstärke um 1MV/cm in positiver Richtung der Koordinatenachse aufgefasst werden. Die Position der Nitrilfunktion innerhalb der verschiedenen gelabelten NpSRII-Mutanten wurde durch Modellierung der Sonde in die Kristallstruktur des Rezeptors erhalten. 70 3.5 Aromatische Nitrile als Infrarotsonden 3.5.4 Wechselwirkungen von 4-MBN mit Lösungsmittelmolekülen Wie bereits erwähnt wird die Frequenz der C≡N Streckschwingung nicht nur durch lokale elektrostatische Felder sondern auch durch direkte Wechselwirkungen mit anderen funktionellen Gruppen beeinflusst. Insbesondere Wechselwirkungen mit dem umgebenden Lösungsmittel haben eine deutliche Verschiebung der Absorptionsbande der C≡N Streckschwingung zur Folge (Nyquist, 1990; Fawcett et al., 1993). Durch die Bildung einer Wasserstoffbrückenbindung wird die C≡N Bindung kürzer, während bei anderen funktionellen Gruppen in der Regel eine Verlängerung der jeweiligen Bindung infolge einer Wasserstoffbrückenbindung zu beobachten ist (Cho und Cheong, 2000). Die Verkürzung der Bindung wird mit der Verringerung des antibindenden Charakters der C≡N Bindung aufgrund der Abgabe von Ladungsträgern an den Wasserstoffbrückenakzeptor begründet: Das freie antibindende Elektronenpaar des Stickstoffs wandert in Richtung des Wasserstoffbrückendonors, so dass sich die Elektronendichte am Stickstoffatom verringert und die Bindungskonstante der C≡N Bindung erhöht (Cho et al., 1998). Abbildung 3.11 veranschaulicht die beschriebenen Zusammenhänge am Beispiel von 4-MBN, das mit einem Alkoholmolekül wasserstoffverbrückt ist. Solvent effect ON N R HS a) C N ΔE1 O H R ΔE2 HS C N H O R Abb. 3.11: a) Einfluss einer Wasserstoffbrückenbindung der Nitrilfunktion von 4-MBN mit einem Alkoholmolekül auf die Energiedifferenz des Schwingungsübergangs der C≡N Streckschwingung. b) Veränderung der Elektronendichteverteilung am Stickstoffatom von Acetonitril durch eine Wasserstoffbrückenbindung mit Methanol (nach Cho et al., 1998). 3.5 Aromatische Nitrile als Infrarotsonden 71 Die Sensitivität der Frequenz der C≡N Streckschwingung für das Lösungsmittel macht die Nitrilfunktion dafür geeignet als Umgebungssonde die Lösungsmittelzugänglichkeit einzelner Seitenketten im Protein sowie Veränderungen der Lösungsmittelzugänglichkeit infolge von Konformationsänderungen zu detektieren. Diese Eigenschaft wurde bereits bei der Untersuchung von Konformationsänderungen eines Peptids der Myosin Light Chain Kinase bei Bindung an Calmodulin ausgenutzt (Getahun et al., 2003). Auf der anderen Seite wird durch den Einfluss der Lösungsmittelzugänglichkeit auf die Frequenz der C≡N Streckschwingung eine quantitative Analyse des Einflusses lokaler elektrostatischer Felder auf die Frequenz der C≡N Streckschwingung erschwert, da sich beide Effekte im Protein überlagern können. Bei den bisherigen Studien, bei denen eine aromatische Nitrilverbindung in ein Protein eingebracht wurde, um Veränderungen lokaler elektrostatischer Felder zu detektieren, wurde der Einfluss von Wasserstoffbrückenbindungen auf die C≡N Streckschwingung allerdings nicht berücksichtigt. Bei diesen Studien wurden allerdings ausschließlich Veränderungen elektrostatischer Felder infolge von Punktmutationen in der Nähe des aktiven Zentrums von Proteinen untersucht, bei denen keine Veränderung der Lösungsmittelzugänglichkeit der IR-Sonde zu erwarten ist, aber nicht völlig ausgeschlossen werden kann (Suydam et al., 2006). Im Rahmen dieser Doktorarbeit sollten mit Hilfe der IR-Sonde auch Konformationsänderungen während des Photozyklus von NpSRII untersucht werden, durch die auch eine veränderte Lösungsmittelzugänglichkeit der IR-Sonde zu erwarten ist. Um den Einfluss von Wasserstoffbrückenbindungen auf die Frequenz der C≡N Streckschwingung von 4-MBN zu untersuchen, wurden zunächst Absorptionsspektren von 4-MBN gelöst in verschiedenen Methanol/Tetrahydrofuran(THF)-Gemischen mit einem unterschiedlichen Anteil von Methanol im Lösungsmittelgemisch gemessen (siehe Kapitel 4.3). Um hohe Intensitäten der C≡N Bande zu erhalten, wurden diese Messungen in Mikroküvetten durchgeführt, die eine variable Schichtdicke ermöglichen (siehe Kapitel 3.6). Die Messungen wurden zudem mit verschiedenen Alkohol/THF-Gemischen wiederholt, um den Einfluss des Lewissäurecharakters des Alkohols auf die Frequenz der C≡N Streckschwingung zu untersuchen. Aufgrund der niedrigen Dielektrizitätskonstante von THF kann eine reine THF-Lösung dafür verwendet werden, um das hydrophobe Innere eines Proteins zu simulieren (Getahun et al., 2003). Durch Messung von Absorptionsspektren von 4-MBN in verschiedenen aprotischen Lösungsmitteln wurde anschließend der Einfluss der Dielektrizitätskonstante des Lösungsmittels auf die C≡N Streckschwingung untersucht. 72 3.5 Aromatische Nitrile als Infrarotsonden Um genauer zu untersuchen, wie die Frequenz der C≡N Streckschwingung durch die Proteinumgebung sowie das Lösungsmittel beeinflusst wird, wurde der Photorezeptor NpSRII sowie der Transducer an verschiedenen Positionen mit 4-MBN markiert. Die Bindung des Labels erfolgte durch Kopplung der freien Thiolfunktion von 4-MBN an Cystein Seitenketten von Mutanten des Rezeptors sowie des Transducers (siehe Kapitel 3.6.2). Der Wildtyprezeptor enthält dagegen keine Cysteine, an die die Bindung des Labels erfolgen könnte. Abbildung 3.12 zeigt exemplarisch die Bindung des Labels an die F210C-Mutante des Rezeptors durch Bildung einer Disulfidbindung. A212 Helix F L90 Retinal L213 A212 HtrII Helix F L213 Helix C SRII Helix G 4-MBN F210C I211 Y160 K157 L159 S158 F210C S153 I211 4-MBN SS-Brücke Helix G TM2 TM 2 TM 1 Abb. 3.12: Kopplung der IR-Sonde 4-MBN mittels Disulfidbrückenbindung an die F210CNpSRII/NpHtrII-Mutante. Ebenfalls hervorgehoben sind weitere Seitenketten der Helices C, F und G des Rezeptors, die auf äquivalente Weise mit 4-MBN gelabelt wurden. Die Helices F und G des Rezeptors sind insbesondere deshalb von Interesse, weil sie in Kontakt mit der Transmembranhelix 2 des Transducers stehen und die Signalweiterleitung an den Transducer vermutlich über strukturelle Änderungen dieser Helices vermittelt werden (siehe Kapitel 1.8). Sowohl auf Helix F als auch auf Helix G wurden jeweils 4 aufeinander folgende Positionen mit 4-MBN gelabelt, so dass das IR-Label vermutlich bei jeder der 4 Mutanten eine unterschiedliche Position relativ zur Helixachse einnimmt. Daher ist auch eine unterschiedlich Lösungsmittelzugänglichkeit bei den verschiedenen gelabelten Mutanten zu erwarten. Es ist allerdings nicht möglich, aus der Position der jeweiligen Seitenkette in der Kristallstruktur, genaue Rückschlüsse auf die Lage der Sonde im gelabelten Komplex zu ziehen. Durch die frei drehbaren Bindungen des Labels sowie der Disulfidbrücke sind viele Orientierungen der Sonde im Protein möglich. Einen Hinweis auf die Umgebung der Sonde im Protein kann allerdings anhand früherer EPRMessungen gewonnen werden, bei denen dieselben Seitenketten der Helices F und G ebenfalls durch Cysteine ersetzt und mit EPR-Spin Labeln markiert wurden (Wegener et al., 2000). Die Kollisionshäufigkeit des EPR-Spin-Labels mit frei diffundierbaren Quen- 3.5 Aromatische Nitrile als Infrarotsonden 73 chermolekülen hängt vom Diffusionskoeffizient und der lokalen Konzentration des Quenchers ab (Altenbach et al., 1990). Die Kollisionshäufigkeit von molekularem Sauerstoff mit dem Spin-Label ist daher im Proteininneren gering, in der Lipidphase dagegen hoch. Kollisionen mit dem wasserlöslichen Chrom(II)-oxalat (CrOx) sind dagegen häufiger zu erwarten, wenn das Spin-Label in die Wasserphase reicht. Ist dagegen die Kollisionshäufigkeit sowohl mit CrOx als auch mit molekularem Sauerstoff niedrig, so befindet sich das Label im Proteininneren. Anhand dieser Daten können folglich Rückschlüsse auf die Orientierung der SpinLabel gewonnen werden (Pfeiffer et al., 1999). Abbildung 3.13 zeigt das Zugänglichkeitsdiagramm der EPR-Spin-Label für molekularen Sauerstoff sowie CrOx an den verschiedenen Positionen von NpSRII. lipid F210R1sol A212R1 Πoxygen 1 K157R1 A212R1sol L213R1 Y160R1 protein protei S158R1 F210R1 I211R1 I211R 1 aqua L159R1 0,1 0,01 Abb. 3.13: 0,1 ΠCrOx 1 Zugänglichkeitsdiagramm der mit EPR-Spin-Labeln markierten Seitenketten der Helices F und G für paramagnetische Quencher (nach Wegener et al., 2000). Da die EPR-Spin Label ebenfalls über Disulfidbrücken an die jeweiligen Cystein-Mutanten von NpSRII gebunden wurden, und die Größe des Moleküls mit 4-MBN vergleichbar ist, sind aus dem Zugänglichkeitsdiagramm auch Schlussfolgerungen auf die Umgebung des IRLabels möglich. Um den Einfluss der Proteinumgebung auf die Frequenz der C≡N Streckschwingung zu untersuchen, wurden zunächst Absorptionsspektren der verschiedenen mit 4MBN gelabelten Cysteinmutanten gemessen und hinsichtlich einer möglichen Korrelation des Absorptionsmaximums der C≡N Streckschwingung mit den Zugänglichkeitsdaten der EPRSpin Label analysiert (siehe Kapitel 4.3). Durch die Bindung des Transducers an den Rezeptor wurde anschließend eine Veränderung der Lösungsmittelzugänglichkeit der IR-Sonde bei einigen Mutanten verursacht und die Auswirkung der Transducerbindung auf die Frequenz der C≡N Streckschwingung von 4-MBN untersucht. 74 3.5 Aromatische Nitrile als Infrarotsonden Im nächsten Schritt wurden Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren der verschiedenen gelabelten NpSRII- sowie NpHtrII-Mutanten gemessen, um mit Hilfe der IRSonde positionsspezifisch strukturelle sowie elektrostatische Veränderung während des Photozyklus von NpSRII zu detektieren (siehe Kapitel 4.3). Um den Einfluss der protonierten Schiff Base sowie des Gegenions Asp75 auf die Frequenz der C≡N Streckschwingung von 4-MBN an den verschiedenen Positionen zu untersuchen, wurden Absorptions- sowie Differenzspektren einiger Doppelmutanten gemessen, bei denen zusätzlich zur gelabelten Position das Gegenion durch ein ungeladenes Asparagin ersetzt wurde. Auf diese Weise konnten die Auswirkungen eines lokalen elektrostatischen Feldes auf die Frequenz der C≡N Streckschwingung quantifiziert werden (siehe Kapitel 4.4). 3.6 Herstellung der gelabelten NpSRII- und NpHtrII-Mutanten 3.6.1 Expression der NpSRII- und NpHtrII-Mutanten Die Expression der in dieser Arbeit verwendeten NpSRII-Mutanten erfolgte im molekularbiologischen Labor von Prof. Martin Engelhard am Max-Planck Institut für molekulare Physiologie in Dortmund. Während eines Aufenthalts in Dortmund wurden die NpSRII-Mutanten L90C-NpSRII, S153C-NpSRII, K157C-NpSRII, L159C-NpSRII, Y160C-NpSRII, F210CNpSRII, I211C-NpSRII, A212C-NpSRII sowie L213C-NpSRII ebenso wie die NpHtrIIMutanten V78C-NpHtrII, S91C-NpHtrII, G101C-NpHtrII und D115C-NpHtrII eigenhändig exprimiert und aufgereinigt. Die Expression der NpSRII- sowie NpHtrII-Mutanten erfolgte in E.coli BL21 (DE3) Zellen analog einem von Shimono et al. beschriebenen Verfahren (Shimono et al., 1997). Hierzu wurden die transformierten E.coli BL21 (DE3) Zellen zunächst in LB-Medium bestehend aus 5g/l Hefeextrakt, 10 g/l Trypton(140)-Hydrolysat und 10 g/l NaCl sowie 50 mg/l Kanamycin zur Selektion des Bakterienstamms bei 37°C aufgezogen. Die Zellvermehrung wurde durch Messung der optischen Dichte (OD) bei 578 nm verfolgt (1 OD578 ≈ 2x108 Zellen/ml). Nachdem die Zellkultur bis zur mittleren logarithmischen Wachstumsphase (OD578 von 0,8 – 1,0) gewachsen ist, wurde die Überexpression der Proteine durch Zugabe von 1 mM Isopropyl-ß-d-Thiogalactopyranosid (IPTG) gestartet. Gleichzeitig wurde bei den NpSRII-Mutanten 50 μl 10 μM all-trans Retinal-Lösung zugegeben. Zwei Stunden nach Beginn der Überexpression wurden die Zellen durch Zentrifugation (5000 rpm, 15 min, 4°C) geerntet und in einem Puffer bestehend aus 150 mM NaCl, 25 mM 3.6 Herstellung der gelabelten NpSRII- und NpHtrII-Mutanten 75 Na2HPO4/KH2PO4 (pH 8.0) und 2 mM EDTA gewaschen, dem ein Protease Inhibitor (Firma Roche, Basel) zugegeben wurde. Auf ähnliche Weise wurden auch die isotopenmarkierten Proben exprimiert. Zur Expression der uniform isotopenmarkierten Proben wurden die transformierten E.coli BL21 (DE3) Zellen in Standard Minimalmedium (M9-Medium) mit 15 NH4Cl als einziger Stickstoffquelle und 13 [ C]-D-Glukose als Kohlenstoffquelle exprimiert. Das M9 Medium besteht aus Thiamin–HCl (0.2 mM), Thymin (0.5 mM), Glucose (20 mM), MgSO4 (2 mM), CaCl2 (0.2 mM), Na2HPO4 (48 mM), KH2PO4 (22 mM), NaCl (12 mM), NH4Cl (25 mM) und die entsprechenden Antibiotika (pH = 8). Die gruppenspezifische Isotopenmarkierung wurde ebenfalls mit Hilfe eines M9-Medium durchgeführt, zu dem [15N]-Lysin hinzugefügt wurde. Die isotopenmarkierten Proben wurden von Swetlana Martell und Nadine Mennes am Max-Planck Institut für molekulare Physiologie in Dortmund hergestellt. 3.6.2 Aufreinigung der NpSRII- und NpHtrII-Mutanten Für die Aufreinigung der Membranproteine wurden folgende Puffer verwendet, denen allen das Detergenz Dodecyl-maltosid (DDM) zugesetzt wurde. Dieses Detergenz bildet Mizellen in die sich die Membranproteine einlagern können und so löslich werden. Tabelle 3.4: Verwendete Pufferlösungen für die Aufreinigung der NpSRII- und NpHtrII-Mutanten Bezeichnung Komponenten Amem 300 m M NaCl, 50 mM Na2HPO4/KH2PO4, pH = 8,0, 2 % DDM (w/v) Bmem 300 mM NaCl, 50 mM Na2HPO4/KH2PO4, pH = 8,0, 0,05 % DDM (w/v) Cmem 300 mM NaCl, 50 mM Na2HPO4/KH2PO4, pH = 8,0, 0,05 % DDM (w/v) + 30 mM Imidazol Dmem 300 mM NaCl, 50 mM Na2HPO4/KH2PO4, pH = 8,0, 0,05 % DDM (w/v) + 200 mM Imidazol Emem 500 mM NaCl, 10 mM Tris, pH = 8,0, 0,1 % DDM (w/v) Der Zellaufschluss erfolgte mit Hilfe eines Mikrofluidizers (Microfluidics Corporation, Newton, MA). Die Zellmembranen wurden anschließend durch Zentrifugation (45000 rpm, 1,5 h, 40 C) sedimentiert und anschließend in 3-4 ml Puffer Amem pro Gramm Zellpellet homogenisiert und zur Solubilisierung mit Puffer Amem für 12h bei 40 C geschwenkt. Die solubilisierten Zellmembranen wurden anschließend erneut zentrifugiert (45000 rpm, 90 min, 4°C). Der Überstand wurde schließlich zusammen mit Ni-NTA Agarose (Quiagen, Hilden) für 1 h bei 8°C unter Lichtausschluss gerührt. Das mit der jeweiligen NpSRII-Mutante beladene Säulenmaterial wurde anschließend in eine Chromatographiesäule gefüllt und mit drei Säulen- 76 3.6 Herstellung der gelabelten NpSRII- und NpHtrII-Mutanten volumina Puffer Bmem gewaschen. Unspezifisch gebundene Proteine wurden durch Waschen mit 10 Säulenvolumina Puffer Cmem eluiert, der zusätzlich zu den Bestandteilen von Puffer Bmem 30 mM Imidazol enthält. Die gereinigten NpSRI-Mutanten wurden anschließend durch Zugabe von Puffer Dmem von der Säule eluiert. Das überschüssige Imidazol wurde durch Dialyse gegen einen 100 fachen Volumenüberschuss Puffer Emem entfernt. 3.6.3 Labeln der NpSRII- sowie NpHtrII-Mutanten mit 4-Mercaptobenzonitril (4-MBN) Die Infrarotsonde 4-Mercaptobenzonitril (4-MBN) wurde im nächsten Schritt kovalent an die Cystein-Seitenketten der NpSRII- sowie NpHtrII-Mutanten gebunden. Hierzu wurde ein 100facher molarer Überschuss des IR-Labels (gelöst in 100 μl Dimethylsulfonoxid (DMSO)) zu dem in 3 ml Puffer Emem gelösten Protein gegeben. Die Proben wurden anschließend für 24 Stunden bei 40 C geschwenkt. Anschließend wurden die Proben bei 50000 rpm zentrifugiert. Der resultierende Überstand wurde abgetrennt, gegebenenfalls ankonzentriert und auf PD10 Entsalzungssäulen der Firma GE Healthcare (München) aufgetragen und so überschüssiges FTIR-Label abgetrennt. Die im Puffer Emem gelösten Proteine wurden anschließend in Purpurmembran-Lipiden rekonstituiert. 3.6.4 Rekonstitution in Purpurmembran-Lipide von Halobacterium salinarium Für die Rekonstitution der NpSRII-Mutanten in native Purpurmembran-Lipide (PML) von Halobacterium salinarium wurden die in Puffer G gelösten Proteine zusammen mit einem 20fachen molaren Überschuss der Lipide und Detergentien-absorbierenden Biobeads (SM2, 10 mg/mg Dodecyl-Maltosid (DDM), Böhringer-Mannheim) für 1 h bei 4°C unter Lichtausschluss inkubiert, um vorhandenes DDM an die Biobeads zu binden. Zur Herstellung der NpSRII/NpHtrII-Komplexe wurden die unabhängig voneinander präparierten Proteine in einem molaren Verhältnis von 1:1 gemischt und analog zu den NpSRII-Mutanten durch Zugabe eines 20-fachen molaren Überschusses der PM-Lipide und Biobeads sowie einstündiger Inkubartionszeit rekonstituiert. Nach Filtrierung der Suspension wurden die rekonstituierten Proteine durch Zentrifugation pelletiert, der Rückstand mit Phosphat gepufferter Salzlösung dreimal gewaschen und in MilliQ Wasser resuspendiert, so dass eine Proteinkonzentration von mehr als 2 mg/ml erhalten wurde. In Tabelle 3.5 sind alle mit 4-MBN gelabelten NpSRIIsowie NpSRII/NpHtrII-Mutanten aufgeführt, die nach diesem Protokoll exprimiert, aufgereinigt, mit 4-MBN gelabelt und in PM-Lipiden rekonstituiert wurden. 3.6 Herstellung der gelabelten NpSRII- und NpHtrII-Mutanten 77 Tabelle 3.5: Cysteinmutanten von NpSRII sowie NpHtrII, die für infrarotspektroskopische Messungen exprimiert und aufgereinigt, mit 4-MBN gelabelt und in PM-Lipiden von H. salinarium rekonstituiert wurden. Rezeptor Komplex L90C-4MBN_NpSRII S153C-4MBN_NpSRII K157C-4MBN_NpSRII K157C-4MBN_NpSRII/NpHtrII S158C-4MBN_NpSRII S158C-4MBN_NpSRII/NpHtrII L159C-4MBN_NpSRII L159C-4MBN_NpSRII/NpHtrII Y160C-4MBN_NpSRII F210C-4MBN_NpSRII I211C-4MBN_NpSRII I211C-4MBN_NpSRII/NpHtrII A212C-4MBN_NpSRII L213C-4MBN_NpSRII L213C-4MBN_NpSRII/NpHtrII NpSRII/V78C-4MBN_NpHtrII NpSRII/S91C-4MBN_NpHtrII NpSRII/G101C-4MBN_NpHtrII NpSRII/D115C-4MBN_NpHtrII Neben diesen gelabelten Einfachmutanten von NpSRII sowie NpHtrII wurden in dieser Arbeit auch mit 4-MBN gelabelte Doppelmutanten vermessen, bei denen zusätzlich zur Cysteinmutation auch das Gegenion Asp75 durch die ungeladen Aminosäure Asparagin (Asn) ausgetauscht wurde, um anschließend die Auswirkungen der dadurch erfolgten Ladungsverschiebung im Protein auf die C≡N Streckschwingung der Infrarotsonde zu untersuchen. In Tabelle 3.6 sind aller gelabelten Doppelmutanten aufgeführt, die zu diesem Zweck FTIR-spektroskopisch untersucht wurden. Tabelle 3.6: Mit 4-MBN gelabelte Doppelmutanten, die im Rahmen dieser Arbeit FTIR-spektroskopisch untersucht wurden. Rezeptor Komplex D75N, L89C-4MBN_NpSRII D75N, S158C-4MBN_NpSRII D75N, L159C-4MBN_NpSRII D75N, L159C-4MBN_NpSRII/NpHtrII D75N, 213C-4MBN_NpSRII Die Proben der Doppelmutanten wurden von Jörg Sauermann aus der Arbeitsgruppe von Prof. Martin Engelhard am Max-Planck-Institut für molekulare Physiologie in Dortmund hergestellt. 78 3.7 Herstellung der Infrarotproben 3.7 Herstellung der Infrarotproben Zur Herstellung der Infrarotproben wird eine Suspension der in PM-Lipiden rekonstituierten NpSRII-Moleküle auf ein Sandwich-Küvetten-Fenster aus Calciumfluorid (CaF2) aufgetragen und unter einem schwachen Stickstoffstrom getrocknet. Eine Vertiefung von etwa 3-7 μm in der Mitte des Fensters definiert die Schichtdicke der Probe. Für die durchgeführten Messungen wurde ein Bis-Tris-Propan Puffer (BTP) bestehend aus 200 mM BTP und 150 mM NaCl verwendet, der auf einen pH-Wert von 8 eingestellt wurde. Auf den getrockneten Proteinfilm werden anschließend 20 μl Puffer aufgetragen und nach einer Equilibrierungszeit von etwa 1 Minute ein planares Deckfenster aufgesetzt. Durch das Aufsetzen des Deckfensters wird ein großer Teil des Puffers nach außen gedrückt. Eine kreisförmige Rille, die das Pufferreservoir umrandet, nimmt einen Teil dieses überschüssigen Puffers auf. Die Sandwich-Probe wird anschließend zusammen mit einer Blende von 0,5 cm Durchmesser in einen speziellen Probenhalter eingesetzt, der in der Probenkammer des Spektrometers eingeschraubt werden kann. Bei einigen der durchgeführten Messungen war eine größere Schichtdicke erforderlich als dies die zur Verfügung stehenden Sandwich-Fenster ermöglichen. Zur Messung von Absorptionsspektren der in verschiedenen organischen Lösungsmitteln gelösten Infrarotsonde 4MBN wurden so genannte Mikroküvetten verwendet. Diese bestehen aus zwei planaren CaF2Fenstern, die durch einen ringförmigen Abstandhalter getrennt werden. Zwei kleine Löcher in einem der beiden Fenster ermöglichen das Einspritzen der Probe in das Innere der Küvette. Nach dem Befüllen können die Löcher durch spezielle Stopfen abgedichtet werden. Damit auch zwischen den beiden Fenstern keine Probe austreten kann, muss die Küvette in einen speziell dafür angefertigten Probenhalter eingesetzt und fest verschraubt werden. Die Schichtdicke der Probe kann je nach verwendetem Abstandhalter beliebig variiert werden und betrug bei den durchgeführten Messungen 20 μm. Eine schematische Darstellung der beiden verwendeten Systeme zeigt Abbildung 3.14. solvent CaF2 - window CaF2 solvent a) CaF2 IR-beam 3 – 7 μm Distanzring 20μm buffer protein film b) CaF2 IR-beam Abb. 3.14: a) Mikroküvette bestehend aus zwei CaF2-Fenstern, die durch einen Abstandshalter getrennt sind. Die Probe wird durch zwei verschließbare Bohrungen eingeführt b) Sandwich Küvette für aufgetrocknete Protein Proben. Über ein Pufferreservoir wird die Hydratisierung des Proteinfilms bewirkt. 3.8 Messapparaturen 79 3.8 Messapparatur 3.8.1 Steady-State Messungen Die Messungen wurden ausschließlich an einem IFS 28 Spektrometer der Firma Bruker (Ettlingen) durchgeführt. Das Spektrometer ist mit einem Globar als Infrarotquelle und zwei Detektoren ausgestattet. Der pyroelektrische DTGS-Detektor (Deuteriertes Triglycinsulfat) zeichnet sich durch eine hohe Linearität unabhängig von der Wellenzahl aus, so dass er für die Messung der Einkanalspektren im Spektralbereich von 5000 cm-1 bis 500 cm-1 zur Bestimmung des Wassergehalts der Proben eingesetzt wurde. Die Einkanalspektren zur Berechnung der Absorptions- sowie Differenzspektren wurden mit einem MCT-Detektor (mercury cadmium telluride), der gegenüber dem DTGS-Detektor eine höhere Empfindlichkeit besitzt, und einer automatischen Nichtlinearitätskorrektur durchgeführt. Vor der eigentlichen Messung wurde die Temperatur der Proben durch eine thermostatisierbare Durchlaufkühlung oder ein Peltierelement reguliert. Zur Vermeidung von Wasserdampf-Schwingungs- und Rotationsbanden wurde die Probenkammer mit trockener Luft gespült. Für die Messung eines Einkanalspektrums wurde jeweils über 512 Scans gemittelt. Jeder Scan umfasst eine vollständige Vorwärts- sowie Rückwärtsbewegung des beweglichen Spiegels, während der die Aufzeichnung der Interferogramme erfolgt. Sowohl für jede Vorwärts- als auch jede Rückwärtsbewegung wurde ein vollständiges beidseitiges Interferogramm erhalten. Die spektrale Auflösung beträgt bei allen gemessenen Einkanalspektren 4 cm-1. Zur Berechnung eines Differenzspektrums wurden zunächst zwei Einkanalspektren des Dunkelzustands gemessen, anschließend wurde die Probe belichtet und während der Belichtungszeit von einer Minute erneut ein Einkanalspektrum gemessen. Die Belichtung der Probe erfolgte durch einen Diaprojektor mit einer Halogenlampe von 150 Watt Leistung als Lichtquelle (Leica Camera AG, Solms). Mit Hilfe von optischen Farbglasfiltern (Schott AG, Mainz) wurde der zur Anregung der Probe geeignete Spektralbereich ausgewählt. Bei den durchgeführten steady-state Messungen wurde ein Tiefpassfilter verwendet, der ausschließlich Licht mit größeren Wellenlängen als 475 nm durchlässt. Das gefilterte Licht wurde mittels eines Flüssigkeitslichtleiters in die Probenkammer des Spektrometers eingeleitet und über einen Germaniumspiegel auf die Probe gelenkt. Aus den beiden Einkanalspektren des Dunkelzustands wurde zur Kontrolle durch Differenzbildung eine Basislinie berechnet, die bei zeitlich stabilen Messbedingungen eine möglichst geringe Abweichung von der Nulllinie ergeben sollte. Aus dem während der Belichtung auf- 80 3.8 Messapparaturen genommenen Einkanalspektrum sowie dem unmittelbar vor der Belichtung aufgenommenen Einkanalspektrum wurde gemäß Gleichung 3.27 ein Differenzspektrum berechnet. Δ A(ν ) = − log S(ν )Photoprodukt Gl.3.27 S(ν )Dunkelzus tan d Nach Ende der Belichtung und einer Wartezeit von zwei Minuten wurde mittels eines automatisierten Programms der Messzyklus mehrmals wiederholt und die erhaltenen Differenzspektren zu einem Durchschnittsspektrum gemittelt. Bei der Messung der Photointermediatminus-Dunkelzustand Differenzspektren von den mit der Infrarotsonde 4-MBN gelabelten NpSRII-Mutanten wurden 40 Differenzspektren gemittelt, um das Signal-Rausch Verhältnis zu erhöhen. 3.8.2 Tieftemperaturmessungen Durch das Kühlen der Probe wird erreicht, dass der Photozyklus von NpSRII nicht vollständig sondern nur bis zu einem bestimmten Intermediat durchlaufen wird. Aufgrund der niedrigen Temperatur besitzt das System nicht ausreichend thermische Energie, um die Aktivierungsenergie Probenstab N-Einfüllstutzen Auspuff zum Erreichen des nächsten Intermediats zu überwinden. Um den Photozyklus nach der Belichtung ratur konnte mit Hilfe eines mit flüssigem Stickstoff gekühlten Kryostaten erreicht werden. Den schema- Stickstofftank Proben bis auf 103 Kelvin abgekühlt. Diese Tempe- Stickstofftank bereits beim K-Intermediat anzuhalten, wurden die tischen Aufbau des Kryostaten verdeutlich Abbildung 3.15. Vom Stickstofftank des Kryostaten geht eine schma- Sowohl der Stickstofftank als auch die Kühlschlan- Helium Kupferblock windet, in dem sich die Probe befindet. Helium le Kühlschlange aus, die sich mehrfach um einen Kühlschlangen äußeres Fenster gen werden durch ein Vakuum nach außen hin isoliert. Der durch Verdampfen unter Druck gesetzte Stickstoff wird durch diese Kühlschlangen bis zu einem „Auspuff“ geleitet, wo er entweichen kann. Vakuum Probenhalter Durch diesen konstanten Stickstoffstrom wird der Abb. 3.15: Kryostat (schematische Darstellung) 3.8 Messapparaturen 81 Kupferblock gekühlt. Innerhalb der Probenkammer gewährleistet eingeleitetes Heliumgas den thermischen Kontakt zur Probe. Mittels eines Heizdrahtes, der entlang der Kühlschlangen verlegt ist, kann die Probentemperatur genau reguliert werden. KBr-Fenster in der äußeren Hülle sowie CaF2-Fenster im Kupferblock gewährleisten, dass der Infrarotstrahl durch den Kryostaten auf die Probe und wieder heraus zum Detektor gelangen kann. Die K-Intermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren wurden erhalten, indem nach dem Herunterkühlen der Probe zunächst zwei Einkanalspektren vor der Belichtung gemessen wurden. Die Belichtung erfolgte wie bei den steady-state Messungen mittels eines Diaprojektors und eines Lichtleiters, der das Anregungslicht auf die Probe lenkt. Mit Hilfe eines Bandpassfilters wurde die Anregungswellenlänge auf den Wellenlängenbereich zwischen 478 nm und 507 nm eingegrenzt. Die Belichtungsdauer betrug 30 Sekunden. Nach Ende der Belichtung wurde ein weiteres Einkanalspektrum mit 512 Scans aufgenommen. Eine statische Messung ist dabei möglich, da durch die niedrige Temperatur der Photozyklus angehalten wird. Die Berechnung der K-Intermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren erfolgte ebenfalls gemäß Gleichung 3.28. Δ A (ν ) = − log S (ν ) K − Intermediat S (ν ) Dunkelzus tan d Gl. 3.28 Zur Wiederholung der Messung war es erforderlich, die im K-Intermedat angereicherte Probe wieder in den Grundzustand zu versetzen. Bei der Rückbelichtung wurde ein Tiefpassfilter verwendet, der Licht mit einer größeren Wellenlänge als 550 nm passieren lässt. Die Rückbelichtungsdauer betrug eine Minute. 82 4.1 K-Intermediat 4. Ergebnisse und Diskussion 4.1 K-Intermediat 4.1.1 Ergebnisse Der Photozyklus von NpSRII beginnt mit der Isomerisierung des Retinalchromophors von der all-trans zur 13-cis Form. Durch diese Reaktion werden aufgrund der geringen Flexibilität der Retinalbindungstasche Spannungen entlang der Polyenkette des Retinals sowie des ß-Ionon Rings verursacht (siehe Kapitel 1.7.1). Infolge der Relaxation des Chromophors in einen energetisch günstigeren Zustand werden bereits im K-Intermediat Konformationsänderungen im Bereich der Retinalbindungstasche verursacht, die sich in signifikanten Amid I Differenzbanden im K-Intermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektrum von NpSRII äußern (Engelhard et al., 1996; Kandori et al., 2001). Es wird angenommen, dass spezifische Chromophor-Protein Wechselwirkungen in diesem Intermediat die Grundlagen für die späteren Interaktionen des Rezeptors mit dem Transducer bilden und somit Voraussetzung für die Signaltransduktion sind (Edman et al., 2002). Die spezifischen Wechselwirkungen, die bei der Signalweiterleitung vom Chromophor und der Bindungstasche bis zum Transducer eine Rolle spielen, könnten auch umgekehrt bewirken, dass die Anwesenheit des Transducers einen Einfluss auf die Chromophor-Protein Wechselwirkungen zu Beginn des Photozyklus haben. Um den Einfluss der Transducerbindung auf die zu Beginn des Photozyklus erfolgenden Reaktionen zu untersuchen, wurden zunächst Tieftemperatur Differenzspektren von NpSRII sowie vom NpSRII/NpHtrII-Komplex bei 103 Kelvin gemessen (siehe Kapitel 3.7.2). Aus beiden Spektren wurde anschließend durch Differenzbildung ein Doppeldifferenzspektrum abgeleitet. Hierzu wurden die Spektren zunächst auf die Differenzbande bei 1705(-) cm-1 und 1698(+) cm-1 normiert, die der C=O Streckschwingung von Asn105 zugeordnet werden konnte (Kandori et al., 2002). Asn105 befindet sich in der Mitte von Helix D von NpSRII und ist an Wechselwirkungen der Helices C und D beteiligt, die beide nicht mit dem Transducer in Kontakt stehen. Aufgrund der deutlichen Distanz zum Interface des Rezeptors mit dem Transducer sollte die Differenzbande nicht durch Interaktionen des Rezeptors mit dem Transducer beeinflusst werden. Abbildung 4.1 zeigt die K-Intermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren von NpSRII sowie vom NpSRII/NpHtrII-Komplex und das aus den beiden Spektren abgeleitete Doppeldifferenzspektrum. 4.1 K-Intermediat 83 NpSRII 0,5 mOD NpSRII/NpHtrII 1600 NpSRII/NpHtrII minus NpSRII 1613 1196 1642 Δ absorption 1698 1672 1557 1705 1632 1590 1552 1204 1657 1800 1700 1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000 -1 wavenumber [cm ] Abb. 4.1: K-Intermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren von NpSRII sowie vom NpSRII/NpHtrII Komplex und das aus den beiden Spektren gebildete Doppeldifferenzspektrum. Vor Bildung des Doppeldifferenzspektrums wurden beide Spektren auf die Differenzbande von Asn105 [1705(-) cm-1/1698(+) cm-1] normiert. Anhand Abbildung 4.1 werden signifikante Unterschiede zwischen den K-Intermediat-minusDunkelzustand Differenzspektren von NpSRII und dem NpSRII/NpHtrII Komplex deutlich. Durch die Anwesenheit des Transducers wird sowohl die Intensität als auch die Form einiger Differenzbanden deutlich beeinflusst. Die Unterschiede können allerdings nicht nur durch den Einfluss des Transducers auf Schwingungsmoden des Rezeptors zustande kommen, sondern auch direkt auf Differenzbanden des Transducers zurückzuführen sein. Diese Banden können durch die Isotopenmarkierung des Transducers identifiziert werden (siehe Kapitel 3.4). Zunächst sollen allerdings die Unterschiede in den Differenzspektren der ungelabelten Proteine genauer analysiert werden: Geringe Intensitätsunterschiede weisen die beiden Differenzspektren im Bereich der negativen Differenzbande bei 1204 cm-1 auf. Diese Bande wird durch die C14-C15 Streckschwingung des Retinals verursacht, die mit den C14-H sowie C15-H in-plane Biegeschwingungen koppeln (Smith et al., 1987). Die C14-H Gruppe des Retinals spielt eventuell eine wichtige Rolle bei 84 4.1 K-Intermediat der Transduceraktivierung, indem sie nach der Photoaktivierung infolge eines sterischen Konflikts die Wasserstoffbrückenbindung zwischen Thr204 von NpSRII und Tyr174 von NpHtrII beeinflusst und so vermutlich indirekt einen Einfluss auf die Bindungsregion des Transducers hat (siehe Kapitel 1.7.1). Die beobachteten Unterschiede könnten darauf hindeuten, dass der Transducer über die Wasserstoffbrückenbindung zwischen Thr204 und Tyr174 bereits im Dunkelzustand einen Einfluss auf Schwingungsmoden des Chromophors im Bereich der Schiff Base hat. Auch die negative Bande bei 1552 cm-1 wird durch die Bindung des Transducers deutlich beeinflusst. Zum einen ist die Intensität der Bande im Differenzspektrum des NpSRII/NpHtrII-Komplexes deutlich gegenüber dem Differenzspektrum des freien Rezeptors erhöht. Zum anderen weist das Differenzspektrum von NpSRII eine zusätzliche negative Bande bei 1557 cm-1 auf, die im Spektrum des NpSRII/NpHtrII-Komplexes fehlt. Da in diesem Spektralbereich sowohl die Ethylen- als auch die Amid II Schwingungsmoden absorbieren, könnten die beobachteten Unterschiede sowohl auf strukturelle Veränderungen des Rezeptors sowie des Transducers oder erneut auf Veränderungen von Chromophorbanden infolge der Transducerbindung zurückzuführen sein. Signifikante Unterschiede zwischen den Differenzspektren von NpSRII sowie dem NpSRII/NpHtrII-Komplex sind auch im Spektralbereich zwischen 1700 cm-1 und 1620 cm-1 zu beobachten, in dem die Amid I Schwingungsmoden absorbieren. Die Intensität der positiven Bande bei 1672 cm-1 ist im Komplex mit dem Transducer deutlich verringert, eine kleine negative Bande ist zudem ausschließlich im NpSRII/NpHtrII Differenzspektrum bei einer Wellenzahl von 1677 cm-1 zu beobachten. Die deutlichsten Unterschiede zwischen den beiden Differenzspektren treten allerdings im Bereich der negativen Bande bei 1656 cm-1 auf. Die Bande weist auf der hochfrequenten Flanke eine Schulter bei 1663 cm-1 auf, die im Komplex mit dem Transducer deutlich stärker ausgeprägt ist. Die Intensität des Peakminimums bei 1656 cm-1 ist im Komplex mit dem Transducer zudem reduziert. Auch auf der niederfrequenten Flanke der Differenzbande wird die Bandenform durch die Anwesenheit des Transducers signifikant verändert. Ein Problem bei der Interpretation dieser Ergebnisse liegt darin, dass in diesem Spektralbereich sowohl die Amid I Moden α-helikaler Bereiche der Proteine als auch die C=N Streckschwingungsmode der Schiff Base absorbieren. Daher könnten sowohl strukturelle Veränderungen des Proteinrückgrats von NpSRII oder NpHtrII als auch Veränderungen im Bereich der Schiff Base infolge der Transducerbindung zu den beschriebenen Veränderungen beitragen. Um die beobachteten Unterschiede besser den verschiedenen Schwingungsmoden zuordnen zu können, wurde die Methode der gruppenspezifischen Isoto- 4.1 K-Intermediat 85 penmarkierung verwendet (siehe Kapitel 3.3). Hierzu wurden die Stickstoffatome der Lysinseitenketten durch die 15 N-Isotopen ersetzt, so dass aufgrund der höheren Masse die C=N Streckschwingung bei niedrigeren Wellenzahlen absorbieren und nicht mehr mit den Amid I Banden überlagern sollte. Abbildung 4.2 zeigt die K-Intermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren von 15Nε-NpSRII sowie vom 15Nε-NpSRII/NpHtrII-Komplex. 15 Nε-Lys-NpSRII 0,5 mOD 15 Nε-Lys-NpSRII/NpHtrII 15 Nε-Lys-NpSRII/NpHtrII minus Δ absorption 1598 1698 15 Nε-Lys-NpSRII 1196 1672 1651 1557 1704 1552 1664 1204 1635 1800 1700 1600 1500 1400 -1 1300 1200 1100 1000 wavenumber [cm ] Abb. 4.2: K-Intermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren von 15Nε-Lys-NpSRII und vom 15 Nε-Lys-NpSRII/NpHtrII Komplex im Spektralbereich von 1800 cm-1 bis 1000 cm-1 sowie das aus den beiden Spektren abgeleitete Doppeldifferenzspektren. Vor Bildung des Doppeldifferenzspektrums wurden beide Spektren auf die Differenzbande von Asn105 [1705(-) cm-1/1698(+) cm-1] normiert. Abbildung 4.2 verdeutlicht, dass infolge der Isotopenmarkierung in den beiden Differenzspektren die Intensität der negativen Bande bei 1657 cm-1 deutlich reduziert und dafür eine neue negative Bande mit einem Minimum bei 1635 cm-1 und einer Schulter bei etwa 1643 cm-1 entstanden ist. Dabei überlagern sich nun offenbar die infolge der Isotopenmarkierung verschobene negative Bande der C=N Streckschwingung der protonierten Schiff Base und die durch die Isotopenmarkierung unbeeinflusste negative Bande bei 1632 cm-1 (siehe Abb. 4.1). Raman spektroskopische Untersuchungen an der isotopenmarkierten Protonenpumpe Bacteriorhodopsin (Argade et al., 1981) sowie theoretische Berechnungen (Aton et al., 1980) lassen darauf schließen, dass infolge der Isotopenmarkierung des Stickstoffatoms eine 86 4.1 K-Intermediat Verschiebung des Absorptionsmaximums der C=N Streckschwingung um etwa 13 cm-1 bis 19 cm-1 zu erwarten ist, so dass vermutlich die Schulter auf der hochfrequenten Flanke der negativen Bande bei 1635 cm-1 der C=N Streckschwingung der Schiff Base im Dunkelzustand zuzuordnen ist. In diesem Spektralbereich zeigen sich die größten Unterschiede zwischen den Differenzspektren des freien Rezeptors und des Komplexes, wie anhand des Doppeldifferenzspektrums in Abb. 4.2 zu beobachten ist. Eine weitere signifikante Veränderung infolge der Isotopenmarkierung ist im Spektralbereich zwischen 1610 cm-1 und 1590 cm-1 zu beobachten. In den Spektren der isotopenmarkierten Proteine fehlt die positive Bande bei 1613 cm-1, während bei 1598 cm-1 eine neue positive Bande entstanden ist (vgl. Abb. 4.1 und Abb. 4.2). Hier überlagern sich offenbar die Bande der C=N Streckschwingung im K-Intermediat und die durch die Isotopenmarkierung unbeeinflusste positive Bande bei 1600 cm-1. Durch Bildung der Doppeldifferenzspektren aus den Differenzspektren der gelabelten und ungelabelten Proteinen kann die Position der Bande der C=N Streckschwingung im Grundzustand sowie im K-Intermediat bestimmt werden. Abbildung 4.3 zeigt die entsprechenden Spektren im Spektralbereich zwischen 1700 cm-1 und 1550 cm-1. 15 1657 1658 15 N ε -Lys-N pSR II m inus N pSR II N ε -LysN pSR II/N pH trII m inus N pSR II/N pH trII 0,5 mOD 1594 Δ absorption 1594 1613 1600 1613 1639 1700 1675 1650 1600 1638 1625 1600 -1 1575 1550 wavenum ber [cm ] Abb. 4.3: Aus den K-Intermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren von NpSRII und 15Nε-LysNpSRII sowie aus den entsprechenden Spektren von 15Nε-Lys-NpSRII/NpHtrII und NpSRII/NpHtrII abgeleitete Doppeldifferenzspektren im Spektralbereich zwischen 1700 cm-1 und 1550 cm-1. 4.1 K-Intermediat Das 15 87 N-Lys-NpSRII-minus-NpSRII Doppeldifferenzspektrum deutet darauf hin, dass die C=N bzw. C=15N Streckschwingung im Dunkelzustand bei 1657 cm-1 respektive 1638 cm-1 absorbiert, so dass das Absorptionsmaximum durch die Isotopenmarkierung um 19 Wellenzahlen verschoben wird. Die negative Bande bei 1613 cm-1 kann dementsprechend der C=N Streckschwingung von NpSRII im K-Intermediat zugeordnet werden. Diese Bande wird infolge der Isotopenmarkierung ebenfalls um 19 Wellenzahlen auf 1594 cm-1 verschoben. Die auf diese Weise ermittelten Frequenzen der C=N Streckschwingungsmode im K-Intermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektrum von NpSRII stimmen exakt mit den Ergebnissen früherer FTIR-spektroskopischer Untersuchungen überein. Mit Hilfe von isotopenmarkierten Proben des freien Rezeptors konnten die Frequenzen der C=N Streckschwingungsmoden von NpSRII im Grundzustand und im K-Intermediat bereits in der Arbeitsgruppe von Hideki Kandori identifiziert werden (Shimono et al., 2003). Allerdings wurden in dieser Arbeit ausschließlich hydratisierte Filmproben des ungebundenen Rezeptors und keine Proben des NpSRII/NpHtrII-Komplexes untersucht. In dieser Arbeit wurden ebenfalls eine negative Bande bei 1600 cm-1 beobachtet (vgl. Abb. 4.3), die nicht auf die C=15N Streckschwingungsmode der Schiff Base zurückzuführen ist, da sie nicht um 19 cm-1 gegenüber der positiven Bande bei 1594 cm-1 verschoben ist. Die Bande könnte durch die NH-Biegeschwingung einer weiteren Lysinseitenkette des Rezeptors hervorgerufen werden, deren Frequenz sich nach der Photoaktivierung ebenfalls verändert. Das 15Nε-Lys-NpSRII/NpHtrII-minus-NpSRII/NpHtrII Doppeldifferenzspektrum verdeutlicht den unterschiedlichen Einfluss der Transducerfragmente auf die Frequenz der C=N Streckschwingungsmode im Dunkelzustand sowie im K-Intermediat. In diesem Spektrum erscheint die durch die Isotopenmarkierung verursachte Differenzbande der C=N Streckschwingungsmode des Dunkelzustandes bei 1658(+) cm-1/1639(-) cm-1 und ist somit um etwa eine Wellenzahl gegenüber der entsprechenden Differenzbande im 15 Nε-Lys-NpSRII-minus-NpSRII Doppeldifferenzspektrum blauverschoben. Die Position der Differenzbande bei 1613(-) cm-1 sowie 1594(+) cm-1 ist dagegen in beiden Doppeldifferenzspektren nahezu unverändert. Im Dunkelzustand wird die Frequenz der C=N Streckschwingungsmode durch die Bindung des Transducers folglich offenbar wesentlich stärker als nach der Isomerisierung des Retinals im K-Intermediat beeinflusst. 88 4.1 K-Intermediat Anhand dieser Ergebnisse lassen sich auch einige Unterschiede in den K-Intermediat-minusDunkelzustand Differenzspektren von NpSRII und NpSRII/NpHtrII sowie und 15 15 Nε-Lys-NpSRII Nε-Lys-NpSRII/HtrII erklären. Abbildung 4.4 zeigt die entsprechenden Differenz- spektren und die daraus abgeleiteten Doppeldifferenzspektren im Spektralbereich zwischen 1700 cm-1 und 1500 cm-1. N p S R II N p S R II / N p H trII N p S R II/N p H trII m in u s N p S R II 0,5 mOD 1600 1540 1640 Δ absorption 1672 1649 1552 1557 1639 1598 1657 1667 1557 1590 1632 1590 1662 15 15 15 1551 N ε - L y s - N p S R II N ε - L y s - N p S R II/N p H tr II N ε - L y s - N p S R II/N p H tr II m in u s 15 N ε - L y s - N p S R II 1598 1672 1540 Δ absorption 1624 1652 1616 1590 1557 1552 1664 1636 1652 1659 1700 1675 1635 1630 1598 1643 1650 1625 1557 1592 1600 1575 1552 1550 1525 1500 -1 w a v e n u m b e r [c m ] Abb. 4.4: K-Intermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren von NpSRII sowie von NpSRII/NpHtrII und das daraus abgeleitete Doppeldifferenzspektrum im Spektralbereich zwischen 1700 cm-1 und 1500 cm-1 sowie die entsprechenden Spektren der isotopenmarkierten Proteine. 4.1 K-Intermediat 89 Durch den Vergleich der K-Intermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren von NpSRII sowie vom NpSRII/NpHtrII-Komplex mit den entsprechenden Spektren der isotopenmarkierten Proben wird deutlich, dass die wesentlichen durch die Anwesenheit des Transducers verursachten Unterschiede im Spektralbereich zwischen 1670 cm-1 und 1640 cm-1 nicht durch Veränderungen von Amid I Schwingungsmoden sondern durch den Einfluss des Transducers auf die C=N Streckschwingungsmode im Dunkelzustand zu erklären sind. Die Bande bei 1662(-) cm-1/1649(+) cm-1 im NpSRII/NpHtrII minus NpSRII Doppeldifferenzspektrum ist im entsprechenden Spektrum der isotopenmarkierten Proteine exakt um 19 Wellenzahlen auf 1643(-) cm-1/1630(+) cm-1 verschoben. Diese Bande kann somit eindeutig auf den Einfluss des Transducers auf die Frequenz der C=N Streckschwingungsmode im Dunkelzustand zurückgeführt werden. Im NpSRII/NpHtrII minus NpSRII Doppeldifferenzspektrum überlagern sich mit dieser Bande allerdings zusätzlich die Banden der Amid I Schwingungsmoden, die durch die Bindung des Transducers beeinflusst werden. Diese Veränderungen äußern sich in diesem Spektrum in der sehr breiten negativen Bande mit Minima bei 1667 cm-1 und 1661 cm-1. In den Spektren der isotopenmarkierten Proben können Veränderungen der Differenzbanden von Amid I Schwingungsmoden besser analysiert werden, weil sich die Bande der C=N Streckschwingungsmode infolge der Isotopenmarkierung nicht mehr mit den Bande der Amid I Schwingungsmoden überlagert. Die Ähnlichkeit der Differenzspektren von 15Nε-Lys-NpSRII und 15 Nε-Lys-NpSRII/HtrII zeigt, dass die Amid I Schwingungsmoden durch die An- wesenheit des Transducers nur geringfügig beeinflusst werden. Lediglich die Intensität der positiven Bande bei 1672 cm-1 ist in den Spektren des isotopenmarkierten sowie unmarkierten Komplexes jeweils deutlich gegenüber den Spektren des Komplexes verringert. Die Bande liegt im Spektralbereich, in dem normalerweise Amid I Schwingungsmoden von αII-Helices absorbieren (Krimm und Bandekar, 1986). Diese helikale Struktur weist ungeordnete Bestandteile auf, so dass die reduzierte Intensität der Bande in den Spektren des NpSRII/NpHtrII-Komplexes darauf hindeuten könnte, dass Helices durch die Assoziation von NpSRII und NpHtrII aufgrund der Helix-Helix Interaktionen stabilisiert werden. Frühere FTIR-spektroskopische Untersuchungen des Komplexes haben allerdings eine Intensitätssteigerung der Bande bei 1672 cm-1 im K-Intermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektrum infolge der Bindung des Transducers ergeben (Furutani et al., 2003). Diese Messungen wurden allerdings mit hydratisierten Filmproben durchgeführt, bei denen der Wassergehalt der Proben schwieriger zu kontrollieren ist, so dass geringe Intensitätsunterschiede im Amid I Bereiche auch hierdurch erklärt werden könnten (Radu, 2006). Auch die Bande bei 90 4.1 K-Intermediat 1659(-) cm-1/1652(+) cm-1 könnte auf strukturelle Veränderungen in α-helikalen Bereichen infolge der Bindung des Transducers hindeuten. Die Intensitätsunterschiede sind allerdings so gering, dass die Effekte ebenfalls auf unterschiedliche Hydratisierungsgrade der verschiedenen Proben zurückzuführen sein könnten. Die Unterschiede sind zudem wesentlich kleiner als bei den zuvor erwähnten FTIR-spektroskopischen Untersuchungen, was die hohe Qualität und die gute Reproduzierbarkeit der Spektren von Proben unterschiedlicher Expressionsexperimente widerspiegelt. Signifikante Unterschiede zwischen den Differenzspektren des Rezeptors sowie des Komplexes finden sich im Spektralbereich zwischen 1600 cm-1 und 1550 cm-1. Die Bande bei 1598(+) cm-1/1590(-) cm-1 im 15 Nε-Lys-NpSRII/NpHtrII minus 15 Nε-Lys-NpSRII Doppel- differenzspektrum wird durch die Isotopenmarkierung der Lysinseitenketten nicht beeinflusst, so dass sie nicht auf Veränderungen der C=N Streckschwingungsmode im K-Intermediat zurückzuführen sein kann. Im Gegensatz zum Dunkelzustand wird die C=N Streckschwingungsmode im K-Intermediat durch die Anwesenheit des Transducers nicht beeinflusst. Im Spektralbereich zwischen 1600 cm-1 und 1550 cm-1 absorbieren allerdings auch die asymmetrischen Streckschwingungsmoden der Carboxylatgruppen sowie hochfrequente Moden der Ethylen Streckschwingung (siehe Kapitel 3.3.2). Die Bande der Ethylen Streckschwingungsmode des Grundzustands überlagert sich zudem mit den Differenzbanden der Amid II Schwingungsmoden, die bei etwa 1550 cm-1 absorbieren. Die Intensität der negativen Bande bei 1552 cm-1 ist in den K-Intermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren des freien Rezeptors gegenüber den entsprechenden Spektren des Komplexes deutlich reduziert, die Intensität des Peakminimums bei 1557 cm-1 dagegen erhöht. Die Komponente bei 1557 cm-1 kann dabei Amid II Schwingungsmoden des Rezeptors zugeordnet werden, da sie bei einer vollständigen Isotopenmarkierung des Rezeptors spektral verschoben wird (Radu, 2005). Dieses Ergebnis deutet somit auf signifikante Veränderungen von Bereichen des Proteinrückgrats von NpSRII infolge der Bindung von NpHtrII hin. 4.1.2 Diskussion In dieser Studie sollte der Einfluss von NpHtrII auf strukturelle Veränderungen des Rezeptors nach der Isomerisierung des Retinals untersucht werden. Hierzu wurde die ersten Reaktionsschritte des Rezeptors sowie des Komplexes nach der Photoaktivierung mit Hilfe der Tieftemperatur FTIR-Spektroskopie untersucht (siehe Kapitel 3.8.2). Ein Vergleich der K-Intermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren von NpSRII und NpSRII/NpHtrII belegt allerdings, dass das Spektrum des Rezeptors durch die Anwesenheit des Transducers nur geringfü- 4.1 K-Intermediat 91 gig beeinflusst wird. Die deutlichsten Unterschiede finden sich im Spektralbereich zwischen 1680 cm-1 und 1600 cm-1, in dem die Amid I Schwingungsmoden sowie die C=N Streckschwingungsmode der Schiff Base absorbieren, sowie bei etwa 1550 cm-1, in dem sowohl die Ethylenmoden des Retinals als auch die Amid II Schwingungsmoden absorbieren (siehe Kapitel 3.3.2). In früheren FTIR-spektroskopische Untersuchungen wurden diese Unterschiede hauptsächlich auf Veränderungen des Proteinrückgrats von NpSRII infolge der Bindung von NpHtrII zurückgeführt (Furutani et al., 2003; Radu, 2005). Ein Vergleich der Kristallstrukturen des ungebundenen Rezeptors mit der Struktur des Komplexes zeigt allerdings keine Veränderungen der Konformation des Proteinrückgrats von NpSRII infolge der Komplexbildung an (Royant et al., 2001; Gordeliy et al., 2002). Allerdings muss dabei berücksichtigt werden, dass mit Hilfe der FTIR-Spektroskopie auch sehr kleine strukturelle Veränderungen detektiert werden können, die in den Kristallstrukturen nicht aufgelöst werden können. Mit der Methode der gruppenspezifischen Isotopenmarkierung (siehe Kapitel 3.4) konnte nun allerdings gezeigt werden, dass die Unterschiede zwischen den Spektren des ungebundenen Rezeptors und des Komplexes im Spektralbereich zwischen 1660 cm-1 und 1650 cm-1 nicht auf Veränderungen von Amid I Schwingungsmoden sondern auf eine Frequenzverschiebung der C=N Streckschwingungsmode im Dunkelzustand infolge der Bindung des Transducers zurückzuführen sind. Signifikante Veränderungen von Amid I Schwingungsmoden konnten lediglich anhand der Reduktion der Intensität der Bande bei 1671(+) cm-1/1664(-) cm-1 gezeigt werden, die vermutlich durch Schwingungsmoden von αII-Helices verursacht wird. Auch der Einfluss des Transducers auf Amid II Schwingungsmoden deutet darauf hin, dass strukturelle Veränderungen des Proteinrückgrats durch die Bindung des Transducers tatsächlich erfolgen. Interessanterweise konnte kein Einfluss des Transducers auf die Frequenz der C=N Streckschwingung der Schiff Base im K-Intermediat nachgewiesen werden. Somit stellt sich natürlich die Frage, warum im Dunkelzustand eine signifikante Frequenzverschiebung dieser Schwingungsmode erfolgt, während im K-Intermediat die Bindung des Transducers keinen Einfluss auf die Schwingungsmode hat. Abbildung 4.5 zeigt eine Überlagerung der Kristallstrukturen des Dunkelzustands sowie des K-Intermediats im Bereich der Schiff Base. 92 4.1 K-Intermediat Tyr 199 Lys 205 Signal transduction G μ CN ( K −int erm Thr 204 H C14 Tyr 174 13cis-retinal G μ CN ( dark − state ) C15 C15 C14 H all-trans-retinal Abb. 4.5: Überlagerung der Kristallstrukturen des Dunkelzustandes und des K-Intermediats. Deutlich wird die unterschiedliche Orientierung von Lys205 sowie der Schiff Base in den beiden Strukturen (PDB Code 1GU8). In der Abbildung wird die unterschiedliche Orientierung der Seitenkette von Lys205 und der Schiff Base sowie die unterschiedliche Geometrie des Retinals im Dunkelzustand und im K-Intermediat deutlich. Die unterschiedliche Konformation der Schiff Base könnte eine Erklärung dafür liefern, warum die C=N Streckschwingung im Dunkelzustand durch die Bindung des Transducers beeinflusst wird, im K-Intermediat dagegen nicht. Im Dunkelzustand ist die C=N Bindung ähnlich orientiert wie die C14-C15-Bindung im K-Intermediat. Daher ist es möglich, dass die C15-H-Bindung im Dunkelzustand auf ähnliche Weise mit der Seitenkette von Thr204 interagiert, wie die C14-H-Bindung während des K-Intermediats (siehe auch Kapitel 1.7.1). Infolge eines sterischen Konflikts des Wasserstoffatoms des C14-Atoms mit der Seitenkette von Thr204 nach der Photoisomerisierung wird die Wasserstoffbrückenbindung zwischen Thr204 und Tyr174 beeinflusst (Ito et al., 2008). Die Stärke dieser Wasserstoffbrückenbindung wird bereits zu Beginn des Photozyklus durch die Anwesenheit des Transducers verändert. (Sudo et al., 2003; Sudo et al., 2006). Die Signalweiterleitung zum Transducer erfolgt vermutlich über die Wasserstoffbrückenbindung zwischen Tyr199 und Asn74 von NpHtrII. Auch hier erfolgen bereits zu Beginn des Photozyklus geringe strukturelle Veränderungen, wie ein kleines Signal von Asn74 im K-Intermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektrum beweist (Furutani et al., 2005). Die hier dargestellten Ergebnisse könnten nun darauf hindeuten, dass über dieselben Wechselwirkungen bereits im Dunkelzustand ein Einfluss des Transducers auf die Schiff Basen Re- 4.1 K-Intermediat 93 gion besteht. Anstelle des Wasserstoffatoms des C14-Atoms, das vor der Photoisomerisierung in die entgegen gesetzte Richtung zeigt, könnte die Interaktion von Thr204 mit der Schiff Basen Region im Dunkelzustand über die C15-H-Bindung erfolgen. Da eine Kopplung der C15-H-Biegeschwingung mit der C=N Streckschwingungsmode besteht, könnte auf diese Weise der Einfluss des Transducers auf die Frequenz der C=N Streckschwingungsmode zu erklären sein. Neben diesen spezifischen Interaktionen könnten auch weiter reichende elektrostatische Wechselwirkungen eine Rolle spielen. Mit Hilfe elektrostatischer Berechnungen konnte ebenfalls ein großer Einfluss von Thr204 auf das elektrostatische Potential der Schiff Basen Region belegt werden (Kloppmann et al., 2005). Die Größe der Frequenzveränderung einer Schwingung in einem äußeren elektrostatischen Feld hängt dabei stark von der Veränderung G des Dipolmoments Δμ während des Schwingungsübergangs ab (siehe Kapitel 3.5.2). Im Fall G der C=N Streckschwingung ist Δμ parallel zur Achse der C=N Bindung orientiert. Aufgrund der unterschiedlichen Orientierung der C=N Bindung im Dunkelzustand und im K-Intermediat ist auch ein unterschiedlich großer Einfluss eines lokalen elektrostatischen Feldes auf die Frequenz der C=N Streckschwingung zu erwarten. Bei einer nahezu senkrechten Orientierung des elektrischen Feldvektors zur Achse der C=N Bindung wäre keine Veränderung der Frequenz der C=N Streckschwingungsmode zu erwarten. Elektrostatische Berechnungen am NpSRII/NpHtrII-Komplex könnten genauere Informationen über die elektrostatischen Veränderungen in der Schiff Basen Region liefern. Natürlich könnten auch Wechselwirkungen der Schiff Base mit anderen Gruppen durch die Bindung des Transducers beeinflusst werden. Allerdings deuten FTIR-spektroskopische Untersuchungen darauf hin, dass zumindest das Wasserstoffbrückennetzwerk der Schiff Base mit dem komplexierten Gegenion durch die Bindung des Transducers nicht beeinflusst wird (Furutani et al., 2003). Sollte der Einfluss des Transducers tatsächlich bereits im Dunkelzustand über die Wasserstoffbrückenbindung zwischen Asn74 von NpHtrII mit Tyr199 sowie zwischen Thr204 und Thr174 Auswirkungen auf die C=N Streckschwingung der Schiff Base haben, würde dies erneut auf die Bedeutung dieser Seitenketten für die Signalübertragung von der Schiff Basen Region zum Rezeptor hindeuten. 94 4.2 M-Intermediat 4.2 M-Intermediat 4.2.1 Ergebnisse Um die Wechselwirkungen zwischen Rezeptor und Transducer im aktiven Zustand des Rezeptors zu untersuchen, wurden Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren von NpSRII sowie vom NpSRII/NpHtrII-Komplex gemessen. Da alle Messungen während einer kontinuierlichen Belichtung durchgeführt wurden, liegt im Photoprodukt jeweils ein Gleichgewicht zwischen verschiedenen Intermediaten vor, wobei die langlebigen, späten Intermediate M und O überwiegen (siehe Kapitel 3.3.2). Von beiden Intermediaten wird aufgrund von in-vivo Studien angenommen, dass sie die aktiven Signalzustände des Rezeptors darstellen (siehe Kapitel 1.7). Durch den Vergleich der Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren des ungebundenen Rezeptors sowie des NpSRII/NpHtrII.-Komplexes können daher die Schwingungsmoden von NpSRII sowie NpHtrII identifiziert werden, die durch die Interaktionen von NpSRII und NpHtrII beim Signalübertragungsprozess beeinflusst werden. Abbildung 4.6 zeigt die Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren von NpSRII und NpSRII/NpHtrII und das daraus abgeleitete Doppeldifferenzspektrum. Δ absorption 1765 1695 1556 1685 1604 1663 1900 NpSRII NpSRII/NpHtrII NpSRII/NpHtrII minus NpSRII 1622 2 mOD 1800 1700 1544 1600 1500 1400 1300 1200 1100 1000 -1 wavenumber [cm ] Abb. 4.6: Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren von NpSRII sowie vom SRII/NpHtrII-Komplex bei 273K sowie das daraus abgeleitete Doppeldifferenzspektrum im Spektralbereich von 1900 cm-1 bis 1000 cm-1. Eine detailliertere Ansicht der Spektren folgt in Abb. 4.7. 4.2 M-Intermediat 95 Die Abbildung verdeutlicht, dass die Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren von NpSRII und vom NpSRII/NpHtrII-Komplex nur geringe Unterschiede aufweisen. Dies deutet darauf hin, dass die Komplexbildung nur einen relativ kleinen Einfluss auf die strukturellen Veränderungen hat, die nach der Photoaktivierung im Rezeptor erfolgen. Lediglich im Bereich der Amid I- sowie Amid II Schwingungsmoden treten kleine Unterschiede zwischen den beiden Differenzspektren auf. Zur Bildung der Doppeldifferenzspektren wurden die Differenzspektren auf die Bande der C=O Streckschwingungsmode von Asp75 bei 1765 cm-1 normiert (siehe Kapitel 3.3.2). Diese Bande zeigt die erfolgte Protonenübertragung von der Schiff Base auf das Gegenion Asp75 beim Übergang zum frühen M-Intermediat an. Bereits frühere FTIR-spektroskopische Studien haben gezeigt, dass der Transducer keinen Einfluss auf diese Bande hat, so dass sie sich gut zur Normierung der Spektren eignet (Furutani et al., 2005). Interessanterweise sind außerdem keine Unterschiede in den Spektren des freien Rezeptors und des NpSRII/NpHtrII-Komplexes im Bereich der Fingerprintbande bei 1204 cm-1 zu beobachten, wie in den entsprechenden KIntermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren (siehe Abb. 4.1). Ursache hierfür könnten unterschiedliche elektrostatische Wechselwirkungen bei 103 K und 273 K sein. Unter anderem könnte die geringere Mobilität von Wassermolekülen bei niedrigen Temperaturen im Rezeptor-Transducer-Interface zur veränderten Elektrostatik im Protein beitragen. Aufgrund der beobachteten Unterschiede in den K-Intermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren des freien Rezeptors sowie des NpSRII/NpHtrII-Komplexes wurde die Bande nicht zur Normierung der Spektren verwendet. Im folgenden sollen die beobachteten Unterschiede zwischen den Spektren im Bereich der Amid I- sowie Amid II Schwingungsmoden genauer analysiert werden. Abbildung 4.7 zeigt die Differenzspektren aus Abbildung 4.6 im Spektralbereich zwischen 1800 cm-1 und 1500 cm-1. 96 4.2 M-Intermediat NpSRII NpSRII/NpHtrII NpSRII/NpHtrII minus NpSRII 2 mOD 1645 1765 1556 Δ absorption 1695 1634 1750 1670 1700 1663 1658 1663 1694 1800 1676 1685 1685 1530 1544 1637 1651 1650 1558 1600 -1 wavenumber [cm ] 1538 1547 1550 1500 Abb.4.7: Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren von NpSRII sowie vom SRII/NpHtrII-Komplex bei 273K sowie das daraus abgeleitete Doppeldifferenzspektrum im Spektralbereich von 1800 cm-1 bis 1500 cm-1. Die Detailansicht der beiden Differenzspektren belegt erneut, dass die strukturellen Veränderungen infolge der Interaktionen des Rezeptors mit dem Transducer wesentlich kleiner sind als die strukturellen Veränderungen von NpSRII selbst beim Übergang vom Dunkelstand in den aktiven Zustand. Die Differenzbande bei 1694(-) cm-1/1685(+) cm-1 im NpSRII/NpHtrII minus NpSRII Doppeldifferenzspektrum konnte bereits in früheren FTIR-spektroskopischen Untersuchungen der C=O Streckschwingung von Asn74 des Transducers zugeordnet werden (Furutani et al., 2005). Diese Seitenkette bildet eine Wasserstoffbrückenbindung mit Tyr199 von NpSRII und könnte bei der Signalweiterleitung eine wichtige Rolle spielen (siehe Kapiteel 1.8). Die Verschiebung der Absorptionsbande von Asn74 zu niedrigeren Wellenzahlen im Photointermediat gegenüber dem Dunkelzustand deutet darauf hin, dass die Wasserstoffbrückenbindung im M-Intermediat verstärkt wird. Diese Schlussfolgerung steht allerdings im Widerspruch zu einer weiteren FTIR-spektroskopischen Studie, in der eine Bande bei 1670 cm-1 der C=O Streckschwingung von Asn74 im M-Intermediat zugeordnet wurde (Bergo et al., 2005). Die deutliche Frequenzverschiebung um 24 cm-1 gegenüber dem Dunkelzustand wäre in diesem Fall nur durch die Brechung der Wasserstoffbrückenbindung von Asn74 mit Tyr199 und Bildung einer neuen stärkeren Wasserstoffbrückenbindung mit einem 4.2 M-Intermediat 97 anderen Bindungspartner zu erklären. Das NpSRII/NpHtrII minus NpSRII Doppeldifferenzspektrum weist ebenfalls eine positive Bande bei 1670 cm-1 auf, so dass zunächst nicht ausgeschlossen werden konnte, dass diese Bande der C=O Streckschwingung von Asn74 im MIntermediat zuzuordnen ist. Die Differenzbande bei 1670(+) cm-1 sowie 1663(-) cm-1 könnte allerdings auch auf Veränderungen von Amid I Schwingungsmoden infolge der Bindung des Transducers zurückzuführen sein. Die Differenzbande liegt dabei im Frequenzbereich, in dem die Amid I Schwingungsmoden von αII-Helices absorbieren, die ungeordnete Strukturbestandteile aufweisen (siehe Kapitel 4.1.1). Die Bande deutet darauf hin, dass im NpSRII/NpHtrIIKomplex im Verlauf des Photozyklus größere Störungen in helikalen Bereichen als im freien Rezeptor auftreten. Grundsätzlich müssen die Doppeldifferenzspektren allerdings immer mit Vorsicht interpretiert werden, da bereits kleine Unterschiede in den Differenzspektren zu signifikanten Banden im Doppeldifferenzspektrum führen können. Die Bande bei 1658(+) cm-1/1651(-) cm-1 liegt im Spektralbereich, in dem die Amid I Moden von αII-Helices absorbieren. Allerdings absorbiert in diesem Wellenzahlbereich auch die C=N Streckschwingungsmode der Schiff Base im Dunkelzustand, die ebenfalls durch die Bindung des Transducers beeinflusst wird. Eine Zuordnung der Banden kann hier erneut durch eine Isotopenmarkierung der Schiff Base erreicht werden (siehe unten). Auch die Banden im Frequenzbereich, in dem die Amid II Schwingungsmoden absorbieren, deuten auf kleine strukturelle Veränderungen im NpSRII/NpHtrII-Komplex gegenüber dem ungebundenen Rezeptor hin. In diesem Spektralbereich absorbiert zudem die EthylenStreckschwingungsmode des Chromophors, die ebenfalls geringfügig durch die Bindung des Transducers beeinflusst worden sein könnte. Im nächsten Schritt sollte untersucht werden, ob die beschriebenen Unterschiede zwischen den Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren von NpSRII und NpSRII/NpHtrII im gesamten Temperaturbereich von 253 K bis 293 K zu beobachten sind. Dies könnte Rückschlüsse darüber ermöglichen, ob strukturelle Veränderungen, die zur Aktivierung des Transducers beitragen, temperaturabhängig sind. Abbildung 4.8 zeigt die Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren von NpSRII und NpSRII/NpHtrII im Temperaturbereich bei 253 K, 273 K und 293 K. 98 4.2 M-Intermediat 10 mOD NpSRII NpSRII/NpHtrII NpSRII/NpHtrII minus NpSRII 253K 1765 1695 Δ absorption 1685 1685 1694 273K 1556 1544 1658 1651 293K 1800 1750 1700 1650 1600 1550 1500 -1 wavenumber [cm ] Abb.4.8: Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren von NpSRII sowie vom SRII/NpHtrII-Komplex bei 253K, 273 K und 293 K sowie die jeweils aus den Spektren abgeleiteten Doppeldifferenzspektren im Spektralbereich von 1800 cm-1 bis 1500 cm-1. Die Abbildung verdeutlicht, dass die Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren von NpSRII sowie NpSRII/NpHtrII nur geringe Unterschiede in Abhängigkeit von der Temperatur aufweisen. Lediglich die Intensitäten einiger Differenzbanden von Amid I sowie Amid II Schwingungsmoden sind mit zunehmender Temperatur geringfügig erhöht. Zudem weist die Bande der C=O Streckschwingung von Asp75 bei 1765 cm-1 mit zunehmender Temperatur eine breite Schulter auf der niederfrequenten Flanke auf. Dies zeigt an, dass aufgrund der veränderten Kinetik des Photozyklus ein höherer Anteil des O-Intermediats im Photoprodukt enthalten ist, da das Absorptionsmaximum der C=O Streckschwingung von Asp75 im O-Intermediat bei 1757 cm-1 liegt (Furutani et al., 2004). Auch die Schulter bei 1556 cm-1 ist auf die Anwesenheit eines späten Photointermediats im Photoprodukt zurückzuführen (Bergo et al., 2005). Trotz des unterschiedlichen Anteils der späten Intermediate M2, N und O im Photoprodukt weisen die NpSRII/NpHtrII minus NpSRII Doppeldifferenzspektren bei 4.2 M-Intermediat 99 253 K, 273 K und 293 K kaum Unterschiede auf. Signifikant ist allerdings, dass die Intensität der Bande der C=O Streckschwingung von Asn74 bei 1694(-) cm-1/1685(+) cm-1 bei 253 K deutlich reduziert ist. Die Temperaturabhängigkeit dieser Bande konnte bei Messungen mit verschiedenen Proben der ungelabelten sowie isotopenmarkierten Proteine reproduziert werden. Dies deutet darauf hin, dass in den Spektralbereichen, in denen die Amid I- sowie Amid II Schwingungsmoden von NpSRII sowie NpHtrII absorbieren, die NpSRII/NpHtrII minus NpSRII Doppeldifferenzspektren dagegen nur geringe Unterschiede aufweisen. Die hier erhaltenen Ergebnisse stehen im Widerspruch zu einer früheren FTIR-spektroskopischen Studie mit hydratisierten Filmproben von NpSRII und NpSRII/NpHtrII, bei der eine Verringerung der Intensität von Amid I Banden mit zunehmender Temperatur ausschließlich in Gegenwart des Transducers beobachtet wurde (Kamada et al., 2006). Hieraus wurde gefolgert, dass bei höheren Temperaturen die Auswärtsbewegung der Helix F des Rezeptors durch die Anwesenheit des Transducers unterbunden wird. Die große Ähnlichkeit der in dieser Arbeit gemessenen Differenzspektren des freien Rezeptors sowie des NpSRII/NpHtrII-Komplexes bei allen Temperaturen zwischen 253 K und 293 K deuten hingegen darauf hin, dass die wesentlichen strukturellen Veränderungen des Rezeptors durch die Gegenwart des Transducers nicht beeinflusst werden. Wahrscheinlich sind die beobachteten Unterschiede in den Spektren von Kamada et al. durch unterschiedliche Hydratisierungen der Filmproben zu erklären. Der Intensitätsanstieg der Bande der C=O Streckschwingung von Asn74 sowie von Banden der Amid I Moden mit zunehmender Temperatur lässt stattdessen darauf schließen, dass bestimmte Konformationsänderungen, die zur Aktivierung des Transducers beitragen, bei niedrigen Temperaturen unterbunden sind. In Frequenzbereich der Amid I Moden absorbiert allerdings auch die C=N Streckschwingungsmode des Dunkelzustands, deren Frequenz durch die Bindung des Transducers ebenfalls beeinflusst wird (siehe Kapitel 4.1). Um die Banden der Amid I Moden von der Bande der C=N Streckschwingung zu trennen, wurden erneut Photointermediat-minusDunkelzustand Differenzspektren von [15Nε]-Lys markierten Proben des Rezeptors und des NpSRII/NpHtrII-Komplexes gemessen. Abbildung 4.9 zeigt die Photointermediat-minusDunkelzustand Differenzspektren von [15Nε]-Lys-NpSRII sowie vom [15Nε]-Lys- NpSRII/NpHtrII-Komplex sowie das aus beiden Differenzspektren abgeleitete Doppeldiffe renzspektrum im Spektralbereich zwischen 1800 cm-1und 1500 cm-1. 100 4.2 M-Intermediat 15 Nε−Lys-NpSRII Nε−Lys-NpSRII/NpHtrII 15 15 Nε−Lys-NpSRII/NpHtrII minus Nε−Lys-NpSRII 15 2 mOD 1568 1765 Δ absorption 1695 1556 1685 1685 1665 1669 1656 1680 1663 1694 1800 1750 1700 1635 1627 1645 1650 1545 1558 1600 1539 1547 1550 1500 -1 wavenumber [cm ] Abb.4.9: Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren von NpSRII [15Nε]-Lys-NpSRII sowie vom [15Nε]-Lys-NpSRII/NpHtrII-Komplex bei 273K sowie das daraus abgeleitete Doppeldifferenzspektrum im Spektralbereich zwischen 1800 cm-1 bis 1500 cm-1. Infolge der Isotopenmarkierung hat die negative Bande bei 1663 cm-1 signifikant an Intensitätverloren, das Minimum der Bande hat sich zudem um zwei Wellenzahlen auf 1665 cm-1 verschoben. Die negative Bande der C=N Streckschwingung überlagert sich nun mit der Bande bei 1634 cm-1, die daher deutlich an Intensität gewinnt. Das aus den Differenzspektren der isotopenmarkierten Proben abgeleitete Doppeldifferenzspektren zeigt, dass die Veränderungen im Frequenzbereich der Amid I Schwingungsmoden durch die Isotopenmarkierung nur geringfügig beeinflusst worden sind. Den Einfluss des Transducers auf die C=N Streckschwingung verdeutlicht die Bande bei 1645(-) cm-1/1627(+) cm-1 mit einer Schulter bei 1637 cm-1. Diese Bande entspricht somit der Differenzbande bei 1643(-) cm-1/1630(+) cm-1 in den aus den K-Intermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren der isotopenmarkierten Proben abgeleiteten Doppeldifferenzspektren (siehe Abb. 4.4). Die Intensität dieser Bande ist allerdings aufgrund der veränderten Elektrostatik innerhalb des Proteins bei 273 K geringer als bei den Tieftemperaturmessungen bei 103 K. Mit Hilfe der Proben des [15Nε]-Lys markierten Komplexes konnte dennoch ein Einfluss des Transducers sowohl auf die Amid I Moden als auch auf die C=N Streckschwingungsmode des Retinals nachgewiesen werden. 4.2 M-Intermediat 101 Zunächst kann allerdings keine Aussage darüber getroffen werden, ob die Banden der Amid I Moden auf strukturelle Veränderungen des Proteinrückgrats von NpSRII oder NpHtrII zurückzuführen sind. Im Frequenzbereich der Amid II Schwingungsmoden absorbiert zudem die Ethylenmode des Retinals. Eine Zuordnung der Banden zu Schwingungsmoden des Rezeptors, des Transducers oder des Chromophors kann durch eine vollständige Isotopenmarkierung von NpSRII sowie NpHtrII erreicht werden (siehe Kapitel 3.4). Zunächst wurden daher Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren von Proben gemessen, in denen der Rezeptor mit vollständig [13C,15N]-isotopenmarkiertem Peptiden von NpHtrII komplexiert ist. Infolge der Isotopenmarkierung sollten die Banden der Amid I Schwingungsmoden des Transducer um etwa 40 cm-1, die Amid II Schwingungsmoden um etwa 30 cm-1 verschoben werden. Abbildung 4.10 zeigt die Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren von NpSRII/[15N,13C]-NpHtrII und NpSRII sowie das daraus abgeleitete Doppeldiferenzspektrum. NpSRII 15 13 NpSRII/ N, C-NpHtrII 15 13 NpSRII/ N, C-NpHtrII minus NpSRII 2 mOD 1555 1765 1531 Δ absorption 1695 1684 1664 1642 1659 1670 1800 1750 1700 1603 1617 1651 1650 1600 1544 1554 1540 1550 1500 -1 wavenumber [cm ] Abb.4.10: Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren von NpSRII sowie vom SRII/[15N,13C]-NpHtrII-Komplex bei 273K sowie das daraus abgeleitete Doppeldifferenzspektrum im Spektralbereich von 1800 cm-1 bis 1500 cm-1. Die Abbildung verdeutlicht, dass das Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektrum des NpSRII/[15N,13C]-NpHtrII-Komplexes nur geringfügige Veränderungen gegenüber dem entsprechenden Differenzspektrum des ungelabelten NpSRII/NpHtrII-Komplexes auf- 102 4.2 M-Intermediat weist (vgl. Abb. 4.7). Veränderungen finden sich insbesondere im Bereich der Differenzbande bei 1695(+) cm-1/1684(-) cm-1, der negativen Bande bei 1664 cm-1, sowie der positiven Schulter bei 1555 cm-1, deren Intensität im Spektrum des isotopenmarkierten Komplexes deutlich erhöht ist. Bereits in früheren zeitaufgelösten FTIR-spektroskopischen Untersuchungen wurde ein deutlicher Intensitätszuwachs dieser Bande im Differenzspektrum des NpSRII/NpHtrIIKomplexes beobachtet und auf die Anwesenheit des N-Intermediats zurückgeführt (Bergo et al., 2003). Diese Veränderungen zeigen sich auch im NpSRII/[15N, 13C]-NpHtrII minus NpSRII Doppeldifferenzspektrum, das gegenüber dem entsprechenden Doppeldifferenzspektrum des unmarkierten Komplexes signifikante Unterschiede aufweist (vgl. Abb. 4.7). Infolge der Isotopenmarkierung des Transducers fehlt die Bande bei 1694(-) cm-1/1685(+) cm-1, die der C=O Streckschwingung von Asn74 zugeordnet werden konnte (Furutani et al., 2005). Diese Bande wurde infolge der Isotopenmarkierung um 43 cm-1 zu niedrigeren Wellenzahlen verschoben und erscheint nun bei 1651(-) cm-1/1642(+) cm-1. Dieses Ergebnis zeigt, dass im Doppeldifferenzspektrum der unmarkierten Proteine die Bande bei 1685 cm-1 und nicht bei 1670 cm-1 die positive Komponente der Differenzbande der C=O Streckschwingung von Asn74 darstellt. Die Frequenz der C=O Streckschwingung von Asn74 wird im M-Intermediat folglich nur um 9 cm-1 und nicht um 24 cm-1 gegenüber dem Dunkelzustand verschoben. Die Wasserstoffbrückenbindung von Asn74 mit Tyr199 wird im M-Intermediat somit offenbar verstärkt und wird nicht durch eine andere Wasserstoffbrückenbindung ersetzt, wie von Bergo et al. angenommen (Bergo et al., 2005). Infolge der Isotopenmarkierung des Transducers überlagert sich die Bande der C=O Streckschwingung nun mit den Banden der Amid I Schwingungsmoden des Rezeptors. Die Bande bei 1659(+) cm-1/1651(-) cm-1 im Doppeldifferenzspektrum der ungelabelten Protein ist durch die Isotopenmarkierung von NpHtrII offensichtlich nicht beeinflusst worden. Diese Bande reflektiert daher strukturelle Veränderungen von α-helikalen Bereichen des Rezeptors infolge der Komplexbildung von NpSRII und NpHtrII. Unklar ist die Herkunft der negativen Bande bei 1670 cm-1 im NpSRII/[15N, 13C]-NpHtrII minus NpSRII Doppeldifferenzspektrum. Die Bande kann nicht durch Schwingungsmoden von NpHtrII verursacht worden sein, da im Doppeldifferenspektrum der ungelabelten Proteine keine entsprechende Bande im Bereich von etwa 1710 cm-1 zu beobachten ist. Im NpSRII/[15N, 13C]-NpHtrII minus NpSRII Doppeldifferenzspektrum ist zudem im Frequenzreich unterhalb von 1630 cm-1 keine Bande vorhanden, die der positiven Bande bei 1670 cm-1 im entsprechenden Spektrum der ungelabelten Proteine entsprechen würde. 4.2 M-Intermediat 103 Bereits bei früheren FTIR-spektroskopischen Untersuchungen haben kleine Divergenzen bei der Probenpräparation zu Inkonsistenzen einiger Ergebnisse geführt (Radu, 2006). Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden daher ausführliche Testmessungen mit verschiedenen Proben aus unterschiedlichen Expressions- und Rekonstitutionsexperimenten durchgeführt. Im Zuge dieser Experimente konnte durch kleine Veränderungen im Rekonstitutionsprotkoll und einer exakten Kontrolle des Hydratisierungsgrades der IR-Proben eine deutliche Verbesserung der Reproduzierbarkeit der Messungen erreicht werden, wie auch der Vergleich der Doppeldifferenzspektren der ungelabelten und [15N-Lys]-gelabelten Proteine belegt (vgl. Abb. 4.7, 4.9). Dennoch konnten kleine Abweichungen in Differenzspektren, die von Proben verschiedener Expressionsversuche gemessen wurden, nicht immer verhindert werden. Im Amid I Bereich traten die Abweichungen dabei vor allem bei einer Wellenzahl von etwa 1670 cm-1 auf, bei der die Amid I Schwingungsmoden von αII-Helices absorbieren. Die weiteren Banden der Amid I Moden konnten dagegen in den Doppeldifferenzspektren aller erhaltenen Proben sehr genau reproduziert werden. Neben der Bande bei 1670 cm-1 traten in den Differenzspektren der gelabelten sowie ungelabelten NpSRII/NpHtrII-Komplexe auch Unterschiede im Bereich der Ethylenmode des Retinals bei etwa 1544 cm-1 auf, wodurch eine Differenzbande mit Extremwerten bei etwa 1554 cm-1 sowie 1540 cm-1 verursacht wird (siehe Abb. 4.10). Vermutlich stellt daher auch die Differenzbande bei 1558(-) cm-1/1539(+) cm-1 im NpSRII/NpHtrII minus NpSRII Doppeldifferenzspektrum der ungelabelten Proteine lediglich ein Artefakt dar, das eine zweite durch Amid II Moden verursachte Bande überlagert (siehe Abb. 4.7). Um dennoch sichere Aussagen über Veränderungen von Amid II Moden infolge der Bindung des Transducers treffen zu können, wurden Differenzspektren von Proben des vollständig isotopenmarkierten Rezeptors aufgenommen. Aufgrund der Isotopenmarkierung sollten die Banden der Amid II Moden des Rezeptors um etwa 30 cm-1 zu niedrigeren Wellenzahlen verschoben werden, während die Differenzbande der Ethylenmode durch die Isotopenmarkierung des Apoproteins nicht beeinflusst wird. Im Differenzspektrum des isotopenmarkierten Rezeptors im Komplex mit den ungelabelten Transducermolekülen sollten zudem die Banden von Amid I Moden von NpHtrII leichter zu identifizieren sein, da diese nicht mehr von den Banden der Amid I Moden von NpSRII überlagert werden. Darüber hinaus wurden auch Differenzspektren von vollständig isotopenmarkierten Transducermolekülen im Komplex mit dem isotopenmarkierten Rezeptor gemessen. Hierdurch sollten auch die Banden der Amid I- sowie Amid II Moden von NpHtrII um etwa 40 cm-1 respektive 30 cm-1 verschoben werden und somit eindeutig dem Transducer zuzuordnen sein. 104 4.2 M-Intermediat Abbildung 4.11 zeigt die Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren von [15N,13C]-NpSRII, [15N,13C]-NpSRII/NpHtrII sowie [15N,13C]-NpSRII/[15N,13C]-NpHtrII und die daraus abgeleiteten Doppeldifferenzspektren im Spektralbereich zwischen 1750 cm-1 und 1450 cm-1. 15 13 5 mOD N, C-NpSRII 15 13 N, C-NpSRII/NpHtrII 15 13 N, C-NpSRII/NpHtrII minus 15 1605 1525 1582 1722 13 N, C-NpSRII Δ absorption 1652 1632 1513 1594 1642 1627 1549 1546 1645 1685 1694 1659 15 1523 1614 1555 1604 1627 1510 13 N, C-N pSRII 15 13 15 13 N, C-N pSRII/ N, C-N pH trII 15 13 15 13 N, C-N pSRII/ N, C-N pH trII m inus 1605 15 13 N , C -NpSR II 1525 1582 1652 Δ absorption 1632 1513 1594 1642 1549 1627 1524 1642 1614 1651 1628 1750 1700 1650 1510 1604 1600 1550 1500 1450 -1 wavenum ber [cm ] Abb.4.11: Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren von [15N,13C]-NpSRII, [15N,13C]-NpSRII/NpHtrII sowie von [15N,13C]-SRII/[15N,13C]-NpHtrII bei 273K sowie die daraus abgeleitete Doppeldifferenzspektren im Spektralbereich von 1750 cm-1 bis 1550 cm-1. 4.2 M-Intermediat 105 In den Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren ist deutlich die Rotverschiebung der Rezeptorbanden gegenüber den Spektren des ungelabelten Rezeptors zu beobachten. Die Bande der C=O Streckschwingung von Asp75 wurde um 43 cm-1 auf 1722 cm-1 verschoben. Auch die Banden der Amid I Schwingungsmoden wurden infolge der Isotopenmarkierung um denselben Betrag zu niedrigeren Wellenzahlen verschoben. Die Banden bei 1652(+) cm-1, 1642(-) cm-1, 1632(+) cm-1, 1627(-) cm-1, 1605(+) cm-1 sowie 1594(-) cm-1 in den Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren von [15N,13C]-NpSRII entsprechen daher den Banden bei respektive 1695(+) cm-1, 1685(-) cm-1, 1676(+) cm-1, 1663(-) cm-1, 1645(+) cm-1 und 1634(-) cm-1 in den Differenzspektren des ungelabelten Rezeptors (vgl. Abb. 4.7). Die Banden der Amid II Moden wurden infolge der Isotopenmarkierung lediglich um 30 cm-1 verschoben, so dass die Bande bei 1525(+) cm-1 und 1513(-) cm-1 vermutlich durch Amid II Moden von NpSRII hervorgerufen wird. In den Spektren des ungelabelten Rezeptors überlagert sich diese Bande mit der negativen Bande der Ethylenmode bei 1544 cm-1. Durch die Trennung der Banden kann nun der Einfluss des Transducers auf die Amid II Schwingungsmoden untersucht werden. Im Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektrum von [15N,13C]-NpSRII/NpHtrII ist diese Bande deutlich intensiver als im Spektrum des ungebundenen Rezeptors, was darauf schließen lässt, dass durch die Komplexierung zusätzliche strukturelle Veränderungen im Proteinrückgrat des Rezeptors ausgelöst werden. Aufgrund der deutlichen Verschiebung der Banden, die durch die Amid I- sowie Amid II Moden von NpSRII verursacht werden, sollten auch die durch strukturelle Veränderungen des Transducers hervorgerufenen Differenzbanden leichter zu identifizieren sein. Im [15N,13C]-NpSRII/NpHtrII minus [15N,13C]-NpSRII Doppeldifferenzspektrum sind vermutlich zwei Banden auf Schwingungsmoden des Transducers zurückzuführen. Zum einen die Bande der C=O Streckschwingung von Asn74 bei 1694(-) cm-1/1685(+) cm-1, zum anderen die Bande bei 1659(-) cm-1/1645(+) cm-1, die vermutlich durch Amid I Moden einer der beiden Transmenbranhelices von NpHtrII verursacht wird. In den Differenzspektren des ungelabelten Rezeptors wird diese Bande vermutlich durch die Differenzbanden von Amid I Schwingungsmoden des Rezeptors überlagert. Im NpSRII/NpHtrII minus NpSRII Doppeldifferenzspektrum erscheint in diesem Frequenzbereich eine Bande bei 1658(+) cm-1/1651(-) cm-1, die vor allem den Einflusses des Transducers auf Amid I Moden von NpSRII widerspiegelt (siehe Abb. 4.7). Diese Bande erscheint im [15N,13C]-NpSRII/NpHtrII minus [15N,13C]-NpSRII Doppeldifferenzspektrum bei 1614(+) cm-1/1604(-) cm-1 und ist somit auf Amid I Moden des Rezeptors zurückzuführen. 106 4.2 M-Intermediat Sollte die Bande bei 1659(-) cm-1/1645(+) cm-1 tatsächlich durch Schwingungsmoden des Transducers verursacht werden, müsste die Bande infolge der Isotopenmarkierung des Transducers ebenfalls um ungefähr 40 cm-1 zu niedrigeren Wellenzahlen verschoben werden, so dass sie sich vermutlich mit der Bande bei 1614(+) cm-1/1604(-) cm-1 überlagern sollte. Tatsächlich fehlt im [15N,13C]-NpSRII/[15N,13C]-NpHtrII minus [15N,13C]-NpSRII Doppeldifferenzspektrum die Bande bei 1659(-) cm-1/1645(+) cm-1, da in diesem Frequenzbereich nun ausschließlich die verschobene Differenzbande der C=O Streckschwingung von Asn74 bei 1651(-) cm-1/1642(+) cm-1 zu beobachten ist. Zudem hat die Differenzbande bei 1614(+) cm-1/1604(-) cm-1 deutlich an Intensität verloren, was durch die Überlagerung mit der Transducerbande zu erklären sein könnte. Die verschobene Amid I Bande des Transducers sollte auch in den Differenzspektren des isotopenmarkierten Transducers im Komplex mit ungelabelten Rezeptormolekülen zu beobachten sein. In diesem Spektrum sollte zudem keine Überlagerung mit den Banden der Amid I Moden von NpSRII erfolgen. Tatsächlich weist das NpSRII/[15N,13C]-NpHtrII minus NpSRII Doppeldifferenzspektrum eine Bande bei 1617(-) cm-1/1603(+) cm-1 auf, die der Bande bei 1659(-) cm-1/1644(+) cm-1 im [15N,13C]-NpSRII/NpHtrII minus [15N,13C]-NpSRII Doppeldifferenzspektrum entsprechen könnte (siehe Abb. 4.10). Mit Hilfe der Isotopenmarkierung konnte die Bande bei 1659(-) cm-1/1645(+) cm-1 somit eindeutig Amid I Moden von NpHtrII zugeordnet werden. Die niedrigere Frequenz der Amid I Moden von NpHtrII im Photointermediat gegenüber dem Dunkelzustand könnte dabei durch eine stärkere Wasserstoffverbrückung einiger Amidgruppen des Transducerfragments im aktiven Zustand zu erklären sein, da mit Hilfe von Modellpeptiden ein starker Einfluss der Wasserstoffverbrückung einer α-Helix auf die Schwingungsfrequenz der Amid I Moden nachgewiesen werden konnte (Krimm und Bandekar, 1986). Thermodynamische Messungen haben zwar eindeutig ergeben, dass die Bindung des Transducers an den Rezeptor im aktiven Zustand schwächer als im Dunkelzustand ist (Sudo et al., 2001; Sudo et al., 2002); die Frequenzverschiebung der C=O Streckschwingung von Asn74 im M-Intermediat gegenüber dem Dunkelzustand verdeutlicht aber, dass trotz der größeren Bindungskonstante im aktiven Zustand Kontakte zwischen der Transmembranhelix 2 von NpHtrII und Helix G von NpSRII innerhalb der Membran verstärkt werden. Im Verlauf des Photozyklus könnten zudem neue Wasserstoffbrückenbindungen innerhalb des 4-Helixbündels der Transducermoleküle gebildet werden. Eine stärkere Interaktion der Transmembranhelices untereinander könnte auch bei der Aktivierung der cytoplasmatischen Domäne des Transducers eine Rolle spielen (siehe Kapitel 1.8). 4.2 M-Intermediat 107 4.2.2 Schlussfolgerungen Die große Ähnlichkeit der Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren des ungebundenen Rezeptors und des NpSRI/NpHtrII-Komplexes zeigt, dass nur kleine strukturelle Veränderungen im Rezeptor infolge der Bindung des Transducerfragments erfolgen. Der geringe Einfluss des Transducers auf die Struktur von NpSRII im Dunkelzustand ist dabei wenig überraschend, da die Kristallstrukturen des ungebundenen Rezeptors sowie des NpSRII/NpHtrII-Komplexes eine nahezu identische Struktur von NpSRII aufweisen (Gordelyi et al., 2002). Nach wie vor ungeklärt ist allerdings die Frage, ob durch die Anwesenheit des Transducers Konformationsänderungen des Rezeptors nach der Photoaktivierung unterbunden werden (siehe Kapitel 1.8). In einer früheren FTIR-spektroskopischen Untersuchung des in Phospholipiden rekonstituierten NpSRII/NpHtrII-Komplexes wurde eine signifikante Intensitätsverringerung von Differenzbanden der Amid I Moden infolge der Bindung des Transducers beobachtet, die mit einer Unterdrückung der Auswärtsbewegung von Helix F im NpSRII/NpHtrII-Komplex begründet wurde (Bergo et al., 2003). Die im Rahmen dieser Arbeit gemessenen Differenzspektren von NpSRII sowie NpSRII/NpHtrII weisen allerdings nur geringen Intensitätsunterschiede der Amid I Banden auf, was darauf hindeutet, dass die wesentlichen strukturellen Veränderungen des Rezeptors durch die Anwesenheit des Transducers nicht verändert werden. Diese Schlussfolgerung wird auch durch verschiedene EPRStudien am NpSRII/NpHtrII-Komplex unterstützt, die ebenfalls auf eine unveränderte Auswärtsbewegung der Helix F im NpSRII/NpHtrII-Komplex hindeuten Wegener et al., 2001; Klare et al., 2004a, Bordignon et al., 2007). Neben den Veränderungen des Rezeptors sollten durch isotopenmarkierte Proben auch die Differenzbanden von Schwingungsmoden des Transducers identifiziert werden. Die Bande bei 1659(-) cm-1/1645(+) cm-1 im [15N,13C]-NpSRII/NpHtrII minus [15N,13C]-NpSRII Doppeldifferenzspektrum ist vermutlich auf Amid I Moden von NpHtrII zurückzuführen und reflektiert somit strukturelle Veränderungen im Bereich der Transmembranhelices von NpHtrII nach der Photoakivierung. Die beobachtete Frequenzverschiebung im Photointermediat könnte auf eine stärkere Wasserstoffverbrückung einer der beiden Transmembranhelices nach der Aktivierung zurückzuführen sein. Die α-helikale Struktur der Transmembranhelices wird nach der Photoaktivierung aber nicht gestört, da das Doppeldifferenzspektrum keine signifikante Bande im Frequenzbereich zwischen 1670 cm-1 und 1660 cm-1 aufweist. Das Signal wird somit vermutlich durch eine “Starrkörperbewegung“ der Transmembranhelices zur cytoplasmatischen Domäne übertragen, bei der die Sekundärstruktur nicht beeinflusst wird. Die 2006 veröffentlichte Kristallstruktur des NpSRII/NpHtrII-Komplexes im aktivierten Zustand zeigt, 108 4.2 M-Intermediat dass bei der Aktivierung tatsächlich nur eine geringfügige Rotation der TM2-Helix senkrecht zur Membranachse sowie eine Translationsbewegung derselben Helix erfolgt, die nicht mit einer Störung der helikalen Struktur einhergeht (Moukhametzianov et al., 2006). Diese strukturellen Änderungen sind allerdings ausreichend, um die Kontakte im Interface zwischen Transducer und Rezeptor zu beeinflussen. Ein wichtiger „Ankerpunkt“ im Komplex zwischen Rezeptor und Transducer ist die Wasserstoffbrückenbindung zwischen Asn74 der TM2-Helix von NpHtrII und Tyr199 der Helix G von NpSRII (siehe Kapitel 1.8). Die Veränderung dieser Wasserstoffbrückenbindung im Verlauf des Photozyklus legt nahe, dass diese Wasserstoffbrückenbindung eine wichtige Rolle bei der Signalübertragung zum Transducer spielen könnte. Allerdings wird in verschiedenen FTIR-spektroskopischen Studien sowohl von einer Stärkung (Furutani et al., 2005) als auch von einem Bruch dieser Wasserstoffbrückenbindung im aktiven Zustand berichtet (Bergo et al., 2005). Dabei könnte ein Bruch der Wasserstoffbrückenbindung den Komplex zwischen NpSRII und NpHtrII destabilsieren und dadurch zur Aktivierung des Transducers beitragen (Sasaki und Spudich, 2008). Die in dieser Arbeit beobachtete Frequenzverringerung der C=O Streckschwingung um 9 cm-1 im Photointermediat gegenüber dem Dunkelzustand deutet allerdings darauf hin, dass die Wasserstoffbrückenbindung bei der Aktivierung lediglich gestärkt und nicht durch eine andere Wasserstoffbrückenbindung ersetzt wird. Auch die Kristallstruktur des aktivierten Komplexes lässt darauf schließen, dass die Wasserstoffbrückenbindung zwischen Asn74 und Tyr199 im M-Intermediat intakt ist (Moukhametzianov et al., 2006). Die bei verschiedenen Temperaturen zwischen 253 K und 293 K aufgenommenen Differenzspektren des NpSRII/NpHtrII-Komplexes zeigen zudem, dass die Differenzbande der C=O Streckschwingung von Asn74 temperaturabhängig ist. Dies könnte darauf hindeuten, dass Konformationsänderungen des Rezeptors, die zur Aktivierung des Transducers beitragen, bei niedrigeren Temperaturen unterbunden werden. Auch der beobachtete Intensitätsanstieg von Differenzbanden der Amid I Moden mit zunehmender Temperatur lässt auf temperaturabhängige Konformationsänderungen im NpSRII/NpHtrII-Komplex schließen. Allerdings kann ohne weitere Informationen keine Aussage darüber getroffen werden, in welchem Bereich des Rezeptors diese temperaturabhängigen Konformationsänderungen erfolgen. In den weiteren Untersuchungen wurde daher versucht, mit Hilfe von Infrarotsonden positionsspezifische Informationen über strukturelle und elektrostatische Veränderungen im NpSRII/NpHtrIIKomplex zu erhalten. 4.3 4-Mercaptobenzonitril 109 4.3 4-Mercaptobenzonitril als Infrarotsonde 4.3.1 Absorptionsmessungen in verschiedenen organischen Lösungsmitteln Innerhalb eines Proteins können große Variationen in lokalen elektrostatischen Feldern auftreten, die einen Einfluss auf die Proteinfunktion haben. Um diese lokalen Felder aufzuspüren, können Infrarotsonden in ein Protein eingebracht werden. Die Schwingungsfrequenz dieser Sonde wird durch das lokale elektrostatische Feld beeinflusst und kann durch Infrarot Spektroskopie beobachtet werden (siehe Kapitel 3.5). Boxer et al. haben aromatische Nitrilverbindungen als Infrarotsonden vorgeschlagen, da die Streckschwingung der Nitrilfunktion stark durch die elektrostatische Umgebung beeinflusst wird und das Absorptionsmaximum in einem Frequenzbereich liegt, in dem keine anderen Proteinbanden zu finden sind (Suydam et al., 2006; Suydam und Boxer, 2003). In der vorliegenden Arbeit wurde daher 4-Mercaptobenzonitril (4-MBN) zunächst als Infrarotsonde getestet, um später im NpSRII/NpHtrII-Komplex Konformationsänderungen und Veränderungen lokaler elektrostatischer Felder in der Umgebung der Sonde aufzuspüren. Um zu untersuchen, wie die Frequenz der C≡N Streckschwingung von 4-MBN durch unterschiedliche elektrostatische Umgebungen beeinflusst wird, wurde 4-MBN in verschiedenen protischen und aprotischen Lösungsmitteln gelöst und Absorptionsspektren aufgenommen. Durch die Interaktion von 4-MBN mit protischen Lösungsmittelmolekülen kann untersucht werden, welchen Einfluss Wasserstoffbrückenbindungen auf die Frequenz der C≡N Streckschwingungsmode von 4-MBN haben. Solche Wechselwirkungen wurden bei den von Boxer et al. durchgeführten Studien bisher nicht berücksichtigt, in denen ausschließlich die Auswirkungen von elektrostatischen Feldern auf die Frequenz der C≡N Streckschwingungsmode untersucht wurde (Webb und Boxer, 2008; Suydam et al., 2006; Suydam und Boxer, 2003). Bereits frühere FTIR-spektroskopische Untersuchungen an Nitrilverbindungen haben allerdings gezeigt, dass auch Wasserstoffbrückenbindungen mit funktionellen Gruppen des Proteins oder Wassermolekülen die Frequenz der C≡N Streckschwingung stark beeinflussen (Getahun et al., 2003). Durch die Bildung einer Wasserstoffbrückenbindung wird die C≡N Bindung verkürzt und die Kraftkonstante erhöht, im Gegensatz zur normalerweise bei Donor-Akzeptor Paaren auftretenden Bindungsverlängerung (siehe Kapitel 3.5.4). Dieser Effekt wird mit der Verringerung des antibindenden Charakters der C≡N Bindung aufgrund der Abgabe von Ladungsträgern an den Akzeptor begründet (Cho und Cheong, 2000). Um das Ausmaß der Frequenzverschiebung infolge von Wasserstoffbrückenbindungen bei 4-MBN zu bestimmen, wurden Absorptionsspektren von 4MBN in verschiedenen Lösungsmittelgemischen gemessen, die einen variierenden Anteil von Methanol aufwiesen. Abbildung 4.12 zeigt die 110 4.3 4-Mercaptobenzonitril Verschiebung der Absorptionsbande der C≡N Streckschwingung von 4-MBN in verschiedenen THF/Methanol-Gemischen. 2231,4 THF 100% THF/Methanol 80% v/v THF/Methanol 60% v/v THF/Methanol 40% v/v THF/Methanol 20% v/v solvent-induced shift 2230,8 absorption -1 wavenumber [cm ] 10 mOD 2231,1 2230,5 2230,2 2229,9 2229,6 a) 2240 2230 -1 wavenumber [cm ] 2225 2229,3 2220 11 10 10 -1 fwhm [cm ] 9 8 20 40 60 methanol fraction (v/v) 80 100 9 8 7 7 6 b) 0 11 fwhm [cm ] -1 2235 c) 0 20 40 60 methanol fraction (v/v) 80 100 6 d) 2229,3 2229,6 2229,9 2230,2 2230,5 2230,8 2231,1 2231,4 -1 wavenumber [cm ] Abb. 4.12: a) Absorptionsbande der C≡N Streckschwingung von 4-MBN in verschiedenen THFMethanol Gemischen mit variierenden Volumenanteilen von Methanol. b) Wellenzahl des Absorptionsmaximums der C≡N Streckschwingung von 4-MBN als Funktion des Anteils von Methanol im Lösungsmittelgemisch. c) Halbwertsbreite der Absorptionsbande (fwhm) der C≡N Streckschwingungsmode von 4-MBN als Funktion des Anteils von Methanol im Lösungsmittelgemisch. d) Halbwertsbreite der Absorptionsbande (fwhm) der C≡N Streckschwingungsmode von 4-MBN als Funktion der Wellenzahl des Absorptionsmaximums. Die Abbildung zeigt die erwartete Erhöhung der Frequenz der C≡N Streckschwingungsmode mit einem höheren Anteil an Methanol im Lösungsmittelgemisch und damit einer höheren Anzahl an Wasserstoffbrückenbindungen zwischen 4-MBN und Methanol. Das Absorptionsmaximum verschiebt sich dabei von 2229,4 cm-1 in einer reinen THF-Lösung zu 2231,2 cm-1 in einem THF/Methanol-Gemisch mit einem Methanolanteil von 85 Prozent. Aufgrund der relativ geringen Frequenzverschiebung können allerdings nicht zwei getrennte Absorptionsbanden derjenigen Moleküle, die Wasserstoffbrückenbindungen eingehen und jener, die keine Wasserstoffbrücken bilden, beobachtet werden. Es ist stattdessen nur eine einzige verbreiterte 4.3 4-Mercaptobenzonitril 111 Absorptionsbande zu erkennen, deren Lage mit der Zahl der Wasserstoffbrückenbindungen von 4-MBN Molekülen im Lösungsmittelgemisch korreliert (siehe Abb. 4.12a). Durch Absorptionsmessungen von 4-MBN in weiteren protischen Lösungsmitteln konnte bestätigt werden, dass die beschriebene Frequenzverschiebung des Absorptionsmaximums tatsächlich auf die Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen zurückzuführen ist. Bei den Messungen zeigte sich zudem eine geringe Abhängigkeit der Höhe der Frequenzverschiebung vom Lewissäurecharakter des Wasserstoffbrückendonors, die bereits von Fawcett et al. bei Acetonitril beschrieben wurde (Reimers et al., 1999; Fawcett et al., 1993). Neben der Verschiebung des Absorptionsmaximums konnte auch eine Verbreiterung der Absorptionsbande der C≡N Streckschwingung in Abhängigkeit vom Methanolanteil im Lösungsmittelgemisch beobachtet werden (siehe Abb. 4.12b). Die größere Halbwertsbreite der Absorptionsbande hat vermutlich zwei verschiedene Ursachen: Zum einen findet eine Überlagerung der Absorptionsbande von wasserstoffverbrückten 4-MBN Molekülen mit der Absorptionsbande von 4-MBN Molekülen statt, die keine Wasserstoffbrückenbindung mit einem Methanolmolekül eingehen. Zum anderen können mehrere Methanolmoleküle mit 4-MBN gleichzeitig wechselwirken und Komplexe bilden, die in der Zeitskala des Schwingungsübergangs stabil bleiben, so dass die Frequenz der C≡N Steckschwingung durch die Interaktion mit 4-MBN Molekülen auf unterschiedliche Weise beeinflusst wird (Getahun et al., 2003). Daher ist die Absorptionsbande der C≡N Streckschwingung auch in einer 90– prozentigen Methanollösung, in der vermutlich die meisten 4-MBN Moleküle Wasserstoffbrückenbindungen mit Methanolmolekülen eingehen, gegenüber einer reinen THF-Lösung verbreitert. Aufgrund der schlechten Löslichkeit von 4-MBN in Alkoholen konnte allerdings kein Absorptionsspektrum von 4-MBN in einer 100-prozentigen Methanollösung aufgenommen werden. Durch die Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen mit Lösungsmittelmolekülen verändert sich daher sowohl die Lage des Absorptionsmaximums als auch die Breite der Absorptionsbande der C≡N Streckschwingungsmode von 4-MBN. Der Anstieg der Halbwertsbreite mit zunehmendem Methanolanteil erfolgt dabei allerdings langsamer als die Verschiebung des Absorptionsmaximums. Daher ergibt sich mit einem zunehmenden Anteil von Methanol im Lösungsmittelgemisch ein degressiver Anstieg der Halbwertsbreite der Absorptionsbande als Funktion der Wellenzahl des Absorptionsmaximums (siehe Abb. 4.12 d). Die Sensitivität der C≡N Streckschwingungsmode für Interaktionen mit Lösungsmittelmolekülen macht die Nitrilfunktion dafür geeignet, als Umgebungssonde die Lösungsmittelzugänglichkeit der IR-Sonde an unterschiedlichen Positionen eines Proteins zu detektieren. Bei 112 einer 4.3 4-Mercaptobenzonitril Veränderung der Lösungsmittelzugänglichkeit der IR-Sonde infolge einer Proteinreaktion, kann zudem indirekt auf Konformationsänderungen innerhalb des Proteins geschlossen werden. Diese Methode wurde bereits bei der Untersuchung von Konformationsänderungen eines Peptids der Myosin Light Chain Kinase bei Bindung an Calmodulin erfolgreich getestet (Getahun et al., 2003). Auch Azidoverbindungen wurden bereits in Peptiden sowie Proteinen dafür eingesetzt, um positionsspezifische Informationen über die Lösungsmittelzugänglichkeit der IR-Sonde zu erhalten, da auch die Azido-Streckschwingung stark durch Wasserstoffbrückenbindungen beeinflusst wird (Oh et al., 2008, Ye et al., 2009). Bei beiden Studien wurde allerdings der Einfluss lokaler elektrostatischer Felder auf die Frequenz der jeweils untersuchten Schwingungsmode nicht berücksichtigt. Während die AzidoStreckschwingungsmode kaum durch elektrostatische Felder beeinflusst wird, reagiert die C≡N Streckschwingungsmode dagegen sehr sensitiv auf eine Veränderung des elektrostatischen Potentials in der Umgebung der IR-Sonde (siehe Kapitel 1.5). Die Höhe der Frequenzverschiebung in Abhängigkeit von der elektrischen Feldstärke ist dabei bekannt, da die Stark Tuning Raten verschiedener Nitrilverbindungen in früheren Studien bereits exakt bestimmt wurden (Suydam und Boxer, 2003). Um den Einfluss eines elektrostatischen Felder in einem Protein auf die C≡N Streckschwingungsmode abschätzen zu können, muss zudem bekannt sein, welche Frequenz die C≡N Streckschwingungsmode im Proteininneren ohne ein elektrostatisches Feld aufweist. Aprotische Lösungsmittel mit einer niedrigen Dielektrizitätskonstanten sollten relativ gut die elektrostatische Umgebung im Proteininneren widerspiegeln (Getahun et al., 2003). Daher wurde 4-MBN in einigen aprotischen Lösungsmitteln gelöst und Absorptionsspektren aufgenommen. Folgende Tabelle stellt für einige aprotische Lösungsmittel die Dielektrizitätskonstante, die Lage des Absorptionsmaximums der C≡N Streckschwingungsmode von 4-MBN sowie die Halbwertsbreite der Absorptionsbande im jeweiligen Lösungsmittel gegenüber. 4.3 4-Mercaptobenzonitril 113 Tabelle 4.1: Position des Absorptionsmaximums der C≡N Streckschwingung von 4-MBN, die Halbwertsbreite (fwhm) der Absorptionsbande sowie die Dielektrizitätskonstante des jeweiligen Lösungsmittels, in dem 4-MBN gelöst wurde. Die Konzentration von 4-MBN betrug jeweils 5-10 mM. Die Messungen wurden bei 298 K durchgeführt. Lösungsmittel Absorptionsmaximum [cm-1] fwhm [cm-1] Dielektrizitätskonstante Dimethylsulfoxid (DMSO) 2226,8 12,8 46,7 Aceton 2228,8 9,9 20,7 Dichlormethan 2229,8 8,5 8,9 Tetrahydrofuran (THF) 2229,0 7,6 7,5 Toluol 2229,7 7,8 2,4 Die Tabelle zeigt, dass das Absorptionsmaximum der C≡N Streckschwingungsmode von 4-MBN in allen Lösungsmitteln mit einer niedrigen Dielektrizitäskonstanten (relativen Permeativität) zwischen 2229 cm-1 und 2230 cm-1 liegt. Daher sollte das Absorptionsmaximum der C≡N Streckschwingung von 4-MBN auch im hydrophoben Inneren eines Proteins in diesem Wellenzahlbereich liegen. Signifikant verschoben ist die Absorptionsbande dagegen in Dimethylsulfoxid (DMSO), das eine deutlich höhere Dielektrizitätskonstante aufweist. Dieses Ergebnis zeigt erneut, dass die Frequenz der C≡N Streckschwingung durch ein lokales elektrostatisches Feld beeinflusst wird, das durch das starke Dipolmoment von DMSO in der Umgebung der Infrarotsonde induziert wird. Durch das elektrostatische Feld wird die Kraftkonstante der C≡N Bindung verringert, wodurch die Verschiebung des Absorptionsmaximums zu niedrigeren Wellenzahlen bei einer höheren Dielektrizitätskonstanten des Lösungsmittels zu erklären ist (siehe Abb. 3.10). Dabei muss allerdings berücksichtigt werden, dass auch direkte Wechselwirkungen zwischen 4-MBN- und DMSO-Molekülen einen Einfluss auf die Frequenz der C≡N Streckschwingung haben können. Infolge dieser Interaktionen können verschiedene Komplexe zwischen 4-MBN- und Lösungsmittelmolekülen gebildet werden, wodurch vermutlich die größere Halbwertsbreite der Absorptionsbande verursacht wird. In einer früheren Studie wurden die Auswirkungen der möglichen Interaktionen zwischen einer Nitrilverbindung und Lösungsmittelmolekülen auf die Frequenz der C≡N Streckschwingungsmode am Beispiel von Acetonitril bereits sehr genau analysiert (Reimers und Hall, 1999). Der Einfluss solcher Wechselwirkungen auf die C≡N Streckschwingungsmode und damit auf die Halbwertsbreite der Absorptionsbande ist dabei offenbar umso größer, je höher die Dielektrizitätskonstante des Lösungsmittels ist. Dieser Zusammenhang kann dadurch erklärt werden, dass bei einer heterogenen Orientierung der Infrarotsonde relativ zu einem lokalen elektrostatischen Feld die Halbwertsbreite der Absorptionsbande vergrößert wird. Im Inneren eines Proteins ist die Mobilität der Infrarot- 114 4.3 4-Mercaptobenzonitril sonde allerdings stark eingeschränkt, so dass die Orientierung der Infrarotsonde relativ zu einem lokalen elektrostatischen Feld dort nicht stark variieren sollte. Daher wird im Proteininneren vermutlich ausschließlich die Frequenz der C≡N Streckschwingungsmode und nicht die Halbwertsbreite der Absorptionsbande durch ein elektrostatisches Feld beeinflusst. Eine Verbreiterung der Absorptionsbande ist ausschließlich an der Proteinoberfläche oder in flexiblen Bereichen des Proteins zu erwarten. 4.3.2 Kopplung der IR-Sonde an den NpSRII/NpHtrII Komplex Um ein besseres Verständnis zu bekommen, wie die Frequenz der C≡N Streckschwingung durch die Proteinumgebung sowie das Lösungsmittel beeinflusst wird, wurde der bakterielle Photorezeptor NpSRII und der Transducer NpHtrII mit 4-MBN als IR-Sonde markiert. Der Komplex ist durch zahlreiche strukturelle sowie spektroskopische Daten wie Kristallstrukturen, FTIR und EPR-Messungen sehr gut charakterisiert und eignet sich daher hervorragend als Modellsystem für das IR-Label. Die Bindung des Labels an den Komplex erfolgte durch Kopplung der freien Thiol-Gruppe von 4-MBN an Cystein Seitenketten von Mutanten des Rezeptors sowie des Transducers (siehe Kapitel 3.5.4). Dabei wurden insbesondere Positionen der Helices F und G mit dem IR-Label markiert, da diese Helices mit den Transmembranhelices des Transducers in Kontakt stehen und die Signalweiterleitung an den Transducer vermutlich über strukturelle Änderungen dieser Helices vermittelt werden (siehe Kapitel 1.8). Insbesondere Helix F kommt wahrscheinlich eine Schlüsselrolle zu, da verschiedene strukturelle und spektroskopische Daten auf eine Auswärtsbewegung der Helix nach Photoaktivierung des Rezeptors hindeuten, die in eine Rotationsbewegung der TM2Helix des Transducers übertragen wird (Bordignon et al., 2007; Moukhametzianov et. al, 2006; Wegener et al., 2000, Wegener et al., 2001). An Lys205 der Helix G ist zudem über eine protonierte Schiffsche Base der Chromophor all-trans Retinal gebunden, der nach Lichtaktivierung zu 13-cis Retinal isomerisiert wird. Im weiteren Verlauf des Photozyklus wird die Schiff Base zudem deprotoniert und das Gegenion Asp75 protoniert (siehe Kapitel 1.7). Die elektrostatischen Veränderungen im Bereich der Schiff Base könnten ebenfalls Auswirkungen auf die Frequenz der C≡N Streckschwingung der Infrarotsonde bei einigen Mutanten haben, da die gelabelten Positionen der Helix G nur zwei bis maximal drei Helixwindungen von Lys205 entfernt sind. Dabei ist allerdings auch entscheidend, ob die IRSonde zum Proteininneren oder zur Proteinoberfläche hin orientiert ist, da nur die niedrige Dielektrizitätskonstante im Inneren eine große Reichweite elektrostatischer Wechselwirkungen gewährleistet. An der Proteinoberfläche werden die elektrostatischen Felder dagegen 4.3 4-Mercaptobenzonitril 115 durch andere geladene Gruppen sowie das umgebende Medium sehr stark abgeschirmt. Sowohl auf Helix F als auch auf Helix G wurden jeweils 4 aufeinander folgende Aminosäuren durch Cysteine ersetzt und mit 4-MBN gelabelt. Dadurch nimmt das Label vermutlich bei allen 4 Mutanten jeweils eine andere Position relativ zur Helixachse ein. Die Orientierung der Seitenketten der Helices F und G, die bei dieser Studie durch Cysteine ersetzt und mit 4-MBN gelabelt wurden, zeigt Abbildung. 4.13. helix C SRII L213 F210 A212 L159 L90 S153 helix G I211 HtrII a) Y160 S158 TM 1 helix F K157 TM 2 L213 L90 F210 A212 L159 retinal S153 L159 I211 helix G b) TM 1 I211 TM 2 c) Y160 helix F K157 S158 Abb. 4.13: a) Sicht von der cytoplasmatischen Seite auf den NpSRII/NpHtrII-Komplex. Hervorgehoben sind die Seitenketten der Helices C, F und G, die jeweils durch Cysteine ersetzt und mit 4-MBN gelabelt wurden. b, c) Orientierung der durch Cysteine und 4-MBN ersetzten Seitenketten relativ zu den Achsen der Helices F und G. Abb. 4.13 zeigt, dass die meisten analysierten Seitenketten der Helices C, F und G wie beispielsweise L90, L159 und L213 zum Proteininneren orientiert sind, während sich S153, S158 sowie K157 am cytosolischen Ende der Helix F bzw. im Bereiche der Schleife zwischen den Helices E und F befinden und vermutlich zur Wasserphase hin orientiert sind. Die Seitenketten von S158 der Helix F und I211 der Helix G stehen dabei im NpSRII/NpHtrIIKomplex mit der Transmembranhelix 2 des Transducers in Kontakt. Die beiden Seitenketten 116 4.3 4-Mercaptobenzonitril weisen somit eine deutlich veränderte elektrostatische Umgebung im Komplex mit dem Transducer NpHtrII auf. Um die Wechselwirkungen zwischen NpSRII und NpHtrII zu untersuchen, wurden einige der Mutanten mit einem 157 Aminosäuren langen Fragment des Transducers coexprimiert und mit 4-MBN gelabelt. Es ist allerdings nicht möglich, aus der Position der jeweiligen Seitenkette in der Kristallstruktur, genaue Rückschlüsse auf die Lage der Sonde im gelabelten Komplex zu ziehen. Durch die frei drehbaren Bindungen des Labels sowie der Disulfidbrücke sind viele Orientierungen der Sonde im Protein möglich. Einen Hinweis auf die Umgebung der Sonde im Protein kann allerdings anhand früherer EPR-Messungen gewonnen werden, bei denen dieselben Seitenketten der Helices F und G durch Cysteine ersetzt und mit EPR-Spin Labeln markiert worden sind (Wegener et al., 2000). Anhand von Zugänglichkeitsdaten der SpinLabel für frei diffundierbare Quencher kann darauf geschlossen werden, ob sich das SpinLabel im Proteininneren, in der Lipidphase oder in der Wasserphase befindet (siehe Kapitel 3.5.4). Die höchste Kollisionshäufigkeit der Spin Label mit dem wasserlöslichen Chrom(II)oxalat weisen dabei die an Positionen 157 und 158 gekoppelten Spin-Label auf, so dass darauf geschlossen werden kann, dass die Spin-Label an diesen Positionen Zugang zur Wasserphase haben (vgl. Abb. 3.13). Niedrige Werte sowohl für die Kollisionshäufigkeit mit Chrom(II)-oxalat als auch für Sauerstoff haben dagegen die an Positionen 159, 160, 211 und 213 gebundenen Spin-Label, was zeigt, dass sie sich im hydrophoben Proteininneren befinden. Die Zugänglichkeit der an Positionen 210 und 212 gebundenen Spin Label für Sauerstoffmoleküle ist dagegen typisch für Seitenketten, die sich im Interface zwischen Protein und Lipiddoppelschicht befinden (Wegener et al., 2000). Da die Nitroxid-Spin Label ebenfalls über Disulfidbrücken an die jeweiligen Cystein-Mutanten gebunden sind und die Größe mit 4-MBN vergleichbar ist, können Schlussfolgerungen auf die Umgebung des IRLabels getroffen werden Um darüber hinaus Aussagen treffen zu können, welche geladenen Gruppen im Inneren des Proteins Einfluss auf die C≡N Streckschwingungsmode haben können, wurden zudem strukturbasierte elektrostatische Kalkulationen für verschiedene mit 4MBN gelabelte NpSRII-Mutanten durchgeführt (siehe 4.3.3). Um Konformationsänderungen des Transducers während des Photozyklus zu detektieren, wurden neben den Rezeptormutanten auch 4 verschiedene Cysteinmutanten (V78C, S91C, G101C, D115C) von NpHtrII mit 4-MBN gelabelt. V78 befindet sich dabei am Ende der TM2-Helix, die vermutlich nach der Aktivierung durch den Rezeptor eine Rotationsbewegung senkrecht zur Membranebene sowie eine geringe Translationsbewegung durchläuft (Wegener et al., 2001, Moukhametzianov et al., 2006). Die Kristallstruktur des 4.3 4-Mercaptobenzonitril 117 Komplexes verdeutlicht zudem, dass die Seitenkette innerhalb des 4-Helixbündels des NpSRII/NpHtrII-Dimers an intermolekularen Wechselwirkungen beteiligt ist (Gordeliy et al. 2002). Die Positionen S91, G101 sowie D115 befinden sich dagegen in der ersten HAMP-Domäne des Transducers. HAMP-Domänen sind in einer Reihe von Proteinfamilien mit unterschiedlichen Funktionen wie Histidin-Kinasen, Adenylat-Cyclasen, Methyl-akzeptierende Chemotaxisproteine und Phopshatasen konserviert und spielen jeweils bei der Signaltransduktion eine wichtige Rolle (siehe Kapitel 1.9). Der Transducer von Natronomonas pharaonis besitzt zwei HAMP-Domänen, die durch eine Linker-Sequenz voneinander getrennt sind. Bei allen untersuchten Mutanten wurden allerdings ausschließlich Konstrukte des Transducers von Position 1-157 exprimiert, so dass jeweils nur die erste HAMP-Domäne im Konstrukt enthalten ist. Zwar existiert keine NMR- oder Kristallstruktur einer HAMP-Domäne von NpHtrII, allerdings können anhand früherer EPR-Messungen sowie eines Sequenzalignments Informationen über die gelabelten Positionen erhalten werden. Wichtige Erkenntnisse über die Rolle der HAMP-Domänen bei der Signaltransduktion konnten auch durch die NMR-Struktur einer HAMP-Domäne des Af1503 Proteins aus Archaeoglobus fulgidus gewonnen werden, die ein Homodimer mit einer 4-helikalen parallelen coiled-coil Struktur und einer ungewöhnlichen Helixpackung zeigt (Hulko et al., 2006). Abbildung 4.14 verdeutlicht durch einen Vergleich der Primärsequenzen der HAMP Domänen verschiedener sensorischer Proteine sowie des Af1503 Proteins das konservierte Muster der HAMP Domänen und zeigt in welchem Bereich der Sekundärstruktur sich die gelabelten Positionen von NpHtrII befinden. S91 G101 NpHtrII HsHtrI HsHtrII EcTar EcTsr EcAer EcNarX EcYhjK Af1503 GGDTAASLST AAETVASIKE GSTTVTALRQ RRMLLTPLAK KASLVAPMNR EWQIVRPIEN RARLLQPWRQ NRLILHPLRN TSTITRPIIE LAAKASRMGD IAAQTERVAN FSRRADEMAA IIAHIREIAG LIDSIRHIAG VAHQALKVAT LLAMASAVSH IARELNAIPA LSNTADKIAE packing (Af1503) heptad x da x da abcdefgabc defgabcd amphipathic sequence 1 (AS1) D115 GDLDVE---QNLEQE---GDLDTD---GNLANT---GDLVKP---GERNSVE-HL RDFTQR---KELVGHQLAL GNLEAE---V LETRREDEIG VTSTRTDEFG IDTSRNDEFG LTIDGRSEMG IEVDGSNEMG NRSDELGLTL ANISGRNEMA PRLHQDDEIG PHQNRADEIG GLYAAFDEMR SLADSIEQMR TLAESFRSMR DLAQSVSHMQ QLAESLRHMQ RAVGQLGLMC MLGTALNNMS MLVRSYNLNQ ILAKSIERLR QSVRT QSLRG DSLSE RSLTD GELMR RWLIN AELAE QLLQR RSLKV da x da x da ab cdefgabcde fga connector amphipathic sequence 2 (AS2) Abb. 4.14: Sequenzalignment der HAMP-Domänen verschiedener sensorischer Proteine sowie des Protein Af1503 aus Archaeoglobus fulgidus. Anhand des Hydrophobizitätsmusters wird deutlich, dass sich S91 von NpHtrII in der ersten amphipatischen Helix der HAMPDomäne befindet, während die beiden anderen gelabelten Positionen an den beiden Enden der connector Sequenz liegen (nach Bordignon et al., 2005). 118 4.3 4-Mercaptobenzonitril Zwar kann anhand des Hydrophobizitätsmusters die Sekundärstruktur der HAMP-Domäne abgeleitet werden, über die Tertiärstruktur dieser Domäne von NpHtrII existieren allerdings verschiedene Modelle (siehe Kapitel 1.9). Während EPR-Messungen darauf hindeuten, dass die HAMP-Domäne eine dynamische molten-globule ähnliche Struktur aufweist, die im Gleichgewicht mit einer kompakteren Struktur steht (Doebber et al., 2008), lassen Kernressonanz (NMR)- sowie Circulardichroismus (CD) Messungen auf eine ähnliche Faltung wie die HAMP-Domäne des Af1503 Proteins aus Archaeoglobus fulgidus schließen (Hayashi et al., 2007). Auf Basis dieser unterschiedlichen Strukturen werden auch verschiedenene Modelle für die Signalamplifikation in der HAMP-Domäne vorgeschlagen (siehe Kapitel 1.8) Einem Modell von Hulko et al. zufolge erfolgt die Signaltransduktion durch den Wechsel zwischen zwei sich in der Helixpackung unterscheidenden Konformationen in Folge konzertierter Helixrotationen. Auf Basis der EPR-Messungen ist allerdings auch ein Modell der Aktivierung der cytoplasmatischen Domäne von NpHtrII durch eine Veränderungen des Gleichgewichts zweier, sich hinsichtlich ihrer Dynamik unterscheidenden Konformationen der HAMP-Domäne denkbar. Ein solcher Mechanismus sollte mit Hilfe des IR-Labels auch durch FTIR-Messungen nachweisbar sein, da in einer dynamischeren, molten-globul ähnlichen Konformation das IR-Label vermutlich eine höhere Lösungsmittelzugänglichkeit besitzt als in einem kompakten 4-Helix Bündel. Auch eine konzertierte Rotation der 4-Helices des Homodimers nach dem Mechanismus von Hulko et al. könnte durch Veränderungen der elektrostatischen Umgebung mit Hilfe des IR-Labels detektierbar sein. 4.3 4-Mercaptobenzonitril 119 4.3.3 Absorptionsspektren der NpSRII- sowie NpHtrII-Mutanten Um genauere Aussagen darüber treffen zu können, wie die Frequenz der C≡N Streckschwingung von 4-MBN durch die Proteinumgebung beeinflusst wird, wurden zunächst Absorptionsspektren der verschiedenen gelabelten Rezeptor- und Transducermutanten gemessen. Abb.4.15 zeigt das Absorptionsspektrum der mit 4-MBN gelabelten L213C-Mutante von NpSRII. 0.5 0,006 0.3 absorption absorption 0.4 0.2 0.1 0,004 CN-stretching vibration 0,002 0,000 0.0 a) 2600 2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 -1 wavenumber [cm b) 2300 2275 2250 2225 2200 2175 2150 2125 2100 ] wavenumber [cm-1] Abb. 4.15: a) Absorptionsspektrum der mit 4-MBN gelabelten, in PM-Lipiden rekonstituierten L213C-Mutante von SRII im Wellenzahlbereich von 2600 cm-1 bis 1000 cm-1. Der rote Pfeil markiert die Absorptionsbande der C≡N Streckschwingung von 4-MBN. b) Absorptionsbande der C≡N Streckschwingung von 4-MBN. Das Absorptinsmaximum liegt bei einer Wellenzahl von 2227,8 cm-1. Das Absorptionsmaximum der C≡N Streckschwingung von 4-MBN liegt bei einer Wellenzahl von 2227,8 cm-1 und ist somit im Protein nur geringfügig gegenüber der Lage der C≡N Streckschwingung des in THF gelösten Moleküls verschoben (siehe Kapitel 4.3.1). Die Dielektrizitätskonstante von THF ist mit etwa 7,5 vergleichbar mit der Dielektrizitätskonstante im hydrophoben Inneren eines Proteins. Auch die Zugänglichkeitsdaten der EPR Spin-Label für paramagnetische Quencher deuten darauf hin, dass die Sonde im Fall der gelabelten L213C-Mutante im Proteininneren verborgen ist (siehe Kapitel 4.3.2). Auch bei den übrigen Rezeptormutanten zeigt sich eine relativ gute Korrelation zwischen der Lage des Absorptionsmaximums der C≡N Streckschwingungsmode und der Lösungsmittelzugänglichkeit der EPR-Spinlabel an den entsprechenden Positionen. Die einzige Ausnahme ist die gelabelte I211C-Mutante, bei der das Absorptionsmaximum der C≡N Streckschwingungsmode bei 2229,9 cm-1 darauf hindeutet, dass die IR-Sonde im Gegensatz zum EPR-Spin Label an dieser Position nicht vollständig im Proteininneren verborgen ist. Noch deutlicher zu höheren Wellenzahlen verschoben ist das Absorptionsmaximum der C≡N Streckschwingungsmode allerdings bei den gelableten S158C- und K157C-NpSRII Mutanten, 120 bei denen die IR-Sonde vermutlich bis in die 4.3 4-Mercaptobenzonitril Wasserphase hineinreicht (2231,9 cm-1, 2230,4 cm-1, respektive). Die beobachtete Verschiebung des Absorptionsmaximums gegenüber den Mutanten, bei denen sich die IR-Sonde im Proteininneren befindet, stimmt dabei relativ gut mit der beobachteten Blauverschiebung der C≡N Streckschwingungsmode infolge der Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen in den Methanol/THF-Gemischen überein (siehe Kapitel 4.3.2). Da das Absorptionsmaximum der C≡N Streckschwingungsmode bei einem Methanolanteil von 85 % (v/v) im Lösungsmittelgemisch bei einer Wellenzahl von 2231,2 cm-1 liegt, kann davon ausgegangen werden, dass zumindest im Fall der K157CMutante die C≡N Gruppe der Sonde vollständig von Wassermolekülen umgeben ist. Da die gelabelten NpSRII-Mutanten in Purpurmembran Lipide (PM) rekonstituiert wurden, ist bei einigen Mutanten auch zu erwarten, dass die IR-Sonde in die Lipiddoppelschicht hineinragt. Aufgrund der Kollisionshäufigkeit mit Sauerstoffmolekülen kann darauf geschlossen werden, dass dies bei den an die Positionen 212 und 210 gekoppelten Nitroxid Spin-Labeln der Fall ist. Die Absorptionsmessungen der mit 4-MBN gelabelten Mutanten lassen darauf schließen, dass die an diesen Positionen gekoppelte IR-Sonde ebenfalls in die Lipidphase reichen. Das Absorptionsmaximum der C≡N Streckschwingungsmode von 4-MBN liegt bei der F210C-4MBN-NpSRII Mutante bei 2230,4 cm-1 und ist damit gegenüber den Mutanten, bei denen sich die IR-Sonde im Proteininneren befindet, deutlich zu einer höheren Wellenzahl verschoben. Die Blauverschiebung könnte durch Interaktion der C≡N Gruppe mit der negativ geladenen Kopfgruppe der PM-Lipide anhand des Stark Effekts erklärt werden (siehe Kapitel 3.5.2). Die Lage des Absorptionsmaximums könnte allerdings auch dadurch zu erklären sein, dass die IR-Sonde zumindest teilweise für Wassermoleküle zugänglich ist. Die zuvor beschriebene Korrelation zwischen der Lage der Absorptionsbande der C≡N Gruppe und der Proteinumgebung veranschaulicht Abbildung 4.16, in der sowohl die Zugänglichkeit der EPR-Spin Label für paramagnetische Quencher als auch die Lage der Absorptionsbande bei diesen drei Mutanten dargestellt ist. 4.3 4-Mercaptobenzonitril 121 wavenumber [cm-1] 2226 2228 2230 2232 2234 2236 lipid F210R1sol 1 K157R1 A212R1sol protein S158R1 F210R1 L213R1 absorption Πoxygen A212R1 K157C-4-MBN Y160R1 F210C-4-MBN I211R1 L159R1 L213C-4-MBN aqua 0,1 0,01 0,1 ΠCrOx 1 Abb. 4.16: Korrelation zwischen der Lage des Absorptionsmaximums der C≡N Streckschwingungsmode von 4-MBN und der aus den Zugänglichkeitsdaten der Nitroxid-Spinlabel für paramagnetische Quencher abgeleiteten Proteinumgebung der Sonde. Im nächsten Schritt sollte untersucht werden, wie die Frequenz der C≡N Streckschwingungsmode durch die Interaktion des Rezeptors mit dem Transducer beeinflusst wird. Daher wurden diejenigen Mutanten mit NpHtrII coexprimiert, bei denen eine Interaktion des IRLabels mit den Transmembranhelices des Transducers zu erwarten ist. Eine Möglichkeit ist die I211C-4MBN Mutante, da die Kristallstruktur des Rezeptors zeigt, dass die Seitenkette von I211 der Helix G mit der TM2-Helix von NpHtrII in Kontakt steht (siehe Abb. 4.13b). Auch das Absorptionsmaximum der C≡N Streckschwingungsmode der mit 4-MBN gelabelten I211C-Mutante bei einer Wellenzahl von 2229,9 cm-1 deutet darauf hin, dass die IR-Sonde bei dieser Mutante im Gegensatz zum EPR-Spin Label nicht vollständig im Proteininneren verborgen ist sondern Zugang zur Lipidphase hat. Im Komplex mit dem Transducer verschiebt sich das Absorptionsmaximum der C≡N Streckschwingungsmode hingegen zu einer Wellenzahl von 2226,7 cm-1, was vermuten lässt, dass die IR-Sonde im NpSRII/NpHtrII-Komplex an dieser Position mit dem gebundenen Transducer in Kontakt steht. Während die Lage der Absorptionsbande der C≡N Streckschwingung beim 122 4.3 4-Mercaptobenzonitril ungebundenen Rezeptor auf eine Lipidumgebung der IR-Sonde hindeutet, ist die IR-Sonde im NpSRII/NpHtrII-Komplex vermutlich vollständig im Proteininneren verborgen, wie anhand folgender Abbildung deutlich wird. Solvent induced shift exposed to water protein interior lipid phase K157C-4MBN-SRII L213C-4MBN-SRII F210C-4MBN-SRII absorption 1 mOD 2250 NpSRII NpSRII/NpHtrII Transducer induced shift 2245 2240 2235 2230 I211C-4MBN-SRII I211C-4MBN-SRII/HtrII 2225 2220 2215 2210 -1 wavenumber [cm ] Abb.4.17: Verschiebung der Absorptionsbande der C≡N Streckschwingung aufgrund der unterschiedlichen Lösungsmittelzugänglichkeit der Sonde in den verschiedenen NpSRII-Mutanten sowie aufgrund der Bindung des Transducers an den Rezeptor im NpSRII/NpHtrII-Komplex. Abbildung 4.17 zeigt, dass die Lage der Absorptionsbande der C≡N Streckschwingung beim gelabelten Rezeptor sehr gut mit der Position der entsprechenden Bande bei einer Mutante übereinstimmt, bei der die Sonde bis in die Lipidphase reicht. Im NpSRII/NpHtrII-Komplex ist die Position der Absorptionsbande dagegen vergleichbar mit der Lage der entsprechenden Bande bei einer Mutante, bei der die Sonde im Proteininneren verborgen ist. Die Absorptionsbande weist zudem im Fall des NpSRII/NpHtrII-Komplexes eine deutlich erkennbare Schulter auf der hochfrequenten Flanke auf. Die Schulter kann zum einen durch eine Konformationsheterogenität im NpSRII/NpHtrII-Komplex erklärt werden, wodurch die IR-Sonde verschiedene Orientierungen innerhalb des Komplexes einnehmen könnte. Die Absorptionsbande würde daher ein Gleichgewicht zwischen verschiedenen Umgebungen der IR-Sonde widerspiegeln. Ein Gleichgewicht zwischen verschiedenen Orientierungen wurde auch bei denjenigen EPR-Spin Labeln beobachtet, die sich vermutlich im Interface zwischen zwei miteinander interagierenden Helices befinden (Wegener et al., 2000). Die Schulter könnte allerdings auch durch eine unvollständige Komplexierung des Rezeptors durch den Transducer verursacht worden sein. Hierfür spricht vor allem die Lage der Schulter im Bereich des Absorptionsmaximums der C≡N Streckschwingung im freien Rezeptor. 4.3 4-Mercaptobenzonitril 123 Neben der I211C-Mutante wurden auch die L213C-, die S158C- sowie die K157C-Mutante des Rezeptors zusammen mit dem Transducer in PM-Lipide rekonstituiert. Auch bei diesen drei Mutanten ist wie bei der I211C-Mutante eine Rotverschiebung des Absorptionsmaximums der C≡N Streckschwingung im Vergleich zu den entsprechenden unkomplexierten Rezeptormutanten zu beobachten. Die Frequenzverschiebung ist allerdings bei den verschiedenen Mutanten unterschiedlich hoch. In der L213C-Mutante ist die Sonde bereits im unkomplexierten Rezeptor im Proteininneren verborgen. Im Komplex mit NpHtrII erfolgt zudem aufgrund der Orientierung der Sonde wahrscheinlich keine direkte Interaktion der C≡N Gruppe mit einer der beiden Transmembranhelices des Transducers. Daher ist keine wesentliche Veränderung der elektrostatischen Umgebung der Sonde im Komplex im Vergleich zum ungebundenen Rezeptor zu erwarten. Tatsächlich ist das Absorptionsmaximum der C≡N Streckschwingung im L213C-NpSRII/NpHtrII-Komplex um nur etwa eine Wellenzahl gegenüber dem Absorptionsmaximum im gelabelten unkomplexierten Rezeptor verschoben (siehe Tabelle 4.2). Die Seitenkette von S158 befindet sich dagegen am cytoplasmatischen Ende der Helix F nur eine Helixwindung von der Schleife zwischen den Helices E und F entfernt (siehe Abb. 4.13b). Von dieser Seitenkette wird angenommen, dass sie in Kontakt mit der cytoplasmatischen Verlängerung der TM2-Helix des Transducers steht (Sasaki und Spudich, 2008). Dies zeigt sich insbesondere dadurch, dass infolge der Bindung des Transducers die Zugänglichkeit des an diese Position gebundenen EPR-Spin Labels für wasserlösliches Chromoxalat deutlich reduziert ist (Wegener et al., 2000). Die nur sehr geringe Frequenzverschiebung der C≡N Streckschwingungsmode von 4-MBN infolge der Transducerbindung um weniger als eine Wellenzahl zeigt allerdings, dass die Infrarotsonde im NpSRII/NpHtrII-Komplex ähnlich wie im freien, ungebundenen Rezeptor, gut für Wassermoleküle zugänglich ist. Im Gegensatz zum Nitroxid-Spin-Label ist die an Position 158 gekoppelte IR-Sonde offenbar nicht im Interface zwischen Rezeptor und Transducer verborgen. Dagegen wird die Frequenz der C≡N Streckschwingung bei der gelabelten K157C-Mutante durch die Bindung des Transducers wesentlich stärker beeinflusst. Im gelabelten K157C-SRII/HtrII-Komplex ist das Absorptionsmaximum gegenüber dem freien Rezeptor um ca. 5 cm-1 zu niedrigeren Wellenzahlen verschoben, so dass angenommen werden kann, dass die im freien Rezeptor zur Wasserphase exponierte Sonde nun im Proteininneren verborgen ist. Möglicherweise spielen neben der unterschiedlichen Proteinumgebung noch andere elektrostatische Wechselwirkungen bei der beobachteten Frequenzverschiebung eine Rolle. So könnte aufgrund der geringeren Mobilität des Labels im NpSRII/NpHtrIIKomplex die C≡N Gruppe leichter durch benachbarte geladene Gruppen beeinflusst werden. 124 4.3 4-Mercaptobenzonitril Eine Möglichkeit wäre die Seitenkette von Arg164, die sich zwei Helixwindungen entfernt zu K157 befindet. Die Frequenzverschiebung wäre somit zum Teil auch anhand des Stark Effekts zu erklären. Der Einfluss einzelner Gruppen auf die C≡N Funktion kann allerdings nur mit Hilfe von Doppelmutanten oder durch strukturbasierte elektrostatische Berechnungen nachgewiesen werden. Die zuvor beschriebene Frequenzverschiebung aufgrund der Bindung des Transducers kann anhand folgender Tabelle nachvollzogen werden. Aufgeführt sind die Position des Absorptionsmaximums sowie die Halbwertsbreite der Absorptionsbande der C≡N Streckschwingungsmode von 4-MBN für alle gelabelten Rezeptor- und Transducermutanten. Tabelle 4.2: Bandenposition und Halbwertsbreite der C≡N Streckschwingungsmode von 4-MBN in den verschiedenen Rezeptor- und Transducermutanten. Δν gibt die Verschiebung des Absorptionsmaximums der C≡N Streckschwingung im NpSRII/NpHtrII-Komplex im Vergleich zum Absorptionsmaximum des an entsprechender Position gelabelten freien Rezeptors an. Die Halbwertsbreite wurde mit Hilfe der Opus Software (Bruker, Ettlingen) berechnet. Die Halbwertsbreite ergibt sich durch den Abstand der Schnittpunkte einer parallel zur lokalen Basislinie verlaufenden Geraden mit der Absorptionsbande von 4-MBN. Mutante Absorptionsmaximum [cm-1] FWHM [cm-1] K157C-4MBN-NpSRII 2231,9 K157C-4MBN-NpSRII / NpHtrII 2227,1 S158C-4MBN-NpSRII 2230,5 S158C-4MBN-NpSRII / NpHrtII 2229,8 I211C-4MBN-NpSRII 2229,9 I211C-4MBN-NpSRII / NpHtrII 2226,7 L213C-4MBN -NpSRII 2227,8 L213C-4-MBN -NpSRII / NpHtRII 2226,7 L90C-4MBN-NpSRII 2230,1 12,8 S153-4MBN-NpSRII 2227,3 9,9 L159-4MBN-NpSRII 2226,1 7,2 Y160-4MBN-NpSRII 2229,6 12,8 F210-4MBN-NpSRII 2230,4 14,4 SRII / V78-4MBN-NpHtrII 2230,1 14,0 SRII / G101-4MBN-NpHtrII 2226,6 8,3 SRII / D115-4MBN-NpHtrII 2226,3 8,1 Δν = 4,8 Δν = 0,7 Δν = 3,2 Δν = 1,1 14,8 11,0 14,2 14,2 14,0 8,8 11,8 8,6 Neben der Lage des Absorptionsmaximums der C≡N Streckschwingungsmode korreliert auch die Halbwertsbreite der Bande gut mit der Proteinumgebung der Sonde. Bei den für Wassermoleküle zugänglichen Labeln ist die Absorptionsbande deutlich verbreitert gegenüber den im Proteininneren verborgenen Molekülen (vgl. Abb. 4.17). In der Wasserphase können 4.3 4-Mercaptobenzonitril 125 mehrere Lösungsmittelmoleküle mit 4-MBN gleichzeitig wechselwirken und Komplexe bilden, die in der Zeitskala des Schwingungsübergangs stabil bleiben (Getahun et al., 2003). Zudem besitzt die IR-Sonde an der Proteinoberfläche eine größere Beweglichkeit, was eine größere Konformationsheterogenität zur Folge hat. Aus diesem Grund konnte auch eine Korrelation zwischen der Halbwertsbreite der Absorptionsbande von 4-MBN, der Lage des Absorptionsmaximums und dem Anteil von Alkoholmolekülen in einem Lösungsmittelgemisch von THF und Methanol beobachten werden (vgl. Abb. 4.12). Abbildung 4.18 verdeutlicht am Beispiel der gelabelten Mutanten von NpSRII sowie NpHtrII den Zusammenhang zwischen der Halbwertsbreite der Absorptionsbande, der Lage des Absorptionsmaximums der C≡N Streckschwingungsmode und der Oberflächenexponiertheit der IRSonde in den gelabelten Proteinen. water 15 S158C-4MBN-SRII / HrtII I211C-4MBN-SRII 14 -1 FWHM [cm ] 13 Y160C-4MBN-SRII 12 L90C-4MBN-SRII L213C-4-MBN -SRII 11 K157C-4MBN-SRII / HtrII 10 S153C-4MBN-SRII 9 I211C-4MBN-SRII / HtrII L213C-4MBN -SRII / HtRII SRII / G101C-4MBN-HtrII SRII / D115C-4MBN-HtrII 8 7 K157C-4MBN-SRII F210C-4MBN-SRII S158C-4MBN-SRII SRII / V78C-4MBN-HtrII L159C-4MBN-SRII protein 2226 2227 2228 2229 2230 -1 2231 2232 wavenumber [cm ] Abb. 4.18: Korrelation zwischen der Halbwertsbreite der Absorptionsbande und der Lage des Absorptionsmaximums der C≡N Streckschwingung von 4-MBN bei den verschiedenen NpSRII- sowie NpHtrII-Mutanten. Die beiden spektralen Parameter zeigen an, ob die IRSonde im Proteininneren verborgen ist oder exponiert zur Lipid- oder Wasserphase ist. Die Abbildung verdeutlicht die Eignung von 4-MBN als Umgebungssonde im NpSRII/NpHtrII-Komplex, da neben der Lage des Absorptionsmaximums ein zweiter spektraler Parameter sensitiv auf die Proteinumgebung reagiert. Anhand dieser beiden Größen kann folglich bestimmt werden werden, ob die IR-Sonde im Proteininneren verborgen oder auf der Oberfläche des Rezeptors exponiert ist. Aufgrund der höheren Mobilität der IR-Sonde an der Proteinoberfläche ist die Halbwertsbreite der Bande allerdings nicht nur in der Wassersondern auch in der Lipidphase verbreitert. Im Fall der gelabelten F210C-NpSRII Mutante, 126 4.3 4-Mercaptobenzonitril bei der das IR-Label ebenfalls in die Lipiphase ragt, liegt das Absorptionsmaximum zudem bei über 2230 cm-1, was vermutlich durch den Einflusses der geladenen Kopfgruppen der Lipiddoppelschicht auf die Frequenz der C≡N Streckschwingungsmode zu erklären ist. Daher ist es schwierig, anhand der beiden spektralen Parameter zu unterscheiden, ob sich die IRSonde in der Lipidphase oder in der Wasserphase befindet. Dies kann an den Positionen des Transducers oder Rezeptors von Bedeutung sein, die an der Grenze zwischen Lipid- und Wasserphase liegen. Dies ist beispielsweise bei der gelabelten NpSRII/V78C-NpHtrII Mutante der Fall, bei der das IR-Label an die letzte helikale Windung der TM2-Helix gebunden ist. Anhand der Form und Lage der C≡N Bande kann daher nicht ausgeschlossen werden, dass die polare C≡N Gruppe der IR-Sonde bei dieser Mutante bis in die Wasserphase reicht. Sowohl die Halbwertsbreite als auch die Lage der Absorptionsbande zeigen allerdings eindeutig, dass die IR-Sonde an dieser Position aus dem 4-Helixbündel des 2:2 Komplexes herausragt und nicht im Proteininneren verborgen ist. Offenbar ist die Helixpackung im Bereich der Transmembranhelices so dicht, dass die Sonde nicht ausreichend Platz im Bereich der Grenzfläche des Dimers findet. Aufgrund der guten Korrelation der Position sowie der Form der Absorptionsbande mit der Lösungsmittelzugänglichkeit der IR-Sonde, sind auch Rückschlüsse auf die Orientierung der IR-Sonde bei den Mutanten möglich, bei denen 4-MBN an die cytoplasmatische HAMP-Domäne des Transducers gebunden ist und für die daher keine genauen strukturellen Informationen zur Verfügung stehen. Sowohl bei der NpSRII/S91C-NpHtrII- als auch der NpSRII/G101C-NpHtrII- sowie der NpSRII/D115C-NpHtrII Mutante zeigen sowohl Lageals auch Halbwertsbreite der C≡N Bande eine hydrophobe Umgebung der Nitrilfunktion an, so dass davon ausgegangen werden kann, dass die IR-Sonde im Inneren der HAMP-Domäne verborgen ist. Bei allen drei Mutanten weist die Absorptionsbande zudem eine breite Schulter auf der hochfrequenten Flanke auf, was auf eine konformelle Heterogenität der HAMPDomäne hindeutet. Dies könnte in Übereinstimmung mit einer dynamischen, molten-globule ähnlichen Struktur der HAMP-Domäne sein, die mit Hilfe von EPR-Messungen nachgewiesen werden konnte (Bordignon et al., 2005; Doebber et al., 2007). Allerdings wäre bei einem echten molten-globule eine hohe Lösungsmittelzugänglichkeit der IR-Sonde im Bereich der flexiblen connector Sequenz zu erwarten, die die beiden amphipatischen Helices eines Monomers miteinander verbindet (siehe Kapitel 1.9). Die geringe Lösungsmittelzugänglichkeit der an die Positionen 101 und 115 gebundenen IR-Sonde deutet hingegen darauf hin, dass die HAMP-Domäne eine zumindest teilweise geordnete Tertiärstruktur aufweist. Auf der anderen Seite könnte bei einer sehr kompakten 4.3 4-Mercaptobenzonitril 127 Konformation im Inneren der HAMP-Domäne - ähnlich wie im Transmembranbereich - nicht ausreichend Platz für die IR-Sonde vorhanden sein. Neben der Interaktion der C≡N Funktion mit dem Lösungsmittel können im Protein auch lokale elektrostatische Felder einen Einfluss auf die Frequenz der C≡N Streckschwingungsmode haben (siehe Kapitel 3.5.2). Dies könnte ebenfalls zur Lage des Absorptionsmaximums bei knapp über 2226 cm-1 bei den zuvor genannten Transducermutanten beitragen, da die HAMP-Domäne mehrere positiv geladene Seitenketten in direkter Nachbarschaft zu den gelabelten Positionen aufweist (siehe Kapitel 4.3.2). Um die Auswirkungen lokaler elektrostatischer Felder auf die Frequenz der C≡N Streckschwingungsmode im Photorezeptor genauer zu untersuchen, wurden bei einigen Rezeptormutanten strukturelle Berechnungen durchgeführt. Ein Einfluss geladener Gruppen auf die Frequenz der C≡N Streckschwingungsmode ist beispielsweise bei der gelabelten L159C-NpSRII Mutante zu erwarten, bei der das Absorptionsmaximum der C≡N Streckschwingungsmode ebenfalls bei etwa 2226 cm-1 liegt (siehe Tablelle 4.3). Die Absorptionsbande der C≡N Streckschwingungsmode ist bei dieser Mutante somit um etwa 3 cm-1 gegenüber der C≡N Bande von in THF gelösten 4-MBN Molekülen verschoben, deren Position aufgrund der Dielektrizitätskonstanten von THF vergleichbar mit der Lage der Absorptionsbande in einer hydrophoben Proteinumgebung sein sollte (siehe Kapitel 4.3.2). Daher ist anzunehmen, dass elektrostatische Wechselwirkungen mit geladenen Gruppen des Proteins zu dieser deutlichen Frequenzverschiebung beitragen. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden strukturelle Berechnungen an dieser Mutante durchgeführt. Hierzu wurde in der Struktur des Dunkelzustandes von NpSRII Leucin159 durch ein Cystein ersetzt und die IR-Sonde 4-MBN über eine Disulfidbindung an das Schwefelatom dieser Aminosäure gebunden. Ausgehend von den möglichen Rotameren der frei drehbaren Einfachbindungen von Cys159 und 4-MBN wurde mit Hilfe eines CHARMM Kraftfelds (Chemistry at HARvard Macromolecular Mechanics) eine Energieminimierung in der Umgebung der IRSonde durchgeführt, bei der die Koordinaten aller Atome im Umkreis von 10 Å zur IR-Sonde variiert wurden. Die dabei erhaltenen energiegünstigsten Strukturen der Mutante wiesen mit einer Ausnahme eine ähnliche Orientierung der IR-Sonde innerhalb des Rezeptors auf, bei der sich die Nitrilfunktion in der Nähe der positiv geladenen Seitenkette von Arg152 befindet. Abbildung 4.19 zeigt die räumliche Nähe der IR-Sonde zu dieser Seitenkette in einer solchen energetisch günstigen Struktur der L159C-4MBN-NpSRII Mutante. 128 4.3 4-Mercaptobenzonitril C159 helix G helix F SS-bridge retinal 4-MBN helix C N R152 Abb. 4.19: Mögliche Orientierung der über eine Disulfidbindung an Cystein 159 gekoppelten IRSonde in der L159C-4MBN-NpSRII Mutante. Die Struktur ist das Ergebnis einer lokalen Energieminimierung in der Umgebung der IR-Sonde unter Verwendung eines CHARMM-Kraftfeldes. Die entsprechenden Berechnungen wurden an der Universität in Bayreuth mit Hilfe von Prof. Ullmann am Lehrstuhl für Biopolymere durchgeführt. Die deutliche Frequenzverschiebung der C≡N Streckschwingungsmode der L159C-NpSRII Mutante zu niedrigeren Wellenzahlen im Vergleich zu den anderen gelabelten NpSRIIMutanten, bei denen sich die IR-Sonde ebenfalls im Proteininneren befindet, kann somit durch die räumliche Nähe der Nitrilfunktion zu einer positiv geladenen Seitenkette anhand des Stark Effekts erklärt werden. Wie bereits zuvor erwähnt, zeigt Abbildung. 4.19 eine energetisch günstige Konformation der IR-Sonde, bei der diese eine ähnliche Orientierung einnimmt wie bei den meisten anderen energetisch günstigen Modellen. Allerdings ist anhand der strukturellen Berechnungen auch eine Konformation möglich, in der die IR-Sonde eine andere Orientierung einnimmt als im dargestellten Modell. Dieser Struktur zufolge ist 4-MBN in Richtung der Schleife zwischen den Helices E und F orientiert. Die Frequenzverschiebung der C≡N Streckschwingungsmode könnte aber auch in dieser Struktur durch die Nähe zu positiv geladenen Seitenketten wie z. B. die von Lys157 erklärt werden. Diese Gruppen haben ein positives Potential in dieser Region des Proteins zur Folge, wie auch anhand von elektrostatischen Berechnungen deutlich wird (siehe unten). 4.3 4-Mercaptobenzonitril 129 Neben der L159C-4MBN-NpSRII Mutante wurden auch strukturelle Berechnungen für die L213C-4MBN-NpSRII Mutante durchgeführt. Im Unterschied zur L159C-4MBN-NpSRII Mutante kann anhand dieser strukturellen Berechnungen allerdings nicht auf eine bevorzugte Orientierung der IR-Sonde geschlossen werden, da die Berechnungen verschiedene energetisch fast gleichwertige Strukturen ergeben haben, in denen die IR-Sonde unterschiedliche Orientierungen einnimmt. Dieses Ergebnis könnte im Zusammenhang mit der asymmetrischen Form der Absorptionsbande der C≡N Streckschwingungsmode bei dieser Mutante stehen, die ebenfalls auf eine konformelle Heterogenität der IR-Sonde hindeutet (siehe Abb.4.15). Obwohl anhand der strukturellen Berechnungen folglich nicht auf eine genaue Orientierung der IR-Sonde innerhalb des Rezeptors geschlossen werden kann, zeigt die Ladungsverteilung innerhalb des Proteins, dass die C≡N Funktion an Position 213 vermutlich durch negativ geladene Gruppen im Protein beeinflusst wird, während sich in der Umgebung der IR-Sonde an Position 159 positiv geladene Gruppen befinden. Das unterschiedliche elektrostatische Potential in der Umgebung der Positionen 159 und 213 des Photorezeptors NpSRII verdeutlicht Abbildung 4.20. Abb. 4.20: Ergebnis von elektrostatischen Berechnungen des Photorezeptors NpSRII. Dargestellt sind die Äquipotentialflächen des Photorezeptors bei -1 kT/e (rot) sowie 1 kT/e (blau). Hervorgehoben sind zudem die Seitenketten von L159 (grau) und L213 (grün). 130 4.3 4-Mercaptobenzonitril In der Abbildung sind die Äquipotentialflächen des Photorezeptors dargestellt. Während in der Umgebung der Seitenkette von Leu159 positives Potential (blau) vorherrscht, befindet sich die Seitenkette von Leu213 im Bereich negativen Potentials (rot). Auch wenn nach den strukturellen Berechnungen unterschiedliche Orientierungen der an Position 213 gebundenen IR-Sonde möglich sind, ist es aufgrund der Verteilung der Äquipotentialflächen wahrscheinlich, dass die C≡N Funktion durch ein negatives Potential beeinflusst wird. Dies trifft insbesondere auf einige der energetisch günstigen Konformationen zu, bei denen die IRSonde im Interface der Helices G und A in Richtung der cytoplasmatischen Schleife zwischen diesen Helices orientiert ist. Die Unterschiede des elektrostatischen Potentials in der Umgebung der Positionen 213 und 159 unterstützen daher die Annahme, dass die unterschiedliche Frequenz der C≡N Streckschwingungsmode bei diesen beiden mit 4-MBN gelabelten Mutanten durch den Stark Effekts zu erklären ist. Auch bei anderen Seitenketten kann der Einfluss geladener Gruppen auf die Frequenz der C≡N Streckschwingung nicht ausgeschlossen werden. So könnten beispielsweise die zu höheren Wellenzahlen verschobenen Absorptionsbanden im Fall der Y160C-Mutante durch Interaktion der C≡N Gruppe mit der negativ geladenen Seitenkette von Asp214 bzw. Glu147 zu erklären sein. Auch bei der deutlichen Frequenzverschiebung im Fall der K157C-NpSRII Mutante infolge der Transducerbindung könnten elektrostatische Wechselwirkungen eine Rolle spielen, wie bereits weiter oben erläutert. Um den Einfluss geladener Gruppen auf die C≡N Streckschwingungsmode bei diesen Mutanten genauer berechnen zu können, sind allerdings aufwendigere Modellberechnungen erforderlich. 4.3 4-Mercaptobenzonitril 131 4.3.4 Differenzspektren der gelabelten NpSRII- sowie NpHtrII-Mutanten 4.3.4.1 K-Intermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren Im nächsten Schritt wurden Differenzspektren der verschiedenen Mutanten gemessen, um Aussagen über Veränderungen der elektrostatischen Umgebung der IR-Sonde infolge von Konformationsänderungen oder elektrostatischer Veränderungen im Verlauf des Photozyklus treffen zu können. Es wurden sowohl K-Intermediat-minus-Dunkelzustand als auch M-Intermediat-minus-Dunkelzustand-Spektren von den gelabelten Mutanten aufgenommen. Beim Übergang vom Dunkelzustand zum K-Intermediat sind die Konformationsänderungen des Photorezeptors ausschließlich auf den Bereich der Retinalbindungstasche beschränkt (siehe Kapitel 1.7.1), so dass Frequenzverschiebungen der C≡N Streckschwingungsmode von 4MBN nur durch elektrostatische Veränderungen im Bereich des Chromophors infolge der Isomerisierung von all-trans-Retinal zu 13-cis-Retinal verursacht werden können. Nach der Isomerisierung des Retinals erfolgt dabei eine geringfügige Umorientierung des Stickstoffatoms der protonierten Schiff Base, wodurch die Salzbrücke zum komplexierten Gegenion Asp75 verändert wird (Edman et al., 2002). Diese elektrostatischen Veränderungen im Bereich der Schiff Base werden auch durch das veränderte Absorptionsmaximum des Chromophors im K-Intermediat im Vergleich zum Dunkelzustand reflektiert. Im Gegensatz zur Protonenpumpe Bacteriorhodopsin ist bei NpSRII die Schiff Basen Bindung allerdings teilweise wieder relaxiert, wodurch größere strukturelle Veränderungen in der Bindungstasche als bei BR ausgelöst werden (Furutani et al., 2006). Die elektrostatischen Veränderungen im Bereich der Schiff Base sind dagegen geringer als bei BR, so dass im Bereich des IR-Labels vermutlich nur sehr geringe Auswirkungen auf die C≡N Streckschwingungsmode zu erwarten sind. Veränderungen der Frequenz der C≡N Streckschwingungsmode können zudem nur bei dejenigen Rezeptormutanten auftreten, bei denen sich die IR-Sonde im Proteininneren befindet, da die elektostatischen Felder vermutlich an der Proteinoberfläche abgeschirmt werden. Dies ist bei der L213C-4MBN- sowie der L159C-4MBN-NpSRII Mutante der Fall (siehe Abb. 4.18). Auch bei Kopplung der IR-Sonde an Position 90 der Helix C sowie Position 160 der Helix F ist die IR-Sonde vermutlich weitgehend im Proteininneren verborgen. Abbildung 4.21a zeigt exemplarisch das K-Intermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektrum der L213C-4MBN-NpSRII Mutante im gesamten Spektralbereich von 1900 cm-1 bis 1000 cm-1, in den weiteren Diagrammen der Abbildung sind zudem die Differenzspektren der gelabelten L213C-4MBN-NpSRII, der L159C-4MBN-NpSRII sowie der L90C-4MBN-NpSRII Mutante im Spektralbereich von 2250 cm-1 bis 2210 cm-1 dargestellt. 132 4.3 4-Mercaptobenzonitril L213C-4MBN-SRII K-Intermediate-minus dark state L213C-4MBN-SRIII K-Intermediat-minus dark state 1 mOD 0,02 mOD Δ absorption Δ absorption CN-stretching vibration a) b) 2220 2215 2210 2600 2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 2250 2245 2240 2235 2230 2225 -1 wavenumber [cm ] -1 wavenumber [cm ] K-Intermediat-minus dark state L159C-4MBN-SRII K-Intermediate-minus dark state 0,02 mOD L90C-4MBN-SRIII Δ absorption Δ absorption 0,02 mOD d) c) 2250 2245 2240 2235 2230 2225 2220 2215 22102250 2245 2240 2235 2230 2225 2220 2215 2210 -1 wavenumber [cm ] -1 wavenumber [cm ] Abb. 4.21: K-Intermediat-minus-Dunkelzustand Spektrum der L213C-4MBN-SRII Mutante im Spektralbereich von 2600 cm-1 bis 1000 cm-1 (a) sowie im Spektralbereich zwischen 2250 cm-1 bis 2210 cm-1 (b). Im selben Spektralbereich sind auch die Differenzspektren der L159C-4MBN-NpSRII (c) sowie der L90C-4MBN-NpSRII Mutante dargestellt (d). Alle Spektren wurden bei 95 K aufgenommen und sind wie alle folgenden Differenzspektren auf die Chromophorbanden im Fingerprintbereich normiert. Trotz der nur relativ geringen elektrostatischen Veränderungen im Bereich der Schiff Base ist eine kleine Differenzbande der C≡N Streckschwingungsmode bei der L213C-4MBN Mutante von NpSRII zu erkennen, was verdeutlicht, wie sensitiv die C≡N Streckschwingungsmode auf geringe Veränderungen lokaler elektrostatischer Felder innerhalb des Photorezeptors reagiert. Die Differenzbande signalisiert dabei eine geringe Verschiebung der C≡N Bande zu niedrigeren Wellenzahlen beim Übergang zum K-Intermediat. Die geringe Intensität der Differenzbande zeigt aber, dass der Einfluss auf die C≡N Streckschwingungsmode nur sehr klein ist und mit der verwendeten Methode gerade noch detektiert werden kann. Da die IRSonde bei Kopplung der Sonde an Position 213 der Helix G offenbar elektrostatische Veränderungen im Bereich des Chromophors detektieren kann, ist zu erwarten, dass die Frequenz der C≡N Streckschwingungsmode von 4-MBN an dieser Position auch durch die 4.3 4-Mercaptobenzonitril 133 stärkeren elektrostatischen Veränderungen der Schiff Basen Region im weiteren Verlauf des Photozyklus beeinflusst wird. Insbesondere die Protonenübertragung von der Schiff Base auf das Gegenion Asp75 sollte Auswirkungen auf das elektrostatische Potential in der Umgebung der an diese Position gebundenen IR-Sonde haben. Im Gegensatz zur L213C-4MBN-NpSRII Mutante konnte an den weiteren gelabelten Positionen der Helix G keine signifikante Differenzbande der C≡N Streckschwingungsmode von 4-MBN beobachtet werden. Dies ist vermutlich dadurch zu erklären, dass die IR-Sonde bei diesen Mutanten nicht vollständig im Proteininneren verborgen ist, sondern in die Lipidphase ragt. Auch bei der L90C-4MBN-NpSRII sowie der L90C-4MBN-NpSRII Mutante, bei denen die IR-Sonde an Helix F respektive Helix C gebunden ist, konnte keine Frequenzverschiebung bei der C≡N Streckschwingungsmode von 4-MBN zu Beginn des Photozyklus beobachtet werden, obwohl bei beiden Mutanten die IR-Sonde zum Proteininneren orientiert ist. Dies beweist, dass die Nitrilfunktion bei den entsprechenden Mutanten zu weit von der Bindungsregion des Chromophors entfernt ist, um geringe elektrostatische Veränderungen in dieser Region detektieren zu können. Später erfolgende Veränderungen, wie die Deprotonierung der Schiff Base und die Protonierung des Gegenions könnten allerdings weiter reichende Wirkung haben und die C≡N Streckschwingungsmode an diesen Positionen beeinflussen. 4.3.4.2 M-Intermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren Im Gegensatz zum K-Intermediat sind die strukturellen und elektrostatischen Veränderungen im Rezeptor nicht auf die Schiff Basen Region begrenzt und sollten daher an verschiedenen gelabelten Positionen Auswirkungen auf die C≡N Streckschwingungsmode von 4-MBN haben. Beim Übergang vom L-Intermediat zum frühen M-Intermediat erfolgt zunächst die Deprotonierung der Schiff Base und die Protonierung von Asp75, was Auswirkungen auf das Wasserstoffbrückennetzwerk des komplexierten Gegenions hat und auch in einiger Entfernung zur Schiff Basen Region mit der IR-Sonde zu detektieren sein sollte. Beim Übergang vom frühen zum späten M-Intermediat erfolgen dann die wesentlichen Konformationsänderungen im Rezeptor, die zur Aktivierung des Transducers führen. Beim späten M-Intermediat sowie dem O-Intermediat handelt es sich daher um den aktiven Signalzustand des Komplexes. Die wesentlichen Konformationsänderungen des Rezeptors während des M-Intermediats konnten mittlerweile durch zahlreiche strukturelle und spektroskopische nachgewiesen werden (siehe Kapitel 1.7.2). So deuten beispielsweise EPRMessungen auf eine Auswärtbewegung der Helix F, verbunden mit einer Rotation der TM2Helix des Transducers während des M-Intermediats hin (Wegener et al., 2000; Wegener et 134 4.3 4-Mercaptobenzonitril al., 2001; Bordignon et al., 2007). Nach wie vor ungeklärt ist allerdings die Frage, ob die Auswärtsbewegung der Helix F auch in Gegenwart des Transducers erfolgt oder ob sie durch die Interaktion mit dem Transducer unterbunden wird (siehe Kapitel 1.8). Auch in der ersten HAMP-Domäne des Transducers erfolgen im aktiven Zustand vermutlich strukturelle Veränderungen, die infolge der Veränderung der elektrostatischen Umgebung der Sonde mittels FTIR-Differenzspektroskopie zu beobachten sein sollten. Auch hier ist der genaue Mechanismus der Signalamplifikation in der HAMP-Domäne bisher ungeklärt (siehe Kapitel 1.9). Um den Einfluss der elektrostatischen und strukturellen Veränderungen auf die Frequenz der C≡N Streckschwingung an den verschiedenen Positionen des Rezeptors und Transducers zu untersuchen, wurden Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren von allen gelabelten Mutanten von NpSRII und NpHtrII gemessen. Abbildung 4.22 zeigt beispielhaft das Photointermediat-minus-Dunkelzustand Spektrum der L90C-4MBN-NpSRII Mutante. Photointermediate minus dark state Photointermediate minus dark state CN stretching vibration Δ absorption Δ absorption CN stretching vibration 2 mOD 0,02 mOD a) b) 2600 2400 2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 2300 2280 2260 2240 2220 2200 2180 2160 2140 2120 2100 wavenumber [cm-1] -1 wavenumber [cm ] Abb. 4.22: Photointermediate-minus-Dunkelzustand Differenzspektrum der L90C-4MBN-SRII Mutante im gesamten gemessenen Spektralbereich von 2700 cm-1 bis 1000 cm-1 bei 283 K (a) sowie Detailansicht im Bereich von 2300 cm-1 bis 2100 cm-1 (b). Die Differenzbande der C≡N Streckschwingung verdeutlicht, dass infolge der Belichtung die Absorptionsbande der C≡N Streckschwingungsmode im Photointermediat geringfügig zu kleineren Wellenzahlen gegenüber dem Dunkelzustand verschoben ist. Die Frequenzverschiebung ist dabei aber so gering, dass sich die Lagen der Absorptionsmaxima im Dunkelzustand und im Photointermediat nur um etwa 0,1 cm-1 unterscheiden. Die geringe Frequenzverschiebung lässt daher vermuten, dass sich die Orientierung der IR-Sonde im Photorezeptor während des Photozyklus nicht wesentlich verändert. Insbesondere eine veränderte Lösungsmittelzugänglichkeit der Sonde im M-Intermediat infolge von Konformationsänderungen würde vermutlich aufgrund der hohen Sensitivität der C≡N Streckschwingungsmode für Wechselwirkungen der C≡N Funktion mit Wassermolekülen eine wesentlich größere Frequenzverschiebung zur Folge haben. Auch bei den Differenzspektren der weiteren Rezeptor- und 4.3 4-Mercaptobenzonitril 135 Transducermutanten ist nur eine relativ geringe Frequenzverschiebung zu beobachten. Dabei besteht eine eindeutige Korrelation zwischen der Position der IR-Sonde innerhalb des Komplexes und der Verschiebung der Absorptionsbande von 4-MBN infolge der Photoaktivierung des Rezeptors. So ist die Absorptionsbande bei Bindung der IR-Sonde an Helix G im Photointermediat gegenüber dem Dunkelzustand zu höheren Wellenzahlen, bei Bindung an Helix F dagegen zu niedrigeren Wellenzahlen verschoben. Bei allen gemessenen Transducermutanten ist dagegen fast keine Verschiebung der C≡N Bande zu beobachten. Abbildung 4.23 zeigt die geringfügige Verschiebung der Absorptionsbande infolge der Photoaktivierung am Beispiel der gelabelten L213C-NpSRII sowie der L159C-NpSRII Mutante sowie die Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren aller NpSRII- und NpHtrII Mutanten. light-induced shift helix G helix G mutants M-Intermediate dark state helix F dark state M-Intermediate L159C-4MBN-SRII (dark state) L159C-4MBN-SRII (M-Intermediate) Δ absorption absorption 0,05 mOD L213C-4MBN-SRII (dark state) L213C-4MBN-SRII (M-Intermediate) 1 mOD F210C-4MBN-SRII I211C-4MBN-SRII L213C-4MBN-SRII a) b) 2250 2245 2240 2235 2230 2225 2220 2215 2210 2205 2200 2250 wavenumber [cm-1] 2245 2240 2235 2230 2220 2215 2210 wavenumber [cm-1] L159C-4MBN-SRII helix F mutants 2225 SRII / G101C-4MBN-HtrII SRII / D115C-4MBN-HtrII SRII / V78C-4MBN-HtrII transducer mutants Y160C-4MBN-SRII S158C-4MBN-SRII Δ absorption Δ absorption K157C-4MBN-SRII 0,05 mOD 0,05 mOD c) 2250 2245 2240 2235 2230 2225 wavenumber [cm-1] 2220 2215 2210 2250 d) 2245 2240 2235 2230 2225 wavenumber [cm-1] 2220 2215 2210 Abb. 4.23: a) Geringfügige Verschiebung der Absorptionsbande der C≡N Streckschwingungsmode von 4-MBN bei der L213C-4MBN-NpSRII Mutante bzw. zu niedrigeren Wellenzahlen bei der L159C-4MBN-NpSRII Mutante infolge der Photoaktivierung des Rezeptors. b) Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren von Rezeptormutanten mit an Helix G gekoppelten IR-Sonden im Spektralbereich von 2250 cm-1 bis 2210 cm-1. c) Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren von Rezeptormutanten mit an Helix F gekoppelten IR-Sonden im Spektralbereich von 2250 cm-1 bis 2210 cm-1. d) M-Intermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren von Transducermutanten im Spektralbereich von 2250 cm-1 bis 2210 cm-1. 136 4.3 4-Mercaptobenzonitril Die Abbildung verdeutlicht, dass die Absorptionsbande der C≡N Streckschwingungsmode bei allen Rezeptormutanten, bei denen die IR-Sonde an Helix G gebunden ist, zu höheren Wellenzahlen verschoben ist. Die Stärke der Frequenzverschiebung ist dabei unabhängig von der Orientierung der Sonde relativ zur Helixachse. Sowohl die I211C-4MBN-NpSRII Mutante, bei der sich die Sonde vermutlich im Interface zwischen Protein- und Lipidphase befindet, als auch die L213C-4MBN-NpSRII Mutante, bei der die Nitrilfunktion der IRSonde im Proteininneren verborgen ist, weisen eine ähnliche Differenzbande der C≡N Streckschwingungsmode auf. Die Orientierung der IR-Sonde zu anderen Bereichen des Proteins spielt bei der beobachteten Frequenzverschiebung offenbar keine Rolle, was darauf hindeutet, dass die Differenzbande bei diesen Mutanten nicht aus einer Konformationsänderung des Rezeptors resultiert. Wahrscheinlich sind stattdessen weit reichende elektrostatische Veränderungen im Protein die Ursache für die beobachtete Frequenzverschiebung der C≡N Streckschwingungsmode bei den an Helix G gekoppelten IR-Sonden. Dies könnte auch die geringere Intensität der Differenzbande der F210C-4MBN-NpSRII Mutante erklären, bei der die IR-Sonde vermutlich von allen drei Mutanten die größte Oberflächenexponiertheit aufweist. Die Verschiebung des Absorptionsmaximums der C≡N Streckschwingungsmode nach der Photoaktivierung beträgt bei der L213C-4MBN Mutante des Photorezeptors etwa 0,15 cm-1. Bei einer Stark Tuning Rate von 0,74 cm-1/(MV/cm) würde diese Frequenzverschiebung einer Veränderung der elektrischen Feldstärke von etwa 0,2 MV/cm entsprechen, wobei der elektrische Feldvektor parallel zur Achse der C≡N Funktion orientiert ist (siehe Kapitel 3.5.2). Eine solche Veränderung des elektrostatischen Potentials kann innerhalb von Proteinen durch Veränderungen des Protonierungszustands geladener Gruppen verursacht werden (Suydam und Boxer, 2003). Da die Schiff Base im M-Intermediat deprotoniert und das Gegenion Asp75 protoniert wird und bereits das K-Intermediat-minusDunkelzustand Differenzspektrum der L213C-4MBN Mutante von NpSRII durch elektrostatische Veränderungen in der Schiff Basen Region beeinflusst wird, könnten die beobachteten Differenzbanden auf diese Reaktion zurückzuführen sein. Die beobachtete Verschiebung der C≡N Bande zu höheren Wellenzahlen ist dabei in Übereinstimmung mit dem Verlust der positiven Ladung am Stickstoffatom der Schiff Base infolge der Protonenübertragung. Elektrostatische Berechnungen haben bestätigt, dass das Differenzpotential zwischen den Zuständen vor und nach der Protonenübertragung im Bereich der Position 213 des Rezeptors negativ ist, wie Abbildung 4.24 zeigt. 4.3 4-Mercaptobenzonitril 137 L213 Abb. 4.24: Veränderung des elektrostatischen Potentials des Photorezeptors NpSRII infolge der Protonenübertragung von der Schiff Base zu Asp75. Dargestellt sind die Äquipotentialflächen, die eine Veränderung des Potentials um +1kT/e (blau) bzw. um -1kT/e (rot) zwischen den beiden Zuständen anzeigen. Die durch die Potentialänderung verursachte Veränderung des elektrostatischen Feldes an Position 213 liegt den Berechnungen zufolge in der Größenordnung des aufgrund der Frequenzverschiebung der C≡N Streckschwingung erwarteten Wertes von ca. 0,2 MV/cm. Für eine exakte Berechnung müsste jedoch die genaue Orientierung der IR-Sonde im Bezug auf den elektrischen Feldvektor bekannt sein. Strukturelle Berechnungen dieser Mutante haben allerdings ergeben, dass verschiedene Orientierungen der IR-Sonde an dieser Position möglich sind (siehe Kapitel 4.3.3). Um den Zusammenhang zwischen der beobachteten Frequenzverschiebung der C≡N Streckschwingungsmode bei der L213C-4MBN-NpSRII Mutante und der Deprotonierung der Schiff Base nachzuweisen, wurden gelabelte Doppelmutanten exprimiert, bei denen das Gegenion Asp75 durch ein Asparagin ersetzt wurde, so dass die Übertragung des Protons nicht stattfinden kann. Dezufolge sollte auch keine entsprechende Verschiebung der C≡N Bande bei der an Position 213 gelabelten Doppelmutante nach der Photoaktivierung zu beobachten sein. Die Ergebnisse der Messungen mit den untersuchten Doppelmutanten sind im nächsten Kapitel dargestellt (siehe Kapitel 4.4) Im Unterschied zu den Mutanten, bei denen die IR-Sonde an Helix G gebunden ist, hat bei Bindung der IR-Sonde an Cysteinreste der Helix F die Orientierung der Sonde relativ zur Helixachse und somit die Lösungsmittelzugänglichkeit einen Einfluss auf die Frequenzver- 138 4.3 4-Mercaptobenzonitril schiebung der C≡N Streckschwingungsmode infolge der Photoaktivierung des Rezeptors. Die Absorptionsbande der C≡N Streckschwingung ist sowohl bei der L159C-4MBN als auch der Y160C-4MBN Mutante von NpSRII, bei denen die Sonde im Proteininneren verborgen ist, zu niedrigeren Wellenzahlen verschoben (siehe Abb. 4.23b). Dagegen ist die Frequenz der C≡N Streckschwingungsmode bei den beiden Rezeptormutanten S158C-4MBN-NpSRII sowie K157C-4MBN-NpSRII im Photointermediat gegenüber dem Dunkelzustand fast nicht verändert. Bei beiden Mutanten weist die IR-Sonde eine gute Zugänglichkeit für das Lösungsmittel auf (vgl. Abb. 4.18). Diese Beobachtung könnte im Zusammenhang mit Konformationsänderungen der Helix F im Verlauf des Photozyklus stehen. Während im Proteininneren bereits kleinere Konformationsänderungen eine Veränderung der elektrostatischen Umgebung der Sonde infolge einer anderen Orientierung der Nitrilfunktion zu geladenen Gruppen oder einer veränderten Lösungsmittelzugänglichkeit haben können, verändert sich die elektrostatische Umgebung von 4-MBN in der Wasserphase vermutlich nicht. Auch bei früheren EPR-Messungen konnte die Auswärtsbewegung der Helix F vor allem bei denjenigen NpSRII-Mutanten nachgewiesen werden, bei denen sich das Nitroxid Spin Label im Proteininneren befindet. Insbesondere die veränderte Mobilität des an Position 159 gekoppelten Spin Labels, weist auf eine Auswärtsbewegung der Helix F hin, während bei Bindung des Labels an Position 157 keine Mobilitätsveränderung beobachtet werden konnte (Bordignon et al., 2007; Wegener et al., 2000). Auch bei Bindung des SpinLabels an Position 158, das sich an der Oberfläche der Helix F befindet, konnte nur eine geringere Mobilitätsveränderung als an Position 159 beobachtet werden. Trotz der guten Übereinstimmung mit früheren EPR-Messungen müssen die erhaltenen Ergebnisse vorsichtig interpretiert werden, da bei der IR-Sonde auch weit reichende elektrostatische Veränderungen Auswirkungen auf die Frequenz der C≡N Streckschwingungsmode haben können. Zudem sind die beobachteten Frequenzverschiebungen nur sehr klein, so dass bei keiner Mutante auf eine deutliche Veränderung der Lösungsmittelzugänglichkeit infolge der Konformationsänderungen geschlossen werden kann. Um einen möglichen Einfluss der elektrostatischen Veränderungen im Bereich der Schiff Base auf die C≡N Streckschwingungsmode von 4-MBN an den Positionen 158 und 159 auszuschließen, wurden auch in diesem Fall Doppelmutanten hergestellt, bei denen neben der Cysteinmutation auch Asp75 durch ein Asparagin ersetzt wurde (siehe Kapitel 4.4). Im Vergleich zu den Rezeptormutanten, weisen die gelabelten Transducermutanten nur äußerst kleine Differenzbanden der C≡N Streckschwingung auf (siehe Abb. 4.23d). Lediglich bei der NpSRII/V78C-4MBN-NpHtrII Mutante ist eine geringfügige Rotverschiebung der 4.3 4-Mercaptobenzonitril 139 Frequenz der C≡N Streckschwingungsmode im Photointermediat gegenüber dem Dunkelzustand zu beobachten. Diese kleine Veränderung des elektrostatischen Potentials in der Umgebung der IR-Sonde könnte im Zusammenhang mit der mittels EPR-Messungen und der Kristallstruktur des aktiven Zustands detektierten Rotation der TM2-Helix infolge der Aktivierung des Transducers um 15° sowie einer kleinen Translationsbewegung dieser Helix stehen (Wegener et al., 2001; Moukhametzianov et al., 2006). Die EPR-Messungen haben eine Licht induzierte Abstandsvergrößerung der Spin Label an Position 78 und 78´ der beiden TM2-Helices des Dimers infolge der konzertierten Rotation dieser Helices ergeben. Im Gegensatz zum EPR-Spin Label ist das IR-Label an dieser Position allerdings offenbar mehr an der Oberfläche des 4-Helix-Bünbdels exponiert, wodurch zusammen mit den nur kleinen Konformationsänderungen der TM2-Helix die geringe Intensität der Differenzbande zu erklären ist. Die Differenzspektren der Transducermutanten, bei denen die IR-Sonde an die erste HAMPDomäne des Transducers gebundenen ist, zeigen dagegen nahezu keine Veränderung des elektrostatischen Potentials in der Umgebung der Nitrilfunktion an. Diese Ergebnisse sind daher nicht in Übereinstimmung mit dem kürzlich vorgeschlagenen Modell, nachdem die Signalamplifikation in der HAMP Domäne durch eine Verschiebung des Gleichgewichts zwischen zwei unterschiedlichen Konformationen infolge der Aktivierung des Transducers erfolgt (siehe Kapitel 1.9). Ein Wechsel zwischen einer dynamischen molten-globule ähnlichen Konformation und einer kompakten Konformation mit einer geordneten Tertiärstruktur hätte vermutlich eine veränderte Lösungsmittelzugänglichkeit der IR-Sonde und damit eine signifikante Verschiebung der C≡N Bande zur Folge. Solch eine Verschiebung der Absorptionsbande konnte auch nicht durch eine Erhöhung der Salzkonzentration induziert werden, die ebenfalls einen Wechsel zwischen den beiden Konformationen zur Folge haben sollte (Doebber et al., 2008). Die sehr geringe Intensität der Differenzbande der C≡N Streckschwingungsmode bei der D115C-4MBN-NpHtrII Mutante zeigt stattdessen nur sehr kleine Konformationsänderungen der HAMP-Domäne infolge der Aktivierung des Transducers an und ist daher eher in Übereinstimmung mit dem von Hulko et al. vorgeschlagenen Modell, nach dem bei der Aktivierung der HAMP-Domäne nur kleine Konformationsänderungen in Form von konzertierten Helixrotationen erfolgen (Hulko et al., 2008). Konformationsänderungen des Transducers könnten auch Auswirkungen auf die C≡N Streckschwingung von 4-MBN bei Rezeptormutanten haben, bei denen die IR-Sonde in Kontakt mit dem Transducer steht. Bereits die Verschiebung der Absorptionsbande der C≡N Streckschwingungsmode infolge der Bindung des Transducers beweist den Einfluss des Transducers 140 4.3 4-Mercaptobenzonitril auf die C≡N Streckschwingung bei einigen Rezeptormutanten (siehe Abb. 4.17). Durch die Messung von Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren des gelabelten Rezeptors im Komplex mit NpHtrII können auch Informationen darüber gewonnen werden, ob die Konformationsänderungen des Transducers durch die Interaktion mit dem Transducer beeinflusst werden. Abbildung 4.25 zeigt die Differenzspektren der gelabelten NpSRII-Mutanten im Komplex mit NpHtrII sowie der gleichen Mutanten des ungebundenen Rezeptors. L213C-4MBN-SRII L213C-4MBN-SRII/HtrII I211C-4MBN-SRII I211C-4MBN-SRII/HtrII 0,04 mOD Δ absorption Δ absorption 0,04 mOD a) 2250 2245 2240 2235 2230 2225 wavenumber [cm-1] 2220 2215 b) 2210 2250 2245 2240 2235 2230 2225 wavenumber [cm-1] 2220 2215 2210 K157C-4MBN-SRII K157C-4MBN-SRII/HtrII L159C-4MBN-NpSRII L159C-4MBN-NpSRII/NpHtrII 0,04 mOD Δ absorption Δ absorption 0,04 mOD d) c) 2250 2245 2240 2235 2230 2225 -1 wavenumber [cm ] 2220 2215 22102250 2245 2240 2235 2230 2225 wavenumber [cm-1] 2220 2215 2210 Abb. 4.25: Photointermediat-Intermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren im Spektralbereich von 2250 cm-1 bis 2210 cm-1 der ungebundenen Rezeptormutanten sowie der an identischer Position gelabelten NpSRII-Mutanten im Komplex mit NpHtrII bei 283K. Die Abbildung verdeutlicht, dass sich die Differenzbande der C≡N Streckschwingungsmode bei allen 4 Mutanten infolge der Bindung des Transducers nur unwesentlich verändert. Bei den Mutanten, bei denen die IR-Sonde an Helix G gebunden ist, ist dieses Ergebnis in Übereinstimmung mit der Hypothese, dass die Differenzbande durch die Protonenübertragung von der Schiff Base zum Gegenion Asp75 verursacht wird. Diese weit reichenden elektrostatischen Wechselwirkungen können natürlich auch im Komplex mit NpHtrII einen Einfluss auf die C≡N Streckschwingungsmode haben. An Position I211 könnte die Auswirkungen auf die C≡N Streckschwingungsmode im Komplex sogar noch größer sein, da die IR-Sonde durch die 4.3 4-Mercaptobenzonitril 141 Bindung von NpHtrII vermutlich eine geringere Oberflächenexponiertheit besitzt und elektrostatische Felder im Proteininneren eine größere Reichweite haben sollten. Interessanterweise ist die Lage der Differenzbande an dieser Position im Komplex gegenüber dem ungebundenen Rezeptor nicht verändert, obwohl die Absorptionsbande der C≡N Streckschwingungsmode deutlich verschoben ist (siehe Tabelle 4.2). Dies könnte darauf zurückzuführen sein, dass ein Gleichgewicht zwischen unterschiedlichen Konformationen des IRLabels existiert. Auch die deutliche Schulter auf der hochfrequenten Flanke der C≡N Bande ist ein Hinweis auf unterschiedliche Populationen der Sonde. Im Gegensatz zur L213C-4MBN, sowie der I211C-4MBN Mutante des Rezeptors erfolgt bei der L159C-4MBN sowie der K157C-4MBN Mutante von NpSRII die Bindung von 4-MBN an die Helix F des Rezeptors, so dass die beobachteten Differenzbanden eventuell durch die Auswärtsbewegung dieser Helix verursacht werden. Dabei ist nach wie vor die Frage ungeklärt, ob die Auswärtsbewegung von Helix F durch die Bindung des Transducers unterbunden wird (siehe Kapitel 1.8). Während FTIR-spektroskopische sowie kristallographischen Studien darauf hindeuten, dass keine Auswärtsbewegung dieser Helix in Gegenwart des Transducers erfolgt (Moukhametzianov et al., 2006; Kamada et al., 2006), zeigen verschiedene EPR-Messungen sowie eine weitere FTIR-spekroskopische Studie keine Unterbindung von Konformationsänderung des Rezeptors infolge der Bindung des Transducers an (Bordignon et al., 2007, Wegener et al., 2000; Bergo et al., 2003). Sollte die Differenzbande der C≡N Streckschwingungsmode an Position 159 tatsächlich durch eine Bewegung dieser Helix hervorgerufen werden, kann anhand dieser Ergebnisse darauf geschlossen werden, dass die Auswärtsbewegung der Helix F auch im Komplex mit dem Transducer erfolgen kann. Darauf deutet insbesondere die gegenüber dem freien Rezeptor nur geringfügig veränderte Differenzbande im Spektrum des L159C-4MBN-NpSRII/NpHtrIIKomplexes hin. Lediglich die geringere Intensität der Differenzbande sowie die kleinere Wellenzahldifferenz zwischen Maximum und Minimum der Differenzbande im NpSRII/NpHtrIIKomplex könnte ein Hinweis darauf sein, dass Konformationsänderungen im Bereich der Helix F durch die Bindung des Transducers eingeschränkt sind. Auch die kleine Differenzbande bei 2226(-) cm-1/2225(+) cm-1 im Spektrum des K157-4MBN-NpSRII/NpHtrII Komplexes könnte auf Konformationsänderungen der Helix F zurückzuführen sein. Die geringe Intensität der Bande könnte darauf zurückzuführen sein, dass unterschiedliche Orientierungen des IR-Labels an dieser Position möglich sind. Auch für das EPR-Spin Label konnten an dieser Position mindestens zwei unterschiedliche Konformationen infolge einer anisotropen Bewegung der Seitenkette nachgewiesen werden (Wegener et al., 2000). Für die 142 4.3 4-Mercaptobenzonitril IR-Sonde ist nur für solche Populationen eine Differenzbande zu erwarten, bei der die IRSonde im Proteininneren verborgen ist. Ist die Nitrilfunktion dagegen zum Lösungsmittel hin exponiert, wie im Fall des ungebundenen Rezeptors, können Konformationsänderungen des Rezeptors mit der IR-Sonde nicht detektiert werden. 4.3.5 Schlussfolgerungen Die Untersuchungen mit 4-MBN als Infrarotsonde haben bestätigt, dass die Frequenz der C≡N Streckschwingungsmode in einem Protein sowohl durch lokale elektrostatische Felder als auch durch Interaktionen der Nitrilfunktion mit dem umgebenden Lösungsmittel beeinflusst werden kann. Bereits die Absorptionsspektren von 4-MBN in verschiedenen protischen und nicht-protischen Lösungsmitteln zeigen, dass die Frequenz der C≡N Streckschwingungsmode sowohl durch die dielektrische Umgebung als auch durch spezifische Interaktionen mit dem Lösungsmittels beeinflusst wird. Insbesondere infolge der Bildung einer Wasserstoffbrückenbindung zwischen der C≡N Funktion und der Hydroxtylfunktion eines Alkoholmoleküls wird die Frequenz der C≡N Streckschwingungsmode deutlich erhöht. Neben der Frequenzverschiebung ist auch eine deutliche Verbreiterung der C≡N Bande infolge der Interaktion mit protischen sowie dipolaren Lösungsmittelmolekülen zu beobachten, da verschiedene Komplexe gebildet werden können, die in der Zeitskala des Schwingungsübergangs stabil sind. Um den Einfluss solcher spezifischer Interaktionen sowie weit reichender elektrostatischer Wechselwirkungen auf die C≡N Streckschwingungsmode auch innerhalb eines Proteins zu untersuchen, wurde die IR-Sonde über Disulfidbindungen an verschiedene Cysteinmutanten des Photorezeptors NpSRII gebunden. Rückschlüsse über die Position der Sonde sind dabei sowohl mit Hilfe der zur Verfügung stehenden Kristallstrukturen als auch anhand früherer EPR-Messungen möglich, bei denen die identischen Positionen des Rezeptors mit EPR Spin-Labeln markiert wurden. Sowohl die Lage des Absorptionsmaximums als auch die Halbwertsbreite der Absorptionsbande der C≡N Streckschwingungsmode zeigen eine deutliche Abhängigkeit von der Lösungsmittelzugänglichkeit der IR-Sonde innerhalb des Photorezeptors. Dies wird insbesondere durch die deutliche Verschiebung der Absorptionsbande infolge der Bindung des Transducers an NpSRII-Mutanten deutlich, bei denen die IR-Sonde im ungebundenen Rezeptor von Wassermolekülen umgeben ist und im NpSRII/NpHtrII-Komplex eine hydrophobe Proteinumgebung aufweisen. Auch bei einem Zugang der C≡N Funktion zur Lipidphase ist die C≡N Bande gegenüber 4-MBN Molekülen im Proteininneren zu höheren Wellenzahlen verschoben. Dies ist vermutlich aufgrund des Einflusses der geladenen Kopfgruppen der Lipide auf die Frequenz der C≡N Streckschwingungsmode zurückzuführen. Auch im Inne- 4.3 4-Mercaptobenzonitril 143 ren des Proteins hat die räumliche Nähe zu einigen geladenen Gruppen im Protein Einfluss auf die Frequenz der C≡N Streckschwingungsmode. So könnte beispielsweise die räumliche Nähe der an Position 159 gebundenen IR-Sonde zur Seitenkette von K152 die Ursache für die gegenüber den anderen Mutanten deutlich zu niedrigeren Wellenzahlen verschobene Absorptionsbande sein. Näheren Aufschluss könnten strukturbasierte elektrostatische Berechnungen bringen, die in näherer Zukunft an dieser Mutante durchgeführt werden sollen. Der Einfluss geladener Gruppen auf die C≡N Streckschwingungsmode konnte auch mit Hilfe der reaktionsinduzierten FTIR-Spektroskopie nachgewiesen werden. Die kleine Differenzbande der C≡N Streckschwingungsmode im K-Intermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektrum bei der L213C-4MBN-NpSRII Mutanten belegt, dass elektrostatische Veränderungen im Bereich der Schiff Base Auswirkungen auf die Frequenz der C≡N Streckschwingungsmode von 4-MBN an dieser Position haben. Dies legt nahe, dass auch die größeren elektrostatischen Veränderungen im Bereich der Schiff Base im weiteren Verlauf des Photozyklus von der IR-Sonde an dieser Position detektiert werden können. Die beobachtete Erhöhung der Frequenz der C≡N Streckschwingungsmode im Photoprodukt gegenüber dem Dunkelzustand bei dieser Mutante könnte daher durch die Deprotonierung der Schiff Base beim Übergang zum M-Intermediat zu erklären sein. Im Gegensatz zu den Mutanten, bei denen die IR-Sonde an Helix G gebunden wurde, ist bei Kopplung der IRSonde an Helix F die Frequenzveränderung der C≡N Streckschwingungsmode nach der Photoaktivierung des Rezeptors von der Orientierung der IR-Sonde relativ zur Helixachse abhängig. Dies kann darauf zurückgeführt werden, dass im homogenen Lösungsmittel Konformationsänderungen des Receptors keine großen Auswirkungen auf das elektrostatische Potential in der Umgebung der IR-Sonde haben, während im Proteininneren wesentlich größere Variationen des elektrostatischen Potentials auftreten können. Um auszuschließen, dass die beobachteten Differenzbanden nicht durch elektrostatische Veränderungen im Bereich der Schiff Base verursacht werden, wurden die Auswirkungen einer Mutation des Gegenions Asp75 auf die C≡N Streckschwingungsmode bei den an Positionen 158 sowie 159 gelabelten Rezeptormutanten untersucht. Mit Hilfe einer solchen Doppelmutante sollte auch der Einfluss von Asp75 sowie der protonierten Schiff Base auf die C≡N Streckschwingung der an Position 213 gebundenen IR-Sonde nachgewiesen werden. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind im nächsten Kapitel dargestellt und werden dort diskutiert. 144 4.4 Untersuchung des Einflusses elektrostatischer Felder…… 4.4 Untersuchung des Einflusses elektrostatischer Felder auf die C≡N Streckschwingungsmode von 4-MBN mit Hilfe der gelabelten Gegenionmutante D75N-NpSRII 4.4.1 Absorptionsspektren der gelabelten Doppelmutanten Um zu untersuchen, welchen Einfluss eine Ladungsveränderung im Bereich der Schiff Base auf die elektrostatische Umgebung der IR-Sonde in den verschiedenen mit 4-MBN gelabelten NpSRII-Mutanten hat, wurden zunächst die Absorptionsspektren von 4 gelabelten Doppelmutanten gemessen, bei denen im Vergleich zu den Einfachmutanten zusätzlich das negativ geladene Gegenion Asp75 der protonierten Schiff Base durch ein ungeladenes Asparagin ersetzt wurde. Durch die Unterbrechung der Salzbrücke zwischen komplexiertem Gegenion und protonierter Schiff Base wird folglich bereits im Dunkelzustand die Ladungsverteilung im aktiven Zentrum verändert, wodurch das Absorptionsmaximum der D75N-NpSRII-Mutante gegenüber dem Wildtyp Rezeptor zu höheren Wellenlängen verschobenen ist (Hein, 2002). Zudem kann die Übertragung des Protons der Schiff Base auf Asp75 beim Übergang zum M-Intermediat nicht stattfinden, so dass der Photozyklus der D75N-NpSRII Mutante signifikant verändert ist (siehe Kapitel 1.7). Die C≡N Streckschwingungsmode der verwendeten Infrarotsonde reagiert aufgrund des Stark Effekts sehr sensitiv auf Veränderungen lokaler elektrostatischer Felder, so dass Ladungsveränderungen im Bereich der Schiff Base auch in einiger räumlicher Entfernung mit der IR-Sonde detektierbar sein sollten. Aufgrund der niedrigen Dielektrizitätskonstante sollte die Reichweite elektrostatischer Wechselwirkungen im Proteininneren zudem größer als im umgebenden Lösungsmittel sein. Daher ist eine Verschiebung der Absorptionsbande der C≡N Streckschwingung von 4-MBN im Vergleich zu den entsprechenden Einfachmutanten bei denjenigen Doppelmutanten zu erwarten, bei denen sich die Sonde im Proteininneren befindet. Abbildung 4.26 zeigt die Orientierung der 4 Seitenketten, die in den untersuchten Doppelmutanten jeweils durch Cystein-Seitenketten ersetzt und mit 4-MBN gelabelt wurden. 4.4 Untersuchung des Einflusses elektrostatischer Felder…… L213 K205 145 helix C N75 L89 helix G L159 helix F S158 retinal Abb.4.26: Orientierung der 4 verschiedenen Seitenketten, die in den untersuchten Doppelmutanten jeweils durch ein Cystein ersetzt und mit 4-MBN gelabelt wurden. Die Abbildung verdeutlicht, dass sowohl die Seitenkette von S158 als auch von L89 an der Oberfläche des Proteins exponiert sind. Die Lage der Absorptionsbande der C≡N Streckschwingungsmode von 4-MBN in der S158C-4MBN-NpSRII Mutante lässt zudem darauf schließen, dass die Sonde bei dieser Mutante bis in die Wasserphase hineinragt (siehe Abb. 4.18). Im Gegensatz dazu sind die Seitenketten von L213 sowie L159 im Proteininneren verborgen. Insbesondere L213 befindet sich lediglich zwei Helixwindungen von Lys205 entfernt, so dass bei Kopplung der IR-Sonde an diese Position, elektrostatische Veränderungen im Bereich der Schiff Base durch eine veränderte Frequenz der C≡N Streckschwingungsmode von 4-MBN angezeigt werden sollten. Der Einfluss elektrostatischer Veränderungen im Bereich der Schiff Base auf die C≡N Streckschwingungsmode an dieser Position wird auch anhand des K-Intermediat-minus Dunkelzustand Differenzspektrums der L213C-4MBN Mutante von NpSRII deutlich, das eine kleine Differenzbande im entsprechenden Frequenzbereich aufweist (siehe Abb. 4.21b). Um zu untersuchen, wie groß der Einfluss von geladenen Gruppen im Bereich der Schiff Base auf die C≡N Streckschwingungsmode ist, wurden zunächst Absorptionsspektren der gelabelten Doppelmutanten aufgenommen. Abbildung 4.27 zeigt die Absorptionsbande der C≡N Streckschwingungsmode von 4-MBN in den 4 untersuchten Doppelmutanten sowie den zugehörigen Einfachmutanten. 146 4.4 Untersuchung des Einflusses elektrostatischer Felder…… S158C-4MBN-SRII S158C, D75N-4MBN-SRII L213C-4MBN-SRII L213C, D75N-4MBN-SRII 1 mOD 2250 absorption absorption 1 mOD 2245 2240 2235 2230 2225 2220 2215 2210 2250 2245 2240 -1 2235 2230 absorption absorption 2240 2235 2230 2225 -1 wavenumber [cm ] 2215 2210 L159C-4MBN-SRII L159C, D75N-4MBN-SRII 1 mOD 2245 2220 wavenumber [cm ] L90C-4MBN-SRII L89C, D75N-4MBN-SRII 2250 2225 -1 wavenumber [cm ] 2220 2215 2210 2250 1 mOD 2245 2240 2235 2230 2225 2220 2215 2210 -1 wavenumber [cm ] Abb. 4.27: Absorptionsspektren von 4 gelabelten Einfachmutanten sowie den entsprechenden Doppelmutanten im Spektralbereich von 2250 cm-1 bis 2200 cm-1. Als Referenz für die L89C, D75N-4MBN-NpSRII Doppelmutante ist die L90C-4MBN-NpSRII Mutante dargestellt, da die L89C-4MBN-NpSRII Mutante nicht zur Verfügung stand. Die Spektren wurden jeweils auf die Amid I Bande normiert. Die Abbildung verdeutlicht, dass im Fall der an Position 158 gelabelten NpSRII-Mutanten die Gegenionmutation nahezu keinen Einfluss auf die Lage der Absorptionsbande der C≡N Streckschwingungsmode von 4-MBN hat. Wahrscheinlich werden elektrische Felder von geladenen Gruppen der Schiff Basen Region an der Proteinoberfläche abschirmt, so dass eine Mutation des Gegenions keinen Einfluss auf die C≡N Streckschwingungsmode der IR-Sonde hat, wenn sich diese nicht im Proteininnereren befindet. Dementsprechend ist auch nur eine geringfügige Verschiebung der Absorptionsbande bei der L89C, D75N-4MBN-NpSRII Mutante im Vergleich zur L90C-4MBN-NpSRII Mutante zu höheren Wellenzahlen zu beobachten. Als Referenz für die L89C, D75N-4MBN-NpSRII Doppelmutante dient die L90C-4MBN Mutante, da die L89C-4MBN-NpSRII Mutante nicht zur Verfügung stand. Die Frequenzverschiebung der C≡N Streckschwingung wird in diesem Fall vermutlich durch eine etwas andere Orientierung der Sonde in den beiden Mutanten verursacht und nicht durch die Mutation 4.4 Untersuchung des Einflusses elektrostatischer Felder…… 147 des Gegenions Asp75 hervorgerufen. Eine Verschiebung des Absorptionsmaximums der C≡N Streckschwingung infolge der Gegenionmutation um etwa eine Wellenzahl ist bei der gelabelten L159C,D75N-4MBN-NpSRII Mutante zu beobachten. Wie zuvor erwartet ist die Frequenzverschiebung aufgrund der geringeren Entfernung zur Schiff Basen Region bei der L213C, D75N-4MBN-NpSRII Mutante aber am größten; das Absorptionsmaximum ist bei dieser Doppelmutante um etwa 3 Wellenzahlen gegenüber der L213C-4MBN-NpSRII Mutante verschoben. In Tabelle 4.3 sind die unterschiedlichen Absorptionsmaxima der C≡N Streckschwingung von 4-MBN in den verschiedenen Einfach- und Doppelmutanten aufgeführt. Tabelle 4.3: Absorptionsmaxima der C≡N Streckschwingung von 4-MBN in den verschiedenen gelabelten Einfach- und Doppelmutanen sowie die infolge der Gegenionmutation beobachtete Verschiebung des jeweiligen Absorptionsmaximums. gelabelte Position Absorptionsmaximum Frequenzverschiebung Einfachmutante Doppelmutante S158C 2230,5 cm-1 2230,7 cm-1 L89C - 2230,9 cm-1 L90C 2230,1 cm-1 - L159C 2226,1 cm-1 2227,2 cm-1 1,1 cm-1 L213C 2227,8 cm-1 2230,9 cm-1 3,1 cm-1 0,2 cm-1 (0,8 cm-1) Sowohl bei der L159C-4MBN-NpSRII als auch bei der L213C-4MBN-NpSRII ist jeweils eine Verschiebung des Absorptionsmaximums der C≡N Streckschwingung zu höheren Wellenzahlen infolge der Gegenionmutation zu beobachten. Durch den Verlust der negativen Ladung des Gegenions ist infolge des Stark Effekts eigentlich eine Verschiebung zu kleineren Wellenzahlen zu erwarten, da die positive Ladung der protonierten Schiff Base nicht mehr durch die negative Ladung des Gegenions abgeschirmt wird. Infolge der Gegenionmutation könnten sich aber auch die Protonierungszustände anderer ionisierbarer Gruppen im Protein verändern, so dass die Auswirkungen auf die elektrostatische Umgebung der IR-Sonde in den verschiedenen Mutanten schwierig abzuschätzen sind. Neben der veränderten Elektrostatik im Proteininneren infolge der Gegenionmutation könnte auch eine unterschiedliche Orientierung der Sonde in der L213C,D75N-4MBN-NpSRII Doppelmutante gegenüber der Einfachmutante bei der Frequenzverschiebung der C≡N Streckschwingungsmode eine Rolle spielen. Die asymmetrische Form der Absorptionsbande der C≡N Streckschwingung in der L213C-4MBN Mutante von NpSRII ist ein Hinweis darauf, dass mehrere Konformationen der IR-Sonde an dieser Position existieren. Durch den Verlust der Salzbrücke zwischen der protonierten Schiff Base und dem Gegenion könnte das Gleichgewicht zwischen den unterschiedlichen Konformationen des Moleküls beeinflusst werden, so dass die Sonde bei der Doppelmutante durch ein anderes elektrostatisches Potential beeinflusst wird als die Einfachmutante. Auch die Tat- 148 4.4 Untersuchung des Einflusses elektrostatischer Felder…… sache, dass sich das Absorptionsmaximum der C≡N Streckschwingungsmode im Bereich der Schulter der C≡N Bande der Einfachmutante befindet, weist auf eine Verschiebung des Gleichgewichts zwischen verschiedenen Konformationen infolge der Gegenionmutation hin. Auf die Existenz verschiedener Konformationen lassen auch Strukturberechnungen an dieser Mutante schließen, die verschiedene energetisch gleichwertige Strukturen mit einer unterschiedlichen Orientierung der IR-Sonde ergeben haben (siehe Kapitel 4.3.3). Neben der Verschiebung des Absorptionsmaximums der C≡N Streckschwingungsmode ist auch eine Vergrößerung der Halbwertsbreite der C≡N Bande bei der L213C, D75N-4MBN Doppelmutante im Vergleich zur entsprechenden Einfachmutante zu beobachten. Dies könnte darauf hindeuten, dass für die Doppelmutante eine Konformation existiert, bei der die IRSonde an der Proteinoberfläche exponiert ist und daher eine größere Konformationsfreiheit besitzt. Am Beispiel der gelabelten Einfachmutanten konnte bereits eine Korrelation zwischen der Halbwertsbreite der Absorptionsbande sowie der Lage des Absorptionsmaximums mit der Zugänglichkeit zur Protein-, Lipid- oder Wasserphase der IR-Sonde gezeigt werden (siehe Abb. 4.18). Abbildung 4.28 zeigt das entsprechende Korrelationsdiagramm, in dem nun auch die Absorptionsmaxima und Halbwertsbreiten der C≡N Bande von 4-MBN für die 4 untersuchten Doppelmutanten abzulesen sind. water 15 F210C-4MBN-SRII S158C-4MBN-SRII I211C-4MBN-SRII 14 -1 FWHM [cm ] 13 Y160C-4MBN-SRII 12 K157C-4MBN-SRII L213C, D75N-4MBN-SRII L89C, D75N-4MBN-SRII S158C, D75N-4MBN-SRII L90C-4MBN-SRII L213C-4-MBN -SRII 11 10 S153C-4MBN-SRII L159C, D75N-4MBN-SRII 9 8 7 L159C-4MBN-SRII protein 2226 2227 2228 2229 2230 2231 2232 2233 2234 -1 wavenumber [cm ] Abb. 4.28: Korrelation zwischen der Halbwertsbreite der Absorptionsbande und dem Absorptionsmaximum der C≡N Streckschwingung von 4-MBN in verschiedenen gelabelten Einfachmutanten (rote Dreiecke) sowie Doppelmutanten (blaue Kreise) von NpSRII mit der Lösungsmittelzugänglichkeit der IR-Sonde. 4.4 Untersuchung des Einflusses elektrostatischer Felder…… 149 Das Korrelationsdiagramm verdeutlicht, dass die Oberflächenexponiertheit der IR-Sonde sowohl in der L159C,D75N-4MBN-NpSRII als auch in der L213C, D75N-4MBN-NpSRII Mutante gegenüber den jeweiligen Einfachmutanten erhöht ist. Dabei könnten strukturelle Veränderungen des Rezeptors infolge der Unterbrechung der Salzbrücke zwischen protonierter Schiff Base und Gegenion durch die Mutation des Gegenions eine Rolle spielen. In-vivo Studien an HsSRII-Mutanten, bei denen die Salzbrücke ebenfalls durch eine Mutation des Gegenions unterbrochen worden ist, belegen aufgrund einer konstitutiven Aktivität der Rezeptoren, die sich in einem verändertem Schwimmverhalten der Bakterienzellen äußert, dass durch die Unterbrechung der Salzbrücke auch ohne eine Photoisomerisierung des Retinals Konformationsänderungen im Photorezeptor ausgelöst werden können, die zur Aktivierung des Transducers erforderlich sind (Spudich et al., 1997). Zwar zeigt die D75N-NpSRII Mutante von Natronobacterium pharaonis im Gegensatz zur Gegenionmutante von HsSRII normalerweise keine konstitutive Aktivität. Anhand von in-vivo Studien an einem chimären Proteinkomplex, der aus Transducermolekülen von Halobacterium Salinarium und D75NNpSRII Mutanten besteht, konnte jedoch ebenfalls eine konstitutive Aktivität des Rezeptors nachgewiesen werden (Sasaki et al., 2007). Die strukturellen Unterschiede der D75N-NpSRII Mutante im Vergleich zum Wildtyp Rezeptor, die diese konstitutive Aktivität bewirken, sind eventuell auch für die veränderte Proteinumgebung der IR-Sonde verantwortlich. Durch die strukturellen Veränderungen infolge der Gegenionmutation könnte eine Konformation begünstigt werden, bei der die IR-Sonde an Position 213 eine höhere Oberflächenexponiertheit besitzt. Auch an Position 159 könnte hierdurch eine andere Orientierung der IR-Sonde begünstigt werden. 4.4.2 K-Intermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren Trotz der strukturellen Veränderungen, die offenbar durch die Unterbrechung der Salzbrücke zwischen der protonierten Schiffbase mit dem Gegenion verursacht werden, sind die D75N-NpSRII Mutanten weiterhin photoaktivierbar. Aufgrund des fehlenden Gegenions erfolgt nach der Photoisomerisierung des Retinals allerdings keine Deprotonierung der Schiff Base, so dass der Photozyklus der D75N-NpSRII Mutante kein M-Intermediat aufweist. Infrarotspektroskopische Untersuchungen an der D75N-Mutante haben aber gezeigt, dass trotz des veränderten Photozyklus die frühen Veränderungen im Bereich der Retinalbindungstasche beim Übergang zum K-Intermediat bei der Gegenionmutante weitgehend identisch zum Wildtyp Rezeptor ablaufen (Hein et al., 2004). Da die Konformationsänderungen, die bis zu diesem frühen Intermediat auftreten, auf geringfügige Veränderungen in der näheren Umgebung 150 4.4 Untersuchung des Einflusses elektrostatischer Felder…… des gebundenen Retinals beschränkt sind, sind eventuelle Frequenzverschiebungen der C≡N Streckschwingung von 4-MBN in den untersuchten Einfach- und Doppelmutanten eindeutig auf elektrostatische Veränderungen im Bereich der Schiff Base zurückzuführen. Bei den untersuchten Einfachmutanten des Rezeptors konnte lediglich im Fall der L213C-4MBNNpSRII Mutante eine geringfügige Differenzbande der C≡N Streckschwingung von 4-MBN nachgewiesen werden. Diese Differenzbande ist somit ein eindeutiger Beleg dafür, dass elektrostatische Veränderungen im Bereich der Schiff Base durch die IR-Sonde an Position 213 nachgewiesen werden können. Diese Ergebnisse sind nun mit Hilfe der Doppelmutanten überprüft worden. Abbildung 4.29 zeigt die durch Tieftemperaturmessungen aufgenommenen K-Intermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren der gelabelten Doppelmutanten sowie der entsprechenden Einfachmutanten im Spektralbereich von 2260 cm-1 bis 2210 cm-1. L159C-4MBN-SRII (95K) L159C, D75N-4MBN-SRII (95K) L213C-4MBN-SRII (95K) L213C, D75N-4MBN-SRII (95K) 0,02 mOD Δ absorption Δ absorption 0,02 mOD 2260 2255 2250 2245 2240 2235 2230 2225 2220 2215 2210 -1 wavenumber [cm ] 2260 2255 2250 2245 2240 2235 2230 2225 2220 2215 2210 -1 wavenumber [cm ] Abb. 4.29: K-Intermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren der gelabelten Doppelmutanten sowie der entsprechenden Einfachmutanten. Die Spektren sind auf Fingerprinbanden des Retinals normiert. Die Abbildung zeigt, dass die K-Intermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren der gelabelten Doppelmutanten im betrachteten Spektralbereich keine signifikanten Unterschiede im Vergleich zu den zugehörigen Einfachmutanten aufweisen, bei denen die IR-Sonde an die identischen Positionen des Proteins gekoppelt sind. Bei Kopplung der IR-Sonde an mutierte Cystein-Seitenketten von Helix F konnten weder bei den Einfach- noch bei den Doppelmutanten signifikante Differenzbanden der C≡N Streckschwingungsmode von 4-MBN nachgewiesen werden. Aufgrund der geringeren Signalintensität des Differenzspektrums der L159C,D75N-4MBN-NpSRII Doppelmutante im Vergleich zur L159C-4MBN-NpSRII Mutante weist die Basislinie des dargestellten normierten Differenzspektrums bei der Doppelmutante lediglich größere Zufallsschwankungen als bei der zugehörigen Einfachmutanten auf. Im Gegensatz zu den Einfach- sowie Doppelmutanten, bei denen die IR-Sonde an Helix F gekoppelt ist, deuten die Differenzspektren der L213C,D75N-4MBN-NpSRII Doppelmutante 4.4 Untersuchung des Einflusses elektrostatischer Felder…… 151 sowie der entsprechenden Einfachmutante auf eine geringfügige Frequenzverschiebung der C≡N Streckschwingungsmode von 4-MBN infolge der elektrostatischen Veränderungen in der Schiff Basen Region hin. Da sich das elektrostatische Potential in der Umgebung der IRSonde nach der Photoaktivierung bei der Doppelmutante offenbar genauso wie bei der Doppelmutante verändert, wie die ähnlichen Differenzbanden zeigen, können die Differenzbanden nicht durch das Gegenion selbst verursacht worden sein. Stattdessen spiegelt die Differenzbande vermutlich elektrostatische Veränderungen infolge der Umorientierung des Stickstoffatoms nach der Photoisomerisierung wider. Die beobachteten Differenzbanden der C≡N Streckschwingungsmode von 4-MBN bei diesen beiden Mutanten belegen somit, dass die IRSonde nicht nur als Umgebungssonde auf eine veränderte Lösungsmittelzugänglichkeit reagiert, sondern auch Veränderungen lokaler elektrostatischer Felder im Verlauf des Photozyklus detektieren kann. Die Intensitäten der Differenzbanden sind aufgrund der nur geringfügigen Veränderungen in diesem frühen Photointermediat und der räumlichen Entfernung zur Schiff Basen Region allerdings nur sehr klein. Die Banden weisen daher eine nur etwas größere Amplitude als Zufallsschwankungen auf. 4.4.3 Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren bei 263K Durch die Messung der K-Intermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren der gelabelten Doppelmutanten konnten also die Ergebnisse der Tieftemperaturmessungen an den entsprechenden Einfachmutanten bestätigt werden. Als nächstes sollte untersucht werden, welche Veränderungen in der elektrostatischen Umgebung der IR-Sonden bei den Doppelmutanten im weiteren Verlauf des Photozyklus auftreten. Aufgrund des fehlenden Gegenions weisen die D75N-NpSRII Mutanten allerdings kein M-Intermediat, sondern nur verschiedene Unterzustände des K-ähnlichen Intermediats auf (Hein, 2002). Bei höheren Temperaturen zerfällt dieses Intermediat zunehmend, was zu weniger intensiven Differenzspektren führt. Mit Hilfe zeitaufgelöster Differenzspektroskopie konnte aber gezeigt werden, dass die im Zeitbereich des Übergangs vom frühen zum späten M-Intermediat auftretenden Veränderungen des Proteinrückgrats bei der D75N-Mutante trotz der fehlenden Deprotonierung der Schiff Base eine große Ähnlichkeit zum Wildtyp Rezeptor aufweisen (Hein et al., 2004). Aufgrund des 100fach schnelleren Photozyklus der Gegenionmutante im Vergleich zum Wildtyprezeptor müssen die steady-state Messungen bei niedrigeren Temperaturen als bei den Einfachmutanten durchgeführt werden. Eine noch relativ große Signalintensität weisen die Differenzspektren bei 263K auf, so dass die Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren der Doppelmutanten zunächst bei dieser Temperatur gemessen wurden. Eine mögliche Tem- 152 4.4 Untersuchung des Einflusses elektrostatischer Felder…… peraturabhängigkeit der beobachteten Differenzbanden der C≡N Streckschwingung von 4-MBN in den verschiedenen Doppelmutanten wurde zudem bei weiteren Temperaturen zwischen 253K und 293K überprüft (siehe Kapitel 4.4.4). Abbildung 4.30 zeigt die Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren der gelabelten Doppelmutanten sowie der zugehörigen Einfachmutanten bei 263K. 0,05 mOD L159C-4MBN-SRII (263K) L159C, D75N-4MBN-SRII (263K) Δ absorption Δ absorption 0,05 mOD L213C-4MBN-SRII (263K) L213C, D75N-4MBN-SRII (263K) 2260 2255 2250 2245 2240 2235 2230 2225 2220 2215 2210 2260 2255 2250 2245 2240 2235 2230 2225 2220 2215 2210 -1 -1 wavenumber [cm ] wavenumber [cm ] L90C-4MBN-SRII (263K) L89C, D75N-4MBN-SRII (263K) 0,05 mOD S158C-4MBN-SRII (263K) S158C, D75N-4MBN-SRII (263K) Δ absorbtion Δ absorption 0,05 mOD 2260 2255 2250 2245 2240 2235 2230 2225 2220 2215 2210 2260 2255 2250 2245 2240 2235 2230 2225 2220 2215 2210 -1 wavenumber [cm ] -1 wavenumber [cm ] Abb. 4.30: Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren der verschiedenen mit 4-MBN gelabelten Doppelmutanten und der entsprechenden Einfachmutanten von NpSRII bei 263K im Spektralbereich zwischen 2250 cm-1 und 2210 cm-1. Die Abbildung verdeutlicht, dass mit Ausnahme der L213C,D75N-4MBN-NpSRII Mutante die Mutation des Gegenions keine Auswirkungen auf die Veränderung des elektrostatischen Potentials im Bereich der IR-Sonde nach der Photoaktivierung hat. Lediglich die größere Intensität der Differenzbande der L159C,D75N-4MBN-NpSRII Mutante im Vergleich zur Einfachmutante könnte auf eine Veränderung des elektrostatischen Potentials in der Umgebung der IR-Sonde bei der Doppelmutante zurückzuführen sein. Für diese Differenzbande konnte allerdings sowohl bei der Einfach- als auch bei der Doppelmutante eine klare Temperaturabhängigkeit festgestellt werden (siehe Kapitel 4.5). Die Unterschiede in der Intensität der Differenzbande sind daher vermutlich auf die unterschiedliche Kinetik der Photozyklen der beiden Mutanten zurückzuführen. Bei 283K weisen die entsprechenden 4.4 Untersuchung des Einflusses elektrostatischer Felder…… 153 Differenzbanden bei beiden Mutanten keine signifikanten Intensitätsunterschiede auf. Die L213C,D75N-4MBN-NpSRII Mutante ist somit die einzige Doppelmutante, bei der die Differenzbande der C≡N Streckschwingung von 4-MBN infolge der Gegenionmutation deutlich verändert wird. Bereits die Absorptionsspektren im Dunkelzustand als auch die Tieftemperatur Differenzspektren haben gezeigt, dass die IR-Sonde an dieser Position die durch die Gegenionmutation hervorgerufenen elektrostatischen und strukturellen Veränderungen im Protein detektieren kann. Eine mögliche Ursache für die Differenzbande im Photointermediatminus-Dunkelzustand Differenzspektrum der L213C-4MBN Mutante von NpSRII könnte in der Protonenübertragung von der Schiff Base zur Asp75 im M-Intermediat liegen (siehe Kapitel 4.3.4). Elektrostatische Berechnungen haben bestätigt, dass das Differenzpotential zwischen den Zuständen vor und nach der Protonenübertragung im Bereich der Position 213 des Rezeptors negativ ist, wodurch die Frequenzerhöhung der C≡N Streckschwingungsmode bei der gelabelten Einfachmutante um etwa 0,15 cm-1 nach der Photoaktivierung erklärt werden kann (siehe Abb. 4.24). Die veränderte Differenzbande in der entsprechenden Doppelmutante ist ein weiterer Beleg dafür, dass die Differenzbande bei der Einfachmutante durch die Protonenübertragung verursacht wird, da diese aufgrund der Gegenionmutation bei der Doppelmutante nicht stattfinden kann. Die Differenzbande der Doppelmutante könnte auf elektrostatische Veränderungen infolge von Umorientierungen im Bereich der protonierten Schiff Base nach der Photoaktivierung zurückgeführt werden. Bei der Interpretation der Differenzspektren muss allerdings berücksichtigt werden, dass durch die Gegenionmutation vermutlich das Gleichgewicht zwischen unterschiedlichen Konformationen der IR-Sonde verändert wird (siehe Kapitel 4.4.1). Daher überwiegt in der Doppelmutante vermutlich eine andere Orientierung der IR-Sonde, so dass nicht ausgeschlossen werden kann, dass diese strukturellen Veränderungen bei den beobachteten Unterschieden in den Differenzspektren der L213C-4MBN-NpSRII Mutante und der entsprechenden Doppelmutante eine Rolle spielen. Für die unterschiedliche Proteinumgebung der IR-Sonde im Dunkelzustand könnten strukturelle Veränderungen im Bereich der Helix G verantwortlich sein, die durch die Unterbrechung der Salzbrücke zwischen protonierter Schiff Base und Gegenion ausgelöst werden. Strukturelle Unterschiede infolge der Gegenionmutation können auch zur Folge haben, dass Konformationsänderungen nach der Photoaktivierung bei den Gegenionmutanten verändert ablaufen. Hierfür spricht auch die konstitutive Aktivität der D75NNpSRII Mutante im Komplex mit dem Transducer von H. salinarium (Sasaki et al., 2007). Es kann daher nicht ausgeschlossen werden, dass die veränderte Differenzbande der C≡N Streckschwingungsmode von 4-MBN bei der L213C,D75N-4MBN-NpSRII Doppelmutante im Ver- 154 4.4 Untersuchung des Einflusses elektrostatischer Felder…… gleich zur Einfachmutante durch unterschiedliche Konformationsänderungen nach der Photoaktivierung im Bereich der Helix G zu erklären ist. Dem widersprechen allerdings FTIRspektroskopische Untersuchungen, die darauf hindeuten, dass die wesentlichen Konformationsänderungen nach der Photoaktivierung auch in den Gegenionmutanten erfolgen (Hein et al., 2004). Zudem wäre eine geringere Intensität der Differenzbande der C≡N Streckschwingungsmode bei der Doppelmutante zu erwarten, wenn bereits im Dunkelzustand dieselben Konformationsänderungen ablaufen, die bei der Einfachmutante erst nach der Photoaktivierung auftreten. Daher sind wahrscheinlich elektrostatische Veränderungen im Bereich der Schiff Base die Ursache für die beobachteten Unterschiede in den Differenzspektren zwischen Einfach- und Doppelmutante. Weitere Hinweise darauf, ob strukturelle oder elektrostatische Veränderungen im Protein die Ursache für die Frequenzveränderungen der C≡N Streckschwingungsmode an den verschiedenen Positionen sind, können auch durch Untersuchungen der Temperaturabhängigkeit der Differenzspektren bei den verschiedenen gelabelten Einfach- und Doppelmutanten erhalten werden. Während die elektrostatischen Veränderungen im Protein bis zum frühen MIntermediat weitestgehend abgeschlossen sind, erfolgen die größeren Konformationsänderungen des Proteins beim Übergang vom frühen zum späten Photointermediat. Da bei niedrigen Temperaturen aufgrund der veränderten Kinetik des Photozyklus die frühen Intermediate im Photoprodukt überwiegen, sollte eine Veränderung der Differenzbanden festzustellen sein, wenn diese durch Konformationsänderungen des Rezeptors verursacht werden. 4.4.4 Temperaturabhängigkeit der Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren bei den verschiedenen gelabelten NpSRII-Mutanten Nach der Messung der Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren der Doppel- sowie der Einfachmutanten bei 263K wurde die Temperaturabhängigkeit der Differenzspektren von einigen gelabelten Einfach- sowie Doppelmutanten im Temperaturbereich von 253K bis 293K genauer untersucht. Bereits das Photointermediat-minus-Dunkelzustands Differenzspektrum des ungelabelten Wildtyp NpSRII-Rezeptors weist eine deutliche Temperaturabhängigkeit einiger Banden auf. Insbesondere die Intensität der negativen Bande bei 1664 cm-1 wird bei zunehmender Temperatur deutlich größer, was darauf hindeutet, dass einige strukturelle Veränderungen im Rezeptor bei niedrigeren Temperaturen unterbleiben. Auch die positive Bande bei 1530 cm-1 weist mit zunehmender Temperatur eine größere Intensität auf, was auf einen höheren Anteil an O-Intermediat im Photoprodukt hindeutet (Bergo et al., 2003). Abbildung 4.31 zeigt die Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren des ungelabelten Rezeptors bei 5 verschiedenen Temperaturen zwischen 253K und 293K. 4.4 Untersuchung des Einflusses elektrostatischer Felder…… 155 N pS R II N pS R II N pS R II N pS R II N pS R II Δ absorption 5 mOD (253K ) (263K ) (273K ) (283K ) (293K ) relative intensity 1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 1,0 250 260 270 280 290 300 temperature [K] 1900 1800 1700 1600 1500 1400 1300 -1 w avenum ber [cm ] 1200 1100 1000 Abb. 4.31: Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren von NpSRII bei verschiedenen Temperaturen von 253K bis 293K sowie Temperaturabhängigkeit der Intensität der Amid I Bande bei 1664 cm-1. Diese Messergebnisse stehen allerdings im Widerspruch zu FTIR-spektroskopischen Untersuchungen an hydratisierten Film Proben von in Phosphatidylcholin-Lipiden rekonstituierten NpSRII-Molekülen, bei denen keine Temperaturabhängigkeit der Amid I bzw. Amid II Differenzbanden des Rezeptors im Temperaturbereich von 253K bis 293K beobachtet werden konnte (Kamada et al., 2006). Bei dieser Studie wurde eine Temperaturabhängigkeit von Amid I und Amid II Differenzbanden des Rezeptors nur innerhalb des Komplexes aus NpSRII und NpHtrII beobachtet, woraus gefolgert wurde, dass die Interaktionen zwischen Rezeptor und Transducer temperaturabhängig sind. Die dabei beobachtete Reduktion in der Intensität von Amid I Banden bei höheren Temperaturen wurde durch ein Unterbinden der Helix F Auswärtsbewegung infolge der Wechselwirkungen mit dem Transducer bei höheren Temperaturen interpretiert. Diese Messungen wurden allerdings mit Filmproben durchgeführt, bei denen die Hydratisierung nur schwierig zu kontrollieren ist. Bereits durch den Vergleich der Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren des Wildtyp Rezeptors und des NpSRII/NpHtrII-Komplexes bei verschiedenen Temperaturen konnte keine Unterbindung von Konformationsänderungen des Rezeptors infolge der Bindung des Transducers nachgewiesen werden (siehe Kapitel 4.2). Stattdessen deutet die Intensitätsverringerung der Bande der C=O Streckschwingungsmode von Asn74 des Transducers bei niedrigen Temperaturen eher darauf hin, dass Konformationsänderungen des Rezeptors, die zur Aktivierung von NpHtrII führen, bei niedrigen Temperaturen unterbleiben. Diese Hypothese wird auch durch die geringere Intensität der Amid I Banden des Rezeptors bei niedrigeren Temperaturen unterstützt. Die 156 4.4 Untersuchung des Einflusses elektrostatischer Felder…… Schwierigkeit bei der Interpretation solcher Differenzspektren besteht allerdings darin, dass ohne weitere Informationen nicht festgestellt werden kann, an welcher Position im Protein die Konformationsänderungen erfolgen, die die veränderten Amid I und Amid II Differenzbanden zur Folge haben. Mit Hilfe der IR-Sonde besteht nun die Möglichkeit, positionsspezifisch die Temperaturabhängigkeit von Konformationsänderungen des Rezeptors alleine und im Komplex mit dem Transducer zu untersuchen. Daher wurde zunächst die Temperaturabhängigkeit der Differenzspektren von gelabelten Einfachmutanten untersucht, bei denen die IR-Sonde an unterschiedlichen Helices des Rezeptors gebunden ist. Mit Hilfe der zugehörigen Doppelmutanten kann zudem überprüft werden, ob infolge der Gegenionmutation eine veränderte Temperaturabhängigkeit der C≡N Bande von 4-MBN zu beobachten ist. Abbildung 4.32 zeigt exemplarisch die Differenzspektren der L159C-4MBN-NpSRII sowie der L213C-4MBN-NpSRII Einfachmutanten bei drei verschiedenen Temperaturen im Vergleich zu den entsprechenden Differenzspektren der zugehörigen Doppelmutanten. L159C-4MBN_NpSRII (263K) L159C-4MBN_NpSRII (273K) L159C-4MBN_NpSRII (283K) 0,05 mOD L159C, D75N-4MBN_NpSRII (263K) L159C, D75N-4MBN_NpSRII (273K) L159C, D75N-4MBN_NpSRII (283K) Δ absorption Δ absorption 0,05 mOD 2260 2255 2250 2245 2240 2235 2230 2225 2220 2215 2210 2260 2255 2250 2245 2240 2235 2230 2225 2220 2215 2210 -1 -1 wavenumber [cm ] L213C-4MBN-NpSRII (263K) L213C-4MBN-NpSRII (273K) L213C-4MBN-NpSRII (283K) 0,05 mOD L213C, D75N-4MBN_NpSRII (263K) L213C, D75N-4MBN_NpSRII (273K) L213C, D75N-4MBN_NpSRII (283K) Δ abosrption Δ absorption 0,05 mOD wavenumber [cm ] 2260 2255 2250 2245 2240 2235 2230 -12225 2220 2215 2210 2260 2255 2250 2245 2240 2235 2230 2225 2220 2215 2210 wavenumber [cm ] -1 wavenumber [cm ] Abb. 4.32: Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren der L159C-4MBN-NpSRII und der L213C-4MBN-NpSRII Einfachmutante im Vergleich zu den entsprechenden Differenzspektren der an denselben Positionen gelabelten D75N-NpSRII Mutanten bei jeweils drei verschiedenen Temperaturen im Spektralbereich von 2260 cm-1 bis 2210 cm-1. 4.4 Untersuchung des Einflusses elektrostatischer Felder…… 157 Die Abbildung verdeutlicht, dass bei Kopplung der IR-Sonde an Position 213 des Rezeptors die Differenzbande der C≡N Streckschwingung von 4-MBN weder bei der Einfach- noch bei der Doppelmutante eine signifikante Temperaturabhängigkeit aufweist. Lediglich bei 263K ist die Intensität der Differenzbande bei der Einfach- sowie der Doppelmutante etwas verringert, die Frequenz der C≡N Streckschwingung ist bei dieser Temperatur gegenüber den Messungen bei höheren Temperaturen zudem leicht zu höheren Wellenzahlen verschoben. Trotz dieser geringfügigen Unterschiede zeigen die ähnlichen Spektren aber an, dass die elektrostatischen oder strukturellen Veränderungen im Protein, die durch die jeweiligen Differenzbanden widergespiegelt werden, sowohl bei der Einfach- als auch bei der Doppelmutante nicht temperaturabhängig sind. Die am Beispiel des ungelabelten Wildtyprezeptors gezeigte Temperaturabhängigkeit von Differenzbanden im Spektralbereich von 1700 cm-1 bis 1500 cm-1 konnte allerdings auch bei diesen Mutanten beobachtet werden. Die temperaturabhängigen Konformationsänderungen, die diese Unterschiede in den Differenzspektren hervorrufen, haben aber keinen Einfluss auf die C≡N Streckschwingungsmode der an Position 213 gekoppelten IRSonde. Dieses Ergebnis ist ebenfalls in Übereinstimmung mit der Hypothese, dass elektrostatische Veränderungen in der Schiff Basen Region die Differenzbande der IR-Sonde an dieser Position hervorrufen könnten. Im Gegensatz zu den an Position 213 gelabelten Mutanten, weist die Differenzbande der C≡N Streckschwingungsmode von 4-MBN bei den an Position 159 gelabelten Einfach- und Doppelmutanten eine deutliche Temperaturabhängigkeit auf. Während bei 283K die Frequenz der C≡N Streckschwingungsmode sowohl bei der Einfach- als auch bei der Doppelmutante im Photointermediat gegenüber dem Dunkelzustand verringert ist, erfolgt bei niedrigeren Temperaturen im Photointermediat jeweils eine Erhöhung der Frequenz im Vergleich zum Dunkelzustand. Die C≡N Streckschwingungsmode der an Position 159 gekoppelten IR-Sonde könnte daher durch Konformationsänderungen beeinflusst werden, die nur bei höheren Temperaturen beobachtet werden können. Eine mögliche Interpretation der veränderten Differenzbande besteht darin, dass die Auswärtsbewegung des cytoplasmatischen Endes von Helix F bei niedrigen Temperaturen nicht erfolgt, weil die Mobilität der Helix bei 263 K vermutlich eingeschränkt ist. Die Differenzbande bei niedrigeren Temperaturen könnte stattdessen elektrostatische Veränderungen innerhalb des Proteins widerspiegeln. Um zu untersuchen, ob die Auswärtsbewegung der Helix F durch temperaturabhängige Interaktionen mit dem Transducer beeinflusst wird, wurden Differenzspektren des an Position 159 gelabelten Komplexes bei drei verschiedenen Temperaturen gemessen und mit den Spektren des freien Rezeptors verglichen. 158 4.4 Untersuchung des Einflusses elektrostatischer Felder…… Abbildung 4.33 zeigt die entsprechenden Spektren im Spektralbereich von 2260 cm-1 bis 2210 cm-1. L159C-4MBNN-NpSRII L159C-4MBN-NpSRII/NpHtrII 0,05 mOD Δ absorption 263K 273K 283K 2260 2255 2250 2245 2240 2235 2230 -1 2225 2220 2215 2210 wavenumber [cm ] Abb. 4.33: Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren der L159C-4MBN-NpSRII sowie der L159C-4MBN-NpSRII/NpHtrII Mutante bei 263K, 273K und 283K im Spektralbereich von 2260 cm-1 bis 2210 cm-1. Dieses Ergebnis zeigt, dass im Komplex dieselbe Temperaturabhängigkeit der C≡N Bande von 4-MBN besteht wie im freien Rezeptor. Dies lässt darauf schließen, dass die Auswärtsbewegung der Helix F auch im Komplex mit dem Transducer erfolgen kann. Allerdings könnte die geringere Intensität der Differenzbande im NpSRII/NpHtrII-Komplex im Vergleich zum freien Rezeptor bei 283 K darauf hindeuten, dass die Helix F Bewegung durch die Bindung des Transducers eingeschränkt, aber nicht völlig unterbunden wird. Diese Ergebnis steht im Widerspruch zu früheren spektroskopischen sowie kristallographischen Studien, nach denen die Auswärtsbewegung der Helix F durch die Bindung des Transducers vollständig unterbunden wird (Kamada et al., 2006; Moukhametzianov et al., 2006). Allerdings lassen auch neuere EPR-Messungen vermuten, dass im Komplex die Auswärtsbewegung der Helix erfolgt (Bordignon et al., 2007). Auch neuere Untersuchungen des Komplexes mittels Einzelmolekül Kraftspektroskopie zeigen, dass die Auswärtsbewegung des cytoplasmatischen Endes der Helix F trotz der Interaktionen mit NpHtrII stattfinden könnte (Cisneros et al., 2008). Im Unterschied zu früheren FTIR-spektroskopischen Untersuchungen konnten in dieser Studie strukturelle und elektrostatische Veränderungen des Rezeptors positionsspezifisch nachgewiesen werden. Die Temperaturabhängigkeit der Differenzbande der C≡N Steckschwingungsmode bei der L159C-4MBN-NpSRII Mutante deutet eindeutig auf eine Kon- 4.4 Untersuchung des Einflusses elektrostatischer Felder…… 159 formationsänderung des Rezeptors als mögliche Ursache hin. Bei Kopplung der IR-Sonde an Helix G konnte dagegen keine Temperaturabhängigkeit der C≡N Bande beobachtet werden, obwohl die Kristallstruktur des aktivierten Komplexes auf größere strukturelle Veränderungen in dieser Region des Rezeptors hindeuten. Zusammengenommen mit den Untersuchungen der an den entsprechenden Positionen gelabelten Doppelmutanten ergibt sich ein Bild, wonach die Differenzbanden der C≡N Streckschwingungsmode bei den an Helix F gebundenen IRSonden durch strukturelle Veränderungen des Rezeptors verursacht werden, während bei Kopplung der IR-Sonde an Helix G die entsprechenden Banden wahrscheinlich überwiegend die elektrostatischen Veränderungen im Bereich der Schiff Basen Region beim Übergang zum frühen M-Intermediat reflektieren. 4.4.5 Schlussfolgerungen und Ausblick Bereits anhand der Absorptionsspektren der verschiedenen gelabelten Doppelmutanten konnte eine unterschiedlich große Auswirkung der Gegenionmutation auf die C≡N Streckschwingungsmode von 4-MBN festgestellt werden. Vor allem bei Kopplung der IR-Sonde an Position 213 der Helix G des Rezeptors ist die C≡N Bande bei der Doppelmutante gegenüber der entsprechenden Doppelmutante deutlich zu höheren Wellenzahlen verschoben. Dieses Ergebnis verdeutlicht den Einfluss von elektrostatischen Feldern auf die Frequenz der C≡N Streckschwingungsmode. Allerdings kann nicht ausgeschlossen werden, dass neben der veränderten Elektrostatik in der Schiff Basen Region auch strukturelle Unterschiede zwischen der D75N-NpSRII Mutante und dem Wildtyp Rezeptor aufgrund der fehlenden Salzbrücke zwischen Asp75 und der protonierten Schiff Base bei der Verschiebung der C≡N Bande eine Rolle spielen. Darauf deutet auch die größere Halbwertsbreite der C≡N Bande bei der Doppelmutante hin, die auf eine größere Oberflächenexponiertheit der IR-Sonde zurückzuführen sein könnte. Die beobachteten Differenzbanden der C≡N Streckschwingungsmode in den K-Intermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren der an Position 213 gelabelten Einfach– sowie Doppelmutante können dagegen nur durch elektrostatische Veränderungen im Bereich der Schiff Basen Region hervorgerufen worden sein, da in diesem frühen Intermediat Konformationsänderungen auf den Bereich der Retinalbindungstasche beschränkt sind. Auch anhand der Photointermediat-minus-Dunkezustand Differenzspektren bei höheren Temperaturen, die die strukturellen sowie elektrostatischen Veränderungen im weiteren Verlauf des Photozyklus reflektieren, konnte der Einfluss der Gegenionmutation auf die Veränderungen der C≡N Streckschwingungsmode nach der Photoaktivierung nachgewiesen werden. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Deprotonierung der Schiff Base beim 160 4.4 Untersuchung des Einflusses elektrostatischer Felder…… Übergang zum frühen M-Intermediat die Differenzbande der C≡N Streckschwingungsmode bei der an Position 213 gelabelten Einfachmutante verursacht. Bei der Doppelmutante könnte die entsprechende Differenzbande stattdessen auf die elektrostatischen Veränderungen infolge der Umorientierung der protonierten Schiff Base im Verlauf des Photozyklus zurückzuführen sein. Allerdings kann auch bei den Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren nicht ausgeschlossen werden, dass unterschiedliche Konformationsänderungen nach der Photoaktivierung bei der D75N-NpSRII Mutante im Vergleich zum Wildtyp-Rezeptor erfolgen und die veränderte Differenzbande bei der D75N,L213C-4MBN-NpSRII Doppelmutante gegenüber der entsprechenden Einfachmutante bewirken. Weder bei der an dieser Position gelabelten Doppelmutante noch bei der Einfachmutante konnte allerdings eine Temperaturabhängigkeit der C≡N Bande in den Differenzspektren festgestellt werden, was eher auf elektrostatische als auf strukturelle Ursachen für diese Differenzbanden hindeutet. Eine solche Temperaturabhängigkeit der Differenzbande der C≡N Steckschwingungsmode konnte stattdessen sowohl bei der L159C-4MBN-NpSRII Mutante als auch bei der entsprechenden Doppelmutante nachgewiesen werden. Die Gegenionmutation hat an dieser Position des Rezeptors dagegen keine wesentlichen Auswirkungen auf die Frequenzveränderungen dieser Schwingungsmode nach der Photoaktivierung, so dass elektrostatische Veränderungen in der Schiff Basen Region als Ursache für die Differenzbande ausgeschlossen werden können. Die Temperaturabhängigkeit der Bande legt dagegen strukturelle Ursachen für die Differenzbande bei 283 K nahe, so dass die entsprechende Bande vermutlich die Auswärtsbewegung der Helix F widerspiegelt. Da dieselbe Temperaturabhängigkeit der C≡N Bande auch in den Photointermedait-minus-Dunkelzustand Differenzspektren des an identischer Position gelabelten NpSRII/NpHtrII-Komplexes zu beobachten ist, hat die Bindung des Transducers offenbar nur geringfügige Auswirkungen auf die Konformationsänderungen des Rezeptors in diesem Bereich. Lediglich die etwas geringere Intensität der Differenzbande im NpSRII/NpHtrII-Komplex bei 283 K könnte darauf hindeuten, dass die Konformationsänderungen durch die Bindung des Transducers eingeschränkt sind. Mit Hilfe von 4-MBN als IR-Sonde ist es folglich möglich während einer Proteinreaktion, sowohl die Veränderungen lokaler elektrostatischer Felder - z.B. infolge einer Protonenübertragungsreaktionen - als auch strukturelle Veränderungen eines Proteins zu detektieren. Um die erhaltenen Ergebnisse auch theoretisch zu untermauern, sollen für die diskutierten Mutanten in näherer Zukunft strukturbasierte elektrostatische Berechnungen durchgeführt werden, mit deren Hilfe die Veränderungen des elektrostatischen Potentials in der Umgebung der IR-Sonde quantifiziert werden können. Weitere Erkenntnisse könnten in zukünftigen 4.4 Untersuchung des Einflusses elektrostatischer Felder…… 161 Studien auch durch die Verwendung von Azido-Verbindungen als IR-Sonden erhalten werden. Die Frequenz der Azido-Streckschwingungsmode wird durch lokale elektrostatische Felder kaum, durch eine veränderte Lösungsmittelzugänglichkeit hingegen deutlich beeinflusst., so dass eindeutig geklärt werden kann, ob die beobachteten Differenzbanden durch eine veränderte Proteinumgebung der IR-Sonde infolge von des Proteins oder durch Ladungsverschiebungen verursacht werden. 162 5. Zusammenfassung 5. Zusammenfassung Im Rahmen dieser Doktorarbeit wurden die Wechselwirkungen des Photorezeptors Sensory Rhodopsin II aus Natronobacterium pharaonis mit seinem Transducer NpHtrII untersucht. Durch die Interaktion der beiden Moleküle wird ein Signalprozess vermittelt, durch den es dem Bakterium ermöglicht wird, Gebiete von zu hoher Lichtintensität bei einem gleichzeitig hohen Sauerstoffgehalt zu vermeiden, um so eine photooxidative Schädigung der Zelle zu verhindern. Das Interesse galt dabei aber nicht dem Signaltransduktionsweg sondern den molekularen Mechanismen, durch die das Lichtsignal in Konformationsänderungen des Rezeptors umgewandelt und infolge von Interaktionen mit dem Transducer durch die Zellmembran in die cytoplasmatische Domäne von NpHtrII weitergeleitet wird. Der Proteinkomplex kann aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit zu anderen Rezeptoren als Modellsystem für Signalübertragungsprozesse angesehen werden. Der Photorezeptor eignet sich auch deshalb gut zur Studie der molekularen Vorgänge bei solchen Prozessen, da die Reaktion durch Lichtbestrahlung des Photorezeptors getriggert werden kann. Hierdurch wird die Photoisomerisierung des gebundenen Chromophors Retinal zur 13-cis Konfiguration ausgelöst, wodurch Konformationsänderungen des Rezeptors hervorgerufen werden, die letztlich zur Aktivierung der gebundenen Transducer Moleküle führen. Trotz jahrelanger Untersuchungen am NpSRII/NpHtrII-Komplex sind dennoch viele Aspekte ungeklärt, wie das Signal auf den Transducer übertragen und zur cytoplasmatischen Domäne weitergeleitet wird. Einem Modell zufolge erfolgt die Aktivierung des Transducers durch eine Auswärtsbewegung des cytoplasmatischen Endes der Helix F von NpSRII, wodurch eine Rotationsbewegung der Transmembranhelix 2 des Transducers ausgelöst wird (Wegener et al., 2001). Dieses Modell ist allerdings durch eine Kristallstruktur des NpSRII/NpHtrII-Komplexes in Zweifel gezogen worden, die darauf hindeutet, dass infolge der Bindung des Transducers die Auswärtsbewegung der Helix F im Proteinkomplex unterbunden wird (Moukhametzianov et al., 2006). Neuere Studien deuten stattdessen darauf hin, dass die Aktivierung des Transducers durch spezifische Wechselwirkungen zwischen Seitenketten des Rezeptors und des Transducers innerhalb der Membran erfolgt. Solche offenen Fragestellungen sollten auch im Rahmen dieser Arbeit untersucht werden. Die Untersuchungen der Wechselwirkungen innerhalb des NpSRII/NpHtrII-Komplexes erfolgten dabei mit Hilfe der FTIR-Spektroskopie. Das Interesse galt dabei sowohl der Untersuchung des Komplexes zu einem sehr frühen Zeitpunkt des Photozyklus als auch während des aktiven Signalzustandes. Mit Hilfe der Tieftemperatur Differenzspektroskopie 5. Zusammenfassung 163 ist es möglich, die strukturellen und elektrostatischen Veränderungen im Komplex beim Übergang vom Dunkelzustand zum K-Intermediat zu untersuchen. Sollte bereits zu diesem frühen Zeitpunkt des Photointermediats ein Einfluss des Transducers auf Schwingungsmoden des Rezeptors nachgewiesen werden können, legt dies nahe, dass über dieselben Wechselwirkungen im weiteren Verlauf des Photozyklus Veränderungen im Transducer durch den Rezeptor bewirkt werden können. Durch den Vergleich der K-Intermediat-minusDunkelzustand Differenzspektren des ungebundenen Rezeptors mit den entsprechenden Spektren des NpSRII/NpHtrII-Komplexes konnte tatsächlich ein Einfluss des Transducers auf eine negative Bande des Rezeptors bei ca. 1657 cm-1 nachgewiesen werden. Auswirkungen auf das K-Intermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektrum in diesem Spektralbereich infolge der Transducerbindung wurden bereits in früheren FTIR-spektroskopischen Untersuchungen beobachtet. Diese Banden wurden Amid I Moden von NpSRII zugeordnet, die strukturelle Veränderungen des Rezeptors widerspiegeln (Furutani et al., 2003). Im selben Spektralbereich absorbiert allerdings auch die C=N Streckschwingungsmode der protonierten Schiff Base im Dunkelzustand des Rezeptors. Mit Hilfe der gruppenspezifischen Isotopenmarkierung konnte nun gezeigt werden, dass die Veränderungen tatsächlich auf diese Schwingungsmode zurückzuführen sind, während keine Veränderung der Banden von Amid I Moden des Rezeptors im Komplex mit NpHtrII zu beobachten waren. Der Einfluss des Transducers auf die Schiff Base im Dunkelzustand könnte über dieselben Wechselwirkungen erfolgen, durch die - einem Modell von Ito et al. zufolge - die Signalübertragung von der Schiff Basen Region zum Transducer vermittelt wird (Ito et al., 2008). Demnach könnte die Bindung des Transducers über die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Asn74 von NpHtrII und Tyr199 von NpSRII sowie Tyr174 und Thr204 Auswirkungen auf die Schiff Base im Dunkelzustand haben. Die Ergebnisse stehen im Einklang mit neueren Untersuchungen, die die Bedeutung des Signalweges von der Schiff Basen Region über Thr204 und Tyr174 zum Transducer beim Aktivierungsmechanismus zeigen (Ito et al., 2008). Während im K-Intermediat strukturelle Veränderungen des Rezeptors auf die Schiff Basen Region beschränkt sind, erfolgen beim Übergang zum späten M-Intermediat die wesentlichen Konfomationsänderungen, die die Aktivierung des Transducers bewirken. Durch Messung von Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren des NpSRII/NpHtrII-Komplexes können diese Veränderungen detektiert werden. Der Vergleich dieser Spektren mit den entsprechenden Differenzspektren von NpSRII legt nahe, dass die strukturellen Veränderungen des Rezeptors nach der Photoaktivierung durch die Bindung 164 5. Zusammenfassung des Transducers nur geringfügig beeinflusst werden. Darauf haben bereits frühere FTIRspektroskopische Studien in unserer Arbeitsgruppe hingewiesen (Radu, 2006). Der Transducer durchläuft nach seiner Aktivierung durch den Rezeptor ebenfalls nur geringfügige Konformationsänderungen, die nicht mit der Störung der helikalen Struktur der beiden Transmembranhelices einhergehen und auf „Starrkörperbewegungen“ dieser Helices nach der Aktivierung hindeuten. Lediglich eine kleine Bande von Amid I Moden der α-Helices des Transducers zeigt an, dass sich die Wasserstoffverbrückung des Proteinrückgrats nach der Photoaktivierung durch den Rezeptor verändert. Beide Ergebnisse sind in Übereinstimmung mit früheren EPR-Messungen sowie der 2006 veröffentlichten Kristallstruktur des aktivierten Komplexes, die eine Rotationsbewegung der TM2-Helix des Transducers senkrecht zur Membranebene sowie eine geringfügige Translationsbewegung dieser Helix anzeigen. Die Veränderung von Wasserstoffbrückenbindungen zwischen Seitenketten des Rezeptors und des Transducers oder dem Proteinrückgrat könnte einen Beitrag dazu leisten, dass die Bindung des Transducers an den Rezeptor im aktiven Zustand schwächer ist. Einen wichtigen Ankerpunkt innerhalb der Membran stellt die Wasserstoffbrückenbindung zwischen Asn74 (TM2) und Tyr199 (Helix G) dar. Bereits frühere FTIR-Studien haben gezeigt, dass diese Wasserstoffbrückenbindung im M-Intermediat verändert wird; es wurde allerdings sowohl von einer Stärkung als auch einer Schwächung der Bindung berichtet (Furutani et al., 2005; Bergo et al., 2005). Auch im Rahmen dieser Arbeit konnte eine Veränderung der C=O Streckschwingungsmode von Asn74 beobachtet werden. Die festgestellte Frequenzveränderung um 9 cm-1 zu kleineren Wellenzahlen im Photointermediat gegenüber dem Dunkelzustand zeigt allerdings an, dass die Wasserstoffbrückenbindung gestärkt und nicht unterbrochen wird. Dies ist in Übereinstimmung mit der Studie von Furutani et al. und widerlegt somit ein Modell, nachdem durch die Unterbrechung dieser Wasserstoffbrückenbindung die Aktivierung des Transducers bewirkt wird (Sasaki und Spudich, 2008). Bei niedrigen Temperaturen konnte zudem eine signifikante Verringerung der Intensität dieser Differenzbande sowie von Differenzbanden der Amid I Moden des Rezeptors festgestellt werden. Bei niedrigen Temperaturen könnten daher die Konformationsänderungen, die zur Aktivierung des Transducers führen, eingeschränkt sein. Es ist mit Hilfe der herkömmlichen FTIR-Spektroskopie allerdings ohne aufwendige Mutationsstudien nicht möglich zu bestimmen, in welchem Bereich des Rezeptors die Konformationsänderungen erfolgen, die die erwähnten temperaturabhängigen Amid I Banden verursachen. 5. Zusammenfassung 165 Im Rahmen dieser Arbeit sollte daher ein neues Verfahren entwickelt und getestet werden, mit dem es möglich ist, positionsspezifische Informationen über strukturelle und elektrostatische Veränderungen innerhalb des NpSRII/NpHtrII-Komplexes zu erhalten. Hierzu sollte eine infrarotaktive Verbindung an verschiedene Positionen des Rezeptors sowie des Transducers gebunden werden. Die positionsspezifische Kopplung der IR-Sonde erfolgte dabei über eine Disulfidbrückenbindung mit einer Cysteinseitenkette von verschiedenen Mutanten des Rezeptors sowie des Transducers. Ursprünglich wurden aromatische Nitrile von Boxer et al. als Infrarotsonden vorgeschlagen, da die C≡N Streckschwingung zum einen sehr sensitiv auf elektrostatische Felder reagiert und das Absorptionsmaximum der Schwingungsmode zudem in einem Frequenzbereich liegt, in dem keine anderen Proteinbanden zu finden sind (Suydam et al., 2006; Suydam und Boxer, 2003). Aromatische Nitrile wurden daher in einigen Studien bereits verwendet, um die Stärke von elektrostatischen Feldern im aktiven Zentrum von Enzymen zu bestimmen (Webb und Boxer, 2008; Suydam et al., 2006). Neben lokalen elektrostatischen Feldern kann sich bei einer Proteinreaktion allerdings auch die Lösungsmittelzugänglichkeit der IR-Sonde verändern, wodurch ebenfalls deutliche Frequenzänderungen der C≡N Streckschwingungsmode zu erwarten sind. Im Rahmen dieser Arbeit sollte daher sowohl der Einfluss von elektrostatischen Feldern als auch die Auswirkungen der Wechselwirkungen mit Lösungsmittelmolekülen auf die Frequenz der C≡N Streckschwingungsmode nachgewiesen werden. Bereits die Absorptionsspektren der in verschiedenen protischen und aprotischen Lösungsmitteln gelösten Verbindung 4-Mercaptobenzonitril (4-MBN) haben bestätigt, dass die Absorptionsbande der C≡N Streckschwingungsmode infolge der Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen mit Lösungsmittelmolekülen zu höheren Wellenzahlen verschoben ist. Dieser Effekt wird mit der Verringerung des antibindenden Charakters der C≡N Bindung aufgrund der Abgabe von Ladungsträgern an den Akzeptor begründet (Cho und Cheong, 2000). Neben der Frequenzverschiebung ist auch eine deutliche Verbreiterung der C≡N Bande infolge der Interaktion mit protischen sowie dipolaren Lösungsmittelmolekülen zu beobachten, da verschiedene Komplexe gebildet werden können, die in der Zeitskala des Schwingungsübergangs stabil sind (Getahun et al., 2002). Auch innerhalb des Proteins konnte nachgewiesen werden, dass sich sowohl die Halbwertsbreite als auch die Position der C≡N Bande deutlich verschieben, wenn die IR-Sonde Zugänglichkeit zur Wasserphase hat. Dies wird insbesondere durch die Verschiebung der Absorptionsbande infolge der Bindung des Transducers an NpSRII-Mutanten deutlich, bei denen die IR-Sonde im ungebundenen Rezeptor von Wassermolekülen umgeben ist und im NpSRII/NpHtrII- 166 5. Zusammenfassung Komplex infolge von Interaktionen mit dem Transducer eine hydrophobe Proteinumgebung aufweist. Für alle Mutanten konnte dabei eine Korrelation zwischen der Lage sowie der Halbwertsbreite der C≡N Bande von 4-MBN und der Zugänglichkeit der IR-Sonde zur Protein-, Lipid- oder Wasserphase gezeigt werden. Bei Mutanten, bei denen sich die IRSonde im Proteininneren befindet, hat zudem die räumliche Nähe zu geladenen Gruppen einen starken Einfluss auf die Frequenz der C≡N Streckschwingungsmode, wie mit Hilfe elektrostatischer Berechnungen gezeigt werden konnte. Dies zeigt die Sensitivität der C≡N Streckschwingungsmode für elektrostatische Felder. Um Veränderungen des elektrostatischen Potentials in der Umgebung der IR-Sonde während des Photozyklus nachzuweisen, wurden K-Intermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektren von den verschiedenen gelabelten Mutanten gemessen, da zu diesem frühen Zeitpunkt des Photozyklus aufgrund der nur geringfügigen strukturellen Veränderungen des Photorezeptors ausschließlich elektrostatische Veränderungen im Bereich der IR-Sonden zu erwarten sind. Eine kleine Differenzbande der C≡N Streckschwingungsmode konnte dabei bei einer Mutante beobachtet werden, bei der die IR-Sonde an Helix G des Rezeptors gebunden ist. Die Differenzbande reflektiert dabei die elektrostatischen Veränderungen im Bereich der Schiff Base zu Beginn des Photozyklus, da strukturelle Veränderungen des Rezeptors auf die Retinalbindungstasche begrenzt sind und keine Auswirkungen auf die Orientierung der IR-Sonde an dieser Position haben können. Dies lässt vermuten, dass die größeren elektrostatischen Veränderungen in der Schiff Basen Region im weiteren Verlauf des Photozyklus ebenfalls mit der IR-Sonde an dieser Position detektiert werden können. Demzufolge konnte bei allen Mutanten, bei denen die IR-Sonde an die Helix G des Rezeptors gebunden ist, eine Erhöhung der Frequenz der C≡N Streckschwingungsmode im M-Intermediat beobachtet werden, was durch die Deprotonierung der Schiff Base beim Übergang zum M-Intermediat erklärt werden kann. Mit Hilfe einer an identischer Position der Helix G gelabelten D75N-NpSRII Mutante, bei der infolge der Mutation des Gegenions Asp75 diese Deprotonierung nicht stattfinden kann, konnte gezeigt werden, dass bei der entsprechenden Einfachmutante die Protonenübertragung von der Schiff Base zum Gegenion die Differenzbande der C≡N Streckschwingungsmode verursacht. Im Gegensatz zu den Mutanten, bei denen die IR-Sonde an Helix G des Rezeptors gebunden ist, haben elektrostatische Veränderungen in der Schiff Basen Region bei Kopplung der IRSonde an Helix F keinen Einfluss auf die C≡N Streckschwingungsmode. Stattdessen konnte eine Temperaturabhängigkeit der C≡N Bande von 4-MBN im Photointermediat-minus-Dunkelzustand Differenzspektrum bei einer dieser Mutanten nachgewiesen werden. Dies deutet 5. Zusammenfassung 167 stark darauf hin, dass diese Bande die strukturellen Veränderungen des Rezeptors in dieser Region reflektiert. Um zu überprüfen, ob die Bindung des Transducers einen Einfluss auf diese strukturellen Veränderungen des Rezeptors hat, wurden auch Photointermediat-minusDunkelzustand Differenzspektren des an identischer Position gelabelten NpSRII/NpHtrIIKomplexes gemessen. Die Differenzbande der C≡N Streckschwingungsmode von 4-MBN wies an dieser Position im Komplex dieselbe Temperaturabhängigkeit auf wie im ungebundenen Rezeptor, was darauf hindeutet, dass die Konformationsänderungen der Helix F auch im Komplex mit dem Transducer erfolgen können. Dieses Ergebnis ist in Übereinstimmung mit neueren EPR-Studien, die ebenfalls anzeigen, dass die Auswärtsbewegung der Helix F durch die Bindung des Transducers nicht unterbunden wird (Bordignon et al., 2007). Mit Hilfe der IR-Sonde ist es also möglich, sowohl strukturelle als auch elektrostatische Veränderungen während einer Proteinreaktion zu detektieren. Mit Hilfe des hier entwickelten Verfahrens sollte es somit möglich sein, auch weitere ungeklärte Mechanismen in Signalprozessen zu erforschen. Daher wurden mit Hilfe des IR-Labels auch Mutanten des Transducers NpHtrII untersucht, bei denen das IR-Label an die erste HAMP-Domäne des Transducers gebunden ist. Diese Domäne spielt vermutlich eine entscheidende Rolle bei der Übertragung des Signals von der Transmembrandomäne zur cytoplasmatischen Domäne des Transducers. Im Gegensatz zu den gelabelten Rezeptormutanten konnte mit Hilfe der IRSonde bei diesen Mutanten des Transducers keine signifikante Differenzbande nachgewiesen werden, was auf nur geringfügige Konformationsänderungen nach der Photoaktivierung in der HAMP-Domäne schließen lässt. Vermutlich erfolgt in der HAMPDomäne nach der Photoaktivierung daher kein Wechsel zwischen einer molten-globule ähnlichen Konformation und einer kompakteren Konformation mit einer geordneten Tertiärstruktur, wie von Doebber et al. vorgeschlagen (Doebber et al., 2008). Bei einem Wechsel zwischen diesen unterschiedlichen Faltungen sollte sich die Lösungsmittelzugänglichkeit der IR-Sonde an den gelabelten Positionen deutlich verändern, wodurch eine starke Differenzbande der C≡N Streckschwingungsmode resultieren sollte. Die Ergebnisse sind dagegen eher mit dem von Hulko et al. vorgeschlagenen Modell in Übereinstimmung, wonach die Signalamplifikation in der HAMP-Domäne durch eine geringfügige konzertierte Rotation der Helices erreicht wird, durch die keine wesentliche Veränderung der Lösungsmittelzugänglichkeit zu erwarten ist. Im Rahmen dieser Arbeit konnte durch den Einsatz einer aromatischen Nitrilverbindung als IR-Sonde ein Verfahren entwickelt und getestet werden, mit dem Konformations- und elektrostatische Veränderungen während einer Proteinreaktion detektiert werden können. Damit 168 5. Zusammenfassung konnten auch neue Erkenntnisse beim Aktivierungsmechanismus des NpSRII/NpHtrII-Komplexes gewonnen werden. Unter anderem deuten die Ergebnisse darauf hin, dass die Helix F Bewegung durch die Bindung des Transducers nicht vollständig unterbunden wird. Mit Hilfe der hier verwendeten Methode konnte somit ein Beitrag zu offenen Fragestellungen bei der Signalübertragung zum Transducer geleistet werden. Die Tatsache, dass die Sonde sowohl für elektrostatische als auch für strukturelle Veränderungen empfindlich ist, erweitert einerseits die Anwendungsmöglichkeiten, erfordert aber andererseits für die Interpretation zusätzliche Kontrollen. Literaturverzeichnis I Literaturverzeichnis Altenbach C., T. Marti, H. G. 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