Dissertation Final

Aus dem Zentrum für Pathologie der Universität zu Köln
Allgemeine Pathologie und Pathologische Anatomie
Direktor: Universitätsprofessor Dr. med. H. P. Dienes
Vergleichende Transkriptions- und immunhistologische Analyse der EndothelinRezeptoren A und B sowie der Proteinkinasen C alpha und beta bei in-situ und
invasiv-duktalem Mammakarzinom
Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde
der Hohen Medizinischen Fakultät
der Universität zu Köln
vorgelegt von
Christina-Maria Geisbüsch
aus Aachen
Promoviert am 10. März 2010
Dekanin/Dekan:
Universitätsprofessor Dr. med J. Klosterkötter
1. Berichterstatterin/Berichterstatter: Privatdozent Dr. med. J. W. U. Fries
2. Berichterstatterin/Berichterstatter: Universitätsprofessor Dr. med. P. Mallmann
Erklärung
Ich erkläre hiermit, dass ich die vorliegende Dissertationsschrift ohne
unzulässige Hilfe Dritter und ohne Benutzung anderer als der angegebenen
Hilfsmittel angefertigt habe; die aus fremden Quellen direkt oder indirekt
übernommenen Gedanken sind als solche kenntlich gemacht.
Bei der Auswahl und Auswertung des Materials sowie bei der Herstellung des
Manuskriptes habe ich Unterstützungsleistungen von folgenden Personen
erhalten. Herr Privatdozent Dr. J. W. U. Fries hat mich während der Arbeit
beratend unterstützt. Weiterhin habe ich methodische Hilfe bei der PCR sowie
Unterstützung bei der RNA-Extraktion von Frau Dr. Melanie von Brandenstein
sowie Herrn Ali Manav erhalten.
Weitere Personen waren an der geistigen Herstellung der vorliegenden Arbeit
nicht beteiligt. Insbesondere habe ich nicht die Hilfe einer
Promotionsberaterin/eines Promotionsberaters in Anspruch genommen. Dritte
haben von mir weder unmittelbar noch mittelbar geldwerte Leistungen für
Arbeiten erhalten, die im Zusammenhang mit dem Inhalt der vorgelegten
Dissertationsschrift stehen.
Die Dissertationsschrift wurde von mir bisher weder im Inland noch im Ausland
in gleicher oder ähnlicher Form einer anderen Prüfungsbehörde vorgelegt.
Köln, 22.10.2009
Christina-Maria Geisbüsch
-2-
Der überwiegende Teil der dieser Arbeit zugrundeliegenden Experimente ist
nach entsprechender Anleitung durch Herrn Privatdozent Dr. J. W. U. Fries von
mir selbst durchgeführt worden.
Ein Teil der angegebenen Experimente ist von mir mit Unterstützung von Frau
Dr. Melanie von Brandenstein durchgeführt worden.
-3-
Dank
Zunächst danke ich Herrn Universitätsprofessor Dr. med. H. P. Dienes für die
Möglichkeit zur Durchführung dieser Promotionsarbeit und die Bereitstellung
der Präparate und Laboratorien seiner Abteilung.
Mein besonderer Dank gilt Herrn Privatdozent Dr. J. W. U. Fries, der mich
während der ganzen Zeit der Promotionsarbeit außergewöhnlich gut betreut
und mich bei theoretischen und praktischen Fragen stets mit viel Zeit unterstützt
hat.
Weiterhin danke ich Frau Dr. Melanie von Brandenstein, die mich in die Technik
der PCR eingewiesen und mich während der gesamten Arbeit im Labor mit
großem Einsatz unterstützt hat. Vielen Dank auch Elli Koenen, Katharina
Wendtland, Susanne Sattler und Ali Manav, die mich ebenfalls bei der
Durchführung der praktischen Arbeit sehr unterstützt haben, sowie allen
Mitarbeitern der Arbeitsgruppen des Instituts für Pathologie, die immer offen für
Fragen waren und deren Laboratorien mir zur Verfügung standen.
Außerdem danke ich dem Team der Fa. GRP, das für alle computertechnischen
Probleme eine Lösung gefunden hat.
Auch meinen Freunden, die mich immer wieder aufgemuntert und mir die
wenige Freizeit nachgesehen haben vielen Dank.
Schließlich danke ich noch ganz besonders meinen Eltern, Maria und Peter
Geisbüsch, die mir durch ihre Unterstützung das Medizinstudium und damit
eine sehr schöne Zeit ermöglicht haben und mich immer wieder in der
Entscheidung die Promotion neben der regulären Arbeit fortzuführen bestärkt
haben.
-4-
Inhaltsverzeichnis
1
Abkürzungsverzeichnis
7
2
Einleitung
8
2.1
Das Endothelinsystem
8
2.1.1
Endothelinformen und Vorkommen
9
2.1.2
Endothelinrezeptoren
10
2.1.3
Endothelinrezeptorantagonisten
12
2.1.4
Endotheline und Tumorentwicklung
13
2.1.5
Einfluss des Endothelins bei Mammakarzinom
15
2.1.6
Signaltransduktion im Endothelinsystem
16
2.1.7
Proteinkinase C und ihre Rolle im Endothelinsystem
18
2.2
Mammakarzinom
20
2.2.1
Aufbau der weiblichen Brust
20
2.2.2
Normale Brustentwicklung
21
2.2.3
Ductales Carcinoma in situ
22
2.2.4
Invasives Mammakarzinom
24
2.3
Fragestellung der Arbeit
27
3
Material und Methoden
28
3.1
Materialien
28
3.1.1
Reagenzien
28
3.1.2
Geräte
30
3.1.3
Verbrauchsmaterialien
30
3.1.4
Untersuchungsmaterial
31
-5-
3.2
PCR
32
3.2.1
RNA-Extraktion
32
3.2.2
RNA-Quantifizierung und Reinheitskontrolle
33
3.2.3
Umschreibung mRNA in cDNA
33
3.2.4
PCR (ETAR, ETBR, PKCα, PKCβII)
34
3.3
Immunhistologie
35
4
Ergebnisse
36
4.1
PCR-Analyse
36
4.2
PCR-Analyse 34 ausgewählter Fälle
38
4.3
Immunhistologische Analyse 34 ausgewählter Fälle
40
4.4
Vergleich PCR und Immunhistologie an ausgewählten Fällen
48
4.5
Einzelfall-Analyse PCR versus Immunhistologie
50
5
Diskussion
53
6
Zusammenfassung
66
7
Literaturverzeichnis
68
8
Anhang
84
9
Lebenslauf
95
-6-
1. Abkürzungsverzeichnis
AK
Antikörper
cAMP
Zyklisches Adenosinmonophosphat
cGMP
Zyklisches Guanosinmonophosphat
DAG
Diacylglycerol
DCIS
Ductales Carcinoma in situ
DNA
Deoxyribonukleinsäure
ET
Endothelin
ETAR
Endothelin-A Rezeptor
ETBR
Endothelin-B Rezeptor
GnRH
Gonadotropin releasing hormone
IP3
Inositol 1,4,5-trisphosphat
MAPK
Mitogen activated protein kinase
NO
Stickstoffmonoxid
OKP
ET-B overexpressing opossum kidney cells
PCR
Polymerase-Ketten-Reaktion
PIP2
Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat
PKC
Proteinkinase C
PMA
Tumor promoting phorbol acetate
PRK
PKC-related Kinasen
PS
Phosphatidylserin
VEGF
Vascular endothelial growth factor
VIC
Vasoactive intestinal contractor
-7-
2. Einleitung
2.1 Das Endothelinsystem
Im Rahmen der Forschung auf dem Gebiet vasoaktiver Substanzen und der
Rolle des Endothels in diesem System kam es in den 80er Jahren zunächst zur
Entdeckung bedeutender vasodilatatorischer Substanzen (86, 41) von denen
eines einige Jahre später als Stickstoffmonoxid (NO) identifiziert wurde (104,
57). Neben diesen gefäßerweiternd wirkenden Substanzen wurden aber auch
vasokonstriktive Substanzen entdeckt (29, 54, 94). Eine Protease-sensitive
Substanz (54), die sich als resistent gegenüber den bisher bekannten
Antagonisten verschiedener im Gefäßsystem eine Rolle spielender Rezeptoren
(wie z.B. Serotonin-, Histamin-,alpha-adrenergen und Angiotensin IIRezeptoren) erwies und eine äußert langanhaltende Vasokonstriktion hervorrief
(94), konnte 1988 von Yanagisawa et al isoliert und sequenziert werden. Nach
seinem Ursprungsort bezeichnete man das Peptid als Endothelin (139). Bis
heute ist Endothelin im Menschen von den vasokonstriktorisch wirkenden
Substanzen die mit der größten und langanhaltendsten Wirkung (55, 81).
Nach der durch Yanagisawa et al 1988 beschriebenen Peptidstruktur, wurden
bereits ein Jahr später zwei weitere verwandte Peptide entdeckt (59), die als
Endothelin-2 und Endothelin-3 bezeichnet wurden, so dass derzeit drei humane
verwandte Endothelinformen, Endothelin-1, -2 und –3 bekannt sind. Ein
weiteres endothelinähnliches Peptid das Endothelin-4 oder VIC (vasoactive
intestinal contractor) wurde in Darmmukosa von Mäusen gefunden (117, 61).
Neben den Mitgliedern der Endothelinfamilie gibt es noch weitere den
Endothelinen in der Struktur sehr ähnliche Peptide, die Sarafotoxine (28). Diese
ebenfalls aus 21 Aminosäuren bestehenden Peptide mit kardiotoxischer
Wirkung konnten 1988 von Takasaki et al aus Schlangen der Gattung
Atractaspis engaddensis isoliert werden (129).
Auch die Struktur der Endothelinrezeptoren, des Endothelin-A und –B
Rezeptors wurden wenig später entschlüsselt (7, 118) und erste
Rezeptorantagonisten entwickelt (33).
-8-
2.1.1 Endothelinformen und Vorkommen
Alle drei Endothelinformen bestehen aus 21 Aminosäuren mit zwei CysteinBrücken im N-terminalen Ende und einem hydrophoben C-Terminus (56), wobei
sich Endothelin-2 in zwei und Endothelin-3 in sechs Aminosäuren innerhalb des
N-Terminus vom Endothelin-1 unterscheiden (140).
Endothelin-1, das im Menschen wohl die bedeutendste Wirkung hat (79, 68),
wird unter anderem in Endothel-, glatten und Herzmuskelzellen, einigen
Epithelzellen und Fibroblasten aber auch zirkulierenden Zellen wie
Makrophagen produziert (139, 66, 100, 56). Endothelin-2 konnte unter anderem
im menschlichen Ovar sowie im Intestinum nachgewiesen werden (71, 12) und
Endothelin-3 findet sich überwiegend im Nervensystem, aber auch in Endothelund Epithelzellen zum Beispiel im Bereich der Niere (68, 56). Das in Mäusen
erstmals gezeigte Endothelin-4 wurde in diesen im Gastrointestinaltrakt
nachgewiesen 117, 61), in vitro werden ihm aber auch Auswirkungen auf
menschliche Monozyten zugeschrieben (27).
Abbildung 1
nach Fagan KA, McMurtry IF, Rodman DM 2001. Role of endothelin-1 in lung disease. Respir Res 2:90-101
-9-
2.1.2 Endothelinrezeptoren
Beim Menschen sind bisher zwei Endothelinrezeptoren bekannt, der
Endothelin-A und Endothelin-B Rezeptor (7, 118). Von denen hat der
Endothelin-A Rezeptor (ETAR) eine etwa gleiche Affinität zu Endothelin-1 und 2, zu Endothelin-3 hingegen zeigt er eine deutlich geringere Affinität.
Demgegenüber zeigt der Endothelin-B Rezeptor (ETBR) eine ähnliche Affinität
zu allen drei Endothelinformen (56). In der Froschspezies Xenopus laevis
wurde außerdem ein Endothelin-C Rezeptor mit hoher Affinität zu Endothelin-3
nachgewiesen (67). Beide humane Endothelinrezeptoren gehören zur Gruppe
der rhodopsinartigen G-Protein- gekoppelten Rezeptoren mit sieben
transmembranösen Helices (28).
Abbildung 2 nach Spieker LE, Noll G, Ruschitzka FT, Lüscher TF 2001. Endothelin receptor antagonists in
congestive heart failure: a new therapeutic principle for the future? J Am Coll Cardiol 37(6): 1493-505
-10-
Die Wirkung des Endothelins an den verschiedenen Rezeptorsubtypen wird
über Signalkaskaden vermittelt, von denen in der Literatur je nach
Rezeptorsubtyp und Zelllinie verschiedene beschrieben werden. Im Rahmen
dieser Signalkaskaden finden sich dann unterschiedliche Ansatzpunkte zur
Antagonisierung oder Verstärkung der Endothelinwirkung, was dann auch für
therapeutische Zwecke genutzt werden könnte. Im Folgenden eine Auflistung
verschiedener Wirkmechanismen der Endothelinrezeptoren die überwiegend in
vitro im Rahmen von Studien untersucht wurden.
Endothelin
ET-1
ET-1
ET-1
ET-1
Rezeptor
Signalweg
Zellen
nicht be- -Calcium unabhängig
schrieben über PKC mit MAPKAktivierung durch
Tyrosinposphorylierung
ETAR
- G-Protein Aktivierung,
dann ERK (extracellular
signal-regulated kinase)
Aktivierung via Ras,
Raf-1 und MEK
ETBR
- Erhöhung c-jun mRNA
- Aktivierung MAPK
(ERK1/2 und MEK1/2,
nicht p38 MAPK)
- cyclin D1 Modulation
ETAR
- PKC Aktivierung (über
PLCß, DAG und
Calcium)
- MAPK-Aktivierung
- P13-K/PKB Signalweg
Tabelle 1
-11-
Autor
glatte Muskulatur
Cain AE
aus Koronargefäßen et al. 2002
(in vitro)
(18)
humane neutrophile
Granulozyten
(in vitro)
Joszef L
et al. 2002
(65)
OKP (ET-B
Chu TS
overexpressing
et al 2007
opossum kidney
(21)
cells) Zellen (in vitro)
glatte
Bouallegue
Gefäßmuskulatur (in A et al
vitro)
2007 (16)
2.1.3 Endothelinrezeptorantagonisten
Kurz nach der Entdeckung der Endothelinrezeptoren wurde auch bereits der
erste Endothelinrezeptorantagonist entwickelt, der zwar einige
Endothelinwirkungen blockierte, dessen Wirkung jedoch noch keine
ausreichende Spezifität erreichte (35). Einen entscheidenden Schritt stellte in
der Folge die Entwicklung des cyclischen Pentapeptids BQ-123 (58) und des
linearen Peptids FR 139317 (125), welche eine hohe Selektivität für den ET-A
Rezeptor aufweisen, dar. Da Peptide aufgrund ihrer chemischen Struktur
jedoch nur die parenterale Applikation, was den klinischen Einsatz erschwert,
erlauben, ging die Entwicklung in Richtung nicht peptidischer
Endothelinrezeptorantagonisten weiter. 1994 entwickelten Clozel et al (22) den
häufig eingesetzten nicht peptidischen kombinierten ETAR/ETBR Antagonisten
Ro 47-0203 oder Bosentan. Anschließend wurden noch weitere selektive oder
nicht-selektive Endothelinrezeptoren wie beispielhaft in Tabelle 2 dargestellt
entwickelt. Dabei gilt ein Antagonist als selektiv zum Beispiel für den
Endothelin-A Rezeptor wenn er eine >100fache Selektivität für diesen aufweist
(87).
Der Effekt von Endothelinrezeptorantagonisten bei unter anderem pulmonaler
Hypertonie und chronischer sowie akuter Herzinsuffizienz wird weiterhin in
vielen Untersuchungen sowohl in vitro als auch in vivo sowie in klinischen
Studien erforscht, wobei sich sehr unterschiedliche Ergebnisse zeigen. Obwohl
in vitro oft die Endothelinwirkungen durch den Einsatz der Antagonisten
unterdrückt werden können, resultiert dies in der klinischen Anwendung oftmals
nicht in einer Verbesserung der Gesamtprognose. Insbesondere in der
Krebstherapie kann bisher oft keine Verbesserung der Überlebenszeit oder eine
verminderte Progression erreicht werden (75).
Ein positiver Effekt im klinischen Einsatz konnte in Pilot- und Folgestudien zum
Einsatz von Endothelinrezeptorantagonisten bei pulmonalarterieller Hypertonie
(20, 116) sowie zunächst auch bezüglich hämodynamischer Veränderungen in
der Therapie der chronischen Herzinsuffizienz gezeigt werden (70, 80). In den
Folgestudien konnte aber trotz der positiven Auswirkungen auf die
Hämodynamik keine Verbesserung des klinischen Zustands (90) nachgewiesen
werden.
-12-
Rezeptorantagonist Zielrezeptor Einsatzgebiet in
Referenz
Studien
LU-208075/BSF-
ETAR
208075
Pulmonalarterielle
Billmann et al
Hypertonie
2002 (15)
(Ambrisentan)
Galie et al 2005
(43)
ABT-627/A-147627
ETAR
(Atrasentan)
Cardiovaskuläre
Opgenorth et al
Erkrankungen
1996 (99)
Prostata-Carcinom
Lassiter et al 2003
(76)
Lee et al 2003 (77)
RO 47-0203
ETAR/ETBR Pulmonalarterielle
(Bosentan)
RO 61-0612
Hypertonie
ETAR/ETBR Hepatorenales
(Tezosentan)
Syndrom
Clozel et al 1994
(22)
Clozel et al 1999
(23)
Akute Herzinsuffizienz
BQ 788
ETBR
In vitro Studie (isolierte Okada et al 2002
Gefäße und Zelllinien) (95)
Ishikawa et al
1994 (62)
Tabelle 2
2.1.4 Endotheline und Tumorentwicklung
Viele Tumore produzieren ein oder mehrere Endotheline und
Endothelinrezeptoren, die in vielen Bereichen Einfluss auf zum Beispiel das
Tumorwachstum ausüben. Eine wichtige Rolle des Endothelins konnte
beispielsweise bei Ovarialkarzinomen (11) Prostatakarzinomen (9) sowie bei
Mammakarzinomen (123) nachgewiesen werden. Über mitogene Effekte an
Tumor- und Stromazellen können sie das Tumorwachstum fördern, über direkte
Stimulation von Endothelzellen oder indirekt über Induktion von VEGF (vascular
endothelial growth factor) Einfluss auf die Angiogenese ausüben, Invasivität
und Metastasierung sowie die Zellapoptose beeinflussen und auch im Bereich
der Immunmodulation zeigt sich eine Bedeutung der Endotheline (45).
-13-
Die einzelnen Signalwege über die die Endothelinwirkungen vermittelt werden
sind noch nicht vollständig aufgedeckt, so dass je nach Zellart und Effekt
verschiedene Signalkaskaden beschrieben werden. Eine durch Endothelin-1
induzierte Verstärkung der Zellproliferation wird durch Aktivierung von
Proteinkinase C (PKC) und Mitogen activated protein kinase (MAPK) sowie
über P13K gesteuerte AKT Aktivierung beschrieben (9). In verschiedenen
Karzinomzelllinien einschließlich Prostata-, Cervix- und
Ovarialkarzinomzelllinien konnte gezeigt werden, dass sich das Endothelin-1
induzierte Größenwachstum durch den Einsatz von Endothelin-A
Rezeptorantagonisten, nicht aber durch Endothelin-B Rezeptorantagonisierung
verhindern ließ, so dass die autokrine Modulation der Zellproliferation durch
Endothelin-1 über den Endothelin-A Rezeptor vermittelt zu sein scheint (91).
Ebenfalls über den Endothelin-A Rezeptor scheint die antiapoptotische Wirkung
des Endothelin-1 vermittelt zu sein (30). In der Tumorangiogenese wird die
mitogene Wirkung auf Endothelzellen über den Endothelin-B Rezeptor
beschrieben, wohingegen die Wirkung auf Zellen der glatten Gefäßmuskulatur
und Perizyten über den Endothelin-A Rezeptor erfolgt (9).
Endothelin-2 wird eine chemotaktische Wirkung auf Makrophagen allgemein
zugeschrieben (34). Die chemotaktische Wirkung auf tumorassoziierte
Makrophagen wird nach Grimshaw et al(2007) über den MAPK-Signalweg via
Endothelin-B Rezeptor beschrieben (45). Weitergehende Untersuchungen
legen auch Wechselwirkungen der Endothelin-A Rezeptor vermittelten
Signalkaskaden mit anderen Signalwegen, wie zum Beispiel durch
Wachstumsfaktoren induziert, nahe (115). Insgesamt unterscheiden sich
Expression und Wirkung je nach Tumorart. Während beispielsweise beim
Mammakarzinom eine erhöhte Expression von Endothelin-A und Endothelin-B
Rezeptoren nachgewiesen werden kann, ist beim Prostatakarzinom eine
erniedrigte Expression des Endothelin-B Rezeptors zu sehen (72).
-14-
2.1.5 Einfluss des Endothelins bei Mammakarzinom
Neben der Wirkung auf viele andere Tumoren kann auch beim
Mammakarzinom der Einfluss von Endothelin gezeigt werden. Bei invasiven
Mammakarzinomen kann im Vergleich zum ductalen Carcinoma in situ sowie
Normalgewebe eine erhöhte Expression von Endothelin-Rezeptoren
nachgewiesen werden (2, 47). Sowohl Tumorzellen (47) als auch CD68+
Makrophagen (48) und Endothelzellen (10) exprimieren Endothelin und
entsprechende Rezeptoren. Eine erhöhte Endothelin-1- Expression findet sich
häufiger bei größeren, weniger differenzierten Karzinomen und
lymphovaskulärer Invasion (135) und auch beim Vorliegen von
Lymphknotenmetastasen wurde eine erhöhte Endothelin-1- Konzentration im
Serum nachgewiesen (51). Außerdem zeigt sich in einer Untersuchung von
Wülfing et al eine positive Korrelation zwischen erhöhter Expression von
Endothelin-A Rezeptoren und Resistenz gegenüber bestimmten
Chemotherapeutika (138). In vitro kann Endothelin über Endothelin-A und
Endothelin-B Rezeptoren an Tumorzellen eine erhöhte Invasivität der
Tumorzellen hervorrufen (46), so wie in vitro auch eine Korrelation von
Invasivität der Mammakarzinomzelllinie mit der Expression von Endothelin und
Endothelinrezeptoren gezeigt werden kann (51). Weiterhin ist die Expression
von Endothelin-1, Endothelin-A und Endothelin-B Rezeptor in Biopsaten
invasiver Mammakarzinome mit einer erhöhten Expression von VEGF und
erhöhter Vaskularisierung assoziiert (137) und bezüglich der
Tumorvaskularisierung kann in einer Untersuchung im Maus-Modell eine
Verminderung der Tumorvaskularisierung durch den
Endothelinrezeptorantagonisten Bosentan gezeigt werden (31). Die Signalwege
über die die Endothelinwirkungen vermittelt werden sind dabei noch nicht
vollständig geklärt und auch verschiedene Cofaktoren scheinen neben
Endothelin eine Rolle zu spielen (45).
-15-
2.1.6 Signaltransduktion im Endothelinsystem
Nahezu alle G-Protein-gekoppelten Rezeptoren –wie auch die
Endothelinrezeptoren A und B- sind zu einer direkten Aktivierung eines aus drei
Untereinheiten (α, β und γ) bestehenden (heterotrimeren) G-Proteins befähigt.
Die Aktivierung eines G-Proteins ist ein mehrstufiger Prozess, der die Bindung
eines Liganden an den Rezeptor, die Konformationsänderung des Rezeptors
sowie die Bindung und Aktivierung eines G-Proteins einschließt und dabei den
Gesetzen der Thermodynamik unterliegt.
G-Protein gekoppelte Rezeptoren bilden die größte Gruppe von Rezeptoren der
Zelloberfläche und übermitteln sowohl externe Signale wie beim Sehen oder
Riechen als auch interne Signale anderer Zellen beispielsweise über Hormone
oder Neurotransmitter. Die Signalstoffe, die eine Reaktion über G-Protein
gekoppelte Rezeptoren auslösen können, sind sehr unterschiedlicher Struktur
und können mitunter an mehreren verschiedenen Rezeptoren dieser Gruppe,
meist in unterschiedlichen Zellen Signalkaskaden auslösen, die je nach
vorliegendem Zelltyp andere Reaktionen hervorrufen können. Trotz deutlicher
Unterschiede in Struktur und Eigenschaften der an die Rezeptoren bindenden
Stoffe, haben alle G-gekoppelten Rezeptoren eine ähnliche Struktur mit sieben
transmembranösen Abschnitten sowie einem unterschiedlich großen
extrazellulären Abschnitt zur Bindung des entsprechenden Moleküls (3). Die
Übersetzung des extrazellulären Signals erfolgt dann über die Aktivierung des
mit dem Rezeptor assoziierten G-Proteins (17). Ein Teil der G-Proteine weist im
inaktiven Zustand eine Bindung an den Rezeptor auf, während es bei
bestimmten G-Proteinen erst nach der Aktivierung zu einer Bindung des GProteins an den Rezeptor kommt. Nach der Bindung des extrazellulären
Moleküls kommt es zum Austausch des im inaktiven Zustand an die αUntereinheit gebundenen GDP gegen GTP, was eine Konformationsänderung
des G-Proteins bewirkt. Durch die Konformationsänderung kommt es zur
Freilegung von Bindungsstellen an der α- Untereinheit sowie am Komplex aus
β- und γ-Untereinheit, die dann mit oder ohne Dissoziation vom Rezeptor mit
den jeweiligen Zielproteinen, meist Ionenkanäle oder Enzyme der
Plasmamembran, interagieren können. Die Inaktivierung des G-Proteins erfolgt
durch Hydrolyse des an die α- Untereinheit gebundenen GTP zu GDP.
-16-
Die Dauer bis zur Umwandlung von GTP zu GDP ist meist kurz und wird durch
die GTPase Aktivität der α-Untereinheit bestimmt, die durch die Bindung an
entweder das Zielprotein oder ein spezifisches regulatorisches Protein verstärkt
wird. Die Signaltransduktion nach Aktivierung des G-Proteins kann auf
unterschiedlichen Wegen erfolgen. Einige G-Proteine, die stimulierenden GsProteine, führen zu einer Erhöhung der intrazellulären cAMP (zyklisches
Adenosinmonophosphat)-Konzentration, während die Adenylatcyclase und
damit die Produktion von cAMP durch inhibitorische Gi-Proteine gehemmt wird.
Auf einem anderen Weg wird durch die Aktivierung des Gq-Proteins die
membrangebundene Phospholipase C ß aktiviert, die das membranständige
Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat (PIP2) in Inositol 1,4,5-trisphosphat (IP3)
und Diacylglycerol (DAG) spaltet. IP3 führt über Beeinflussung von CalciumKanälen zu einer Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration. Das in der
Plasmamembran verbleibende Diacylglycerol ist neben der Beteiligung an der
Aktivierung konventioneller sowie neuer Proteinkinase C Formen auch an der
Bildung von Eicosanoiden einschließlich der Prostaglandine beteiligt. Außerdem
ist ein direkter Einfluss der aktivierten G-Proteine auf membrangebundene
Ionenkanäle der Zielzelle möglich, so führt die Bindung der β-γ-Untereinheit des
muskarinischen Acetylcholinrezeptors an Kaliumkanäle der Myokardzellen
unmittelbar zur Öffnung dieser und erhöht somit die Kaliumkonzentration und
erschwert die Depolarisierung der Zelle. Weitere bedeutende G-Protein
gekoppelte Rezeptoren sind olfaktorische Rezeptoren, deren Signale über eine
cAMP Erhöhung vermittelt werden sowie optische Rezeptoren zu denen unter
anderem das Rhodopsin zählt, die eine Veränderung der zellulären cGMP
Konzentration bewirken.
Bei Stimulation der Rezeptoren in hoher Konzentration oder von langer Dauer
kommt es zur Adaptation der Rezeptoren, die entweder durch eine Inaktivierung
des Rezeptors, durch eine Verlagerung des Rezeptors ins Zytoplasma oder
eine zytoplasmatische Aufnahme mit anschließender lysosomaler Zerstörung
des Rezeptors erfolgt (3)
-17-
Abbildung 3
Schritt 1: Bindung des G-Proteins
Schritt 2: Ligandenbindung
Schritt 3: Aktivierung des Rezeptors
Schritt 4: Aktivierung der G-Proteine
Schritt 5: Signaltransduktion
Schritt 6: G-Protein-Inaktivierung
2.1.7 Proteinkinase C und ihre Rolle im Endothelinsystem
Die Proteinkinase C (PKC) ist eine der bereits früh entdeckten Proteinkinasen
(60). Zunächst konnten aus DNA-Datenbanken aus Hirngewebe die drei PKC
Isoformen α, β und γ identifiziert werden (105). Im weiteren Verlauf wurden mit
Hilfe dieser cDNA-Datenbank dann die weiteren PKC-Isoformen δ, ε und ζ
identifiziert (96), aus anderen cDNA- Datenbanken die Isoformen η,θ und ι
(101, 102, 120) sowie zuletzt die PKC-related Kinasen (PRK`s) (103, 89).
-18-
Eine Einteilung der PKC-Formen erfolgt in konventionelle PKCs (cPKCs) wozu
die PKC Formen, α, βI, βII und γ zählen. Diese werden calciumabhängig durch
Phosphatidylserin (PS) aktiviert und die Bindung von Diacylglycerol (DAG) kann
sowohl die Spezifität für PS erhöhen als auch die Calciumempfindlichkeit
steigern (128). Außerdem ist eine Aktivierung durch tumor promoting phorbol
acetate (PMA) möglich (19). Eine weitere Gruppe stellen die neuen PKC
Isoformen ε, η, δ und θ dar. Diese werden ebenfalls durch DAG und
Phorbolester in Anwesenheit von PS jedoch calciumunabhängig aktiviert (97).
Ebenfalls Calciumunabhängig sind die atypischen PKC Formen ι und ζ der
dritten Gruppe, die aber auch nicht auf DAG oder PMA reagieren (98). Die erst
vor kurzem entdeckte Gruppe der PRKs kann in PRK 1, 2 und 3 unterteilt
werden (103, 88).
Am besten untersucht ist die DAG/PKC Signalkaskade (73), die unter anderem
durch Endothelin-1 über den Endothelin-A Rezeptor aktiviert werden kann
(127).
Durch Phosphorylierung anderer Proteine können Proteinkinasen, abhängig
vom jeweiligen Gewebetyp, deren Funktion verändern (73, 93, 112, 127).
Abbildung 4 nach Reyland ME 2009. Protein kinase C isoforms: Multi functional regulators of cell life and death.
Front Biosci 1;14:2386-99
-19-
2.2 Mammakarzinom
Die Diagnose Brustkrebs stellt mit einem geschätzten Anteil von 26% in den
USA nach wie vor den größten Teil der malignen Neuerkrankungen in der
weiblichen Bevölkerung und ungefähr 15% der Todesfälle durch
Krebserkrankungen wird in der weiblichen Bevölkerung der USA durch
Brustkrebs verursacht, was nur von malignen Lungenerkrankungen mit einem
Anteil von 26% übertroffen wird (64). Daher kommt der Erkrankung nach wie
vor ein hoher Stellenwert zu und neue therapeutische Optionen sind für eine
große Gruppe der weiblichen Bevölkerung von entscheidender Bedeutung.
2.2.1 Aufbau der weiblichen Brust
Die Brust der erwachsenen Frau dehnt sich frontal auf der Thoraxwand auf
Höhe der 4. Rippe aus (78). Sie besteht aus Läppchen aus Drüsengewebe, die
gitterförmig von Bindegewebe umgeben und deren Zwischenräume mit
Fettgewebe ausgefüllt sind (24). Die Anteile an Drüsen-, kollagenreichem
Binde- und Fettgewebe variieren interindividuell stark, verändern sich
altersabhängig und unterliegen hormonellen Schwankungen (44). Das
Drüsengewebe ist in Läppchen und Gänge unterteilt, wobei die kleineren
Gänge in Zentralgängen münden, von denen mehrere parallel in Richtung
Brustwarze laufen und dort auf der Oberfläche der Brustwarze münden. Ob
zwischen den einzelnen Gangsystemen auch Querverbindungen, die dann eine
Auswirkung auf eine Streuung bei malignen Erkrankungen der Brustdrüse
haben könnten, bestehen, ist noch nicht abschließend geklärt (44).
Die arterielle Blutversorgung der Brustdrüse erfolgt durch Abzweige der A.
mammaria interna, aus den Interkostalarterien sowie Ästen der A. axillaris (26).
Der venöse Abfluss erfolgt durch die Interkostalvenen mit Zugang zu den
Vertebralvenen und Venen entlang der Arterien (78).
-20-
Lymphabflusswege sind hauptsächlich über axilläre Lymphknoten sowie
Lymphknoten entlang der A. und V. mammaria interna, wobei der größte Teil
über gleichseitige Lymphknoten in der Axilla abfließt, während der Abfluss
unmittelbar in kontralaterale, supraklavikuläre oder posteriore InterkostalLymphknoten deutlich seltener ist (44). Die Innervation erfolgt über Äste der
Nervi intercostales (44).
Histologischer Aufbau
Die Lobuli in der adulten Brust erreichen in der Regel eine Größe von 0,5 bis
2mm und variieren sowohl interindividuell als auch intraindividuell stark in ihrer
Dichte. Sie bestehen aus runden oder ovalen Ductuli oder Azini, die von
Bindegewebe umgeben sind. Oft lassen sich auch eingestreute Lymphozyten
oder Plasmazellen darstellen. Die aus den kleineren Ductuli entstehenden
zentralen Gänge sind von kubischen Epithelzellen ausgekleidet und von einer
mehr oder weniger kontinuierlichen Schicht myoepithelialer Zellen umgeben
(44).
Hormonrezeptoren
Normales Brustdrüsengewebe exprimiert Östrogen- und
Progesteronrezeptoren, wobei die Expression nie 100% erreicht und auch keine
enge Korrelation zwischen Proliferation und Expression der Hormonrezeptoren
besteht, so dass eine Stimulation der Zellen auch auf parakrinem oder
juxtakrinem Weg nahe liegt. Dies steht im Gegensatz zu neoplastischen
Epithelzellen, bei denen sich oftmals eine Co-Expression von Steroidrezeptoren
und Proliferationsmarkern findet (44).
2.2.2 Normale Brustentwicklung
Die intrauterin angelegte kleine Brustdrüse ruht bis zum Eintritt in die Pubertät.
Mit Beginn der Thelarche, beginnt ein Größenwachstum sowie die Ausbildung
ductulo-lobulärer Einheiten, die zu diesem Zeitpunkt jedoch sekretorisch inaktiv
sind. Die Ausbildung der vollen sekretorischen Funktion mit Zunahme des
Drüsengewebes wird erst im Rahmen einer Schwangerschaft durch die dann
auftretenden hormonellen Veränderungen erreicht.
-21-
Das Ende der Stillperiode führt zu einer erneuten Umwandlung des
Brustgewebes mit „Involution“ des Drüsengewebes, so dass nahezu der
Ausgangszustand vor Beginn der Schwangerschaft erreicht wird. Mit Eintritt in
die Menopause beginnt ein erneuter Abbau des Drüsengewebes, so dass die
Brustdrüse nach der Menopause überwiegend aus Fett- und weniger fibrösem
Bindegewebe mit nur noch vereinzelten, wenn überhaupt vorhandenen, kleinen
Lobuli besteht (44).
Aber auch ohne Schwangerschaft oder Laktation kommt es prämenopausal zu
ständiger zyklusabhängiger Proliferation und Apoptose duktaler und lobulärer
Zellen. Besonders ausgeprägt sind proliferative Vorgänge bei jungen Frauen
(44).
2.2.3 Ductales Carcinoma in situ
Als ductales Carcinoma in situ (DCIS) bezeichnet man eine maligne klonale
Zellproliferation innerhalb des Brustdrüsenparenchyms, ausgehend von
Epithelzellen der Brustdrüsengänge, die keine invasiven Anteile aufweist. Es gilt
als Vorläufer des invasiven Mammakarzinoms, muss aber nicht zwangsläufig in
ein solches übergehen 107).
Diagnostiziert wird das DCIS meist im Rahmen einer ScreeningMammographie, in der sich gehäuft typischerweise Mikrokalzifikationen
nachweisen lassen. Es kann aber auch als Raumforderung oder in Form eines
M. Paget der Brustwarze auftreten (107).
Makroskopisch ist zum Teil eine speckige Oberfläche sowie Komedonekrosen
am Ende der Gänge sichtbar, klassische Veränderungen sind aber oft nicht
nachweisbar, so dass es makroskopisch nicht sichtbar ist (107).
Die maligne Epithelzellproliferation ist überwiegend auf die Zellen innerhalb
des Gangsystems beschränkt, wobei je nach histologischem Grad des DCIS
eine retrograde Invasion in Drüsenläppchen erfolgen kann, wobei man dann
von lobulärer Kanzerisierung spricht.
-22-
Nachdem man früher eine klassische Einteilung anhand des
Wachstumsmusters der Epithelzellproliferation vornahm, unterteilen neuere
Klassifikationssysteme das DCIS anhand des Grades der Kernatypie und zum
Teil auch des Vorliegen von Komedonekrosen ein. Die häufigste Einteilung ist
die in High, Intermediate und Low Grade DCIS.
Low Grade DCIS
Die Zellen des Low Grade DCIS sind meist klein, gleichförmig und gut
abgrenzbar mit deutlicher Polarität. Der Zellkern ist in der Regel rund mit
wenigen Mitosen. Das Wachstumsmuster des Low Grade DCIS ist oft
kribriform oder in Mikropapillen.
Intermediate Grade DCIS
DCIS Formen die weder die klassischen Merkmale des High grade DCIS noch
des Low grade DCIS aufweisen werden in der Regel dem Intermediate Grade
DCIS zugeordnet. Die Zellen zeigen mäßig pleomorphe Zellkerne mit ein oder
zwei Nucleoli und sind meist polarisiert. Das Wachstumsmuster ist kribriform
oder solide.
Eine Form der Klassifikation nach Kernatypien und dem Vorliegen von
Komedonekrosen ist die Klassifikation nach Van Nuys, die eine Einteilung in die
drei Gruppen, High grade, Non High Grade with necrosis und Non High Grade
without necrosis, vornimmt.
High Grade DCIS
Das High grade DCIS besteht aus pleomorphen Zellen, die deutliche
Variationen in Form und Größe zeigen und keine eindeutige Polarisierung
aufweisen. Im Zellkern mit grobschollig erkennbarem Chromatin befinden sich
oft prominente Nucleoli und es treten viele Mitosen auf. Der Aufbau ist meist
solide mit Kalzifizierungen und Komedonekrosen im Zentrum.
-23-
Zusätzlich gibt es noch einige DCIS Unterformen, die aufgrund spezieller
Merkmale nicht gut allein anhand der Kernatypie zugeteilt werden können, wie
das apokrine DCIS, das intrazystische, das neuroendokrine sowie das KlarzellDCIS. Als mikroinvasives Karzinom wird ein DCIS mit einem oder mehreren
invasiven Anteilen, die jeweils kleiner als 1mm Durchmesser, sind bezeichnet.
Immunhistochemie
Die Expression von Östrogenrezeptoren tritt beim Low grade DCIS häufiger auf
als beim High Grade DCIS, das dahingegen öfter das Onkoprotein Her2neu
exprimiert.
Diagnostik und Therapie
Zur Diagnostik sollte eine „core biopsy“ anstelle einer Feinnadelaspiration
durchgeführt werden, da bei letzterer keine sichere Unterscheidung vom
invasiven Karzinom möglich ist. Differentialdiagnostisch ist die Abgrenzung zur
atypischen duktalen Hyperplasie, die einige aber nicht alle Anteile eines
ductalen Carcinoma in situ zeigt, wichtig.
Die übliche Therapie besteht in der vollständigen chirurgischen Exzision im
Gesunden, mit oder ohne adjuvante Radiotherapie (107).
2.2.4 Invasives Mammakarzinom
Das invasive Mammakarzinom, eine maligne Zellproliferation ausgehend von
Epithelzellen der ductulolobulären Einheit entsteht in vielen Fällen auf dem
Boden eines DCIS, jedoch auch primär aus unauffälligem Brustdrüsengewebe
heraus und kann ubiquitär in Brustdrüsengewebe auftreten, die
Hauptlokalisation ist meist jedoch im oberen äußeren Quadranten.
Es gibt verschiedene histologische Formen, wobei im Folgenden vor allem auf
die häufigste Form, das invasiv ductale Karzinom näher eingegangen wird (53).
-24-
Invasiv ductales Mammakarzinom
Makroskopisch ist der in seiner Größe sehr variable Tumor durch eine mäßig
bis schlecht begrenzte Knoten- oder sternförmige Konfiguration mit gräulichweißer fester Schnittfläche gekennzeichnet (53).
Mikroskopisch stellen sich Zellen verschiedenen Atypiegrades mit oft fokaler
Nekrose und begleitender Infiltration durch Entzündungszellen dar.
Verdrängende und infiltrative Anteile treten nebeneinander auf. In vielen Fällen
ist das invasive Karzinom außerdem mit einem intermediate oder high grade
DCIS assoziiert. Immunhistologisch besteht in 70-80% der nicht näher
spezifizierten ductalen Karzinome ein positiver Nachweis des
Östrogenrezeptors, während 15-30% Her2 positiv sind (53).
Diagnostik und Therapie
Ein entscheidender Stellenwert in der Diagnostik des Mammakarzinoms kommt
der Mammographie, sowohl als Screeningmaßnahme als auch bei klinischem
Verdacht zu. Ergänzend wird in der Bildgebung die Sonographie sowie die
Magnetresonanztomographie (38, 119) eingesetzt.
Anschließend folgt zur weitergehenden Diagnostik meist zunächst eine
Feinnadelpunktion zur Differenzierung maligner und benigner Veränderungen,
die dann bei dem Verdacht einer malignen Veränderung eine chirurgische
Intervention zur Folge hat. Dabei wird meist versucht den Tumor brusterhaltend
zu entfernen, in einigen Fällen ist aber weiterhin die großzügige Entfernung bis
hin zur Mastektomie erforderlich.
Eine Chemotherapie oder Strahlentherapie kann adjuvant oder neoadjuvant in
verschiedenen Formen erfolgen. Zusätzlich zu den etablierten
Chemotherapeutika werden in den letzten Jahren zunehmend medikamentöse
Therapieansätze erforscht, die speziell auf die entsprechenden Tumorzellen
abzielen ohne das gesunde Gewebe zu schädigen, wie es bei den meisten
Chemotherapeutika der Fall ist, was dann zu mitunter schwerwiegenden
Nebenwirkungen der Therapie führen kann. Das erste derartige Medikament im
klinischen Einsatz war 1977 der selektive Östrogenrezeptor Modulator
Tamoxifen, der heute in Kombination mit GnRH Analoga als adjuvante Therapie
der ersten Wahl bei prämenopausalen Frauen mit Hormonrezeptor- positivem
-25-
Mammakarzinom eingesetzt wird (36). Ebenfalls am Östrogenkreislauf setzen
auch Aromataseinhibitoren an, welche bei postmenopausalen Frauen mit
metastasiertem Hormonrezeptor-positivem Mammakarzinom als Therapie der
ersten Wahl zum Einsatz kommen (101).
Ein weiterer Ansatzpunkt derartiger spezifischer Therapien ist der
Wachstumsfaktorrezeptor Her2neu, dessen Amplifikation und ProteinÜberexpression mit einer schlechten Prognose assoziiert ist (121).
Trastuzumab, ein monoklonaler Antikörper gegen den extrazellulären Anteil von
Her2 gerichtet, wird bei Her2 positivem metastasiertem Mammakarzinom und in
letzter Zeit auch bereits bei Mammkarzinomen in frühen Stadien adjuvant
eingesetzt (37). Neben Trastuzumab sind noch weitere Antikörper gegen
andere bekannte Wachstumsfaktor-Rezeptoren, die ebenfalls zur erbB-Familie
gehören, entwickelt worden, wobei die meisten dieser Antikörper im klinischen
Einsatz kein zufriedenstellendes Ergebnis zeigen (37).
Weitere Ansatzpunkte für spezifische medikamentöse Therapien sind die
Regulation von Zellzyklus und Apoptose sowie die Tumorinvasion und
Metastasierung. An der Tumorzellinvasion, als entscheidendem Schritt in der
Metastasierungskaskade, sind unter anderem proteolytische Enzyme, die
Matrix-Metalloproteinasen, beteiligt, deren Inhibition durch spezifische
Antikörper in einigen Fällen im klinischen Einsatz eine Verbesserung der
Überlebensrate sowie der Rezidivfreiheit nachweisen konnte (126).
Im Hinblick auf einen möglichen Angriffspunkt in der Angiogenese sind
insbesondere der vascula endothlial growth factor, der basic fibroblast growth
factor und der tumor necrosis factor alpha von Bedeutung (142). Diesbezüglich
kann für Bevacizumab, einem Antikörper gegen VEGF, in der
Kombinationstherapie mit Paclitaxel in einer Untersuchung ein positiver
klinischer Effekt nachgewiesen werden (84), wohingegen Inhibitoren an
anderen Stellen der Angiogenese trotz anti-angiogenetischer Effekte in vitro
und in vivo in der Klinik keinen Erfolg für die Patienten zeigen (37). Zusätzlich
werden auch im Bereich der Zellproliferation und -differenzierung
Untersuchungen in der Blockade einzelner Signalkaskaden durchgeführt, deren
klinischer Erfolg noch abzuwarten bleibt.
-26-
Neue Ansatzpunkte sind außerdem das Endothelinsystem, dessen Inhibierung
gegenwärtig in einer, von der Dr. Mildred Scheel Stiftung finanzierten,
therapeutischen Studie untersucht wird, wobei die Wirkung von Bosentan, dem
ETA- und B-Rezeptorantagonisten, bei Mammacarcinomen getestet wird.
Hitzeschockproteine und das IGF (insulin like growth factor)-System (37) sind
weitere mögliche therapeutische Ansatzpunkte.
2.3 Fragestellung der Arbeit
Ziel dieser Arbeit war es auf transkriptioneller und translationeller Ebene die
Expression von Endothelin-A und Endothelin-B Rezeptor sowie PKC alpha und
PKC beta II in Normalgewebe, ductalem Carcinoma in situ und invasiv ductalem
Karzinom zu analysieren. Insbesondere nach Vorergebnissen der
Arbeitsgruppe an anderen Tumoren und Tumorzelllinien wie MCF-7 bestand die
Frage in wie weit eine Aktivierung des PKC Wegs zur zusätzlichen
Signalverstärkung beitragen könnte. Schließlich sollte untersucht werden ob
aus eventuell nachweisbaren Unterschieden der Expressionsmuster mögliche
Ansatzpunkte für weitere Untersuchungen (z.B. Tierversuch) mit dem Ziel
therapeutischer Interventionsmöglichkeiten zu erhalten sind.
-27-
3. Material und Methoden
3.1 Verwendete Materialien
3.1.1 Reagenzien
AK-Verdünnungspuffer, grün
Firma Zymed, California
Aquatex
Merck KGaA, Darmstadt
Chromogen
Firma Dako, Cambridgeshire CB7 4EX
DEPC Water
0.1% (v/v) DEPC
1 l water
DNAse-Mix
20µl H2O
1µl RNAse-Inhibitor
3µl DNAse(10U/µl)
1µl MgCl²
DTT
0.1 M stock solution
Store at –20°C
EDTA
0.5 M EDTA pH 8.0
EnVision-HRP
Firma Dako UK Ltd,
Cambridgeshire CB7 4EX
Hämalaun
VWR International GmbH, Darmstadt
PBS
123 mM sodium chloride
16,6 mM di-sodium
Hydrogenphosphate
dihydrate
10 mM potassium
dihydrogenphosphate
pH 7.2-7.8
Primärantikörper ETAR
Primärantikörper ETBR
Primärantikörper PKC α
LifeSpan Biosciences,Inc. Seattle
Acris Antibodies, Herford
Santa Cruz Biotechnology,
Inc., Heidelberg
Santa Cruz Biotechnology,
Inc., Heidelberg
Primärantikörper PKC β
-28-
TAE (50x)
2 M Tris/HCl
0.25 M sodium acetate
0.05 M EDTA pH 8.0
pH 7.8
TBE (10X)
0.9 M Tris base
0.9 M boric acid
0.02 M EDTA pH 8.0
TE (1x)
10 mM Tris-HCl
1 mM EDTA pH 8.0
TBS (1x)
10 mM Tris/HCl pH 7.5
100 mM sodium chloride
dNTP Mix
10mM dATP
10mM dCTP
10mMdGTP
10mM dTTP
Random Primers
Invitrogen, Carlsbad California
Superscript III
Invitrogen, Carlsbad California
Red Taq
Sigma-Aldrich Chemie GmbH,
München
Xylol
VWR International GmbH
Darmstadt
EtOH
VWR International GmbH
Darmstadt
0,3% H2O2-TBS
500µl H2O2
50 ml TBS-Puffer
-29-
3.1.2 Geräte
Geräte
Balance EMB 200-2
BioPhotometer
Dampfgarer Multi Gourmet
Eismaschine
Electrophoresis Powersupplier
Eppendorf centrifuge 5402
Eppendorf centrifuge 5415
Gefrierschrank -20°C
Firma
KERN Stuttgart
Eppendorf, Hamburg
Braun GmbH, Kronberg
Ziegra, Isernhagen
BioRad, Munich
Eppendorf, Hamburg
Eppendorf, Hamburg
Bosch GmbH, GerlingenSchillerhöhe
BioRad, Munich
BioRad, Munich
NUNC, Naperville
Easytronic, Gallingen
Leica Biosystems GmbH, Nussloch
Biozyme Scientific GmbH, Oldendorf
Cyberscan, USA
IBS Integra Biosciences, Fernwald
Biozyme Scientific GmbH, Oldendorf
Janke and Kunkel
IKA Labortechnik, Staufen
PEQLAB Biotechnologie GmbH,
Erlangen
H+P Labortechnik, Magdeburg
Janke and Kunkel
IKA Labortechnik, Staufen
Julabo, Seelbach
Gel Kammer 220 V-50
Gel power supply 200/400
Microflow Biological safety cabinet
Mikrowelle
Mikrotom
PCR Thermocycler
pH-Meter
PipetBoy acu
Pipetten 1000µl, 100µl, 10µl
Shaker KS 250
Thermo Shaker TS 100
Ultralow –86°C
Vortex VF 2
Wasserbad
Tabelle 3
3.1.3 Verbrauchsmaterialien
Material
Eppendorf tubes 0.5 ml, 1.5 ml, 2.0 ml
Falcons 15 ml /50 ml
Filter tips (0.1 µl – 1000 µl)
Glas pipettes 5ml, 20ml
Pipette tips
Objektträger
Deckgläser
Firma
Eppendorf, Hamburg
Carl Roth GmbH, Karlsruhe
Starlab GmbH, Ahrensburg
Corning Incorporated, New York
Biozyme Scientific GmbH, Oldendorf
MEDITE GmbH, Burgdorf
MEDITE GmbH, Burgdorf
Tabelle 4
-30-
Gen
PCR-Primer Sequenz
Forw 5’-TTGGCAATGAGCGGTTCCGCTG-3’
Rev 5’-GACAGCACTGTGTTGGCGTA-3’
Forw 5`-AGCTCAGCTTCCTGGTTACC-3`
Rev 5`-TCCTGAGCAGAGTTGCATTC-3`
Forw 5`-GCCATTTGGAGCTGAGATGT-3`
Rev 5`-CTGCTGTCCATTTTGGAACC-3`
Forw 5`-ATGGCTGACGTTTTCCCGG-3`
Rev 5`- AGGTGGGCTGCTTGAAGA-3`
II Forw 5`-GGAGCACAAGATCATGGTGGG-3`
Rev. 5`-ACAGTGGGCCGGGCCTGCTG-3`
Annealing Anzahl Zyklen
Temp.
β-actin
50°C
35 x
ETAR
50°C
35 x
55°C
35 x
50°C
35 x
55°C
35 x
ETBR
PKC α
PKC β
Tabelle 5
3.1.4 Untersuchungsmaterial
Als Untersuchungsmaterial wurden 100 in Paraffin eingebettete Gewebeproben
aus den Jahren 2000-2007 des Archivs des Instituts für Pathologie der
Universität zu Köln verwendet. Zur Untersuchung und anschließenden
Archivierung waren die Gewebeproben in Formaldehyd fixiert und in Paraffin
eingebettet worden.
Es wurden 13 Gewebeproben mit Anteilen eines ductalen Carcinoma in situ
sowie 76 Gewebeproben mit invasiv ductalem Mammakarzinom in die
Untersuchung eingeschlossen. Als Kontrollgruppe wurden 11 unauffällige
Gewebeproben von Mamma-Reduktionsplastiken sowie Gewebeproben mit
unauffälligem Gewebe aus Randbereichen entfernten Tumorgewebes
verwendet. Die Vorauswahl der in die Untersuchungsgruppe eingeschlossenen
Gewebeproben wurde anhand der histologischen Befundberichte getroffen.
Anschließend erfolgte die Endauswahl und Bestätigung der Diagnose durch
erneute mikroskopische Untersuchung der archivierten Gewebeschnitte.
Nach initial durchgeführter PCR an 100 Proben wurden aus diesen Proben
zunächst 50 Proben, darunter 10 Proben mit DCIS, 10 Proben mit
Normalgewebe und 30 Proben invasiver Karzinome so ausgewählt, dass
möglichst alle PCR Ergebnisse (keine, schwache und starke Expression von
Endothelin-A und -B Rezeptor, PKC alpha und PKC beta II) vertreten waren.
-31-
Aufgrund Gewebsverlust während der Färbevorgänge oder nach der PCR nicht
mehr ausreichend vorhandenem Material um aussagekräftige Schnitte
herzustellen wurden schließlich 34 Proben in die Auswertung der
immunhistologischen Färbung eingeschlossen.
3.2 PCR
3.2.1 RNA-Extraktion aus den in Paraffin eingebetteten Gewebeproben
Vor der Extraktion wurde von jedem Gewebeblock mit dem Mikrotom ein Schnitt
von 7,5 µm Dicke angefertigt und in ein Save-Lock Tube als Reaktionsgefäß
gegeben.
Für die Entparaffinierung wurden die Proben 5 min bei 65°C erwärmt und
anschließend kurz zentrifugiert. In jedes Reaktionsgefäß wurden 500µl Xylol
zugegeben, danach wurden die Proben für 5 min bei 65°C im Thermomixer mit
einer Schüttelfrequenz von 10-11/min erwärmt und anschließend bei
13000U/min für 2 Minuten zentrifugiert. Der Xylolüberstand wurde dann
abpipettiert und der gesamte Vorgang insgesamt dreimal wiederholt.
Anschließend wurden die Proben dreimal mit Ethanol gewaschen, indem jeder
Probe 500µl Ethanol zugegeben wurde, diese nach kurzem vortexen erneut 2
min bei 13000U/min abzentrifugiert wurden und der jeweilige Überstand
abpipettiert und verworfen wurde. Die dann entparaffinierten Proben wurden
eine Stunde bei 37°C im Brutkasten getrocknet.
Zur weiteren Behandlung wurde den Proben 200µl Proteinase-K-Mix
(Stammlösung 20mg/ml) zugegeben und sie wurden über Nacht bei 65°C im
Thermomixer inkubiert. Bei vollständiger Lyse des Gewebes wurde der Verdau
des Gewebes dann durch Erhitzen auf 95°C für 10 Minuten gestoppt.
Zur eigentlichen Extraktion der RNA wurden in jedes Reaktionsgefäß zu dem
Proteinase-K Ansatz jeweils 200µl Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol und 20µl
Na-Acetatlösung gegeben und die Probe zunächst kurz von Hand geschüttelt
und anschließend 20 Minuten bei 13000U/min zentrifugiert. Der wässrige, die
RNA enthaltende Überstand wurde vorsichtig abpipettiert und in ein neues, mit
eiskaltem Isopropanol und 2µl t-RNA gefülltes Reaktionsgefäß gegeben,
-32-
während das restliche in der unteren Phenolphase gelöste Material verworfen
wurde. Der neue Ansatz wurde vorsichtig von Hand geschüttelt, mindestens
zwei Stunden oder über Nacht bei –20°C gefällt und anschließend bei
13000U/min 20 Minuten zentrifugiert und der Überstand abpipettiert. Danach
wurden die Proben in drei Durchgängen mit jeweils 500µl eiskaltem 70%igem
Ethanol gewaschen und anschließend 30 Minuten bei 37°C im Brutschrank
getrocknet.
Den getrockneten Proben wurden dann je 25 µl DNAse-Mix, bestehend aus
20µl Wasser, 1µl RNase-Inhibitor, 3 µl DNase (10U/µl) und 1 µl MgCl²,
zugegeben und diese bei 37°C im Thermomixer 30 Minuten inkubiert. Nach
kurzem Zentrifugieren wurde die Reaktion 3 Minuten bei 95°C im Thermomixer
gestoppt. Nach Abkühlung auf Raumtemperatur erfolgte nach kurzem
Zentrifugieren pro Reaktionsgefäß die Zugabe von 1µl RNase-Inhibitor, die
Proben wurden erneut zentrifugiert und anschließend bei –70°C eingefroren.
3.2.2 RNA Quantifizierung und Reinheitskontrolle
Zur Quantifizierung der isolierten RNA wurden je 2µl RNA mit 98µl RNase
freiem Wasser verdünnt und anschließend die Menge der darin enthaltenen
RNA photometrisch ( in ng/µl) bestimmt. Als Reinheitskontrolle der Probe
wurde der Quotient der Absorption bei 260 und 280nm bestimmt.
3.2.3 Umschreibung der mRNA in cDNA
Die isolierte RNA wurde zur weiteren Verarbeitung nach dem folgenden
Protokoll mit Superscript III in cDNA umgeschrieben. Dabei wurde jeweils 1 µg
RNA mit 1µl 10mM dNTP Mix und 1µl Random Primers gemischt und mit DEPC
Wasser auf 13µl Gesamtvolumen aufgefüllt. Nach Erhitzen auf 65°C für 5
Minuten wurde die Reaktion in 1,5 Minuten auf Eis gestoppt. Anschließend
wurde jedem Tube 6µl eines Mastermix aus 4µl 5xBuffer,1µl 0,1MDTT und
0,5µl Superscript III je Probe zugegeben, gemischt und die Probe dann 5
Minuten bei 25°C, 60 Minuten bei 50°C und 15 Minuten bei 70°C inkubiert und
-33-
die Reaktion dann 3 Minuten auf Eis gestoppt. Die erhaltene cDNA wurde
anschließend bis zur weiteren Verwendung bei –20°C eingefroren.
Zur Qualitätskontrolle der cDNA diente eine an allen 100 Proben erfolgte ßActin PCR.
3.2.4 PCR (ETAR, ETBR, PKCα, PKCβ II)
Die PCR wurde in einem Gesamtvolumen von 21µl durchgeführt, wobei 1µl der
cDNA mit einem RedTaq ReadyMix gemäß den Angaben des Hersteller
Protokolls gemischt wurde.
Dabei wurden für jeweils 30 Proben folgende Komponenten verwandt:
270µl H2O
375µl RedTaq
15µl 5`Forward Primer
15µl 3`Reverse Primer
zu jeweils 20µl der erhaltenen Mischung wurden je 1 µl cDNA gegeben, was ein
Gesamtvolumen von 21µl ergab.
Die PCR Reaktion wurde dann bei 95°C für 5min, dann 35 Cyclen mit jeweils
1min 94°C, 1min 50°C (bei PKCß II 1min 55°C) und 1min 72°C, anschließend
72°C für 5 min, 4°C für 10 min und nachfolgend 15°C bis zum Beenden des
Programms, vollautomatisch durchgeführt.
Die PCR-Analyse wurde mittels Gel-Elektrophorese in 2% Agarose Gel mit
TAE Puffer bei 130 V durchgeführt.
-34-
3.3 Immunhistologie
Die Färbung wurde über zwei Tage durchgeführt. Zunächst erfolgte an Tag 1
die Entparaffinierung der zuvor angefertigten Schnitte mittels Xylol und
absteigender Alkoholreihe: Xylol 10min, Xylol 10 min, Xylol 10 min, 100% EtOH
5min, 96% EtOH 5min, 70% EtOH 5min, 50% EtOH 5 min, H2O und Aqua dest.
Zur weiteren Vorbehandlung wurden die entparaffinierten Schnitte in
Citratpuffer pH 6 (Endothelin-B Rezeptor-AK und PKC beta II-AK) oder EDTAPuffer pH 9 (Endothelin-A Rezeptor-AK und PKC alpha-AK) im Dampfgarer 25
min erhitzt, anschließend mindestens 10 min. im Wasserbad abgekühlt und
dann zunächst mit Leitungswasser und anschließend Aqua dest. gewaschen.
Danach wurden die Schnitte zur Blockade der endogenen Peroxidase für 20
min. in 0,3%igem H2O2-TBS-Puffer eingelegt und die Reaktion mittels
dreimaligen Waschens in Leitungswasser gestoppt. Nach erneutem Waschen
mit TBS-Puffer wurden die Schnitte mit dem Primärantikörper in der jeweiligen
Verdünnung über Nacht bei 4°C in einer Feuchtkammer inkubiert. Die
Verdünnung wurde durch AK-Verdünnungspuffer grün der Firma Zymed in je
nach Antikörper unterschiedlicher Verdünnung (Endothelin-A-Rez.-AK 1:75,
Endothelin-B-Rez.-AK 1:50, PKC alpha-AK 1:75, PKC beta II-AK 1:100)
hergestellt.
An Tag 2 wurden die erneut mit TBS-Puffer gewaschenen Schnitte für 30min
mit dem Sekundärantikörper, goat anti-rabbit, bei Endothelin-A Rez.-,
Endothelin-B Rez.- und PKC beta II-AK sowie goat anti-mouse bei PKC alphaAK der Firma Envision inkubiert. Nach erneutem Waschen in TBS-Puffer folgte
dann die Chromogen-Färbung mittels AEC der Firma DAKO für 20 min. Die
Gegenfärbung wurde nach Waschen mit Leitungswasser und Aqua dest. mit
Hämalaun für 30 sec durchgeführt und überschüssige Farbe mit Aqua dest. und
anschließend mit Leitungswasser entfernt. Danach wurden die Schnitte wässrig
eingedeckt.
-35-
4. Ergebnisse
Im Rahmen der Untersuchung der verschiedenen Fälle ductaler
Mammakarzinome, ductaler Carcinoma in situ (DCIS) und Normalgewebe
bezüglich der Expression der Endothelin-A und -B Rezeptoren sowie der PKC
alpha- und PKC beta II-Expression wurden zwei Nachweisverfahren
eingesetzt.
Zum Einen wurde der Nachweis mittels PCR an insgesamt 100 Proben
durchgeführt, zusätzlich wurden an 34 Proben aus diesem Kollektiv - so
ausgewählt, dass möglichst alle PCR-Ergebnisse (keine, schwache und starke
Expression von Endothelin-A und-B Rezeptor, PKC alpha und beta II) vertreten
waren - immunhistologische Färbungen durchgeführt.
4.1 Polymerase-Ketten-Reaktions (PCR)-Analyse
Normal (PCR)
50
45
40
35
30
relativer Anteil
25
in %
20
3+
2+
15
10
5
0
ETAR
ETBR
Grafik 1
-36-
PKC alpha
PKC beta II
DCIS (PCR)
50
45
40
35
30
relativer Anteil
25
in %
20
3+
2+
15
10
5
0
ETAR
ETBR
PKC alpha
PKC beta II
Grafik 2
Invasiv (PCR)
50
45
40
35
30
relativer Anteil
25
in %
20
3+
2+
15
10
5
0
ETAR
ETBR
PKC alpha
PKC beta II
Grafik 3
Die Ergebnisse der PCR zeigen im Normalgewebe in 9,1% der Fälle eine
deutliche (3+) Expression des Endothelin-A Rezeptors sowie eine mäßige (2+)
Expression der PKC alpha sowie der PKC beta II in ebenfalls 9,1%. Der
Endothelin-B Rezeptor ließ sich dagegen nicht nachweisen.
-37-
Bei der Untersuchung der DCIS-Proben ist eine starke (3+) sowie eine mäßige
(2+) Endothelin-A Rezeptor Expression in jeweils 7,1% der Fälle zu
verzeichnen, d.h. es sind insgesamt 14,2% der Fälle Endothelin-A Rezeptor positiv. Eine mäßige(2+) Expression des Endothelin B-Rezeptors zeigt sich in
15,4%, PKC alpha wird in 38,5% der Fälle stark (3+) und PKC beta II in7,7%
der Proben mäßig exprimiert.
In invasiven Tumoren kann eine Expression des ETAR deutlich (3+) und mäßig
(2+) in jeweils 10,5% der Fälle beobachtet werden, zusammengenommen also
21%. Die ETBR Expression ist stark (3+) in 11,8% und mäßig (2+) in 9,2% der
Fälle, damit insgesamt in 21% aller Fälle nachweisbar. PKC alpha wird in
17,1% deutlich (3+) und in 18,4 % mäßig (2+) und damit insgesamt in 35,5%
exprimiert. Die PKC beta II-Expression zeigt sich mäßig (2+) in 7,9% der
Proben.
4.2 PCR-Analyse 34 ausgewählter Fälle
DCIS (PCR 34 Proben)
50
45
40
35
30
relativer Anteil
25
in %
20
3+
2+
15
10
5
0
ETAR
ETBR
Grafik 4
-38-
PKC alpha
PKC beta II
Invasiv (PCR 34 Proben)
50
45
40
35
30
relativer Anteil
25
in %
20
3+
2+
15
10
5
0
ETAR
ETBR
PKC alpha
PKC beta II
Grafik 5
In der PCR-Analyse der 34 ausgewählten Fälle zu denen auch eine
immunhistologische Färbung vorliegt kann in der Gruppe der Fälle mit
Normalgewebe keine Endothelinrezeptor-Expression nachgewiesen werden
und auch PKC alpha und PKC beta II werden nicht exprimiert.
In der Gruppe der ductalen Carcinoma in situ ist eine Endothelin- A Rezeptor
Expression in 25% der Fälle stark (3+) und in 25% der Fälle mäßig (2+) zu
sehen, das heißt in insgesamt 50% der Fälle liegt eine relevante Endothelin-A
Rezeptor Expression vor. Der Endothelin-B Rezeptor wird in dieser Gruppe in
50% mäßig (2+) stark exprimiert. Eine starke (3+) PKC alpha Expression liegt in
25% der Fälle vor, während eine PKC beta II Expression nicht nachgewiesen
werden kann.
An invasiven Tumoren zeigt die PCR-Analyse eine Endothelin-A Rezeptor
Expression in insgesamt 42,8% der Fälle, wobei in 19% eine starke (3+) und in
23,8% der Fälle eine mäßige (2+) Expression vorliegt. Der Endothelin-B
Rezeptor wird mit starker (3+) Expression in 28,6% und mäßiger (2+)
Expression in 19% in insgesamt 47,6% der Fälle dieser Gruppe exprimiert. Eine
starke (3+) PKC alpha- Expression kann in 4,8% der Fälle und eine mäßige
(2+) PKC beta II- Expression ebenfalls in 4,8% der Fälle nachgewiesen werden.
-39-
4.3 Immunhistologische Analyse 34 ausgewählter Fälle
Normal (Immuno)
50
45
40
35
30
3+
relativer Anteil
25
in %
20
2+
1+
15
10
5
0
ETAR
ETBR
PKC alpha
PKC beta II
Grafik 6
DCIS (Immuno)
50
45
40
35
30
relativer Anteil
25
in %
20
3+
2+
1+
15
10
5
0
ETAR
ETBR
Grafik 7
-40-
PKC alpha
PKC beta II
Invasiv (Immuno)
50
45
40
35
30
relativer Anteil
25
in %
20
3+
2+
1+
15
10
5
0
ETAR
ETB-Rez.
PKC alpha
PKC beta II
Grafik 8
In der Gruppe der Proben mit Normalgewebe (9 Fälle), zeigt sich ein starke
(3+) sowie eine mäßige (2+) Expression des Endothelin-A Rezeptors in jeweils
33,3% der Fälle, eine schwache (1+) Expression in 22,2% der NormalgewebeProben. Der Endothelin-B Rezeptor wird in dieser Gruppe in keinem Fall stark
(3+) exprimiert, während in je 22,2% eine mäßige (2+) sowie eine schwache
(1+) Expression vorliegen. Eine PKC alpha- Expression kann in diesem
Kollektiv in Normalgewebe nicht nachgewiesen werden, PKC beta II wird in
11,1% der Fälle mäßig (2+) exprimiert, während keine starke oder schwache
Expression nachgewiesen werden kann.
In der kleinen Gruppe der Fälle ductaler Carcinoma in situ (4 Fälle) ist eine
mäßige (2+) Expression des Endothelin-B Rezeptors in 75% der Fälle sowie
eine mäßige (2+) Expression der PKC beta II in jeweils 25% der Fälle zu sehen.
-41-
Abbildung 5a
Abbildung 5b
Abbildung 5c
Abbildung 5d
Abbildung 5e
Abbildung 5f
Abbildung 5a-f:
a) Normalgewebe ohne Nachweis ETAR oder ETBR, b) Normalgewebe positiv
für ETAR , c) Normalgewebe positiv für ETBR
d) DCIS ohne Nachweis von ETAR, ETBR, PKCα oder PKCβ II, e) DCIS positiv
für ETBR , f) DCIS positiv für PKCβ II
-42-
Bei der Färbung der invasiven Tumoren zeigt sich eine Endothelin-A Rezeptor
-Expression von mäßiger (2+) Intensität in 9,5% und von schwacher Intensität
in 14,3% der Fälle. Der Endothelin-B Rezeptor wird in dieser Gruppe in 19%
stark (3+), in 9,5% mäßig (2+) und in 4,8% der Fälle schwach (1+) exprimiert.
Die Expression von PKC alpha ist in 4,8% der Fälle mäßig (2+) und in 14,3%
der Fälle schwach(1+) zu sehen, sowie PKC beta II ebenfalls in 4,8% der Fälle
mit mäßiger (2+) Intensität und in 19% der Fälle mit starker (3+) Intensität
nachweisbar ist.
Abbildung 6a
Abbildung 6b
Abbildung 6c
Abbildung 6d
-43-
Abbildung 6e
Abbildung 6a-e:
a) Invasiv duktales Karzinom ohne Nachweis von ETAR, ETBR, PKCα oder
PKCβ II, b) Invasiv duktales Karzinom positiv für ETAR , c) Invasiv duktales
Karzinom positiv für ETBR , d) Invasiv duktales Karzinom positiv für PKCα,
e) Invasiv duktales Karzinom positiv für PKCβ II
Neben den prozentualen Angaben zur Endothelin-A und Endothelin-B Rezeptor
sowie PKC alpha- und PKC beta II- Expression zeigen die nachfolgenden
Tabellen noch einmal die Einzelfälle, jeweils aufgeteilt nach Fällen, die
Endothelin-A Rezeptor- positiv, Endothelin-B Rezeptor- positiv oder PKC alphabeziehungsweise PKC beta II- positiv sind.
-44-
Nr.
PCR
67
74
89
93
Invasiv
ETAR
+
+
+
++
Invasiv
ETBR
0
0
0
0
Invasiv
PKCα
0
+
0
0
Invasiv
PKCβ II
0
0
0
0
DCIS
ETAR
0
0
0
0
DCIS
ETBR
0
0
0
++
DCIS
PKCα
0
0
0
0
DCIS
PKCβ II
0
0
0
0
Norm.
ETAR
0
0
++
+++
Norm.
ETBR
++
0
0
++
Entz.
PKCβ II
0
0
+++
0
Östrogenrezeptor
IRS 12
>90%
0
IRS 9
Invasiv
PKCα
0
0
0
0
0
0
+
Invasiv
PKCβ II
+
0
0
0
0
+
0
DCIS
ETAR
0
0
0
0
0
+
0
DCIS
ETBR
0
++
++
0
0
+++
0
DCIS
PKCα
0
0
0
0
0
+
0
DCIS
PKCβ II
0
0
0
0
0
+
0
Norm.
ETAR
0
++
0
0
+
0
+++
Norm.
ETBR
0
+++
0
0
0
0
++
Entz.
PKCβ II
+
+
0
+++
0
+
0
Östrogenrezeptor
80%
+
IRS 12
0
IRS12
>95%
80%
Tabelle 6 Einzelfälle ETAR positiv
-45Nr.
PCR
31
42
72
75
76
87
64
Invasiv
ETAR
0
++
0
0
0
0
0
Invasiv
ETBR
+++
+++
+++
++
++
+++
+
Tabelle 7 Einzelfälle ETBR positiv
Tabelle 6 zeigt die 4 mittels Immunhistologie nachgewiesenen Endothelin- A
Rezeptor positiven Fälle invasiver Karzinome der bereits zuvor beschriebenen
34 immunhistologisch untersuchten Fälle. Dabei sind in der Tabelle die
Ergebnisse des Endothelin Rezeptorstatus sowie der PKC alpha und beta IIExpression im invasiven Karzinomanteil, in anhängendem ductalem Carcinoma
in situ sowie anhängendem Normalgewebe und der Östrogenrezeptorstatus,
der bereits in einer Voruntersuchung festgelegt wurde, aufgezeichnet. Bei der
Betrachtung der Einzelfälle zeigt sich bis auf den gemeinsamen Endothelin-A
Rezeptor Nachweis keine signifikante Gemeinsamkeit im Sinne einer
begleitenden Endothelin-B Rezeptor-, PKC alpha- oder PKC beta II-Expression.
Der Östrogenrezeptor wird jedoch in 3 von 4 Fällen und damit in 75% der Fälle
exprimiert.
In Tabelle 7 sind die insgesamt 7 Fälle, in denen in der Immunhistologie der
Endothelin-B Rezeptor nachgewiesen werden konnte, aufgeführt und es wird
ersichtlich, dass es außer dem positiven Endothelin-B Rezeptor Nachweis
wenig Gemeinsamkeiten zwischen den einzelnen Fällen gibt. Sowohl ein
zusätzlicher Nachweis des Endothelin-A Rezeptors als auch eine begleitende
PKC alpha- oder beta II-Expression können nur in Einzelfällen gezeigt werden.
Bezüglich des Östrogenrezeptors sind in der Gruppe 6 von 7 Fällen und damit
86% positiv.
Auch bei den Fällen mit Nachweis einer PKC alpha- oder PKC beta IIExpression, dargestellt in Tabelle 8 und Tabelle 9, zeigen sich, bis auf einen
in allen Fällen nachweisbaren Östrogenrezeptor, keine signifikanten
Gemeinsamkeiten bei insgesamt auch sehr kleiner Gruppengröße.
-46-
Nr.
PCR
41
64
66
74
Invasiv
ETAR
0
0
0
+
Invasiv
ETBR
0
+
0
0
Invasiv
PKCα
++
+
+
+
Invasiv
PKCβ II
+
0
0
0
DCIS
ETAR
0
0
0
0
DCIS
ETBR
++
0
0
0
DCIS
PKCα
0
0
0
0
DCIS
PKCβ II
0
0
0
0
Norm.
ETAR
0
+++
0
0
Norm.
ETBR
++
++
0
0
Entz.
PKCβ II
0
0
+
0
Östrogenrezeptor
IRS 12
80%
>90%
>90%
Invasiv
PKCβ II
+
+
+
++
DCIS
ETAR
0
0
+
0
DCIS
ETBR
0
++
+++
+
DCIS
PKCα
0
0
+
0
DCIS
PKCβ II
0
0
+
0
Norm.
ETAR
0
0
0
+++
Norm.
ETBR
0
++
0
0
Entz.
PKCβ II
++
0
+
0
Östrogenrezeptor
80%
IRS 12
>95%
IRS 8
Tabelle 8 Einzelfälle PKC alpha positiv
-47Nr.
PCR
31
41
87
88
Invasiv
ETAR
0
0
0
0
Invasiv
ETBR
+++
0
+++
0
Invasiv
PKCα
0
++
0
0
Tabelle 9 Einzelfälle PKC beta II positiv
4.4 Vergleich PCR und Immunhistologie an ausgewählten Fällen
In Grafik 9 und 10 wird die Verteilung der Rezeptorexpression sowie der
Expression von PKC alpha und PKC beta II in PCR und immunhistochemischer
Färbung im Vergleich dargestellt, wobei sich die Angaben jeweils auf den
prozentualen Anteil an der jeweiligen Untergruppe von 9 Fällen mit
Normalgewebe, 4 Proben eines DCIS und 21 Gewebeproben eines invasiv
ductalen Carcinoms beziehen, in denen sowohl eine PCR-Untersuchung als
auch immunhistochemische Färbung vorliegen.
PCR (34 Fälle)
100
90
80
70
relativer Anteil
in %
60
ETAR
50
ETBR
40
α
30
β II
20
10
0
Normal
DCIS
Grafik 9
-48-
Invasiv
Immuno (34 Fälle)
100
90
80
70
relativer Anteil
in %
60
ETAR
50
ETBR
40
α
30
β II
20
10
0
Normal
DCIS
Invasiv
Grafik 10
Dabei zeigt sich in der PCR kein Fall von Normalgewebe, der eine Expression
des Endothelin-A Rezeptors, des Endothelin-B Rezeptors oder eine PKC alphaoder PKC beta II-Expression zeigt. In der Immunhistologie weisen 89% der
Fälle mit Normalgewebe eine Endothelin-A Rezeptor-Expression auf. Eine
Endothelin-B Rezeptor-Expression zeigt sich in 44,4% der Fälle und während
eine Expression von PKC alpha nicht nachgewiesen werden kann wird PKC
beta II in 11,1% der Fälle exprimiert.
Bei der Betrachtung der Proben aus ductalen Carcinoma in situ exprimieren
in der PCR jeweils 50% den Endothelin-A oder Endothelin-B Rezeptor und in
25% der Fälle zeigt sich eine PKC alpha-Expression, während keine PKC beta
II-Expression nachgewiesen werden kann.
In der immunhistochemischen Färbung zeigen in dieser Gruppe 75% der Fälle
des Gesamtkollektivs eine Endothelin-B Rezeptor- Expression und 25% eine
PKC beta II-Expression, wohingegen weder der Endothelin-A Rezeptor noch
PKC alpha exprimiert werden.
-49-
In der größten Untergruppe, den Proben mit überwiegendem Anteil ductal
invasiver Carcinome, kann in der PCR gezeigt werden, dass in 57,1% der
Fälle mit invasiv ductalem Carcinom eine Endothelin-A Rezeptor-Expression
und 61,9% der Fälle eine Endothelin-B Rezeptor-Expression vorliegt. Eine
Expression von PKC alpha oder PKC beta II tritt in jeweils 4,8% der Fälle auf.
Die Immunhistologie zeigt in 23,8% eine Endothelin-A Rezeptor- Expression in
invasivem Tumorgewebe und in 33,3% der Fälle wird in diesem Gewebe eine
Endothelin-B Rezeptor- Expression nachgewiesen. Eine Expression von PKC
alpha zeigt sich in 19,1% und eine PKC beta II-Expression in 23,8% im
invasiven Tumorgewebe.
4.5 Einzelfall-Analyse PCR versus Immunhistologie
Die bereits in Tabelle 10 erkennbaren Unterschiede in der Endothelin-A und -B
Rezeptor-Expression sowie der Expression von PKC alpha und beta II zeigen
sich noch deutlicher in der Analyse der Einzelfälle. Dabei fällt auf, dass es nur
eine sehr geringe Übereinstimmung der PCR-Ergebnisse mit den Ergebnissen
der immunhistochemischen Färbung in den Einzelfällen gibt. Die folgende
Tabelle zeigt neun Einzelfälle, an denen die verschiedenen Konstellationen von
PCR-Ergebnis und immunhistochemischer Färbung deutlich werden.
PCR
Immunhistochemie
ETB
PKCα
DCIS
56
2
3
2
0
1
Tumor 0
Normal +
DCIS ++
Normal 0
Tumor 0
Normal 0
DCIS
58
2
2
2
0
1
DCIS 0
DCIS ++
inv.
40
3
3
3
0
1
Tumor 0
Tumor 0
Normal 0
inv.
41
2
3
3
0
1
Tumor 0
Normal ++
DCIS ++
inv.
64
2
2
3
0
1
inv.
67
2
2
2
0
1
inv.
71
2
3
3
0
1
Normal +++
Tumor 0
Tumor 50% +
Normal 0
Tumor 0
Tumor +
Normal ++
Normal ++
Tumor 0
Tumor 0
Normal 0
inv.
89
2
2
2
0
1
Normal ++
Tumor 0
Tumor 0
Normal 0
Einzelzellen +
prolif.
Mastopathie ++
DCIS ++
DCIS 0
Normal wenig
granulär
Tumor 0
Tumor 0
Normal 0
Normal 0
Entz. +++
TumorTumor
membran ++ herdförmig
nukleär +
Tumor +
Tumor 0
Normal 0
Normal 0
Tumor 0
Tumor 0
Normal 0
Tumor 0
Tumor 0
Normal 0
Normal 0
Entz. ++
Tumor 0
Tumor 0
Normal 0
Normal 0
Entz. +++
inv.
88
1
1
1
3
2
Normal +++
Tumor 0
Tumor 0
DCIS 0
Nr.PCR ß-Ac ETA ETB
PKCα PKCßII ETA
Tabelle 10
-50-
DCIS +
Tumor 0
PKCß
Östr.
Her2n
IRS 12 0
IRS 12 2+
80%
1+
pos.
IRS 12 0
80%
pos.
0
neg.
1+
Tumorkerne ++ IRS 8
Normal 0
0
In Tabelle 10 werden exemplarisch neun Einzelfälle aus dem Kollektiv der 34
sowohl mittels PCR als auch durch immunhistochemische Färbung
untersuchten Gewebeproben. Dabei werden die unterschiedlichen Ergebnisse
in den einzelnen Methoden und deren mögliche Ursache gut sichtbar.
Bei Fall Nr. 1 zeigt die PCR sowohl für den Endothelin-A als auch für den
Endothelin-B Rezeptor eine deutliche Expression, während in der
immunhistochemischen Färbung der Endothelin-A Rezeptor im Tumorgewebe
nicht und im Normalgewebe schwach exprimiert wird. Bei dem Endothelin-B
Rezeptor, der im Anteil des ductalen Carcinoma in situ ebenfalls mäßig stark
exprimiert wird, stimmt das Ergebnis überein. Auch in Fall Nr.2 zeigt sich eine
weitgehende Übereinstimmung der Ergebnisse, während in Fall Nr. 3 der
starken Endothelin-A und -B Rezeptor- Expression in der PCR nur eine sehr
schwache bis fehlende Expression in der Färbung entgegengesetzt werden
kann. Auch in Fall Nr. 5, der eine ähnlich starke Expression der beiden
Rezeptoren in der PCR zeigt, ist das Tumorgewebe in der Färbung nur
schwach positiv, während in diesem Fall das anhängende Normalgewebe eine
deutliche Expression zeigt. Außerdem ist auch wie in Fall Nr. 5 die
Konstellation, dass nur in der PCR ein positiver Nachweis der Rezeptoren
erfolgt, während diese in der Färbung in keinem Anteil des Gewebes
nachweisbar sind.
Bezüglich der Expression von PKC alpha zeigt sich in der PCR in keiner der
Proben ein positiver Nachweis, während in der immunhistochemischen Färbung
in Fall 4 und 5 eine schwache Expression zu erkennen ist.
PKC beta II wird in der PCR in nahezu allen Fällen schwach exprimiert,
während in der Färbung nur in Fall 1, 2 und 4 eine Anfärbung des
Tumorgewebes nachgewiesen werden kann, während in Fall 3, 7 und 8
lediglich die Zellen der ausgeprägten Entzündung einen PKC beta II Nachweis
zeigen.
-51-
Insgesamt wird damit in invasiven Tumoren sowohl in der PCR als auch in der
immunhistochemischen Färbung PKC alpha nur in sehr geringem Maße
exprimiert und auch bezüglich PKC beta II zeigt sich in der PCR-Analyse eine
nur schwache Expression, die aufgrund dessen in den vorangehenden
Analysen nicht berücksichtigt wurde. In der immunhistochemischen Färbung
wird PKC beta II ebenfalls in geringem Maße exprimiert.
-52-
5. Diskussion
Aufgrund der großen Bedeutung des Mammakarzinoms im Bereich der
malignen Tumoren der Frau (64) hat auch die Forschung zu neuen
therapeutischen Ansätzen auf diesem Gebiet einen hohen Stellenwert. Neben
verschiedenen Hormonrezeptoren, wie zum Beispiel Östrogenrezeptoren, an
denen bereits seit längerem therapeutisch angesetzt wird, erscheint das
Endothelinsystem, wie es bei anderen Tumoren bereits längere Zeit
angenommen wird, auch im Bereich des Mammakarzinoms als möglicher neuer
therapeutischer Ansatzpunkt.
Ziel dieser Arbeit war es die Expression des Endothelin-A sowie des
Endothelin-B Rezeptors sowie die PKC alpha- und PKC beta II-Expression in
Normalgewebe, ductalem Carcinoma in situ und invasiv ductalem Karzinom zu
zeigen und aus eventuell nachweisbaren Unterschieden der Expressionsmuster
mögliche Ansatzpunkte für weitere Untersuchungen mit dem Ziel
therapeutischer Interventionsmöglichkeiten zu erhalten. Zum Nachweis der
Endothelin-A - und –B Rezeptor- sowie der PKC alpha- und beta II-Expression
wurde zum einen die qualitative PCR zum Nachweis auf mRNA-Ebene als auch
die immunhistologische Färbung zum Nachweis auf Proteinebene durchgeführt.
Die PCR, die an 100 Gewebeproben, davon 11 Proben aus Normalgewebe, 13
Proben mit DCIS und 76 Proben eines invasiv ductalen Karzinoms, erfolgte,
zeigte im Vergleich zum Normalgewebe eine Zunahme der Expression des
Endothelin-A - und Endothelin-B Rezeptors sowie auch eine höhere PKC alphaund beta II-Expression im invasiven Karzinom. Ähnliches wird auch in der
Literatur beschrieben. Alanen et al zeigten 2000 an invasiven
Mammakarzinomen eine, im Vergleich zum Normalgewebe, erhöhte Expression
des Endothelin-B Rezeptors auf mRNA Ebene (2) und auch Grimshaw et al
konnten 2002 eine deutlich erhöhte Expression des Endothelin-B Rezeptors auf
mRNA Ebene in invasiven Karzinomen nachwiesen (47).
-53-
Im Gegensatz dazu steht eine Arbeit an 37 Gewebeproben, wovon 31 aus
invasiven Karzinomen und 6 aus Normalgewebe stammen, die keinen
Unterschied der Endothelin-B Rezeptor-Expression auf mRNA Ebene in den
beiden Gruppen beschreibt, allerdings, wie auch in vorangehenden
Untersuchungen beschrieben, eine signifikant höhere Expression des
Endothelin-A Rezeptors in der Gruppe der invasiven Karzinome zeigt (136,
134). Aber auch wenn die Arbeiten unterschiedliche Ergebnisse zeigen so ist
doch allgemein auffallend, dass mit Zunahme der Invasivität eine Veränderung
im Endothelinsystem auftritt, so dass weitere Untersuchungen dieser
Veränderungen vielversprechend erscheinen.
Zur genaueren Untersuchung der Expressionsmuster wurden in der
vorliegenden Arbeit 34 Proben, davon 21 aus invasiven Karzinomen, 4 aus
ductalen Carcinoma in situ und 9 aus Normalgewebe von
Mammareduktionsplastiken zusätzlich mittels immunhistochemischer Färbung
untersucht und mit den PCR Ergebnissen derselben Proben verglichen.
Im Vergleich der Ergebnisse beider Verfahren innerhalb der Gruppe der 34
Proben zeigt sich dabei ein deutlicher Unterschied. So kann in der PCR
Untersuchung im Normalgewebe trotz guter Expression von ß-Actin, keine
Endothelin-A- oder Endothelin-B Rezeptor- Expression nachgewiesen werden
und auch eine PKC alpha- oder PKC beta II-Expression tritt nicht auf, während
in der immunhistologischen Färbung in 89% eine Endothelin-A Rezeptor- und
in 44,4% eine Endothelin-B Rezeptor- Expression im Normalgewebe
nachzuweisen ist. In der Gruppe der invasiven Karzinome wird in der PCR in
57,1% der Fälle der Endothelin-A und in 61,9% der Endothelin-B Rezeptor
exprimiert und zeigt damit eine deutlich höhere Expressionsrate als in der
immunhistologischen Färbung. Immunhistologisch zeigt sich im invasiven
Tumorgewebe lediglich in 23,8% eine positive Expression des Endothelin-A
Rezeptors und ein positiver Nachweis des Endothelin-B Rezeptors kann
ebenfalls nur in 33,3% der Fälle gezeigt werden.
-54-
Eine mögliche Ursache für den stärkeren Nachweis der Endothelinrezeptoren in
der PCR könnte zum einen Normalgewebe oder DCIS in der direkten
Umgebung des Tumors sein, da ein Gewebeschnitt in der Regel nicht
ausschließlich Tumorzellen enthält und in der PCR anschließend nicht mehr
nachvollzogen werden kann aus welchem Gewebeanteil die extrahierte mRNA
stammt. So kann auch anhängendes Normalgewebe, mit eventuell starker
Endothelin-A oder Endothelin-B Rezeptor-Expression zu einem positiven
Nachweis der entsprechenden mRNA in der Probe führen, obwohl der invasive
Tumoranteil einen negativen Rezeptorstatus aufweist.
In der immunhistologischen Färbung dagegen zählten nur positiv angefärbte
Tumorzellen, die lichtmikroskopisch von anhängendem Normalgewebe oder
Anteilen eines ductalen Carcinoma in situ unterschieden werden konnten. Auch
wenn für die PCR Gewebeblöcke gewählt wurden, die möglichst einheitliches
Tumorgewebe enthielten, ist anhängendes nicht tumorinfiltriertes
Normalgewebe vorhanden. In der lichtmikroskopischen Untersuchung der
gefärbten Schnitte fiel auf, wie auch in Tabelle 10 ersichtlich, dass
Normalgewebe , DCIS und Tumorgewebe meist einen unterschiedlichen
Rezeptorstatus aufweisen, was dann zu den beschriebenen falsch positiven
Ergebnissen geführt haben dürfte.
Als weitere mögliche Ursache unterschiedlicher Ergebnisse in PCR und
Immunhistologie wird in der Literatur die eventuell ausbleibende Translation
vorhandener mRNA in erkennbare Proteinstrukturen angeführt (74), was auch
zu falsch positiven Ergebnissen führen würde, wenn man davon ausgeht, dass
nur intakte Proteine klinisch bedeutsam sind.
Besonders problematisch erscheint die Diskrepanz zwischen PCR und
Immunhistologie in Bezug auf das Normalgewebe, bei dem die PCR Ergebnisse
komplett negative und die Immunhistologie durchaus auch positive Ergebnisse
erzielte. Prinzipiell wären als mögliche Ursachen Gewebedegradation, Fehler
im Ansatz der PCR und Probleme beim PCR Lauf zu diskutieren.
Gewebedegradation läßt sich auf Grund der gelungenen ß-Aktin Amplifikation
ausschließen, Fehler in der PCR Reaktion sind ebenfalls unwahrscheinlich, da
die jeweils mitgeführten Positivkontrollen die erwarteten Ergebnisse ergaben,
-55-
so dass fehlende oder degradierte Reagenzien im Mastermix für die PCR LaufFehler als Ursache ausscheiden.
Im umgekehrten Fall, des falsch negativen Ergebnisses könnte ein besserer
Proteinerhalt während der Formalinfixierung und Paraffineinbettung für einen
möglichen Nachweis auf Proteinebene verantwortlich sein, während die mRNA
entsprechender Proteine durch eine verzögerte Fixierung des Gewebes (zu
wenig Formalin; nicht genügend schnelles Eindringen des Fixationsmittels
durch zu dicke Gewebescheiben) degradiert wurde oder nur noch in so
geringem Umfang vorliegt, dass in der quantitativen PCR kein sicherer
Nachweis mehr möglich ist. Insbesondere bei Proben, die nicht unmittelbar
durch den Untersucher selbst ausreichend fixiert wurden, sondern aus anderen
Abteilungen zugesandt werden und somit eventuell längere Zeitspannen
zwischen Entnahme des Gewebes und Fixierung liegen, könnte dies zu einem
Verlust von mRNA führen. Insgesamt zeigen Untersuchungen zu
unterschiedlichen Verfahren der Fixierung , dass Proteine in 10%igem
gepuffertem Formalin fixiertem Gewebe selbst nach längerer Fixierung noch
durch immunhistochemische Verfahren nachgewiesen werden können (133),
während bereits die übliche Formalinfixierung zu einem größeren Verlust
nachweisbarer mRNA führen kann (83). Neben der Formalinfixierung trägt auch
die Paraffineinbettung wesentlich zur reduzierten Effizienz der mRNA Extraktion
an derart präserviertem Gewebe bei. So konnten Fries et al (2003) nachweisen,
dass die Formalinfixierung selbst unter optimalen Bedingungen die
extrahierbare mRNA Menge um den Faktor 500 reduziert (40), während die
Paraffineinbettung noch einmal für einen weiteren, ca. 20%igen Verlust von
mRNA im Vergleich zur Verwendung von frisch gefrorenem Gewebe
verantwortlich zu machen ist (40).
Angesichts dieser Unterschiede ist zu diskutieren ob und in welchem Maß sich
die PCR als alleiniges Routineverfahren zum Nachweis des Rezeptorstatus bei
einer potentiell darauf aufbauenden Therapie eignet. Selbst bei besonderer
Auswahl des Gewebes, aus dem die mRNA-Extraktion erfolgt, ist nicht zu
verhindern, dass andere Zellen, die mitunter den Tumorzellen direkt benachbart
sind, Einfluss auf das Ergebnis haben und so zu falsch positiven Ergebnissen
führen. Auch eine immer gleiche und schnelle Fixierung, um einen eventuellen
-56-
mRNA Verlust zu verhindern, wird in der Praxis schwer zu erreichen sein, so
dass man angesichts dieser möglichen Fehlerquellen auf die
immunhistologische Färbung als Grundlage der Entscheidungsfindung offenbar
leider nicht verzichten kann. Dies ist umso bedauerlicher, als die mRNA
Extraktion mit anschließender RT-PCR nicht nur insgesamt schneller zu
bewerkstelligen ist, sondern auch deutlich billiger wäre. Der mögliche
Kritikpunkt der Immunhistologie, nämlich die Tatsache, dass es sich dabei um
ein semiquantitatives Verfahren handelt und somit kein absolut vergleichbares
Ergebnis vorliegt, könnte mit der Einführung entsprechender Richtlinien zur
Beurteilung der Färbeintensität und Lokalisation wie es auch beim Nachweis
der Östrogenrezeptoren der Fall ist, entkräftet werden. Hier wären eventuell
Ringversuche zur Standardisierung der Ergebnisse zwischen verschiedenen
Labors sinnvoll.
Aufgrund dieser vorangehend beschriebenen unterschiedlichen Ergebnisse
beziehen sich die nachfolgenden Beobachtungen und Vergleiche ausschließlich
auf die Ergebnisse der Immunhistologie.
Bei der Betrachtung der Ergebnisse zeigt sich in der Gruppe invasiver
Carcinome eine Expression des Endothelin-A Rezeptors in 23,8% und des
Endothelin-B Rezeptors in 33,3%, womit ein deutlicher Rückgang der
Expression des Endothelin-A Rezeptors im Vergleich zum Normalgewebe, in
dem dieser in 89% der Fälle nachgewiesen werden kann, vorliegt. Auch der
Endothelin-B Rezeptor kann in den Fällen mit Normalgewebe zu einem höheren
Prozentsatz nachgewiesen werden, in der Betrachtung der Intensität der
Expression zeigt sich jedoch eine Zunahme der Intensität im invasiven
Karzinom. Während der Endothelin-B Rezeptor in Normalgewebe nur schwach
bis mäßig exprimiert wird, tritt in den Endothelin-B Rezeptor- positiven invasiven
Karzinomen überwiegend eine starke und mäßige Expression auf. Auffallend ist
weiterhin die besonders hohe Expression des Endothelin-B Rezeptors in der
Gruppe der DCIS-Fälle, in der dieser in 75% nachgewiesen werden kann,
wobei Verteilungen innerhalb dieser Gruppe aufgrund der geringen Fallzahl
durchaus kritisch zu bewerten sind.
-57-
Insgesamt deuten die Ergebnisse aber auf eine besondere Rolle des
Endothelin-B Rezeptors in invasiven Karzinomen hin. Vorangehende Arbeiten,
in denen die Expression von Endothelin und Endothelinrezeptoren untersucht
wurde, zeigen einen insgesamt höheren prozentualen Anteil
Endothelinrezeptor positiver Gewebeproben bei invasiven Karzinomen im
Vergleich zum Normalgewebe, mit leicht erhöhtem Anteil einer Endothelin-B
Rezeptor- Expression. An 160 Gewebeproben invasiver Mammakarzinome
konnten Wülfing et al 2003, in 46,5% der Fälle eine immunhistologisch
nachgewiesene Endothelin-A Rezeptor- Expression und in 53,4% eine
Endothelin-B Rezeptor Expression nachweisen (135). Ähnliche Ergebnisse
werden auch in einer Arbeit, in der 88 Fälle invasiver Mammakarzinome mit
zum Teil anhängendem Gewebe eines ductalen Carcinoma in situ bezüglich der
Expression der Endothelinrezeptoren mittels Immunhistologie untersucht
wurden, gezeigt. Dabei wird eine Endothelin-A Rezeptor- Expression in 45,3%
und eine Endothelin-B Rezeptor- Expression in 55,7% der invasiven Karzinome
nachgewiesen. In ductalen Carcinomen in situ liegt die Endothelin-A RezeptorExpression bei 38,4%, während eine Endothelin-B Rezeptor- Expression in
60% nachweisbar ist. Im Vergleich der Gruppen untereinander wird bezüglich
des Endothelin-A Rezeptors eine Zunahme der Expression mit zunehmender
Invasivität beschrieben, während Veränderungen der Endothelin-B RezeptorExpression nicht in diesem Maße auftreten. Wie auch in der hier vorliegenden
Arbeit, in der in Gewebeanteilen mit ductalem Carcinoma in situ der EndothelinB Rezeptor deutlich stärker exprimiert wird als in invasiven Karzinomen, zeigt
sich auch in der zuvor beschriebenen Arbeit in ductalen Carcinoma in situ eine
stärkere Endothelin-B Rezeptor- Expression als im invasiven Tumoranteil (134).
Ein Unterschied zu den vorliegenden Daten zeigt sich in einigen der
vorangehend beschriebenen Untersuchungen bezüglich des Rezeptorstatus
des Normalgewebes. Eine Arbeitsgruppe zeigt eine ETAR-Expression in 14%
und eine ETBR-Expression in 22,1% in der immunhistologischen Färbung
(134). Auch eine nachfolgende Untersuchung von Wülfing et al zeigt 2004 einen
geringen ETAR-Nachweis in Normalgewebe, wobei es sich dabei um eine
Expression auf mRNA Ebene handelt (136), so dass kein direkter Vergleich
möglich ist.
-58-
Insgesamt zeigen also auch die Ergebnisse der Immunhistologie, dass das
Endothelinsystem in Entstehung und Erhalt des Mammakarzinoms
offensichtlich eine Bedeutung hat. Das Besondere der hier vorliegenden Arbeit
ist einerseits, dass 1) der in dieser Untersuchung beobachtete Wechsel von der
erhöhten Expression des Endothelin-A Rezeptors im Normalgewebe hin zu
stärkerer Expression des Endothelin-B Rezeptors im invasiven Karzinom
überwiegend nicht in den vorangehenden Untersuchungen gezeigt wurde und
2) eine besondere Bedeutung des Endothelin-B Rezeptors zusätzlich an der
höheren Expression abgelesen werden kann.
Weitere Untersuchungen speziell im Hinblick auf eine Veränderung der
Expression des Endothelinrezeptors in der Karzinogenese erscheinen hier
sinnvoll. Da Rezeptoren für Endothelin insgesamt aber nur bei einer relativ
kleinen Anzahl von Mammakarzinomfällen überhaupt vorhanden zu sein
scheinen, muss bei der Suche nach therapeutischen Ansatzpunkten der
Endothelin-Rezeptorstatus unbedingt zuvor immunhistologisch bestimmt
werden. Solche Richtlinien gibt es aber gegenwärtig noch nicht.
Bezüglich der PKC alpha und PKC beta II Expression zeigen die vorliegenden
Daten in der Gruppe invasiver Karzinome mit einer PKC alpha Expression in
19,1% der Fälle die stärkste Ausprägung gegenüber den DCIS-Fällen und den
Normalfällen in denen sich PKC alpha nicht nachweisen lässt. PKC beta II wird
mit 23,8% in der Gruppe der invasiven Karzinome und 25% bei ductalen
Carcinoma in situ in diesen beiden Gruppen ähnlich hoch exprimiert während
im Normalgewebe PKC beta II nur in 11,1% der Fälle nachgewiesen werden
kann.
Damit scheint auch PKC Formen eine Rolle in der Tumorentwicklung oder im
Tumorerhalt zuzukommen.
Auffallend ist in der vorliegenden Arbeit eine insgesamt geringe PKCExpression in Normalgewebe und DCIS, wobei ausschließlich PKC beta II
exprimiert wird, sowie eine deutliche Zunahme der PKC alpha- Expression in
der Gruppe der invasiven Tumoren.
-59-
Eine zunehmende Invasivität in Zusammenhang mit erhöhter PKC alphaExpression wird auch in einem Review von Lahn et al (2004) deutlich gemacht.
Berichtet wird, dass in einer Zusammenstellung mehrerer in vitro Studien die
PKC alpha- Expression in verschiedenen Zelllinien, unter anderem MCF-7
Zellen, mit einer Zunahme der Malignität und Tumorzellproliferation assoziiert
ist (74).
Im Gegensatz dazu stehen Arbeiten in denen eine Abnahme der PKC alphaExpression mit zunehmender Invasivität beschrieben wird (1, 69). In neuerer
Zeit wurde auch in Untersuchungen an humanem Brustdrüsengewebe eine
signifikant höhere Expression von PKC alpha, beta I und beta II in
Mammakarzinomen im Vergleich zu unverändertem Gewebe nachgewiesen (5).
Bezüglich des Einflusses von PKC beta in Entwicklung und Verlauf invasiver
Mammakarzinome sind bislang, wie Sledge et al (2006) in einer
Übersichtsarbeit zusammenfassen, wenige und überwiegend aus in vitro
Untersuchungen an Brustkrebszelllinien stammende Erkenntnisse über
Verteilung und Einfluss der PKC beta Isoformen beschrieben (122).
Bezüglich der insgesamt geringen PKC- Expression in der vorliegenden Arbeit
ist als mögliche Ursache der Einfluss des Hormonrezeptorstatus zu diskutieren.
In einer Arbeit von Assender et al (2007) wird in Zellkulturen eine geringe PKC
alpha- Expression bei positivem Östrogenrezeptorstatus und umgekehrt
beschrieben (8), so dass die Tatsache, dass im überwiegenden Teil der
untersuchten Mammakarzinome ein positiver Östrogenrezeptorstatus vorlag,
durchaus in Zusammenhang mit der nur geringen PKC alpha- und eventuell
auch beta II-Expression stehen könnte.
In der Analyse der Einzelfälle mit positivem Endothelin- A oder B Rezeptor
Nachweis oder dem Nachweis einer PKC alpha- oder beta II-Expression zeigt
sich in den zuvor beschriebenen Tabellen 6 bis 9, dass es zwar -wie auch
mehrfach beschrieben- bestimmte Untergruppen mit dem jeweiligen Rezeptor
oder PKC Nachweis gibt, diese jedoch bezüglich der Expression anderer
Rezeptoren oder PKC Formen sehr heterogen sind. So kann aus dem
-60-
Nachweis einer Endothelin-A- oder -B Rezeptor-Expression kein Rückschluss
auf den jeweils anderen Endothelinrezeptor oder eine begleitende PKC alphaoder beta II-Expression gezogen werden, was wiederum für die klinische
Anwendung wichtig ist, da damit vor Einsatz eines entsprechenden Rezeptor
Blockers auch der zu blockierende Rezeptor immunhistologisch nachgewiesen
werden sollte um überhaupt die Möglichkeit einer positiven Wirkung haben zu
können.
Insgesamt ist festzustellen, dass sowohl das Endothelinsystem als auch
verschiedene Formen der Proteinkinase C Einfluss auf Entwicklung und Erhalt
invasiver Mammakarzinome zu haben scheinen und somit einen wichtigen
therapeutischen Ansatzpunkt in der Krebstherapie darstellen.
Während bei anderen Erkrankungen Endothelinrezeptorantagonisten wie
beispielsweise der kombinierte Endothelin-A - und Endothelin-B RezeptorAntagonist Bosentan in der Therapie der pulmonalen Hypertonie (14), bereits
zur allgemeinen Therapie zugelassen sind, befinden sich auf den meisten
anderen Gebieten, wie auch in der Therapie des Mammakarzinoms, die
Endothelinrezeptorantagonisten im Stadium der präklinischen und klinischen
Erforschung. Wie bereits in einer zusammenfassenden Arbeit von Lalich et al
(2007) geschlussfolgert wird, sind zunächst weitere klinische Studien notwendig
um signifikante Verbesserungen bezüglich Überlebenszeit und Progression der
Erkrankung zu zeigen (75).
Ansetzend an der zuvor beschriebenen, in invasiven Mammakarzinomen
erhöhten, Endothelin-A Rezeptor- Expression sind derzeit vor allem die nichtpeptidischen Endothelin-A Rezeptorantagonisten Atrasentan und ZD4054
Gegenstand der Forschung (124). Sowohl in vitro, als auch im Tiermodell in
vivo, konnte für Atrasentan eine Verminderung von Knochenmetastasen
invasiver Mammakarzinome gezeigt werden (50, 141). Für den selektiven
Endothelin-A Rezeptorantagonisten ZD4054 konnte zunächst in vitro an
Ovarialkarzinomzelllinien und im Tierversuch eine Hemmung des
Tumorwachstums gezeigt werden (114).
-61-
Auch im Tierversuch zeigt sich beim Ovarialkarzinom ein Rückgang der
Tumorgröße sowie eine Hemmung der Tumorangiogenese durch den Einsatz
von ZD4054 (49) und in einer PhaseII Studie bei metastasiertem
Prostatakarzinom scheint ZD4054 eine positive Auswirkung auf die
Überlebenszeit zu haben (63)
Aber auch ansetzend an Endothelin-B Rezeptoren sind therapeutische
Interventionen untersucht worden. Im Tierversuch wurde zunächst eine
Endothelin-B Rezeptor vermittelte Zunahme des Blutflusses in
Brustdrüsentumoren gezeigt (109), Weitergehende Untersuchungen konnten
dann ebenfalls im Tierversuch zeigen, dass es unter Einsatz des Endothelin-A
Rezeptor Agonisten IRL 1620 bei gleichzeitiger Chemotherapie mit Paclitaxel
zu einer erhöhten Konzentration des Chemotherapeutikums im Tumorgewebe
kommt (111, 110), ohne zu einer Veränderung der Pharmakokinetik zu führen
(110).
Bosentan, ein kombinierter Endothelin-A und Endothelin-B Rezeptor
Antagonist, der bislang erfolgreich bei idiopathischer pulmonaler Hypertonie
(20) eingesetzt wird und zunehmend auch vielversprechende Effekte bei
pulmonaler Hypertonie im Kindesalter (13) sowie bei pulmonaler Hypertonie
aufgrund anderer Grunderkrankungen (42) zeigt, wird im Rahmen von Studien
jetzt auch in der Tumortherapie eingesetzt. Im Mausmodell konnten auch eine
Hemmung der Gefäßneubildung im Tumorgewebe von Brustdrüsentumoren
sowie eine verminderte Knochenmetastasierung gezeigt werden(31).
Neben den therapeutischen Ansatzpunkten wurden in verschiedenen Studien
auch prognostische Eigenschaften einer Endothelin- oder EndothelinrezeptorExpression in Tumorzellen untersucht. Wülfing et al zeigten in einer
Untersuchung von 176 invasiven Mammakarzinomen eine signifikant
verminderte erkrankungsfreie 5-Jahres-Überlebenszeit bei Expression des
Endothelin-A Rezeptors im Tumorgewebe sowie auf nicht signifikantem Niveau
auch bei Endothelin-B Rezeptorexpression (135). Außerdem wird eine positive
Korrelation der Expression des Endothelin-A Rezeptors mit erhöhter Resistenz
gegenüber den eingesetzten Chemotherapeutika beschrieben (138).
-62-
Im Hinblick auf die Expression der verschiedenen PKC-Formen, insbesondere
der klassischen Formen PKC alpha und beta II, die in der vorliegenden
Untersuchung zwar insgesamt wenig aber dabei verstärkt in invasiven
Mammakarzinomen nachgewiesen werden können und somit einen möglichen
Ansatzpunkt therapeutischer Maßnahmen darstellen könnten, wird auch von
anderen Arbeitsgruppen ein vielversprechender therapeutischer Ansatz im
PKC-System vermutet (4).
Zur weiteren Untersuchung möglicher Effekte auf die Tumorentwicklung durch
Blockade oder Anregung verschiedener PKC Formen, sind viele Studien
zunächst überwiegend in vitro oder als Tierversuch durchgeführt worden bevor
auch erste Phase I -III Studien begonnen wurden. Dabei zeigte sich, dass
oftmals an Krebszelllinien oder im Tierversuch positive Ergebnisse erreicht
wurden, die aber in weiterführenden Studien nicht bestätigt werden konnten.
Eine PKC alpha Blockade versprach im Tierversuch positive Effekte (143), die
in der nachfolgenden Phase II Studie bei Patienten mit malignem Melanom
nicht bestätigt werden konnten (85). Auch im Einsatz des PKC-beta Blockers
Enzastaurin(LY317615.HCI) konnten in in vitro Studien an Tumorzelllinien,
Tumorgewebe und im Tierversuch positive Effekte in Form einer Hemmung der
Angiogenese im Tumorgewebe (130, 52) sowie eine Sensibilisierung von
Brustkrebszellen gegenüber ionisierender Strahlung (32) nachgewiesen werden
und auch in klinischen Phase I Studien ergaben sich Hinweise auf positive
Effekte durch den Einsatz von Enzastaurin (108).
Bryostatin 1 eine Verbindung, die ebenfalls Auswirkungen auf die PKC Expression und - Wirkung hat, zeigte in Kombination mit Gemcitabine an
Brutkrebszellen (MCF-7 und MDA-MB-231) eine Erhöhung der GemcitabineWirkung (6). In einer klinischen Phase II Studie an Patienten mit metastasiertem
Melanom konnte aber ebenfalls kein positiver Effekt der Therapie mit Bryostatin
nachgewiesen werden (132)
Ein weiterer Ansatzpunkt mit Einfluss auf das PKC System ist der Einsatz von
Antisense Nukleotiden wie ISIS 3521, mit Wirkung auf PKC alpha, der in Phase
I Studien bei Patienten mit fortgeschrittenen Karzinomen eine positive Wirkung
bei akzeptabler Verträglichkeit vermuten ließ (92).
-63-
In nachfolgenden Phase II Studien werden unterschiedliche Ergebnisse
beschrieben, während der Einsatz bei Non-Hodgkin-Lymphomen eine
hemmende Wirkung auf die Tumorzellen zeigt (113), kann diese bei
kolorektalen Karzinomen nicht nachgewiesen werden (25, 82).
Neben dem alleinigen Einsatz von Substanzen, die PKC Formen blocken oder
einer Kombination dieser mit verschiedenen Chemotherapeutika, spielt der
Zusammenhang von PKC Isoformen und Hormonrezeptoren eine bedeutende
Rolle in der Erforschung neuer Therapieansätze. In verschiedenen Studien
konnte gezeigt werden, dass eine Überexpression bestimmter PKC Isoformen
mit schlechterem Ansprechen auf eine Hormontherapie assoziiert ist. In der
Untersuchung von Gewebeproben mehrerer Mammakarzinome zeigte sich
neben einer Assoziation des PKC Status mit dem Östrogenrezeptorstatus,
wobei eine hohe PKC alpha- Expression mit einer geringen ÖstrogenrezeptorExpression einhergeht, dass eine hohe PKC alpha- Expression mit einem
Tumorprogress unter Hormontherapie assoziiert ist (8). Auch der Vergleich von
Mammakarzinomgewebe von Patienten mit Progress nach Tamoxifen-Therapie
und Patienten, die kein Rezidiv nach Tamoxifen-Therapie entwickelten, zeigt
einen höheren Anteil an PKC alpha- Expression in der ersten Gruppe, so dass
möglicherweise eine hohe PKC alpha-Expression ein Marker für ein schlechtes
Ansprechen auf eine Tamoxifen- Therapie ist (131). Dieser Zusammenhang
wird auch in vitro an Brustkrebszelllinien beschrieben (39).
Angesichts der in der vorliegenden Arbeit erhobenen Ergebnisse bezüglich der
Endothelin- A - und –B Rezeptor- sowie der PKC alpha- und beta II-Expression
in verschiedenen Gewebetypen, und den, durch andere Arbeitsgruppen
beschriebenen Ergebnissen, scheinen Endothelin- und PKC System in der
Tumorentstehung und –entwicklung eine Bedeutung zu haben.
Im Hinblick auf einen zukünftigen therapeutischen und prognostischen Wert des
Endothelin- und PKC Systems könnte der Endothelinrezeptorstatus als
Merkmal einzelner Subgruppen gelten und damit ein Kriterium für bestimmte
therapeutische Möglichkeiten darstellen oder als prognostischer Faktor für den
Krankheitsverlauf gelten. Um dahingehend nähere Aussagen machen zu
können, wären weitergehende Untersuchungen nicht nur zum
-64-
Endothelinrezeptorstatus und dessen Auswirkung in votro und in vivo, sondern
auch die Forschung bezüglich anderer PKC Formen, die eventuell in stärkerem
Maße in Mammakarzinomen exprimiert werden, sinnvoll.
Zusätzlich wäre auch die genauere Untersuchung der Signalkaskaden zur
Übertragung der Endothelin- und PKC- Wirkung an Zelllinien von Nutzen, da
der genaue Mechanismus der Signalkaskaden noch weitgehend unbekannt ist.
-65-
6. Zusammenfassung
Endothelinen, die ursprünglich aufgrund ihrer gefäßverengenden Wirkung
entdeckt und dahingehend weiter untersucht wurden, wird in den letzten
Jahren auf Grund ihrer Aktivierung der Zellproliferation und Angiogenese eine
zunehmende Bedeutung auch im Bereich der Tumorentwicklung zugesprochen.
Einen weiteren Ansatzpunkt in der Tumorforschung stellen die zahlreichen
Proteinkinase C (PKC) Formen, die in klassische, neue und atypische PKC
Formen unterteilt werden können und durch Phosphorylierung anderer Proteine
deren Einfluss verändern können, dar.
Ziel dieser Arbeit war es die Expression des Endothelin-A und Endothelin-B
Rezeptors, sowie die PKC alpha- und beta II-Expression in invasiv duktalen
Mammakarzinomen auch im Vergleich zu normalem Brustdrüsengewebe und
ductalen Carcinoma in situ darzustellen und Ansatzpunkte für weitergehende
Untersuchungen mit dem Ziel therapeutischer Interventionen zu gewinnen.
Durch Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) sowie an einer geringeren Fallzahl
auch mittels Immunhistologie wurde die Expression des Endothelin-A- und –B
Rezeptors sowie die PKC alpha- und PKC beta II-Expression an formalin- und
paraffinfixiertem Gewebe aus invasiv duktalen Mammakarzinomen, ductalen
Carcinoma in situ und normalem Mammagewebe untersucht.
Dabei zeigte sich ein Rückgang der Endothelin-A Rezeptor- Expression im
invasiven Karzinom im Vergleich zu Normalgewebe und DCIS sowie bezüglich
der Häufigkeit auch ein leichter Rückgang der Endothelin-B RezeptorExpression bei jedoch deutlicher Zunahme der Intensität der Expression des
Endothelin-B Rezeptors im invasiven Mammakarzinom. Bezüglich der PKC
alpha- Expression zeigte sich eine deutliche Zunahme im invasiven Karzinom
im Vergleich zu Normalgewebe in dem keine PKC alpha- Expression
nachgewiesen werden konnte. PKC beta II wurde bei geringer Expression im
Normalgewebe in invasiven Karzinomen häufiger exprimiert.
-66-
Im Vergleich der Ergebnisse der PCR und der Immunhistologie zeigten sich
deutliche Unterschiede in der Expression von Endothelin-A- und –B Rezeptor
sowie PKC alpha und beta II. Diese beruhen einerseits auf Unterschieden
zwischen transkribierter RNA und translatierter Proteinmenge. Andererseits
könnten „verunreinigende“ und nicht zu trennende Anteile von normalem oder
DCIS Gewebe im untersuchten Material eines invasiven Karzinoms sowie die
Abhängigkeit der Qualität der Analyse von Gewebeerhalt und -Fixierung
ursächlich zu Differenzen beitragen. Im Vergleich zwischen PCR und
Immunhistologie stellt damit die Immunhistologie das aussagekräftigere
Verfahren dar.
Aus den Ergebnissen der Immunhistologie kann geschlossen werden, dass
sowohl den Endothelinrezeptoren als auch verschiedenen PKC Formen,
insbesondere Endothelin-B Rezeptor und PKC alpha, eine Rolle in
Tumorgenese und -entwicklung haben. Damit wären weitere Untersuchungen
im Hinblick auf den Endothelinrezeptorstatus oder die Expression
verschiedener PKC Formen als prognostischer Faktor für den
Krankheitsverlauf, sowie eine weitere Forschung zur genaueren Kenntnis der
Signalkaskaden, sinnvoll, um damit mögliche Ansatzpunkte für therapeutische
Interventionen zu erhalten.
-67-
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Kunitomo M 2003. Effect of PKC412, a selective inhibitor of protein
kinase C, on lung metastasis in mice injected with B16 melanoma cells.
Life Sci 72(12): 1377-87
-83-
8. Anhang
RNA-Extraktion
Entparaffinierung
Insgesamt 3x
-
5 min bei 65°C erwärmt
-
500µl Xylol zugeben
-
5 min bei 65°C im Thermomixer erwärmt
-
2 min bei 13000U/min zentrifugiert und Xylolüberstand
abpippetiert
3x waschen mit Ethanol
Trocknung 60 min bei 37°C
RNA-Extraktion
Zugabe 200µl Proteinase K-Mix
Inkubation über Nacht bei 65°C
Stop Gewebeverdau für 10 min bei 95°C
Zugabe 200µl Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol
20µl Natriumacetat
20 min bei 13000U/min zentrifugiert und
Überstand abpippetiert und Zugabe zu 200µl eiskaltem Isopropanol und 2µl tRNA
Fällung mindestens 2h bei -20°C dann 20 min bei 13000U/min zentrifugiert
3x mit 500µl eiskaltem 70%igem Ethanol gewaschen
30min Trocknung bei 37°C
Zugabe 25µl DNAse-Mix , Inkubation im Thermomixer 30 min bei 37°C, kurzes
Zentrifugieren, Stop bei 95°C für 3 min im Thermomixer, Abkühlung auf
Raumtemperatur
Zugabe 1µl RNAse-Inhibitor
Aufbewahrung bei -70°C
-84-
Umschreiben mRNA in cDNA
Reakionsansatz:
1µl 10mM dNTP Mix
1µg mRNA
1µl Random Primers
DEPC Wasser auffüllen auf 13 µl
5 min bei 65°C, anschließend 1,5 min auf Eis
Zufügen von:
4µl 5x Puffer
1µl 0,1 M DTT
0,5µl Superscript III
Inkubieren für:
5 min bei 25°C
60 min bei 50°C
15 min bei 70°C
3 min auf Eis
Aufbewahrung bei -20°C
-85-
PCR (ETAR, ETBR, PKCα, PKCβ II)
- Pro Reaktionsgefäß:
9 µl H2O
12,5 µl RedTaq
0,5µl 5`Forward Primer
0,5µl 3`Reverse Primer
1µl cDNA
- Zentrifugieren
- inkubieren für 5 min bei 95°C
- PCR: 35 Zyklen
1min bei 94°C
1min bei 50°C (PKCβ II bei 55°C)
1 min bei 72°C
- 5 min bei 72°C
- 10 min bei 4°C
- Ende bei 15°C
-86-
Immunhistologie
-
Schnitte entparaffinieren
Xylol 10min
Xylol 10min
Xylol 10min
100% EtOH 5 min
96% EtOH 5 min
70% EtOH 5 min
50% EtOH 5 min
H2O
Aqua dest
-
Entparaffinierte Schnitte im Dampfgarer 25 min in zuvor 7 min erhitztem
Citratpuffer (pH 6) (ETBR, PKCβII) oder
EDTA-Puffer (pH 9)(ETAR, PKCα) kochen
-
Im Wasserbad 10 min abkühlen
-
Blockierung der endogenen Peroxidase in 0,3%igem H2O2-TBS für 20min
mit H2O abstoppen
-
1x waschen mit TBS-Puffer pH 7,4
-
Primärantikörper mit AK-Verdünnungspuffer verdünnen (ETAR 1:75, ETBR
1:50, PKCα 1:75, PKCβ II 1:100) und Schnitte damit über Nacht bei 4°C
inkubieren
-
3x waschen mit TBS-Puffer
-
Sekundärantikörper : EnVision-HRP
goat anti-mouse bei PKCα
goat anti-rabbit bei ETAR, ETBR,
PKCβ II
30min bei Raumtemperatur inkubieren
-
3x waschen mit TBS Puffer
-
Färbung mit Chromogen 30 min
-
Waschen mit H2O
-
Gegenfärbung mit Hämalaun 30 sec.
-
Bläuen in Leitungswasser
-
Eindecken mit Aquatex
-87-
-88-
Gewebe
Jahr
OP
GebJahr
Block
PCR
Nr.
PCR
PCR ßActin
PCR
ETAR
PCR
ETBR
PKC
alpha
PKC
beta II
Östrogenrezeptor
Her2neu
Größe (größte
Ausdehnung)
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
n
DCIS
DCIS
DCIS
DCIS
DCIS
DCIS
DCIS
DCIS
DCIS
DCIS
DCIS
DCIS
DCIS
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
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1948
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Ig
b
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Z 35
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c
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Ij
d
Il
100
8
3
4
6
9
7
2
5
98
1
60
48
50
51
99
56
58
49
53
54
59
52
55
91
88
68
70
73
80
3
3
3
3
3
3
3
3
3
2
3
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2
2
2
1
2
2
1
2
2
2
2
2
3
1
1
1
1
1
3
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0
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0
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0
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3
2
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1
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2
2
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2
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0
0
0
3
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3
3
3
0
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0
0
0
0
0
0
3
3
2
2
2
2
2
1
1
1
1
1
0
0
0
0
0
2
1
1
1
1
1
1
1
0
0
0
0
0
2
2
2
2
2
2
80%
IRS 6
IRS 12
k.A.
IRS 12
k.A.
k.A.
neg.
IRS 12
IRS 6
50%
80-90%
neg.
IRS 9
IRS 8
IRS 12
IRS 12
IRS 12
IRS 12
1+
3+
0
k.A.
0
k.A.
k.A.
1+
0
0
<10%
<10%
pos.
1+
0
1+
1+
0
0
2,0 cm
1,5 cm
0,5 cm
1,6 cm
1,5 cm
3,0 cm
5,5cm
1,5 cm
1,8 cm
1,5 cm
0,6 cm
1,5 cm
1,7cm
1,1 cm
1,9 cm
1,3 cm
2,5 cm
2,2 cm
2,7 cm
Gewebe
-89-
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
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Block
PCR
d
Ie
Ii
Im
III d
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Ie
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Ie
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Ik
a
Ie
Ia
d
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d
II f
II g
III c
i
Id
Ie
Id
Ih
m
b
Ie
Id
Nr.
PCR
21
57
62
90
92
95
19
20
34
65
69
14
16
40
41
43
44
71
75
61
64
67
76
89
72
79
97
45
87
39
63
PCR ßActin
1
2
2
2
1
1
1
1
1
1
1
3
1
3
2
3
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2
3
2
2
2
2
2
1
3
2
2
1
3
2
PCR
ETAR
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
3
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2
2
2
2
2
1
0
3
2
2
1
1
PCR
ETBR
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
3
3
3
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2
2
2
2
1
1
1
1
1
PKC
alpha
3
3
3
3
3
3
2
2
2
2
2
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
PKC
beta II
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
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1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
Östrogenrezeptor
IRS 6
90%
neg.
neg.
IRS 12
IRS 12
>90%
fast 100%
IRS 12
60%
neg.
<3%
>90%
IRS 12
IRS 12
neg.
80-90%
80%
neg.
IRS 12
80%
IRS 12
IRS12
neg.
IRS 12
neg.
k.A.
90%
>95%
90%
IRS 12
Her2neu
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0
0
0
1
1
0
1+
0
0
0
4+
3+
0
2+
0
1+
0
0
0
1+
0
1+
1+
1+
0
k.A.
3+
0
0
2+
Größe (größte
Ausdehnung)
2,5 cm
2,5 cm
1,1 cm
2,7 cm
2,3 cm
1,4 cm
0,9 cm
2,5 cm
1,1 cm
2,1 cm
0,9 cm
5,5 cm
1,6 cm
1,5 cm
2,6 cm
6,0 cm
1,5 cm
1,7 cm
2,2 cm
2,5 cm
1,3 cm
1,2 cm
2,2 cm
1,6 cm
1,7 cm
1,2 cm
2,3 cm
1,5 cm
1,3 cm
3,0 cm
2,2 cm
Gewebe
-90-
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
Jahr
OP
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1965
1947
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Block
PCR
a
II j
Vc
Ih
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c
a
b
Ih
Ib
Ie
g
b
IIId
Id
f
c
a
b
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d
c
If
Ie
d
I g1
Ib
If
b
Ia
Nr.
PCR
66
93
94
37
42
46
18
22
23
24
25
96
27
32
35
36
38
10
11
12
13
15
26
28
29
30
33
78
85
74
81
PCR ßActin
3
1
2
2
3
2
1
1
1
1
1
1
2
1
1
1
2
3
3
3
3
3
1
1
1
1
1
3
1
3
2
PCR
ETAR
1
1
1
0
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
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0
0
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0
0
0
0
0
3
1
1
1
PCR
ETBR
1
1
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
3
2
1
1
PKC
alpha
0
0
0
0
0
0
0
3
3
3
3
3
2
2
2
2
2
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
0
0
0
0
PKC
beta II
1
1
1
1
1
1
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
Östrogenrezeptor
>90%
IRS 9
>90%
50%
pos.
50%
50%
IRS 12
>90%
100%
70%
IRS 12
80%
100%
>90%
neg.
IRS 9
k.A.
>90%
>95%
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>90%
60-80%
85%
<5%
90%
80%
IRS 12
80%
>90%
IRS 12
Her2neu
0
1+
1
0
0
0
1+
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0
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2
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2+
2+
1+
0
k.A.
0
20%
0
0
0
0
3+
0
2+
2+
0
0
2+
Größe (größte
Ausdehnung)
2,3 cm
1,2 cm
1,4 cm
1,6 cm
2,0 cm
1,4 cm
1,8 cm
2,2 cm
1,9 cm
2,2 cm
1,2 cm
1,5 cm
2,7 cm
0,9 cm
0,8 cm
3,0 cm
2,4 cm
2,2 cm
2,5 cm
2,3 cm
1,1 cm
1,4 cm
1,4 cm
1,6 cm
4,5 cm
0,9 cm
1,2 cm
1,7 cm
2,1 cm
1,5 cm
1,5 cm
Gewebe
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
inv.
Jahr
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1927
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Block
PCR
II i
c
Ig
Id
c
Il
Ij
II g
Nr.
PCR
82
84
86
31
47
77
83
17
PCR ßActin
2
2
1
1
2
2
1
2
PCR
ETAR
1
1
1
0
1
1
1
0
PCR
ETBR
1
1
1
1
0
0
0
0
PKC
alpha
0
0
0
0
0
0
0
0
PKC
beta II
0
0
0
0
0
0
0
0
Östrogenrezeptor
90%
50%
IRS 12
80%
>90%
IRS 12
IRS 12
neg.
Her2neu
1+
2+
0
0
2+
1+
0
3+
Größe (größte
Ausdehnung)
1,7 cm
1,2 cm
1,5 cm
8,0 cm
1,9 cm
1,5 cm
1,3 cm
2,2 cm
-91-
-92-
Nr.
PCR
1
PCR ß- PCR PCR PKC
Actin
ETAR ETBR alpha
3
0
0
0
PKC
beta II
0
ETA-Rez.
Normal+++
2
3
3
3
0
0
0
0
0
0
0
1
Normal++
Normal+++
4
5
6
8
3
3
3
3
0
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
1
0
1
1
98
2
0
0
0
0
Normal+
Normal+++
Normal++
apokrin+++
Normal0
Normal++
9
3
0
0
0
1
Normal+
56
2
3
2
0
1
58
2
2
2
0
59
2
1
0
99
1
0
31
1
37
40
ETB-Rez.
apokrin+++
Normal+
Normal0
Normal0
DCIS0
Normal0
Normal++
Normal0
apokrin+++
Normal++
Normal0
ÖstrogenHer2neu
rezeptor
PKCalpha
apokrin++
Normal0
Normal0
Normal0
PKC beta II
Normal0
Tumor0
Normal+
apokrin++
Normal+
DCIS++
Normal0
Normal0
Normal0
Normal0
apokrin++
Normal0
apokrin+++
Normal0
apokrin+++
Norml0
Tumor0
Normal0
1
DCIS0
DCIS++
DCIS0
0
0
Normal+
apokrin+++
apokrin+++
Normal0
0
3
1
Normal++
apokrin+++
DCIS0
Tumor0
Normal+++
Tumor0
Normal0
Normal0
Normal0
apokrin
herdförm.++
apokrin+
Normal0
umschrieben
zytoplasmat.+++
prolif.
Mastopathie ++
DCIS ++
Normal wenig
granulär
apokrin granulär+ 50%
Normal0
DCIS0
Tumor0
Normal0
Tumor0
Normal0
0
1
0
0
Tumor0
Normal0
Tumor0
DCIS+ - ++
Normal++
Tumor+++
Normal0
Tumor0
2
0
1
0
1
3
3
0
1
Tumor0
Normal0
Tumor0
Normal0
Tumor0
3
Tumor0
Normal+++
Tumor0
Tumor0
Normal0
Größe
Normal0
Normal0
3 cm
5,5 cm
<10%
0,6 cm
IRS 12
0
1,5 cm
Tumor
grobgran.+
Entz.++
Tumor0
80%
0
8 cm
50%
0
1,6 cm
Tumor0
Normal0
Entz.+++
IRS 12
0
1,5 cm
-93-
Nr.
PCR
41
PCR ß- PCR PCR
Actin
ETAR ETBR
2
3
3
PKC PKC
alpha beta II
0
1
42
3
1
0
0
1
43
3
3
3
0
1
46
2
1
0
0
1
64
2
2
3
0
1
66
3
1
1
0
1
67
2
2
2
0
1
71
2
3
3
0
72
1
1
2
74
3
1
75
3
76
ETA-Rez.
Tumor0
ETB-Rez.
Normal++
DCIS++
Normal++
Tumor
herdförmig+-++
Tumor0
DCIS++
Tumor++-+++
Normal+++
Tumor0
Normal0
Normal+
Tumor0
Normal
vereinzelt+
Tumor0
Normal+++
Tumor0
Tumor0
Tumor+
Normal+ - ++
Tumor0
PKCalpha
PKC beta II
TumorTumor
membran ++ herdförmig
nukleär +
Tumor0
Tumor0
Normal0
Entz.+
Tumor0
Tumor0
Tumor +
Normal0
Tumor
herdförm.
Gran. +
Tumor0
Normal0
Tumor0
Normal0
1
Tumor +
Normal0
Tumor0
Normal++
Tumor 0
Tumor 0
Normal0
0
1
Tumor0
1
0
0
Tumor+
DCIS0
3
3
0
1
Tumor0
Normal0
DCIS++
Tumor0
Tumor++ - +++
Tumor0
Tumor
herdförm.
Gran. +
Tumor+ -++
Tumor0
Normal0
2
2
2
0
1
81
2
1
1
0
0
Normal+
Tumor0
Tumor0
86
0-1
1
1
0
0
Tumor0
Normal++
Tumor+ - ++
Normal++
Tumor0
Tumor0
Normal0
Tumor0
Normal0
Normal0
Tumor0
Normal0
Östrogenrezeptor
IRS 12
Her2neu
2+
Größe
2,6 cm
pos.
0
2 cm
Tumor0
Entz.+++
Tumor0
0
0
6 cm
50%
0
1,4 cm
Tumor0
Normal0
Tumor0
Entz.+
80%
1+
1,3 cm
>90%
0
2,3 cm
Tumor0
IRS 12
0
1,2 cm
Tumor0
Normal0
Entz.++
Tumor0
DCIS0
Tumor0
80%
0
1,7 cm
IRS 12
1+
1,7 cm
>90%
0
1,5 cm
Tumor0
Normal0
Entz.+++
Tumor0
0
0
2,2 cm
IRS12
1+
2,2 cm
Normal0
IRS 12
2+
1,5 cm
Tumor0
Entz.+
IRS 12
0
1,5 cm
Nr.
PCR
87
PCR ß- PCR
PCR
Actin
ETAR ETBR
1
2
1
PKC PKC
alpha beta II
0
1
88
1
1
1
3
2
89
2
2
2
0
1
93
1
1
1
0
1
ETA-Rez.
apokrin++
DCIS einzeln+
Tumor0
ETB-Rez.
DCIS+++
Tumor+++
PKCalpha
apokrin+++
DCIS einz.+
Tumor0
Normal+++
Tumor0
Normal++
Tumor0
einzelne
Zellen+
Normal+++
Tumor
herdförmig++
DCIS+
Tumor0
Tumor0
Normal0
Tumor0
DCIS0
Tumor0
Normal0
Normal++
DCIS++
apokrin++
Tumor0
PKC beta II
DCIS+
Tumorkerne+
Entz.+
Normal0
Tumorkerne ++
Normal0
Tumor0
Normal0
Entz.+++
Tumor0
Östrogen- Her2ne
rezeptor
u
>95%
0
Größe
1,3 cm
IRS 8
0
1,9 cm
0
1+
1,6 cm
IRS 9
1+
1,2 cm
-94-
9. Lebenslauf
Mein Lebenslauf wird aus Gründen des Datenschutzes in
der elektronischen Fassung meiner Arbeit nicht veröffentlicht.
-95-