Die Bedeutung des Proteinase Inhibitor 9 für die

Aus der Abteilung I der Medizinischen Universitätsklinik
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br.
(Direktor: Prof. Dr. med. R. Mertelsmann)
Die Bedeutung des Proteinase Inhibitor 9
für die Apoptoseresistenz
in leukämischen Zelllinien
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg im Breisgau
Vorgelegt 2008
von Kristina Fritsch
geboren in München
Dekan:
Prof. Dr. C. Peters
1. Gutachter:
Prof. Dr. J. Finke
2. Gutachter:
Prof. Dr. A. Schmitt-Gräff
Jahr der Promotion: 2009
I
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung ...................................................................................................................... 1
1.1
Stammzell-Transplantation .................................................................................... 1
1.2
Apoptose ................................................................................................................ 2
1.2.1
Caspasen ................................................................................................................ 3
1.2.2
Intrinsischer Weg ................................................................................................... 4
1.2.3
Extrinsischer Weg.................................................................................................. 5
1.2.4
Granula-vermittelte Zytotoxizität .......................................................................... 5
1.3
Proteinase Inhibitor 9............................................................................................. 8
1.4
Ziel der Arbeit ..................................................................................................... 10
2
Material und Methoden ............................................................................................. 11
2.1
Material ................................................................................................................ 11
2.1.1
Zellen ................................................................................................................... 11
2.1.1.1
Zelllinien .............................................................................................................. 11
2.1.1.2
Primäre Zellen ..................................................................................................... 12
2.1.2
Chemikalien und Reagenzien .............................................................................. 13
2.1.3
Antikörper ............................................................................................................ 14
2.1.4
Lösungen ............................................................................................................. 15
2.1.5
Materialien ........................................................................................................... 17
2.1.6
Geräte................................................................................................................... 17
2.2
Methoden ............................................................................................................. 18
2.2.1
Dichtezellzentrifugation ...................................................................................... 18
2.2.2
Zellkultur ............................................................................................................. 19
2.2.3
Zellzählung .......................................................................................................... 19
2.2.4
Aufreinigung der primären Leukämien ............................................................... 20
2.2.5
Herstellung von Zelllysaten ................................................................................. 21
2.2.6
Bestimmung der Proteinkonzentration ................................................................ 21
2.2.7
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ........................................ 22
II
Inhaltsverzeichnis
2.2.8
Immunopräzipitation ........................................................................................... 24
2.2.9
Isolation von zytotoxischen Granula aus YT-Zellen ........................................... 25
2.2.10
Bestimmung der enzymatischen Aktivität von Granzym B mit Hilfe eines
colorimetrischen Versuchs .................................................................................. 25
2.2.10.1
Versuche ohne Zusatz von Zelllysaten oder Zellen......................................... 26
2.2.10.2
Versuche mit Zelllysaten ................................................................................. 26
2.2.10.3
Versuche mit Zellen......................................................................................... 26
2.2.11
Durchflusszytometrie (FACS) ............................................................................. 27
2.2.11.1
Bestimmung der aktiven Caspase 3 ................................................................. 30
2.2.11.2
Überprüfung der Reinheit der aufgereinigten primären Leukämien ............... 30
2.3
Versuchsablauf .................................................................................................... 31
2.4
Angaben zur Statistik........................................................................................... 31
3
Ergebnisse ................................................................................................................... 32
3.1
PI-9 im Western Blot ........................................................................................... 32
3.1.1
PI-9 in den Zelllinien ........................................................................................... 32
3.1.2
PI-9 positive Tochterlinie der Zelllinie U937...................................................... 32
3.1.3
PI-9 in der NK-Zelllinie YT ................................................................................ 33
3.1.4
Immunopräzipitation von PI-9 aus YT-Lysat ...................................................... 34
3.1.5
PI-9 in AML-R .................................................................................................... 34
3.1.6
PI-9 in den primären Leukämiezellen ................................................................. 35
3.2
Messung der Granzym B Aktivität mit Hilfe von Ac-IEPD-pNA ...................... 36
3.2.1
Erstellung einer Zeitkurve ................................................................................... 36
3.2.2
Messung der Granzym B Aktivität nach Zugabe von Zelllysaten....................... 37
3.2.3
Ac-IEPD-pNA Versuch nach Inkubation der Zellen mit YT-Granula ................ 38
3.3
Messung der aktiven Caspase 3 ........................................................................... 39
4
4.1
Diskussion ................................................................................................................... 43
Expression von Proteinase Inhibitor 9 in leukämischen Zellen und anderen
malignen Zellen ................................................................................................... 43
4.2
Expression von Proteinase Inhibitor 9 in leukämischen Zellen .......................... 44
4.3
Hemmung der Granzym B Aktivität durch Proteinase Inhibitor 9 ...................... 46
Inhaltsverzeichnis
III
4.4
Einfluss der Expression von Proteinase Inhibitor 9 auf die Apoptoseresistenz .. 47
4.4.1
Einfluss
weiterer
Bestandteile
der
zytotoxischen
Granula
auf
die
Apoptoseresistenz ................................................................................................ 48
4.4.2
Einfluss der Proteine der Bcl-2 Familie auf die Apoptoseresistenz .................... 49
4.5
Überexpression von Proteinase Inhibitor 9 als Graft versus Leukämie Resistenz
............................................................................................................................. 50
5
Zusammenfassung ...................................................................................................... 51
6
Literaturverzeichnis ................................................................................................... 52
7
Anhang ........................................................................................................................ 66
7.1
Abkürzungsverzeichnis ....................................................................................... 66
7.2
Veröffentlichungen .............................................................................................. 69
7.3
Lebenslauf ........................................................................................................... 70
7.4
Danksagung ......................................................................................................... 71
1
Einleitung
1 Einleitung
1.1
Stammzell-Transplantation
Die allogene Stammzell-Transplantation ist heute eine wichtige Therapie in der
Behandlung
maligner
hämatologischer Erkrankungen. Hierbei wird durch eine
hochdosierte Chemotherapie mit oder ohne Ganzkörperbestrahlung eine Myeloablation
sowie eine Immunsuppression erreicht. Danach werden hämatopoetische Stammzellen
eines gesunden Spenders auf den Patienten übertragen, aus denen sich ein neues
blutbildendes System entwickeln soll. Diese können aus dem Knochenmark (KMT), aus
dem peripheren Blut (PBSCT) oder aus Nabelschnurblut (UCBT) gewonnen werden. Die
Spenderlymphozyten des Transplantats verursachen eine immunologische Reaktion gegen
den Empfängerorganismus. (Graft versus host disease = GvHD) Diese Abstoßungsreaktion
limitiert diese Therapieform. Es wurde jedoch festgestellt, dass eine GvHD das Risiko des
Auftretens eines Rezidivs vermindert, da sich die Reaktion der Spenderlymphozyten auch
gegen verbliebene Zellen des malignen Klons richtet. (Graft versus Leukämie Effekt =
GvL oder Graft versus Malignancy Effekt = GvM). So kann ein Rezidiv nach Behandlung
mit einer Transplantation auch mit der Gabe von Spenderlymphozyten (DLI) behandelt
werden. Der GvL-Effekt fehlt nach autologer Transplantation, nach Transplantation von
Stammzellen eines eineiigen Zwillings oder bei T-Zell-depletierten Transplantaten. [Kolb
1995; Finke 1998; Copelan 2006]
Einige Studien weisen darauf hin, dass für die GvHD bzw. den GvL-Effekt zytotoxische
T-Zellen und NK-Zellen verantwortlich sind. Für die Pathogenese sind drei zytotoxische
Signalwege von Bedeutung, die über Fas-L/Fas, Perforin/Granzym bzw. TNF/TNF-R
ausgelöst werden. Dabei scheint der Fas-L/Fas Signalweg hauptsächlich für die GvHD
verantwortlich zu sein und weniger für den GvL-Effekt, während der Perforin/Granzym
Signalweg beim GvL-Effekt wichtiger zu sein scheint. [Hsieh und Korngold 2000;
Schmaltz 2001; Grüllich 2005]
2
1.2
Einleitung
Apoptose
Apoptose ist die morphologische Manifestation des programmierten Zelltodes, bei der
Zellproteine und DNA durch zelleigene Proteine aktiv und energieabhängig zerstört
werden. Der Begriff kommt aus dem Griechischen und beschreibt den Prozess, wenn eine
Blüte ihre Blütenblätter verliert. Kerr prägte den Begriff aufgrund der morphologischen
Veränderungen, die die Zelle während der Apoptose durchläuft. [Kerr 1972, Kerr 2002]
Dabei kommt es typischerweise zu Zellschrumpfung, Verlust des Membrankontakts zu den
Nachbarzellen, Membranausstülpungen, Chromatinkondensation und Kernfragmentierung
sowie zum Verlust des mitochondrialen Membranpotentials und schließlich dem Zerfall in
Membranvesikel. [Shi 2004] Beim apoptotischen Zelltod kommt es zu keiner oder nur zu
einer sehr geringen Entzündungsreaktion, da die Membran dieser Vesikel intakt bleibt, bis
diese von Makrophagen phagozytiert werden. Die Apoptose betrifft meist einzelne Zellen
in einem ansonst gesunden Organ.
Im Gegensatz dazu betrifft die Nekrose häufig mehrere Zellen eines geschädigten Organs.
Dabei kommt es früh zu Zellschwellung und dem Verlust der Membranintegrität aber erst
relativ spät zur DNA-Fragmentierung. Bei der Nekrose ist regelmäßig eine entzündliche
und immunologische Reaktion zu beobachten. Nekrose kann durch chemische und
physikalische Reize ausgelöst werden. Außerdem ist sie bei mangelnder Sauerstoff- oder
Nährstoffversorgung zu beobachten, sowie bei viralen Infekten. [Leist und Jäättelä 2001;
Vermeulen 2005]
Als Modellsystem für Apoptose gilt der Nematode Caenorhabditis elegans. In dessen
Entwicklung sterben immer dieselben 131 von 1090 Zellen durch programmierten Zelltod.
Die Gene, die an der Apoptose beteiligt sind, wurden 1986 von Ellis und Horvitz
identifiziert und untersucht. Es wurden ein antiapoptotisches Gen, ced-9, und drei
proapoptotische Gene, ced-3, ced-4 und egl-1 gefunden. Ced-9 entspricht dabei dem Bcl-2
der Säuger, ced-3 den Caspasen, ced-4 Apaf-1 und egl-1 den BH3-only Proteinen. [Ellis
und Horvitz 1986; Metzstein 1998; Reed 1999; Friedlander 2003; Danial und Korsmeyer
2004; Chipuk und Green 2005]
Apoptose spielt eine wichtige Rolle in der Embryonalentwicklung, z. B. bei der
Entwicklung der Interdigitalspalten. Gewebe, das zunächst angelegt, später aber nicht mehr
benötigt wird, verschwindet durch Apoptose. Das Zusammenspiel von Proliferation und
Apoptose ist für die Aufrechterhaltung der Zellhomöostase von Bedeutung, um die
Einleitung
3
Zellzahl in Organen und Geweben kontrollieren zu können. Des weiteren spielt die
Apoptose eine entscheidende Rolle im Immunsystem. So gehen Lymphozyten, die längere
Zeit
nicht
durch
Antigenkontakt
stimuliert
werden,
in
Apoptose.
Um
Autoimmunreaktionen zu vermeiden, können autoreaktive B- und T-Lymphozyten durch
Apoptose
beseitigt
werden.
Virusinfizierte
Zellen
werden
durch
zytotoxische
T-Lymphozyten getötet, indem Apoptose induziert wird. Ungenügende Apoptose kann
sich in Tumoren oder als Autoimmunität manifestieren, während gesteigerte Apoptose für
akute und chronische degenerative Erkrankungen, Immundefizienzen und Infertilität
ursächlich ist. [Friedlander 2003; Danial und Korsmeyer 2004] Apoptose kann ausgelöst
werden 1. über den Rezeptor-vermittelten oder extrinsischen Weg, 2. über Granulavermittelte Zytotoxizität oder 3. über den intrinsischen oder mitochondrialen Weg. Dabei
sind meist Caspasen beteiligt, es wird aber auch ein apoptotischer Zelltod beschrieben, der
unabhängig von der Aktivierung von Caspasen ist. [Lockshin und Zakeri 2004; Chipuk
und Green 2005]
1.2.1 Caspasen
Wichtige Enzyme der Apoptosekaskade sind die Caspasen. Caspasen sind Sequenzspezifische Cystein-abhängige, Aspartat-spezifische Proteasen. Sie werden als inaktives
Zymogen produziert und können in Caspasen mit kurzer oder mit langer N-terminaler
Prodomäne (CARD) eingeteilt werden. Caspasen mit langer Prodomäne gehören zu den
Initiatorcaspasen der Apoptose. Dazu zählen die Caspasen 2, 8, 9 und 10. Caspasen mit
kurzer Prodomäne gehören zu den Effektorcaspasen. Dazu zählen die Caspasen 3, 6 und 7.
[Kumar 1999; Vermeulen 2005; Wang 2005] Initiatorcaspasen werden zu Beginn der
Apoptosekaskade aktivert. Sie aktivieren dann wiederum die Effektorcaspasen. Diese
zerschneiden verschiedene Proteine des Zytoskeletts und des Zellkerns und sind so für die
morphologischen Phänomene der Apoptose verantwortlich. [Waterhouse 2006] Für die
DNA-Fragmentierung ist die Inaktivierung von ICAD (Inhibitor of caspase-activated
desoxynuclease) von besonderer Bedeutung. ICAD ist im aktiven Zustand an CAD
(caspase-activated deoxynuclease) gebunden und hemmt sie dadurch. Bei der Aktivierung
von ICAD durch Caspase 3 wird CAD frei und kann dann DNA schneiden. [Waterhouse
und Green 1999; Barry und Bleackley 2002]
4
Einleitung
Insgesamt sind beim Menschen 11 verschiedene Caspasen bekannt. [Debatin und Krammer
2004; Salvesen und Abrams 2004] Sie werden entweder durch andere Caspasen oder durch
Autoproteolyse aktiviert. Die Prozessierung und Aktivierung von Caspasen kann über
Moleküle wie FADD, APAF-1, Proteine der Bcl-2 Familie, FLIP und IAPs reguliert
werden. [Ekert 1999]
1.2.2 Intrinsischer Weg
Der intrinsische oder mitochondriale Weg der Apoptose wird durch Faktoren ausgelöst, die
Zellstress verursachen, wie zum Beispiel ultraviolettes Licht, Sauerstoffmangel,
therapeutische Bestrahlung, zytostatische Medikamente, DNA-Schäden oder die
Abwesenheit von Überlebensfaktoren. Er führt zu einer Permeabilisierung der äußeren
mitochondrialen Membran (MOMP). Dies wird beeinflusst durch Proteine der Bcl-2
Familie. Bax, Bad, Bak und Bid steigern die Membrandurchlässigkeit und wirken somit
proapoptotisch, Bcl-2 und Bcl-XL wirken antiapoptotisch. Durch MOMP werden
Cytochrom C, Smac/Diablo, HtrA2/Omi und Endonuclease G aus dem Intermembranraum
des Mitochondriums freigesetzt und gelangen ins Zytoplasma. Cytochrom C bildet dort
zusammen mit APAF-1 (apoptotic-protease-activating factor 1), dATP und Procaspase 9
das Apoptosom, wodurch Caspase 9 aktiviert wird, die wiederum ihrerseits die
Effektorcaspasen aktiviert. [Alberts 2002; Alteri 2003b; Hill et al. 2003; Green and
Kroemer 2004; Chipuk und Green 2005; Wang 2005] Die Aktivierung der Endonuclease G
ist neben der Inaktivierung von ICAD der zweite Weg, der zur DNA-Fragmentierung führt.
[Barry und Bleackley 2002] Smac/Diablo und HtrA2/Omi fördern die Aktivierung von
Caspasen, indem sie die hemmende Wirkung der IAPs aufheben. [Debatin und Krammer
2004; Waterhouse 2006]
5
Einleitung
1.2.3 Extrinsischer Weg
Der extrinsische oder Rezeptor-vermittelte Apoptoseweg wird über einen LigandenRezeptor-Komplex in der Plasmamembran ausgelöst. Dabei binden Liganden aus
zytotoxischen T-Zellen (z. B. TNF, Fas-L oder TRAIL) an Rezeptoren (z. B. TNF-R, Fas
oder DR4/5) der Zellmembran, wodurch auf der zytosolischen Seite des Rezeptors die
Bindung von Adaptormolekülen stimuliert wird, die jeweils sogenannte „death domains“
(DD) und „death effector domains“ (DED) besitzen. Nach Bindung werden diese als „Fasassoziierte death domains“ (FADD) bezeichnet. Diese binden mehrere Moleküle der
inaktiv vorliegenden Procaspase 8, die sich gegenseitig aktivieren. Caspase 8 kann dann
Caspase 3 und andere Effektorcaspasen aktivieren. Außerdem schneidet Caspase 8 Bid zu
dem aktiven tBid, das MOMP induzieren kann. [Danial und Korsmeyer 2004; Chipuk und
Green 2005]
1.2.4 Granula-vermittelte Zytotoxizität
Zytotoxischen T-Lymphozyten und NK-Zellen bilden sekretorische Granula, die
verschiedene, für die Induktion von Apoptose bedeutende Proteine enthalten. Dazu
gehören unter anderem Membran zerstörende Proteine wie Perforin und Granulysin, das
Proteoglykan Serglycin sowie Granzyme. [Waterhouse und Trapani 2002; Lieberman
2003] Granzyme sind Serinproteasen, die als inaktive Zymogene synthetisiert werden und
bei ihrer Verpackung in die sekretorischen Granula aktiviert werden. Granzyme machen
dabei 90 % des Inhalts der sekretorischen Granula aus. Sie kommen in aktivierten
T-Lymphozyten, in Thymozyten und in NK-Zellen vor. Ihr pH-Optimum liegt bei 7,5. Im
Menschen sind fünf Granzyme bekannt (Granzym A, B, H, K und M). [Barry und
Bleackley 2002; Grossman 2003; Bots und Medema 2006] Die hauptsächliche Aufgabe
der Granzyme besteht darin, in virusinfizierten und anderen potentiell schädlichen Zellen
Apoptose auszulösen. Dabei hat Granzym B die stärkste apoptotische Aktivität von allen
Granzymen. Granzym B ist eine 33 kDa große Aspartase, das heißt es schneidet seine
Substrate in spezifischen Erkennungssequenzen nach Aspartatresten.
Einleitung
6
Serglycin ist ein negativ geladenes Chrondroitinsulfat-reiches Proteoglykan. Es wird davon
ausgegangen, dass die im sauren pH der sekretorischen Granula positiv geladenen Proteine
Granzym B und Perforin in Serglycin wie in einem Gerüst gelagert sind. [Metkar 2002;
Raja 2002; Lieberman 2003; Grujic 2005; Raja 2005]
Um Apoptose auszulösen entleeren zytotoxische T-Lymphozyten und NK-Zellen den
Inhalt ihrer Granula in die sektretorische Synapse, den Spalt zwischen der Effektor- und
der Zielzelle [Bossi 2002]. Dieser Vorgang ist abhängig von Calcium. Von dort gelangen
Granzyme und Perforin in das Zytosol der Zielzelle. Am effektivsten wird Granzym B in
Anwesenheit von Perforin über Endozytose in die Zelle aufgenommen. Weit weniger
effektiv scheinen die Aufnahme von Granzym B über Endozytose in Abwesenheit von
Perforin sowie die Aufnahme über Makropinozytose zu sein. [Keefe 2005] Die genauen
Mechanismen bleiben weiterhin unklar. Die frühere Annahme, dass Perforin Poren in der
Zellmembran formt, durch die Granzym in die Zelle gelangt, stellte sich als falsch heraus.
Auch über die Relevanz einer Rezeptor-vermittelten Endozytose mit Hilfe eines Kationenunabhängigen
Mannose 6-Phosphat-Rezeptors
gibt
es
sich
widersprechende
Veröffentlichungen. [Russell und Ley 2002; Trapani and Smyth 2002; Griffiths 2003; Raja
2003; Dressel 2004; Kurschus 2005; Veugelers 2004; Bird 2005; Veugelers 2006;
Giesübel 2006] Des weiteren wird die Aufnahme von Granzymen und Perforin über ein
Plasmamembran-Reparatursystem diskutiert. Dabei soll es durch die Porenbildung durch
Perforin in der Plasmamembran der attackierten Zelle zum Ca2+-Einstrom kommen.
Dadurch wird ein Reparatursystem aktiviert, bei dem es zur Fusion von Membranen von
intrazellulären Vesikeln mit der Plasmamembran kommt, um diese zu reparieren. Dabei
kommt es zur Aufnahme von Granzym B zusammen mit Perforin durch Endozytose.
[Jaiswal 2002; Russell und Ley 2002; Catalfamo und Henkart 2003; Keefe 2005] Eventuell
ist Perforin notwendig für die Freisetzung von Granzym B aus den endozytotischen
Vesikeln. Dagegen spricht allerdings, dass sich in den endozytotischen Vesikeln rasch ein
pH von etwa 4,5 einstellt, die Aktivität von Perforin bei pH Werten unter 7 jedoch schnell
abnimmt. [Smyth 2001; Waterhouse und Trapani 2002; Trambas und Griffiths 2003;
Trapani 2003]
Einmal in der Zelle, hat Granzym B unterschiedliche Angriffspunkte, um Apoptose
auszulösen. Granzym B kann direkt Caspase 3, 7, 8 und 10 aktivieren und so die CaspaseKaskade der Apoptose aktivieren. Allerdings kann Granzym B die Caspasen 3, 8 und 10
nicht vollständig aktivieren, dazu wird zusätzlich aktive Caspase 3 benötigt. Diese könnte
7
Einleitung
durch Autoprozessierung in einem zweiten Schritt nach der unvollständigen Aktivierung
durch Granzym B enstehen. [Waterhouse 2006] Außerdem kann Granzym B Bid
aktivieren, welches ein proapoptotisches BH3-only Protein der Bcl-2 Familie ist. Durch die
Aktivierung von Bid zu tBid kommt es zur Aktivierung von anderen proapoptotischen
Proteinen der Bcl-2 Familie wie Bax und Bak. Diese translozieren in die äußere Membran
des Mitochondriums und permeabilisieren diese (MOMP). Dadurch kommt es zum
Ausstrom von Cytochrom C und anderen apoptotisch wirksamen Proteinen des
Intermembranraums in das Zytosol. Des weiteren kann Granzym B das Mitochondrium
auch direkt, dann unabhängig von Bid, Bax und Bak schädigen. [Thomas 2001] Zusätzlich
zur Aktivierung dieser Apoptosewege kann Granzym B auch wichtige strukturelle und
regulatorische Proteine direkt schneiden, die auch Substrate der Effektorcaspasen sind. So
inaktiviert Granzym B ICAD, wodurch CAD frei wird und es zur DNA-Fragmentierung
kommt. Außerdem kann Granzym B DNA-PK und PARP inaktivieren, die für die DNAReparatur entscheidend sind. [Trapani 2001; Waterhouse und Trapani 2002; Catalfamo
und Henkart 2003; Lord 2003; Metkar 2003; Raja 2003; Sutton 2003; Trapani und Sutton
2003; Bredemeyer 2004; Froelich 2004; Adrain 2005; Shi 2005]
Einleitung
8
Granzym B
Bax
Granzym B
Bid
ICAD
DNA -PK
Caspase 8
PARP
Cyt C
Apaf-1
Caspase 3
Cyt C
Caspase 9
DNA -Fragmentierung
Abbildung 1: Aktivierung der Apoptose durch Granzym B. Granzym B kann über die Aktivierung von
Caspase 8 die Caspasekaskade der Apoptose aktivieren, außerdem kann Granzym B Caspase 3 auch
direkt schneiden. Des weiteren kann Granzym B den mitochondrialen Weg der Apoptose über Bid
aktivieren und Proteine, die für die DNA-Fragmentierung verantwortlich sind, direkt schneiden.
1.3
Proteinase Inhibitor 9
Proteinase Inhibitor 9 (PI-9) ist ein Serinproteinase Inhibitor (Serpin). Serpine bilden eine
im Tier- und Pflanzenreich, sowie in Viren weit verbreitete Proteinfamilie. Sie kommen
extra- und intrazellulär vor und spielen außer in der Apoptose auch bei der Gerinnung, der
Fibrinolyse und bei Entzündungsvorgängen eine wichtige Rolle. [Gettins 2000] Das
Polypeptid bildet in der Tertiärstruktur 9 α-Helices und 3 β-Faltblattstrukturen. [Silverman
2001] Proteinase Inhibitor 9 gehört zur Subfamilie der Ovalbumin- oder intrazellulären
Serpine. [Remold-O’Donnell 1993; Bladergroen 2005] PI-9 ist dabei ein hochspezifischer
Inhibitor von Granzym B. Außerdem kann PI-9 Caspase 1 und 4 hemmen, allerdings ist
Einleitung
9
diese Hemmung weit weniger effektiv als die Hemmung von Granzym B. [Annand 1999]
Die Caspasen 1 und 4 sind jedoch nicht an der Apoptose beteiligt sondern aktivieren
Zytokine. PI-9 bindet als Pseudosubstrat irreversibel an Granzym B. Bei dieser Bindung
wird
das
reaktive
Zentrum
von
PI-9
geschnitten.
Dadurch
kommt
es
zur
Konformationsänderung des hyperstabilen PI-9 und dadurch zur Konformationsänderung
der Protease. Dabei wird das katalytische Zentrum der Protease zerstört und es kommt zum
Funktionsverlust. [Dahlen 1997; Huntington 2000; Silverman 2001; Sun 2001; Zhang
2006] PI-9 ist ein zytosolisches Protein mit einer Größe von 42 kDa, das in Zellen
exprimiert wird, die Granzym B bilden, also in NK-Zellen und in T-Lymphozyten. Dabei
wird davon ausgegangen, dass Granzym B, das aus den sekretorischen Granula in das
Zytosol gelangt ist, von PI-9 abgefangen wird. So soll verhindert werden, dass die Zelle
durch ihr eigenes Granzym B in Apoptose gebracht wird. [Bird 1998; Hirst 2003]
Außerdem wird PI-9 in geringeren Mengen in Antigen-präsentierenden Zellen wie
dendritischen Zellen, Monozyten und B-Zellen gebildet, um die Zellen zu schützen, da sie
in nahem oder direkten Kontakt zu zytotoxischen Lymphozyten stehen. Außerdem kommt
es in Zellen an immunprivilegierten Stellen vor, z. B. in den Sertoli-Zellen des Hodens, in
Synzytiotrophoblasten und in spezialisierten Zellen des Ovars, des Auges und in
Endothelien. PI-9 ist der einzige bekannte natürliche Inhibitor von Granzym B. [Bird 1999;
Morris 2001; Trapani 2001; Trapani 2003] PI-9 selber kann von Granzym M geschnitten
und damit inaktiviert werden. [Mahrust 2004]
Neben einer antiapoptotischen Wirkung scheint PI-9 auch eine antiinflammatorische
Wirkung zu haben. So reduziert es über die Hemmung der Caspase 1 die Bildung
proinflammatorischer Zytokine, die für die Reifung und Migration der Zellen des
Immunsystems entscheidend sind. [Kannan-Thulasiraman und Shapiro 2002]
Es gibt Hinweise darauf, dass eine gesteigerte PI-9 Expression in Tumorzellen die
apoptotische Wirkung von Granzym B verhindert oder zumindest abschwächen kann. Dies
ist insbesondere im Zusammenhang mit dem GvL-Effekt nach Stammzelltransplantationen
interessant. Hierbei greifen NK-Zellen und zytotoxische T-Zellen die malignen Zellen
hauptsächlich über den durch Granzym B und Perforin vermittelten Apoptoseweg an.
Dabei gibt es widersprüchliche Daten darüber, ob PI-9 exprimierende leukämische Zellen
resistenter gegenüber Granzym B induzierter Apoptose sind, als Zellen, die kein PI-9
bilden. [Medema 2001; Bladergroen 2002; Classen 2004; Bots 2005; Bots 2006a; Godal
2006
10
1.4
Einleitung
Ziel der Arbeit
In meiner Arbeit sollte untersucht werden, ob eine hohe PI-9 Expression tatsächlich mit
einer hohen Apoptoseresistenz nach Apoptoseinduktion mit Granzym B korreliert. Dazu
wurde in einem ersten Schritt die Expression von Proteinase Inhibitor 9 in leukämischen
Zelllinien und primären leukämischen Zellen im Western Blot untersucht. In einem
zweiten Schritt wurde mit Hilfe eines colorimetrisch aktiven Substrats die Granzym B
Aktivität gemessen. Dazu wurden isolierte Granula der Granzym B hoch exprimierenden
Zelllinie YT verwendet (im weiteren Text werden diese als YT-Granula bezeichnet) und
untersucht, ob sich die Granzym B Aktivität durch Zugabe von PI-9 aus den verwendeten
Zelllinien senken lässt. Außerdem wurden die YT-Granula zu den ganzen Zellen der
untersuchten Zelllinien gegeben, um zu zeigen, dass Granzym B auch intrazellulär vom
PI-9 der Zellen abgefangen werden kann. Im dritten Schritt wurde mit den YT-Granula
Apoptose in den verwendeten Zelllinien induziert, um festzustellen, ob die PI-9 Expression
mit der Resistenz gegenüber Granzym B induzierter Apoptose korreliert.
11
Material und Methoden
2 Material und Methoden
2.1
Material
2.1.1 Zellen
2.1.1.1 Zelllinien
Daudi
Die humane Burkitt Lymphom Linie wurde 1967 aus der Orbitabiopsie eines 16 Jahre
alten afrikanischen Jungens mit Burkitt Lymphom etabliert. Die Zellen sind CD3-, CD10+,
CD13-, CD19+, CD20+, CD34-, CD37+, CD38+, CD79a+, cyCD79a+, CD80+, CD138-,
HLA-DR+, sm/cyIgG-, sm/cyIgM+, sm/cykappa+, sm/cylambda-. [Klein 1968]
Jurkat
Die humane T-ALL Linie wurde 1976 aus dem peripheren Blut eines 14 Jahre alten
Jungens mit ALL etabliert. Die Zellen sind CD2+, CD3+, CD4(+), CD5+, CD6+, CD7+,
CD8-, CD13-, CD19-, CD34+, TCRalpha/beta+, TCRgamma/delta-. [Schneider 1977]
K562
Die humane CML Linie wurde 1970 aus dem Pleuraerguss einer 50 Jahre alten Frau mit
CML in der Blastenkrise etabliert. Die Zellen sind CD3-, CD13+, CD19-, CD20-, CD34-,
CD41(+), CD42+, CD45+, CD71+, CD79a-, cyCD79a+, CD80-, CD235a(+). [Lozzio und
Lozzio 1975]
U937
Die humane histiozytische Lymphom Linie wurde 1974 aus dem Pleuraerguss eines
37 Jahre alten Mannes mit generalisiertem diffusen histiozytären Lymphom etabliert. Die
Zellen sind CD3-, CD4+, CD13(+), CD14-, CD15+, CD19-, CD33+, CD34+, CD54+,
CD68+. [Sundstrom und Nilsson 1976]
12
Material und Methoden
U937PI9+
Nachdem die Linie U937 über Monate in Kultur behalten wurde, entstand die PI-9 positive
Tochterlinie U937PI9+. Die Zellen sind CD4+, CD13+, CD33+ und CD45+.
YT
Die humane T/NK-Zellleukämie Linie wurde 1983 aus der Perikardflüssigkeit eines
15 Jahre alten Jungens mit ALL etabliert. Der Patient hatte ein begleitendes Thymom. Die
Zellen sind CD2-, CD3-, CD4-, CD5-, CD6-, CD7+, CD8-, CD13-, CD19-, CD25+,
CD30+, CD34-, TCRalpha/beta-, TCRgamma/delta-. [Yodoi 1985]
LCL1 und 2
Die B-lymphoblastoide Zellen entstanden aus EBV-immortalisierten B-Lymphozyten.
AML-R
Die Zellen wuchsen aus einer AML und ließen sich über Monate in Kultur halten. Die
Zellen sind CD7+, CD13-, CD19-, CD33-, CD34-, CD38+, CD45+, CD79a-, CD117-,
HLADR+, MPO+.
2.1.1.2 Primäre Zellen
Tabelle 1: Primäre Leukämiezellen
Blastenanteil
Oberflächenantigene
T-ALL 1
92 %
CD1a+, CD3+, CD4+, CD5+, CD7+, CD38+
Reifzellige B-ALL 2
59 %
CD19+, CD22+, CD38+, CD43+, CD79a+
AML 1
77 %
CD33+, CD117+
AML 2
> 95 %
CD11c+, CD13+, CD33+, CD117+
AML 3
89 %
CD11c+, CD13+, CD14+, CD15+, CD33+, CD34+,
CD65+, CD117+
AML 4
80 %
CD11c, CD33+, CD56+, CD65+
AML 5
50 %
CD13+, CD19-, CD33+, CD34+, CD38-, CD79a-,
CD117+, HLADR+, MPO+,
13
CLL 1
nd
CD20+
CLL 2
nd
CD20+
CLL 3
nd
CD20+
Material und Methoden
2.1.2 Chemikalien und Reagenzien
Ac-IEPD-pNA
Biomol, Hamburg, D
40 % Acrylamid
Bio-Rad, Hercules, USA
Albumin
Roth, Karlsruhe, D
Ammoniumpersulfat
Bio Rad Laboratories GmbH, München, D
Aprotinin
Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
BCA Protein Assay Kit
TM
Pierce, Rockford, USA
Cytofix/Cytoperm
BD Biosciences, San Jose, USA
Dimethylsulfoxid (DMSO)
Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
DTT
Roth, Karlsruhe, D
ECL plus Western Blotting Detection
Amersham Biosciences, Little Chalfont, GB
System
EDTA
Serva Boehringer, Heidelberg, D
EGTA
Bio Rad Laboratories GmbH, München, D
Ethanol
Mallinckrodt Baker B.V., Deventer, NL
Fetales Kälberserum (FCS)
Invitrogen Gibco, Karlsruhe, D
Glycerol
Serva Boeringer, Heidelberg, D
Glycin
Merck, Darmstadt, D
Hepes
Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Kaleidoscope Pestained Standards
Bio-Rad, Hercules, USA
L-Glutamin (200 mM)
Invitrogen Gibco, Karlsruhe, D
Leupeptin
Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Lymphozyten-Separationsmedium
PAA Laboratories, Cölbe, D
MACS Puffer
Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, D
Mercaptoethanol
Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
14
Material und Methoden
Methanol
Merck, Darmstadt, D
NaCl
Fluka, Buchs, CH
Non Essential Amino Acids (100 mM)
Invitrogen Gibco, Karlsruhe, D
Nonidet P 40
Calbiochem, Schwalbach, D
Penicillin 10000 U/ml / Streptomycin 10000 Invitrogen Gibco, Karlsruhe, D
µg/ml
Perm/WashTM Puffer
BD Biosciences, San Jose, USA
Phosphate buffered saline (PBS)
Invitrogen Gibco, Karlsruhe, D
PMSF
Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Ponceau S
Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Protein A/G PLUS-Agarose
Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz,
USA
PVDF-Membran ImmoblilonTM-P
Millipore Corporation, Bedford, USA
Re-Blot Plus Mild
Chemicon, Temecula, USA
RMPI 1640
Invitrogen Gibco, Karlsruhe, D
SDS ultra pure
Roth, Karlsruhe, D
Skim Milk Powder
Fluka, Buchs, CH
Sodium Pyruvat 100 mM
Invitrogen Gibco, Karlsruhe, D
TEMED
Roth, Karlsruhe, D
Trizma base
Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Trypanblau 0,4 %
Invitrogen Gibco, Karlsruhe, D
Tween 20
Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
2.1.3 Antikörper
Mab to Proteinase Inhibitor 9 (mAb PI9-17) Alexis, San Diego, USA
ECL Anti-mouse IgG, Horseraddish
Amersham Biosciences, Little Chalfont, GB
Peroxidase linked
FITC anti-CD19
FITC anti-CD33
BD Biosciences, San Jose, USA
15
Material und Methoden
FITC Mouse IgG1
FITC-conjugated anti-active Caspase 3
monoclonal antibody
Anti-CD3 MicroBeads
Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, D
Anti-CD14 MicroBeads
Anti-CD19 MicroBeads
Anti-CD56 MicroBeads
2.1.4 Lösungen
Blockpuffer
3 g Trockenmilchpulver
3 g Albumin
auf 100 ml mit PBS auffüllen
IEPD-Versuchspuffer 50 mM Hepes, pH 7,4
100 mM NaCl
1 mM EDTA
0,1 % NP-40
10 % Glycerol
in H2O
Ladepuffer
2/3 Laemmli Puffer
1/3 Mercaptoethanol
Laemmli Puffer (3 x) 2,4 ml 1 M Tris – HCl pH 6,8
3 ml 20 % SDS
3 ml Glycerol
6 mg Bromphenolblau
auf 10 ml mit H2O auffüllen
16
Laufpuffer (10 x)
30,3 g Trizma Base
144 g Glycin
10 g SDS
auf 1 l mit H2O auffüllen
Lyse Puffer
NP-40
1:200 PMSF (Endkonzentration: 0,5 mM)
1:100 Leupeptin (Endkonzentration: 1 µg/ml)
1:100 Aprotinin (Endkonzentration: 1 µg/ml)
Puffer A
0,2 M Hepes pH 7,5
0,1 M KCl
0,1 M MgCl
0,1 M NaEGTA
0,5 M NaEDTA
in H2O
Sammelgel (4,8 %)
1,86 ml H2O
0,75 ml 4x Tris-Puffer pH 6,8
0,36 ml 40 % Acrylamid
30 µl 10 % APS
3 µl TEMED
Transferpuffer (10 x) 30,3 g Trizma Base
144 g Glycin
auf 1 l mit H2O auffüllen
Trenngel (12%)
4,39 ml H2O
2,5 ml 4x Tris-Puffer pH 8,8
3 ml 40 % Acrylamid
100 µl 10 % APS
10 µl TEMED
Material und Methoden
17
Material und Methoden
4x Tris Puffer pH 8,8 18,15 g Trizma base
0,4 g SDS
auf 100 ml mit H2O auffüllen
mit HCl auf pH 8,8 einstellen
4x Tris Puffer pH 6,8 6,05 g Trizma base
0,4 g SDS
auf 100 ml mit H2O auffüllen
mit HCl auf pH 6,8 einstellen
2.1.5 Materialien
Einfrierröhrchen
Corning, Corning, USA
HyperfilmTM ECL
Amersham Biosciences, Little Chalfont, GB
MACS Separationssäulen
Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, D
Pipettenspitzen 10 µl, 20 µl, 200 µl, Molecular Bioproducts, San Diego, USA
1000 µl
Polystyrol-FACS-Röhrchen 5 ml
Falcon BD, F
Reaktionsgefäße 1,5 ml, 2 ml
Eppendorf, Deutschland, D
Reaktionsgefäße 14 ml, 50 ml
Falcon BD, F
Stripetten 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml,
Falcon BD, F
50 ml
Zellkulturflaschen 25 cm2, 75 cm2,
Falcon BD, F
175 cm2
Zellkulturplatten 96-well
Falcon BD, F
2.1.6 Geräte
Biofuge 15 Eppendorfzentrifuge
Heraeus, Hanau, D
Brutschrank Heracell
Heraeus, Hanau, D
18
Material und Methoden
Durchlichtmikroskop CK2
Olympus Optical GmbH, Hamburg, D
FACS Calibur mit CellQuest-
BD-Pharmingen, Franklin Lakes, USA
Software
Filmkassette
Siemens, Erlangen, D
Heizblock
Liebisch, Bielefeld, D
MACS Magnetic Multi Stand mit
Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, D
MACS Mini Separation Unit
Magnetrührer RCT basic
IKA Labortechnik, Staufen, D
Mikro 20 Eppendorfzentrifuge
Hettich, Tuttlingen, D
Netzgerät EPS 300
Pharmacia Biotech, San Francisco, USA
Neubauer-Zählkammer
Brand, Wertheim, D
Omnifuge 2.0 SF
Heraeus, Hanau, D
Pipetboy
Gilson, Middleton, USA
Pipetten 10 µl, 20 µl, 200 µl, 1000
Corning, USA
µl
Shaker Mini Rocker MR-1
Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, D
Typon Optimax
Raymed, Duedingen, CH
Vortex
Bender & Holbein AG, Zürich, CH
Waage
Scaltec Instruments GmbH, Göttingen, D
Wasserbad GFL 1083
Hilab, Düsseldorf, D
Western Blot Kammern
Bio Rad Laboratories GmbH, München, D
Zellhomogenisator PelletPestle
Kimble-Kontes, Vineland, USA
2.2
Methoden
2.2.1 Dichtezellzentrifugation
Bei der Dichtezellzentrifugation werden aus Vollblut Lymphozyten und Monozyten
extrahiert. Dabei wurden 9 ml Vollblut mit 26 ml PBS verdünnt und in einem 50 ml
Falcon-Röhrchen auf 15 ml Ficoll-Lösung aufgeschichtet. Die Röhrchen wurden bei
Raumtemperatur 20 min bei 2000 U/min bei ausgeschalteter Bremse zentrifugiert, bis sich
19
Material und Methoden
vier scharf abgrenzbare Phasen bildeten. Die Erythrozyten bildeten ein Sediment am
Boden des Röhrchens, die Lymphozyten und Monozyten befanden sich in der milchigtrüben Interphase. Diese Interphase wurde vorsichtig abgenommen und zweimal mit PBS
gewaschen, wobei die Zellen in 50 ml PBS aufgenommen und bei Raumtemperatur bei
2000 U/min in 5 min sedimentiert wurden. Der Überstand wurde verworfen. Ein Teil der
Zellen wurde sofort weiterverarbeitet, der Rest wurde entweder eingefroren oder in Kultur
genommen.
Das Einfriermedium bestand aus RMPI 1640 Medium mit 20 % FCS und 10 % DMSO. Es
wurden jeweils 1x107 Zellen in 1 ml Einfriermedium bei –80 °C eingefroren und nach
einigen Tagen in den Stickstofftank überführt.
2.2.2 Zellkultur
Es wurden Zellkulturen der Zelllinien in RMPI 1640 Medium
mit 10 % FCS, 1 %
Glutamin, 1 % Penicillin/Streptomycin, 1 % nicht essentiellen Aminosäuren und 1 %
Natriumpyruvat angelegt. Die Kulturen wurden in feuchter Atmosphäre mit 5 %
Kohlendioxid bei 37 °C gehalten. Das Medium wurde bei Farbänderung des Mediums von
rot nach orange-gelb, etwa alle 3 Tage, gewechselt. Die primären Leukämien konnten über
ca. 1 Woche in Kultur gehalten werden.
2.2.3 Zellzählung
Alle verwendeten Zellen wuchsen in Suspension. Zellen, die Kolonien bildeten, mussten
vor der Zellzählung durch mehrmaliges Durchmischen der Zellsuspension mit Hilfe einer
10 ml Pipette, voneinander getrennt werden. Zellen, die als Einzelzellen wuchsen, konnten
direkt gezählt werden. Es wurden jeweils 10 µl Zellsuspension mit 10 µl Trypanblau
vermischt (Verdünnungsfaktor 2). Bei Zellen, die sehr dicht wuchsen, wurden zusätzlich
80 µl PBS dazugemischt (Verdünnungsfaktor 10). Zur Zellzählung wurden jeweils 10 µl
20
Material und Methoden
der Mischung in eine Neubauerzählkammer pipettiert. Es wurden 4 x 16 Quadrate
ausgezählt. Die Berechnung der Zellzahl erfolgte nach folgender Formel:
gezählte Zellzahl
Zellzahl
x Verdünnungsfaktor x 10000 =
4
ml
2.2.4 Aufreinigung der primären Leukämien
Die primären Leukämiezellen mussten vor der Verwendung aufgereinigt werden. Dabei
läuft die Zellsuspension durch eine MACS-Säule, die sich in einem magnetischen Feld
befindet. Dadurch werden Zellen, die vorher mit einem speziellen Antikörper markiert
wurden, an den Eisen gebunden ist, in der Säule zurückgehalten.
Für die Aufreinigung wurden die Zellen 2 x in MACS Puffer gewaschen und danach in
100 µl MACS Puffer aufgenommen. Es wurden von jedem benötigten Antikörper 20 µl in
den Ansatz pipettiert und 20 min bei 4 °C inkubiert. Danach wurden die Zellen 1 x in
MACS Puffer gewaschen und dann in 0,5 ml MACS Puffer aufgenommen. Auf die MACS
Säule wurden 0,5 ml MACS Puffer gegeben, um die Säule zu befeuchten. Die
Zellsuspension wurde dann auf die Säule gegeben, nach dem Durchlaufen aufgefangen und
erneut auf die Säule gegeben und mit 3 x 0,5 ml MACS Puffer nachgespült. Die unten
aufgefangene Zellfraktion wurde weiterverwendet, die Fraktion in der Säule verworfen.
Die Reinheit der aufgereinigten Zellen wurde mit dem Durchflusszytometer überprüft.
Tabelle 2: Zur Aufreinigung der primären Leukämien verwendeten Antikörper
Zellen
verwendete Antikörper
AML 1
Anti-CD3 MicroBeads, anti-CD19 MicroBeads, anti-CD14 MicroBeads, antiCD56 MicroBeads
AML 2
Anti-CD3 MicroBeads, anti-CD19 MicroBeads, anti-CD14 MicroBeads, antiCD56 MicroBeads
AML 3
Anti-CD3 MicroBeads, anti-CD19 MicroBeads, anti-CD14 MicroBeads, antiCD56 MicroBeads
21
AML 4
Material und Methoden
Anti-CD3 MicroBeads, anti-CD19 MicroBeads, anti-CD14 MicroBeads, antiCD56 MicroBeads
ALL 1
-
ALL 2
Anti-CD3 MicroBeads, anti-CD14 MicroBeads, anti-CD56 MicroBeads
CLL 1
Anti-CD3 MicroBeads, anti-CD14 MicroBeads
CLL 2
Anti-CD3 MicroBeads, anti-CD14 MicroBeads
CLL 3
Anti-CD3 MicroBeads, anti-CD14 MicroBeads
2.2.5 Herstellung von Zelllysaten
Es wurden 5 x 106 Zellen bei 2000 U/min in 5 min sedimentiert und einmal in PBS
gewaschen. Dabei wurden die Zellen in 1 ml PBS resuspendiert und bei 2000 U/min
abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, die Zellen in 50 µl Lyse Puffer
aufgenommen und 30 min auf Eis inkubiert. Die Proben wurden bei 13000 U/min 5 min
abzentrifugiert, der Überstand wurde in ein neues Eppendorfröhrchen überführt. Das Pellet
wurde verworfen. Nach Bestimmung der Proteinkonzentration wurden die Proben bei
-20 °C eingefroren.
2.2.6 Bestimmung der Proteinkonzentration
Die Bestimmung der Proteinkonzentration erfolgte mit Hilfe des BCA Protein Assay Kits.
Lösung A und Lösung B wurden im Verhältnis 50:1 gemischt. Zur Erstellung einer
Proteinstandardkurve wurden in eine 96-Lochplatte mit flachem Boden 0 µl, 2 µl, 4 µl und
8 µl einer BSA-Lösung (Konzentration: 2 µg/µl) pipettiert. Dazu wurden jeweils 200 µl
des Gemisches aus Lösung A und B gegeben. Aus den Proben wurden 2 µl in die
96-Lochplatte pipettiert und ebenfalls mit 200 µl des Gemisches aus Lösung A und B
versetzt. Alle Ansätze wurden in doppelter Ausführung durchgeführt. Die Platte wurde
30 min bei 37 °C inkubiert. Die Absorptionsmessung erfolgte in einem Platereader bei
575 nm. Durch die Messwerte der BSA-Lösungen mit bekannter Konzentration wurde eine
22
Material und Methoden
Ausgleichsgerade gelegt mit deren Hilfe die Konzentrationen der Proben bestimmt werden
konnten.
2.2.7 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
In der SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese werden Proteine auf Grund ihres
Molekulargewichts elektrophoretisch in Anwesenheit des denaturierenden, anionischen
Detergens Natriumdodecylsulfat (SDS) in Richtung Anode in einem Polyacrylamidgel
aufgetrennt, wobei große Proteine langsamer durch die Gelporen wandern als kleine.
Durch Variation des Vernetzungsgrads und somit der Porengröße des Gels kann eine
optimale Auftrennung der Proteine erreicht werden. Das negativ geladene Detergens SDS
bindet an hydrophobe Proteinbezirke, wodurch es zum Entfalten der Eiweiße und zur
Aufhebung der Wechselwirkungen mit anderen Proteinen und Lipiden kommt. Die
aufgetrennten Eiweiße können anschließend mittels Western Blot-Technik detektiert
werden.
Es wurden 1,5 mm dicke Gele gegossen. Dazu wurde die Kammer bis ca. 2,5 cm unter
dem Rand mit dem Trenngel (12 %) gefüllt und mit Ethanol bedeckt, um eine glatte
Oberfläche auf dem Trenngel herzustellen. Nach dem Erhärten des Trenngels wurde das
Ethanol abgegossen und der Rest der Kammer mit dem Sammelgel aufgefüllt. In das noch
flüssige Gel wurde der Kamm gesteckt, welcher nach dem Erhärten wieder entfernt wurde.
Es wurde jeweils 100 µg Protein aufgetrennt. Dazu wurde jeweils 100 µg Protein der
Proben mit destilliertem Wasser auf die gleiche Menge aufgefüllt und mit dem Ladepuffer
versetzt. Der Ladepuffer bildete dabei 1/3 des Gesamtladevolumens. Das Bromphenolblau
des Ladepuffers ist bei pH > 4 ein blauer Farbstoff und macht so die Bande während der
Auftrennung sichtbar. Die Proben wurden 5 min bei 105 °C auf dem Heizblock gekocht
und dann in die Geltaschen pipettiert. Als Größenmarker wurden 15 µl einer gefärbten
Standardproteinlösung (Kaleidoscope Prestained Standards) in die erste Tasche pipettiert.
Das Gel wurde in die Trennkammer gestellt und mit Laufpuffer bedeckt. Die
Trennkammer wurde ihrerseits an ein Netzgerät angeschlossen, wobei die probennahe
Elektrode negativ war. Um die Proteine an der Grenze zwischen Sammel- und Trenngel zu
sammeln, wurde für 45 min eine Spannung von 75 V angelegt. Die eigentliche
23
Material und Methoden
Auftrennung der Proteine im Trenngel erfolgte bei 120 V in ca. 2 h, bis die mit
Bromphenol angefärbte Lauffront das untere Ende des Gels erreicht hatte.
Mit Hilfe der Western Blot-Technik wurde nun ein „Abklatsch“ des Gels auf eine
Polyvinyldifluorid (PVDF)-Membran gemacht. Dafür wurde die Membran 30 s in
Methanol, 3 min in H2O und dann 15 min in Transfer Puffer eingelegt. Ebenso wurden
Filterpapier und Schwämme der Transferkammer in Transfer Puffer eingeweicht. Für den
Transfer wurde ein „Sandwich“ geschichtet. Dabei befand sich das Gel anodennah, die
Membran kathodennah. Zwischen Gel, bzw. Membran und Transferkammer befanden sich
innen jeweils zwei Filterpapierstreifen und außen je ein Schwamm (s. Abb.5).
Der Transfer erfolgte in Transfer Puffer bei 15 V in 6 h.
Anode +
Schwamm
Gel
je zwei Filterpapierstreifen
PVDFMembran
Kathode -
Schwamm
Abbildung 2: Aufbau des Transfer-Sandwichs
Um die Qualität des Transfers zu überprüfen, wurde die Membran in H2O gespült und
dann kurz in Ponceau-S getaucht. Der rote Farbstoff Ponceau-S bindet reversibel an die
Proteine auf der Membran. Um den Farbstoff wieder auszuwaschen, wurde die Membran
3 x 5 min auf dem Shaker in PBS mit 0,1 % Tween gewaschen.
Um die freien Proteinbindungsstellen auf der Membran zu blockieren, wurde die Membran
für 12 h bei 4 °C in Blockpuffer inkubiert.
Für den Antigennachweis wurde der Primärantikörper anti-PI-9 im Verhältnis 1:2500 in
PBS-Tween (0,1 %) gelöst. Die Membran wurde damit 2 h bei Raumtemperatur auf dem
Shaker inkubiert und nach der Inkubation mit dem Primärantikörper 3 x 5 min in PBSTween (0,1 %) gewaschen. Die Inkubation mit dem mit Horseraddish-Peroxidase
konjugierten Sekundärantikörper erfolgte in 1 h bei Raumtemperatur auf dem Shaker. Der
24
Material und Methoden
Sekundärantikörper wurde im Verhältnis 1:5000 in Blockpuffer gelöst. Nach der
Inkubation wurde die Membran 3 x 5 min in PBS-Tween (0,1 %) gewaschen.
Zur Detektion des Signals wurde die Membran 7 min in ECL Detektionslösung auf dem
Shaker inkubiert. Die Lösung wurde frisch aus 0,5 ml Lösung A und 125 µl Lösung B des
ECL Detection Systems hergestellt. Die Peroxidase des Sekundärantikörpers bildet mit
dem Luminol der ECL Lösung in einer chemischen Reaktion Lichtquanten, die mit Hilfe
eines Autoradiographiefilms sichtbar gemacht werden können. Dafür wird der Film auf die
Membran aufgelegt und danach in einem Röntgenfilmentwicklungsgerät entwickelt.
Falls eine Membran auf unterschiedliche Proteine getestet werden sollte, mussten schon
gebundene Antikörper wieder von der Membran entfernt werden. Dazu wurde die
Membran 15 min in PBS gewaschen und danach 15 min in Reblot plus mild (10 % in H2O)
eingelegt. Danach wurde die Membran 3 x 5 min in PBS-Tween (0,1 %) gewaschen und in
Blockpuffer bei 4 °C aufbewahrt.
2.2.8 Immunopräzipitation
5 x 106 YT-Zellen wurden 1 x in PBS gewaschen. Dabei wurden die Zellen in 1 ml PBS
aufgenommen und dann bei Raumtemperatur bei 2000 U/min in 5 min sedimentiert. Alle
darauf folgenden Waschschritte wurden nach demselben Schema durchgeführt. Danach
wurden die Zellen in 1 ml Lyse Puffer 30 min auf Eis inkubiert. Die Probe wurde bei
13000 U/min in 5 min abzentrifugiert und der Überstand in ein neues Eppendorfröhrchen
gegeben. Das Pellet wurde verworfen. Der Überstand wurde 1 h bei 4 °C mit dem
Primärantikörper inkubiert, in diesem Fall mit 5 µl anti-PI-9. Danach wurden 20 µl Protein
A/G PLUS-Agarose dazugegeben und 6 h bei 4 °C inkubiert. Die Probe wurde dabei
immer wieder gemischt, da sich Protein A/G PLUS-Agarose sehr schnell absetzt. Die
Probe wurde bei 2500 U/min in 10 min bei 4 °C abzentrifugiert. Der Überstand wurde
abgenommen und bei –20 °C eingefroren. Das Pellet wurde 3 x in NP-40 Puffer
gewaschen und danach in 20 µl Lade Puffer resuspendiert. Dieses Gemisch wurde 5 min
bei 105 °C auf der Heizplatte gekocht und danach in 2 Portionen bei –20 °C eingefroren.
Für die Elektrophorese wurde ein 1,5 mm dickes Gel (12 %) hergestellt. Eine Portion des
eingefrorene Pellets in Loading Puffer wurde aufgetaut und komplett auf das Gel
Material und Methoden
25
aufgetragen. Der Überstand wurde als Kontrolle auch auf das Gel aufgetragen. Dabei
wurden 22 µl (53 µg Protein) mit 11 µl Loading Puffer vermischt und 5 min bei 105 °C auf
der Heizplatte gekocht. Der Rest des Versuchs wurde wie in 2.2.7 durch geführt.
2.2.9 Isolation von zytotoxischen Granula aus YT-Zellen
Es wurden die Zellen aus zwei großen Zellkulturflaschen verwendet (ca. 5 x 107 Zellen).
Die Zellen wurden bei 2000 U/min in 5 min sedimendiert. Der Überstand wurde
verworfen. Die Zellen wurden zweimal in PBS gewaschen. Dazu wurden die Zellen in
1 ml PBS resuspendiert und bei 2000 U/min in 5 min abzentrifugiert. Das Pellet wurde in
0,5 ml Puffer A resuspendiert und 15 min auf Eis inkubiert. In dieser Zeit fand die
hypotone Schwellung der Zellen statt. Danach wurden die Zellen mehrmals mit einem
Pellet Pestle homogenisiert, um die Zellmembran aufzubrechen. Dabei wurde die Probe
weiterhin auf Eis behalten, um die Temperatur niedrig zu halten. Die Probe wurde bei 2500
U/min
in
10 min
abzentrifugiert
und
der
Überstand
abgenommen.
Die
Proteinkonzentration des Überstands wurde bestimmt. Es wurden Aliquots mit je 300 µg
Protein bei –20 °C eingefroren.
Vor Verwendung der YT-Granula wurde ein Ionenausgleich gemacht. Die Endlösung
enthielt 5 mmol/l CaCl2 und 117,5 mmol/l NaCl.
2.2.10 Bestimmung der enzymatischen Aktivität von Granzym B mit Hilfe eines
colorimetrischen Versuchs
Ac-IEPD-pNA (P4-P1) entspricht der optimalen Erkennungssequenz von Granzym B.
[Rotonda 2001] Bei der Spaltung von Ac-IEPD-pNA durch Granzym B wird
Paranitroanilid (pNA) frei, dessen Absorption bei 405 nm gemessen werden kann. [Harris
1998] So kann über die Absorption von pNA auf die Enzymaktivität von Granzym B
geschlossen werden. Ac-IEPD-pNA wurde in DMSO gelöst (50 mM) und bei –20 °C
aufbewahrt.
26
Material und Methoden
2.2.10.1 Versuche ohne Zusatz von Zelllysaten oder Zellen
Um die Abhängigkeit der Reaktion von der Zeit und von der eingesetzten Menge der YTGranula zu untersuchen wurden unterschiedliche Mengen YT-Granula mit H2O auf 10 µl
verdünnt und in eine 96-Loch-Flachbodenplatte gegeben. Der IEPD-Versuchspuffer wurde
mit DTT versetzt (Endkonzentration: 10 mM). Zu jedem Ansatz wurden 90 µl IEPDVersuchspuffer und 0,4 µl Ac-IEPD-pNA gegeben (Endkonzentration 0,2 mM) und bei
37 °C inkubiert. Die Absorption wurde zu unterschiedlichen Zeitpunkten bei 405 nm in
einem Microplatereader gemessen.
2.2.10.2 Versuche mit Zelllysaten
Jeweils 100 µg Protein des Zelllysats wurden mit unterschiedlichen Mengen der YTGranula versetzt und mit H2O auf 30 µl aufgefüllt. Die Ansätze wurden 30 min bei
Raumtemperatur inkubiert. Die Kontrolle bestand aus 100 µg Protein des Zelllysats ohne
YT-Granula. Auch die Kontrolle wurde ebenfalls mit H2O auf 30 µl aufgefüllt. Der IEPDVersuchspuffer wurde mit DTT versetzt (Endkonzentration: 10 mM). Nach Inkubation
wurden die Ansätze in einer 96-Loch-Flachbodenplatte mit 70 µl IEPD-Versuchspuffer
und 0,4 µl Ac-IEPD-pNA versetzt (Endkonzentration 0,2 mM) und bei 37 °C inkubiert.
Nach 30 min wurde die Absorption bei 405 nm in einem Microplatereader gemessen.
2.2.10.3 Versuche mit Zellen
Jeweils 2 x 106 Zellen wurden in 140 µl Medium mit 10 µg YT-Granula für 4 h bei 37 °C
inkubiert. Dabei wird das Granzym B der YT-Granula in die Zellen aufgenommen. Die
Kontrolle bestand aus 2 x 106 Zellen in 140 µl Medium ohne YT-Granula. Nach der
Inkubation wurden die Zellen lysiert. Dazu wurden die Zellen 1 x in PBS gewaschen und
danach in 50 µl Lyse Puffer aufgenommen, 30 min auf Eis inkubiert und bei 13000 U/min
in 5 min abzentrifugiert. 30 µl des Überstands wurden in eine 96-Loch-Flachbodenplatte
Material und Methoden
27
gegeben. Der IEPD-Versuchspuffer wurde mit DTT versetzt (Endkonzentration: 10 mM).
Zu jedem Ansatz wurden 70 µl IEPD-Versuchspuffer und 0,4 µl Ac-IEPD-pNA gegeben
(Endkonzentration 0,2 mM) und bei 37 °C inkubiert. Nach 30 min wurde die Absorption
bei 405 nm in einem Microplatereader gemessen.
2.2.11 Durchflusszytometrie (FACS)
Bei der Durchflusszytometrie werden Einzelzellen einer Zellsuspension, die durch eine
Kapillare strömen, von mehreren Lichtquellen abgetastet. Die Einzelimpulse werden von
Impulshöhenanalysatoren verarbeitet und zu Verteilungskurven zusammengesetzt. Zum
einen wird das Streulicht gemessen. Dabei wird zwischen Vorwärtsstreulicht und
Seitwärtsstreulicht unterschieden. Vorwärtsstreulicht wird auch Forward-Scatter (FSC),
Seitwärtsstreulicht Side-Scatter (SSC) genannt. FSC wird vor allem von der Größe der
Zelle bestimmt, während beim SSC auch der Inhalt der Zelle, das heißt die Granularität
eine Rolle spielt. Anhand von Zellgröße und Zellgranularität können unterschiedliche
Zellpopulationen voneinander abgegrenzt werden.
Außerdem können spezifische Antigene auf der Zelloberfläche oder auch im Zellinneren
mit fluoreszierenden monoklonalen Antikörpern markiert werden, um die Zellen in
verschiedene Populationen unterteilen zu können. Die unterschiedlichen Fluoreszenzen
können in verschiedenen Kanälen des Durchflusszytometers gemessen werden. In dieser
Arbeit wurden nur mit Fluoreszein-Isothiocyanat (FITC) markierte Antikörper verwendet.
FITC ist ein Fluoreszenzfarbstoff, der Licht mit einer Wellenlänge von 530 nm emittiert.
Diese
Grünfluoreszenz
wird
von
einem
entsprechenden
Filter
(FL1)
des
Durchflusszytometers detektiert. Der Messbereich dieses Filters liegt bei 530 ± 15 nm. Aus
jeder Probe wurden 10000 Zellen gemessen.
Zu jeder Probe wurde eine Kontrolle gemessen, die mit einem mit Fluoreszenzfarbstoff
markierten unspezifischen Antikörper gefärbt wurde, um die Hintergrundaktivität aus der
spezifisch positiven Fraktion herausrechnen zu können. Dazu wurde mit der Cell Quest®Software der Marker M1 so in das Histogramm der Kontrolle gelegt, dass der Hauptanteil
der Zellen unter ihm zu liegen kam. Über den Rest des Histogramms wurde der Marker M2
gelegt (s. Abb. 3). Diese Marker wurden in das Histogramm der Probe übernommen, die
28
Material und Methoden
mit dem mit dem spezifischen Fluoreszenzfarbstoff markierten Antikörper gefärbt wurde.
Die Zellen unter M1 wurden als Apoptose-negativ, die Zellen unter M2 als Apoptosepositiv bezeichnet.
Abbildung 3: Durchflusszytometrie, Messung der aktiven Caspase 3, Histogramm. In der Kontrolle
wird die Apoptose-negative Fraktion festgelegt, in dem der Marker M1 so gesetzt wird, dass er den
Hauptanteil der Zellen einschließt. Die restlichen Zellen werden unter dem Marker M2 eingeschlossen.
Diese Marker werden in das Histogramm der spezifisch gefärbten Probe übertragen. Die Zellen, die
dort unter M1 zu finden sind, werden als Apoptose-negativ, die Zellen unter M2 als Apoptose-positiv
bezeichnet.
In Ansätzen, bei denen die Kontrollen schon viele toten Zellen enthielten, sollten nur die
lebenden Zellen gemessen werden. Dazu wurde im Dotplot der Kontrolle ein Gate um die
lebendige Population gelegt (s. Abb. 4A). Im Anschluss wurde nur von den Zellen
innerhalb des Gates ein Histogramm erstellt (s. Abb. 4B).
Die spezifisch positive Fraktion der Ansätze wurde mit folgender Formel errechnet:
spezifisch pos. Fraktion =
pos. Fraktion des Ansatzes − pos. Fraktion der Kontrolle
x100
100 − pos. Fraktion der Kontrolle
29
Material und Methoden
Abbildung 4: Durchflusszytometrie, Messung der aktiven Caspase 3, (A) Dotplot. Es wurde ein Gate
um die lebenden Zellen gelegt, um ein Histogramm von diesen Zellen erstellen zu können. (B)
Histogramm. Das Histogramm wurde nur aus den Zellen erstellt, die im Dotplot in A innerhalb des
Gates lagen.
30
Material und Methoden
2.2.11.1 Bestimmung der aktiven Caspase 3
Caspase 3 wird in der Effektorphase der Apoptosekaskade aktiviert. Daher ist die aktive
Caspase 3 ein guter Marker für Apoptose. Sie kann intrazellulär mit einem Antikörper
markiert werden, an den Fluoreszein-Isothiocyanat (FITC) gekoppelt ist.
Für den Versuch wurden 1 x 106 Zellen in 70 µl Medium aufgenommen. Apoptose wurde
mit YT-Granula induziert. Dazu wurden 10 µg Protein der YT-Granula in den Ansatz
pipettiert (Endkonzentration 0,14 µg/µl). Die Kontrolle bestand aus 1 x 106 Zellen in 70 µl
Medium ohne YT-Granula.
Die Ansätze wurden 6 h bei 37 °C inkubiert und danach 2 x in PBS gewaschen. Dabei
wurden die Zellen jeweils in 5 ml PBS aufgenommen und in 5 min bei 2000 U/min
sedimentiert. Um die Zellen zu permeabilisieren wurden sie in 0,5 ml Cytofix/Cytoperm
aufgenommen und darin 20 min auf Eis inkubiert. Danach wurden die Zellen 2 x in 0,5 ml
Perm/Wash Puffer gewaschen. Um die aktive Caspase 3 zu markieren, wurden die Zellen
30 min bei Raumtemperatur mit 12 µl FITC-anti-aktive Caspase 3 in 100 µl Perm/Wash
Puffer inkubiert. Zu den Ansätzen wurden für die Analyse im Durchflusszytometer 0,5 ml
Perm/Wash Puffer gegeben.
2.2.11.2 Überprüfung der Reinheit der aufgereinigten primären Leukämien
Um die Reinheit der aufgereinigten primären Leukämien zu überprüfen, wurden 50 µl der
Zellsuspension mit 150 µl PBS und 5 µl eines mit FITC markierten Antikörpers inkubiert,
der gegen spezifische Antigene der Leukämiezellen gerichtet war. Die Inkubation erfolgte
in 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. Als Kontrolle wurden 50 µl der
Zellsuspension mit 150 µl PBS und 5 µl FITC Maus IgG1 inkubiert.
Tabelle 3: Zur Kontrolle der Aufreinigung der primären Leukämiezellen verwendete Antikörper
Zellen
verwendete Antikörper
AML 1
FITC anti-CD33
AML 2
FITC anti-CD33
AML 3
FITC anti-CD33
Material und Methoden
31
AML 4
FITC anti-CD33
ALL 1
-
ALL 2
FITC anti-CD19
CLL 1
FITC anti-CD19
CLL 2
FITC anti-CD19
CLL 3
FITC anti-CD19
2.3
I.
Versuchsablauf
Nachweis von Proteinase Inhibitor 9 in leukämischen Zelllinien und primären
Leukämiezellen mittels Western Blot
II.
Nachweis der Aktivität von Granzym B mit Hilfe eines colorimetrisch aktiven
Substrats
a) in YT-Granula
b) in den Lysaten der untersuchten Zellen nach Zugabe von YT-Granula
c) in den untersuchten Zellen nach Zugabe von YT-Granula
III.
Durchflusszytometrische
Messung
der
aktiven
Caspase 3
nach
Apoptoseinduktion mit YT-Granula.
2.4
Angaben zur Statistik
Die Western Blots der Zelllinien wurden jeweils mindestens zweimal durchgeführt, die
Western Blots der primären Zellen nur einmal. Alle Ac-IEPD-pNA- und CaspaseVersuche wurden dreimal durchgeführt. Außerdem wurden die einzelnen Ac-IEPD-pNAVersuche in doppelten Ansätzen gemacht. Aus den 3 bzw. 6 Werten wurden Mittelwert
und Standardfehler errechnet.
32
Ergebnisse
3 Ergebnisse
3.1
PI-9 im Western Blot
Um zu untersuchen, ob Proteinase Inhibitor 9 in leukämischen Zelllinien und primären
Leukämiezellen abberant exprimiert wird, wurden Western Blots gemacht.
3.1.1 PI-9 in den Zelllinien
Die Zelllinien konnten anhand den Expressionsmustern in den Western Blots in vier
Gruppen eingeteilt werden: Jurkat und U937 exprimieren kein PI-9, LCL1 hat eine
niedrige PI-9 Expression, K562 und LCL2 haben eine mittlere PI-9 Expression, Daudi und
U937PI9+ haben eine hohe PI-9 Expression. (s. Abb. 5)
Abbildung 5: Western Blot mit anti-PI-9 der Linien Daudi, Jurkat, K562, U937, einer PI-9-positiven
Tochterlinie der Linie U937 sowie zwei LCLs. Es wurden 100 µg Protein aufgetragen. Die erwartete
Bande lag bei 42 kDa. Exemplarische Abbildung eines representativen Blots.
3.1.2 PI-9 positive Tochterlinie der Zelllinie U937
Die Zelllinie U937 veränderte sich nach langer Passagezeit. Als nach dieser Zeit erneut die
PI-9-Expression im Western Blot untersucht wurde, stellte sich heraus, dass die vorher
PI-9 negative Linie nun PI-9 positiv geworden war. Es wurde eine durchflusszytometrische
33
Ergebnisse
Kontrolle des Phänotyps der PI-9 positiven Tochterlinie durchgeführt. Die Zellen sind
CD45+, sowie teilweise CD4+, CD13+ und CD33+. Für die Spur U937 (s. Abb. 6) wurden
die Zellen der ursprünglichen Linie frisch aufgetaut.
Abbildung 6: Western Blot mit anti-PI-9 der Linie U937 und eines PI-9 positive Tochterlinie dieser
Linie. Es wurden 100 µg Protein aufgetragen. Die erwartete Bande lag bei 42 kDa. Exemplarische
Abbildung eines representativen Blots.
3.1.3 PI-9 in der NK-Zelllinie YT
YT ist eine NK-Zelllinie, die Granzym B in großen Mengen exprimiert. Für die Versuche,
bei denen Granzym B benötigt wurde, wurde Granzym B aus YT-Zellen aufgereinigt. Im
Western Blot ist zu sehen, dass die Zelllinie auch PI-9 hoch exprimiert (s. Abb. 7 Bande
bei ca. 42 kDa).
Abbildung 7: Western Blot mit anti-PI-9 der NK-Zelllinie YT. Es wurden 100 µg Protein aufgetragen.
Bei etwa 42 kDa zeigt sich eine Bande, die PI-9 entspricht. Der Komplex von PI-9 und Granzym B ist
etwa 63 kDa groß. Exemplarische Abbildung eines representativen Blots.
34
Ergebnisse
3.1.4 Immunopräzipitation von PI-9 aus YT-Lysat
Es wurde eine Immunopräzipitation von PI-9 aus YT-Lysat durchgeführt. Dabei wurde das
Präzipitat sowie der Überstand in einer SDS-PAGE elektrophoretisch aufgetrennt. Der
Western Blot wurde mit anti-PI-9 inkubiert. PI-9 und der Komplex von PI-9 und
Granzym B werden hierbei immunopräzipitiert während Granzym B im Überstand bleibt.
Außerdem sieht man die Banden der leichten sowie der schweren Kette des zur
Immunopräzipitation verwendeten Antikörpers. (s. Abb. 8)
Abbildung 8: Immunopräzipitation von PI-9 aus YT-Lysat und anschließendem Western Blot mit antiPI-9. PI-9 (42 kDa) und der Komplex aus PI-9 und Granzym B (63 kDa) werden immunopräzipitiert,
während das freie Granzym B (33 kDa) im Überstand verbleibt. Exemplarische Abbildung eines
representativen Blots.
3.1.5 PI-9 in AML-R
AML-R ist eine primäre akute myeloische Leukämie M4, die sich über Monate in Kultur
halten ließ. Es wurde eine Phänotypisierung der Zellen am FACS durchgeführt. Anhand
des Markerprofils ist zu erkennen, dass es sich nicht um eine LCL handelt, da die
B-Zellmarker CD19 und CD79a negativ sind. Die Oberflächenmarker CD7, CD38, MPO
35
Ergebnisse
und HLA-DR sind positiv. Im Vergleich zu den ursprünglichen primären Zellen wurden
die vorher positiven Marker CD13, CD33, CD34 und CD117 negativ.
Im Western Blot zeigt sich, dass die Zellen PI-9 hoch exprimieren, außerdem bilden die
Zellen Granzym B. Der Komplex von PI-9 und Granzym B hat eine Größe von 63 kDa und
wird vom verwendeten Antikörper erkannt. Des weiteren werden zwei Banden bei 38 kDa
und bei 25 kDa erkannt, die Spaltprodukte von PI-9 darstellen könnten. (s. Abb. 9)
Abbildung 9: Western Blot mit anti-PI-9 der Granzym B enthaltenden AML-R. Es wurden 100 µg
Protein aufgetragen. Die erwartete Bande für PI-9 lag bei 42 kDa, der Komplex aus Granzym B und
PI-9 hat eine Größe von 63 kDa. Exemplarische Abbildung eines representativen Blots.
3.1.6 PI-9 in den primären Leukämiezellen
Die primären Leukämiezellen wurden durch Magnetsäulenseparierung (MACS) negativ
aufgereinigt. T-Zellen wurden mit anti-CD3, myelomonozytäre Zellen mit anti-CD14,
B-Zellen mit anti-CD19 und NK-Zellen mit anti-CD56 aussortiert. Zur Erhöhung der
Reinheit wurde dieser Vorgang einmal wiederholt und im Anschluss daran eine
durchflusszytometrische Reinheitskontrolle durchgeführt. PI-9 wird in den leukämischen
Zellen aberrant exprimiert. Die beiden untersuchten ALLs sind PI-9 negativ. AML1 ist
stark PI-9 positiv, AML2 und AML3 sind PI-9 positiv, AML4 ist PI-9 negativ. CLL1 und
CLL2 sind PI-9 positiv, CLL3 ist PI-9 negativ. (s. Abb. 10)
36
Ergebnisse
Abbildung 10: Western Blot mit anti-PI-9 der untersuchten primären Leukämien. Es wurde 100 µg
Protein aufgetragen. Die erwartete Bande lag bei 42 kDa.
3.2
Messung der Granzym B Aktivität mit Hilfe von Ac-IEPD-pNA
3.2.1 Erstellung einer Zeitkurve
Um zu untersuchen, ob das Granzym B der aufgereinigten YT-Granula aktiv ist und das
spezifische Substrat schneidet und colorimetrisch aktiviert, wurden verschiedene Mengen
der YT-Granula mit Ac-IEPD-pNA versetzt. Daraufhin wurde an mehreren Zeitpunkten
eine Absorptionsmessung durchgeführt.
Die Aktivität steigt abhängig von der eingesetzten Menge der YT-Granula sowie der Zeit.
Dabei nähert sich die Kurve bei ansteigendem t einer Asymptote (s. Abb. 11). Für die
Versuche mit Zelllysaten bzw. mit Zellen wurde der Messzeitpunkt 30 min festgelegt, da
zu diesem Zeitpunkt die Kurve noch linear verläuft.
Ergebnisse
37
9
8
7
A/A0
6
0,5 µg
1 µg
2 µg
4 µg
5
4
3
2
1
0
0
100
200
300
400
t (min)
Abbildung 11: Colorimetrische Messung der Aktivität von Granzym B aus YT. Unterschiedliche
Mengen der YT-Granula wurden mit jeweils der gleichen Menge Ac-IEPD-pNA versetzt. Zu mehreren
Zeitpunkten wurde die Aktivität von Granzym B gemessen. A ist die gemessene Aktivität, A0 ist die
Granzym B Aktivität der Kontrolle. Ausdruck der Aktivität ist die Absorption bei 405 nm.
3.2.2 Messung der Granzym B Aktivität nach Zugabe von Zelllysaten
In einem zweiten Schritt sollte untersucht werden, ob sich die Granzym B Aktivität durch
Zugabe eines PI-9 haltigen Lysats senken lässt. Dazu wurden jeweils 100 µg Protein des
Daudi- und des Jurkatlysats mit unterschiedlichen Mengen der YT-Granula 30 min
inkubiert, anschließend Ac-IEPD-pNA zugegeben und die Absorption gemessen.
Wie erwartet lässt sich die Granzym B Aktivität durch Zugabe des PI-9 haltigen
Daudilysats senken. Diese Absenkung der Granzym B Aktivität ist bei Zugabe von
Jurkatlysat, das kein PI-9 enthält, nicht zu beobachten (s. Abb. 12).
Ergebnisse
38
7
6
A/A0
5
4
Daudi
Jurkat
3
2
1
0
0
5
10
15
20
25
30
35
YT-Granula (µg)
Abbildung 12: Colorimetrische Messung der Aktivität von Granzym B aus YT. Jeweils 100 µg des
Lysats von Daudi bzw. Jurkat wurden mit unterschiedlichen Mengen der YT-Granula für 30 min
inkubiert. Danach wurde Ac-IEPD-pNA zugegeben und die Aktivität von Granzym B nach 30 min
bestimmt. A ist die gemessene Aktivität, A0 ist die Granzym B Aktivität der Kontrolle. Ausdruck der
Aktivität ist die Absorption bei 405 nm.
3.2.3 Ac-IEPD-pNA Versuch nach Inkubation der Zellen mit YT-Granula
Im dritten Schritt sollte die Hemmung der Granzym B Aktivität durch PI-9 in ganzen
Zellen nachgewiesen werden.
Die Zellen wurden 4 h mit 10 µg YT-Granula inkubiert. Das Granzym B der YT-Granula
wird dabei in die Zellen aufgenommen. Danach wurden die Zellen gewaschen und lysiert.
Dieses Lysat wurde anschließend mit Ac-IEPD-pNA versetzt und die Absorption von
freiem pNA nach 30 min gemessen. Die Granzym B Aktivität ist in den Zellen, die PI-9
bilden (Daudi, AML-R, U937PI9+) deutlich niedriger als in den Zellen, die wenig (LCL1
und 2, K562) oder gar kein (U937, Jurkat) PI-9 bilden (s. Abb. 13).
Ergebnisse
39
3,0
A/A0
2,5
2,0
1,5
Ju
rk
at
U
93
7
LC
L2
K
56
2
LC
L1
7P
I9
+
R
U
93
M
L-
A
D
au
di
1,0
Abbildung 13: Colorimetrische Messung der Aktivität von Granzym B aus YT. Jeweils 10 Mio Zellen
wurden für 4 h mit 10 µg YT-Granula inkubiert und danach lysiert. Die Lysate wurden 30 min mit AcIEPD-pNA inkubiert, danach wurde die Aktivität von Granzym B in den Lysaten bestimmt. In der
Abbildung links sind die PI-9 positiven Zellen, rechts die PI-9 negativen aufgetragen.
3.3
Messung der aktiven Caspase 3
Die Zellen wurden 6 h mit 10 µg YT-Granula inkubiert um Apoptose auszulösen. Danach
wurde die aktive Caspase 3 durchflusszytometrisch bestimmt. Da Caspase 3 während der
Apoptose aktiviert wird, kann über die aktive Caspase 3 auf die Apoptoserate der Zellen
geschlossen werden. Es wird davon ausgegangen, dass die zellulären Vorgänge, die zur
Apoptose führen, nicht mehr umkehrbar sind, sobald Caspase 3 aktiviert ist. Anhand der
Formel in Kapitel 2.2.11 wurde die spezifische Apoptoserate ausgerechnet. Die Ergebnisse
sind in den Abbildungen 14-17 dargestellt. Dabei sind in Abb. 14 die Zellen mit hoher PI-9
Expression (Daudi, AML-R, U937PI9+) dargestellt, in Abb. 15 die Zellen mit mittlerer
PI-9 Expression (LCL1), in Abb. 16 die Zellen mit niedriger PI-9 Expression (K562,
LCL2) und in Abb. 17 die Zellen ohne PI-9 Expression (U937, Jurkat). Die weiße Kurve
stellt jeweils die Apoptoserate der Kontrolle dar, die blaue Kurve zeigt die Apoptoserate
nach Apoptoseinduktion mit Granzym B. Die spezifische Apoptoserate ist in den
Histogrammen jeweils unten rechts als Prozentzahl angegeben. Sie korreliert negativ mit
40
Ergebnisse
der PI-9 Expression der verschiedenen Zelllinien. Dieses Ergebnis ist in Abb. 18 noch
einmal zusammengefasst.
Abbildung 14: Durchflusszytometrische Messung der aktiven Caspase 3 der Zelllinien mit hoher PI-9
Expression.
41
Ergebnisse
Abbildung 15: Durchflusszytometrische Messung der aktiven Caspase 3 der Zelllinie mit mittlerer
PI-9 Expression.
Abbildung 16: Durchflusszytometrische Messung der aktiven Caspase 3 der Zelllinien mit niedriger
PI-9 Expression.
Ergebnisse
42
Abbildung 17: Durchflusszytometrische Messung der aktiven Caspase 3 der Zelllinien ohne PI-9
Expression.
spez. Apoptoserate (%)
50
40
30
20
10
Ju
rk
at
93
7
U
LC
L2
56
2
K
LC
L1
D
au
di
A
M
LR
U
93
7P
I9
+
0
Abbildung 18 Durchflusszytometrische Messung der Aktivität der Caspase 3. Die spezifische
Apoptoserate korreliert negativ mit der PI-9 Expression der Zellen.
Diskussion
43
4 Diskussion
4.1
Expression von Proteinase Inhibitor 9 in leukämischen Zellen und anderen
malignen Zellen
Es gibt mehrere Studien, in denen die PI-9 Expression verschiedener Tumorentitäten
untersucht und teilweise mit klinischen Daten korreliert wurde. Diese Studien kommen
jedoch zu unterschiedlichen Ergebnissen.
Zwei Studien, die Patienten mit großzelligem anaplastischem Lymphom bzw. Patienten
mit metastasiertem Melanom untersuchen, kommen zu dem Ergebnis, dass eine hohe PI-9
Expression mit einer schlechten Prognose assoziiert ist. [ten Berge 2002; van Houdt 2005]
In einer weiteren Studie wurden Patienten mit primär nodalem diffusen großzelligen
B-Zell Lymphom untersucht. Dabei konnte keine Korrelation zwischen der PI-9
Expression und der Überlebenszeit hergestellt werden. [Muris 2004]
Des weiteren gibt es eine Studie, in der Patienten mit nasalem NK/T-Zell Lymphom
untersucht wurden. In dieser Studie wurde die PI-9 Expression der Tumoren mit dem
Überleben sowie mit dem krankheitsfreien Überleben korreliert. Erstaunlicherweise war
hier eine hohe PI-9 Expression der Zellen mit einer guten Prognose assoziiert. In dieser
Arbeit wird spekuliert, dass in NK/T-Zell Lymphomen der Verlust von PI-9 für eine
Entdifferenzierung spricht, da normale NK-Zellen PI-9 exprimieren. [Bossard 2007]
Außerdem wurde die PI-9 Expression bei Patienten mit Ewing Sarkom untersucht. Es
wurde in keinem der Tumoren eine PI-9 Expression gefunden. [de Hooge 2007] In
nasopharyngealen Karzinomen war die Fallzahl der PI-9 positiven Tumoren so gering, dass
eine Korrelation mit klinischen Daten nicht sinnvoll war. [Oudejans 2002] Auch in
Hodgkin und Non-Hodgkin Lymphomen sowie in Mamma, Cervix und Colon Karzinomen
wurden PI-9 exprimierende Tumoren gefunden. [Medema 2001; Bladergroen 2002] Der
Nachweis der PI-9 Expression wurde bei Medema et al. und bei de Hooge et al. mittels
PCR
erbracht.
In
den
anderen
erwähnten
Studien
wurde
der
Nachweis
immunhistochemisch oder im Western Blot mit dem Antikörper PI9-17 durchgeführt.
Zusammenfassend kann also festgestellt werden, dass PI-9 in unterschiedlichen
Tumorentitäten aberrant exprimiert wird. In zwei Studien war eine PI-9 Expression der
44
Diskussion
Tumorzellen mit einem schlechten Überleben der Patienten assoziiert, in einer Studie
konnte keine Korrelation festgestellt werden und in einer Studie war eine PI-9 Expression
der Tumorzellen mit einem guten Überleben der Patienten korreliert. Obwohl die
Studienlage nicht eindeutig ist, kann weiterhin davon ausgegangen werden, dass PI-9
exprimierende Tumorzellen besser vor Granzym B induzierter Apoptose geschützt und
somit resistenter sind als Tumorzellen, die kein PI-9 exprimieren. Sicherlich spielen auch
andere Mechanismen, die den Tumorzellen ermöglichen, der Überwachung des
Immunsystem zu entkommen oder die sie resistenter gegenüber Therapien machen, eine
entscheidende Rolle. Auch könnten andere Mechanismen den Effekt einer PI-9
Überexpression beeinflussen. Außerdem ist es wahrscheinlich, dass Granzym B induzierte
Apoptose nicht in allen Tumorentitäten und nicht unter allen therapeutischen Bedingungen
eine gleich wichtige Rolle spielt.
In der vorliegenden Arbeit sollte der Einfluss von PI-9 auf die Ganzym B-induzierte
Apoptose auf molekularer Ebene gezeigt werden.
4.2
Expression von Proteinase Inhibitor 9 in leukämischen Zellen
PI-9 wurde als Inhibitor von Granzym B beschrieben. Über die Relevanz liegen
widersprüchliche Ergebnisse vor.
In dieser Arbeit wurde die PI-9 Expression in leukämischen Zelllinien mit Hilfe des
Western Blots untersucht. Dabei konnte festgestellt werden, dass PI-9 mit einer großen
Variabilität in leukämischen Zelllinien exprimiert wird. Anhand der Expression von PI-9
wurden die untersuchten Zellen in vier Gruppen eingeteilt: Die Zelllinien Daudi, AML-R
und U937PI9+ haben eine hohe PI-9 Expression, die Zelllinie LCL1 hat eine mittlere PI-9
Expression, die Zelllinien K562 und LCL2 haben eine niedrige PI-9 Expression, die
Zelllinien U937 und Jurkat bilden kein PI-9.
YT ist eine NK-Zelllinie, die sehr viel Granzym B enthält. Das für die Versuche
verwendete Granzym B wurde aus YT-Zellen aufgereinigt.
Es wurde eine Immunopräzipitation mit anti-PI-9 der YT-Granula durchgeführt, in der der
Nachweis einer stabilen Bindung zwischen PI-9 und Granzym B erbracht werden konnte.
Dabei wurden das Präzipitat sowie der Überstand elektrophoretisch aufgetrennt. Der
45
Diskussion
Western Blot wurde mit anti-PI-9 inkubiert. PI-9 sowie der Komplex aus PI-9 und
Granzym B werden immunopräzipitiert. Granzym-B verbleibt im Überstand. Die Banden,
die den Spaltprodukten des Komplexes entsprechen könnten, erscheinen nach
Immunopräzipitation deutlicher als im normalen Western Blot.
AML-R ist eine primäre akute myelomonozytäre Leukämie, die sich als Linie in Kultur
halten ließ.
Nach sehr häufiger Passage der Linie U937 entstand die PI-9 positive Tochterlinie
U937PI9+. Die durchflusszytometrische Phänotypisierung bewies, dass es sich bei
U937PI9+ um eine Tochterlinie von U937 handelt. U937PI9+ und U937 sind beide positiv
für die Marker CD4, CD13 und CD33. Besonders die Übereinstimmung des Markerprofils
für CD4 ist ein starker Hinweis dafür, da CD4 ein aberranter Marker der histiozytären
Linie U937 ist.
Neben den leukämischen Zelllinien, wurden auch einige primäre Leukämien untersucht.
Dazu wurden die Zellen mit Hilfe der Magnetsäulenseparierung (MACS) negativ
aufgereinigt und anschließend ein Western Blot durchgeführt. Bei den untersuchten ALLs
sind 0 von 2 PI-9 positiv, bei den AMLs sind 3 von 4 PI-9 positiv und bei den CLLs sind 2
von 3 PI-9 positiv. PI-9 kann somit in Leukämiezellen aberrant exprimiert werden. Um
weitergehende Aussagen zu treffen, sind die Fallzahlen allerdings zu gering.
Die Zelllinien YT, Daudi, Jurkat und K562 wurde auch von Godal auf ihre PI-9 Expression
untersucht. [Godal 2006] Dabei wurde der Antikörper anti-PI-9 7D8 verwendet und damit
ein durchflusszytometrischer Expressionsnachweis durchgeführt. Godal konnte keine PI-9
Expression in Jurkat und Daudi feststellen, K562 war PI-9 positiv, YT stark PI-9 positiv.
Im Gegensatz zu der Arbeit von Godal wurde der Expressionsnachweis bei uns mit Hilfe
von Western Blots durchgeführt. Konsistent mit den Ergebnissen von Godal konnte eine
Expression von PI-9 in YT und in K562 nachgewiesen werden, während Jurkat PI-9
negativ ist. Die Zelllinie Daudi zeigt in den hier durchgeführten Versuchen eine hohe PI-9
Expression während sie bei Godal PI-9 negativ ist. Dies könnte daran liegen, dass nicht der
gleiche Antikörper verwendet wurde und der Nachweis mit unterschiedlichen Methoden
erfolgte. Eine andere Möglichkeit könnte sein, dass PI-9 in einem Komplex mit einem
anderen Protein vorliegt, der dann in der Durchflusszytometrie von dem verwendeten
Antikörper nicht erkannt wird. Dieser Komplex könnte in der SDS-Gelelektrophorese
denaturiert werden, sodass der Antikörper das nun freie PI-9 erkennen könnte.
46
4.3
Diskussion
Hemmung der Granzym B Aktivität durch Proteinase Inhibitor 9
Um die hemmende Wirkung von PI-9 auf Granzym B nachzuweisen, wurde zunächst ein
Ansatz gewählt, in dem mit Hilfe des colorimetrisch aktiven Substrats Ac-IEPD-pNA die
enzymatische Aktivität von Granzym B untersucht wurde. Dabei entspricht die
Aminosäuresequenz des Substrats der spezifischen Erkennungssequenz von Granzym B.
Die Umsetzung des Substrats durch Granzym B erfolgt zeit- und dosisabhängig. Durch
Zugabe von Lysaten der verwendeten Zelllinien zu aufgereinigtem Granzym B aus YTZellen kann die Granzym B Aktivität gesenkt werden, wobei die Senkung der Aktivität mit
der PI-9 Expression der Zelllinie korreliert. PI-9 bildet mit Granzym B einen Komplex.
Dabei bindet das aktive Serin der Protease an das reaktive Zentrum des Serpin, wodurch
dieses geschnitten wird. Dadurch kommt es zu einer Konformationsänderung von
Granzym B, das dadurch seine Funktion verliert. Diese Hemmung ist irreversibel.
[Huntington 2000; Zhang 2006] Um diese Hemmung der Granzym B Aktivität durch PI-9
auch in ganzen Zellen nachzuweisen, wurde Granzym B zu den verwendeten Zelllinien
gegeben. Das Granzym B wird in die Zellen aufgenommen und kann dann im Zytoplasma
von PI-9 komplexiert werden, wenn die entsprechende Zelle PI-9 exprimiert. Nach der
Inkubation mit Granzym B wurden die Zellen lysiert. Wie erwartet, korreliert die
Granzym B Aktivität in den Lysaten negativ mit der PI-9 Expression der Zelllinie.
Die enzymatische Aktivität von Granzym B wird mit Hilfe eines colorimetrischen
Substrats gemessen. Ac-IEPD-pNA ist dabei die optimale Erkennungssequenz für
Granzym B. [Thornberry 1997; Harris 1998]
Ac-IEPD-pNA wurde in einigen Studien verwendet, um die Expression von Granzym B
nachzuweisen. [Grujic 2005; Giesübel 2006; Jahrsdörfer 2006; Sipione 2006] Allerdings
gibt es noch keine Studie, in der gezeigt wird, dass durch Zugabe von PI-9 zu Granzym B
und folgender Komplexbildung zwischen Granzym B und PI-9 die Granzym B Aktivität
gesenkt werden kann.
Diskussion
47
4.4
Einfluss der Expression von Proteinase Inhibitor 9 auf die Apoptoseresistenz
Um zu untersuchen, ob die PI-9 Expression und damit auch die Senkung der Granzym B
Aktivität nach Zugabe von Granzym B mit der Apoptoseresistenz einer Zelle korreliert,
wurden Apoptoseversuche durchgeführt. Dazu wurde Apoptose mit aufgereinigtem
Granzym B aus YT-Zellen induziert und die aktive Caspase 3 in den Zellen im FACS
nachgewiesen. Aktive Caspase 3 ist ein guter Marker für Apoptose, da davon ausgegangen
werden kann, dass die zellulären Vorgänge, die zur Apoptose der Zelle führen, nicht mehr
umkehrbar sind, sobald Caspase 3 aktiviert ist. Die spezifische Apoptoserate korreliert
negativ mit der PI-9 Expression. Das PI-9 im Zytosol der untersuchten Zellen kann also die
Aktivität von zugeführtem Granzym B hemmen und somit die Apoptose verhindern.
Classen et al. untersuchten Zellen mit unterschiedlicher PI-9 Expression im Western Blot.
Dafür wurden die Lysate dieser Zellen mit Granzym B in steigender Konzentration
inkubiert. Auf den Blots der PI-9 exprimierenden Zellen erschien mit steigender
Granzym B Konzentration der Komplex von PI-9 und Granzym B, sowie die aktive
Caspase 3. Konsistent mit meinen Ergebnissen zeigt dies, dass das PI-9 das zugegebene
Granzym B komplexiert und es zur Aktivierung der Caspase 3 und somit zur Induktion von
Apoptose kommt. Außerdem wurden Ko-Inkubationen mit YT-Zellen durchgeführt. Dabei
wurden die Patientenzellen mit YT-Zellen in unterschiedlichen Verhältnissen inkubiert.
Die Apoptoserate wurde durchflusszytometrisch nach Färbung der Zellen mit
Propidiumjodid (PI) bestimmt. Es zeigte sich, dass die Zellen mit hoher PI-9 Expression
weniger in Apoptose gingen, als die Zellen mit niedriger PI-9 Expression. [Classen 2004]
Allerdings wurde dieser Ko-Inkubation nur mit zwei Patientenproben durchgeführt, sodass
diese Ergebnisse wenig aussagekräftig sind.
Auch in der in Kapitel 4.2 erwähnten Veröffentlichung von Godal et al. [Godal 2006]
wurden Ko-Inkubationen durchgeführt. Als Effektorzellen wurden hierbei Lymphokinaktivierten NK-Zellen und zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) verwendet, die in
unterschiedlichen
Verhältnissen
zu
den
untersuchten
Zelllinien
und
primären
Lymphomzellen gegeben wurden. Die Apoptoserate wurde durchflusszytometrisch über
die
Färbung
mit
FITC-markiertem
VAD-FMK
bestimmt.
VAD-FMK
ist
ein
Pseudosubstrat der Caspasen und weist so die Aktivierung dieser nach. Es konnte keine
Korrelation zwischen der PI-9 Expression der Zellen und der Apoptoserate hergestellt
48
Diskussion
werden. Eventuell ist in den Ko-Inkubationen das Verhältnis der Effektor- zu Zielzellen zu
hoch (bis 20:1), sodass das PI-9 der Zielzellen nicht ausreicht, um das Granzym B der
Effektorzellen ausreichend zu hemmen. Außerdem ist bekannt, dass Lymphokin-aktivierte
NK-Zellen deutlich größere Mengen an Granzym B bilden als NK-Zellen aus dem
peripheren Blut [Bots 2006b]. Es könnte also sein, dass die von Godal et al. hergestellten
in vitro Bedingungen die in vivo Situation nicht ausreichend gut repräsentieren und der
Effekt von PI-9 durch die Potenz der verwendeten Lymphokin-aktivierten Effektorzellen
überdeckt wird.
4.4.1 Einfluss weiterer Bestandteile der zytotoxischen Granula auf die
Apoptoseresistenz
In den durchgeführten Versuchen wurde Apoptose nicht mit reinem Granzym B sondern
mit den aufgereinigten Granula der YT-Zellen induziert. Dabei ist zu beachten, dass diese
Granula neben Granzym B weitere Proteine enthalten, die einen Einfluss auf den Zelltod
der Zielzellen haben könnten. In eigenen nicht-veröffentlichten Labordaten konnte
allerdings gezeigt werden, dass die apoptose-induzierenden Aktivität nur von Granzym B
ausgeht. In den beiden oben erwähnten Arbeiten von Godal und Classen wurden KoInkubationen mit YT-Zellen, aktivierten NK-Zellen und CTL durchgeführt. Diese
Effektorzellen induzieren Apoptose hauptsächlich Granula-vermittelt. Dabei wirken neben
Granzym B auch andere Proteine der Granula auf die Zielzellen ein. Dazu gehören die
Granzyme A und M.
Granzym A löst einen Caspase-unabhängigen Zelltod aus, der nicht apoptotisch ist
[Lieberman und Fan 2003; Bots 2006a; Waterhouse 2006]. Durch den Nachweis der
Apoptose über den Nachweis der aktiven Caspase 3 oder den Nachweis der generellen
Caspasenaktivierung durch VAD-FMK kann diese Art von Zelltod ausgeschlossen werden.
Bei Classen et al. kann dies nicht ausgeschlossen werden, da dort der Apoptosenachweis
über PI-Färbung erbracht wurde.
Ein weiteres Protein, das in den zytotoxischen Granula der NK-Zellen und CTL vorkommt,
ist Granzym M. Granzym M kann wie Granzym A einen Caspase-unabhängigen Zelltod
auslösen, der nicht apoptotisch ist [Sayers 2001; Kelly 2004]. Auch dieser kann über den
49
Diskussion
Nachweis der aktiven Caspase 3 bzw. der generellen Caspasenaktivierung durch VADFMK ausgeschlossen werden. Außerdem wird vermutet, dass Granzym M PI-9 schneiden
kann [Mahrus 2004; Bots und Medema 2006]. In den durchgeführten Versuchen wurde
Apoptose mit aufgereinigten Granula aus YT-Zellen induziert. Diese könnten neben
Granzym B auch Granzym M enthalten, da YT eine NK-Zelllinie ist und gerade NK-Zellen
Granzym M hoch exprimieren. So könnte Granzym M, das zusammen mit Granzym B in
die Zielzelle gelangt, die Inhibition von Granzym B durch PI-9 aufheben. Auch in den
Versuchen von Godal et al. und Classen et al. könnte Granzym M einen Einfluss auf das
Ergebnis der Versuche haben, da auch dort Apoptose mit NK-Zellen bzw. mit YT-Zellen
induziert wurde.
4.4.2 Einfluss der Proteine der Bcl-2 Familie auf die Apoptoseresistenz
Die Proteine der Bcl-2 Familie haben einen wichtigen Einfluss auf die Apoptoseresistenz
der Zelle. Das proapoptotische Bid kann von Granzym B und von Caspase 8 zum aktiven
tBid geschnitten werden, dass dann die Translokation von Bak und Bax in die äußere
mitochondriale Membran steigert. Dadurch kommt es zum Ausstrom von Cytochrom C aus
dem Intermembranraum. Die Translokation von Bak und Bax wird vom antiapoptotischen
Bcl-2 gehemmt.
Eine Überexpression von Bcl-2 hemmt die Granzym B induzierte Apoptose effektiv
[Sutton 1997; MacDonald 1999; Waterhouse und Green 1999; Debatin 2004; Waterhouse
2006]. So scheint die Beteiligung der Mitochondrien entscheidend für die Granzym B
induzierte Apoptose zu sein, obwohl Granzym B über Caspase 3 und Caspase 8 auch einen
Weg der Apoptose aktiviert, der ohne mitochondriale Beteiligung abläuft. Die
Expressionsmuster von Bcl-2 wurden in den Versuchen nicht untersucht. Eine
Überexpression von Bcl-2 könnte aber ein wichtiger Faktor für das Ansprechen der Zellen
auf Granzym B induzierte Apoptose darstellen. In der schon oben erwähnten Arbeit von
Godal et al. wurde die Bcl-2 Expression der Zellen untersucht. Es wurde keine Korrelation
der Bcl-2 Expression mit der Apoptoseresistenz der Zellen gefunden. Auch dies könnte
daran liegen, dass Apoptose in Ko-Inkubationen mit aktivierten NK-Zellen und CTL
induziert wurde, wobei unterschiedliche Bestandteile des Inhalts der zytotoxischen Granula
Diskussion
50
auf die Zielzellen einwirken. Außerdem könnte ein Effekt durch ein zu hohes Verhältnis
der Effektor- zu den Zielzellen überdeckt werden.
Des weiteren scheint die Expression des BH3-only Proteins Bid eine wichtige Rolle in der
Granzym B induzierten Apoptose zu spielen. Bid defiziente Zellen sind teilweise resistent
gegenüber Granzym B vermittelter Apoptose. Allerdings können die Zellen durch
gesteigerte Granzym B Konzentrationen in Apoptose gebracht werden [Waterhouse 2005,
Waterhouse 2006] So scheint die Beteiligung der Mitochondrien die Apoptose zu steigern
aber nicht essentiell für das Ablaufen der Apoptose zu sein.
Zwei weitere Proteine der Bcl-2 Familie, die in der Granzym B induzierten Apoptose eine
Rolle spielen könnten, sind das antiapoptotische Protein Mcl-1 und das proapoptotische
BH3-only Protein Bim. Sie bilden einen Komplex, in dem Bim von Mcl-1 inhibiert wird.
Mcl-1 kann von Granzym B und Caspase 3 geschnitten werden. Dadurch wird Bim frei
und es kommt zum Ausstrom von Cytochrom C aus dem Intermembranraum [Han 2004;
Han 2005]. Es wird davon ausgegangen, dass dieser Mechanismus neben der Aktivierung
von Bid eine weitere Verbindung zwischen Granzym B und dem Mitochondrium ist.
4.5
Überexpression von Proteinase Inhibitor 9 als Graft versus Leukämie
Resistenz
Im speziellen Fall der malignen hämatologischen Erkrankungen, die mit allogener
Stammzelltransplantation behandelt wurden, könnte die Überexpression von PI-9 ein
entscheidender
Resistenzfaktor
sein.
Der
GvL-Effekt,
der
nach
allogener
Stammzelltransplantation auftritt, wird durch NK-Zellen und CTL vermittelt. Dabei wird
die Apoptose hauptsächlich Granzym B vermittelt induziert. Somit könnte in diesem
speziellen Fall die PI-9 Expression der malignen Zellen von entscheidender Bedeutung
sein, da diese besonders dem Angriff der NK-Zellen und der CTL ausgesetzt sind.
Darüber könnte eine Studie Aufschluss geben, in der die PI-9 Expression leukämischer
Zellen mit dem Ansprechen auf eine allogene Stammzelltransplantation korreliert werden
würde.
51
Zusammenfassung
5 Zusammenfassung
Die allogene Stammzelltransplantation ist heute eine wichtige Behandlungsoption in der
Therapie maligner hämatologischer Erkrankungen. Für den Erfolg der Therapie ist
entscheidend, dass verbliebende maligne Zellen durch NK-Zellen und zytotoxische
T-Lymphozyten des Transplantats beseitigt werden (Graft versus Leukämie-Effekt). Dabei
lösen NK-Zellen und zytotoxische T-Lymphozyten Apoptose in den malignen Zellen
hauptsächlich Granzym B vermittelt aus. Einziger bekannter endogener Inhibitor von
Granzym B ist Proteinase Inhibitor 9 (PI-9).
In der vorliegenden Arbeit wurde die PI-9 Expression in myeloblastischen und
lymphoblastischen Zelllinien, in EBV-transformierten B-Zellen sowie in einigen primären
Leukämien im Western Blot untersucht.
Diese Zellen wurden mit aufgereinigten Granula der Granzym B reichen Zelllinie YT
inkubiert, um zu untersuchen, ob das intrazelluläre PI-9 die Aktivität von zugeführtem
Granzym B senken kann. Dazu wurde die Aktivität von Granzym B intrazellulär mit dem
colorimetrisch aktiven Substrat Ac-IEPD-pNA gemessen.
Des weiteren wurde Apoptose durch Inkubation der Zellen mit den oben erwähnten
Granula induziert. Zur Messung der Apoptoserate wurde die aktive Caspase 3
durchflusszytometrisch bestimmt.
Es konnte gezeigt werden, dass die PI-9 Expression der Zellen mit der Hemmung der
Granzym B Aktivität korreliert. Außerdem korreliert die Granzym B Aktivität mit der
Aktivierung der Caspase 3.
Die Expression von PI-9 in leukämischen Zellen schwächt also die Granzym B vermittelte
Aktivierung von Caspase 3 und somit die Apoptose ab. Dies stellt deshalb einen
Resistenzmechanismus der Zellen gegenüber des Graft versus Leukämie Effekts nach
Stammzelltransplantation dar.
52
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Anhang
7 Anhang
7.1
Abkürzungsverzeichnis
Ac-IEPD-pNA
Acetyl-Isoleucin-Glutamat-Prolin-Aspartat-Paranitroanilid
ALL
Akute lymphatische Leukämie
AML
Akute myeloische Leukämie
APAF-1
Apoptotic protease activating factor 1
APS
Amoniumpersulfat
BCA
Bicinchronic acid
BH
Bcl-2 homology
BIR
Baculoviral IAP repeat
BSA
Bovines Serumalbumin
CAD
Caspase-activated desoxynuclease
CLL
Chronisch lymphatische Leukämie
CTL
Zytotoxische T-Lymphozyten
DATP
Desoxyadenosintriphosphat
DED
Death effector domain
DD
Death domain
DLI
Donor lymphocytes infusion
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
Desoxyribonucleinsäure
DTT
Dithiothreitol
EBV
Epstein-Barr-Virus
ECL
Enhanced chemiluminescence
EDTA
Ethylendiamintetraacetat
EGTA
Ethylenglykol-bis(β-Aminoethylether)-N,N,N’,N’-Tetraacetatsäure
FACS
Fluorescence activated cell sorter
Fas-L
Fas-Ligand
FCS
Fetales Kälberserum
FITC
Fluoreszein-Isothiocyanat
67
FSC
Forward scatter
GvHD
Graft versus host desease
GvL
Graft versus Leukämie
GvM
Graft versus Malignancy
HEPES
N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N’-2-Ethansulfonsäure
HLA
Humanes Leukozyten Antigen
IAP
Inhibitor of apoptosis protein
ICAD
Inhibitor of caspase-activated desoxynuclease
KMT
Knochenmarkstransplantation
LCL
EBV-transformierte lymphoblastische B-Zelllinie
MACS
Magnetic cell separation
MDS
Myelodysplastisches Syndrom
MOMP
Mitochondrial outer membrane permeabilisation
MPO
Myeloperoxidase
Nd
not done
NHL
Non-Hodgkin Lymphom
NK-Zellen
Natürliche Killer-Zellen
PAGE
Polyacrylamid Gelelektrophorese
PBS
Phosphate buffered saline
PBSCT
Peripheral blood stem cell transplantation
PCR
Polymerase-Kettenreaktion
PI
Propidium Iodid
PI-9
Proteinase Inhibitor 9
PMSF
Phenylmethylsulfonylfluorid
PVDF
Polyvinyldifluorid
SDS
Natriumdodecylsulfat
Serpin
Serinprotease Inhibitor
SMAC
Second mitochondrial activator of caspases
SSC
Side scatter
TEMED
N, N, N’, N’, Tetramethylethylendiamin
TNF
Tumor Nekrose Faktor
TNF-R
Tumor Nekrose Faktor Rezeptor
Anhang
68
TRAIL
Tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand
UCBT
Umbilical cord blood transplantation
VAD-FMK
Benzoyloxycarbonyl-VAD-fluoromethylketon
Anhang
69
7.2
Anhang
Veröffentlichungen
Grüllich C, Fritsch K, Finke J: Constitutive expression of the granzyme B inhibitor PI-9
protects leukemic cells from granzyme B induced apoptosis. ASH 2005, Atlanta, USA.
Poster.
Grüllich C, Fritsch K, Finke J: Serine-protease inhibitor PI-9 confers resistance to
granzyme B mediated apoptosis in leukemia cells. Laccrl 2007, Freiburg. Poster.
70
7.3
Anhang
Lebenslauf
Persönliche Daten
Name
Kristina Fritsch
Geburtsdatum
11.12.1981
Geburtsort
München
Familienstand
ledig
Schulbildung
1988-1990
Dorfacker-Grundschule Tübingen
1990-1992
Weststadt-Grundschule Ravensburg
1992-2001
Welfen-Gymnasium Ravensburg
8/98-2/99
Highschool Vista, CA, USA
2001
Allgemeine Hochschulreife
Studium
10/01-9/03
Medizinstudium an der Freien Universität Berlin
9/2003
Ärztliche Vorprüfung
10/03-3/04
Medizinstudium an der Charité-Universitätsmedizin Berlin
seit 4/04
Medizinstudium an der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br.
9/05-4/06
Auslandssemester an der Universidad de Sevilla, Spanien
2/07-1/08
Praktisches Jahr am Regionalkrankenhaus Bozen, Italien, am
Hospital Ramos Mejía Buenos Aires, Argentinien und am
Universitätsklinikum Freiburg
Famulaturen
8/04
Praxis Dr. med. Martin Volz, Facharzt für Orthopädie, Ravensburg
9/04
Innere Medizin, Diakoniekrankenhaus Freiburg
8/05
Urologie, Hospital Universitario Virgen Macarena Sevilla, Spanien
3/06
Chirurgie, Hospital Universitario Virgen Macarena Sevilla, Spanien
10/06
Onkologische Rehabilitation, Klinik für Tumorbiologie Freiburg
71
7.4
Anhang
Danksagung
Zunächst möchte ich mich bei Prof. Dr. J. Finke für die Überlassung dieses interessanten
Themas und für die Unterstützung während der Durchführung dieser Arbeit bedanken.
Seine Ideen und Anregungen waren sehr wertvoll und haben so zum Gelingen meiner
Arbeit beigetragen.
Außerdem möchte ich Frau Prof. Dr. A. Schmitt-Gräff dafür danken, dass sie die
Zweitkorrektur meiner Arbeit übernommen hat.
Ganz besonders möchte ich mich bei meinem Betreuer Dr. Carsten Grüllich für die
Einführung in das wissenschaftliche Arbeiten, anregende Diskussionen über das Thema
sowie die Hilfestellung während der Laborphase bedanken.
Sophie Krüger und Ingrid Huber unterstützten mich beim Erlernen der Methoden und
waren bei jeglichen auftretenden Problemen im Labor eine große Hilfe.
Außerdem möchte ich mich bei meinen Mit- bzw. Vordoktoranden bedanken, ganz
besonders bei Christian Ziegler und Viktoria Friske. Deren moralische Unterstützung
während langer Nächte und Wochenenden im Labor war nicht weniger bedeutsam für das
Gelingen meiner Arbeit als die vielen Diskussionen und Ratschläge zu fachlichen Themen.
Nicht zuletzt danke ich meiner Familie sowie meinen Freunden für das Korrekturlesen
meiner Arbeit.
Schließlich möchte ich mich bei meinen Eltern bedanken, die es mir ermöglichen, mein
Medizinstudium ohne Sorge zu absolvieren und mich zu jeder Zeit auf jede erdenkliche
Art unterstützen.