Prof. Dr. Ulrich Hahn - Chemie

RNA Biochemie:
Protein Design mit Ribonucleasen und RNA-Target-Interaktionen
One main topic during the last years is protein design with ribonuclease (RNase) T1.
Besides collaborative studies of the stability and folding pathway of this enzyme we
are interested in its catalytic mechanism and specificity. One major aim was to
change its specific recognition of a nucleobase in single stranded RNA combining a
rational with a random mutagenesis approach. Another field of investigation is the
selection of RNA aptamers – molecules that specifically bind to various targets thus
in many aspects behaving like (monoclonal) antibodies.
Prof. Dr.
Ulrich Hahn
Research topics: Molecular Enzymology and in vitro Selection
(Life Sciences)
Protein Design mit RNase T1
RNase T1 ist der Hauptvertreter und
Namensgeber einer Familie mikrobieller RNasen aus Pro- und Eukaryoten.
Das relativ kleine Enzym (104 Aminosäuren) spaltet einzelsträngige RNA
spezifisch nach Guanosin. Die 3DStruktur eines Komplexes aus RNase
T1 mit dessen potentestem Inhibitor ist
lange gelöst (Abb. 1). Uns gelang die
Konstruktion eines das Enzym überproduzierenden Bakterien-Klons[1], die
Etablierung von Indikatorplatten, welche das schnelle Auffinden RNase-produzierender Klone erlauben (Abb. 2)
und die Ausarbeitung einer generell
anwendbaren Mutagenesemethode
mittels PCR.
Institut für Biochemie und
Lebensmittelchemie
Biochemie und Molekularbiologie
Universität Hamburg
Martin-Luther-King-Platz 6
20146 Hamburg
Abb. 2: RNase Indikatorplatte, die mit E.
coli Zellen beimpft wurde, welche das Wildtyp-Enzym (a) oder unterschiedlich aktive
Varianten sekretieren (b, Kontrolle ohne
fremdes RNase Gen)[5].
Die spezifische Erkennung der Base
Guanin erfogt über Stapelwechselwirkungen und Wasserstoffbrückenbindungen (Abb. 3). Ein Ziel unserer Arbeiten ist die Änderung der Basenspezifität von RNase T1. Nachdem diverse
rationale, auch von MoleküldynamikRechnungen unterstützte Ansätze nicht
zum Erfolg führten[2], randomisierten
wir die Region zwischen den Aminosäureresten 41-46, der so genannten
primären Bindungsstelle (engl.: primary
recognition site, PRS; Abb. 3). Wir
erhielten nach Screening mittels Indikatorplatten (Abb. 2) eine Kollektion verschiedener RNase T1 Varianten, die
alle noch G-spezifisch waren (Abb. 4).
Basierend auf der Röntgen-KristallStruktur einer dieser Varianten erhielten
wir nach gezieltem Austausch zweier
weiterer Aminosäuren eine Variante,
Abb. 1: 3D-Struktur des Komplexes aus
RNase T1 mit dem Inhibitor 2’GMP (Röntgenstrukturanalyse von Heinemann &
Saenger, 1982)[4].
Abb. 3: Primäre Bindungsstelle (PRS) in
RNase T1. Die Base Guanin interagiert mit
dem Enzym über Stapelwechselwirkungen
mit den beiden Tyrosin-Seitenketten 42 & 45,
sowie über Wasserstoffbrückenbindungen
mit dem Aminosäureketten-Rückgrat und
der Seitenkette Glutaminsäure 46.
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Chemiedozententagung 2006
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Beruflicher Werdegang:
Biologie-Diplom (Mikrobiologie) Göttingen (1977); Promotion (Dr. rer. nat.)
Max-Planck-Institut für experimentelle Medizin, Göttingen (AG Hans Küntzel, Abteilung Chemie, Direktor:
Friedrich Cramer, 1980); Postdoktorand ebenda (1980-1982); Akademischer Rat, Institut für Kristallographie,
Freie Universität Berlin, Abteilung
Wolfram Saenger (1982); Habilitation
(Biochemie) FU Berlin (1989); Hochschuldozent, Medizinische Universität zu Lübeck, Institut für Biochemie
(1993); C4-Professur (Allgemeine
und Mikrobielle Biochemie) Universität Leipzig (1994); C4-Professur
(Biochemie und Molekularbiologie)
Universität Hamburg (2002).
die im Vergleich zum Wildtyp die Base
Adenin etwa um den Faktor 320 besser
erkennt[3].
Da das Aptamer 2’-amino-modifizierte
Pyrimidine enthielt, war es in RNasehaltigen natürlichen Medien stabil und
konnte auch in einer Staphylococcus
aureus Kultur die antibiotische Wirkung
von Monomycin A kompetieren.
Kristallisationsversuche des Aptamers
mit und ohne gebundenem Antibiotikum schlugen bisher fehl. Versuche,
Kristalle von einem ebenfalls „Lipid-bindenden“ Aptamer, das einen Farnesylrest erkennt, zu erhalten, waren erfolgreicher, müssen allerdings noch optimiert werden (Abb. 8).
Abb. 4: Sequenzvergleich verschiedener
ausgewählter primärer Bindungsstellen
(PRS) von RNase T1, die nach Randomisierung dieser Region erhalten wurden (T1,
RNase T1; Ba, Barnase).
Aptamere - SELEX
Aptamere sind Nucleinsäuren, die aufgrund ihrer definierten Struktur TargetMoleküle mit zum Teil sehr hoher Spezifität binden. In vielerlei Hinsicht verhalten sie sich wie (monoklonale) Antikörper.
Abb. 8: Farnesyl-Aptamer-Kristalle
Aptamere werden in einem „SELEX“
genannten in vitro Selektionsprozess
selektiert (SELEX, systematic evolution
of ligands by exponential enrichment).
Ein Target für die Selektion von Aptameren war das Antibiotikum Moenomycin A (Abb. 5). Wir konnten zeigen, dass
ein erhaltenes Aptamer (Abb. 6) an den
Lipidanker des Antibiotikums bindet[6].
Die Dissoziationskonstante, die mittels
Fluoreszenz Korrelations Spektroskopie (FCS) ermittelt wurde, betrug 440
nM[7].
Abb. 6: Potenzielle 2D Struktur des Moenomycin A Aptamers
(Darstellung unter Verwendung von Mfold,
www.bioinfo.rpi.edu/~zukerm/)
Weitere Arbeitsgebiete: Protein Design
mit Fucosyltransferasen, Selektion Hühnervirus-neutralisierender Aptamere,
Untersuchung von RNA-Target-Interaktionen in vivo mittels FCS.
Literatur
[1]
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Abb. 5: Moenomycin A – Antibiotikum, das
bei grampositiven Bakterien die Transglycosylierung während der Zellwand-Biosynthese inhibiert.
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H. Schürer, A. Buchynskyy, K. Korn, M.
Famulok, P. Welzel, U. Hahn, Biological
Chemistry 2001, 382, 479.
Abb. 7: Fluoreszenz Korrelations Spektroskopie (FCS; www.zeiss.de/fcs). Diese
Methode erlaubt u. a. die Messung der Interaktion fluoreszenzmarkierter Moleküle in
Lösung bei sehr geringen Konzentrationen
(bis Einzelmolekül-Maßstab).
Chemiedozententagung 2006
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