Identifizierung und elektrophysiologische Charakterisierung von

Identifizierung und elektrophysiologische
Charakterisierung von Mutationen
im cardialen
Ca2+-Freisetzungskanal/Ryanodin-Rezeptor
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der
Naturwissenschaften an der Fakultät für Chemie der
Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Nina Lukas
Lehrstuhl für Physiologische Chemie I
Ruhr-Universität Bochum
Bochum 2003
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
7
2 Material
21
3 Methoden
3.1 Molekularbiologische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.1.1 Isolierung genomischer DNA aus menschlichem Vollblut . . . . . .
3.1.2 photometrische Konzentrationsbestimmung von DNA . . . . . . .
3.1.3 Präparation von DNA aus Bakterienkulturen . . . . . . . . . . . .
3.1.4 Isolierung von DNA aus Bakterienkulturen im mg-Bereich . . . .
3.1.5 Transformation von Plasmiden in Bakterien . . . . . . . . . . . .
3.1.6 Restriktion von Nukleinsäuren . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.1.7 Ligation von DNA-Fragmenten . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.1.8 Elution von DNA aus Agarosegelen . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.1.9 Polymerase Kettenreaktion (PCR) . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.1.10 Gerichtete Mutagenese . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.1.11 Verdau mit DPNI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.1.12 Sequenzierung von DNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2 Proteinisolierung aus Geweben . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.1 Isolierung des schweren sarkoplasmatischen Retikulums (HSR) aus
Herzgewebe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.2 Anreicherung des cardialen Ca2+ -Freisetzungskanals aus dem schweren SR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2.3 3 H-Ryanodin Bindungstest . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3 Analytisch Chemische Methoden . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3.1 horizontale Agarosegelelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3.2 SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese . . . . . . . . . . . . . . . .
3.4 Zellkultur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.4.1 Kultivierung der Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.4.2 Bestimmung der Zellzahl . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.4.3 Auftauen und Einfrieren von Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.4.4 Umsetzen von Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
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36
37
37
3
Inhaltsverzeichnis
3.5
3.6
3.7
3.4.5 Transfektion von Zellen nach der Calciumphosphat-Methode . . .
3.4.6 Aufarbeitung des cardialen Ryanodin-Rezeptors aus HEK293 Zellen
Einzelstrang Konformations Polymorphismus Analyse (SSCP) . . . . . .
3.5.1 Gelelektrophorese nativer Acrylamidgele . . . . . . . . . . . . . .
3.5.2 Silberfärbung von DNA in nativen Acrylamidgelen . . . . . . . .
Schmelztemperaturanalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.6.1 Schmelzpunktanalyse mittels HybProbes . . . . . . . . . . . . . .
Einzelkanalmessungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.7.1 Messeinrichtung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.7.2 Aufbau und Eigenschaften von Bilayern . . . . . . . . . . . . . . .
3.7.3 Herstellung künstlicher Lipid-Bilayer . . . . . . . . . . . . . . . .
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4 Ergebnisse
49
4.1 Etablierung und Optimierung der Einzelstrang Konformations Polymorphismus Analyse (SSCP) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49
4.2 Ergebnisse der SSCP Analysen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
4.3 Ergebnisse Schmelztemperaturanalyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57
4.4 Ergebnisse Sequenzierungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60
4.5 Klonierung und Expression von Ryanodin-Rezeptoren . . . . . . . . . . . 62
4.6 Ryanodin-Rezeptor Isolierung aus menschlichem Herzgewebe . . . . . . . 65
4.7 Ergebnisse der Einzelkanalmessungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
4.7.1 Einzelkanalmessungen mit dem rekombinanten Wildtyp-Kanal . . 67
4.7.2 Einzelkanalmessungen mit dem rekombinanten Rezeptors, Mutante E4950K . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
4.7.3 Einzelkanalmessungen mit dem nativen Wildtyp-Kanals . . . . . . 73
4.7.4 Einzelkanalmessungen des nativen Ca2+ -Freisetzungskanals mit den
Mutationen G1885E und G1886S . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76
5 Diskussion
81
6 Zusammenfassung
91
7 Ausblick
93
8 Anhang
95
8.1 Primersequenzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
8.2 Sequenzen der bei der SSCP berücksichtigten DNA des Ryanodin-Rezeptors102
Abbildungsverzeichnis
125
Tabellenverzeichnis
127
Literaturverzeichnis
129
4
Inhaltsverzeichnis
Danksagung
139
Lebenslauf
141
5
Inhaltsverzeichnis
6
1 Einleitung
Intrazelluläre Calciumionen regulieren verschiedene zelluläre Prozesse wie Muskelkontraktion, Hormonsekretion und apoptotische Vorgänge.
Calcium ist aufgrund seiner Verteilung im intra- und extrazellulärem Raum gut als Botenstoff geeignet. Im ruhenden Muskel liegt die intrazelluläre [Ca2+ ] signifikant niedriger
als im extrazellulärem Raum (3.6mM zu 0.1M) [1]. Durch kurzzeitige Öffnung von
Kanälen können grosse Mengen Ca2+ in kürzester Zeit ins Cytosol eindringen und die
Signalübertragungskette induzieren.
Die Kontraktion des Herzmuskels wird durch die Konzentration von Ca2+ reguliert. Im
Ruhezustand ist die [Ca2+ ] so niedrig, 10−7 M, dass Myosin und Aktin nicht miteinander
interagieren können.
Wird dann eine Kontraktion durch elektrische Erregung in Schrittmacherzellen ausgelöst
(elektrochemischer Gradient), wird die Membran durchlässig für Na+ und es kommt
zur Depolarisierung der Zelle und ihrer Einstülpungen, den transversalen Tubuli. In
den Membranen der transversalen Tubuli sitzen die spannungsabhängigen Ca2+ -Kanäle,
die Dihydropyridin-Rezeptoren (DHPR). Durch sie gelangen kleine Mengen Ca2+ in
die Zelle. Dadurch kommt es zu einem lokalen Anstieg der Ca2+ -Konzentration zwischen T-Tubulus und den terminalen Cisternen des sarkoplasmatischen Retikulums. Dieser Anstieg induziert die calciuminduzierte Calciumfreisetzung (CICR). Die RyanodinRezeptoren, Ca2+ -Kanäle hoher Leitfähigkeit, werden Ca2+ -aktiviert, öffnen sich dadurch und lassen grosse Mengen Ca2+ aus dem sarkoplasmatischen Retikulum in das
Cytoplasma der Zelle frei, was die Ca2+ -Konzentration im Cytoplasma auf 1-10 mM
anhebt.
Der Anstieg der cytoplasmatischen Calciumionenkonzentration bewirkt, dass die Calciumbindende Untereinheit des Troponins, das Troponin C, Ca2+ bindet, es kommt zu einer
Konformationsänderung des Troponinkomplexes, wodurch die Wechselwirkung zwischen
Tropomyosin und Aktin beeinflusst wird. Als Folge dessen kann Myosin an Aktin binden
und diese Interaktion löst die Kontraktion des Herzens aus.
Nach der Kontraktion wird das Ca2+ durch die SR-Ca2+ -ATPase (SERCA,ca. 70%),
den Na/Ca Tauscher (NCX, ca. 28%), der Ca-ATPase (≤1%) und den mitochondrialen
Calciumuniporter(≤1%)aus dem Cytosol entfernt, wobei die beiden letztgenannten Systeme nur eine untergeordnete Rolle spielen [2].
Der Calciumtransient weist bei Patienten mit terminaler Herzinsuffizienz eine erhöhte
[Ca2+ ] im Cytoplasma der Zelle im Ruhezustand auf. Der Anstieg der [Ca2+ ] während
7
1 Einleitung
2K
2Na
Sarcolemma
a
b
NCX
f
g
CSQ
JCT
FKBP
Ca
c
ATP
e
Trd
Ca
Ca
ATP
Ca
d
Myofibrillen
T-Tubuli
Ca
Abbildung 1.1: EC-Kopplung im Herzen, Abb. nach Bers [2]. Ca2+ gelangt durch die DHPR
in die Zelle (a) und öffnen damit die RYR (b), die dann grosse Mengen Ca2+ aus dem SR in
das Cytosol der Zelle schleusen, die dann an Troponin binden wodurch es zur Kontraktion des
Muskels kommt (c). Abtransportiert wird das Ca2+ über die SERCA (d), den NCX (e), der
Ca-ATPase (f) und den Ca-Uniporter (g). Am Ryanodin-Rezeptor finden sich die assoziierten
Proteine Junctin (JCT), Triadin (TRD), FKBP und Calsequestrin (CSQ).
der Kontraktion ist deutlich verringert. Nach der Kontraktion ist die Entfernung des
Ca2+ aus der Zelle deutlich verlangsamt, das Ca2+ wird weniger effektiv aus dem Cytosol gepumpt, als bei gesunden Personen.
Obwohl allgemein anerkannt ist, dass der SR-Ca2+ -Gehalt in der Herzinsuffizienz reduziert ist, wird kontrovers über die Ursache dessen diskutiert.
Somit kann der Fehler im Abtransport des Ca2+ aus der Zelle liegen, also einer reduzierten Aktivität der SR-Ca2+ -ATPase oder über einen erhöhten Ca2+ -Einstrom, bedingt
durch ein Leck im Ryanodin-Rezeptor. Für beide Theorien gibt es experimentelle Daten,
die den jeweiligen Ansatz unterstützen [3, 4, 5, 6, 7, 8], [2, 9, 10, 11, 12, 5].
Auch der transsarcolemmale Ca2+ -Fluss beeinflusst den SR Ca2+ -Gehalt. So kann eine
geringere Einfuhr von Ca2+ in das SR oder eine erhöhte Ca2+ -Ausfuhr über den Na/CaAustauscher (NCX) die [Ca2+ ] im SR vermindern. Eine erhöhte Expression und erhöhte
Funktion konnte für den NCX auch nachgewiesen werden [2, 9]. Auch wurde eine ge-
8
ringe Veränderung im ICa gezeigt, wobei die Ergebnisse der einzelnen Arbeitsgruppen
kontrovers waren [2, 9]. Eine erhöhte NCX Aktivität könnte mit der SERCA in Konkurrenz treten, also mehr Ca2+ aus der Zelle abtransportieren und somit eine Entleerung
des SR verursachen. Im neuen Gleichgewicht allerdings würde dann bei jeder Systole
eine entsprechend größere Menge Ca2+ in die Zelle gepumpt, z.B. würde eine geringere Ca2+ -Freisetzung eine geringere Inaktivierung durch den ICa bewirken, so dass ein
neues Gleichgewicht entstehen würde [13]. Der Fokus der Ca2+ -Regulierung im sarkoplasmatischen Retikulum liegt jedoch auf zwei anderen Systemen, der SERCA- und der
Ryanodin-Rezeptor-Funktion.
In der jüngeren Vergangenheit wurde die Rolle des erhöhten SR Ca2+ -Lecks in der terminalen Herzinsuffizienz zunehmend kontrovers diskutiert [3, 4, 5, 6, 7, 8]. Dabei sprechen
Argumente sowohl für die erniedrigte SERCA-Aktivität, als auch für das Leck durch den
Ryanodin-Rezeptor.
Ein Schwerpunkt lag in der Untersuchungen der SERCA und deren Wechselwirkung mit
Phospholamban (PLB). PLB inhibiert die SR Ca2+ -ATPase. Wird PLB phosphoryliert,
so dissoziiert es von der SERCA und diese beginnt das Ca2+ aus der Zelle zu pumpen.
Es ergab sich somit die Hypothese, dass Mutationen in einem der beiden Proteine, oder
Störungen in der Wechselwirkung zwischen der SERCA und PLB zur Ausbildung einer
DCM führen könnten. Aus diesem Grunde wurden PLB defiziente Knock-out Mäuse
generiert. Diese Mäuse zeigten dann auch eine erhöhte [Ca2+ ] im Zellinneren, jedoch
entwickelten die Tiere keine DCM [14].
Im Gegensatz zu den eben beschriebenen Experimenten konnte in mehreren Studien
nachgewiesen werden, dass die Expression und/oder die Funktion der SERCA reduziert
war [2, 9, 10, 11, 12, 5].
Auch das Maß der Phosphorylierung des Phospholambans, welches eine Reduzierung
der SERCA Funktion bedingte, wurde in einer Studie untersucht [2]. Es ist allgemein
akzeptiert, dass in einigen Punkten die SERCA bei der systolischen und diastolischen
Dysfunktion in der Herzinsuffizienz beteiligt ist [2, 9]. Diese Befunde deuteten aber auch
darauf hin, dass dieses System nicht die alleinige Ursache sein konnte.
Ein weiteres System, welches den SR Ca2+ -Gehalt effektiv beeinflussen kann, ist der
SR Ca2+ -Freisetzungskanal/Ryanodin-Rezeptor. Der Kanal soll während eines Aktionspotentials geöffnet werden und nach Freisetzung des Ca2+ aus dem sarkoplasmatischen
Retikulum wieder schließen.
Bei Patienten mit Herzinsuffizienz ist der Ca2+ -Eflux reduziert. Dies könnte durch eine
reduzierte Anzahl der Ryanodin-Rezeptoren bedingt sein oder durch eine geringere Öffnungswahrscheinlichkeit der einzelnen Kanäle. Studien ergaben jedoch weder auf RNA-,
noch auf Proteinebene Abweichungen in der Quantität, so dass die zuletzt genannte Hypothese nicht haltbar war [5]. Eine geringere Öffnungswahrscheinlichkeit würde durch
einen Autoregulationsmechanismus zum größten Teil ausgeglichen, also durch eine geringere Inaktivierung des Calcium-Stroms (z.B. durch die L-Typ Rezeptoren).
Betrachtet man dagegen die Diastole, sollte der Kanal geschlossen sein. Der RyanodinRezeptor kann phosphoryliert werden [15, 16]. Es besteht ein wichtiger Zusammenhang
9
1 Einleitung
zwischen dieser Phosphorylierung und der Interaktion des Rezeptors mit dem ihm assoziierten Protein FKBP, welches die Interaktionen der einzelnen Monomere des Kanals
und somit auch die geschlossene Form des Kanals stabilisiert. Weiterhin stabilisiert das
FKBP das coupled gating“verschiedener Rezeptoren, also die gleichzeitige Öffnung und
”
Schließung mehrerer oder aller Ryanodin-Rezeptoren einer Gruppe [17].
Wird der Kanal phosphoryliert, so dissoziiert das FKBP 12.6 vom Kanal. Durch die Dissoziation des FKBP fehlt die Kopplung zwischen den Kanälen und es könnte sein, dass
bei einem Ereignis weniger Kanäle öffnen und somit die Effizienz der Calcium-induzierten
Calcium-Freisetzung herabsetzen. Gleichzeitig könnten die Kanäle nicht mehr richtig
schließen und es würde zu einem dauerhaften Ca2+ -Strom aus dem SR ins Innere der
Zelle kommen. Weiterhin resultiert, dass es auch bei geringen aktivierenden Ca2+ Konzentrationen zu sogenannten subconducting states“ kommt, wodurch ein diastolisches
”
Ca2+ -Leck entsteht. Dies kann als lang andauernde Ca2+ sparks“ der Freisetzung aus
”
dem SR beobachtet werden [18].
Die Ca2+ -Freisetzungskanäle/Ryanodin-Rezeptoren kommen in drei unterschiedlichen
Isoformen vor [19, 20, 21, 22, 23, 24]. Die drei Isoformen werden in verschiedenen Geweben unterschiedlich stark exprimiert. Der Ryanodin-Rezeptor Typ 1, RyR1, ist vor
allem im Skelettmuskel, aber auch im Gehirn zu finden [25, 26, 27]. Der RyanodinRezeptor Typ 2, RyR2, ist die dominierende Form im Herzmuskel, kommt aber auch in
glatter Muskulatur und im Gehirn vor [28, 29, 30]. Der Ryanodin-Rezeptor 3, RyR3,
wird in verschiedenen Regionen des Gehirns, in der Skelettmuskulatur und in Zellen des
Immunsystems exprimiert.
In Skelettmuskeln beträgt der Gehalt an RYR3 weniger als 1 % des RYR1-Gehalts. Im
Gehirn ist RYR2 insgesamt die häufigste Isoform, wobei in unterschiedlichen Regionen
jeweils genau reguliert ist, in welchem Verhältnis die drei RyR Isoformen exprimiert werden. RYR3 ist zum Beispiel die dominierende Isoform im Hippocampus und im Corpus
Striatum [31, 32].
Die Struktur von Ca2+ -Freisetzungskanälen/Ryanodin-Rezeptoren in den Membranen
des sarkoplasmatischen Retikulums wurde aus Hydropathie-Profilen der Aminosäuresequenzen, proteolytischen Spaltungen, Antikörperstudien und Cross-Linking Experimenten abgeleitet [33, 34, 35].
Es handelt sich bei Ca2+ -Freisetzungskanälen um homotetramere Proteine. Jedes Monomer besteht aus etwa 5000 Aminosäuren, die Masse beträgt etwa 560kD/Monomer.
Der Rezeptor besteht aus einer grossen, cytoplasmatischen Domäne, die etwa 80% des
Moleküls darstellt und einer kleinen transmembranen Domäne, die die Pore bildet, durch
die das Calcium in die Zelle gelangt [36, 37].
Elektronenmikroskopische Aufnahmen gefriergetrockneter Ca2+ -Freisetzungskanäle
(RyR1) zeigen, dass der Rezeptor in zwei verschiedenen Konformationen vorkommt: einer geschlossenen und einer geöffneten, wobei die Öffnung in der Mitte des Tetramers
sitzt [36].
Die drei Isoformen der Ryanodin-Rezeptoren in Säugern werden von drei unterschiedlichen Genen kodiert. Die RyR1 cDNA wurde als erste Isoform 1990 aus dem Skelett-
10
muskel des Menschen isoliert und sequenziert [26]. Die humane RyR1 cDNA erstreckt
sich über etwa 16 Kilobasen (kb) mit einem offenen Leserahmen von 15117 Basenpaaren
(bp), der für 5038 Aminosäuren kodiert. Der 5’- und der 3’- Bereich umfassen 130 bp
und 146 bp. Das humane RyR1 Gen erstreckt sich über 160 kb und ist in 106 Exons
aufgeteilt. Damit zählt das RyR1 Gen zu den größten bekannten Genen [38]. Das RyR1
Gen liegt auf dem Chromosom 19q12-q13.2 [39].
RyR2 und RyR3 cDNAs wurden aus Kaninchen und Mensch kloniert [28, 32, 40, 41, 42].
Die beiden cDNAs haben mit 4967 Aminosäuren (RyR2) und 4870 Aminosäuren (RyR3)
einen etwas kürzeren offenen Leserahmen als RyR1.
Im humanen Genom wurde RyR2 auf Chromosom 1q42.1-q43 lokalisiert, es erstreckt
sich über etwa 15 kb und besteht aus 105 Exons. RyR3 liegt auf Chromosom 15q14-q15
[43, 22, 42].
Die drei Isoformen der Ryanodin-Rezeptoren weisen eine gegenseitige Homologie von
66-70% auf. Dagegen sind die Herzmuskel-Isoformen innerhalb der Säugetiere zu etwa
95 % konserviert.
RyR1 Knock-out Mäuse sterben perinatal mit bedeutenden Abnormitäten der Skelettmuskulatur. Sie können nicht atmen, haben ungewöhnliche Krümmungen der Wirbelsäule und dünne Extremitäten mit sehr fragilen Muskeln. Histologisch zeigt die Muskulatur degenerative Veränderungen [44]. Die normale Erregungs-Kontraktions Kopplung (EC-Kopplung) ist nicht nachzuweisen, jedoch können schwache Muskelkontraktionen bei externer elektrischer Anregung beobachtet werden [44]. Ebenso wurden Knockout Mäuse für funktionelles RyR3 untersucht. Diese Tiere zeigen keine besonderen phenotypischen Auffälligkeiten. Es wird nur eine gesteigerte Bewegungsaktivität festgestellt,
und die Ca2+ Ausschüttung im Skelettmuskel SR ist leicht reduziert. Und obwohl RyR3
in T-Zellen exprimiert wird, proliferieren Milzzellen aus solchen Mäusen normal [45].
Obwohl die cDNA-Sequenzen und damit auch die Aminosäuresequenzen schon länger
bekannt sind, weiß man sehr wenig über die Beziehungen zwischen Struktur und Funktion der RyR Proteine. Aus der Aminosäuresequenz lassen sich zwei Proteinmodelle
ableiten, die entweder 4 oder 10 Transmembrandomänen ausbilden [25, 26]. Ergebnisse
aus Kristallstrukturdaten lassen 10 Transmembrandomänen vermuten [46], AntikörperBindungsstudien und Einzelkanalmessungen mit Deletionsmutanten jedoch favorisieren
das Modell mit 4 Domänen [33, 20].
Zudem wurden Leucin-Zipper Motive in den Sequenzen von Ca2+ -Freisetzungskanälen
gefunden. Dieses Motiv besteht aus einer periodischen Wiederholung von Leucin-Resten
an jeder siebten Position über eine Distanz von acht helikalen Windungen. Strukturell
könnte sich dabei eine Helix ausbilden, die mit einer anderen Helix gleicher Konformation in Interaktion tritt. Obwohl das Motiv ursprünglich bei DNA-bindenden Proteinen
identifiziert wurde, zeigte es auch wichtige strukturelle Funktionen in der Ausbildung
von Tetrameren [47].
Die SR-Ca2+ -Freisetzungskanäle binden mit sehr hoher Affinität das Pflanzenalkaloid
Ryanodin [48], durch diese Interaktion erhielten die Kanäle ihren Namen RyanodinRezeptor. Ryanodin ist ein insektizides Pflanzenalkaloid, das aus den Wurzeln und
11
1 Einleitung
dem Stamm des südafrikanischen Strauchgewächses Ryania speciosa gewonnen wird.
Das Alkaloid hält den Rezeptor [Ca2+ ] abhängig in permanent halboffenem Zustand.
Während es im Skelettmuskel von Wirbeltieren langsame, irreversible Kontraktionen
bewirkt, senkt es im Herzmuskel die Kontraktionskraft [49].
Mehrere Ryanodin-Bindungsstellen wurden an dem Kanalprotein identifiziert, wobei das
Alkaloid in Ca2+ -abhängiger Weise bindet [50]. Allerdings existiert nur eine einzige hochaffine Bindungsstelle für Ryanodin pro RyR Tetramer. Die anderen drei potentiellen
Bindungsstellen müssen demnach eine Umwandlung von hochaffiner zu niedrigaffiner
Bindungsstelle durchlaufen, was eine Konformationsänderung dieser Untereinheiten nahe legt [51].
Liganden, die den Ca2+ -Freisetzungskanal öffnen und die Ca2+ -Freisetzung regulieren,
stimulieren auch die Ryanodin-Bindung, Liganden mit antagonistischer Wirkung verhindern die Bindung von Ryanodin [19]. Ca2+ selbst ist einer der wichtigsten Liganden im Zusammenhang mit der Kanalfunktion. Es hat, konzentrationsabhängig, sowohl
aktivierende als auch inaktivierende Wirkung auf die Ca2+ -Freisetzung aus isolierten
Vesikeln des sarkoplasmatischen Retikulums [52, 20], ebenso auf Einzelkanalmessungen [53, 54, 55] und auf die Ryanodinbindung [51, 20, 56]. Es konnte eine hoch- und
eine niedrigaffine Ca2+ -Bindungsregion identifiziert werden [51, 56]. Bei Besetzung der
niedrigaffinen Bindungsstelle wird die Ryanodin Bindung [56], die Ca2+ -Freisetzung aus
isolierten Vesikeln [20] und die Aktivität von Kanälen, die in einer planaren Lipiddoppelschicht inkorporiert sind [57], inhibiert. Eine Information zur Stöchiometrie der Bindung
oder der Bindungskonstanten ist bisher nicht möglich.
Ein weiterer wichtiger Ligand ist das Mg2+ . Es wirkt in millimolaren Konzentrationen inhibierend auf die Ca2+ -Ausschüttung von RyR1, aber nur in geringem Maße auf RyR2.
Neben Ca2+ und Mg2+ wurden eine Reihe weiterer Agonisten und Antagonisten der
RyR Funktion beschrieben, zu den Aktivatoren zählen Adenin-Nukleotide und Koffein.
Zu den Inhibitoren zählen Dantrolen und Ruthenium-Rot [42]. Ryanodin-Rezeptoren
interagieren auch mit vielen hydrophoben Drogen, einschließlich einiger Lokalanesthetika
und anderer Betäubungsmittel [58]. Doch nicht nur niedermolekulare Agentien können
die Kanalaktivität beeinflussen, sondern auch Peptidketten und Proteine.
Für die Regulation des Rezeptors scheint auch sein Phosphorylierungszustand eine entscheidende Rolle zu spielen. Es gibt mehrere potentielle Phosphorylierungsstellen im
Molekül, die durch unterschiedliche Kinasen phosphoryliert werden können, zum Beispiel die Ca2+ /Calmodulin- abhängige Kinase [59, 14], zyklische AMP-abhängige und
zyklische GMP-abhängige Protein-Kinase [23]. Es konnte gezeigt werden, dass der skeletale Ryanodin-Rezeptor spezifisch am Serin 2843 phosphoryliert werden kann [16].
Die Aktivierung der endogenen Calmodulin abhängigen Kinase führt zu einer Schließung
des Ryanodin-Rezeptors. Durch Dephosphorylierung mit Phosphatasen kann dies wieder
rückgängig gemacht werden [60]. Herrmann-Frank und Varsanyi zeigten dagegen, dass
es durch Phosphorylierung zu einer Erhöhung der Öffnungswahrscheinlichkeit kommt,
die durch eine Protein-Phosphatase wieder erniedrigt wird [61].
Ein mit dem Kanal assoziiertes Protein ist Calsequestrin. Calsequestrin ist ein luminal
12
lokalisiertes Protein, das Ca2+ mit hoher Kapazität (40-50 mol Ca2+ pro mol Calsequestrin) und geringer Affinität (KD =1mM)binden kann [62, 63]. Dies lässt vermuten, dass
das Calsequestrin einen Puffer und ein Reservoir für Ca2+ darstellt. Lokalisationsstudien zeigten, dass sich Calsequestrin in direkter räumlicher Nähe zum Ryanodin-Rezeptor
befindet [64, 65]. Diese Erkenntnisse führten zu dem Schluss, dass eine Regulation des
Ryanodin-Rezeptors durch luminal lokalisierte Proteine stattfinden könnte. Es wurde
vermutet, dass die Regulation durch Calsequestrin indirekt durch Triadin und Junctin,
zwei membrandurchspannende Proteine, stattfindet [66, 67, 68]. Vor wenigen Jahren
konnte jedoch eine direkte Interaktion von Calsequestrin und dem Ryanodin-Rezeptor
nachgewiesen werden [69]. Triadin ist ein Protein der terminalen Zisternen des SR. Es ist
ein über Disulfidbrücken gebundenes Homopolymer unterschiedlicher Größe. Es besitzt
eine Masse von 79 kD pro Monomer und beinhaltet ein einzelnes hydrophobes Segment,
welches lang genug ist, um die Membran als α-Helix zu überspannen [70, 71]. Der übrige
Teil des Proteins beinhaltet viele Lysine und ist stark geladen.
Junctin ist ein 26 kD großes Protein, das zuerst im SR des Kaninchen Herzmuskels gefunden wurde [72]. Es besitzt, ähnlich wie das Triadin eine membrandurchspannende
Domäne [72]. Von der Aminosäuresequenz gesehen sind Triadin und Junctin im luminalen Bereich sehr ähnlich. Beide Proteine besitzen eine hohe Anzahl positiv geladener
Aminosäuren. Es wird vermutet, dass darüber die Interaktion mit dem Calsequestrin
stattfindet [72]. Vor kurzem wurde gezeigt, dass Junctin an Triadin, den RyanodinRezeptor und Calsequestrin binden kann. Dies führte zu dem Schluss, dass diese vier
Proteine einen quaternären Komplex bilden könnten [73]. Diese Ergebnisse widersprechen jedoch den von Murray publizierten Ergebnissen [69], die eine Beteiligung von Triadin und Junctin bei der Interaktion zwischen Calsequestrin und den Ryanodin-Rezeptor
ausschließen.
Auch die Phosphorylierung von im Lumen des SR lokalisierten Proteinen spielen eine
wichtige regulatorische Rolle. Im SR Lumen ist ein Phosphorylierungssystem lokalisiert,
das die luminalen Proteine Sarcolumenin, ’Histidine-rich’ Ca2+ -binding Protein [74] und
Calsequestrin [75, 76] phosphoryliert. Das für die Phosphorylierung notwendige ATP
kann durch einen im SR lokalisierten Porin-ähnlichen Anionenkanal erfolgen [58]. Dieses
im SR Lumen lokalisierte Phosphorylierungssystem übt eine entscheidende modulatorische Rolle auf die Ca2+ -Freisetzung durch den RyR aus [77]. Calsequestrin moduliert,
abhängig von seinem Phosphorylierungszustand, die RyR Aktivität und beeinflusst so die
Menge an freigesetztem Ca2+ ins Cytosol [78]. Die funktionelle Wechselwirkung zwischen
Calsequestrin und dem Ryanodin-Rezeptor konnte mit Hilfe von Oberflächen-PlasmonResonanzstudien als hochaffine molekulare Interaktion (KD ca. 100 nM) charakterisiert
werden [79]. Die Interaktion scheint dabei nicht vom Phosphorylierungszustand des Calsequestrins abhängig zu sein. Da die intraluminale Calsequestrin Konzentration mit ca.
100 mg/ml sehr hoch ist, müsste den Ergebnissen zufolge Calsequestrin immer mit dem
RyR assoziert sein. Calsequestrin kommt im Lumen überwiegend in der phosphorylierten
Form vor. Ergebnisse elektrophysiologischer Messungen zeigten, dass Dephosphorylierung von ca. 1% des Phospho-Calsequestrins ausreicht, um den RyR-Kanal halbmaximal
13
1 Einleitung
zu aktivieren, ohne dass das Calsequestrin von dem SR-Freisetzungskanal dissoziiert [78].
Da für die Regulation der Ca2+ -Freisetzung nur die dephosphorylierte Form relevant ist,
scheint der physiologisch entscheidende Schritt die Dephosphorylierung des Calsequestrins zu sein. Die Fortsetzung der Analyse luminaler Ereignisse auf die RyR- Kanalaktivität haben in der jüngsten Vergangenheit zu neuen Erkenntnissen geführt. Die Suche
nach neuen luminalen Interaktionspartnern des RyR mit Hilfe von Hefe Two-Hybrid
Untersuchungen führte zur Identifikation eines Polypeptids, das in Assoziation mit dem
Ca2+ -Freisetzungskanals die Kanaleigenschaften fundamental ändert [80]. Interessanterweise konnten in jüngerer Zeit auch Mutationen im Gen des Calsequestrins nachgewiesen
werden, die im Zusammenhang mit der Ausbildung einer CPVT [81, 82] stehen, was ein
weiterer Hinweis auf einen pathogenen Zusammenhang zwischen Arrhythmien und der
cardialen Erregungs-Kontraktions-Kopplung darstellt.
Ein weiteres regulatorisches System stellt das Calmodulin dar. Die Hemmung von Ca2+ Kanälen und ATP aktivierten Kanäle durch Calmodulin zeigten Smith et al. [53]. Das
Calmodulin reduziert in [Ca2+ ] abhängiger Weise von der Myoplasmaseite die Öffnungsdauer von Einzelkanälen, ohne dabei die Kanal-Leitfähigkeit zu beeinflussen [83, 84].
Wenn die Calciumionenkonzentration kleiner als 0.2nM ist, aktiviert Calmodulin den
Ryanodin-Rezeptor, wohingegen höhere Konzentrationen (mikro- und millimolarer Bereich) eine Inhibierung der Ca2+ -aktivierten Kanäle bewirken.
In diesem Zusammenhang wird auch die Funktion des FK506 diskutiert. Hierbei handelt
es sich um ein makrolides Immunsuppressivum, das an eine Familie von intrazellulären
Rezeptoren bindet. Diese Rezeptoren werden als FK506-bindende Proteine (FKBP) bezeichnet. Das FKBP 12 (12kD) ist das am häufigsten vorkommende Protein dieser Familie. Im Herzen ist FKBP 12.6 (12.6kD) die Hauptform.
Während das FKBP12.6 sowohl am cardialen, als auch am skeletalen Rezeptor binden
kann, bindet das FKBP12 selektiv an der skeletalen Isoform. Verantwortlich für diese
Selektivität sind drei Aminosäuren: Glutamin31, Asparagin32 und Phenylalanin59 [85].
Das FKBP ist in einem stöchiometrischen Verhältnis von 1:1 an den Ryanodin-Rezeptor
assoziiert. Das Protein stabilisiert den geschlossenen Zustand des Kanals [7], entfernt
man FKBP12 vom Ryanodin-Rezeptor, wird der Ca2+ -Kanal durchlässig.
Mögliche Funktionen des Proteins liegen also in der Koordinierung des RyR Tetramers,
Stabilisierung des geschlossenen Zustandes des Kanals [86] und Koordinierung des Übergangs zum vollständig geöffneten Zustand [87].
In den vergangenen Jahren konnten Mutationen im Gen des cardialen Ryanodin-Rezeptors
bei Patienten bestimmter Formen der Herzinsuffizienz nachgewiesen werden [88, 89, 90].
Dabei könnten Mutationen im Bereich der FKBP-Bindungsstelle und Mutationen in der
Porenregion von besonderem Interesse sein. Auch Mutationen, die eine zusätzliche Phosphorylierungsstelle schaffen, könnten von Interesse sein, da der Ryanodin-Rezeptor in
der Herzinsuffizienz einen erhöhten Phosphorylierungsgrad aufweist [7].
Alle bisher mit einem genetischen Defekt in Zusammenhang gebrachten Mutationen
in den Genen des Ryanodin-Rezeptors lagen in drei, auch zwischen den verschiedenen
Isoformen konservierten Bereichen.
14
Y4653P
N4104K
Q4201R
E4950K
S2246L
P2328S
N2386I
R2474M
G1885E
G1886S
L433P
R176Q
C35R
R163C
G248R
G341R
I403M
Y522S
R552W
R614L/C
R2163C/H
Y2168M
T2206M/R
Y2214I
D2431N
G2431N
G2434R
R2335H/C
R2452W
R2454C
RyR1
Exons1-19
Exon37
Exons 43-50
I4890T
T4826I
RyR2
Exons 90-105
Abbildung 1.2: Vergleich der drei Bereiche, in der bisher Mutationen gefunden wurden,
die mit maligner Hyperthermie und Central Core Desease (beide RyR1) bzw. arrhythmogener
rechtsventrikulärer Cardiomyopathie und katecholaminerger polymorpher ventrikulärer Tachykardie (beide RyR2) in Verbindung stehen. Abb. nach [7]
Diese drei Bereiche scheinen also besonders wichtig für die Struktur und Funktion des
Kanals zu sein. Der erste Bereich erstreckt sich über die Exons 1-19 und liegt in der
cytoplasmatischen Domäne des Rezeptors. Über diesen Bereich ist bisher nicht viel an
funktionellen Eigenschaften bekannt. Auch der zweite Bereich, der sich über die Exons
43-50 erstreckt, liegt in der cytoplasmatischen Domäne. In diesem Bereich liegt die Bindungsstelle für das regulatorisch wirkende Protein FKBP, ebenso liegt der Bereich in
der Nähe der Phosphorylierungsstelle. Der dritte Bereich liegt in der transmembranen
und c-terminalen Region des Rezeptors und erstreckt sich über die Exons 90-105, bzw.
106 in der skeletalen Isoform. Dieser Bereich bildet die Ca2+ -Pore.
Mutationen im Gen der Ryanodin-Rezeptoren stehen etiologisch mit unterschiedlichen
Krankheiten wie Maligner Hypertonie (MH) (RyR1), Central Core Disease (CCD) (RyR1),
catecholaminerger polymorpher ventrikulärer Tachycardie (CPVT)(RyR2) und arrhythmogener rechtsventrikulärer Cardiomyopathie (RyR2) im Zusammenhang.
Die Herzinsuffizienz ist eine der Haupttodesursachen in den westlichen Industrienationen. Es wird großer finanzieller und arbeitsintensiver Aufwand betrieben, um die molekularen und zellulären Ursachen zu erforschen.
Während viele Aspekte kontrovers diskutiert werden, ist es allgemein akzeptiert, dass
ein großer Teil des kontraktilen Defizits in der Herzinsuffizienz durch einen reduzierten Ca2+ -Transienten in den Myozyten begründet ist [2, 9, 91, 10]. Auch Änderungen
des Ca2+ -Stroms (ICa ) und der Charakteristika des Aktionspotentials wurden bei der
Herzinsuffizienz beobachtet. Ein zentraler Faktor für den reduzierten Ca2+ -Transienten
ist jedoch ein Abfall des Ca2+ Gehalts im sarkoplasmatischen Retikulum [91, 10, 11, 12].
In den letzten Jahren konnte nachgewiesen werden, dass Defekte in cardialen Ionenkanälen zu ventrikulären Arrhythmien führen können, welche die Hauptursache für den
15
1 Einleitung
plötzlichen Herztod darstellen [92]. Bis heute sind 6 Ionenkanäle bekannt, die mit Arrhythmien in Zusammenhang stehen, darunter ein Natriumkanal, ein Kaliumkanal und
auch der Ca2+ -Freisetzungskanal/Ryanodin-Rezeptor.
Mutationen im humanen Ryanodin-Rezeptor wurden kürzlich mit verschiedenen Formen
cardialer Arrhythmien, darunter catecholaminerge polymorphe ventrikuläre Tachycardie
(CPVT) und arrhythmogene rechtsventrikuläre Cardiomyopathie Typ2 (ARVC2) [93, 88,
94] in Verbindung gebracht.
Die Herzinsuffizienz hat verschiedene Etiologien. Die genetisch bedingten Cardiomyopathien unterscheiden sich im klinischen Phenotyp, beruhen aber auf Mutationen, die
oft in denselben Proteinen zu finden sind. Die häufigsten Cardiomyopathien sind die
hypertrophe Cardiomyopathie (HCM) und die dilatative Cardiomyopathie (DCM), die
jeweils einen unterschiedlichen Anteil an Patienten mit genetischer Disposition aufweisen. Die Prävalenz der arrhythmogenen rechtsventrikulären Cardiomyopathie (ARVC)
ist im Vergleich zur HCM und DCM eine seltene Herzerkrankung.
Die dilatative Cardiomyopathie (DCM) ist laut WHO als eine Erkrankung des Herzmuskels definiert, die zur Dilatation und eingeschränkten systolischen Funktion vor allem
des linken, aber auch/und des rechten Ventrikels führt. Sie ist durch eine fortschreitende Verminderung der Fähigkeit der Herzmuskelzellen sich während der Systole zu
kontrahieren, gekennzeichnet [95, 96]. Aufgrund des Verlaufs der Krankheit, die mittlere
Lebenserwartung bei symptomatischen Patienten liegt bei 5 Jahren [97], und den stark
eingeschränkten medikamentösen Behandlungsmöglichkeiten stellt die dilatative Cardiomyopathie eine der schwersten Herzkrankheiten dar und ist mit die häufigste Indikation
für eine Herztransplantation und bildet mit einem Anteil von 18% bis 28% eine der
Hauptursachen der Herzinsuffizienz dar [98, 99, 100].
DCM Herz
Gesundes Herz
LA
LA
RA
RA
LV
LV
RV
RV
Abbildung 1.3: Vergleich eines gesunden Herzens und einem DCM-Herzen. Der linke Ventrikel
(LV) des DCM-Herzens ist stark vergrößert, während rechter Ventrikel (RV), ebenso rechtes
und linkes Atrium (RA bzw. LA) unverändert zum Kontroll Herzen sind.
Der Verlauf ist für den Erkrankten durch allgemeine Insuffizienz und Luftnot bei im-
16
mer geringeren Belastungen gekennzeichnet [101]. Im weiteren Verlauf kommt es bei
etwa 25% der Betroffenen zu Angina Pectoris, es können Herzrhythmusstörungen und
Vorhofflimmern auftreten, es kann zu Embolien führen [96]. Aufgrund der verringerten
Auswurfleistung des Ventrikels kann es in Folge dessen zu Schädigungen peripherer Organe wie Leber und Niere kommen [95].
Man unterscheidet bei einer DCM zwischen primärer und sekundärer Form.
Die Ursache der sekundären Form ist bekannt, -z.B. kann exzessiver Alkoholkonsum oder
eine Virus Myocarditis als Ursache in Frage kommen [95]. Bei der primären Form ist
die Ursache weitgehend unbekannt.
Im Jahre 1961 wurde erstmals eine familiäre Häufung bei der DCM beschrieben [102,
103, 104]. Erst im Jahre 1992 fand die erste systematische Analyse von Familienangehörigen von Michels et al. [105] statt. In dieser Studie wurde gezeigt, dass 20% der
untersuchten Patienten mit DCM eine familiäre Form aufwiesen. Auch spätere Untersuchungen bestätigten, dass ca. 25% aller Fälle eine familiäre Erkrankung zugrunde
liegt [106, 107, 108, 105].
Die Definition der familiären DCM besagt, dass die Erkrankung vererbt wird [109]und
es erstens in einer Familie zwei oder mehr Betroffene gibt oder zweitens ein Verwandter ersten Grades eines Patienten mit DCM vor dem 35. Lebensjahr einen unerklärten,
plötzlichen Herztod erlitten hat.
Es findet sich zumeist ein autosomal dominanter Erbgang, es gibt aber auch Fälle mit autosomal rezessivem, x-chromosomalem und selten maternalem Erbgang [107, 110, 111].
1994 wurde der erste Genort für eine autosomal-dominant erbliche dilatative Cardiomyopathie auf Chromosom 1 beschrieben [112]. Danach konnten weitere Genorte auf
verschiedenen Chromosomen in Familien mit dilatative Cardiomyopathie identifiziert
werden [113, 114, 115, 112, 116, 117, 118, 119, 120, 121]. Bis heute sind 15 verschiedene
Genorte für die autosomal-dominant erbliche DCM bekannt. Bisher gelang aber nur in
9 potentiellen Krankheitsgenen die Identifikation der betroffenen Proteine: Dystrophin,
Tafazzin, cardiales Aktin, Desmin, Lamin A/C, δ-Sarcoglycan, α-Myosin und TroponinT [95].
Die Mutationen wirken sich auf unterschiedliche Weise aus. So verursachen Mutationen
in Proteinen des Zytoskeletts eine verminderte Kraftübertragung benachbarter Myozyten, Mutationen im Lamin Gen resultieren hingegen in einer verminderten Myozytenzahl
und dadurch zu einer reduzierten Kraftentwicklung bei der Kontraktion, Mutationen im
δ-Sarcoglycan Gen sind mit subklinischer Skelettmuskelbeteiligung assoziiert. Die Mutationen im α-Myosin und Troponin-T haben eine reduzierte Kraftentwicklung innerhalb
des Sarkomers zur Folge [97].
Bis jetzt ist noch nicht abschließend geklärt, wie die verschiedenen Mutationen zum
Krankheitsbild der Dilatation und verminderten systolischen Funktion des Ventrikels
führen.
Die arrhythmogene rechtsventrikuläre Cardiomyopathie ist ebenfalls eine primäre Herzmuskelerkrankung, sie wurde 1995 in die WHO Klassifikation als eigenständige Erkrankung aufgenommen, bis zu diesem Zeitpunkt wurde sie als arrhythmogene rechtsventri-
17
1 Einleitung
kuläre Dysplasie (ARVD) bezeichnet.
Typisch für die ARVC ist eine Kontraktionsstörung des rechten Ventrikels. Das klinische
Erscheinungsbild umfasst asymptomatische Fälle, die fast ausschließlich bei systematischem Familienscreening entdeckt werden, über Patienten mit Kammertachykardien bis
hin zum plötzlichen Herztod.
In etwa 30% der Fälle lässt sich eine familiäre Häufung feststellen.
Die Erkrankung ist z.B. eine wesentliche Ursache von plötzlichem Herztod bei Jugendlichen und Athleten in der Veneto-Region Italiens [94].
Makroskopisch erkennt man im normalen oder vergrößerten rechten Ventrikel eine vermehrte Bindegewebs-/ Fetteinlagerung, die vermutlich durch degenerative Prozesse verursacht werden, die durch progressiven Verlust von Cardiomyozyten gekennzeichnet sind,
[122]. Weiterhin können Apoptose und inflammatorische Effekte, zum Teil vergleichbar
mit einer aktiven Myocarditis, in den betroffenen Regionen beobachtet werden [122].
Die rechte Herzwand erscheint aufgrund dieser Einlagerungen gelblich oder weiß, pergamentartig. Die rechtsventrikuläre Dilatation ist ein Charakteristikum der ARVC. Eine
Beteiligung des rechten Ventrikels wurde bei 50% der Fälle beobachtet [123]. Während
des Fortschreitens der Krankheit kann auch der linke Ventrikel in Mitleidenschaft geraten, was zur Imitierung und Verwechslung mit der dilatativen Cardiomyopathie führen
kann [123].
Bei der ARVC sind sowohl die Etiologie als auch die Pathogenese untersucht. Vor allem
bleiben die Vorgänge, die zu einem progressiven Verlust des Myokards und zum Binde/Fettgewebe-Ersatz führen, ungeklärt.
Bei familiärem Auftreten konnte ein autosomal dominanter Vererbungsweg nachgewiesen werden. Es wurden fünf Gen Loci durch ’Linkage’-Analyse identifiziert, wobei zwei
sich auf dem Chromosom 14 und jeweils ein Locus sich auf den Chromosonen 1, 2 und
3 befinden.
Die spezifischen Gendefekte und die entsprechenden Proteine wurden bisher in nur einem Fall identifiziert. Laitinen et al. konnten den Genlocus auf Chromosom 1.q42-1.q43,
das Gen, das für den cardialen Ryanodin-Rezeptor codiert, festlegen. Im weiteren gelang
Ihnen der Nachweis von Mutationen im Gen des Ryanodin-Rezeptors betroffener Patienten [88]. Die molekularen und zellulären Prozesse, die diesen Formen der Arrhythmien
zugrunde liegen, sind noch nicht geklärt.
Aus diesem Grund wurde von uns die Hypothese aufgestellt, dass bei Patienten mit
DCM/ARVC Mutationen im Gen des Ryanodin-Rezeptor mitverantwortlich bei der Ausbildung des Krankheitsbildes sein können, es sogar Mutationen gibt, die in verschiedenen
Formen der Cardiomyopathien vorkommen.
Ziel der Arbeit
Eine Ursache für den verringerten Ca2+ -Transienten bei der Herzinsuffizienz könnte darin
liegen, dass der Ca2+ -Freisetzungskanal/Ryanodin-Rezeptor permanent geringe Mengen
Ca2+ aus dem SR in das Cytosol der Zelle freisetzt, auch während der Diastole, in der
18
der Kanal im gesunden Herzen geschlossen ist.
Aus diesem Grund wird postuliert, dass die Entstehung einer Cardiomyopathie durch
Mutationen im Gen des cardialen Ryanodin-Rezeptors mit bedingt sein kann, oder dass
Mutationen oder Polymorhpismen in diesem Gen als ’Modifier’ für den Verlauf einer
Herzinsuffizienz dienen könnten. Weiterhin könnte die Wechselwirkung des RyanodinRezeptors mit einem seiner assoziierten Proteine gestört sein. So wurde gezeigt, dass das
FK-Bindeprotein den geschlossenen Zustand des Ryanodin-Rezeptors stabilisiert [124]
und Mutationen im Calsequestrin Formen der catecholaminergen polymorhen ventrikulären Tachycardie, CPVT, verursachen können [81, 82].
In dieser Arbeit sollte analysiert werden, ob es bei Patienten, die an einer Herzinsuffizienz
leiden, Auffälligkeiten im Gen des cardialen Ryanodin-Rezeptors gibt, welche im engen
Zusammenhang mit der Entwicklung oder dem Verlauf der Krankheit stehen könnten.
Es wurden zwei Gruppen von Patienten untersucht. Zum einen wurde die genomische DNA von 13 Patienten mit arrhythmogener rechtsventrikulärer Cardiomyopathie,
ARVC, analysiert. Bei dieser Erkrankung wurde bereits über eine mögliche Beteiligung
des Ryanodin-Rezeptors berichtet [94]. Zum anderen wurde die genomische DNA von
80 Patienten mit dilatativer Cardiomyopathie, DCM, analysiert. Bisher wurden bei der
DCM nur Mutationen in den Proteinen des kontraktilen Apparates nachgewiesen. Allerdings wurde ein mit der Krankheit im Zusammenhang stehender Genort auf Chromosom 1 nachgewiesen, auf diesem Chromosom liegt auch das Gen des cardialen RyanodinRezeptors. Wie bei der ARVC scheinen die molekularen Ursachen mitunter in einer
Veränderung der Ca2+ -Regulation der Zelle begründet zu sein. Es wird daher hier angenommen, dass ähnliche molekulare und zelluläre Mechanismen in beiden Krankheitsbildern zugrunde liegen könnten. Somit könnte der Ryanodin-Rezeptor auch für Patienten
mit dem klinischen Phenotyp DCM ein Kandidaten-Gen darstellen. Diese Hypothese
sollte hier analysiert werde.
Die Arbeit gliederte sich in zwei Teile:
Im ersten Teil wurden Mutationsanalysen mittels Einzelstrang Konformations Polymorphismus Analyse (SSCP), Schmelztemperaturanalyse und Sequenzierung durchgeführt.
Das Gen des cardialen Ryanodin-Rezeptors (105 Exons) wurde in einem Kollektiv von
insgesamt 93 DCM/ARVC Patienten analysiert.
Wurden Abweichungen in einem Exon festgestellt, wurde dieses Exon mit denselben
Methoden auch in einem Kontrollkollektiv (70 bzw. 200 Personen) untersucht, um die
Häufigkeit der Abweichung(en) verifizieren zu können.
Im zweiten Teil der Arbeit sind die funktionellen Auswirkungen der gefundenen BasenAbweichungen auf Proteinebene analysiert worden.
Diese Analyse erfolgte über elektrophysiologische Untersuchungen des Ryanodin-Rezeptors
in einer künstlichen Lipiddoppelschicht.
Zum einen wurde der native, aus menschlichem Herzen isolierte Rezeptor analysiert. Ein
weiterer Ansatz war es, das Protein rekombinant darzustellen. Nach Transfektion von
HEK293 Zellen mit der cDNA des cardialen Ryanodin-Rezeptors wurde das exprimierte
Wildtyp- und mutierte-RyR-Protein angereichert. Zielsetzung dieser Experimente war
19
1 Einleitung
festzustellen, ob und wie sich die Mutationen auf die Kanalparameter des RyanodinRezeptors auswirken.
20
2 Material
GFX-DNA Blood Isolierungskit
Miniprep Kit
Miniplasmid Kit
Midiprep Kit
RNA Isolierungskit
PCR-Primer
Hybridisierungssonden
Acrylamid/Bisacrylamid (30%)
Agarose, ultra rein
Ammoniumpersulfat
Ampicillin
Bromphenolblau
Desoxynukleotide (dATP, dCTP, dGTP, dTTP)
Ethidiumbromid
Formamid
GeneRuler 1 kb DNA Ladder
Glycin
LB Agar, Miller
LB Broth Miller
2YT-Medium
OrangeG
PIPES
Serva Blue
Phospholipide für Einzelkanalmessungen
Proteaseinhibitoren
Amersham Pharmacia
Amersham Pharmacia
Eppendorf
Jet Star, Genomed
Qiagen
MWG-AG
tibMolBiol
Carl Roth GmbH
Biozym
Sigma
Boehringer Mannheim GmbH
Merck
Eppendorf
Sigma
Sigma
MBI-Fermentas
Waldeck
Becton Dickinsen
Becton Dickinsen
Gibco/BRL
Sigma
Biomol
Serva
Avanti
Boehringer
Alle sonstigen Chemikalien wurden, sofern nicht anders aufgeführt, in Analyse-Qualität
von den Firmen Roche, Biomol, Fluka, MBI-Fermentas, Merck, Roth, Serva, Sigma,
Pharmacia oder GibcoBRL bezogen.
21
2 Material
Puffer und Medien
1 × TE-Puffer
10 mM Tris-HCL pH 7.6
1 mM EDTA
SOC Medium
2 % (w/v) Trypton (Difco)
0,5 % (w/v) Hefeextrakt (Difco)
10 mM NaCl
10 mM MgCl 2
10 mM MgSO 4
2,5 mM KCl
20 mM Glucose
2YT-Medium
16 g/l Becto Pepton
10 g/l Hefeextrakt
10 g/l NaCl
LB-Medium (1l)
10 g/l Bakto-Trypton
5 g/l Bakto-Hefeextrakt
10 g/l NaCl pH 7,0
LB-Platten (1l)
25 g/l Luria Bertani Medium, Difco
20 g/l Agar, Difco
10 × TBE-Laufpuffer
0.9 M Tris-Borat, pH 8.3
20 mM EDTA
10 × Auftragspuffer
50 % (w/v)Sucrose
0.5 % Orange G
Laemmli-Puffer
62.7 mM Tris-Hcl pH 6.8
3 % SDS
0.1 % Bromphenolblau
5 % β-Mercaptoethanol
10 % Glycerin
22
Chemikalien für die Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus-Analyse
Probenpuffer SSCP:
95 % Formamid
20 mM EDTA (pH 8.0)
0.05 % Bromphenolblau
0.05 % Xylene cyanol
Agarose-Teil (50ml)
0,25 g Agarose
10 ml TBE 10 ×, pH 8.0
40 ml Wasser
alternativ mit 5 ml TBE und 45 ml Wasser
Acrylamid-Teil (50 ml):
20 ml Acrylamid/Bis ( 19 ml + 1 ml)
5 ml Glycerol
25 ml Wasser
alternativ ohne Glycerol, dann mit 30 ml Wasser
Silbernitratlösung (1 l)
1 g Silbernitrat
1.5 ml Formaldehyd
Entwicklerlösung
30 g DiNatriumcarbonat
1.5 ml Formaldehyd
20 mg Na2 S2 O3
Zellkultur
Zellkulturmedium
DMEM Medium, 4.5 g/l Glucose, n-Glutamin
10 % fötales Kälberserum
100 u/ml Penicillin
10 µg/ml Streptomycin
Einfriermedium
25 % fötales Kälberserum
12 %DMSO
31.5 % DMEM
31.5 % konditioniertes Medium
23
2 Material
1 × PBS
10 mM Na2 HPO4
140 mM NaCl
1.8 mM KH2 PO4
2.7 mM KCl
2 × BES Lösung 10.7 g/l BES
16 g/l NaCl
0.27 g/l Dinatriumhydrogenphosphat
Vektoren, Bakterienstämme und Zelllinien
pCDNA 3.1+
pGEX-5X-1
pCRII TOPO
Stratagene
Pharmacia
Invitrogen
XL1blue
XL10gold
HEK293
Stratagene
Stratagene
freundliche Gabe des Lehrstuhls
für Pharmakologie und Toxikologie, RUB
Enzyme
Restriktionsendonukleasen (10 U/µl)
MBI-Fermentas
T4-DNA-Ligase (5 U/µl)
Roche
PfuTurbo DNA-Polymerase (2,5 U/µl) Stratagene
PfuUltra DNA-Polymerase (2,5 U/µl) Stratagene
Taq DNA-Polymerase(10 U/µl)
Eppendorf
MasterTaq DNA-Polymerase
Eppendorf
Puffer für die Restriktionsendonukleasen:
R-Puffer
10 mM Tris-HCl pH 8.5 bei 37◦ C
10 mM MgCl2
100 mM KCl
0.1 mg/ml BSA
Y-Puffer
33 mM Tris-Acetat pH 7.9 bei 37◦ C
10 mM Magnesiumacetat
66 mM Kaliumacetat
0.1 mg/ml BSA
24
3 Methoden
3.1 Molekularbiologische Methoden
3.1.1 Isolierung genomischer DNA aus menschlichem Vollblut
Zur Aufreinigung von DNA aus Blut wurde der genomic DNA Isolation kit von Amersham Pharmacia verwendet.
Zu 300 µl Vollblut wurden 900 µl Puffer 1 addiert. Die Lösung wurde gemischt und anschließend 20 sec, 20.000×g, Raumtemperatur (RT) zentrifugiert, der Überstand wurde
bis auf 20 µl verworfen. Das Sediment (Leukozyten) wurde mit dem restlichen Lösungsvolumen resuspendiert, es wurden 400 µl Puffer 2 zugegeben und erneut gemischt. Nach
5 minütiger Inkubation wurde die Lösung auf eine GFX-Säule gegeben und für 30 sec,
8000×g, RT zentrifugiert. Der Durchlauf wurde verworfen, 500 µl Waschpuffer wurden
auf die Säule gegeben und erneut wie oben zentrifugiert. Die Säule wurde auf ein neues
Gefäß gesetzt und 200 µl auf 70◦ C erhitztes Wasser zur Elution der DNA auf die Säule
gegeben. Es wurde erneut für 1 Min, 20.000×g, RT zentrifugiert, die Konzentration der
gewonnenen DNA wurde photometrisch, wie in 3.1.2 beschrieben, bestimmt.
Alternativ wurde 20 µl 50 mM EDTA mit 200 µl Blut vermischt. Zur hypotonen
Hämolyse wurden 800 µl 25mM NaCl zugegeben und ca. 2 min bei Raumtemperatur
inkubiert. Nach Ausgleich der Osmolarität im Ansatz mit 400 µl PBS500 wurde 1 min,
3000×g, RT sedimentiert und der Überstand verworfen. Dem Sediment wurden nach
Aufnahme in 200 µl Lysepuffer zur Proteinzerstörung 200 µl Phenol zugegeben. Nach
Mischen wurden 800 µl Chloroform zugesetzt und erneut gemischt. Es wurde 2 min,
20.000×g, RT zentrifugiert Die Oberphase wurde abgenommen und zu einer Mischung
von 1/10 Volumen 3M Na-Acetat und 200 µl Isopropanol gegeben und zur Sedimentation
der DNA 3 min, 20.000×g, RT zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Zum
Waschen der DNA wurden 400 µl 70 % Ethanol zugegeben, kurz gemischt und 1 min,
20.000×g, RT zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Die DNA wurde in 20 µl
TE-Puffer aufgenommen und 5 min bei 60 ◦ C gelöst.
25
3 Methoden
Puffer 1, 2, 3 nicht spezifiziert
PBS 500
100 mM NaH2 PO 4 Puffer, pH 7,4
500 mM NaCl
Lysepuffer
50 mM TrisHCl pH 7,5
5 mM EDTA
0,1 % TritonX-100
0,1 % Nonidet P40
0,1 % Tween20
3.1.2 photometrische Konzentrationsbestimmung von DNA
Die Konzentration der DNA wurde durch Messung der Absorption bei 260 nm bestimmt.
Bei einer Schichtdicke von 1 cm entspricht bei dieser Wellenlänge eine optische Dichte
von 1 einer Konzentration von 50 µg/ml. Die Messungen wurden mit dem GenequantPhotometer, Amersham Pharmacia, durchgeführt, die Quarz-Küvette stammt von Hellma.
3.1.3 Präparation von DNA aus Bakterienkulturen
Zur Präparation wurde der GFX Micro-Plasmidkit von Amersham Biosciences, sowie
das Mini-Plasmid-Kit der Firma Eppendorf verwendet. Während das Kit der Firma
Amersham Biosciences auf dem System der alkalischen Lyse beruht, verwendet Eppendorf die enzymatische und osmotische Lyse.
GFX-Kit: 2 ml einer Bakterienkultur wurde für 1 Minute bei 20.000×g zentrifugiert
und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in 400 µl Puffer 1 resuspendiert und
1 Min. inkubiert. Die Lösung wurde auf eine Säule gegeben und erneut für 30 Sekunden
bei 20000×g zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen, 400 µl Waschpuffer auf die
Säule gegeben und erneut wie oben zentrifugiert. Die Säule wurde auf ein sauberes Eppendorfcup gesetzt und 50 µl Wasser zur Elution der DNA auf die Säule gegeben. Nach
1 minütiger Inkubation wurde erneut wie oben zentrifugiert. Die Konzentrationsbestimmungen der isolierten DNA erfolgten wie zuvor beschrieben.
Puffer 1
Acetat-gepufferte Lösung, nicht weiter spezifiziert,
und chaotrope Salze
GFX-Säule vorgepackte Säule mit
Glasfasermatrix
Waschpuffer 10 mM Tris-EDTA, pH 8.0
80 % Ethanol p.a.
Micro Plasmid-Kit: 2 ml einer Bakterienkultur wurde für 1 Minute bei 20.000×g zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in 400 µl eiskaltem Lysepuffer
26
3.1 Molekularbiologische Methoden
(enthält RNase und Lysozym) resuspendiert, 30 sec bei höchster Stufe gevortext und
3 Min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Lösung wurde auf eine Säule gegeben und
für 45 Sekunden bei 20.000×g zentrifugiert; anschließend erfolgte die Zugabe von 400 µl
Waschpuffer auf die Säule und es wurde erneut wie oben zentrifugiert,der Durchfluss
wurde verworfen. Es folgte eine Zentrifugation von 1 Min bei denselben Bedingungen,
um die Säule zu trocknen. Die Säule wurde danach auf ein sauberes Eppendorfcup gesetzt und es wurden 50 µl Elutionspuffer (10 mM Tris-EDTA, pH 8.5) zugegeben. Es
wurde erneut wie oben zentrifugiert. Die Konzentrationsbestimmungen der isolierten
DNA erfolgten wie unter 3.1.2 beschrieben. Die Zusammensetzungen der Puffer wurden,
mit Ausnahme des Elutionspuffers, nicht angegeben.
3.1.4 Isolierung von DNA aus Bakterienkulturen im mg-Bereich
Um größere Mengen hochreiner Plasmid DNA zu erhalten, wurde das Plasmid Midi Kit
oder das Plasmid Maxi Kit von Jetstar, Genomed eingesetzt. Die Bakterien wurden dabei zunächst durch eine NaOH/SDS - Behandlung lysiert und Proteine und assoziierte
genomische DNA durch Kaliumacetat gefällt. Anschließend wurde über Ionenaustauschchromatographie die Plasmid DNA gewonnen.
250 ml LB-Medium mit dem entsprechenden Antibiotikum (Ampicillin, 100mg/l) wurden mit 1000 µl einer Bakterienvorkultur angeimpft und über Nacht bei 37 ◦ C (150 U/min)
inkubiert. Zum Pelletieren der Bakterien wurde die Kultur 20 min bei 10000×g (in der
Heraeus Suprafuge 22, HFA14290-Rotor) zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen
und das Pellet in 10 ml Puffer E1 resuspendiert. Zur Lyse der Bakterien wurde das
gleiche Volumen Puffer E2 zugegeben, vorsichtig gemischt und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden zur Neutralisierung 10 ml E3 zupipettiert und die
Lösung zuerst geschwenkt und dann geschüttelt. Der Niederschlag aus Proteinen, SDS
und chromosomaler DNA wurde durch 20 min Zentrifugation bei 15000×g und 20 ◦ C
(Heraeus Suprafuge 22, HFA14290 Rotor) abgetrennt. Zur Reinigung der Plasmide wurde zunächst eine Ionenaustausch-Säule mit 30 ml Puffer E4 äquilibriert. Der Überstand
der Zentrifugation wurde auf die Säule aufgetragen. Gewaschen wurde die Säule mit
1× 60 ml Puffer E5. Die Elution erfolgte mit 15 ml Puffer E6. Die eluierte Plasmid
DNA wurde mit 10,5 ml Isopropanol gefällt. Die DNA wurde durch 30 min Zentrifugation bei 15000×g und 4 ◦ C (Heraeus Suprafuge 22, Rotor 2250) pelletiert, mit 10 ml
70 % Ethanol gewaschen, erneut 15 min unter denselben Bedingungen zentrifugiert und
anschließend 10 min luftgetrocknet. Das Plasmidpellet wurde schließlich in einem entsprechenden Volumen TE Puffer gelöst, die Konzentration der DNA wurde wie oben
angegeben bestimmt[ 3.1.2].
27
3 Methoden
E1
50 mM Tris/HCl, pH 8,0
10 mM EDTA
100 µg/ml DNase-freie RNase A
E2 200 mM NaOH
1 % (w/v) SDS
E3 3.1 M Kaliumacetat, pH 5,5
E4 600 mM NaCl
100 mM Natriumacetat, pH 5,0
0,15 % (v/v) Triton X-100
E5
E6
TE
800 mM NaCl
100 mM Natriumacetat, pH 5,0
1,25 M NaCl
100 mM Natriumacetat, pH 5,0
10 mM Tris/HCl, pH 7,5
1 mM EDTA
3.1.5 Transformation von Plasmiden in Bakterien
Die Aufarbeitung folgte einer Anleitung der Firma Stratagene. Transformationskompetente Bakterien (XL1blue oder XL10gold) wurden auf Eis aufgetaut. Pro 45 µl Bakterien
wurden 2 µl Mercaptoethanol zugegeben, die Mischung für 10 Min alle 2 Min vorsichtig
gemischt. Anschließend wurden 2 µl DNA-Lösung (Ligationsansatz oder Mutageneseansatz) zu der Bakterienmischung pipettiert. Der Ansatz wurde 30 min auf Eis inkubiert.
Es folgte ein Hitzeschock der Bakterien bei 42 ◦ C im Wasserbad für 30 sec. Die Lösung
wurde 2 min auf Eis inkubiert. Dem Ansatz wurden 500 µl vorgewärmtes SOC oder
2YT-Medium zupipettiert und die Reaktion wurde 1 Stunde bei 37 ◦ C im Schüttler
inkubiert. Danach wurden je nach Ausgangskonzentration des Plasmids 50 - 200 µl des
Transformationsansatzes auf LB-Agarplatten mit 100 mg/l Ampicillin ausplattiert und
bei 37 ◦ C über Nacht inkubiert. Am nächsten Morgen wurden die Platten aus dem Inkubator genommen und bis zur Entnahme der Kolonien im Kühlraum gelagert.
Alternativ wurde die DNA in einen pCRII TOPO Vektor (Invitrogen) transformiert. Dieser Vektor kann auch DNA mit blanken Enden effektiv aufnehmen. Die Bakterien wurden
auf LB-Amp Platten, die mit X-Gal1 behandelt waren, ausplattiert und 16-20 Stunden inkubiert. Durch den eingesetzten Farbstoff konnte eine Farbselektion der Kolonien
durchgeführt werden. Diese Bakterien bzw. deren funktionstüchtige β -Galaktosidasen
setzen X-Gal enzymatisch um und bilden Galaktose und den blauen Farbstoff 5-Bromo4-Chloro-3-Indol, durch den die Kolonien blau erscheinen. Der Einbau des Fragments
1
5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-b -D-Galaktosid
28
3.1 Molekularbiologische Methoden
in die MKS (Multiple Klonierungs Stelle, die innerhalb eines 5’-Abschnitts des lac ZGens liegt) zerstört das Leseraster des lac Z-Gens, es kann keine funktionsfähige β Galaktosidase mehr gebildet werden, so dass die betreffenden Bakterien-Kolonien auch
in Gegenwart von X-Gal farblos (weiß) bleiben.
3.1.6 Restriktion von Nukleinsäuren
Die Restriktionen wurden mit den unter 2 aufgeführten Enzymen und den mitgelieferten
Puffern nach der Methode von Maniatis et al.,1989 durchgeführt. Die DNA wurde mit 15 U Restriktionsenzym pro µg DNA 1-4 h bei 37 ◦ C inkubiert. Die vollständige Spaltung
der DNA wurde auf Agarosegelen überprüft.
3.1.7 Ligation von DNA-Fragmenten
Zur Ligation wurden das rapid DNA Ligation Kit von Boehringer Mannheim und das
TOPO Iso Cloning Kit von Invitrogen eingesetzt. Das molare Verhältnis von Vector
zu Insert betrug 1:2. Das Reaktionsvolumen lag zwischen 30 µl und 70 µl. Der Ansatz
enthielt neben dem entsprechenden Reaktionspuffer 400-800 U T4-DNA Ligase. Die
Ligation erfolgte über Nacht bei 16 ◦ C oder alternativ 2-3 Stunden bei Raumtemperatur.
3.1.8 Elution von DNA aus Agarosegelen
Das GFX-DNA and Gel Purification Kit stammt von der Firma Amersham Biosciences.
Ausgeschnittene Agarosestückchen wurden gewogen und mit 1 Volumen (1 ml/mg Gel)
Extraction Puffer versetzt. Dieser Ansatz wurde 5-15 min bei 60 ◦ C im Wasserbad inkubiert und gelegentlich geschüttelt. Die Probe wurde auf eine GFX-Säule geben, 1 Minute
bei RT inkubiert und anschließend 30 sec bei 20.000×g bei RT zentrifugiert. Die Säule
wurde mit 500 µl Waschpuffer gewaschen und erneut wie oben zentrifugiert. Die Säule
wurde auf ein neues Reaktionsgefäss gesetzt und es wurden 50 µl Elutionspuffer zugeben
(z.B. 10 mM Tris pH 7,6, oder bidest. Wasser). Nach 1 Minute Inkubation bei RT wurde
wie oben zentrifugiert und die eluierte DNA aufgefangen und für die weitere Verwendung
aufbewahrt, die Konzentration der DNA wurde photometrisch wie in 3.1.2 beschrieben,
bestimmt.
Extraktionspuffer
GFX-Säule
Waschpuffer
Acetat gepufferte Lösung
und chaotrope Salze
vorgepackte Säule mit
Glasfasermatrix
10 mM Tris-EDTA, pH 8.0
80 % Ethanol p.a.
29
3 Methoden
3.1.9 Polymerase Kettenreaktion (PCR)
Die PCR beruht auf der Arbeit von Saiki et al.. Geeignete Primerpaare für die Analyse
des Gens des cardialen RyR wurden von Tiso et al. ermittelt [94] und in dieser Arbeit
übernommen, die Sequenzen der Primer finden sich im Anhang.
Ein Standardansatz enthielt in 20 µl Gesamtvolumen etwa 30 ng Matrizen-DNA, 3.2 µl
10× Taq-Puffer des Herstellers, je 50 pmol Primer, 200 µM der jeweiligen dNTPs und
2,5 U Taq DNA Polymerase. Die Komponenten des Ansatzes wurden auf Eis pipettiert,
um vorzeitige Reaktionen der Polymerase zu verhindern, gemischt und die Reaktionsgefäße in einen Thermocycler überführt. Standardmäßig wurde eine touch-down PCR
durchgeführt.
Prinzip dabei ist, dass die Annealing Temperatur in den ersten Zyklen möglichst hochgehalten wurde, um eine möglichst hohe Spezifität zu erlangen, bis eine genügend hohe
Anzahl spezifischen Templates geschaffen war. Anschließend wurde die Annealing Temperatur abgesenkt, um eine möglichst grosse Ausbeute zu erhalten. Nach Ende der PCR
wurden die Produkte auf Agarosegelen analysiert (siehe 3.3.1).
Schritt
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Temperatur [◦ C]
95
62
68
95
goto 2
59
68
95
goto 6
56
68
95
goto 10
4
End
Zeit[s]
60
70
abhängig von der zu amplifizierenden Fragmentgröße
35
3x
70
abhängig von der zu amplifizierenden Fragmentgröße
35
3x
70
abhängig von der zu amplifizierenden Fragmentgröße
35
20x
for ever
3.1.10 Gerichtete Mutagenese
Die gerichtete Mutagenese wurde mit Hilfe des ’XLII one step Mutagenesis Kits’ von
Stratagene durchgeführt, die auf einer PCR mit anschließendem Verdau mit DpnI und
folgender Transformation in ultrakompetente Zellen beruht.
Als Matrix dienten 10 ng RyR2-WT-DNA. Für die verschiedenen Mutanten wurden
30
3.1 Molekularbiologische Methoden
die entsprechenden Primer 2 im Überschuss eingesetzt, um eine möglichst hohe Annealingrate und somit eine hohe Effizienz zu erzielen (Primersequenzen siehe Anhang).
Weiterhin wurde eine für diese Zwecke speziell abgestimmte Pfu Polymerase mit proof
reading Aktivität eingesetzt, die eine sehr geringe Mutationsrate aufweist (Pfu Ultra,
Stratagene) Die Elongationszeit der PCR richtete sich nach dem eingesetzten Template.
Weiterhin wurden nur 18 Zyklen im Cycler durchgeführt, da bei weiteren Zyklen nicht
mehr im ausreichenden Maße Primer zur Verfügung stünden und somit die Effizienz der
Mutagenese verringert würde.
Temperatur [◦ C]
95
60
68
95
goto 2
4
End
Zeit[min]
2
1
22 bzw. 45
30
17x
for ever
3.1.11 Verdau mit DPNI
Die PCR Produkte wurden eine Stunde bei 37◦ C mit DpnI-Endonuklease (Erkennungssequenz: 5-Gm6 ATC-3) inkubiert, um die Matrix-DNA zu verdauen. Diese Endonuklease
schneidet spezifisch methylierte und hemimethylierte DNA [125].
3.1.12 Sequenzierung von DNA
Die Sequenzierung der DNA erfolgte auf dem ABI Prism 377-DNA Sequencer Automat, alternativ auf dem ABI-Prism 310 Kapillarsequenzier Automat. Es handelte sich
in beiden Fällen um eine Cycle-Sequenzierung.
Die DNA wurde einer PCR unterzogen, es wurde das Sequenzier Kit von ABI PRISM
benutzt, welches fluoreszenz markierte Didesoxynukleotide enthält, die bei der PCR
zu Kettenabbruch führen. Die resultierenden Fragmente wurden mittels AcrylamidGelelektrophorese oder Kapillare aufgetrennt und über ihre Fluoreszenz nachgewiesen.
Es wurde folgendes PCR-Programm verwendet:
2
24-30mere, bei denen die Mutation im mittleren Bereich liegen. Die beiden Primer-Sequenzen sind
komplementär und liegen über denselben Basen auf beiden Strängen. Die Primer wurden mit dem
Primer-Designprogramm der Firma Stratagene ausgewählt
31
3 Methoden
Temperatur [◦ C]
95
goto 60
60
95
goto 2
4
End
Zeit[s]
150
1◦ /s
240 + 5s/cycle
30
20x
for ever
3.2 Proteinisolierung aus Geweben
3.2.1 Isolierung des schweren sarkoplasmatischen Retikulums
(HSR) aus Herzgewebe
Die Aufarbeitung folgte einer Aufarbeitung von Meissner et al. [126] mit folgenden Modifikationen. Zu 60 g Ventrikel Muskel wurden 550 ml Puffer 1 gegeben und im Warring
Blendor 4×25 sec homogenisiert. Nach Zentrifugation bei 3700 ×g, 30 Minuten, 4 ◦ C
wurde der Überstand durch ein doppeltes Gazetuch filtriert. Es folgte eine erneute Zentrifugation bei 35.000×g, 4 ◦ C für 30 Minuten. Der Überstand wurde verworfen, das Pellet
wurde in 270 ml Puffer 2 aufgenommen und 90 Minuten bei 4 ◦ C inkubiert. Es folgte eine
Zentrifugation bei 70.000×g, 4 ◦ C für 30 Minuten. Das Pellet wurde in 15ml eiskalten
Puffer 3 aufgenommen und gepottert. Anschließend wurde die Lösung auf einen linearen
Sucrosegradienten (15 - 45 %) aufgetragen und 16 Stunden bei 100.000×g, 4 ◦ C in einem
swing-out Rotor zentrifugiert. Die Gradienten wurden in 1.5 ml Aliquots fraktioniert und
die einzelnen Fraktionen auf ihre 3 H-Ryanodin Bindung untersucht. Die 3 H-Ryanodin
bindenden Fraktionen wurden gepoolt. Die gepoolte Lösung wurde mit dem dreifachen
Volumen Puffer 3 versetzt und bei 100.000×g, 4 ◦ C für 60 Minuten zentrifugiert. Der
Überstand wurde verworfen, das Pellet in 4 ml eiskaltem Puffer 5 aufgenommen und
gepottert. Die Lösung wurde aliquotiert, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei
-80 ◦ C gelagert oder direkt zur RyR Anreicherung verwendet.
Puffer 1 0.1 M NaCl
0.5 mM EGTA
10 mM Na-HEPES pH 7.5
0.2 mM Pefabloc
100 nM Aprotinin
1 µM Leupeptin
1 µM Pepstatin
32
3.2 Proteinisolierung aus Geweben
1 mM Benzamidin
1 µM Calpain I
1 µM Calpain II
Puffer 2 0.6 M KCl
0.25 M Saccharose
100 µM EGTA
90 µM CaCl2
10 mM K-PIPES pH 7.0
0.2 mM Pefabloc
100 nM Aprotinin
1 µM Leupeptin
1 µM Pepstatin
1 mM Benzamidin
1 µM Calpain I
1 µM Calpain II
Puffer 3 0.1 M NaCl
0.5 mM EGTA
10 mM Na-HEPES pH 7.5
0.2 mM Pefabloc
100 nM Aprotinin
1 µM Leupeptin
1 µM Pepstatin
1 mM Benzamidin
1 µM Calpain I
1 µM Calpain II
Puffer 4 0.1 M NaCl
0.3 M Saccharose
10 mM K-PIPES pH 6.8
0.1 mM Pefabloc
Puffer 5 0.1 M NaCl
0.5 mM EGTA
10 mM Na-HEPES pH 7.5
0.2 mM Pefabloc
100 nM Aprotinin
1 µM Leupeptin
1 µM Pepstatin
1 mM Benzamidin
1 µM Calpain I
1 µM Calpain II
33
3 Methoden
3.2.2 Anreicherung des cardialen Ca2+ -Freisetzungskanals aus dem
schweren SR
Die Aufarbeitung folgte einer Aufarbeitung von Meissner [126] mit leichten Modifikationen. Die aus der HSR Präparation erhaltenen Fraktionen wurden mit dem doppelten
Volumen Puffer 6 versetzt, erst 60 Minuten auf Eis und anschließend 30 Minuten bei
RT inkubiert. Die Lösung wurde auf einen linearen Sucrosegradienten (10-30 %Sucrose)aufgetragen und 16 Stunden bei 120.000×g, 4 ◦ C zentrifugiert. Die Gradienten wurden
in 1ml Fraktionen aliquotiert und einem 3 H-Ryanodin Bindungstest unterzogen. Die 3 HRyanodin bindenden Fraktionen wurden in Aliquots unterteilt und in flüssigem Stickstoff
schockgefroren bzw. direkt zur Einzelkanalmessung verwendet.
Puffer 6 2.1 M NaCl
0.2 mM EGTA
40 mM Na-PIPES pH 7.2
0.2 mM EGTA
0.3 mM CaCl2
1.6 % CHAPS3
5 mg/ml Phosphatidylcholin
1 mM DTT
0.1 mM Pefabloc
100 nM Aprotinin
je 1 µM Leupeptin
1 µM Pepstatin
1 mM Benzamidin
1 µM Calpain I
1 µM Calpain II
3.2.3 3 H-Ryanodin Bindungstest
Der Test folgte einer Anleitung von Meissner [126] mit leichten Modifikationen. Zu einem
25 µl Aliquot der Sucrose Gradienten wurde 25 µl 3 H-Ryanodin enthaltender Probenpuffer gegeben. Die Konzentration des 3 H-Ryanodin betrug 10 nM, die Aktivität betrug
0.36 Bq. Die Lösung wurde 30 Min bei 37 ◦ C im Wasserbad inkubiert. Anschließend wurde über einen Filter (Whatman, Typ GF/B) abgenutscht und mit 3×5 ml Waschpuffer
gewaschen. Das Filterpapier wurde nach Trocknung in ein Szintillationsgefäß gegeben,
mit Safety-Szinti -Lösung (Fa. Baker) überschichtet und im Szintillator analysiert.
34
3.3 Analytisch Chemische Methoden
Ryanodin Bindungspuffer
Waschpuffer
1 M NaCl
20 mM MOPS
40 mM Na-PIPES pH 7.2
10 nM Ryanodin
5 µM CaCl2
0.2 M NaCl
10 mM MOPS
50 µM CaCl2
3.3 Analytisch Chemische Methoden
3.3.1 horizontale Agarosegelelektrophorese
Die Durchführung erfolte wie in Maniatis [127] beschrieben mit leichten Modifikationen. Zur Überprüfung des Erfolgs von enzymatischen Schritten oder zur Gewinnung von
DNA- Fragmenten wurden horizontale Agarosegele verwendet. Je nach Größe der zu untersuchenden DNA-Fragmente wurden Agarose-Konzentrationen von 0,5-2 % gewählt.
Die Agarose wurde im entsprechenden Volumen 1× TBE Laufpuffer mit EthidiumbromidLösung (Endkonzentration 50 µg/l) suspendiert. Die Agarose wurde durch Hitze gelöst
und in Gelschlitten mit entsprechenden Kämmen gegossen. Nach der Polymerisation
wurde der Kamm gezogen und das Gel in eine mit 1× TBE, ebenfalls mit Ethidiumbromid in einer Konzentration von 50 µg/l versetzt, gefüllte Gelkammer gesetzt. Das Gel
war dabei vollständig mit Laufpuffer bedeckt. Die zu analysierende DNA-Lösung wurde
mit 1/10 Volumen Ladepuffer (Zusammensetzung siehe Material) beschwert und in die
Geltaschen pipettiert. Die Elektrophorese erfolgte bei Feldstärken von 5-10 V/cm. Die
DNA Fragmente wurden durch Fluoreszenz des in die DNA interkalierten Ethidiumbromids unter UV-Licht bei 312 nm sichtbar gemacht.
3.3.2 SDS-Polyacrylamid Gelelektrophorese
Die Durchführung erfolte wie in Maniatis [127] beschrieben mit leichten Modifikationen.
Zur analytischen Auftrennung von Proteinen wurden SDS-Polyacrylamidgele mit diskontinuierlichem Puffersystem verwendet. Trenn- und Sammelgele wurden nach den in Tabelle 3.3.2 angegebenen Rezepturen hergestellt. Die Trenngellösung wurde zwischen zwei
Glasplatten, die zunächst durch eine Gummidichtung abgedichtet sind, gegossen und
mit etwas Isobutanol zur Verhinderung der Ausbildung eines Meniskus überschichtet.
Nach Polymerisation des Gels wurde das Sammelgel gegossen, in das die Probentaschen
durch Einführen eines Teflonkamms einpolymerisiert wurden. Die Proteinproben wurden
vor dem Gellauf in 2× Laemmli-Probenpuffer [128] (Zusammensetzung siehe Material)
für 5 min auf 95 ◦ C erhitzt. Als Proteingrößenstandard (Marker) wurde HMW (highmolecular weight Puffer, Firma Roth) verwendet. Die Elektrophorese erfolgte bei 10 mA
im Sammelgel und 20 mA im Trenngel unter Verwendung von SDS-PAGE-Laufpuffer
35
3 Methoden
(Zusammensetzung siehe 2).
3%
AA-Stammlösung/ml
0,25
H2O/ml
0,92
1 M Tris/HCl pH 8,8/ml
2,81
0,25 M Tris/HCl pH 6,8/ml 1,25
10 % (w/v) SDS/µl
50
10 % (w/v) AMPS/µl
30
TEMED/µl
3
Gesamtvol./ml
2,5
Sammelgel
5%
0,42
0,75
5%
1,25
3,23
6%
1,5
2,98
2,81
1,25
150
60
4
7,5
Trenngel
7,5%
1,88
2,6
Tabelle 3.1: SDS-PAA Gelzusammensetzung für ein Gel
3.4 Zellkultur
Es wurden HEK293 (Human Embryonic Kidney; Typenbezeichnung nach der American
Type Culture Collection (ATCC, 1998): CRL-1573; Graham et al., 1977, freundliche
Gabe des Lehrstuhls für Pharmakologie und Toxikologie der Ruhr-Universität Bochum)
in dieser Arbeit eingesetzt.
3.4.1 Kultivierung der Zellen
Die Durchführung entsprach einer Anleitung von Chen et al. [129] mit leichten Modifikationen. Die Zelllinien wurden in den entsprechenden Nährmedien (Zusammensetzung
der zellspezifischen Medien siehe Material) in Gegenwart von 10 % FCS (fetal calf serum) unter Standardbedingungen (37 ◦ C, 5 % CO2 , 90 % relativer Luftfeuchtigkeit)
kultiviert. Dazu wurden Standard 250 ml Kulturflaschen (Fläche: 75 cm2 , Fa. Nunc)
mit 40 ml Mediumüberstand oder Kulturschalen (d = 150 mm; Fläche: 56,7 cm2 ; Fa.
Nunc) mit 20 ml Mediumüberstand verwendet.
3.4.2 Bestimmung der Zellzahl
Zur Bestimmung der Zellzahl wurde eine Neubauer-Zählkammer verwendet. Diese Kammer hat eine Tiefe von 0.1 mm, weshalb das Volumen in einem Großquadrat genau
1 mm 3 beträgt. Auf die Zählkammer wurde ein leicht angefeuchtetes Deckgläschen gelegt
und leicht angepreßt, sodass Newtonsche Ringe erkennbar ware. Anschließend wurde die
Zellsuspension unter das Deckgläschen pipettiert und die vier Großquadrate ausgezählt.
Aus dem Mittelwert der Großquadrate ergibt sich wie folgt die Zellzahl: Zellzahl/ml =
Mittelwert ×104 .
36
3.4 Zellkultur
3.4.3 Auftauen und Einfrieren von Zellen
Die Durchführung erfolgte nach einer Anleitung von Maniatis [127] mit leichten Modifikationen. Zum Auftauen von Zellen wurde die Probe im Wasserbad bei 37 ◦ C zügig
angetaut und sofort in 10 ml des Kulturmediums überführt. Nach Pelletieren der Zellen
wurden diese in frischem Kulturmedium (Zusammensetzung siehe 2) resuspendiert und
kultiviert. Am folgenden Tag wurden die Zellen erneut umgesetzt.
Zum Einfrieren wurden Zellen zwischen der vierten und siebten Passage verwendet. Die
Zellen wurden wie zum Passagieren mit Trypsin von den Kulturflaschen gelöst und pelletiert. Nach Waschen mit Kulturmedium und erneuter Zentrifugation wurden die Zellen
im Einfriermedium (Zusammensetzung siehe 2) resuspendiert und in Kryoröhrchen aliquotiert. Diese wurden über Nacht in einer geschlossenen Styroporbox 24 h bei -70 ◦ C
eingefroren, bevor sie zur Dauerlagerung in flüssigen Stickstoff überführt wurden.
3.4.4 Umsetzen von Zellen
Die Durchführung erfolgte nach einer Anleitung von Maniatis [127] mit leichten Modifikationen. Die Zellen wurden bei Erreichen einer konfluenten, zweidimensionalen Bedeckung
des Zellkulturgefäßes umgesetzt (alle 3-4 Tage). Dazu wurde das überstehende Medium
(konditioniertes Medium) abgesaugt, die Zellen zweimal mit PBS (frei von Ca2+ /Mg2+ Ionen) gewaschen und für 2-5 min mit Trypsin (0,25 (w/v) pro ml Kultur) behandelt.
Durch Zugabe von frischem Nährmedium wurde das Trypsin inhibiert, die Zellen wurden
für 5 min bei 1000×g (Minfuge, Fa. Haereus) zentrifugiert. Nachdem das überstehende
Medium verworfen worden war, wurde das Zellpellet in frischem Medium resuspendiert
und die Zelldichte in einer Neubauer-Zählkammer bestimmt. Die Zellen wurden mit einer Dichte von 3×104 Zellen pro 75 cm2 Kultur ausgesät, für die Transfektion wurde die
Zelldichte auf 1×106 Zellen pro Flasche angehoben.
3.4.5 Transfektion von Zellen nach der Calciumphosphat-Methode
Die Durchführung entsprach einer Anleitung von Chen et al. [129] mit leichten Modifikationen. Bei der Transfektion von Gewebekulturen wurden die Zellen einen Tag vorher mit
einer Dichte von 5×105 pro Kulturschale (Fläche: 75 cm2 , 10 ml Medium) ausgesät und
über Nacht kultiviert, insgesamt 18-22 Stunden. Zur Herstellung der Transfektionslösung
wurden in einem Reaktionsgefäß 30 µg Plasmid-DNA (in Shuttleexpressionsvektor) in
750 µl einer 250 mM CaCl2 -Lösung gelöst. In einem zweiten Reaktionsgefäß wurden
750 µl 2× BES-Puffer (pH 6,95 bei 20 ◦ C) vorgelegt und anschließend die DNA-Lösung
tropfenweise zupipettiert. Nachdem die Transfektionslösung gut durchmischt worden
war, wurde sie für 20 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend tropfenweise
auf die Zellen gegeben. Durch Schwenken der Kulturschale wurde die Transfektionslösung
im Medium verteilt. Nach einer Inkubation von 15 - 24 h bei 3 % CO2 , 35 ◦ C und 95 %
relativer Luftfeuchtigkeit wurde das Medium gewechselt und die Zellen weitere 24 Stun-
37
3 Methoden
den bei Standardbedingungen (8 % CO2 , 37 ◦ C und 95 % relativer Luftfeuchtigkeit)
inkubiert. Die Zellen wurden umgesetzt und dabei 1:10 verdünnt. Nach weiteren 24-48
Stunden wurden die Zellen geerntet.
3.4.6 Aufarbeitung des cardialen Ryanodin-Rezeptors aus HEK293
Zellen
Die Durchführung entsprach einer Anleitung von Du et al. [50] mit leichten Modifikationen. Die transfizierten Zellen wurden 2× mit je 5 ml 1×PBS pro Petrischale gewaschen
und in 5 ml PBS mit 5 mM EDTA aufgenommen. Nach Zentrifugation bei 2000×g, 4 ◦ C,
10 Minuten wurde der Überstand verworfen, das Pellet in 5 ml PBS aufgenommen und
wie oben zentrifugiert. Das Pellet wurde in 1 ml Puffer 1 aufgenommen und 1 Stunde
auf Eis solubilisiert. Zur Abtrennung der Zelltrümmer wurde der Ansatz 20 Minuten
bei 4 ◦ C, 8000×g zentrifugiert. Der Überstand wurde erneut bei 4 ◦ C, 45.000×g für
60 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Pellet in einem möglichst
kleinen Volumen Puffer 2 aufgenommen und 60 Minuten auf Eis inkubiert. Der Ansatz
wurde bei 4◦ C, 45.000×g für 30 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde auf einen
linearen Sucrosegradienten (5 - 25 % Sucrose) aufgetragen. Dieser Ansatz wurde in einem
swing-out Rotor 16 Stunden bei 4 ◦ C, 120.000×g zentrifugiert. Nach der Zentrifugation
wurden die Gradienten aliquotiert und einem 3 H-Ryanodin Bindungstest unterzogen. Die
3
H-Ryanodin bindenden Fraktionen wurden gepoolt und in 200 µl Aliquots in flüssigem
Stickstoff schockgefroren, oder direkt für die Einzelkanalmessungen verwendet.
38
3.5 Einzelstrang Konformations Polymorphismus Analyse (SSCP)
Puffer 1 0.15 M NaCl
50 mM Tris-HCl, pH 8.0
1 % Chaps
5 mg/ml Phosphatidylcholin
0.1 mM Pefabloc
1 mM Benzamidin
1 µg/ml Aprotinin
1 µg/ml Leupeptin
1 µg/ml Pepstatin
Puffer 2 1 M NaCl
50 mM HEPES, pH 8.0
1 % Chaps
5 mg/ml Phosphatidylcholin
0.1 mM Pefabloc
1 mM Benzamidin
1 µg/ml Aprotinin
1 µg/ml Leupeptin
1 µg/ml Pepstatin
Sucrosegradient
5 bzw. 25 % Sucrose
0.3 M NaCl
50 mM Tris-HEPES, pH 7.4
0.3 % Chaps
0.15 % Phosphatidylcholin
0.1 mM Pefabloc
1 mM Benzamidin
1 µg/ml Aprotinin
1 µg/ml Leupeptin
1 µg/ml Pepstatin
3.5 Einzelstrang Konformations Polymorphismus
Analyse (SSCP)
Bei der Einzelstrang Konformations Polymorphismus Analyse (Single Strand Conformation Polymorphism, SSCP) [130] wird ein PCR-Produkt durch Hitze denaturiert,
wodurch einzelne DNA-Stränge entstehen. Durch schnelles Abkühlen der DNA und Zusatz von Formaldehyd zu der Probe wird die Rückbildung des Doppelstrangs verhindert.
39
3 Methoden
Die einzelsträngige DNA bindet mit sich selbst und bildet dabei hochkomplexe, nicht
vorhersehbare Strukturen aus, die von der Sequenz der einzelsträngigen DNA abhängen.
Der Tausch einer einzelnen Base kann die Sekundärstruktur grundlegend verändern.
Dadurch werden die Laufeigenschaften der DNA in einem nativen Polyacryamidgel zum
Teil drastisch verändert. Die Sekundärstrukturen entstehen durch elektrostatische Bindungen, sowie durch Basenpaarungen zwischen komplementären Sequenzabschnitten.
Die SSCP benötigt als eine Voraussetzung eine bestimmte Fragmentgrösse des zu untersuchenden Amplifikats. So können nur Proben mit einer Länge zwischen 150 und etwa
300 Basenpaaren mit dieser Methode verlässlich untersucht werden. Sind die Stücke zu
kurz oder zu lang, kann sich in der denaturierten Probe die einzelsträngige DNA nicht
zu dreidimensionalen Strukturen ausbilden, die unter nicht-denaturierenden Bedingungen in einem Acrylamidgel detektiert werden können. Aus diesem Grund wurden die
Primersequenzen so gewählt, dass die erhaltenen Fragmente in diesem Grössenbereich
liegen. Eine Abweichung im mittleren Bereich des Amplifikats hat einen grossen Einfluss
auf die Ausbildung der dreidimensionalen Struktur, wohingegen Abweichungen in den
Randbereichen der Probe nur einen geringen strukturgebenden Anteil haben. Deshalb
ist die Detektion einer Abweichung in der Mitte eines Fragments leichter möglich, als in
den Randbereichen. Aus diesem Grund wurden die Primer so gewählt, dass das Exon in
der Mitte des Fragments lag und von Intronbereichen flankiert wurde (Primersequenzen
siehe Anhang). Da nicht alle Basenabweichungen innerhalb eines Bereichs unter denselben Laufbedingungen zu einer Änderung des Laufverhaltens der Probe im Gel führte,
wurden routinemäßig 4 verschiedene Laufbedingungen für jedes untersuchte Exon durchgeführt.
Die Amplifikate der PCR wurden mit 7 µl denaturierendem Probenpuffer (Zusammensetzung siehe Kap. 2, Materialien) versetzt und für 2 Min bei 95 ◦ C hitzedenaturiert.
Anschließend wurden die Proben sofort auf Eis gestellt, um eine Renaturierung der DNA
zu verhindern.
Die denaturierten Proben wurden auf ein natives Polyacrylamidgel aufgetragen und die
Elektrophorese erfolgte bei konstant gehaltener Leistung.
Da die Laufeigenschaften stark von der Temperatur abhängig waren, wurden die Analysen bei zwei verschiedenen Temperaturen (4 ◦ C und Raumtemperatur) durchgeführt.
Die Temperatur durfte nicht zu hoch sein, um ein Schmelzen der Sekundärstrukturen
der einzelsträngigen DNA zu verhindern. Die Laufstrecke sollte möglichst lang sein, um
auch geringe Mobilitätsänderungen detektieren zu können. Im Anschluss an die Elektrophorese wurde die DNA mittels Silberfärbung (Orita, 1991) angefärbt.
3.5.1 Gelelektrophorese nativer Acrylamidgele
Für den Agaroseteil (Zusammensetzung siehe Kap. 2) wurden alle Komponenten gemischt, die Agarose durch Erhitzen geschmolzen und die Mischung wurde auf 50 ◦ C
abgekühlt. Der Acrylamid Teil (Zusammensetzung siehe Kap. 2) wurde auf 45 ◦ C im
Wasserbad erwärmt, dann wurde der Agaroseteil zugegeben. Es folgte die Zugabe von je
40
3.6 Schmelztemperaturanalyse
100 µl APS 4 (10 %) und TEMED 5 zum Start der Polymerisation, es wurde gemischt
und die Lösung wurde in die auf 50 ◦ C vorgewärmten Glasplatten (30×40 cm, 0.4 mm
Spacer, vorbehandelt mit blueslick, Serva, zur Verhinderung des Anhaftens des Gels an
die Glasplatten) Luftblasenfrei gegossen. Das Gel wurde über Nacht, mindestens aber
3 Stunden, polymerisiert. Die Elektrophorese erfolgte bei konstant 2 / 15 / 18 oder
40 Watt, entweder bei Raumtemperatur, oder bei 4 ◦ C.
3.5.2 Silberfärbung von DNA in nativen Acrylamidgelen
Die Färbung erfolgte nach einer Anleitung von Bassam et al. [131]. Nach der Elektrophorese wurde das Gel von den Glasplatten gelöst und für 20 Minuten in 10 prozentiger
Essigsäure, zum Stoppen der Diffusion im Gel, inkubiert. Mit Wasser wurde 3 mal je
2 Minuten gewaschen, anschließend folgte die Färbung für 30 Minuten mit einer Lösung
aus 1.5 g/l Silbernitrat und 0.15 % Formaldehyd in Wasser. Mit Wasser wurde 20 sec
gespült. Die Entwicklung erfolgte durch eine Lösung aus 60 g/l Di-Natriumcarbonat,
0.15 % Formaldehyd und 40mg/l Natriumthiosulfat in Wasser. Die Entwickler-Lösung
war auf 4 ◦ C gekühlt, um eine langsame, kontrollierbare Entwicklung zu gewährleisten.
Die Abstoppung dieser Reaktion erfolgte mit 10 %iger Essigsäure, ebenfalls auf 4 ◦ C
gekühlt. Um die Gele lagern und dokumentieren zu können, wurden sie auf Whatman
Papier aufgezogen und an der Luft getrocknet. Die Auswertung der Gele erfolgte im
trockenen Zustand.
3.6 Schmelztemperaturanalyse
Die Real-Time PCR beruht auf der Messung einer Fluoreszenz-Änderung während einer
PCR, z.B. durch die Interaktion eines Fluoreszenzfarbstoffes mit der amplifizierten DNA.
Fluoreszenz ist die Eigenschaft eines Stoffes (Chromophor), nach Anregung mit Licht
ein Fluoreszenzlicht, das längerwellig (rotverschoben) als das eingestrahlte Licht ist,
abzugeben. Die Verschiebung der Absorptions- und Emissionsmaxima liegt zwischen 15
und 40 nm (Stokes-Shift). Ein gutes Fluorophor sollte also eine starke Absorption und
einen großen Stokes-Shift haben. Weiterhin muss das eingestrahlte Licht in der Nähe des
Absorptionsmaximums des Fluorophors liegen, um einen hohen Extinktionskoeffizienten
zu erhalten. Um Fluoreszenz-Signale zu erzeugen, die reaktionsabhängig sind, kann man
mehrere Methoden einsetzen. Zum einen ist der Einsatz eines Farbstoffes möglich, der
fluoresziert, wenn er mit DNA interagiert.
Ein zweiter Ansatz ist der Einsatz von Sequenz-spezifischen Sonden. Die Methode beruht
darauf, dass Fluorophore durch benachbarte Chromophore ’gequencht’ werden können.
Dies führt zu einer veränderten Fluoreszenz: die Fluoreszenz kann abgeschwächt werden,
aber es kann auch zu einer Übertragung der Energie eines Fluorophors auf ein anderes
4
5
Ammoniumpersulfat
NNN’N’-Tetramethylethylendiamin
41
3 Methoden
kommen. Diesen Effekt nennt man Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET).
Blauer
Laser
FRET Probe
FITC
RED 640
Downstram Sensor
FRET Probe
F
Abbildung 3.1: Das Prinzip der real-time PCR beruht darauf, dass Fluorophore durch benachbarte Chromophore ’gequencht’ werden können. Die Fluorophore werden mit einer blaulicht emittierenden Diode bestrahlt. Das mit der DNA assoziierte Donorfluorophor (Fluorescein) wird dadurch spezifisch angeregt und überträgt seine Energie strahlungslos auf den
Akzeptor (Light Cycler red). Dieser emittiert Licht einer höheren Wellenlänge, das detektiert
werden kann. Diesen Effekt nennt man Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET).
Diesen Effekt macht sich dieser Ansatz zu Nutze. Die Sonden sind kurze, einzelsträngige Oligonukleotide, die auf einer DNA-Sequenz auf demselben Strang in enger Nachbarschaft hybridisieren können. Der Abstand beträgt normalerweise 1-5 Nukleotide. Das
Prinzip ist, dass es nur dann zu einer Fluoreszenz kommen kann, wenn beide Fluorophore in enger räumlicher Nähe sind.
Das Donorfluorophor (Fluorescein) wird mit einer blauen LED-Quelle angeregt und
überträgt dann seine Energie strahlungslos auf den Akzeptor (Light Cycler Red). Dieser
emittierte dann Licht einer höheren Wellenlänge (rot), das detektiert werden kann. Dieser Energietransfer ist nur dann möglich, wenn beide Sonden an der Zielsequenz binden.
Die Menge der hybridisierenden Sondenpaare steigt im gleichen Maße wie das PCRProdukt und somit ist das Signal der Menge des Produktes proportional.
Die Sonden liegen benachbart auf einem Strang der DNA. Eine der Sonden hat am 3’Ende ein Fluorescein, die andere ist am 5’-Ende mit einem Farbstoff versehen (LC Red
640), die 3’-Hydroxygruppe dieser Sonde ist durch eine Phosphatmodifikation gegen die
Verlängerung durch die Polymerase blockiert. Diese Sonden können in mehreren Bereichen eingesetzt werden. Zum einen können dadurch Quantifizierungen spezifisch für die
Zielsequenz durchgeführt werden, zum anderen kann diese Methode zur Genotypisierung
eingesetzt werden.
3.6.1 Schmelzpunktanalyse mittels HybProbes
Für die Schmelztemperaturanalyse überdeckte die eine Sonde die zu untersuchende,
variable Sequenz (Sensorsonde), die ihr benachbarte Ankersonde besaß einen höheren
Schmelzpunkt, band also stärker. Somit hing der gemessene Schmelzpunkt hauptsächlich
von der Bindung der Sensorprobe ab.
42
3.7 Einzelkanalmessungen
Der Light-Cycler, Fa. Roche wurde für diese Analysen eingesetzt. Nach erfolgter Denaturierung (30 sec, 95 ◦ C) wurden die Sonden an die DNA hybridisiert (20 sec, 30 ◦ C).
Es folgte eine langsame Temperaturerhöhung (0.2 ◦ C/s), während der die Abnahme der
Fluoreszenz durch das Ablösen der Sonden von der DNA kontinuierlich gemessen wurde.
Jede Abweichung der Sequenz unter der Sensorsonde und Ankersonde führte zu einer
schlechteren Bindung der Sonden zum Target und somit zur Schmelzpunkterniedrigung.
Eine homozygote Probe, die der Sequenz der Sonde entsprach, sollte somit einem hohen Schmelzpunkt entsprechen, eine homozygote, von der Sondensequenz abweichende
Probe, sollte einen niedrigeren Schmelzpunkt haben und eine heterozygote Probe würde
zwei unterschiedliche Schmelzpunkte besitzen.
Der Unterschied der Schmelzpunkte lag bei 10 ◦ C, wenn eine einzige Base ausgetauscht
wurde. Wurden zwei Basen ausgetauscht, erniedrigte sich die Schmelztemperatur um
weitere 10 ◦ C.
3.7 Einzelkanalmessungen
Im Rahmen dieser Arbeit wurde unter Anleitung von Prof. Dr. I. Jona, Universität Debrecen, Ungarn und unter Mithilfe von PD Dr. R. Thieleczek, Ruhr-Universität Bochum,
eine Anlage zur Messung von Einzelkanal Aktivitäten etabliert.
3.7.1 Messeinrichtung
Die Anlage besteht aus einer Messzelle, einem Digital-Analog (AD/DA) Wandler, einem
Verstärker und einem Computer zur Datenaufnahme und -analyse. Die Messzelle besitzt
zwei Kammern. Die Kammern stehen über eine Lipiddoppelschicht, die ein 250 µm großes
Loch überspannt, in Kontakt. In jede der Kammern wurde eine Ag/AgCl-Elektrode
eingeführt. Die gemessenen Membran-Ströme wurden durch einen Picoamper-Verstärker
verstärkt und durch den Wandler in ein digitales Signal umgewandelt, welches dann im
Rechner aufgezeichnet und gespeichert werden konnte.
3.7.2 Aufbau und Eigenschaften von Bilayern
Für Einzelkanalmessungen benötigt man eine künstliche Membran, in die der Kanal
inkorporiert werden kann. Diese künstlichen Membranen werden aus Phospholipiden
hergestellt.
Die Membranen bestehen immer aus mindestens zwei Komponenten, einem amphipathischen Material und einem organischen Lösungsmittel. Kommen weitere Komponenten dazu, kann die Stabilität der Membran erhöht werden. Zur Nachbildung einer Plasmamembran werden zumeist Phosphatidylcholin, Phosphatidylserin und Phosphatidylethanolamin verwendet. Die Stabilität der daraus gebildeten Membran kann
43
3 Methoden
FaradayKäfig
Computer
AnalogDigitalWandler
Verstärker
Messzelle
mit Magnetrührer
Abbildung 3.2: Aufbau der Anlage zur Einzelkanalmessung. Die über die Elektroden in der
Messzelle gemessenen Membran-Ströme wurden durch den Picoampere-Verstärker amplifiziert,
über den Analog-Digitalwandler in digitale Signale umgerechnet und konnten dann am Computer mit Hilfe des Programms Clampex, Firma Axon aufgezeichnet werden.
durch Variation der Anteile der einzelnen Lipide beeinflusst werden. Während L-αDiphytanoylphosphatidylcholin und Phosphatidylethanolamin elektrisch neutral sind,
ist Phosphatidylserin negativ.
War bei einem Experiment die Stabilität der Membran nicht ausreichend, so konnte der
Anteil an L-α-Diphytanoylphosphatidylcholin erhöht werden. War der Einbau eines Rezeptors nur schwer zu erreichen, führte eine Erniedrigung der Membranstabilität durch
Erhöhung des Phosphatidylserin-Anteils häufig zum Erfolg.
Somit kann die Lipidzusammensetzung auf die Ansprüche des Rezeptors angepasst werden.
Der Grund für diese modifizierenden Eigenschaften liegt an der unterschiedlichen Polarität der Kopfgruppen dieser Phospholipide. Während Bilayer mit positiv geladenen
Kopfgruppen sensitiv für Anionen sind, sind negativ geladene Lipide sensitiv für Kationen.
3.7.3 Herstellung künstlicher Lipid-Bilayer
Es wurde für den rekombinanten Ryanodin-Rezeptor eine Mischung aus fünf Teilen Phosphatidylethanolamin und drei Teilen L-α-Diphytanoylphosphatidylcholin, beide in Chloroform gelöst, hergestellt. Diese Mischung bildet eine sehr stabile Membran, bei anderen
Mischungen führte die Inkorporation eines Rezeptors zur Ruption der Membran. Für
den nativen Ryanodin-Rezeptor wurde eine Lipidzusammensetzung von fünf Teilen Lα-Diphytanoylphosphatidylcholin, vier Teilen Phosphatidylethanolamin und einem Teil
Phosphatidylserin verwendet, was die Inkorporation des Rezeptors wesentlich erleichterte.
44
3.7 Einzelkanalmessungen
Das Chloroform musste rückstandslos entfernt werden. Das Lösungsmittel wurde deshalb unter Argonfluss verdampft, die Lipide mit n-Decan gewaschen und erneut unter
Argon getrocknet. Die Mischung wurde in einer Konzentration von 35 mg/ml in n-Decan
gelöst und bei -80 ◦ C gelagert.
Die Teflonkammer wurde rund um das Loch mit Lipiden benetzt und unter Argonatmosphäre 30 Minuten getrocknet. Anschließend wurde die Teflonkammer in die äußere
Kammer der Messaparatur eingesetzt. Es wurden je 3 ml Bilayer-Puffers in beide Kammern gegeben.
Puffer:
250 mM KCl
20 mM Na-Pipes, pH 7.2
0.1 mM EGTA
0.15 mM CaCl2
Mit Hilfe eines mit Lipiden benetzten Teflonstabs wurde die Lipidmischung auf die
Öffnung der Teflonkammer aufgetragen. Während der Formation aggregierten an beiden
Seiten der Öl-Wasser Grenzfläche die oberflächenaktiven Moleküle zu Monolayern. Das
Lösungsmittel zwischen diesen Monolayern wurde verdrängt, der Bilayer konnte sich
spontan ausbilden.
A
B
N-Decan
Wässrige
Lösung
Abbildung 3.3: Nach Auftragen der Lipidmischung auf die Kammeröffnung bildete sich eine
dicke Lipidschicht aus, die die beiden Pufferreservoirs voneinander trennt. Aus dieser dicken
Lipidschicht bildet sich spontan ein Bilayer. a zeigt ein Foto der Bildung eines Bilayers. b zeigt
das Prinzip der Bilayerbildung: Während der Formation aggregieren an beiden Seiten der ÖlWasser Grenzfläche die oberflächenaktiven Moleküle zu Monolayern. Das Lösungsmittel wird
zwischen diesen Monolayer verdrängt, der Bilayer kann sich ausbilden, Abb. nach [132].
Der Vorgang der Bilayerbildung konnte am Verhalten des Membranstroms beobachtet
werden. Während der Membranbildung wurde auf die Elektroden ein externer Spannungsgradient angelegt. Es handelte sich um eine Dreieckwelle mit einer Amplitude
von 10 mV und einer Frequenz von 45Hz. Gleichzeitig wurde durch die Elektroden der
Strom gemessen. Bildet sich eine Lipiddoppelschicht, so verhält sich diese elektrisch wie
ein Kondensator. Dieser wird der Dreieckwelle entsprechend ge- und entladen. Durch
Zufügung einer Gleichspannung von bis zu etwa 180 mV kann die Amplitude des kapazitiven Stroms und damit die Ausbildung eines Bilayers verfolgt werden. Die Kapazität
45
3 Methoden
der Membran ist dabei umgekehrt proportional zu ihrer Dicke und proportional zu ihrer
Fläche. Auch das Ausdünnen der Membran zu einem Bilayer lässt sich durch Zunahme
der Membran-Kapazität und damit des Membran-Stroms beobachten.
Nach Bildung des Bilayers (Abschäzung der Dicke und Größe erfolgte anhand des kapazitiven Stroms) wurde auf Membranstrommessung im Picoampere Bereich umgeschaltet.
Ein Aliquot des entsprechenden Ryanodin-Rezeptors/Ca2+ -Freisetzungskanals mit einer
Konzentration von 1-10 µg/ml wurde in die Teflonkammer pipettiert, und die Lösung
wurde gerührt. Der Einbau eines Kanals in die künstliche Lipiddoppelschicht erfolgte nach dem Zufallsprinzip. Man konnte die Wahrscheinlichkeit eines Einbaus jedoch
erhöhen, wenn das Haltepotential gewechselt, der angelegte Strom verändert und die
Lösung ständig gerührt wurde. Der Einbau eines Kanalmoleküls konnte durch eine charakteristische Änderung der Leitfähigkeit der Membran nachgewiesen werden.
Die freie [Ca2+ ] lag zu Beginn des Experiments bei 50 µM. Bei dieser Konzentration ist
die Öffnungswahrscheinlichkeit des Kanals maximal. Als nächstes musste die Orientierung des Kanals in der Membran ermittelt werden, da manche Effektoren nur an der
cytosolischen (cis), andere nur an der luminalen (trans) Seite des Rezeptors eine Wirkung zeigen.
Es erfolgte zunächst die Zugabe von 40 µl 100 mM EGTA zur Teflonkammer. Durch
das EGTA nahm die freie [Ca2+ ] auf submikromolares Niveau ab. Verringerte sich die
Öffnungswahrscheinlichkeit des Kanals durch die EGTA-Zugabe, so lag die cytosolische
Seite des Kanals in dieser Kammer vor. Zeigte sich nach erneuter Einstellung des Gleichgewichts in der Lösung (etwa nach 5 Minuten) kein Effekt, so wurde die Konzentration an
freiem Ca2+ wieder auf den ursprünglichen Wert durch Zugabe von 40 µl 100 mM CaCl2
angehoben. Anschließend wurde mit der anderen Kammer dieselbe Prozedur wiederholt.
Im Allgemeinen war dadurch die Orientierung des Kanals in der Membran sicher zu
klären. Anschließend wurden Modulatoren des Kanals, ATP und Ryanodin, in unterschiedlichen Konzentrationen zugegeben und der Membranstrom A, die Zeitkonstante
der Öffnungsereignisse τ und die Öffnungswahrscheinlichkeit Po des Kanals ermittelt.
Aus dem Membranstrom wurde letztlich die spezifische Leitfähigkeit des Kanals ermittelt. Dabei wurde immer mindestens fünf Minuten nach Zugabe eines Modulators
gewartet, um sicherzustellen, dass die Lösung ein neues Äquilibrium erreicht hatte. Die
Diffusionsgeschwindigkeit der verschiedenen Substanzen ist abhängig von deren Größe.
Während ein Effekt bei Ca2+ und EGTA bereits nach ein bis zwei Minuten erkennbar
war, benötigte der Effekt von Ryanodin etwa die doppelte Zeit.
Die Messungen wurden für die nativen Rezeptoren und die rekombinanten Rezeptoren
(Wildtyp und Mutanten) auf dieselbe Weise durchgeführt.
Auswertung der Bilayer-Messungen
Die Auswertung der Bilayer-Messungen erfolgte mit Hilfe des Programms Clampfit der
Firma Axon. Bei der Auswertung der Öffnungsereignisse wurden alle Signale, die kürzer
als 0.4 ms waren diskriminiert. Dies entspricht mehr als der doppelten Ansprechzeit des
Filters (4-Pol-Besselfilter), der zur Filterung des Rauschens bei der Detektion benutzt
46
3.7 Einzelkanalmessungen
wurde. Erst Signale, die über diesem Schwellenwert liegen konnten als valide angesehen
werden.
Die Rohdaten wurden dann mit der Annäherung an verschiedene Funktionen ausgewertet. Die Strom-Amplituden im geschlossenem (c) und offenen (o) Zustand des Kanals
wurden als Histogram dargestellt und in beiden Fällen durch eine Summe von Gaussfunktionen angenähert.
−(χ−µ2 )/2σ 2
f (x) = ni=1 Ai × e σ √i2π i + C
i
Dabei entspricht Ai der Häufigkeits-Amplitude, µi der mittleren Stromamplitude, σi
der Standardabweichung der Stromamplitude und C einem Offset der Komponente i.
P
Die Öffnungswahrscheinlichkeit Po des Kanals ist bestimmt durch das Verhältnis der
Flächen unter den Gausskurven, die dem geschlossenen (ac σc ) und offenen (ao σo ) Zustand
repräsentieren.
Po = 1+ a1c ·σc
ao ·σo
Die Öffnungszeiten des Kanals folgen einer exponentiellen Wahrscheinlichkeitsfunktion
der Form:
P
f (t) = ni=1 Pi τi−1 e−t/τi + C
Dabei entspricht Pi einem Proportionalitätsfaktor, τi der Zeitkonstante der Öffnungsereignisse und C einem Offset der Komponente i.
47
3 Methoden
48
4 Ergebnisse
4.1 Etablierung und Optimierung der Einzelstrang
Konformations Polymorphismus Analyse (SSCP)
In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob Nukleotid-Abweichungen im Gen des cardialen Ryanodin-Rezeptors bei Patienten mit dilatativer Cardiomyopathie (DCM) und arrhythmogener rechtsventrikulärer Cardiomyopathie (ARVC) auftreten und welche Auswirkung eine mögliche Mutation in diesem Gen auf die Funktion des Proteins hat.
Dies sollte über die Analyse der genomischen DNA dieser Patienten, die aus deren Vollblut isoliert wurde, geschehen.
Da das Gen des Ryanodin-Rezeptors des Herzens aus 106 Exons besteht, war es erforderlich eine Methode zu etablieren, die mit einer geringen Fehlerrate und in möglichst
kurzer Zeit die Analyse einer grossen Probenzahl ermöglicht.
Die SSCP ist eine solche Methode. Der apparative Aufwand ist gering, da die Methode
auf einer nativen Acrylamid Gelelektrophorese beruht. Wichtig war es, bei der Elektrophorese eine möglichst lange Laufstrecke und eine möglichst geringe Dicke des Gels zu
haben, um eine hohe Auflösung zu erzielen. Durch den Einsatz von Sequenziergelkammern mit einer Laufstrecke von 40 cm und einer Dicke von 0.4 mm konnte die Auflösung
im Vergleich zu den Minigelen (7 cm Lauflänge, 1 mm Dicke) deutlich verbessert werden. In den großen Gelen konnten auch Abweichungen nachgewiesen werden, die in den
kleineren Gelen nicht mehr detektierbar waren.
Die Silberfärbung erfolgte in einem Bad, wodurch das 0.4 mm dicke 6 %ige Acrylamidgel
häufig beschädigt wurde. Um die Stabilität des Gels zu erhöhen, wurde dem Gel Agarose zugesetzt. Weiterhin wurden die Glasplatten mit Serva Blueslick (siehe Materialien)
behandelt, was das Haften des Gels am Glas verhinderte. So konnte das Gel zum Färben
ohne Beschädigungen vom Glas gelöst werden. Eine Färbung des Gels auf einer Glasplatte war nicht möglich, da die Silbernitratlösung nicht genügend ins Gel eindringen
konnte und somit die Hintergrundfärbung in Relation zur Färbung der DNA zu stark
war. Zur Dokumentation wurde das Gel auf Whatman-Papier getrocknet und anschließend mittels einer Digitalkamera fotografiert.
Anhand von Proben, bei denen Lage und Art der Mutation bekannt war, wurden die
besten Laufbedingungen für die SSCP ermittelt. Während der Acrylamidgehalt und das
Verhältnis von Acrylamid zu Bisacrylamid kaum Einfluss hatten, waren Temperatur,
49
4 Ergebnisse
TBE Gehalt, Glyceringehalt und angelegte Spannung Faktoren, die das Laufverhalten
der DNA entscheidend beeinflussen konnten. Die meisten Abweichungen waren bei einem
Glyceringehalt von 5 %, 4◦ C oder Raumtemperatur, und 1× bzw 0.5× TBE detektierbar. Aus diesem Grund wurden diese vier Bedingungen routinemäßig angewendet. Waren dann bei der Analyse keine Abweichungen erkennbar, wurde der Glyceringehalt auf
10 % erhöht und eine weitere Analyse unter diesen Bedingungen durchgeführt. War auch
dann keine Abweichung erkennbar, wurde davon ausgegangen, dass es in dieser Probe
kein auffälliges Laufverhalten und somit keine Abweichungen in der DNA Sequenz gab.
Laut einer Studie von Nataraj et al. können so etwa 95% der vorhandenen Polymorphismen nachgewiesen werden [133].
Als Kontrolle wurde immer die DNA einer Person, die bis zu den Untersuchungen keine
Anzeichen einer Herzerkrankung aufwies, mit auf das Gel aufgetragen. Als Kontrolle
wurde die DNA eines 68 Jahre alten Menschen verwendet. Das durchschnittliche Alter zur Entwicklung einer Herzinsuffizienz liegt mit etwa 50 Jahren deutlich unter dem
Alter der Kontrollperson, weshalb davon ausgegangen werden kann, dass diese Person
an einer solchen Krankheit wahrscheinlich nicht mehr erkranken wird. Weiterhin wurde
diese DNA auch im nicht denaturierten Zustand mit aufgetragen. Die nicht denaturierte
Probe wurde deshalb eingesetzt, damit etwaige Laufunterschiede durch nicht vollständige Denaturierung einer Probe von wirklichen Basenabweichungen unterschieden werden
konnten.
4.2 Ergebnisse der SSCP Analysen
Es wurden von 80 DCM (davon 17 mit Verdacht auf einen familiären Hintergrund der
Erkrankung) und 13 ARVC Patienten alle 105 Exons mit den angrenzenden Intronsequenzen (im weiteren als Bereich bezeichnet) des cardialen Ryanodin-Rezeptors mit
Hilfe der SSCP untersucht. Auf einem Gel konnten je Bereich 34 Patienten auf einmal
untersucht werden, zusätzlich wurde jeweils die Probe der Kontrollperson als Referenz,
sowie eine nicht denaturierte Probe derselben PCR der Kontrollperson aufgetragen.
In bestimmten Bereichen 1 konnten unter unterschiedlichen Laufbedingungen insgesamt
43× Abweichungen im Laufverhalten einzelner Patienten nachgewiesen werden.
Von den in der SSCP abweichenden Proben, ebenso wie von einer nicht auffälligen Probe, wurden von dem entsprechenden Bereich neue PCRs in zweifacher Ausführung angesetzt, um spontane Mutationen, die bei der PCR für die Durchführung der SSCP hätten
auftreten können, auszuschließen. Von diesen PCRs wurden Sequenzierungen angesetzt
und die Proben mittels des Sequenzierautomats (AbiPrism 377 ) untersucht. Die Elektropherogramme wurden mit dem Programm Chromas 32 ausgewertet. Die Sequenzen
wurden mit der in der Literatur angegebenen Sequenz [134] mit Hilfe des Alignment
Programms lalign analysiert.
Um auch hier spontane Mutationen identifizieren zu können, wurden immer Hin- und
1
Bereiche 3, 4, 6, 8, 12, 15, 23, 30, 37, 49, 52, 53, 55, 67, 71, 77, 82, 83, 86, 92, 95, 98, 101 und 102
50
4.2 Ergebnisse der SSCP Analysen
Rückstrang sequenziert. Nur die Abweichungen, die auf beiden Strängen in beiden PCR
Ansätzen eine Abweichung an derselben Stelle zeigten, wurden hier in die Auswertung
aufgenommen.
Es handelte sich bei 35 der 43 Abweichungen um Abweichungen im Intron, 20 dieser Austausche waren heterozygot. Es konnten zwei Insertionen im Intronbereich nachgewiesen
werden, ebenso wie eine Deletion. In acht Fällen wurde ein homozygoter Austausch beobachtet (siehe Tabelle 4.1). Die in den Exon flankierenden Intronbereichen gefundenen
Intron um Original
Exon Nr.
3
4
6
6
8
12
12
23
30
49
52
55
55
67
77
77
82
82
T
T
A
A
A
T
A
G
C
G
A
G
C
G
A
A
Neu
Lage
T+C
T+C
A+G
A+G
A+C
T+C
A+G
G+C+A
Ins. T
C+T
Ins. A
T
A+G
G+A
T
Delet.
A+G
A+G
182
230
155
158
77
32
202
198
72
60
63
256
272
280
130
15
37
56
Intron um Original
Exon Nr.
82
82
83
83
86
92
92
95
95
98
98
98
101
102
102
A
G
C
G
T
G
G
A
G
A
T
A
C
A
C
Neu
Lage
A+G
G+C
T
G+C
C
G+C
A
A+G
G+A
G
T+A
A+G
G+T
T
C+G
61
53
65
53
221
228
259
41
56
45
82
146
194
86
26
Tabelle 4.1: Übersicht über die mittels SSCP gefundenen Abweichungen (per Sequenzierung
identifiziert) im Intron des cardialen Ryanodin-Rezeptors bei 80 DCM und 13 ARVC Patienten. Spalten 1 und 5 bezeichnen das Intron, um das jeweilige Exon, bei dem die Abweichung
gefunden wurde, Spalten 2 und 6 zeigen die Originalbase in der Sequenz, Spalten 3 und 7 die
bei dem entsprechenden Patienten gefundene(n) Basen. Die 4. und 8. Spalte gibt an, an welcher
Stelle im Bereich die Abweichung liegt. Die Sequenzen der Bereiche finden sich im Anhang.
Abweichungen wurden mit den bekannten Intron-Consensussequenzen verglichen, um
mögliche Splice-Defekte zu überprüfen. Diese Consensussequenzen sind Abschnitte auf
der genomischen DNA die zwar im Intronbereich liegen, die aber für die Transkription,
z.B. Start oder Stop, eine Rolle spielen. Es handelte sich um die häufigsten Splice-Donor
und -Akzeptor Sites, sowie die so genannte ’Branch’ Site, die zur Ausbildung der Lassostruktur während des Splice Vorgangs benötigt wird. Laut Literatur [134] weist das
51
4 Ergebnisse
RyR2 Gen vorwiegend Intronsplice-Sites vom Typ GT-AG auf. In dieser Arbeit konnte
nachgewiesen werden, dass nach Exon 3 die Splicing Variante GC-AG vorliegt. Laut
Saxonov et al. [135] handelt es sich dabei allerdings um eine bekannte Variation, die in
etwa 0.02% der Fälle vorkommt.
Da außerhalb dieser Consensussequenzen nur sehr wenig über Auswirkungen von Abweichung im Intronbereich bekannt ist, wurden diese Abweichungen nicht weiter untersucht.
Bei den acht weiteren Abweichungen handelte es sich um Basenaustausche im Exonbereich. Die Abweichungen wurden in den Exons 3, 15, 37, 49, 53, 71 und 98 gefunden,
wobei in Exon 37 zwei Abweichungen identifiziert wurden. Mit Ausnahme dieser beiden
Abweichungen in Exon 37 handelte es sich um konservative Änderungen und nur die
’wobble’-Base des Tripletts war betroffen, d.h. es ergab sich keine Änderung auf Aminosäureebene. Sequenzierungen von Kontrollproben ergaben weiterhin, dass es sich in
diesen sechs Fällen um Polymorphismen handelte. Diese Proben wurden ebenfalls keinen
weiteren Untersuchungen unterzogen.
Exon Nr. Original
3
15
37
37
49
53
71
98
GAC
AGC
GGG
AGC
GAC
AAA
AAC
CTA
Neu
Aminosäure
Laufbedingungen SSCP
GAC+T
AGC+T
GGG GAG
GGC AGC
GAC+T
AAA+G
AAC+T
CTA+T
D68
S453
G1885E
G1886S
D2455
K2691
N3418
L4620
4W, RT, 0.5 × TBE
15W, 4 ◦ C , 0.5 ×
15W, RT, 1 × TBE
15W, RT, 1 × TBE
4W, RT, 1 × TBE
15W, RT ,0.5 × TBE
4W, 4 ◦ C, 0.5 × TBE
15W, 4 ◦ C, 1 × TBE
Tabelle 4.2: Übersicht über die mittels SSCP gefundenen Abweichungen in den Exons des
cardialen Ryanodin-Rezeptors bei 80 DCM und 15 ARVC Patienten. Spalte 1 bezeichnet, in
welchem Exon die Abweichung gefunden wurde, Spalte 2 zeigt die Originalbase in der Sequenz,
Spalte 3 die bei dem entsprechenden Patienten gefundene(n) Basen, Spalte 4 gibt wieder, um
welche Aminosäure es sich handelt. In Spalte 5 sind die Laufbedingungen der SSCP wiedergegeben, bei der die Abweichung detektiert wurde.
52
4.2 Ergebnisse der SSCP Analysen
a
b
c
d
e
f
Abbildung 4.1: SSCP-Gele der Exons 3 (a), 15 (b), 49 (c), 53 (d), 71 (e) und 98 (f) des
humanen cardialen Ryanodin-Rezeptors. Die hervorgehobenen Ausschnitte zeigen zur besseren
Darstellung eine stark überarbeitete und vergrößerte Darstellung der Regionen, in der die
abweichenden Proben erkennbar waren.
53
4 Ergebnisse
a
b
c
d
e
f
Abbildung 4.2: Sequenzierungen der Exons 3 (A), 15 (B), 49 (C), 53 (D), 71 (E) und 98 (F)
des humanen cardialen Ryanodin-Rezeptors im Bereich der Abweichungen. In Exon 3 wurde
ein Cytosin heterozygot durch ein Thymin ersetzt, in Exon 15 wurde ein Cytosin heterozygot
durch ein Thymin ersetzt, in Exon 49 wurde ein Cytosin heterozygot durch ein Thymin ersetzt
in Exon 53 wurde ein Adenosin heterozygot durch ein Guanosin ersetzt, in Exon 71 wurde ein
Cytosin heterozygot durch ein Thymin ersetzt, in Exon 98 wurde ein Adenosin heterozygot
durch ein Thymin ersetzt. Die betroffenen Basen sind im Bild grau hinterlegt und mit N
gekennzeichnet.
Die Abweichungen in Exon 37 führten jedoch beide zu Änderungen auch auf Aminosäureebene. Es waren zwei benachbarte Aminosäuren betroffen, Aminosäuren 1885
und 1886.
Die Detektion der Abweichungen erfolgte bei Raumtemperatur, 15 Watt und 1×TBE.
Bei anderen Laufbedingungen waren die Änderungen nicht erkennbar. Es musste geprüft
werden, ob es sich bei diesen Abweichungen um Polymorphismen handelte, oder ob es
sich um krankheitsbezogene Mutationen handeln könnte. Zunächst wurde die DNA aller
93 Patienten mittels SSCP untersucht. Bei 8 der Patienten konnten in der SSCP abweichende Laufverhalten beobachtet werden. Bei einer Probe konnte bei beiden Banden der
SSCP ein abweichendes Bild festgestellt werden, wohingegen bei den anderen 7 Patienten nur in einer Bande eine Abweichung erkennbar war, siehe Abb. 4.3.
Alle 8 Proben wurden sequenziert. Bei den sieben Patienten, bei denen nur eine
Auffälligkeit erkennbar war, konnte ein Basentausch, heterozygot, von Guanosin zu
Guanosin/Adenosin nachgewiesen werden, was zu einem Aminosäuretausch Glycin zu
Glutamat (Abweichung G1885E) führte. Bei der achten Probe, die in beiden Banden der
54
4.2 Ergebnisse der SSCP Analysen
Abbildung 4.3: SSCP-Gel des Exons 37 des humanen cardialen Ryanodin-Rezeptors Der hervorgehobene Ausschnitt zeigt zur besseren Darstellung eine stark überarbeitete und vergrößerte
Darstellung der Regionen, in der die abweichende Proben erkennbar war.
einzelsträngigen DNA in der Lauflänge abwich, konnte ebenfalls der zuvor beschriebene heterozygote Austausch nachgewiesen werden, Weiterhin wurde der Austausch eines
weiteren Guanosin, zwei Basen benachbart zum Ersten, zu Guanosin/Adenosin beobachtet, was einen zusätzlichen Aminosäuretausch Glycin zu Serin (Abweichung G1886S)
bedeutet. Dieser zweite Basentausch konnte in keiner der acht Proben ohne den ersten
Basentausch nachgewiesen werden.
A
CCAAGGGGGGCAAG
B
CCAAGGNGGGCAAG
C
CCAAGGNGNGCAAG
Abbildung 4.4: Sequenzierungen des Exons 37 des humanen cardialen Ryanodin-Rezeptors
im Bereich der Abweichungen. Es sind zwei heterozygote Abweichungen von Guanosin zu Guanosin/Adenosin erkennbar. Bild a zeigt den Wildtyp, Bild b zeigt Abweichung G1885E, Bild c
zeigt zusätzlich zu Abweichung G1885E auch Abweichung G1886S. Die betroffenen Basen sind
grau hinterlegt. Der Leserahmen ist durch senkrechte Striche in der Sequenz gekennzeichnet.
Im Anschluss an die Patientenproben wurde in Bereich 37 ein Kollektiv von rund
200 Kontroll-DNAs mittels SSCP unter denselben Laufbedingungen untersucht. Bei den
Kontrollen handelte es sich um DNA von Blutspendern der Blutbank des Herz- und
Diabeteszentrums Bad Oeynhausen im Alter von 20-62 Jahren, bei denen es keine geschlechtliche Selektion gab. Die Spender waren bis zu diesem Zeitpunkt unauffällig für
irgendeine Form von Herzinsuffizienz, es konnte jedoch nicht ausgeschlossen werden, dass
diese Personen eine DCM oder ARVC im Laufe ihres Lebens entwickeln.
Bei diesen Kontrollproben konnten in 32 Fällen Abweichungen im Laufverhalten nachgewiesen werden. Auch diese Abweichungen waren, genau wie die der sieben Patienten,
55
4 Ergebnisse
nur auf einer der zwei Banden bei der SSCP erkennbar. Auch diese Proben wurden
sequenziert, auch hier konnte nur der Austausch G1885E nachgewiesen werden.
Über die Abweichung G1886S konnte jedoch noch keine weiteren Aussagen gemacht
werden, da sie bisher nur im Zusammenhang mit Abweichung G1885E, jedoch nicht
isoliert nachgewiesen wurde. Aus diesem Grunde wurde die betroffene Probe, die beide
Abweichungen zeigte, weiteren Untersuchungen unterzogen.
Als nächstes wurde die Allelverteilung der zuvor genannten Probe analysiert. Dazu wurde
das PCR-Produkt dieses Fragments ’blunt end’ in einen TOPO-Vektor (pCRII-TOPO,
Ivitrogen) kloniert. Nach blau-weiss Selektion wurde von 10 Kolonien Flüssigkulturen
angelegt, die Plasmid DNA aufgereinigt (siehe 3.1.3) und sequenziert, die Ergebnisse
der Sequenzierungen finden sich in Abb. 4.5. Vier der Kolonien wiesen homozygot Abweichung G1885E, die anderen sechs Kolonien homozygot die Abweichung G1886S auf.
Somit kann mit großer Wahrscheinlichkeit davon ausgegangen werden, dass die beiden
Abweichungen in diesem Patienten auf zwei unterschiedlichen Allelen liegen.
a
GCCAAGGAGGGCAA
b
AGGGGAGCAAG
Abbildung 4.5: Sequenzierung der Plasmid-DNA des in den pCRII-TOPO-Vektor klonierten
Exons 37 des humanen cardialen Ryanodin-Rezeptors im Bereich der Abweichungen. Es lag
entweder eine homozygote Ausprägung der Abweichung G1885E (a) oder Abweichung G1886S
(b) vor, was bedeutet, dass die beiden Abweichungen mit großer Wahrscheinlichkeit auf zwei
unterschiedlichen Allelen liegen.
Die Plasmid-DNA beider Klone wurde getrennt und gemischt in der SSCP eingesetzt, um zu überprüfen, welches Laufverhalten diese definierten DNA-Abschnitte aufwiesen. Abweichung G1885E zeigte bei der SSCP die identische Laufstreckenänderung,
die auch bei den heterozygoten Patientenproben als zusätzliche Bande zu sehen war.
Abweichung G1886S konnte unter Standard-Bedingungen nicht nachgewiesen werden,
es war kein Laufunterschied im Gel im Vergleich zum Wildtyp erkennbar. Auch unter
anderen Laufbedingungen 2 konnte Abweichung G1886S ohne Abweichung G1885E nicht
mittels SSCP nachgewiesen werden.
2
Variation von Temperatur (4◦ C und RT), TBE Gehalt (0.5 und 1x), angelegter Spannung (4, 14, 20
und 40W), Acrylamidgehalt (5, 6 und 7%) Acrylamid/Bisacrylamidverhältnis (19:1, 29:1, 49:1) und
Glyceringehalt(0, 5, 10, 15 und 20%)
56
4.3 Ergebnisse Schmelztemperaturanalyse
4.3 Ergebnisse Schmelztemperaturanalyse
Da die SSCP bei der Identifizierung von Abweichung G1886S ihre Limitationen erreicht
hatte, wurden die Proben mittels Schmelztemperaturanalyse untersucht. Die Schmelztemperaturanalyse setzt voraus, dass die zu untersuchende Sequenz bekannt ist. Bei
dieser Methode werden zwei Sonden (eine Anker- und eine Sensorsonde) eingesetzt, die
beim Binden an räumlich eng benachbarten Stellen der DNA eine Fluoreszenz (FRET,
siehe 3.1) verursachen. Durch sukzessives Erhöhen der Temperatur nahm die Bindungsstärke zwischen Probe und Sonde ab und die Sonden lösten sich wieder von der DNA,
die Fluoreszenz nahm ab. Der Wendepunkt der aufgezeichneten Kurve entsprach der
Schmelztemperatur, bei der 50% der Sonde dissoziiert und 50% gebunden vorlagen. Bildete man dann die erste Ableitung der Fluoreszenz nach der Temperatur und trug dies
gegen die Temperatur auf, so erhielt man eine Kurve, deren Maximum dem Schmelzpunkt der Probe entsprach.
Dabei war die Bindungsstärke und somit der Schmelzpunkt, an dem sich die Sonde von
der Probe löst, abhängig von der Anzahl der ausgebildeten H-Brücken zwischen Sonden
und DNA. Das bedeutete, dass Sonden, die mit allen Basen der Target-DNA H-Brücken
bilden konnten, stärker banden und erst bei höheren Temperaturen gelöst wurden, als
wenn es ’Mismatches’ in den Sequenzen gab.
a
Sensor-Sonde
GAG GGC
GAG GGC
b
Anker-Sonde
DNA
H-Brücken
GAG GGC
GGG GGC
c
GAG GGC
GAG AGC
d
GAG GGC
GGG AGC
Abbildung 4.6: Konstruktion der Sonden für die Schmelztemperturanalyse. Die Sonden binden, je nach Grad der Übereinstimmung, mit der Zielsequenz unterschiedlich stark an die
DNA, so dass es bei Erhöhung der Temperatur im Ansatz zur Ablösung der Sonden bei unterschiedlichen Temperaturen kommt. Bei genauer Übereinstimmung (Bild a) der Sequenzen
ist der Schmelzpunkt am höchsten, bei einem ’Mismatch’ (Bilder b und c) in den Sequenzen
verringert sich der Schmelzpunkt um etwa 10 ◦ C, ein weiterer ’Mismatch’ (Bild d) verringert
den Schmelzpunkt um weitere 10 ◦ C.
Die Sonden wurden so konzipiert, dass die Ankersonde upstream auf die DNA Sequenz
passte, die variable Base lag an vorletzter Stelle der Ankersonde. Direkt nach der Ankersonde schloss sich die Sensorsonde an, die an der zweiten Stelle die variable Base aufwies.
57
4 Ergebnisse
Die Sequenzen der Sonde wurden so gewählt, dass die Sequenz der Ankersonde perfekt
zur Abweichung G1885E passte 3 . Die Sequenz der Sensorsonde passte perfekt zum Wildtyp. Somit ergaben sich folgende Möglichkeiten: höchster Schmelzpunkt und komplette
Übereinstimmung der Sonden mit der Sequenz GAGGGC, mittlerer Schmelzpunkt mit
den Sequenzen GGGGGC und GAGAGC und geringster Schmelzpunkt mit der Sequenz
GGGAGC. Nachteil bei diesem Ansatz war, dass die beiden Varianten mit jeweils einem
Mismatch, also GGGGGC und GAGAGC nicht unterschieden werden konnten, da in
beiden Fällen jeweils eine H-Brücke weniger ausgebildet wurde, auch wenn der ’Mismatch’ an unterschiedlichen Stellen der DNA auftrat. Diese beiden Varianten konnten
jedoch mit Hilfe der SSCP unterschieden werden, so dass hier kein größeres Problem
auftreten sollte.
dF/dT
0.04
a
b
c
0.03
d2
0.02
d1
0.01
45
55
65
Temperatur [°C]
75
Abbildung 4.7: Schmelztemperaturanalyse der Klone definierter Sequenzen mit Abweichung
G1885E bzw. G1886S und einer Probe, die sich in der Sequenzierung als homozygot Wildtyp (c) erwiesen hatte. Weiterhin die Analyse einer heterozygoten Probe (d). Es wurden die
Schmelzpunkte der jeweiligen Basensequenz, perfekte Übereinstimmung (a), 1 ’Mismatch’ (c),
2 ’Mismatches’ (b)ermittelt. Die Schmelzpunkte lagen für die reinen Proben bei 45, 55 und 65
◦ C. Die heterozygote Probe wies zwei Schmelzpunkte auf (d1 und d2)
Mittels der homozygoten Klone und einer Probe, die sich in der Sequenzierung als
homozygot Wildtyp erwiesen hatte, wurden die Schmelzpunkte der jeweiligen Basensequenz (komplette Übereinstimmung, 1 ’Mismatch’, 2 ’Mismatches’) ermittelt. Die
Schmelzpunkte lagen für die reinen Proben bei 45, 55 und 65 ◦ C und lagen somit
genügend weit auseinander, um eine einwandfreie Identifizierung zu gewährleisten (siehe
dazu Abb. 4.7, Kurven a,b und c). Desweiteren wurde die heterozygote Probe, die beide
Abweichungen enthielt, untersucht, um zu sehen, ob auch heterozygote Proben in ihrem
Schmelzverhalten unterscheidbar waren. Diese Probe wies zwei Schmelzpunkte auf, die
3
Sequenz Ankersonde: tggtgaggaagaagccaaggag ,Sequenz Sensorsonde: ggccttccttgggccgcttgcc
58
4.3 Ergebnisse Schmelztemperaturanalyse
ebenfalls bei denselben Temperaturen lagen, wie die Schmelzpunkte der homozygoten
Proben (siehe Abb. 4.7 Kurve d1/d2). Somit schien die Methode zur Identifizierung der
Abweichung G1886S als geeignet.
a
0.04
b
dF/dT
dF/dT
0.04
0.03
0.03
0.02
0.02
0.01
0.01
45
55
65
Temperatur [°C]
75
45
55
65
Temperatur [°C]
75
Abbildung 4.8: Bild a: Schmelztemperaturanalyse der Kontrollen. Etwa 80% der Proben wiesen eine Schmelztemperatur von 55◦ C auf, was der Sequenz GGGGGC entsprach, da aufgrund
der SSCP Analysen die Sequenz GAGAGC ausschied. Bild b: Schmelztemperaturanalyse der
Patienten. Etwa 60% der Proben wiesen eine Schmelztemperatur von 55 und 65◦ C auf, was
der heterozygoten Sequenz GAGGGC/GGGGGC entsprach, und den Ergebnissen der SSCP
widersprach.
Basenfolge
Kontrollen
Patienten
Anzahl
Prozent
Anzahl
GGGGGC/GAGAGC
147
78
14
GNGGGC
18
9.5
19
GAGGGC
6
3
30
GGGNGC
5
3
1
GGGAGC
0
0
0
Prozent
21.9
30.6
47.5
1.5
0
Tabelle 4.3: Verteilung der verschiedenen Schmelztemperaturen bei Kontrollen und Patienten.
Die in der Basenfolge mit N angegebenen Proben waren heterozygot und wiesen zwei Maxima
bei der Schmelztemperaturanalyse auf.
Die Verteilung der Schmelztemperaturen bei Patienten und Kontrollen unterschieden
sich stark voneinander (siehe Abb. 4.8). Der überwiegende Teil der Kontrollen (147 von
176) wiesen ein ’Mismatch’ (Schmelztemperatur 55◦ C) auf und entsprachen somit der
Sequenz GGGGGC, da diese Proben bei der SSCP unauffällig waren und deshalb der
Genotyp GAGAGC ausschied. Bei den Patienten jedoch war der höchste Schmelzpunkt
(65◦ C) dominierend. Dies bedeutete, dass nach dieser Analysemethode der überwiegende
Teil der DCM-Patienten die Basenfolge GAGGGC aufweisen sollte, was jedoch nicht im
Einklang mit den SSCP Ergebnissen und den Ergebnissen der Sequenzierungen stand.
59
4 Ergebnisse
4.4 Ergebnisse Sequenzierungen
Da die Ergebnisse der SSCP und der Schmelztemperaturanalyse sich voneinander unterschieden, wurden die Proben einer Sequenzierung unterzogen. Es wurde die DNA von
60 DCM Patienten, 6 ARVC Patienten und 77 Kontrollen sequenziert. Auch hier zeigte
sich, dass die Verteilung der Abweichungen G1885E und G1886S zwischen Patienten und
Kontrollen unterschiedlich war.
Da jedes Gen auf je zwei Allelen vorkommt, gibt es bei 2 Abweichungen 8 verschiedene Kombinationen, wie diese verteilt sein können (siehe Tab. 4.4). Es können auf
beiden Allelen keine Abweichung vorkommen (Fall a). Es kann auf einem Allel Abweichung G1885E vorkommen, das andere Allel weist keine Abweichung auf (Fall b). Beide
Abweichungen kommen auf einem Allel vor, das zweite ist unverändert (Fall c1), Abweichung G1885E liegt auf dem ersten, Abweichung G1886S liegt auf dem zweiten Allel (Fall
c2). Auf beiden Allelen liegt ausschließlich Abweichung G1885E vor (Fall d), auf beiden
Allelen kommen beide Abweichungen vor (Fall e). Es kommt nur Abweichung G1886S
auf einem Allel vor (Fall f), oder es kommt auf beiden Allelen Abweichung G1886S vor
(Fall g).
Patienten
30
15
11
3
0
2
0
61
aus Allelverteilung Bez. Variante
resultierende AS
GG
a
GG
GG
b
EG
GG und GS
c
ES und EG
EG
d
EG
ES
e
ES
GG
f
GS
EG
g
ES
Summe
Kontrollen Summe
21
51
47
62
1
12
7
10
0
0
1
3
0
0
77
138
Tabelle 4.4: Allelverteilung bei Patienten und Kontrollen nach Auswertung der Sequenzierungen. Während bei den Kontrollen Fall b am häufigsten auftrat, lag bei den Patienten am
häufigsten Fall a vor. Fall c kam bei den Patienten zehnmal häufiger vor, als bei den Kontrollen. Fälle e und g konnten weder bei den Patienten, noch bei den Kontrollen nachgewiesen
werden. G,E und S bezeichnen die Aminosäuren, die sich aus den verschiedenen Fälle ergaben.
Die erste Zeile entsprach dem ersten Allel, die zweite Zeile entsprach dem anderen Allel.
60
4.4 Ergebnisse Sequenzierungen
50
40
30
20
10
a
Patienten
Kontrollen
Anzahl Proben
Anzahl Proben
So war Abweichung G1885E bei den Kontrollen zu 71% der Fälle aufgetreten, wohingegen der eigentliche Wildtyp nur in 19% der Kontrollen nachgewiesen werden konnte.
Bei den Patienten war das Verhältnis nahezu umgekehrt, 26% der Patienten zeigten
Abweichung G1885E, 74% entsprachen dem in der Datenbank (ncbi Pub Med.) angegebenen Wildtyp [134].
Auch die Häufigkeit von Abweichung G1886S unterschied sich bei Patienten und Kontrollen deutlich. Nur 2.5% der Kontrollen wies Abweichung G1886S auf, während dies
bei 21.5% der Patienten zu beobachten war, also etwa eine neunfache Häufung.
Bei differenzierter Betrachtung, in der aufgeschlüsselt wurde, ob nur eine der Abweichungen einzeln vorkamen, oder ob beide in derselben Person auftraten und ob die Abweichung homo- oder heterozygot war, ergaben sich folgende Verhältnisse (siehe Abb. 4.9):
60 b
50
40
30
20
10
Patienten
Kontrollen
Gesamt
F
G1885E G1886S
Abweichung
AS Allel1 GG EG EG/GG EG ES GS EG
AS Allel2 GG GG GS/ES EG ES GG ES
Abbildung 4.9: Vergleich der Allelverteilung zwischen Patienten und Kontrollen. Bild a zeigt
die Unterschiede in den Abweichungen G1885E und G1886S allgemein, es wurde keine Differenzierung zwischen homo- und heterozygoter Ausprägung gemacht, ebenso nicht, ob beide
Abweichungen gleichzeitig in einem Patienten gefunden wurden. Bild b zeigt eine differenziertere Darstellung, in der auch die Gesamtzahl der Proben aufgezeichnet ist. Es wurde zwischen
den 8 möglichen verschiedenen Allelzusammensetzungen unterschieden, wobei sich Fall c in
zwei Zusammensetzungen gliederte, die anhand von Sequenzierungen nicht unterschieden werden konnte.
Es konnte festgestellt werden, dass Abweichung G1885E homozygot ausgeprägt wurde, wohingegen Abweichung G1886S nur heterozygot nachgewiesen werden konnte (siehe
Abb. 4.9,Bild b). Keine Abweichung kam in 49% der Patienten vor, bei den Kontrollen
waren es 27% (Fall a). Abweichung G1885E konnte bei 24.5% der Patienten und 61%
der Kontrollen heterozygot nachgewiesen werden (Fall b), beide Abweichungen lagen
bei 18% der Patienten und 1.3% der Kontrollen heterozygot vor (Fall c). Abweichung
G1885E in homozygoter Form war bei knapp 5% der Patienten und 9% der Kontrollen nachweisbar (Fall d). Eine homozygote Ausprägung von Abweichung G1886S war
weder allein, noch zusammen mit Abweichung G1885E nachweisbar (Fälle g und e).
Eine heterozygote Ausprägung der Abweichung G1886S allein lag in 3% der Patienten
61
4 Ergebnisse
und 1.3% der Kontrollen vor (Fall f). Die Signifikanz der unterschiedlichen Verteilungen wurde über einen χ2 -Test festgestellt. Für Abweichung G1885E betrug er 8.9, für
Abweichung G1886S 22.5, beide Abweichungen sind demnach signifikant unterschiedlich
zwischen Patienten und Kontrollen verteilt.
4.5 Klonierung und Expression von
Ryanodin-Rezeptoren
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der cardiale Ryanodin-Rezeptor aus menschlichem
Herzgewebe isoliert. Weiterhin wurde die cDNA des Kaninchen Ryanodin-Rezeptors in
HEK293 Zellen transfiziert und das Protein aufgereinigt. Die drei Rezeptoren, die aus
dem cDNA Klon hergestellt wurden, sollten den Wildtyp, die zuvor detektierte Abweichung G1886S und eine zusätzliche Abweichung, E4950K, die bei einem Patienten
mit catecholaminerger Tachycardie berichtet wurde [93], enthalten. Anschließend sind
funktionelle Untersuchungen des Wildtyps und der Mutante E4950K an den dargestellten Kanäle mit Hilfe der Einzelkanalmessung im künstlichen Lipidbilayer durchgeführt
worden. Die Darstellung der Mutante G1886S war bisher nicht möglich.
Darstellung des Ryanodin-Rezeptors
Die cDNA des cardialen Ryanodin-Rezeptors aus Kaninchen4 wurde wie in 3.1.5 beschrieben in den Bakterienstamm XL1blue transformiert und auf LB Amp Agarplatten
ausplattiert. Die Platten wurden 17 Stunden bei 37◦ C inkubiert. Es wurden 10 Kolonien
ausgewählt und bei 37◦ C in LB Amp Medium angezogen. Von 1.5ml Bakterienkultur
wurde eine DNA Minipräparation (siehe 3.1.3) angesetzt. 50% der aufgereinigten Plasmid DNA wurde mit XhoI und NotI verdaut, so dass Insert und Vektor voneinander
getrennt waren. Sowohl die geschnittenen, als auch die ungeschnittenen DNAs wurden
auf ein 0.8%iges Agarosegel aufgetragen, zusätzlich wurde ein DNA Grössenstandard
und die original DNA, ebenfalls geschnitten und ungeschnitten, aufgetragen. Die Klone
mit demselben Laufverhalten wie die original DNA wurden zur zusätzlichen Kontrolle
sequenziert.
Eine der zehn Kolonien enthielt die komplette cDNA, alle anderen Klone enthielten Deletionen oder stark mutierte Bereiche. Auch die für die weiteren Versuche eingesetzte
DNA enthielt drei Mutationen im Vergleich zur original cDNA, die sich jedoch alle nicht
auf Proteinebene auswirkten. Von diesem Klon, im weiteren Verlauf als WT-DNA bezeichnet, wurde durch eine DNA Maxipräparation (siehe 3.1.4) etwa 1 mg WT-DNA
pro Aufarbeitung hergestellt.
Gerichtete Mutagenese des Ryanodin-Rezeptors
Die gerichtete Mutagenese wurde mit Hilfe des ’XLII one step Mutagenesis Kits’ von
Stratagene durchgeführt, die auf einer PCR mit anschließendem Verdau mit DpnI und
4
wurde freundlicherweise von Prof. Dr. D. MacLennan, Universität Toronto, zur Verfügung gestellt
62
4.5 Klonierung und Expression von Ryanodin-Rezeptoren
folgender Transformation in ultrakompetente Zellen beruht. Die Elongationszeit der
PCR richtete sich nach dem eingesetzten Template. Da der Ryanodin-Rezeptor eine
Größe von etwa 16 kB hatte und der Vektor eine Größe von etwa 5 kB, ergab sich eine
Gesamtgröße von etwa 21kB. Bei einer Elongationsrate der Pfu-Ultra von 1 kB/Min
ergab sich somit eine Elongationszeit von 21 Minuten. Bei grossen Plasmiden (größer
10kB) kann zur Optimierung der Mutagenese die Elongationszeit auf 2 Min/kB erhöht
werden, um keine degradierten Fragmente zu erhalten. Somit wurden immer zwei PCRs
durchgeführt, die die unterschiedlichen Elongationszeiten berücksichtigten.
Bei dem Klon, der die Mutation E4950K enthielt, führte eine kurze Elongationszeit zum
Volllängenklon, wohingegen bei der Mutante G1886S die lange Elongationszeit nötig
war.
Weiterhin wurden nur 18 Zyklen im Cycler durchgeführt, da bei weiteren Zyklen nicht
mehr im ausreichenden Maße Primer zur Verfügung stünden und somit die Effizienz der
Mutagenese verringert würde.
Die PCR Produkte wurden mit DpnI-Endonuklease inkubiert, um die Eltern DNA
zu verdauen. Diese Endonuklease schneidet spezifisch methylierte und hemimethylierte
DNA [125]. Die aus E.coli gewonnene Eltern DNA enthielt eine dam Methylierung und
war deshalb für einen Verdau mit diesem Enzym zugänglich. Die aus der MutagenesePCR stammende, mutierte DNA wies diese Methylierung nicht auf, weshalb diese nicht
verdaut wurde. Nach der Inkubation wurde das Enzym durch Hitze deaktiviert (5 Min,
60◦ C), die DNA wurde wie in 3.1.5 beschrieben in den ultrakompetenten E.coli Stamm
XL10Gold transformiert, welcher besonders für grosse (größer 10kB) und schwierige (hoher GC-Gehalt) Plasmide eingesetzt wird [136]. Die Kulturen wurden auf LB-Amp Agarplatten ausplattiert und über Nacht bei 37◦ C inkubiert, von 10 Klonen wurde je eine Kultur angelegt und eine DNA Minipräparation von 1.5 ml der Bakterienkultur angesetzt.
Die Plasmid DNA wurde auf ein 0.8%iges Agarosegel aufgetragen (siehe Abb. 4.10),
ebenso wie die WT -DNA und ein 1kB DNA-Grössenstandard. Der Klon, der im Laufverhalten mit der WT-DNA übereinstimmte wurde sequenziert, um zu überprüfen, ob
außer der gewünschten noch weitere Mutationen vorhanden waren. Dies war in beiden
Fällen nicht der Fall. Anschließend wurden von diesen Kolonien Glycerinstocks angelegt und mittels Maxipräparation grosse Mengen (einige mg) mutierter Plasmid DNA
hergestellt.
63
4 Ergebnisse
St
WT
R N
K8
K7
R N R N
K6
K5
K4
R N
R N
R N
K3
K2
K1
R N R N R N
10kB
5kB
3kB
Abbildung 4.10: Das Bild zeigt das Agarosegel nach Mutagenese, Transformation, Miniprep
und Proberestriktion des Ryanodin-Rezeptors mit der Mutation E4950K. Bahn 1 zeigt den
DNA Grössenstandard, Bahn 2 den Wildtyp restringiert mit XhoI und NotI, Bahn 3 den
Wildtyp nicht restringiert . Die Bahnen 4 bis 20 zeigen die Klone aus der Mutagenese, jeweils
restringiert und nicht restringiert.
Expression der Klone des Rezeptors
Aufgrund der Größe des Ryanodin-Rezeptor Klons konnte dieses Protein nicht in prokaryotischen Systemen wie E.coli oder Hefen exprimiert werden. Aus diesem Grund wurde
die DNA in HEK293 Zellen transfiziert.
Da es sich bei dem pcDNA3.1 Vektor um einen Shuttle-Vektor handelte, der sowohl in
prokaryotischen, als auch in eukaryotischen Systemen eingesetzt werden konnte, entfiel
eine weitere Umklonierung nach der DNA Isolierung. Die Transfektion erfolgte nach der
Calciumpräzipitationsmethode [43]. Diese Methode war nur für transiente Transfektionen geeignet, stabile Linien sind mit dem Ryanodin-Rezeptor allerdings weder in der
Literatur beschrieben, noch konnte im Rahmen dieser Arbeit eine stabile Zelllinie mit
diesem Protein hergestellt werden.
Der Vektor vermittelte eine zusätzliche Resistenz gegen das Antibiotikum Gentamycin.
Durch Zugabe dieses Antibiotikums nach der Transfektion konnte die Transfektionsrate
abgeschätzt werden, sie lag bei geschätzten 60%.
48 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen aufgearbeitet und das Protein wie
in 3.4.6 beschrieben aufgereinigt. Dabei wurden die Zellen mit CHAPS solubilisiert, um
die membranständigen Proteine, wie den Ryanodin-Rezeptor, in Lösung zu bringen. Der
solubilisierte Rezeptor wurde durch eine Sucrose Dichtegradienten Zentrifugation angereichert. Nach Zentrifugation wurden die Gradienten in 1 ml Fraktionen aliquotiert. Von
dem Gradienten wurde die Sucrosekonzentration der einzelnen Fraktionen mittels eines
Refraktometers bestimmt. Da die Gradienten eines Laufs unter identischen Bedingungen simultan gegossen wurden, konnte man davon ausgehen, dass sich alle Gradienten
gleichmäßig ausgebildet hatten. Weiterhin wurde von allen Fraktionen ein 3 H-Ryanodin
64
4.6 Ryanodin-Rezeptor Isolierung aus menschlichem Herzgewebe
600
25
400
20
200
15
0
10
2
Sucrose Konzentration [%]
Ereignisse [CPM]
Bindungstest durchgeführt. Da der Ryanodin-Rezeptor eine hohe Affinität zu dem Ryanodin besitzt, konnten somit die Fraktionen ermittelt werden, die den Rezeptor enthalten.
4 6 8 10 12 14 16
Fraktionen Sucrosegradient
Abbildung 4.11: Sucrosegradient und 3 H-Ryanodin Bindungstest des in HEK293-Zellen exprimierten Ryanodin-Rezeptors. Die Aufarbeitung des Kanals aus den Zellen erfolgte wie unter 3.4.6 beschrieben. Der 3 H-Ryanodin Bindungstest erfolgte wie unter 4.11 beschrieben.
Der Ryanodin-Rezeptor liegt bei einer Sucrosekonzentration von etwa 15% vor, was durch
die erhöhte 3 H-Ryanodin-Bindung erkennbar ist.
Die Konzentration des Rezeptors in den Fraktionen war zu gering, um im SDS-Gel mit
anschließender Commassie-Färbung (siehe Kap 3.1) nachgewiesen werden zu können.
4.6 Ryanodin-Rezeptor Isolierung aus menschlichem
Herzgewebe
Aufarbeitung des Ryanodin-Rezeptors
Die Aufarbeitung des schweren SR erfolgte wie in 3.2.2 beschrieben. Das Homogenat der
Diaden wurde auf vier Sucrose-Gradienten (15-45 % Sucrose) verteilt. Die Gradienten
wurden in 1.5 ml Fraktionen aliquotiert. Die einzelnen Fraktionen wurden einem 3 HRyanodin-Bindungstest unterzogen, die den Rezeptor enthaltenden Fraktionen wurden
vereint und weiter aufgereinigt wie in 3.2.2 beschrieben.
Nach der Solubilisierung mit CHAPS wurde die Probe zur Anreicherung des RyanodinRezeptors auf einem linearen Sucrosegradienten (7-30 % Sucrose) aufgetragen. Der Nachweis des Rezeptors erfolgte wiederum über einen 3 H-Ryanodin-Bindungstest.
65
40
15.000
30
10.000
20
5.000
10
Ereignisse [CPM]
20.000
2
Sucrose Konzentration
4 Ergebnisse
4 6 8 10 12 14 16
Fraktionen Sucrosegradient
25
750
20
500
15
250
10
Ereignisse [CPM]
1000
2
Sucrose Konzentration [%]
Abbildung 4.12: Sucrosegradient und 3 H-Ryanodin Bindungstest nach SR-Isolierung aus
humanem Herzgewebe. Die Aufarbeitung erfolgte wie unter 3.2.2 beschrieben. Das schwere SR
liegt bei einer Sucrosekonzentration von 30 % vor, erkennbar an den erhöhten 3 H-Ryanodin
Bindung im Test 4.11.
4 6 8 10 12 14 16
Fraktionen Sucrosegradient
Abbildung 4.13: Sucrosegradient und 3 H-Ryanodin Bindungstest des nativen RyanodinRezeptors nach Anreicherung aus dem SR. Die Aufarbeitung des Kanals erfolgte wie unter 3.2.2
beschrieben, der 3 H-Ryanodin Bindungstest erfolgte wie unter 4.11 beschrieben.der Rezeptor
liegt bei einer Sucrosekonzentration von 17 % vor, erkennbar an der erhöhten 3 H-Ryanodin
Bindung im Test.
66
4.7 Ergebnisse der Einzelkanalmessungen
4.7 Ergebnisse der Einzelkanalmessungen
Durch Messungen der Einzelkanalaktivität wurde analysiert wie sich verschiedene Mutationen auf die Kanaleigenschaften des Ryanodin-Rezeptor auswirken. Es wurden sowohl native Ca2+ -Freisetzungskanäle als auch rekombinant dargestellte Rezeptoren untersucht.
Bei dem nativen Kanälen handelt es sich um Proteine, welche aus explantierten Herzen, oder Teilen davon, präpariert wurden. Das Patientenmaterial wurde vom Herz- und
Diabeteszentrum NRW, Bad Oeynhausen zur Verfügung gestellt.
Es wurden zwei Herz-Aufarbeitungen untersucht. Zum einen ein Kanal, dessen Spender an einer ARVC erkrankt war, dessen DNA aber dem Wildtyp-Ryanodin-Rezeptor
entsprach. Der zweite Rezeptor stammte von dem Patienten, der in Exon 37 beide Abweichungen (G1885E und G1886S) aufwies. Wie in Kapitel 4.2 beschrieben, befinden sich
die beiden Abweichungen auf unterschiedlichen Allelen. Außerdem wurden der Wildtypkanal und ein rekombinanter Rezeptor mit dem krankheitsbezogenen Aminosäureaustausch E4950K analysiert.
In den Einzelkanalanalysen dienten K+ -Ionen als Ladungsträger. Nach Bildung der Membrandoppelschicht, Typ Müller-Rudin [137], die durch einen charakteristischen kapazitiven Membranstrom bemerkbar war, wurde der Rezeptor in die Kammer gegeben. Zufallsbedingt wurde der Kanal in die Membran inkorporiert, der Einbau konnte durch Änderung des Membranstroms beobachtet werden. Da die Ca2+ -Konzentration so gewählt
war, dass der Rezeptor im aktivierten Zustand vorlag, konnte anhand des Ionenstroms
das Schaltverhalten beobachtet werden. Ein hoher Leitfähigkeitszustand entsprach einem geöffneten Kanal, eine geringe Leitfähigkeit auf dem Niveau der Grundlinie einem
geschlossenen Kanal.
Nach Bestimmung der Orientierung des Kanals in der Membran wurden niedermolekulare Effektoren zu der relevanten Seite des Kanals addiert. Das Verhalten des Kanals
wurde dabei kontinuierlich aufgezeichnet. Nach Abschluss der Messung konnten aus den
gewonnenen Daten Kanalparameter wie die Öffnungswahrscheinlichkeit Po , die Zeitkonstante der Öffnungsereignisse τ und die Amplitude A des Einzelkanal-Stroms ermittelt
werden.
4.7.1 Einzelkanalmessungen mit dem rekombinanten Wildtyp-Kanal
Mit den Messungen des Wildtyp-Kanals sollte überprüft werden, ob die Kanaleigenschaften des exprimierten Proteins denen des nativen Rezeptors entsprachen. Für den skeletalen Typ wurde bereits gezeigt, dass sich bei rekombinanten und nativen Rezeptoren die
Zeitkonstante der Öffnungsereignisse τ (0.220±0.022 ms rekombinant zu 0.224±0.027 ms
nativ), die Amplitude A des Einzelkanal-Stroms (beide etwa 23 pA) und die spezifischen
Leitfähigkeiten (780±12.8 pS rekombinant zu 778±5.66 pS nativ) nahezu glichen [129].
Die Überprüfung der Kanaleigenschaften war auch deshalb wichtig, da in den weiteren
Experimenten Mutationen in ein heterogenes System (beim Menschen gefundene Mu-
67
4 Ergebnisse
tationen in einem Kanal des Kaninchens) eingebracht werden sollten. Die Kanäle der
beiden Spezies weisen eine Ähnlichkeit von 98.6% auf Proteinebene auf.
Die Öffnungswahrscheinlichkeit des nativen, rekombinanten Kanals lag unter Start- Bedingungen (50 µM freies [Ca2+ ], 85mV Haltepotential) bei Po =0.3±0.1,
τ lag bei 1.1±0.23 ms. Der Strom lag bei 8±4 pA (siehe Abb. 4.14, Bilder A und a). Dies
entsprach einer spezifischen Leitfähigkeit von 94±47 pS. Die spezifische Leitfähigkeit war
somit um Faktor 8 niedriger als in der Literatur, mit etwa 600-700pS, beschrieben[50].
Durch die Zugabe von ATP (Endkonzentration 1.7mM, siehe Abb. 4.14, Bilder B und
b) erhöhte sich die Öffnungswahrscheinlichkeit auf 0.59±0.12, τ verringerte sich auf
τ =0.73±0.33 ms. Der Amplituden-Strom erhöhte sich auf 20±10 pA, bei einer angelegten Spannung von 60 mV, womit sich die spezifische Leitfähigkeit auf 330±53 pS erhöhte.
Die Aktivierung des Kanals durch ATP konnte wie in [138] beschrieben, nachgewiesen
werden. Der so charakterisierte rekombinante Wildtyp-Kanal wurde als Referenz zur
Beurteilung der mutierten rekombinanten Kanäle herangezogen.
68
4.7 Ergebnisse der Einzelkanalmessungen
A
o
10pA
g
B
50ms
o
g
a
100
200
1.0
150
0.75
100
50
0
8
16
24
0
b
Counts (N)
200
150
100
50
2
6
4
10
20
30
Amplitude [pA]
40
0
8
200
1.0
150
0.75
100
5.000
10.000
0.5
0.25
50
0
0.5
0.25
P(offen)
50
Counts (N)
P(offen)
Counts (N)
Counts (N)
200
150
0
2
4
6
Zeitkonstante der
Öffnungsereignisse t [ms]
0
5000
10.000
Zeit[ms]
Abbildung 4.14: Kanaleigenschaften des Wildtyps des cardialen rekombinanten RyanodinRezeptors im künstlichen Lipidbilayer. A und B zeigen repräsentative Ausschnitte der Membranströme (je 500ms). g gibt den geschlossenen, o den geöffneten Zustand wieder. a und b
zeigen die Verteilungen der Stromamplituden (erste Spalte), der Öffnungszeiten(zweite Spalte)
und der Öffnungswahrscheinlichkeit (dritte Spalte) über einen Zeitraum von 10 sec. Der Kanal
zeigte bei Startbedingungen (Haltepotential 85 mV, 50 µM [Ca2+ ]) eine Amplitude des Einzelkanalstroms von 8pA und somit eine spezifische Leitfähigkeit von 94±47 pS. Die Zeitkonstante
der Öffnungszeiten τ lag bei 1.1±0.23 ms und die Öffnungswahrscheinlichkeit bei Po =0.3±0.1
(A,a). Nach Zugabe von ATP (B,b) erhöhte sich die Öffnungswahrscheinlichkeit auf 0.59±0.12,
τ verringerte sich auf τ =0.73±0.33 ms. Der Einzelkanal-Strom betrug 20±10 pA , bei einer
angelegten Spannung von 60 mV, und damit lag die spezifische Leitfähigkeit bei 330±53 pS.
69
4 Ergebnisse
4.7.2 Einzelkanalmessungen mit dem rekombinanten Rezeptors,
Mutante E4950K
Diese Mutante wurde bei einem Patienten mit catecholaminerger polymorpher ventrikikulärer Tachycardie (CPVT)in heterozygoter Form beschrieben [93]. Da es sich um einen
Aminosäuretausch in der C-terminalen Region des Rezeptors handelt, die für die Porenbildung verantwortlich gemacht wird, wurde untersucht, wie sich der Aminosäuretausch
E4950K auf die Kanaleigenschaften auswirkt. Dazu wurde dieser Rezeptor rekombinant
hergestellt. In unserem Patientenkollektiv wurde keine derartige Mutation nachgewiesen.
Der Rezeptor wurde wie zuvor beschrieben mittels gerichteter Mutagenese verändert(siehe
Kap 3.1.10). Der Einbau der Mutation wurde per Sequenzierung überprüft, die DNA in
HEK293 Zellen transfiziert (siehe Kap. 3.4) und das Protein elektrophysiologisch charakterisiert.
Bei Startbedingungen (50 µM freies Ca2+ , 83 mV Haltepotential) betrug die maximale
Einzelkanal-Strom Amplitude etwa 17pA (siehe Abb. 4.16, Bilder A und a). Die spezifische Leitfähigkeit des Rezeptors lag bei 204±13.8 pS, was etwa 30% des Literaturwertes
für den Wildtyp entsprach. Es wurde beobachtet, dass der Kanal vorwiegend im geöffneten Zustand vorlag (Po =0.99±0.03), nur selten waren Schließereignisse erkennbar. Die
Zeitkonstante der Öffnungsereignisse τ lag bei 9.76±2.67ms.
Es folgte die Identifikation der Orientierung des Kanals durch Zugabe von EGTA. Nach
der Zugabe konnte eine Reduzierung der Öffnungswahrscheinlichkeit beobachtet werden.
Bei zwei unabhängigen Messungen der gleichen Mutante fiel dabei der Grad der Herabsetzung der Po unterschiedlich deutlich aus. Während bei einer Aufarbeitung die Po
von 0.98 auf 0.82±0.023 reduziert wurde, lag die Po bei der anderen Aufarbeitung bei
0.38±0.07. (siehe Abb. 4.15, und Abb. 4.16, Bilder B und b) deutlich niedriger.
Bei der Messung, die die geringere Öffnungswahrscheinlichkeit in Gegenwart von EGTA ergab, war eine deutliche Zunahme des Kanal-Rauschens bei der Aufnahme zu beobachten. Der EGTA Effekt konnte bei diesem Kanal nur bei negativem Haltepotential
beobachtet werden. Bei positivem Haltepotential bewirkte die EGTA Zugabe bei dieser
Messung weder von der cis-, noch von der trans-Kammer eine Herabsetzung der Öffnungswahrscheinlichkeit.
Da der Kanal fast ständig geöffnet war, wurde auf die Zugabe des Aktivators ATP verzichtet. Es wurde im Anschluss die Wirkung von Ryanodin auf den Rezeptor untersucht.
Ryanodin hält normalerweise den Ryanodin-Rezeptor, abhängig von der Calciumkonzentration, in einem halbgeöffneten Zustand [57].
Bei dieser Mutante jedoch bewirkte die Zugabe von Ryanodin (siehe Abb. 4.16, Bilder
C und c) zunächst die Abnahme der Öffnungswahrscheinlichkeit (Po = 0.7 ± 0.05) um
etwa 30%, τ lag bei 7.36±4.82 und änderte sich somit nicht signifikant (P=0.059). Nach
etwa 10 Minuten zeigte der Rezeptor ein verändertes Verhalten (siehe Abb. 4.16, Bilder
D und d). Es waren Perioden zu beobachten, in denen der Rezeptor die Schalteigenschaften eines nicht mutierten Rezeptors zeigte, abwechselnd mit Perioden, in denen
der Kanal entweder ständig geschlossen oder geöffnet war. Die Öffnungswahrscheinlich-
70
4.7 Ergebnisse der Einzelkanalmessungen
a
0.75
0.75
0.5
0.5
0.25
0.25
0
b
1.0
P(offen)
P(offen)
1.0
15.000
Zeit[ms]
30.000
0
15.000
Zeit[ms]
30.000
Abbildung 4.15: Öffnungswahrscheinlichkeit der Mutante E4950K nach EGTA Zugabe über
einen Zeitraum von 30 sec. Bei der ersten Aufarbeitung war die Reduzierung der Po deutlicher
ausgeprägt(0.38±0.07) (A), bei der zweiten Aufarbeitung(B) fällt sie deutlich geringer aus
(0.83±0.023) .
keit erniedrigte sich auf Po = 0.6 ± 0.14, τ veränderte sich mit 6.48±4.2 ms ebenfalls
nicht signifikant (P=0.055). Diese Angaben gelten jedoch nur für die Perioden, in denen
der Kanal geregelt schaltete. Lang andauernde, halbgeöffnete Zustände, die eigentlich
durch Zugabe des Ryanodin erreicht werden, konnten nicht beobachtet werden (siehe
Abb. 4.16, Bilder C,D,c und d).
Zusammenfassend kann man feststellen, dass diese Mutante E4950K im Vergleich zum
Wildtyp wesentliche regulatorische Eigenschaften verloren hat.
71
4 Ergebnisse
A
B
o
O
20pA
g
C
o
g
D
50ms o
g
g
a
120
P(offen)
80
40
0.5
40
5
10
0.25
20
15
0
Counts (N)
600
400
200
20
40
60
800
1.0
600
0.75
0
10
30
20
5.000
10.000
5.000
10.000
0.5
400
0.25
200
-10
0
80
P(offen)
0
800
Counts (N)
0.75
120
80
b
1.0
160
Counts (N)
Counts (N)
160
0
6
4
2
0
8
c
30
60
1.0
45
0.75
P(offen)
Count (N)
Counts (N)
60
45
30
0
10
20
30
20
0
40
0.5
0.25
15
15
40
60
0
80
5.000
10.000
60
1.0
45
0.75
30
15
P(offen)
60
45
Count (N)
Counts (N)
d
30
0.25
15
0
10
20
30
40
Amplitude [pA]
0.5
0
10
20
30
40
0
Zeitkonstante der Öffnungsereigisse [ms]
5000
10.000
Zeit[ms]
Abbildung 4.16: Kanaleigenschaften der c-terminale Mutante E4950K des cardialen rekombinanten Ryanodin-Rezeptors im künstlichen Lipidbilayer. A, B C und D zeigen repräsentative
Ausschnitte der Membranströme. g gibt den geschlossenen, o den geöffneten Zustand wieder.
a, b, c und d zeigen die Verteilungen der Stromamplituden A (erste Spalte), der Öffnungszeiten
τ (zweite Spalte) und der Öffnungswahrscheinlichkeit Po (dritte Spalte) über einen Zeitraum
von 10sec. Der Kanal war bei Startbedingungen (85mV, 50 µM freie [Ca2+ ]) fast immer im
geöffneten Zustand Po =0.99±0.03, τ lag bei 9.76±2.96 ms, A lag bei 16pA (A/a). Zugabe von
EGTA (B/b) reduzierte Po auf 0.38±0.07, τ lag bei 7.36±5.21 ms, A bei 8pA bei 85 mV. Zugabe
von Ryanodin bewirkte zunächst (C/c) Erhöhung der Po auf 0.7±0.05, τ lag bei 7.36±4.82 ms,
A=38pA bei 85 mV. Nach 10 Min. konnte geregeltes Schaltverhalten des Kanals beobachtet
werden (Bilder D/d),Po =0.6±0.14, τ lag bei 6.48±4.2 ms, A lag bei 38pA bei 101 mV., Die
für Ryanodin-Zugabe typischen halbgeöffneten Zustände konnten nicht beobachtet werden.
72
4.7 Ergebnisse der Einzelkanalmessungen
4.7.3 Einzelkanalmessungen mit dem nativen Wildtyp-Kanals
Diese Messungen wurden an einem aus Herzmaterial eines ARVC-Patienten isolierten
Ryanodin-Rezeptor durchgeführt, dessen DNA dem Wildtyp entsprach. Die Überprüfung
der DNA erfolgte wie unter 3.1.12 beschrieben mittels Sequenzierung aller Exons. Bei
diesem Patienten konnte eine Abweichung im Calsequestrin nachgewiesen werden, es
handelte sich um den Polymorphismus T66A (Daten der Gruppe von Dr. H. Milting,
HDZ NRW, Bad Oeynhausen). Es wurden zwei Messungen mit unterschiedlichen Fraktionen derselben Aufarbeitung durchgeführt. Das Verhalten der beiden inkorporierten
Kanäle unterschied sich deutlich voneinander. Die Öffnungswahrscheinlichkeit der Rezeptoren bei Start-Bedingungen (Haltepotential= 81.2 mV für den ersten Typ und 85.6 mV
für den zweiten Typ, freie [Ca2+ ]=50 µM) lag bei Po,Start =0.51±0.03. Der Strom hatte
eine Amplitude von 20 pA für den ersten Typ und 40pA für den zweiten Typ, mit einer
Zeitkonstanten für die Öffnungsereignisse τ von 0.25±0.16 ms für den ersten Typ und
1.83±0.97 ms für den zweiten Typ. Die spezifische Leitfähigkeit dieses Rezeptors lag
bei 246±13 pS (erster Typ) und 467±24 pS (zweiter Typ). Somit entsprach der erste
Typ durch die Zeitkonstanten für die Öffnungsereignisse dem Verhalten der skeletalen
Isoform des Kanals (gemessen τ =0.25±0.16 ms zu Literatur [129] τ =0.224±0.027 ms),
der zweite Typ zeigte mit langen Zeitkonstanten für die Öffnungsereignisse, wie in [17]
beschrieben, das Verhalten eines Rezeptors aus dem Herzen (siehe Abb. 4.17). Die kom-
a
o
g
b
o
20pA
g
30ms
Abbildung 4.17: Vergleich der zwei untersuchten Kanäle aus dem Patienten. Die DNA entsprach dem Wildtyp. Der erste Kanal (a) besitzt eine deutlich geringere Zeitkonstanten für
die Öffnungsereignisse (τ =0.25±0.14 ms)und hat eine geringere Einzelkanal-Strom-Amplitude
mit 18pA, der zweite Typ (b) hat deutlich höhere Zeitkonstanten für die Öffnungsereignisse
(τ =1.83±0.97 ms) und eine etwa doppelt so große maximale Einzelkanal-Strom-Amplitude.
plette Analyse des Herzmuskel-typischen Kanals war bisher noch nicht möglich, daher
73
4 Ergebnisse
beziehen sich die weiteren Angaben auf den ersten, Skelettmuskel-ähnlichen Typ (siehe
Abb. 4.18).
Durch Zugabe von EGTA (siehe Abb. 4.18, Bilder B und b) reduzierte sich die Po zu
0.01±0.005, was einem nahezu vollständig geschlossenem Kanal entspricht, τ veränderte sich nicht signifikant auf 0.24±0.13 ms (P=0.122). Die maximale Einzelkanal-Strom
Amplitude verringerte sich auf 8pA.
Die Zugabe von Protein Phosphatase PP2A (siehe Abb. 4.18, Bilder C und c) verringerte
A auf 6pA bei 86 mV, die Öffnungswahrscheinlichkeit änderte sich signifikant zum Startwert, sie betrug über einen Zeitraum von 10 sec gemittelt Po,P P 2A =0.37, (P=0.0001). τ
blieb bei diesen Messungen nahezu unverändert mit Werten um τ =0.23±0.07 ms. Durch
Zugabe von ATP (siehe Abb. 4.18, Bilder D und d) konnte die Öffnungswahrscheinlichkeit auf Po,AT P = 0.57±0.11 wieder signifikant (P=0.0001) erhöht werden, τ erhöhte
sich auf τ =0.38±0.09 ms. Die Zugabe von Ryanodin (siehe Abb. 4.18, Bilder E und
e) veränderte die Öffnungswahrscheinlichkeit (0.51±0.12) nicht signifikant, (P=0.28), τ
erhöhte sich auf 0.46±0.11 ms. Die typischen halbgeöffneten Zustände konnten zwischenzeitlich beobachtet werden, sie waren jedoch nur von kurzer Dauer, danach schaltete der
Kanal wieder geregelt.
Somit kann gesagt werden, dass der Skelettmuskel-typische Kanal aus Herzmaterial eines
ARVC-Patienten unter aktivierenden Bedingungen geregelt schaltet. Durch Erniedrigung
der freien [Ca2+ ] wird der Kanal wie erwartet geschlossen. Der Aktivator ATP aktiviert
den Kanal. Der Zusatz von Phosphatase scheint den Kanal zu dephosphorylieren und
somit den geschlossenen Zustand des Kanals leicht zu stabilisieren, was durch Abnahme
der Öffnungswahrscheinlichkeit erkennbar war.
74
4.7 Ergebnisse der Einzelkanalmessungen
A
C
B
o
o
o
g
9pA
g
g
E
D
50ms
o
o
g
g
a
200
Counts (N)
Counts (N)
P(offen)
0.5
100
50
0.25
50
-10
0
10
20
30
0
20
2
4
6
8
10
5
10.000
0
5.000
10.000
0
5.000
10.000
0.5
15
P(offen)
15
5.000
0
20
Counts (N)
Counts (N)
0.75
150
100
b
1.0
200
150
10
0.25
5
0
5
10
15
20
0
2
4
6
8
c
4
8
0
Counts (N)
20
0
10
20
30
200
2
4
6
8
80
1.0
60
0.75
40
0.5
20
0.25
0
2
4
6
0
8
Count (N)
100
50
0
10
20
30
Strom-Amplitude [pA]
0.5
0.25
50
-10
10.000
0.75
150
100
5.000
1.0
200
150
P(offen)
Counts (N)
40
-10
0.2
10
60
0.6
0.4
P(offen)
0
80
Counts (N)
100
50
-4
e
150
P(offen)
100
50
d
0.8
200
Counts (N)
Counts (N)
200
150
0
2
4
6
8
Zeitkonstante der
Öffnungsereignisse t [ms]
0
5.000
10.000
Zeit[ms]
Abbildung 4.18: Kanaleigenschaften des nativen Wildtyp Ca2+ -Freisetzungskanals im künstlichen Lipidbilayer. A, B C, D und E zeigen repräsentative Ausschnitte der Membranströme.
g gibt den geschlossenen, o den geöffneten Zustand wieder. a, b, c, d und e zeigen die Verteilungen der Stromamplituden A (erste Spalte), der Öffnungszeiten τ (zweite Spalte) und der
Öffnungswahrscheinlichkeit Po (dritte Spalte) über einen Zeitraum von 10sec. Der Kanal zeigte
bei Startbedingungen (86.5 mV, 50 µM [Ca2+ ]) eine Po =0.51±0.03, τ lag bei 0.25±0.16 ms,
A=20pA (A/a), Zugabe von EGTA (B/b) reduzierte Po auf 0.01±0.005, τ lag bei 0.24±0.13 ms,
A reduzierte sich auf 8pA bei 85 mV. Zugabe von Protein Phosphatase (C/c) verringerte A
auf 6pA bei 85 mV, Po,P P 2A auf 0.37±0.12 und τ lag bei 0.23±0.07 ms. Zugabe von ATP
(D/d) erhöhte Po auf 0.57±0.11, τ =0.38±0.09 ms A=15 pA bei 86 mV. Zugabe von Ryanodin (E/e) veränderte Po auf 0.51±0.02 und τ =0.46±0.11 ms. Die typischen halbgeöffneten
Zustände konnten zwischenzeitlich beobachtet werden, sie waren jedoch nur von kurzer Dauer,
danach schaltete der Kanal wieder geregelt.
75
4 Ergebnisse
4.7.4 Einzelkanalmessungen des nativen Ca2+ -Freisetzungskanals
mit den Mutationen G1885E und G1886S
Der Ca2+ -Freisetzungskanal wurde aus dem explantierten Herzen des Patienten aufgearbeitet, der in der Mutationsanalyse in Exon 37 die Mutationen G1885E und G1886S
aufwies. Der Kanal zeigte bei den Anfangsbedingungen (Haltepotential 92.5 mV, freie
[Ca2+ ]=50 µM) sehr unterschiedliche Eigenschaften. Teilweise war er fast ständig geöffnet Po = 0.99 (siehe Abb. 4.19, Bilder A und a), teilweise jedoch lag die Po bei nur 0.1. Da
dies innerhalb einer Messung zu beobachten war, konnte man ausschließen, dass es sich
um verschiedene Rezeptor-Populationen handelte, es scheint sich eher um charakteristische Eigenschaften der Mutante zu handeln. Die Zeitkonstante der Öffnungsereignisse
τ lag bei 2.4±1.7 ms, die maximale Einzelkanal Strom-Amplitude A lag bei 17pA, die
spezifische Leitfähigkeit betrug 182±12 pS und entsprach somit etwa 30% des Literaturwertes [50].
Die Zugabe von EGTA (siehe Abb. 4.19, Bilder B und b) verringerte die Öffnungswahrscheinlichkeit auf Po = 0.013±0.001. τ lag bei 0.88±0.67 ms, der Einzelkanalstrom lag
bei 35 pA bei 96 mV.
Die Zugabe von PP2A (siehe Abb. 4.19, Bilder C und c) verringerte die Po signifikant
zu 0.32±0.21 (P=0.001), τ lag bei 0.5±0.0.12 ms, die maximale Einzelkanal StromAmplitude lag bei 5 pA bei 84 mV. Durch Zugabe von ATP konnte die Po auf 0.54±0.12
erhöht werden, τ lag bei 1.23±0.37 ms, die maximale Strom-Amplitude lag bei 12pA
bei 61 mV. Die Zugabe von Ryanodin (siehe Abb. 4.19, Bilder D und d) bewirkte die
Reduktion der Po auf 041±0.08, τ lag bei 1.16±0.34 ms, die maximale Strom-Amplitude
lag bei 17pA bei 61 mV. Der Übergang zu halbgeöffneten Zuständen konnte beobachtet
werden.
Es lässt sich zusammenfassend sagen, dass sich der Kanal bei aktivierender [Ca2+ ] sehr
inhomogen verhält. Die Reduktion der freien [Ca2+ ] reduzierte die Öffnungswahrscheinlichkeit wie erwartet. Der Aktivator ATP führte erwartungsgemäß zu einer Erhöhung
der Öffnungswahrscheinlichkeit. In Gegenwart von Protein-Phosphatase wurde der geschlossene Zustand des Kanals leicht stabilisiert. Die Zugabe von Ryanodin bewirkte
typische halbgeöffnete Zustände.
76
4.7 Ergebnisse der Einzelkanalmessungen
C
B
A
o
o
g
g
g
E
D
o
o
g
g
8pA
o
a
100
1.0
P(offen)
Counts (N)
Counts (N)
100
75
75
0.75
50
50
0.5
25
25
0.25
]
-8
8
0
16
50ms
0
1
2
3
5.000
10.000
0
5.000
10.000
0
5.000
10.000
5.000
10.000
4
0
b
30
15
60
1.0
45
0.75
P(offen)
Counts (N)
Counts (N)
60
45
30
15
0
10
30
20
2
0
40
0.5
0.25
4
6
8
c
300
200
100
300
200
0
8
4
Counts (N)
600
400
200
2
4
6
8
800
1.0
600
0.75
400
10
30
20
0.5
0.25
200
0
0.5
0.25
P(offen)
0
800
Counts (N)
1.0
0.75
100
-4
d
400
P(offen)
Counts (N)
Counts (N)
400
0
40
2
4
6
0
8
e
600
400
800
1.0
600
0.75
P(offen)
Count (N)
Counts (N)
800
400
200
200
-7.5
0
7.5
15
22.5
Amplitude [pA]
30
0
0.5
0.25
2
4
6
8
Zeitkonstante der
Öffnungsereignisse t [ms]
0
5.000
10.000
Zeit[ms]
Abbildung 4.19: Einzelkanalmessungen des nativen Ca2+ -Freisetzungskanals mit den Mutationen G1885E und G1886S. A, B C und D zeigen repräsentative Ausschnitte der Membranströme. g gibt den geschlossenen, o den geöffneten Zustand wieder. a, b, c und d zeigen die
Verteilungen der Stromamplituden A (erste Spalte), der Öffnungszeiten τ (zweite Spalte) und
der Öffnungswahrscheinlichkeit Po (dritte Spalte) über einen Zeitraum von 10sec. Der Kanal
zeigte bei Anfangsbedingungen (HP 92.5 mV, freie [Ca2+ ]=50 µM) hohe Po von 0.99, τ lag bei
2.4±1.7 ms, A lag bei 16pA. (A/a). Zugabe von EGTA (B/b) verringerte Po auf 0.013±0.001,
τ lag bei 0.88±0.67 ms, A= 35pA bei 95 mV. Zugabe von PP2A (C/c) verringerte Po zu
0.32±0.21, τ lag bei 0.5±0.0.12 ms, A lag bei 5pA bei 84 mV. Zugabe von ATP erhöhte Po auf
0.54±0.12, τ lag bei 1.23±0.37 ms, A lag bei 12pA bei 61 mV. Zugabe von Ryanodin (D/d)
bewirkte Reduktion der Po auf 041±0.08, τ lag bei 1.16±0.34 ms, A lag bei 17pA bei 61 mV.
Der Übergang zu halbgeöffneten Zuständen konnte beobachtet werden.
77
4 Ergebnisse
Bei diesem Kanal war besonders auffällig, dass er zwischenzeitlich zwischen 4 verschiedenen Leitfähigkeitszuständen sprang. Nach Zugabe von Phosphatase und ATP stabilisierte sich der Kanal insofern, dass er nur noch zwei Leitfähigkeitszustände aufwies,
die dem komplett geöffnetem, bzw. komplett geschlossenem Kanal entsprachen (siehe
Abb. 4.20).
a
o
10pA
g
b
o
100ms
g
Abbildung 4.20: Vergleich des nativen, mutierten Kanals vor und nach PP2A/ATP-Zugabe.
Vor der Zugabe von PP2A/ATP sprang der Kanal zwischen 4 verschiedenen Leitfähigkeitsniveaus, er zeigte kein geregeltes Schaltverhalten. Nach Zugabe von PP2A/ATP war ein normales
Schaltverhalten mit zwei Leitfähigkeitsniveaus, offen (o) und geschlossen (g) erkennbar.
Von allen vier Kanälen (Wildtyp rekombinant, rekominant mit Mutation E4950K,
Wildtyp nativ und nativ mit Mutation G1885E oder G1886S) wurden Strom- Spannungskurven aufgenommen. Es konnte gezeigt werden, dass sich alle Rezeptor-Kanäle
wie ein Ohmscher Widerstand verhielten (siehe Abb. 4.21). Dies ist das typische Verhalten der nicht spannungsabhängigen Ca2+ -Freisetzungskanäle.
78
4.7 Ergebnisse der Einzelkanalmessungen
a
-40
-20
150
150
100
100
50
50
0
0
20
-10
-100
-100
Strom [pA]
150
100
100
50
-20
20
-150
d
150
-40
10
-50
-150
c
-20
40
-50
Spannung [mV]
-60
b
200
50
20
40
-20
-10
10
-50
-50
-100
-100
-150
-150
20
Abbildung 4.21: Strom-Spannungskurve der vier Ca2+ -Freisetzungs-Kanäle: Wildtyp rekombinant (a), rekominant mit Mutation E4950K (b), Wildtyp nativ (c) und nativ mit Mutation
G1885E oder G1886S (d). Alle zeigen die Charakteristik eines Ohmschen Widerstands
79
4 Ergebnisse
80
5 Diskussion
In dieser Arbeit wurde das Gen des humanen cardialen Ryanodin-Rezeptors bei Patienten mit dilatativer Cardiomyopathie, DCM, und arrhythmogener rechtsventrikulärer
Cardiomyopathie, ARVC, mit Hilfe der Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus
(SSCP) Methode, Schmelztemperaturanalyse und Sequenzierung untersucht. Es wurde die DNA von 93 Patienten (80 DCM und 13 ARVC Patienten) untersucht, bei 23 der
Patienten kann ein familiärer Hintergrund der Erkrankung vermutet werden. Die Mutationsanalyse lieferte zwei Abweichungen im Gen des cardialen Ca2+ -Freisetzungskanals,
beide Abweichungen befinden sich in Exon 37, die Aminosäuren 1885 und 1886 sind
betroffen.
Die Untersuchungen des Exons 37 stellten sich als sehr widersprüchlich dar. Alle drei verwendeten Untersuchungsmethoden lieferten stark voneinander abweichende Verteilungen
der Abweichungen G1885E und G1886S. Die unsicherste Methode hat die SSCP dargestellt, da nachgewiesen werden konnte, dass Abweichung G1886S zu keiner Lauflängenänderung im nativen Acrylamidgel führte (siehe Kap. 4.2). Die aus diesem Grunde zusätzlich
durchgeführte Schmelztemperaturanalyse sollte valide Ergebnisse liefern, da die eingesetzten Sonden genau auf die zu untersuchende Sequenz abgestimmt waren. Doch auch
hier stellte sich heraus, dass in zwei unabhängigen Untersuchungen derselben Proben
unterschiedliche Schmelzpunkte detektiert wurden. Dies war ein Hinweis darauf, dass es
bei der Replikation dieser Sequenz Schwierigkeiten gab.
Daher wurde die Verteilung der Abweichungen G1885E und G1886S mittels SangerSequenzierung/Cycle-Sequencing überprüft. Dass auch diese Methode technisch bedingt
Limitationen aufweist zeigte sich bei der Analyse eines Patienten, bei dem der senseStrang die Abweichung G1885E ergab, wobei unter dem Guanosin, welches Abweichung
G1886S bedingen würde, ein sehr kleines, von der Auswertesoftware nicht als valides
Signal interpretiertes Adenosin vorkam. Die Sequenzierung des antisense-Strang jedoch
wies eindeutig beide Abweichungen heterozygot auf, wobei das Untergrundsignal der
sense-Sequenzierung in dieser Sequenzierung ein valides Signal gab.
Das Problem der hier eingesetzten Methode ist, dass die Sequenziergeräte eine spezifische
Fluoreszenzverteilung berechnen, die aus der partiellen Überlappung der EmmissionsSpektren entstehen. Das bedeutet, dass es auch zu dem Fall kommen kann, dass ein
valides Signal nach Abzug der Intensitäten interferierender Sonden nicht mehr von der
Auswertesoftware erfasst wird. Deshalb wurde diese Probe einmal sequenziert, wobei ein
Kapillarsequenzierer (ABI 310) benutzt wurde, um Gerätefehler oder Ungenauigkeiten
81
5 Diskussion
des Plattensequenzierers auszuschließen. Die Ergebnisse waren nicht eindeutiger und unabhängig von dem verwendeten Primer (sense oder antisense). Auch andere, näher an
der zu untersuchenden Stelle liegende Primer führten nicht zu eindeutigen Ergebnissen.
Dieses Verhalten trat allerdings nur bei zwei der Proben auf, die anderen auf beiden
Strängen untersuchten Proben lieferten konsistente Ergebnisse in Strang und Gegenstrang.
Eine weitere Erklärung für dieses Phänomen ist, dass die in allen drei Untersuchungsmethoden eingesetzte Taq-Polymerase (mit oder ohne Korrekturfähigkeit, Korrektur durch
Exonukleaseaktivität), Schwierigkeiten beim Erkennen und Replizieren der Sequenz hatte. Die Originalsequenz zeigt sechs Guanosine hintereinander, was eine besonders starke
Bindung der beiden Doppelstränge der DNA in diesem Bereich verursacht. Der Einsatz
von Pfu-Polymerase brachte allerdings auch keine neuen Erkenntnisse. Bei der Sequenzierung konnte auf die normale Taq-Polymerase nicht verzichtet werden, da diese im
fertig gelieferten Sequenziermix eingesetzt wurde. Eine andere Polymerase war für diesen Sequenzierer nicht erhältlich. Ein Nachteil der Taq ist weiterhin, dass sie aufgrund
sterischer Probleme nicht in der Lage ist, alle ’Farbstoff-Nukleotide’ bei der Sequenzierung gleich gut einzubauen. Diese Fähigkeit zum Einbau hängt zusätzlich noch von der
vorangegangenen Base ab.
Auffällig war bei den Sequenzierungen die unterschiedliche Verteilung der Abweichungen in Exon37 bei den Kontrollen und den Patienten. Abweichung G1885E wurde von
Marks et al. [7] als gewöhnlicher Polymorphismus bezeichnet. Es ist in dieser Arbeit aber
festgestellt worden, dass diese Klassifizierung wahrscheinlich nicht korrekt ist, da die
Verteilung dieser Abweichung nicht normalverteilt zu sein scheint. Abweichung G1885E
kommt in etwa 71% der Kontrollen vor, wohingegen der in der Medline Datenbank [134]
angegebene Wildtyp G1885 nur in 29% der hier analysierten Kontrollen vorkommt.
Da Abweichung G1885E deutlich häufiger ist als der Wildtyp, sollte man Abweichung
G1885E eher als Wildtyp bezeichnen und den sogenannten Wildtyp (G1885) als Abweichung dazu sehen.
Sieht man sich dagegen die Verteilung der Abweichung G1885E bei den Patienten an,
so tritt sie hier signifikant seltener auf. Dies könnte ein Hinweis darauf sein, dass der
Wildtyp“, also G1885, eine Art Risikofaktor darstellen könnte, im Laufe seines Lebens
”
eine Herzinsuffizienz zu entwickeln. Ein weiterer Ansatz wäre, dass diese Abweichung
G1885 ein Modifier ist. Nicht jeder herzinsuffiziente Patient bedarf einer Transplantation. Die hier untersuchten Patienten spiegeln somit den ’schlimmsten Fall’ wieder, da
sie alle zur Herztransplantation eingewiesen wurden. Somit könnte es sein, dass eine aus
anderen Gründen ausgelöste Herzinsuffizienz durch die Ausprägung des Genotyps G1885
schwerer verläuft.
Exon 37 liegt in einem Bereich, dem bisher keine besonderen strukturellen oder funktionellen Eigenschaften zugewiesen wurden. Es wurde gezeigt, dass in diesem glutamatreichen Bereich (Aminosäuren 1853-1891) eine α-Helix vorliegt, die zwischen dem skeletalen und cardialen Ryanodin-Rezeptor mäßig konserviert ist [139]. Es gibt im cardialen
Rezeptor zwischen Aminosäuren 1853 und 1891 Deletionen von insgesamt 13 Aminosäur-
82
en [139] im Vergleich zur skeletalen Isoform.
Die Aminosäure G1885 ist in verschiedenen Spezies (Mensch, Maus und Kaninchen)nicht
konserviert (siehe Abb. 5.1), aber es handelt sich in den drei Spezies um eine unpolare,
ungeladene Aminosäure, wohingegen der hier nachgewiesene Austausch zu Glutamat einem nicht-konservativen Tausch entspricht. Durch das Glutamat wird eine zusätzliche
negative Ladung in das Protein eingeführt, deren Auswirkung sich jedoch kaum absehen lässt. Die Aminosäure befindet sich in einem Bereich, der in der skeletalen Isoform
als glutamatreich bezeichnet wird [43], es kommen 39 Glutamat-Reste vor. Auch in der
cardialen Isoform sind 12 dieser Glutamat-Reste konserviert, so dass eine dreizehnte
negative Ladung in diesem ohnehin sehr sauren Bereich nur geringe strukturgebende
Eigenschaften haben sollte. Wirklichen Aufschluss darüber erlauben aber nur kristallographische Untersuchungen des Ryanodin-Rezeptors.
RyR2 Mensch
RyR1 Mensch
RyR2 Kaninchen
RyR2 Maus
G
_
EEAK E GKRPK
EEADEGEKEE
EEAKVGKRPK
EEAKGGKRPK
Abbildung 5.1: Multiples Alignment verschiedener Ryanodin-Rezeptoren im Bereich der beiden gefundenen Abweichungen. Verglichen wurden der menschliche cardiale Rezeptor mit der
menschlichen skeletalen Isoform und dem cardialen Rezeptor des Kaninchens und der Maus.
Aminosäure G1886 ist in allen Isoformen konserviert, während dies bei Aminosäure G1885
nicht der Fall ist.
Aminosäure 1886 ist in allen in Abb. 5.1 gezeigten Ryanodin-Rezeptoren von Mensch
(skeletale und cardiale Isoform), Maus und Kaninchen (jeweils cardiale Isoform) konserviert.
Auch die Häufigkeit, mit der der Basentausch gefunden wurde, verhält sich bei Abweichung G1886S umgekehrt zu Abweichung G1885E. Sie ist in den Kontrollen nur
zu 2.5% aufgetreten, während sie bei den Patienten in 21.5% der Fälle nachgewiesen
werden konnte. Dies ist nahezu eine Verneunfachung der Häufigkeit, was ein deutlicher
Hinweis darauf ist, dass Abweichung G1886S einen Risikofaktor zur Entwicklung einer
Herzinsuffizienz darstellen könnte. Außerdem konnte die Mutation in keinem Individuum
homozygot nachgewiesen werden. In den Einzelkanalmessungen im künstlichen Lipidbilayer konnte nachgewiesen werden, dass der Kanal des Patienten, der Abweichungen
G1885E und G1886S exprimiert, signifikant abweichende Kanaleigenschaften zeigte (siehe Abb. 4.19). Die Abweichung, die zu dem Aminosäuretausch G1886S führt, ist in der
Literatur bisher nicht beschrieben worden, möglicherweise handelt es sich um keinen
häufig in der Bevölkerung vorkommenden Polymorphismus. Der gefundene AminosäureTausch ist nicht konservativ, ein Glycin wird durch ein Serin ersetzt. Dies bedeutet, dass
eine zusätzliche potentielle Phosphorylierungsstelle in das Protein eingebracht wird. Es
83
5 Diskussion
wird eine Erkennungssequenz für die Protein Kinase C geschaffen. Diese Kinase benötigt
zur Erkennung die Sequenz S/T-X-K/R oder K/R-X-S/T 1 , somit gibt es zwei Möglichkeiten für die Protein Kinase C (PKC) die Sequenz in Exon 37 zu erkennen (K-G/E-S
und S-K-R). In der Literatur ist bisher die Beteiligung der Proteinkinase C bei der
Ryanodin-Rezeptor Regulation nicht beschrieben worden. Die Protein Kinase C wird
über die Phosphoinositidkaskade bei Aktivierung von Plasmamembran-Rezeptoren von
Wachstums-Faktoren und bei der Tumorentwicklung aktiviert. Dabei wird neben den
IP3 -Rezeptoren auch Diacylglycerin gebildet, das den Aktivator der PKC darstellt [140].
Weiterhin muss zur Aktivierung der PKC Ca2+ und Phosphatidylserin vorhanden sein.
Es ist bekannt, dass die Protein Kinase C über den Angiotensin- und Endothelinweg bei
Patienten mit Herzinsuffizienz im verstärkten Maße aktiviert ist [141], was ein weiterer
Hinweis auf eventuelle Beteiligung dieses Systems ist. Ob in dem Ryanodin-Rezeptor das
Serin 1886 sterisch für die Kinase zugänglich ist, und ob sie überhaupt aktiviert werden
kann, ist nicht bekannt. Sollte dies allerdings der Fall sein und die Aminosäure 1886S
wirklich phosphoryliert werden, so könnte dies z.B. zu einer einer verminderten FKBPBindung resultieren. Die Auswirkungen der Mutation wurden in Einzelkanalmessungen
überprüft und werden im Zusammenhang mit den Einzelkanalergebnissen diskutiert.
Somit konnte zum ersten Mal eine Abweichung im Gen des cardialen Ryanodin-Rezeptors
mit der DCM in Zusammenhang gebracht werden. Die Aussage kann sogar auf eine
allgemeine Herzinsuffizienz ausgeweitet werden, da sich im Patientenkollektiv sowohl
Personen mit DCM, als auch Personen mit ARVC befanden. Die Abgrenzung der verschiedenen Formen der Herzinsuffizienz im Anfangsstadium voneinander scheint anhand
der klinischen Bilder recht schwierig und nicht immer eindeutig zu sein. So wurde z.B.
der ARVC Patient, der beide Abweichungen aufzeigt, zunächst als DCM Patient klassifiziert. Die Ergebnisse dieser Arbeit sind ein Hinweis darauf, dass es immer notwendiger
wird, die Einteilung der verschiedenen Formen der Herzinsuffizienz nach dem klinischen
Erscheinungsbild mit Hilfe der zunehmenden Methoden/Erkenntnisse der molekularen
Kardiologie weiter zu differenzieren.
Durch die Identifizierung der beiden Abweichungen G1885E und G1886S konnte ein Beitrag dazu geleistet werden.
Funktionelle Auswirkungen dieser und anderer Mutationen in der cDNA des cardialen
Ryanodin-Rezeptors wurden im Anschluss an das Mutationsscreening untersucht.
Dabei wurden sowohl rekombinant dargestellte Ryanodin-Rezeptoren, als auch aus Herzmaterial von ARVC-Patienten aufgereinigte Membranproteine charakterisiert. Bei den
rekombinanten Rezeptoren handelte es sich um ein heterogenes System, da es sich bei
dem Klon um die cDNA des cardialen Ryanodin-Rezeptors aus Kaninchen handelte, in
die eine Mutation eingebaut wurde, die bei einem Menschen gefunden wurde.
Die cardialen Ryanodin-Rezeptoren von Mensch und Kaninchen haben auf Aminosäureebene eine Ähnlichkeit von 98.6%. Somit sollten die Kanaleigenschaften sehr ähnlich sein,
was Studien mit Einzelkanalmessungen auch gezeigt haben [50].
1
S=Serin, T=Threonin, X=beliebige Aminosäure, K=Lysin und R=Arginin
84
Da die C-terminale Region eine besondere Rolle bei der Calciumfreisetzung darstellen
könnte, wurde zusätzlich zu den selbst gefundenen Basentauschen eine Mutante hergestellt, die bei einem Patienten mit catecholaminerger polymorpher ventrikulärer Tachycardie beschrieben wurde [93]. Diese Mutation liegt in dem C-terminalen Bereich
des Rezeptors. Es handelte sich um Aminosäure 4950. Die Wildtyp-Aminosäure war
ein Glutamat, also eine Aminosäure mit negativ geladener Seitenkette, die heterozygot
durch Lysin, also einer Aminosäure mit positiv geladener Seitenkette, ersetzt wurde.
Die Eigenschaften nativer und rekombinanter Ryanodin-Rezeptoren ohne Mutationen (RyR1) im künstlichen Lipidbilayer unterscheiden sich nur unwesentlich voneinander [129]. So ist etwa die Zeitkonstante der Öffnungsereignisse leicht, jedoch nicht
signifikant (0.220 ms nativ zu 0.227 ms rekombinant), erhöht. Im Rahmen dieser Arbeit
betrug die spezifische Leitfähigkeit des rekombinanten Wildtyps nur etwa 25% des Normalwertes von etwa 700pS [50]. Eine mögliche Erklärung wäre das Fehlen ausreichender
Mengen FKBP. Wird ein nativer Kanal aufgearbeitet, so bleibt das FKBP12.6 mit dem
Rezeptor assoziiert. Reinigt man rekombinante Kanäle auf, so scheinen signifikant geringere FKBP-Konzentrationen vorhanden zu sein. Dies könnte die bei Chen et al. [129]
gefundenen Diskrepanzen erklären.
Der analysierte Wildtyp-Kanal weist bei aktivierendenr [Ca2+ ] in den Experimenten normale Öffnungswahrscheinlichkeiten (gemessen Po =0.3 zu 0.33 in der Literatur [50]) auf.
Auch konnte die Öffnungswahrscheinlichkeit durch ATP-Zugabe (Po =0.59 zu 0.39 in
der Literatur [129]) erhöht werden. Somit hat der Kanal zwar eine geringere spezifische
Leitfähigkeit, was durch Fehlen von FKBP bedingt sein könnte, besitzt aber typische
regulatorische Eigenschaften.
Der zweite rekombinant dargestellte Rezeptor enthielt eine durch gerichtete Mutagenese
eingebrachte Mutation im C-terminalen Bereich des Kanals. Aminosäure 4950 wurde
von Glutamat zu Lysin verändert.
Diese RyR2-Mutante besitzt eine Öffnungswahrscheinlichkeit, die bei einer freien [Ca2+ ]
von 50 µM nahe bei 1 liegt. Die Reduzierung der [Ca2+ ], was eine Simulation der diastolischen Situation darstellt, führte bei dieser Mutante nur zu geringfügiger Absenkung des
Öffnungswahrscheinlichkeit auf 30-82%. Auch bei submikromolarem [Ca2+ ] besitzt dieser
Kanal eine Tendenz zum Öffnen. Die Folge dessen könnte im Herzen eine erhöhte diastolische [Ca2+ ] sein, was zu einem veränderten Calciumtransienten führen könnte. Daraufhin müssten die SR-Ca ATPase und der Na-Ca Tauscher mit hoher Aktivität arbeiten,
um ein annähernd funktionsgerechtes Verhalten der Myocardzelle zu gewährleisten. Dies
alles sind Hinweise, dass eine homozygote Ausprägung der Mutante E4950K eher unwahrscheinlich sind. In der Tat weist der Patient nur eine heterozygote Ausprägung auf.
Dies bedeutet, dass er auch Rezeptoren besitzt, die dem Wildtyp entsprechen. Diese weisen eine normale Schaltfunktion auf und könnten somit die Auswirkungen der anderen,
mutierten Kanäle im Zellverband teilweise abfangen.
Ungeklärt ist bisher auch die Beobachtung, dass der Kanal nach Zugabe von Ryanodin
nach etwa 10 Minuten beginnt wie ein Wildtyp-Kanal geregelt zu schalten. Diese Ergeb-
85
5 Diskussion
nisse stimmten mit den Beobachtungen von Du et al. [50] überein. Die Gruppe hatte
verschiedene Mutationen in der Porenregion des cardialen Ryanodin-Rezeptors untersucht. Mehrere Mutationen, beispielhaft G4828A, führten, ebenso wie die hier analysierte Mutante, unabhängig von Effektoren und Calcium-Konzentration zu einem praktisch
ständig geöffneten Ca2+ -Freisetzungskanal. Auch diese Mutante zeigte erst nach Zugabe
von Ryanodin in hohen Konzentrationen (100 µM über Nacht) ein Schaltverhalten mit
längeren geschlossenen Phasen, aber ebenfalls keine halbgeöffneten, lang anhaltenden
Zustände, die für den Ryanodin-Rezeptor typisch sind.
Beide Mutanten besaßen eine spezifische Leitfähigkeit die bei 2/3 des Wildtyps mit rund
700 pS lag [50]. Beide scheinen aber ihre regulatorischen Fähigkeiten komplett verloren
zu haben, da sie auf keinen Effektor reagierten. Die Ursache dafür könnten Konformationsänderungen der Mutante E4950K im Kanal sein. Ein Erklärungsansatz wäre, dass
das C-terminale Ende, ähnlich wie beim K-Kanal [142], eine Art ’Stopfen’ bilden kann
(siehe Abb. 5.2), der den Kanal schließt. Ob der C-terminale Bereich allerdings frei beweglich ist und ob eine Interaktion der Aminosäuren des C-Terminus mit Aminosäuren
der transmembranen Domänen besteht, wurde bisher nicht geklärt.
Die Messungen des nativen Kanals des ARVC Patienten, dessen DNA dem Wildtyp
a
b
?+- E4950
? +K4950
+
Abbildung 5.2: Modell der Regulation des Kanals mit der Mutation E4950K. Vorgeschlagen
wird, dass sich der C-terminale Bereich als eine Art Stopfen über die Pore legt (Bild a). Dies
wäre aufgrund der veränderten Ladung in der Mutante (Bild b) nicht mehr möglich. Abb.
nach [2]
entsprach, zeigte eine den Literaturangaben [50] entsprechende Öffnungswahrscheinlichkeit. Auch sprach dieser Kanal auf EGTA (Minderung der Po ), ATP (Erhöhung der
Po ) in erwarteter Weise an. Der Zusatz von Ryanodin bewirkte aber keine langfristig
halbgeöffneten Zustände, die spezifische Leitfähigkeit lag um Faktor 2 bis 3 unter der
des Wildtyps mit 700pS, was zeigt, dass der Kanal in seinem Verhalten nicht in allen
Eigenschaften dem Wildtyp-Kanal entsprach.
Der Kanal schaltete sehr schnell mit Zeitkonstanten der Öffnungsereignisse von etwa
0.2 bis 0.4 ms. Dies gibt einen Hinweis darauf, dass sich der Kanal eher wie die Skelettmuskelisoform verhält. Diese Kanäle weisen Zeitkonstanten von 0.22 ms auf [129].
RyR2 hingegen schaltet mit Zeitkonstanten von >1 ms deutlich langsamer, wie auch
86
im zweiten Versuch mit einem anderen Kanal dieses Patienten gezeigt werden konnte,
(siehe Abb. 4.17).
In der Literatur ist beschrieben worden, dass in insuffizienten Herzen die Expression der
Skelettmuskel-Isoform etwa verdoppelt ist [143]. Der Nachweis erfolgte in dieser Studie
über RT-PCR und Western Blot Analyse.
Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse lassen sich am besten interpretieren, wenn
man annimmt, dass die skeletale Isoform in messbaren Mengen im Herzen dieses Patienten exprimiert wurde. Es könnte demnach sein, dass in dieser einen Messung ein
Skelettmuskel Rezeptor eingebaut wurde.
Bei einer zweiten Messung mit einer anderen Probe desselben Patienten konnten deutlich
andere Werte der Zeitkonstanten für die Öffnungsereignisse ermittelt werden. Die mittlere Öffnungsdauer war um Faktor 10 höher (τ =2 ms) als bei der ersten Messung, die
spezifische Leitfähigkeit war etwa 50% höher. Der Kanal schien dem Herztyp zu entsprechen. Dies ist ein weiterer Hinweis darauf, dass bei diesem Patienten zwei unterschiedliche
Populationen des Ryanodin-Rezeptors, RyR1 und RyR2, im Herzen exprimiert werden.
Der Skelettmuskel-ähnliche Kanal entsprach aufgrund seiner spezifischen Leitfähigkeit
und seinem Ansprechverhalten auf Ryanodin nicht dem Wildtyp. Bei diesem Patienten
wurde im Gen des Calsequestrins ein Polymorphismus T66A nachgewiesen. Es ist bisher
noch nicht abschließend geklärt worden, wie sich dieser Polymorphismus auf die Funktion des Calsequestrins, oder dessen Interaktion mit dem Ryanodin-Rezeptor auswirkt.
Auffällig war bei allen inkorporierten Kanälen beider Patientenproben, dass der Rezeptor innerhalb kurzer Perioden zwischen vier Leitfähigkeitszuständen sprang, wobei dieses
Phenomen bei dem Patienten mit Wildtyp-DNA deutlich seltener auftrat als bei dem
Patienten mit den Mutationen.
In der Literatur finden sich zwei Erklärungsansätze für dieses Verhalten. Zum einen wurden Einzelkanalexperimente von Ryanodin-Rezeptoren FKBP-defizienter Mäusen durchgeführt [124]. Diese Kanäle zeigen sowohl in der skeletalen, als auch in der cardialen
Isoform vier Leitfähigkeitszustände, die 1/4, 1/2 und 3/4 der vollständigen Öffnung entsprachen (siehe Abb. 5.3).
Dies spiegelt das Verhalten der Kanäle der beiden Patienten sehr gut wieder. Auch
die Tatsache, dass sich der Kanal nach Phosphatase-Behandlung und ATP Behandlung
stabilisierte (siehe Abb. 4.20) spricht dafür, dass der Kanal zuvor phosphoryliert war.
Man könnte daraus schließen, dass bei den Rezeptoren der untersuchten Patienten die
Wechselwirkung zum FKBP (eventuell aufgrund von Phosphorylierung) gestört ist. Dies
könnte weiterhin bedeuten, dass der Kanal dieser Patienten nicht richtig im geschlossenen Zustand stabilisiert werden kann. Der Kanal könnte auch während der Diastole
kleine Mengen Calcium freisetzen und somit den veränderten Calciumtransienten, wie
in der Einleitung beschrieben, begründen.
Der zweite Ansatz beschreibt das gekoppelte Schalten der Kanal-Monomere in einem Tetramer [132]. Diese Studie besagt, dass es durch die Entkopplung der Kanal-Monomere
(z.B. durch Inkubation mit Rapamycin) zu Zwischenleitfähigkeits-Zuständen kommt,
87
5 Diskussion
a
A
o
g
b
B
o
10pA
10pA
g
250ms
100ms
Abbildung 5.3: In a und A sind die beiden Wildtyp-Kanäle aus Maus (Angaben aus [124])
und Kaninchen (gemesssen mit rekombinantem Wildtyp) dargestellt. Beide zeigen normales
Schaltverhalten, der geschlossene Zustand liegt auf dem Niveau der Grundlinie. Abbildungen
b und B zeigen den Kanal einer FKBP defizienten Maus und den Kanal eines ARVC Patienten.
Beide Kanäle springen zwischen vier Leitfähigkeitszuständen, die der Leitfähigkeit von1/4, 1/2,
3/4 und voller Öffnung des Kanals entsprechen. Ein georndetes Öffnungs- und Schliessverhalten
ist bei den FKBP defizienten Mäusen und -Patienten Kanälen nicht erkennbar. Abb. a und b
nach [124]
die der Öffnung von einer, zwei, drei oder vier Untereinheiten eines Ryanodin-Rezeptor
Tetramers entspricht. Auch hier wird die fehlende Wechselwirkung mit FKBP als eine
mögliche Ursache genannt.
Da bei beiden Patienten dieses Verhalten des Ryanodin-Rezeptors nachgewiesen werden
konnte, ist dies ein Hinweis darauf, dass bei Patienten, die an einer Herzinsuffizienz leiden, die Bindung des FKBP zum Ryanodin-Rezeptor geschwächt sein könnte. Wie es
zu der reduzierten Wechselwirkung vom Ryanodin-Rezeptor mit dem FKBP kommt, ist
noch nicht geklärt.
Betrachtet man den Kanal des Patienten mit den Abweichungen G1885E und G1886S,
so findet man die Leitfähigkeitssprünge deutlich häufiger als bei dem Patienten ohne Mutation. Hinzu kommt, dass eine der beiden Abweichungen einen Austausch von Glycin
zu Serin bedingt. Dies bedeutet, dass unter Berücksichtigung der Erkennungssequenz,
eine zusätzliche potentielle Phosphorylierungsstelle für die Protein Kinase C vorhanden ist. Würde diese wirklich aktiviert, bedeutet dies auch eine potentielle Beteiligung
88
einer anderen als der β-adrenergen Signal-Kette bei der Phosphorylierung des RyanodinRezeptors.
Anhand der vorgestellten Ergebnisse ließe sich folgendes, hypothetische Modell zur Erklärung des ungewöhnlichen Schaltverhaltens des Ryanodin-Rezeptors von Patienten mit
DCM/ARVC vorschlagen (siehe Abb. 5.4):
Durch die Mutation G1886S wird eine neue potentielle Posphorylierungstelle im Ca2+ Freisetzungskanals geschaffen. Die Protein Kinase C kann diesen Serin-Rest zusätzlich
phosphorylieren. Durch diese Phosphorylierung wird die Wirkung des FKBP12.6 verringert, wodurch die Regulation des Schaltverhaltens weniger strikt und koordiniert ist, es
kommt zu einer Destabilisierung des geschlossenen Zustandes und des Schaltverhaltens
des Kanals. Das Resultat ist ein Kanal, dessen Monomere nicht mehr korrekt gekoppelt
sind. Aus diesem Grund kommt es zu vier verschiedenen Leitfähigkeitsstufen, die dem
gekoppelten Schalten von 1,2,3 oder 4 Monomeren entsprechen. Durch die Dissoziation
des FKBP kann der Kanal nicht mehr komplett schließen. Es kommt zu einem stetigen
Ca2+ -Fluss, der durch erhöhte SR-Ca-ATPase und Na-Ca Tauscher-Aktivitäten kompensiert werden könnte, der aber eine Erniedrigung der [Ca2+ ] im sarkoplasmatischen
Retikulum zur Folge hat. Dies hat zur Folge, dass auch der Calcium-Transient weniger
stark ausgebildet und dadurch die Kontraktionskraft des Herzens abgesenkt wird.
3Na
NCX
Ca
FKBP
3Na
Sarcolemma
2+
FKBP
RyR
Ca2+
ATPase
Ca
a
2+
NCX
Phosphatidyl2+
serin, Ca
PKC
S
P
Ca2+
RyR
Ca2+
ATPase
2+
2+
Ca
Ca
b
Abbildung 5.4: Modell zur Erklärung des Schaltverhaltens des Ryanodin-Rezeptors bei Patienten mit ARVC. Der Ryanodin-Rezeptor wird durch die Protein Kinas C zusätzlich am
Serin 1886 phosphoryliert. Durch die Phosphorylierung wird indirekt die Bindung zum FKBP
geschwächt, welches den Kanal im geschlossenen Zustand stabilisiert. Durch die verringerte
FKBP Bindung kommt es zu permanenten Ca2+ -Fluss, der durch erhöhte SERCA und NCXAktivität zwar kompensiert werden könnte, der aber eine Erniedrigung der [Ca2+ ] im SR zur
Folge hat. Abb. modifiziert nach [144]
89
5 Diskussion
90
6 Zusammenfassung
In dieser Arbeit wurde das Gen des humanen cardialen Ryanodin-Rezeptors bei Patienten mit dilatativer Cardiomyopathie und arrhythmogener rechtsventrikulärer Cardiomyopathie mit Hilfe der Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus (SSCP) Methode
untersucht.
Die gefundenen Abweichungen wurden auf ihre Lage im Gen und auf ihre Auswirkungen
auf Proteinebene hin überprüft.
Es konnten zwei Abweichungen im Exon 37 nachgewiesen werden, die zu nicht konservativen Änderungen auf Proteinebene führten. Es handelte sich um die Aminosäuren
1885 (Austausch Glycin zu Glutamat, Abweichung G1885E) und 1886 (Glycin zu Serin, Abweichung G1886S). Damit konnten zum ersten Mal Abweichungen im Gen des
Ryanodin-Rezeptors mit der Ausbildung einer DCM in Verbindung gebracht werden.
Ausserdem konnte in dieser Arbeit zum ersten Mal eine Mutation außerhalb der drei
Bereiche1 nachgewiesen werden, in denen bisher alle krankheits assoziierten Mutationen
lagen.
Beide Abweichungen konnten mehrmals sowohl bei den Patienten, als auch bei den
Kontrollen nachgewiesen werden.
Die Verteilung der Abweichungen war jedoch in den beiden Gruppen stark unterschiedlich. Während 70% der Kontrollen Abweichung G1885E aufwiesen, taten dies nur etwa
20% der Patienten. Daraus wurde postuliert, dass 1885E als Wildtyp bezeichnet werden
sollte. Bei Abweichung G1886S war der Unterschied noch deutlicher, aber umgekehrt.
Nur 2.5% der Kontrollen wiesen diese Abweichung auf, während es mit etwa 21% der
Patienten eine fast neunfache Häufung gab. Auch konnte Abweichung G1886S nicht in
homozygoter Form nachgewiesen werden, was darauf hinweist, dass eine homozygote
Expression zu schwerwiegenden Konsequenzen führen könnte.
Anhand dieser Daten wurde in dieser Arbeit postuliert, dass der Aminosäuretausch
G1886S ein Risikofaktor darstellen könnte, eine Herzinsuffizienz zu entwickeln.
Der native Kanal des Patienten mit den Mutationen G1885E und G1886S wurde mittels
Einzelkanaluntersuchung in einem künstlichen Lipid-Bilayer analysiert. Ebenso wurde
der nativer Kanal eines ARVC-Patienten, untersucht, dessen DNA dem Wildtyp entsprach.
1
Bereich 1: Exons 1-19, Bereich 2: Exons 43-50, Bereich 3: Exons 90-105
91
6 Zusammenfassung
Auch rekombinant hergestellte Ryanodin-Rezeptoren wurden chararkterisiert. Es wurde
zum einen der Wildtyp getestet, zum anderen wurde Mutante im C-terminalen Bereich
des Rezeptors (Aminosäure E4950K)analysiert. Die Mutante wurde zur Überprüfung der
These, dass Mutationen im C-terminalen Bereich großen Einfluss auf die Kanaleigenschaften haben, eingesetzt. Die Mutation war von Priori et al. [93] bei einem Patienten
mit catecolaminerger polymorpher ventrikulärer Tachyvardie beschrieben worden.
Von allen untersuchten Kanälen wurden die mittlere Öffnungsdauer τ , die Amplitude
A und die Öffnungswahrscheinlichkeit Po unter dem Einfluss verschiedener Effektoren
ermittelt.
Es konnte gezeigt werden, dass der rekombinante Wildtyp-Kanal normale Schalteigenschaften aufwies, jedoch eine extrem niedrige spezifische Leitfähigkeit besaß.
Der Kanal mit der Patientin mit Abweichungen G1885E und G1886S war häufiger
und länger geöffnet, als der entsprechende Wildtyp. Weiterhin waren vier verschiedene
Leitfähigkeitszustände zu erkennen. Dieses Verhalten war auch beim Rezeptor FKBPdefizienter Mäuse nachgewiesen worden. Dies führte zu der Vermutung, dass bei diesem
Rezeptortyp die Wechselwirkung mit dem FKBP gestört ist.
Der andere native Kanal zeigte nur geringfügige Änderungen zum Wildtyp, in einer Messung konnte ein Kanal beobachtet werden, der die Schalteigenschaften eines skeletalen
Rezeptors aufwies.
Die Mutante E4950K war unter fast allen Bedingungen zu über 90% geöffnet, lediglich
die Erniedrigung der freien [Ca2+ ] konnte die Öffnungswahrscheinlichkeit geringfügig
herabsetzen. Auch zeigte dieser Kanal kaum Änderungen nach Zugabe von Ryanodin.
Erst nach etwa 10 min beobachtet werden, dass der Kanal geregeltes, dem Wildtyp entsprechendes Schaltverhalten zeigte. Die für Ryanodin typischen halbgeöffneten Zustände
wurde allerdings nicht beobachtet.
Es lässt sich also folgendes resümieren: Innerhalb dieser Arbeit konnte eine Abweichung
im Gen des cardialen Ryanodin-Rezeptors bei Patienten mit Herzinsuffizienz nachgewiesen werden. In Einzelkanalmessungen im künstlichen Bilayer konnte gezeigt werden,
dass die Kanaleigenschaften durch diese Mutation verändert waren: der Kanal hat eine erhöhte Öffnungswahrscheinlichkeit und weist dieselbe Charakteristik wie FKBPdefiziente Ryanodin-Rezeptoren auf.
Weiterhin konnte die Annahme verstärkt werden, dass sich Mutationen im C-terminalen
Bereich entscheidend auf dessen Kanaleigenschaften auswirken.
92
7 Ausblick
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine Abweichung im Gen des cardialen
Ryanodin-Rezeptors bei Patienten mit Herzinsuffizienz 10 mal häufiger vorkommt, als
bei Personen, die zum Zeitpunkt der Untersuchung an keiner Herzkrankheit litten. Es soll
nun in weiteren Experimenten geklärt werden, ob in einem grösseren Kollektiv von heterogen zusammengesetzten Patienten diese Trends bestätigt werden können. Weiterhin
soll noch eine weitere Methode zur Überprüfung der Sequenz dieses Bereichs eingesetzt
werden. Es handelt sich in diesem Fall um die Pyro-Sequenzierung.
Die Pyro-Sequenzierung hat den grossen Vorteil, dass keine Taq-Polymerase eingesetzt
werden muss und somit die Schwierigkeiten, die alle bisher eingesetzten Methoden hatten, nicht mehr auftreten sollten.
Die Methode beruht darauf, dass zu einer einzelsträngigen DNA Sequenz ein SequenzierPrimer in Gegenwart von DNA Polymerase, ATP Sulfurylase, Luziferase und Apyrase
und den Substraten Adenosinphosphosulfat (APS) und Luziferin zugegeben wird. Im
zweiten Schritt wird das erste der vier Desoxynukleotidtriphosphate zu dem Reaktionsgemisch gegeben. Die DNA Polymerase katalysiert daraufhin den Einbau des Nukleotids,
wenn die komplementäre Base auf dem Matrixstrang vorliegt. Jede Inkorporation wird
von der Freisetzung von Pyrophosphat begleited. Die Freisetzung erfolgt im äquimolaren
Verhältnis zum Einbau des Nukleotids.
Die ATP-Sulfurylase setzt das Pyrophosphat in Anwesenheit von Adenosin 5’ Phosphosulfat quantitativ zu ATP um. Dieses ATP veranlasst die durch die Luziferase katalysierte Reaktion von Luziferin zu Oxiluziferin. Bei dieser Umwandlung entsteht im
proportionalen Verhältnis zum ATP Gehalt sichtbares Licht. Dieses Licht wird dann
über eine CCD-Kamera detektiert und als Peak in einem Pyrogramm dargestellt. Somit
ist jedes Lichtsignal proportional zu der Anzahl inkorporierter Nukleotide.
Die nicht eingebauten Nukleotide, ebenso wie das überschüssige ATP, werden während
der Reaktion von der Apyrase degradiert. Ist die Degradierung quantitativ, so kann das
nächste Nukleotid zugesetzt werden. Die der DNA komplementäre Sequenz wird durch
den Signal-Peak im Pyrogramm determiniert.
Es konnte gezeigt werden, dass im künstlichen Bilayer die Eigenschaften des Kanals mit
der Abweichungen G1885E oder G1886S nicht dem Verhalten des Wildtyps entsprach.
Es wurde vermutet, dass es durch verstärkte Phosphorylierung zu einer Dissoziation des
FKBP kam.
In weiteren Experimenten soll überprüft werden, ob das Serin 1886 im phosphorylierten
93
7 Ausblick
Zustand vorliegt, bzw. im rekombinant dargestellten Protein durch die Protein Kinase C
phosphoryliert werden kann. Dies könnte z.B. über massenspektrometrische Methoden
erfolgen. Eine weitere Möglichkeit wäre auch der Einsatz unterschiedlicher Antikörper,
die spezifisch gegen Erkennungssequenzen der phosphorylierten bzw. dephosphorylierten
gerichtet sind.
Ein weiterer interessanter Punkt wäre es, nach Mutationen im Gen des FKBP zu suchen.
Auch die Expressionsniveaus des Proteins könnten über Western-Blot Analyse überprüft
werden.
Weiterhin ist es wichtig, eine höhere Fallzahl der Einzelkanalmessungen zu erhalten.
Auch die Expression und Messungen des homozygoten Kanals mit der Mutation G1886S
sind geplant.
Weiterhin soll die Rolle weiterer assoziierten Proteine wie Calsequestrin, Triadin und
Junctin analysiert werden. Es ist geplant im Patientenkollektiv in den Genen dieser
Proteine nach Mutationen zu suchen.
Ein weiterer Ansatz wären Genfunktionsanalysen mit Hilfe von RNA-Interferenze-Studien.
Dazu könnte beispielsweise in ventrikulären Cardiomyozyten die Beeinflussung der Ca2+ Transienten RyR2-assoziierter Proteine durch Hemmung Genexpression auf posttranskriptionaler Ebene analysiert werden.
94
8 Anhang
8.1 Primersequenzen
95
8 Anhang
Bereich Name Primer
1
RyR2 Ex1f
2
RyR2 Ex1r
3
RyR2 Ex2f
4
RyR2 Ex2r
5
RyR2 Ex3f
6
RyR2 Ex3r
7
RyR2 Ex4f
8
RyR2 Ex4r
9
RyR2 Ex5f
10
RyR2 Ex5r
11
RyR2 Ex6f
12
RyR2 Ex6r
13
RyR2 Ex7f
14
RyR2 Ex7r
15
RyR2 Ex8f
16
RyR2 Ex8r
17
RyR2 Ex9f
18
RyR2 Ex9r
19
RyR2 Ex10f
20
RyR2 Ex10r
21
RyR2 Ex11f
22
RyR2 Ex11r
23
RyR2 Ex12f
24
RyR2 Ex12r
25
RyR2 Ex13f
26
RyR2 Ex13r
27
RyR2 Ex14f
28
RyR2 Ex14r
29
RyR2 Ex15f
30
RyR2 Ex15r
31
RyR2 Ex16f
32
RyR2 Ex16r
33
RyR2 Ex17f
34
RyR2 Ex17r
35
RyR2 Ex18f
36
RyR2 Ex18r
37
RyR2 Ex19f
38
RyR2 Ex19r
39
RyR2 Ex20f
40
RyR2 Ex20r
Sequenz
AT
CAGCAGAAGCAGAAGGCAG
65
TCCTCTAGCTTTCCACACGC
65
GCAGTCATGTCACGTCTCAC
60
TTGCATATTTGAATAGCCTTGA
60
TGCTGACTGCTCTTCCTCTT
60
CAACTGAAAGGCATGGACTTA
60
AATTGGAAGTAGATTGTGGTGC
60
AAGCCACACTAGGAAGCAAA
60
TCTCTTTTCCTTATGCCCCTA
60
GCATGTGAAGAAAAGTTACATGG 60
CGTTCCTTTGAGAGCAAGAG
60
ATGACCACAGGGAGATGAAA
60
GCAACCTTGTCTCAAACACA
60
TTCTTTCCTGACTCCATCCA
60
TTGTGTGTTGGGAATCATTG
60
AGCAGATACATGATCCTACTTTCC 60
TTACAGCTTACCAGAGCCTGA
60
GTCAACTTTGCAGCAAGGAC
60
GGCTATCAGCACCTGACACT
60
ACATCAAGGCAAAAGAGTGC
60
TTTACTCACAGGCCATTTGC
60
AAGCACAACGCTGAGCTATT
60
GTGGGTGCTATTGGATCAAG
60
TCAAAGGAAATATGACCGGG
60
AGGGCTGAATTTTTCAAGGA
60
GCCAATTATTTTTGACTTGTGC
60
GGAAAAGAGACGTTGGGAGT
60
TCAAACAACTACGCCTACAAAA
60
GGGAGAGAGATTAATGCCTGA
60
AATTTTCCCAACCAAGAAGC
60
GCAGAATGACAGTTTTGGATG
60
TGTTGCTATGAACCCAATCA
60
GATCCAATATTTTAGGGCTGC
60
CCACCACACCTCACTCAAA
60
AGACACTGGTCATTGTACACCA
60
TTTGAGAATTCATTCAGGGAA
60
GAGGGAGGATCAGCTGAAAG
60
CAGCTACAGGGCAAGAACAT
60
CCTTACATGTGATTCCCGTC
60
ACACGGTGAAAGAAAATGGA
60
Tabelle 8.1: Primer der Bereiche 1-20 des RyR 2 für die SSCP Analyse.
96
FL
365
365
209
209
256
256
235
235
261
261
207
207
272
272
229
229
200
200
204
204
250
250
254
254
349
349
202
202
349
349
222
222
300
300
224
224
241
241
301
301
8.1 Primersequenzen
Bereich Name Primer
Sequenz
41
RyR2 Ex21f
TTTGACTTTGGCTCTGAAGC
42
RyR2 Ex21r
GGCAGTGCAGAGTCTTCTGT
43
RyR2 Ex22f
TTGACTCTAACGTGCATCCTC
44
RyR2 Ex22r
ATACCAGTGATTGCCATTCG
45
RyR2 Ex23f
AGACTGTTGGCACTGCATCT
46
RyR2 Ex23r
GATTGATGTCACCCCATAGC
47
RyR2 Ex24f
AATTCCATTGCTAGTGCCTG
48
RyR2 Ex24r
GGAAGGCAGGTTGGAAAATA
49
RyR2 Ex25f
CTGCTGCTGTCTTGGGTTAT
50
RyR2 Ex25r
AAAGCAAGGCATCTGTGTGT
51
RyR2 Ex26f
ATGGAAGAACAGCAATGAGG
52
RyR2 Ex26r
TCCTTCCTGTTACAAATTATGCT
53
RyR2 Ex27f
AAAAGCCCTTGGTATTGCTT
54
RyR2 Ex27r
ATCATCTTGCAACCGAAGAA
55
RyR2 Ex28f
CTTCTCTTTCACCTCCCCAT
56
RyR2 Ex28r
CAGCACGTACAGATGACTGG
57
RyR2 Ex29f
TGCAATTTTCCTGGCTTAGT
58
RyR2 Ex29r
ATGAAAGCTTCCTTGTGCTG
59
RyR2 Ex30f
TTCGGTCCTGGAACAATATG
60
RyR2 Ex30r
TGCTTTTTAGAAATGGCCTG
61
RyR2 Ex31If
TGAAAACGTGATGTGCCTTA
62
RyR2 Ex31Ir
ACTAGATGGCCATGAGCTGT
63
RyR2 Ex31IIf
GAGGTCTTCTCCAAGACGGT
64
RyR2 Ex31IIr
AGGAGACCCTTTACTCTGGACT
65
RyR2 Ex32f
CCAGGTTTAAGGCAACTCAA
66
RyR2 Ex32r
GACAAAAGCTGCAACCTCAT
67
RyR2 Ex33f
TGCCAATATTTGGTTCTGCT
86
RyR2 Ex33r
AAAGGAATAGCTAGGTTCACCA
87
RyR2 Ex34f
TCCCATTACAGCATGAGCTT
88
RyR2 Ex34r
GATATCATCACTGACCGCGT
89
RyR2 Ex35f
AATCTCTGGGCTCCTTCTGT
90
RyR2 Ex35r TTCATTTCAGAATAAAACAATGCT
91
RyR2 Ex36f
AACCCCAAGGGATGTTCTAC
92
RyR2 Ex36r
CCAATCAGAATGTCAGGGAT
93
RyR2 Ex37If
TCTGGTCCCAAGCATTTCAGA
94
RyR2 Ex37Ir
TGTTCTCATCAGGGAACAGG
95
RyR2 Ex37IIf
CGTGCTGGCTACTATGACCT
96
RyR2 Ex37IIr
GATGTCCAGTGGGAACTCTG
AT
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
FL
341
341
278
278
268
268
206
206
246
246
329
329
239
239
305
305
284
284
338
338
345
345
303
303
232
232
260
260
300
300
270
270
313
313
478
478
264
264
Tabelle 8.2: Primer der Bereichs 21-37II des RyR 2 für die SSCP Analyse.
97
8 Anhang
Bereich Name Primer
100
RyR2 Ex37IIIr
101
RyR2 Ex37IIIr
102
RyR2 Ex37IVf
103
RyR2 Ex37IVr
104
RyR2 Ex38f
105
RyR2 Ex38r
106
RyR2 Ex39f
107
RyR2 Ex39r
108
RyR2 Ex40f
109
RyR2 Ex40r
110
RyR2 Ex41f
111
RyR2 Ex41r
112
RyR2 Ex42f
113
RyR2 Ex42r
114
RyR2 Ex43f
115
RyR2 Ex43r
116
RyR2 Ex44f
117
RyR2 Ex44r
118
RyR2 Ex45f
119
RyR2 Ex45r
120
RyR2 Ex46f
121
RyR2 Ex46r
122
RyR2 Ex47f
123
RyR2 Ex47r
124
RyR2 Ex48f
125
RyR2 Ex48r
126
RyR2 Ex49f
127
RyR2 Ex49r
128
RyR2 Ex50f
129
RyR2 Ex50r
130
RyR2 Ex51f
131
RyR2 Ex51r
132
RyR2 Ex52f
133
RyR2 Ex52r
134
RyR2 Ex53f
135
RyR2 Ex53r
136
RyR2 Ex54f
137
RyR2 Ex54r
138
RyR2 Ex55f
139
RyR2 Ex55r
Sequenz
AGTTTTCCTCCCCCAGTTTT
GGCTCAATCAACTGCAAGAT
TGATCATGGGCATCTTTCAC
AGCAATTCTGAAATTCACTCAAG
AGATGTGCCTACTGCTTCAG
AGGCAGAGATCCTGAATGAC
TGCCATTCTTGAATTCACCT
ACAGGTATCGTGTGTATTCGTG
AGGCCTCAGAATTATTTGCC
AGTGTCAGCAGTTGGGTCAT
AATATCCATAATGACTTTGCAGC
AAACATTTACGAGACAATTTGTTG
TGTTGCTCTGAGCTTTACCC
GAGTGAGCCTCTGTCTCCAA
CGTTTGCTTTCAGCAGCTA
ACCTATTGGCCAACTATCTGTC
GTTACAGCACGATCCAGGTT
GAGAAAACCGTGAAAAAGCA
AATGAGTTTTCAGCCAAGGG
TTCCTTCATGAAAGTGCTGAG
TTTGTTTACTTATCTTCCCCATTC
TATGGATCACTCGTGAGGGT
GTCCCTTTCCTCGGAGAGAT
GGTTTTGGATGCTGTTATGC
GGATTCCAATACTTCAGATTTCC
AGGTTGGGATGTTGAGTACG
ACAGCCATTGACACCAAAAT
AGAGAGGAGGAAGTCCATCG
ATGTCCCCATGTTAATCCCT
AAGAAGCCGGAATAGAATTTG
AGAAACATTTCTTGGCATTATGA
CCAGCTTCAAGCATGATGTA
TGGGCAATTTCACTTCAGAT
AACAAACCCACAAACCATTAAA
TGCTGACAACTTTTGCCATA
TGCTGCAATAGAAAGAGTCCA
TGAAAATCAAGCTCTTTTGTCTT
CAGAAATATTTGAACAGTGACCAG
ACGCACTTAAACACCTGCAT
TTTTTAAACGGGACCTTTGG
AT
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
Tabelle 8.3: Primer der Bereichs 37III-55 des RyR 2 für die SSCP Analyse.
98
FL
259
259
270
270
268
268
285
285
263
263
339
339
284
284
311
311
209
209
276
276
256
256
282
282
296
296
239
239
331
331
237
237
288
288
244
244
184
184
308
308
8.1 Primersequenzen
Bereich Name Primer
Sequenz
140
RyR2 Ex56f
GGCAGTCTATTTTAGAGCAAAGC
141
RyR2 Ex56r CCCTTCTAAATTTTGTGACTCTTC
142
RyR2 Ex57f
TGTTTGGAAATTTGTGCCAT
143
RyR2 Ex57r
AAATAAACCATGCTGCCAAA
144
RyR2 Ex58f
TGGGATTCACATTCTAAAGAAGA
145
RyR2 Ex58r
CATCCATACACTCATGGAATTG
146
RyR2 Ex59f
CTATGCTGTGTTCTTGTCCTGA
147
RyR2 Ex59r
TCATTGAATTCATTTTCAGCTTT
148
RyR2 Ex60f
TCCCATTTTCATTTTTGCTC
149
RyR2 Ex60r
TCCATTGACCGTTGAACTCT
150
RyR2 Ex61f
TGTTTCCAGTGCAGCATTTA
151
RyR2 Ex61r
CTGAAAAGGGCAACGATCTA
152
RyR2 Ex62f
ATCCCCTGAAAGATTCCACT
153
RyR2 Ex62r
TGCAGCTGCGTATACACCTA
154
RyR2 Ex63f
CTTTTGTCTTCAGCCTATTCTGC
155
RyR2 Ex63r
CTCGAGGACCTTATCTTGGC
156
RyR2 Ex64f
CTCAGGGCAATTTATACAGCA
157
RyR2 Ex64r
AATCCAGACACTGGGTCCTT
158
RyR2 Ex65f
CGAGTCCTCCCTTATTTACTTTC
159
RyR2 Ex65r
CCAGATGTGGCTATTACTGTTTT
160
RyR2 Ex66f
GTGGGTTTTTCTTTCAAGTGAG
161
RyR2 Ex66r
CCAAGGAATTTCAAAGGTCA
162
RyR2 Ex67f
GCAACGTTCTGCATTAGGA
163
RyR2 Ex67r
CTCCCTCATCTATCACAGGG
164
RyR2 Ex68If
AAATCCGCCATATCATCTCA
165
RyR2 Ex68Ir
GATTGTTCTCAGGTCCATGC
166
RyR2 Ex68IIf
ATTCGCTACACTCAAATGCC
167
RyR2 Ex68IIr
GGGGTACAATGTCTTCTTCCA
168
RyR2 Ex69f
AAGTCATGTGCTGGAGAAGG
169
RyR2 Ex69r
AATGAAGCGATTGAACAAGG
170
RyR2 Ex70f
ACAACACTGTGCTGAAACCA
171
RyR2 Ex70r
AAGCAGGTGCCTACAAACAG
172
RyR2 Ex71f
TTGCAGGTTCTGTGTAACCTC
173
RyR2 Ex71r TATTTTCCAGAACAGTGAAACAGT
174
RyR2 Ex72f
TTCAGATCCCAGCACTTCTC
175
RyR2 Ex72r
TCAGATGATCATTACCGCTG
176
RyR2 Ex73f
TTGACTTGTGACAGTTGATGC
177
RyR2 Ex73r
CAAAAGGCTTTGCAAGTAGG
178
RyR2 Ex74f
TGATGGGTGGACTCTTCCTA
179
RyR2 Ex74r
TTGAATTGACACAAAGCCTG
AT
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
FL
350
350
270
270
300
300
251
251
297
297
189
189
230
230
211
211
190
190
350
350
254
254
305
305
256
256
255
255
437
437
267
267
207
207
242
242
268
268
244
244
Tabelle 8.4: Primer der Bereichs 55-74 des RyR 2 für die SSCP Analyse.
99
8 Anhang
Bereich Name Primer
180
RyR2 Ex75f
181
RyR2 Ex75r
182
RyR2 Ex76f
183
RyR2 Ex76r
184
RyR2 Ex77f
185
RyR2 Ex77r
186
RyR2 Ex78f
187
RyR2 Ex78r
188
RyR2 Ex79f
189
RyR2 Ex79r
190
RyR2 Ex80f
191
RyR2 Ex80r
192
RyR2 Ex81f
193
RyR2 Ex81r
194
RyR2 Ex82f
195
RyR2 Ex82r
196
RyR2 Ex83f
197
RyR2 Ex83r
198
RyR2 Ex84f
199
RyR2 Ex84r
200
RyR2 Ex85f
201
RyR2 Ex85r
202
RyR2 Ex86f
203
RyR2 Ex86r
204
RyR2 Ex86f
205
RyR2 Ex87r
206
RyR2 Ex88f
207
RyR2 Ex88r
208
RyR2 Ex89f
209
RyR2 Ex89r
210
RyR2 Ex90If
211
RyR2 Ex90Ir
212
RyR2 Ex90IIf
213
RyR2 Ex90IIr
214
RyR2 Ex90IIIf
215
RyR2 Ex90IIIr
216
RyR2 Ex90IVf
217
RyR2 Ex90IVr
218
RyR2 Ex90Vf
219
RyR2 Ex90Vr
Sequenz
AT
CGTTAAACAAGTTGCCTCGT
60
GGCCATTGAGCACTGTACTT
60
TTTGAAGGTAGTTTGGGGTG
60
TTTTCCATCCTTCTCTTGGA
60
GTGCTTACCTTTCAGCATCG
60
TAATGACTGCTCACGCCAAC
60
GCTGTCCTTCACAGTGCTTT
60
CACGGGTGTCTTTATTTGCT
60
TGCCTAGCCTTCTGCTTAAA
60
CTGCCATGGAATTTAGAACG
60
TTTGCACTTTCTAAAATCTCAACA 60
GCTCTGACATGCAGTTCCTT
60
ATCGTTGGTGTTGAAATGGT
60
GAGCAACGAGGAAATCTGAA
60
AAGTGCAGCATTGGAGGTAG
60
TGGTCCATTTGTCTGAAAAGTA
60
AATGGAAAGCCTGTTTTGGT
60
AACCACTGAGTAGAACCCCC
60
GGTACGCAATGAATGGAGAC
60
GAAGGGAGACAGGTGATCCT
60
AGTTGTATGGAGGTGGGGAC
60
AGTATCATCAGAAGTTCCGGG
60
TAGAAAGCATTTGCCTTTGG
60
AACTCTGCCGTATTGTTTCAA
60
GGCATAAAGTCCAAGACTGGT
60
TCAGTGCTACAGATAGCAGCC
60
TGAGGAATAATTGCCGTTTG
60
AATGAGCAAAAGAGGCATGA
60
TCCTGCTGCATAGTTTTCTTG
60
ACACTTTGATTCCATAAGCCC
60
ACAAATGCAACTGCCTTACC
60
TTTCATTCTCATCCGTCTCC
60
GAGCCATAAGCACTACACGC
60
ATAGACCCTCTCGATGCGTT
60
ATTAGCAGAGAGCGTCCTGA
60
TATTCGCTGACCTCTCGTTC
60
GGACACCATCTTTGAAATGC
60
CATGTCCTTCACGGTCATCT
60
GAGCCTGAAGAAGCAGATGA
60
TCCCCATCTCCTCTAACCTC
60
Tabelle 8.5: Primer der Bereichs 75-90V des RyR 2 für die SSCP Analyse.
100
FL
219
219
267
267
187
187
238
238
244
244
248
248
289
289
209
209
205
205
262
262
193
193
241
241
247
247
300
300
213
213
292
292
289
289
293
293
256
256
255
255
8.1 Primersequenzen
Bereich Name Primer
220
RyR2 Ex90VIf
221
RyR2 Ex90VIr
222
RyR2 Ex91f
223
RyR2 Ex91r
224
RyR2 Ex92f
225
RyR2 Ex92r
226
RyR2 Ex93f
227
RyR2 Ex93r
228
RyR2 Ex94f
229
RyR2 Ex94r
230
RyR2 Ex95f
231
RyR2 Ex95r
232
RyR2 Ex96f
233
RyR2 Ex96r
234
RyR2 Ex97f
235
RyR2 Ex97r
236
RyR2 Ex98f
237
RyR2 Ex98r
238
RyR2 Ex99f
239
RyR2 Ex99r
240
RyR2 Ex100f
241
RyR2 Ex100r
242
RyR2 Ex101f
243
RyR2 Ex101r
244
RyR2 Ex102f
245
RyR2 Ex102r
246
RyR2 Ex103f
247
RyR2 Ex103r
248
RyR2 Ex104f
249
RyR2 Ex104r
250
RyR2 Ex105f
251
RyR2 Ex105r
Sequenz
AACATGCCAGACCCCACT
CAGAGAGAATGCTGCTGTGAC
TTCATTCAAAGGTGATGGGT
GGCACAATTAGTTCTGTGGC
CCACAACACCCGTTTAGTTC
AGGGAGAGGTCAGCAAACAT
AGGTTTCAAGCCTGTTGATTC
GCCTAGGCACCAGTATTTCA
AATGCTTTGAATCAGGTCTCC
CAGGTACCTTGGTGCCTTACT
TGACCACAAGATATGCCAGTAA
ACAAATCTGCAGGAACTCCA
TCATTGTAAGTTTACGTGGCAG
AAATGGAGACATTAATAGGCAGA
AATGGTTGAAGCCAACAAAA
GGAAAGGAAATCAATGCACA
TGTCCAAGTCTTGTCCCATT
CTGCAGAACTCCCACAGTCT
TTCTGACATGTTCTTTCCCC
TCCCTGCAGTTTAGAACAGG
TTCTCACTAGAGCACTCGCC
CTGCAGAAGCAGGAGACATT
AAAATGGGTAATGTCCCTCC
TCAGCTTCAGTGAGGAGGAT
TGTACATCTCCCCTTTCCCT
CCAGGACAACAAAGAAGCTG
AACCAAATAATAGCTGCCCC
CGTCTACTGGAGAGGTGGAA
TTCCATACCGTTCATTTCTGA
AGTAATTCCGTGCCTCACTG
GACTTCTCTATTCCGTGCGA
GAGAGAGGGGTAGGGTTTTG
AT
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
60
FL
300
300
253
253
299
299
273
273
262
262
274
274
294
294
265
265
235
235
331
331
283
283
231
231
199
199
237
237
194
194
249
249
Tabelle 8.6: Primer der Bereichs 90VI-105 des RyR 2 für die SSCP Analyse.
101
8 Anhang
8.2 Sequenzen der bei der SSCP berücksichtigten DNA
des Ryanodin-Rezeptors
Bereich 1
Die Exons sind fett gedruckt.
1 gcgcggccccctccagcccccggctcccggcagcagaagcagaaggcagcgccaggggcc
61gccgccgccgccgagctccgcggggctcgggagccggccccggcgaggaggcgcggaacc
121atggccgatgggggcgagggcgaagacgagatccagttcctgcgaactgtaagcgccgtg
181 cgtcgcgtgtgctgtcaggggaagggggcgtcagggcatccactagcggggtccgggcag
241 agtgacagcgggcagcggggactcgcgggcggggcgagggggtgccccctgaggatgcgg
301 gaggagcgggcatcaccaagtgtgtgcaggtgtgcgtgttggggcgagggaaggcaaggg
361 cgcgtgtctgtgcgcgcgtgtggaaagctagagga
Bereich 2
1gcagtcatgtcacgtctcacttatttttccctctctttctccccctttgcaggatgatga
61 agtggttctgcagtgcaccgcaaccatccacaaagaacaacagaagctatgcttggcagc
121 agaaggatttggcaacagactttgtttcttggagtccacttccaattccaaggtgggatg
181 aagtctttcaaggctattcaaatatgcaa
Bereich 3
1tgctgactgctcttcctctttctgtgcagaatgtgcccccagacctctccatctgcacct
61 ttgtgctggagcagtccctctctgtccgggcgctgcaggagatgctggctaacaccgtgg
121 agaaatcagaaggggtaagtacccaatttatgtagacttgtagtattttaatgagctcag
181 ctactataggaacaatttctttcacaggtgtcagagattttcttttttgctaaaataagt
241 ccatgcctttcagttg
Bereich 4
1aattggaagtagattgtggtgcaaggaccaaattgatatcaattcatttaaatgacagta
61 attgaaacattgctaggtatttgtttgtttgttatttattttggctttttctttccacag
121 caagttgatgtggaaaaatgggtatgtgtttccatgtatttgcaaagaaattgtgatcta
181 aaagtgcatgcttgctctcgcctctaatctttcattttgcttcctagtgtggctt
Bereich 5
1tctcttttccttatgcccctacagaaattcatgatgaaggtaagacatcttaatatatat
61 gctatgtatatatatagcagatatattactatatatggattatatatgtatgtatctgca
121 tattagtatagctgtattatatatatgacagatatatatattactatatatcagctatat
181 atatgtggtactttgtatgttttctgtatggttatacacatttgttttacttttgaatcc
241 atgtaacttttcttcacatgc
102
8.2 Sequenzen der bei der SSCP berücksichtigten DNA des Ryanodin-Rezeptors
Bereich 6
1cgttcctttgagagcaagagagtattttatcaacttggttaagttactcttttgtgtttt
61 tctctcttgttctccttttttctcttctctctaaagactgctcaaggtggtggtcatcga
121 acactcctctacggacatgccatattgctgcgccattcctatagtggcatggtgagtagg
181 catttgatttcatctccctgtggtcat
Bereich 7
1gcaaccttgtctcaaacacaaacaacagacgaacaaaacctctacttacaactactgatt
61 ttgtactttgtagtatctgtgctgcctgtccacctcccggtcttcaactgataagctggc
121 ttttgatgttggcttgcaagaggacaccacaggtaagcatcttgtgctgcgggaagccag
181 gttcagagagaaccctgcaggggttggattggaagaagccgggaaatacgatacatggga
241 tgaatgttcttatggatggagtcaggaaagaa
Bereich 8
1ttgtgtgttgggaatcattggcaaagaaaatagattttaattaagaggaactttttcatg
61 tttcacatatccgtatatctgcaggggaggcttgttggtggaccatacaccctgcctcta
121 agcagcgatcagaaggagaaaaagtacgagttggagatgacctcatcttagttagcgtgt
181 cctctgaaaggtacttggtaagtgtggaaagtaggatcatgtatctgct
Bereich 9
1ttacagcttaccagagcctgaagtgatgcctccttttgcctcttgatacagcacttgtct
61 tatggcaacggcagcttacacgtggatgccgctttccagcagactctctggagcgtggcc
121 ccaatcagctcaggaagtgaggcagcccaaggtaaaaactccacttcaattagagggcct
181 gtccttgctgcaaagttgac
Bereich 10
1ggctatcagcacctgacactgacagtccagacctgaatgattttttatccttacagggta
61 tctcattggtggtgatgtcctcaggttgctgcatggacacatggacgagtgtctcactgt
121 cccttcaggagaacatggtgaagagcagcggaggttagtacctgagctcattgcattgag
181 acttgcactcttttgccttgatgt
Bereich 11
1tttactcacaggccatttgcttttctctcctaattagcttcaaaaaattagagtccaaag
61 aatgaaacatgtttaactcacatttgggcttttgtttgtttgttgaaacagaactgttca
121 ttatgaaggtggcgctgtgtctgttcatgcacgttccctttggagactagagacgctaag
181 agttgcgtaagtagaacttctaaacacagcctaatgcaccaagtgtaccaaatagctcag
241 cgttgtgctt
103
8 Anhang
Bereich 12
1gtgggtgctattggatcaagtcctaactgttttcattaggtggagtggaagccacataag
61 atggggacagccattccgactacgccatgtcacaacaggaaaatacttgagtctcatgga
121 agacaaaaaccttctactcatggacaaagagaaagctgatgtaaaatcaacagcatttac
181 cttccggtcttccaaggtgagacagaaaatattttgggtttcctataaatgttacccggt
241 catatttcctttga
Bereich 13
1agggctgaatttttcaaggaacatatttgcaataaggcaaaattctattgccatacacta
61 gtatttttgaaatgtttactgacctttttttcctcctctccccttaggaaaaattggatg
121 taggggtgagaaaagaagtagatggcatgggaacatctgaaataaaatacggtgactcag
181 tatgctatatacaacatgtagacacaggcctatggcttacttaccagtctgtggacgtga
241 aatccgtgagaatgggatctatacaacgtaaggtaaggtgatagaaaaaaacataattta
301 tagaagtaattttttatgaatacacaagcacaagtcaaaaataattggc
Bereich 14
1 ggaaaagagacgttgggatgtaatggccttatttttgctttcttacaggctattatgcat
61 catgaaggccacatggatgatggcataagtttgtcgagatcccagcatgaagaatcacgc
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Bereich 15
1 gggagagagattaatgcctgaaatcatctataaatggaaaaatgataaaattgtgaatca
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301 ttctcttctgttattctcttgtaaaaacagcttcttggttgggaaaatt
Bereich 16
1 gcagaatgacagttttggatgtctgattgtgattttttttttttttaacgttccagggaa
61 tgatcaacctcgtgcttgagtgcatagaccgtttgcacgtctacagcagtgcagcacact
121 ttgctgatgttgctgggcgagaagcaggagagtcttggaaatccattctgaattctctgt
181 atgagttgctgggtaagaagcatgattgggttcatagcaaca
104
8.2 Sequenzen der bei der SSCP berücksichtigten DNA des Ryanodin-Rezeptors
Bereich 17
1 gatccaatattttagggctgcatattagcttatctcaattttcgagctagaaaatcacat
61 aaaggtgaaatctatttcttcttttgcagcggctctaattagaggaaatcgtaaaaactg
121 tgctcaattttctggctccctcgactggttgatcagcagattggaaagactggaagcttc
181 ttcaggtatgttttctagttttttccttgttgtgatagatcactcctatttttctttgct
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Bereich 18
1 agacactggtcattgtacaccaattaatcatgtgttttttttcctctttctttgttttat
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121 ttattaaagaaggacatattaaatctattatctcacttttagacaaacatggaagaaatc
181 acaaggtaaatgaactattttatttccctgaatgaattctcaaa
Bereich 19
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61 tgtgtttgccacggggttgcagtccgttctaaccagcatctcatctgtgacaatctccta
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181 acagacaatgtcacctgacaggtaccataataaaagaattaatgttcttgccctgtagct
241 g
Bereich 20
1 ccttacatgtgattcccgtctctttaaagcatgagacccaatatttttctgggcgtcagt
61 gaaggttctgctcagtataagaaatggtactatgaattgatggtggaccacacagagccc
121 tttgtgacagctgaagcaactcacctgcgagtgggctgggcttccactgaaggatattct
181 ccctaccctggagggggcgaagagtggggtggaaatggtgttggagatgatctcttctcc
241 tatggatttgatggccttcatctctggtcaggtacgtactatccattttctttcaccgtg
301 t
Bereich 21
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61 ttttccccccaataggttgtattgctcgtactgtaagctcaccaaaccaacatctgttaa
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241 cagtcgttagtttctctgcaggaataaagttagtatgtctatgttttttggtctctttcc
301 tttctcatttctcatacctccacagaagactctgcactgcc
Bereich 22
1 ttgactctaacgtgcatcctctttagagtacgctttctgcttggagggcgacatggagaa
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105
8 Anhang
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181 ctgggccccacagtttccctgacgcaagctgccttcacacccatccctgtggataccagc
241 caggtaccaagatccactcgaatggcaatcactggtat
Bereich 23
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121 ccatgaactctgggttatgaataaaattgagcttggctggcagtatggtccggtatgtaa
181 ttttgaaatttattttcggattctgtgaatacatctttctgaaaacataactttttctgc
241 cttttcccgctatggggtgacatcaatc
Bereich 24
1 aattccattgctagtgcctggcattggagactattttatgtcaatttcctgtcctgtttc
61 aggttagagatgacaacaagagacaacacccatgcctggtggagttctccaagctgcctg
121 aacaggagcgcaattacaacttacaaatgtcgcttgagaccctgaagtgagtttcttaac
181 tttttctattttccaacctgccttcc
Bereich 25
1 ctgctgctgtcttgggttattctggacatagagaagaaatgatcacacttatctctggtt
61 ttgttttccaggactttgttggcattaggatgtcatgtgggtatatcagatgaacatgct
121 gaagacaaggtgaaaaaaatgaagctacccaagaagtaagttgaatgactaagcaatatt
181 aaataatctgtgtagagatttagtgcaaccaaataactcttgatggacacacagatgcct
241 tgcttt
Bereich 26
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61 ggccaattatacacaaatttctttgtctctgatttgtagttaccagctgacaagtggata
121 caagcctgcccctatggacctgagctttatcaaactcaccccatcgcaagaagcaatggt
181 ggacaagttggcagaaaatgcacataatgtgtgggcgcgggatcgaatccggcagggctg
241 gacttatggcatccaacaggtacatgggaattagcatttggtctgagacttacttaagtg
301 ggaattagcataatttgtaacaggaagga
Bereich 27
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61 cagaagaaatcctcgccttgttccctacactcctctggatgaccgaaccaagaaatccaa
121 caaggacagcctccgcgaggctgtgcgcacgctgctggggtacggctacaacttggaagc
181 accagatcaagatcatggtattttggttttactttcctcttcttcggttgcaagatgat
106
8.2 Sequenzen der bei der SSCP berücksichtigten DNA des Ryanodin-Rezeptors
Bereich 28
1 cttctctttcacctccccatccaatgaccaccagaaatctctgtccatttcccagcagcc
61 agagccgaagtgtgcagcggcaccggggaaaggttccgaatcttccgtgccgagaagacc
121 tatgcagtgaaggccggacggtggtattttgaatttgagacggtcactgctggagacatg
181 agggttggttggagtcgtcctggttgtcaaccggatcaggagcttggctcagatgaacgt
241 gcctttgcctttgatggcttcaaggtgagtggactttgtcctgtgccagtcatctgtacg
301 tgctg
Bereich 29
1 tgcaattttcctggcttagtctgtgacaagggacttttctgtcctctgtataggcccagc
61 ggtggcatcagggcaatgaacactatgggcgctcttggcaagcaggcgatgtcgtggggt
121 gtatggttgacatgaacgaacacaccatgatgttcacactgaatggtgaaatccttcttg
181 atgattcaggctcagaactggctttcaaggactttgatgttggcgatggtaagtctacta
241 tgttttgtgttttttttaagtttgcagcacaaggaagctttcat
Bereich 30
1 ttcggtcctggaacaatatgtttgataattctatactaacaggatcatatactaatggta
61 ctaaaacttgatttttttttcttcccaggattcatacctgtgtgtagccttggagtggct
121 caagtgggtaggatgaactttggaaaggatgtcagcaccttgaaatatttcaccatctgt
181 ggcttacaagagggctatgaaccatttgccgttaatacaaacagggatattaccatgtgg
241 ctgagcaagaggcttcctcagtttcttcaagttccatcaaaccatgaacatatagaggtt
301 tgctttttctttaaaaatcaggccatttctaaaaagca
Bereich 31
1 tgaaaacgtgatgtgccttagtcatctttagaatcaggaaattgacaatggtgattggaa
61 tgtgaactatcgcttcttcgtttgctaggtgaccagaatagacggcaccatagacagttc
121 cccatgtttaaaggtcactcagaagtcttttggttctcagaacagcaacactgatatcat
181 gttttatcgcctgagcatgccgatcgagtgcgcggaggtcttctccaagacggtggctgg
241 agggctccctggggctggcctttttgggcccaagaatgacttggaagattatgatgctga
301 ttctgactttgaggttctgatgaagacagctcatggccatctagtgcccgatcgtgttga
361 caaagacaaagaagctactaaaccagagtttaacaaccacaaagattatgcccaggaaaa
421 gccctctcgtctgaaacaaaggttactaatttatacgctgtgattttaaatttgtagtta
481 tgtgaggagggttacagtccagagtaaagggtctcct
Bereich 32
1 ccaggtttaaggcaactcaattgattatatgctcatatttgaagtagacagaacatttta
61 atgttgcttattgttagtcctctgaaatatttcagatttttgcttagaagaacaaagcca
121 gattacagcacaagccattctgcaagactcaccgaagatgtccttgctgatgatcgggat
181 gactatgatttcttgatgcaaacgtccacggtatgaggttgcagcttttgtc
107
8 Anhang
Bereich 33
1 ccaggtttaaggcaactcaattgattatatgctcatatttgaagtagacagaacatttta
61 atgttgcttattgttagtcctctgaaatatttcagatttttgcttagaagaacaaagcca
121 gattacagcacaagccattctgcaagactcaccgaagatgtccttgctgatgatcgggat
181 gactatgatttcttgatgcaaacgtccacggtatgaggttgcagcttttgtc
Bereich 34
1 tcccattacagcatgagcttgttgcttgcgcagcataatttagttagtttgcaagatata
61 cctgctttctcttttatctgtggttgtacaaagataaaaatgttcttttgaaattcagca
121 tcaaacgcagcaactgctatatggtatgtgcgggtgagagcatgagccccgggcaaggac
181 gcaacaataatggactggagattggctgtgtggtggatgctgccagcgggctgctcacat
241 tcattgccaatggcaaggaactgagcacatactatcaggtacgcggtcagtgatgatatc
Bereich 35
1 aatctctgggctccttctgtaaagtattcctttgttgttataaagaaaaactttttccct
61 tgtcttgtttcattactaacattattaaattcattaaatgtatttcaggtggaaccgagt
121 acaaaattatttcctgcggtttttgcacaagctacaagtcccaatgttttccagtttgag
181 ttgggaagaataaaggtaataaaacttattcctggtattgtatttgtattttttctatta
241 ggatatagcattgttttattctgaaatgaa
Bereich 36
1 aaccccaagggatgttctacatttattctttttctgcctccccatccgctagaatgtgat
61 gcctctctcggcgggattattcaagagtgagcacaagaaccccgtgccgcagtgcccccc
121 gcgcctccacgtgcagttcctgtcacacgtcctgtggagcagaatgcccaaccagttttt
181 gaaggtagatgtgtctcgaataagtgaacgccaaggctggttggtgcagtgtttggatcc
241 tctgcagttcatgtctcttcatatccctgaggaaaacaggtcagccccagtgaatccctg
301 acattctgattgg
Bereich 37
1 tctggtccccaagcatttcagattagggatgttcaacctgcagtgtctattcccataact
61 tttttccttcaaatttacagtgcatactgatttctcctctgattcagattttaaaaaatc
121 attcatttctaatcttactaccactctcctcccttctacagatctgttgacatcttagag
181 ttgacagagcaggaggaattgctgaaatttcactatcacactctccggctctactcagcc
241 gtctgtgctcttgggaaccaccgggtggcccatgccctgtgcagccatgtggatgaacct
301 cagctcctctatgccattgagaacaagtacatgcctggtttgctgcgtgctggctactat
361 gacctgctgattgacatccacctgagctcctatgccactgccaggctcatgatgaacaac
421 gagtacattgtccccatgacggaggagacgaagagcatcaccctgttccctgatgagaac
481 aaaaaacacggccttccagggatcggcctcagcacctccctcaggccacggatgcagttt
108
8.2 Sequenzen der bei der SSCP berücksichtigten DNA des Ryanodin-Rezeptors
541
601
661
721
781
841
901
961
tcctcccccagttttgtaagcattagtaatgaatgttaccagtacagtccagagttccca
ctggacatcctcaagtccaaaaccatacagatgctgacagaagctgttaaagagggcagt
cttcatgcccgggacccagttggagggactactgaattcctctttgtacctctcatcaag
cttttctataccctgctgatcatgggcatctttcacaacgaggacttgaagcacatcttg
cagttgattgagcccagtgtgtttaaagaagctgccactccggaggaggagagtgacacg
ctggagaaagagctcagtgtggacgatgcaaagctgcaaggagctggtgaggaagaagcc
aaggggggcaagcggcccaaggaaggcctgctccaaatgaaactgccagagccagttaaa
ttgcaggtaatcagaacaagagacttgagtgaatttcagaattgct
Bereich 38
1 agatgtgcctactgcttcagtacctctgtgactgccaggtccggcaccggatagaagcca
61 ttgtagccttttcagatgattttgtggctaagctccaagacaatcaacgtttccgataca
121 acgaagtcatgcaagccttaaacatgtcagctgcactcacagccaggaagacaaaggaat
181 ttagatcaccacctcaagaacaggtacagaaatgaaatgaaaattcttcgtatttatgtt
241 ggcttttagtcattcaggatctctgcct
Bereich 39
1 tgccattcttgaattcacctttcttttcttcctccttcttcctctttcttgtttttcaaa
61 ctttcagatcaatatgcttctcaattttaaggatgacaaaagtgaatgtccatgtccaga
121 agaaattcgtgaccaactattggatttccatgaagatttgatgacacattgtggtaaggt
181 ctttttgattaaaagcttttattaattgtatgtttttaatccatatatcctgagacgaaa
241 ttaagtgtatatgcgaatattttcacgaatacacacgatacctgt
Bereich 40
1 aggcctcagaattatttgcccaagtgtattctttaaatatttttttctgcctctctgttt
61 ttttatactaggaattgagctggatgaagatgggtctctggatggaaacagtgatttaac
121 aattagagggcgtctgctatccctggtagaaaaggtgacatatctgaagaagaagcaagc
181 agaaaaaccagttgagagtgactccaaaaagtcctgtaagcagtatgagagtgcactggc
241 agaatgacccaactgctgacact
Bereich 41
1 aatatccataatgactttgcagccactctgcagcagctgatttctgagaccatggtccga
61 tgggctcaggagtctgtcattgaagaccccgagctggtgagggccatgtttgtgttgctc
121 catcggcagtatgacggcattgggggtcttgttcgggccctgccaaagacctacacgata
181 aatggtgtgtccgtggaggacaccatcaacctgctggcatcccttggtcagattcggtcc
241 ctgctgagtgtgagaatgggcaaagaagaagagaagctcatgattcgtggattagggtta
301 attatttaactactacaacaaattgtctcgtaaatgttt
109
8 Anhang
Bereich 42
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61 aagtgttttaccagcaccctaatctcatgagggcactggggatgcacgagactgtgatgg
121 aggtcatggtgaacgtccttggaggtggagagtccaaggtaacgtctttgattcctgaga
181 tgctatttagtatcatctcctggagtatatagattgatatagaatgcagatttttttttt
241 ttttttttttttttttttttttttttggagacagaggctcactc
Bereich 43
1 cgtttgctttcagcagctaatgacatgctttatctgtaggaaatcacctttcccaagatg
61 gtggccaactgttgccgttttctctgttacttctgtcgtataagtaggcagaatcaaaaa
121 gctatgtttgatcatctcagttatttactggaaaacagcagtgttggtcttggtaagtaa
181 atgacttttatttcatctttaaggttgaaataatataatattacatttaaaaagcaaacg
241 ttttgttaaaaaatgtgcaatggacctgaatagacatttcacaaaagaagacagatagtt
301ggccaataggt
Bereich 44
1 gttacagcacgatccaggttatatttcatcttcatttgaattaatagcctccccagctat
61 gagaggttcaacaccactggatgtggctgcagcttcggtgatggataataatgaactagc
121 attagctctgcgtgagccggatctagaaaaggtgagcaatgttcctgccctgtgtttttg
181 tttgaattatgctttttcacggttttctc
Bereich 45
1 aatgagttttcagccaagggataactctttgttaatcatgttgtttgcaggtagttcgtt
61 atttggctggttgtggactgcaaagttgccagatgctggtgtctaagggctatccagaca
121 ttgggtggaacccagttgaaggagagagatatcttgactttctcagatttgctgtcttct
181 gtaatggtaggacttgatttcttgaggtcttttgagttatcattaaaactgcatagagat
241 ataataaggattcatctcagcactttcatgaaggaa
Bereich 46
1 tttgtttacttatcttccccattctactttaggggagagtgtggaggaaaatgcaaatgt
61 cgtggtgagattgctcattcggaggcctgagtgttttggtcctgctttgagaggagaagg
121 tgggaatgggcttcttgcagcaatggaagaagccatcaaaatcgccgaggatccttcccg
181 agatggtccctcaccaaatagcggatccagtaaaacactgtaggtctaatatacacaccc
241 tcacgagtgatccata
Bereich 47
1 gtccctttcctcggagagatatgtaataaacatgaaatgtcagttatcccatttgctttc
61 tctttcttttgaaacattcatgaaagtgacacagaggaggaggaagatgacactatccac
121 atggggaacgcgatcatgaccttctattcagctttgattgacctcttgggacgctgtgct
110
8.2 Sequenzen der bei der SSCP berücksichtigten DNA des Ryanodin-Rezeptors
181 cctgagatgcatgtgagtttctgggagttcaggagcagcaatcctgatttctctgtgtta
241 agacatctatagctgtcaaagagcataacagcatccaaaacc
Bereich 48
1 ggattccaatacttcagatttcctagacagaattgtaacattgatgtcacaaagttgttc
61 taatgtttttttttcccctgtatagttgattcatgccgggaagggagaagccatcagaat
121 taggtccattttgagatccctcattcccctgggagatttggtgggcgttatcagcatcgc
181 ttttcagatgccaacaatagccaaaggtaaggccaacttcaatttgtcctaattcagtag
241 gatgttggatgacatcatgttctaaagaatgttttccgtactcaacatcccaacct
Bereich 49
1 acagccattgacaccaaaattcacttctctcttttagatgggaatgtggtggaacctgac
61 atgtctgcggggttttgcccagatcacaaggcagccatggttttattccttgacagggtc
121 tatgggattgaggttcaagacttcctcctccatcttcttgaggttggctttctgccagat
181 ctccgggcggctgcttctttagatacggtgagattggagcgatggacttcctcctctct
Bereich 50
1 atgtccccatgttaatccctttgaaggttatctactgccaaacacaaatggccttctact
61 ctctgattctttttcaggcagctttgagtgctacagacatggccttggccctcaatcggt
121 acctttgcacagccgtcttgccattgttaacaagatgtgctcctctctttgctggcacag
181 agcaccacgcttctctcattgactcattacttcatactgtgtatagactttctaagggct
241 gttcacttaccaaagctcagcgggattccatagaagtttgtttactctctatttgtgggt
301gagtggataacaaattctattccggcttctt
Bereich 51
1 agaaacatttcttggcattatgaacattagctttgttccaacagacaactgagaccttct
61 atgatgcagcacttactcagaagattagtatttgatgtcccattattaaatgaacacgca
121 aagatgcctcttaaagtaagtataggaaatgtttgtagatatttgattactggcttctct
181 gactttattttctatgacaacatatacatttcttagatacatcatgcttgaagctgg
Bereich 52
1 tgggcaatttcacttcagatgaccttataatgtagcattagagtgtgatatgaggagaaa
61 atgaaaaaaaatataaaaggttttgatagctcattgcttttataattgttttcccacata
121 gctgctgacaaatcattatgaaagatgctggaaatattactgcctgcctggagggtgggg
181 aaactttggtgctgcctcagaagaagaacttcatttatcaagaaagttgttctggggcat
241 ttttgatgccctgtctcaaaaggtaatttaatggtttgtgggtttgtt
111
8 Anhang
Bereich 53
1 tgggcaatttcacttcagatgaccttataatgtagcattagagtgtgatatgaggagaaa
61 atgaaaaaaaatataaaaggttttgatagctcattgcttttataattgttttcccacata
121 gctgctgacaaatcattatgaaagatgctggaaatattactgcctgcctggagggtgggg
181 aaactttggtgctgcctcagaagaagaacttcatttatcaagaaagttgttctggggcat
241 ttttgatgccctgtctcaaaaggtaatttaatggtttgtgggtttgtt
Bereich 54
1 tgaaaatcaagctcttttgtctttacttttctcatagtattacaattcctgagaaattgg
61 aatacttcattaacaaatatgcagaacactcccatgacaaatggtcaatggacaaggtaa
121 aaagagtattacattctaattcagtagtcattattaatgactggtcactgttcaaatatt
181 tctg
Bereich 55
1 acgcacttaaacacctgcatatctacaatctctaaaattaacacgtgtaaaacaattttt
61 aatgtttgcctttttttaagttggcaaatggatggatttatggagaaatatattcagact
121 cttctaaggttcagccattaatgaagccatataagctattgtctgaaaaggtaaggattt
181 tttgtttgttttagtttgtaaagtttttattcttttgaaaaatgtgttttttggttatat
241 tttttatattaaaatgtcttctttattttaaatttcacattttttcttccaaaggtcccg
301 tttaaaaa
Bereich 56
1 ggcagtctattttagagcaaagcgttacttaacatttttatttacattcataatatatct
61 gttgtttcttgttttttcttctctaggaaaaagaaatttatcgctggccaatcaaagaat
121 ctttaaaaactatgctggctaggactatgagaactgaaagaactcgggagggagacagca
181 tggccctttacaaccggactcgtcgtatttctcagacaagccaggtaagaattcatcacg
241 gtgatgaatcaactgtttatgttatggattaaataattttttaaatttaattattgagtt
301 tttctaaaaaataatctgaaaattctgaagagtcacaaaatttagaaggg
Bereich 57
1 tgtttggaaatttgtgccatatttttaaagtataagttaagtctctcttcacaaggtttt
61 taatgaggcactgttttttcacacaaatgatctaggtttctgtggacgctgcccatggtt
121 acagtccccgggccattgacatgagcaatgttacactatctagagacctgcatgtaagta
181 ctattaacttttaaaaatagtctccaaatttaatttttaagaagcataatgtaatgcttt
241 cctgcatatatttggcagcatggtttattt
Bereich 58
1 tgggattcacattctaaagaagagtgtttgatatcttttaaatgtatcatagcactaata
61 ctgtatgagttattcctttaaggtatctaatattatatattagaaagcaatattatcctt
112
8.2 Sequenzen der bei der SSCP berücksichtigten DNA des Ryanodin-Rezeptors
121 ttttacttattgaaacgataaatatttttgttcatttaaggctatggcagaaatgatggc
181 tgaaaactaccataatatatgggcaaagaaaaagaaaatggagttggagtccaaaggtaa
241 tattttctaaaaacgtttattaaaaaataatctgagctcaattccatgagtgtatggatg
Bereich 59
1 ctatgctgtgttcttgtcctgacatactcttaggaggaggaaaccatcctctgctggtgc
61 cctatgatacactgacagccaaagagaaagccaaggatagagaaaaagcacaggacatcc
121 tcaagttcttgcagatcaatggatatgctgtatccaggtaaaagtacacataccctaagt
181 acacactcttttcacaagagtgaatatttaaatatctccatcatatttaaagctgaaaat
241 gaattcaatga
Bereich 60
1 tcccattttcatttttgctcttccagaggatttaaggacctggaactggacacgccttct
61 attgagaaacgatttgcctatagtttcctccaacaactcattcgctatgtggatgaagcc
121 catcagtatatcctggagtttggtaggtaccatagtcccattgctaatagcccagtgttt
181 gttgtttttaatgtttacaacatcaggatatagaacaacacaggctgctgagctatttgt
241 gatggtataaacccatctattcatcctactactaagtagagttcaacggtcaatgga
Bereich 61
1 tgtttccagtgcagcatttacctaaaaactcttcaaatctacagatggtggcagcagagg
61 caaaggagaacatttcccttatgaacaagaaatcaagttctttgcaaaagtacagtatac
121 aatctatcttgtttttgcttcaatatgtttgtttacataccctactcattagatcgttgc
181 ccttttcag
Bereich 62
1 atcccctgaaagattccactacgtagatctgtcttcttttcctttctttcaggtcgttct
61 tcctttaattgatcagtatttcaaaaaccatcgtttatacttcttatctgcagcaagcag
121 acctctctgctctggaggacatgcttccaacaaagagaaagaaatggtgactaggtaaac
181 agctataaaaataagcactgttgtatgacttaggtgtatacgcagctgca
Bereich 63
1 cttttgtcttcagcctattctgcaaacttggagttcttgtcaggcataggatttcactat
61 ttggtaaggagacccttgaaaaaatacaagcatggccatcacttggttttctttgccatt
121 tttgcactgtgttgtgtgctgctatgttgcatggatgcatgtttgcatggctgcatgcat
181 ggtcgttgcaggccaagataaggtcctcgag
113
8 Anhang
Bereich 64
1 ctcagggcaatttatacagcattttgtttcctctttaggcaatgatgcaacatcaattgt
61 caactgtcttcatattttgggtcagactttggatgcaaggtaaatggatacatttttacc
121 taaataaattactataataatgatacatgtatatatataagaatattaagaaggacccag
181 tgtctggatt
Bereich 65
1 cgagtcctcccttatttactttctaggacagtgatgaagactggcctggagagtgttaaa
61 agtgcactcagagcttttctggacaacgctgcagaggatctggagaagaccatggaaaac
121 ctcaagcagggccagttcactcacacccgaaaccagcccaaaggggttactcagattatc
181 aattacaccacagtggccctgctgccaatgctgtcgtcattatttgaacatattggccag
241 catcagttcggagaagacctaatatgtatgtaaatttatatcttggagtttttttttttt
301 taatcgaaataccctgtagtacaatcaaaaacagtaatagccacatctgg
Bereich 66
1 gtgggtttttctttcaagtgagattctctttttccttagtggaagatgtccaggtgtctt
61 gttatagaattctgactagcttatatgctttgggaaccagcaagagtatttacgtggaga
121 ggtaagaatgtttaaagtttaactttgtattaattgctgcttcaagttttataactattt
181 atttcaagaatcttcatttcataacctgtttcctagttataaactaaaccggattgacct
241 ttgaaattccttgg
Bereich 67
1 aggcaacgttctgcattaggagaatgtctagctgcctttgctggtgcttttcctgtagca
61 tttttggaaactcatctggacaaacataatatttactccatctacaataccaagtcttca
121 cgagaaagagcaggtaacacagaaacatgtgcagtgctttgagatatgaagctaaaactt
181 gatatttatcatattgtccaatagtgatttttaatgagctctttcagtttactatatcca
241 atcttgtttgttcttaaatgttattgtttggtattctatgtgatgtaccctgtgatagat
301 gagggag
Bereich 68
1 aaatccgccatatcatctcagtactttctttgaatatcatccatttttatatgtacttct
61 ccagctctcagtttgccaactaatgtggaagatgtttgtccaaacattccgtctttggag
121 aaactcatggaagaaatcgtggaattagccgagtccggcattcgctacactcaaatgcca
181 catgtcatggaagtcatactgcccatgctttgcagctacatgtctcgttggtgggagcat
241 ggacctgagaacaatccagaacgggccgagatgtgctgcacagccctgaactcagagcac
301 atgaacacacttctagggaacatattgaaaatcatatataataacttggggattgatgag
361 ggagcctggatgaagaggctagcaggtaagaactggaagaagacattgtacccc
114
8.2 Sequenzen der bei der SSCP berücksichtigten DNA des Ryanodin-Rezeptors
Bereich 69
1 aagtcatgtgctggagaaggaggctttaattatgttacaattgtaattacaatctatcat
61 catgttaatgaatggttttacagagcagaatactaatgtctgtctttaaacagtgttttc
121 ccagcctataataaataaagtgaaacctcagctcttgaaaactcatttcttgccgttaat
181 ggagaaactcaagaaaaaggcagctacggtggtgtctgaggaagaccacctgaaagctga
241 ggccaggggggacatgtcggaggcagaactcctcatcctagatgagttcaccacactggc
301 cagagatctctatgccttctaccctctcttgattagatttgtggactataacaggtatga
361 tcaaaagtaatttagtaatttctccaattcggtcataacgtttcttggctcacatgtcct
421 tgttcaatcgcttcatt
Bereich 70
1 acaacactgtgctgaaaccatcatgagctctgtggtcagtacatttaactttggggggat
61 ggttttttttttttaaattaactttaaggagtagctgagaaaccactttatttattatgt
121 gatccagggcaaagtggctaaaggagcctaacccagaagcagaggagctcttccgcatgg
181 tggctgaagtgtttatctactggtcgaagtcccatgtgagtgtgaaaatattgatagatc
241 acgcctactgtttgtaggcacctgctt
Bereich 71
1 ttgcaggttctgtgtaacctctaattacaaagacttctttaagtggttttaactgaaatt
61 tcctttgcaacttctcagaatttcaaaagagaagagcagaacttcgttgtacagaatgaa
121 atcaacaatatgtctttccttattactgataccaagtcaaagatgtcaaaggtattacta
181 taaactgtttcactgttctggaaaata
Bereich 72
1 ttcagatcccagcacttctctttgttccataggcagctgtttctgatcaggaaaggaaga
61 aaatgaagcgcaaaggagatcggtattccatgcagacctctctgattgtagcagctctga
121 agcggttactgcccattgggttgaacatctgtgcccctggggaccaggagctcattgctc
181 tggccaaaaatcgatttagcctggtaagtctccttttcatcccagcggtaatgatcatct
241 ga
Bereich 73
1 ttgacttgtgacagttgatgcaatagaagactccttttaggtaacatatatttcttgaca
61 gaaagatactgaggatgaagtacgagatataatccgcagcaatattcatttacaaggcaa
121 ggtaagccaaattttattcttaagccacatttactacctatacattagttaatctctctt
181 taaaataatactataaataatgttactttaaacattaaggtaatagacatattttaatta
241 gtcattatcctacttgcaaagccttttg
115
8 Anhang
Bereich 74
1 tgatgggtggactcttcctatctttagattgtaaccttgtttttagattcccatcttccc
61 attgtaaccttttccttttttctgcagttggaggatcctgctattagatggcaaatggct
121 ctttacaaagacttaccaaacaggactgatgatacctcagatccagagaagacggtagaa
181 agagtattggatatagcaaatgtgctttttcatcttgaacaggtcaggctttgtgtcaat
241 tcaa
Bereich 75
1 cgttaaacaagttgcctcgtgaaaatttctaaaccaccgcagtccaaacattttaaatgt
61 ttacttcagacattattacaatcatttttgactctttactgcaaaggataataaatgtag
121 ttttacttttttagctaacataacatttttatttctttcagaagtctaaacgtgtgggtc
181 gaagacattactgtctggtaagtacagtgctcaatggcc
Bereich 76
1 tttgaaggtagtttggggtgtaaatatttatttgtgtcattctacctcaggtggaacatc
61 ctcagagatctaaaaaggctgtatggcataaactactgtctaagcagaggaaaagggctg
121 ttgtagcctgcttccggatggcccccttatataatctgccaaggtcggaattactttatt
181 ttttgtaatagatcaatgttattttttcctagtaagtgacaggtgtttagaatctacctt
241 aataggggtacaatagtccaagagaaggatggaaaa
Bereich 77
1 gtgcttacctttcaggcatcgggctgtcaatctctttcttcagggatatgaaaagtcttg
61 gattgaaacagaagaacattactttgaagataaactgatagaagatttagcagtatgttt
121 ttagtggggctctaagatgaaagagggtctaggcttggtgcagcaatgttggcgtgagca
181 gtcatta
Bereich 78
1 gctgtccttcacagtgcttttggatttgagtgaacatttttttttaatgtgacattttat
61 aaatttgacttttttgcagaaacctggggctgaacctccagaagaagatgaaggcactaa
121 gagagttgatcctctacatcagctgatccttctgtttagtcggacagctttaacagagaa
181 atggtatggttgggagggttcctatgagacataggaggagcaaataaagacacccgtg
Bereich 79
1 tgcctagccttctgcttaaacactgatgttttcttcttgctttccccagcaaactggagg
61 aagattttttatatatggcctatgcagatattatggcaaaggtaaataagtatccttcct
121 gattttcatgtttaattttaataaagggaagtaactttcatctgaaaaggataagaatct
181 gtgtatttcattaatttcaactttttgtttgtagcatgaatctccgttctaaattccatg
241 gcag
116
8.2 Sequenzen der bei der SSCP berücksichtigten DNA des Ryanodin-Rezeptors
Bereich 80
1 tttgcactttctaaaatctcaacatattcctgtctcctttttttttttttttaaatatac
61 agagttgtcatgatgaggaagatgacgatggtgaagaggaagtgaagagttttgaagtaa
121 gatggatctttctggatttgcctttctttctatcttgaaacattgtttcatagcttataa
181 ctgacatttatgtttcttgcttcatggcttattgcagcttattgtgtcaaggaactgcat
241 gtcagagc
Bereich 81
1 atcgttggtgttgaaatggtccataatgttgtcatagagcccatacatgaagagatgact
61 aaaaatatggtctgtagaaatctgttgtgcttactgataccctcaacataaatggttggg
121 atttgtgttcaggaaaaagaaatggaaaagcaaaagcttctataccagcaagcccgactc
181 cacgatcgtggcgcggctgagatggtgctacagacaatcagtgccagcaaaggtaaggtt
241 ccttgagttcccctcacgagtgtctgttcttcagatttcctcgttgctc
Bereich 82
1 aagtgcagcattggaggtagaataggttaatatagaaggcgaaatgatataaggaacact
61 acttttttatatttcttaggtgaaactggaccaatggtagcagctactctgaaacttgga
121 attgctattttaaatggtgggaactccacagtacagcaggtaacagcttccagtcattca
181 tataatgtacttttcagacaaatggacca
Bereich 83
1 aatggaaagcctgttttggttgtttatttatttaacaaacaataagatttttgttcagtg
61 gccacgtggtttctataattcccatagaaaatgcttgactacctcaaggagaaaaaggat
121 gtgggcttctttcagagcctggccggcctgatgcagtcatgtaggtaaggactcacttcc
181 ttcttgggggttctactcagtggtt
Bereich 84
1 ggtacgcaatgaatggagacatgttttcagtgtacgttaacatttgcttcatcttccaag
61 atatatggtgtttagatgtttgctctcctgagcaaagaaaatgttctattagtcctctaa
121 atgtttttttttcccttgttattatagtgtccttgacctaaatgcatttgagcgacaaaa
181 caaagctgaaggtcttgggatggtgacagaggaaggatcaggtattaatgacttacatta
241 aaaggatcacctgtctcccttc
Bereich 85
1 agttgtatggaggtggggacagaaagggagcggcaggctggggtggctggtaatgtttga
61 tccctctggatttcccacaggagaaaaggttctgcaggacgatgagttcacctgtgacct
121 cttccgattcctgcaactactctgtgagggacacaactcaggtttgtgagtccccggaac
181 ttctgatgatact
117
8 Anhang
Bereich 86
1 tagaaagcatttgcctttggagttcttagaatgactcaacttgaacttctgagcaagcat
61 taataacatttttttatcttgcatagattttcagaattatctgagaactcagactggcaa
121 taatacaactgtcaacataattatctccactgtagactacctactgagagttcaggtatg
181 ttgctttccatattagtaacaaattaaaagggttggtatgttgaaacaatacggcagagt
241 t
Bereich 87
1 ggcataaagtccaagactggttagtcaatggtaactttagaatgtgacttgataataaat
61 aatatcatctctatttcccaggaatcaattagtgacttttattggtattactctgggaaa
121 gatgttattgatgaacaaggacaacggaatttctccaaagctatccaagtggcaaaacaa
181 gtctttaacactcttacagagtatattcaggtaaacatttaaacatggctgctatctgta
241 gcactga
Bereich 88
1 tgaggaataattgccgtttgtctgtttatgctccagggtccttgcactgggaatcaacag
61 agtttggcacacagcaggctgtgggatgctgtggtcggctttcttcatgtgtttgcccat
121 atgcagatgaagctgtcgcaggtaaactaactaactgccttcctctctcttaaatgacaa
181 actggagactgtaatcatcagcaaattaaacatgctttttgatgttagaatattatcttt
241 ttaaaatcactttatcacttgtctttttaagatcattttatcatgcctcttttgctcatt
Bereich 89
1 tcctgctgcatagttttcttgtattatctcaaaacaaatgttaatattttcaggattcca
61 gtcaaattgagctattaaaagaattaatggatctgcagaaggatatggtggtcatgttgc
121 tgtccatgttagaaggtagttttgatttaaacttttaaattctctttattatcttattta
181 aaggatcagcatgggcttatggaatcaaagtgt
Bereich 90
1 acaaatgcaactgccttaccaccaggtaatgttgttaatggaacgattggcaaacagatg
61 gtggatatgcttgtggaatcttccaacaacgtggagatgattctcaaattttttgacatg
121 ttcttaaaactaaaggatttgacgtcgtctgatacttttaaagaatatgaccccgatggc
181 aagggagtcatttccaagagggacttccacaaagcgatggagagccataagcactacacg
241 cagtcagaaacggaatttcttttgtcttgtgcggagacggatgagaatgaaaccctcgac
301 tacgaagagttcgtcaaacgcttccacgaacctgcgaaggacatcggcttcaacgtcgcc
361 gtccttctgacaaacctctctgagcacatgcccaacgatacccgacttcagacttttctg
421 gaattagcagagagcgtcctgaattatttccagccctttctgggccgcatcgaaatcatg
481 ggaagcgccaaacgcatcgagagggtctattttgaaatcagtgagtccagccgaacccag
541 tgggagaagccccaggtcaaggagtccaaaagacagttcatatttgacgtggtcaacgaa
601 ggcggagagaaagagaagatggaactctttgtgaacttctgcgaggacaccatctttgaa
118
8.2 Sequenzen der bei der SSCP berücksichtigten DNA des Ryanodin-Rezeptors
661 atgcagctggcggctcagatctcggagtcggacttgaacgagaggtcagcgaataaggaa
721 gaaagcgagaaggagaggccggaagagcaggggccgaggatggctttcttctccattctg
781 acggtcaggtcggccctgtttgcgctcaggtacaatatcttgacccttatgcgaatgctc
841 agtctgaagagcctgaagaagcagatgaaaaaagtaaaaaagatgaccgtgaaggacatg
901 gtcacggccttcttttcatcctactggagtattttcatgaccctcttgcacttcgtggcc
961 agcgttttcagaggctttttccgcatcatttgcagcctgctgcttgggggaagcctcgtc
1021 gaaggtgctaaaaagatcaaagttgcagaactgttagccaacatgccagaccccactcag
1081 gatgaggttagaggagatggggaggagggagagaggaaacccctggaagccgccctgccc
1141 tccgaggatctgaccgacttaaaggagctgacagaggaaagtgaccttctttcggacatc
1201 tttggcctggatctgaagagagaaggaggacagtacaaactgattcctcataatccaaat
1261 gctgggctcagtgacctcatgagcaacccagtccccatgcctgaggtgcaggaaaaattt
1321 caggtaatttatctctaagtcacagcagcattctctctg
Bereich 91
1 ttcattcaaaggtgatgggtaatcctggttttcttttccccattgactcattcaaggaac
61 agaaggcaaaagaagaagaaaaggaagaaaaagaagaaaccaaatctgaacctgaaaaag
121 ccgagtatgtatagtttgcatatacttttccttcgtttcagtttgtcattacatctcttt
181 ttcttgtactctgtctttgggagctgcaagggagaatctcatattgtcaaggagccacag
241 aactaattgtgcc
Bereich 92
1 ccacaacacccgtttagttctttagtttctggagagcttatgttttgtttgtttgttttc
61 ataggggagaagatggagaaaaagaagagaaagccaaggaagacaagggcaaacaaaagt
121 tgaggcagcttcacacacacagatacggagaaccagaagtgccagagtcagcattctgga
181 agaaaatcatagcatatcaacagaaacttctagtaagatgttttagagtgaatattgtta
241 ctgatatagtgcaataccgtaataatttaggctcagtaaatgtttgctgacctctccct
Bereich 93
1 aggtttcaagcctgttgattcagtgaccttttcataatgtttttcaccctcagaactatt
61 ttgctcgcaacttttacaacatgagaatgttagccttatttgtcgcatttgctatcaatt
121 tcatcttgctcttttataaggtacgtacatctcactgttttaattactggtataaaactc
181 caaatagaaatgaatgtaaagatttcacgatgaacgtatctactactgctagtgaacatg
241 tctaaacctattatgaaatactggtgcctaggc
Bereich 94
1 aatgctttgaatcaggtctccacttcttctgtggttgaaggaaaggagctccccacgaga
61 agttcaagtgaaaatgccaaagtgacaagcctggacagcagctcccatagaatcatcgca
121 gttcactatgtactagaggagagcagcggctacatggagcccacgttgcgtatcttagct
181 attctgcacacggtcatttctttcttctgcatcattggatactactgcttgaaagtaaga
119
8 Anhang
241 tagtaaggcaccaaggtacctg
Bereich 95
1 tgaccacaagatatgccagtaaatctaaactaattttaacatatttatttttcctgtgta
61 ggtcccattggttatttttaagcgagaaaaggaagtggcacggaaattggaatttgatgg
121 gctttatattacagaacagccttcagaagatgatattaaaggccagtgggatagactcgt
181 aatcaacacacagtgagtaaatacttatatgagactttctgcactcaaaaatttcagaca
241 tgaaaatatttggttggagttcctgcagatttgt
Bereich 96
1 tcattgtaagtttacgtggcaggatatatgtttacatattattttaagtatgccatatat
61 cccaaatgatatgttattatttgtcattaaaaataatactatttacttctatgcttttgt
121 atattttaggtcatttcccaacaactactgggacaaatttgttaaaagaaaggtaatatt
181 acttggaatcctctacatttttcttaaagcacagtttagatttttatttgatgtgattca
241 gatgtagaataagatattgaggtataatttatctgcctattaatgtctccattt
Bereich 97
1 aatggttgaagccaacaaaatgctttttctcataccccaaggttatggataaatatggag
61 agttctacggccgagacagaatcagtgaattacttggcatggacaaggcagctctggact
121 tcagtgatgccagagaaaagaagaagccaaagaaagacagctccttatcagctgtgtaag
181 tgttacttcggctctatcctacagacttagattgaaaggggaaaacattaatacattttt
241 aaacttgtgcattgatttcctttcc
Bereich 98
1 tgtccaagtcttgtcccattgaatgtgaaggccgtcaggctctctcaagcctatgagtct
61 ttggttaatgtgcataactacacatttttttttttttgtcattgcagactgaactccatt
121 gatgtgaagtatcagatgtggaaactaggagtcgttttcactgacaacgtaagcctactt
181 cattatcacaaaagaaaatgcactctgattagataagactgtgggagttctgcag
Bereich 99
1 ttctgacatgttctttccccccgttttgtcttaatagtccttcctctacctagcctggta
61 tatgactatgtctgttcttggacactataacaactttttttttgccgctcaccttctcga
121 cattgctatgggattcaagacattaagaaccatcttgtcctcagtaactcacaatggcaa
181 acaggtaaacagtttatctttttcctcccttgcagaaaataaaaaagcaacaaataaagc
241 aaagaaaaataaaactacccctcaaatgacaatgtacagttttaaagatttttttgaagg
301 gagggtctgcacctgttctaaactgcaggga
120
8.2 Sequenzen der bei der SSCP berücksichtigten DNA des Ryanodin-Rezeptors
Bereich 100
1 ttctcactagagcactcgccgcccatgtagatgtcacgtgtcaattgtatgtcctacatt
61 tctaatacctggtccttgtcacattgttttccagctcgtattaaccgttggcttattagc
121 tgttgttgtatacctatacactgtggtggcattcaattttttccgaaaattctacaataa
181 aagtgaagatggtgatacaccagatatgaaatgtgacgatatgctaacagtaagttcata
241 acctttgatctcacataaacaaaaatgtctcctgcttctgcag
Bereich 101
1 aaaatgggtaatgtccctccaagaagtgataccatgtcttttttccagtgctatatgttc
61 cacatgtatgttggagttcgtgctggaggagggatcggggatgaaatcgaagacccagca
121 ggagatgaatatgagatctatcgaatcatctttgacatcactttcttcttctttgttatt
181 gtcattctcttggccataatacaaggtaagtatcctcctcactgaagctga
Bereich 102
1 tgtacatctcccctttccctggggggattagccaaggaactgaattattcattgcttgat
61 aaagattaaattgtgtttttatttaacaccaggtctaattattgatgcttttggagaact
121 aagagaccaacaggaacaagtcaaagaagacatggaggtaagcttctccattcatgactc
181 agcttctttgttgtcctgg
Bereich 103
1 aaccaaataatagctgcccctacatggcgagttgtgttttccttttgttttgctttctga
61 actctgacgttaatatttccctttgttttctagaccaaatgcttcatctgtgggataggc
121 aatgattacttcgacacagtgccacatggctttgaaacccacactttacaggagcacaac
181 ttggctaattacttgtgagtgtgcccgtttcagaatcttccacctctccagtagacg
Bereich 104
1 ttccataccgttcatttctgatcagtttctctgtatctgtaggttttttctgatgtatct
61 tataaacaaagatgaaacagaacacacaggacaggtaggtaaattattacatgtcatctt
121 ctgaaagaaatgatagagaagctctaaatatcagaacaaaatgtgtgcattaaacagtga
181 ggcacggaattact
Bereich 105
1 gacttctctattccgtgcgatataggtaacagaattgagtttctaccttatgttttgtta
61 gcacacactttggggaaaatgttaatacatttgcttgacttttgcaggaatcttatgtct
121 ggaagatgtatcaagaaaggtgttgggaatttttcccagcaggggattgcttccggaaac
181 agtatgaagaccagctaaattaaactcagacccaatcacctctaaaaaccaaaaccctac
241 ccctctctc
121
8 Anhang
Primer für die Überprüfung der cDNA des cardialen Ryanodin-Rezeptor aus
Kaninchen.
Name Primer
RyR2 1f
RyR2 1r
RyR2 2f
RyR2 2r
RyR2 3f
RyR2 3r
RyR2 4f
RyR2 4r
RyR2 5f
RyR2 5r
RyR2 6f
RyR2 6r
RyR2 7f
RyR2 7r
RyR2 8f
RyR2 8r
RyR2 9f
RyR2 9r
RyR2 10f
RyR2 10r
RyR2 11f
RyR2 11r
RyR2 12f
RyR2 12r
Sequenz
ATGGCTGATGGGGGCGAAG
CTCTGACCGCTGCTTTGAGGC
TTGCATGTAGATGCCGCCTT
ATCCATGTGGCCTTCATGG
GATCTATACAACGTAAGGCCA
GCAGGAGGTTGTCACAAATG
AGCTTCCTCGGGTATTCTTGA
GAGGCAACACAATCTGGCTG
GGAGGGGGTGAAGAGTGGG
GCATGATCTTGATCTGGAGC
CAGATGTCACTTGAGACCTTG
CTCAATGGGCATGCTCAGAC
CACCAGGGCAACGAGCACTATGG
TATGTGCTCAGTTCCTTGCC
CTGGAGGATTACGATGCAGAT
GGAGGCCGTGCTTCTTGTTC
GCCTCTCTCAGCGGGATTATTC
ATTAATCTGTTCTTGAGGTG
GAATGTTACCAGTATAGCCCA
CAGTTGGCCACCATCTTCGG
CTGTGGAATTGAGCTGGATGAAG
CATCCTCTTCCTCCTCCG
GGATAATAATGAGTTGGCCC
CGGCAGCCCGCAGGTCTGG
Tabelle 8.7: Primer zur Überprüfung der cDNA des cardialen Ryanodin-Rezeptors, Teil1
122
8.2 Sequenzen der bei der SSCP berücksichtigten DNA des Ryanodin-Rezeptors
Name Primer
RyR2 13f
RyR2 13r
RyR2 14f
RyR2 14r
RyR2 15f
RyR2 15r
RyR2 16f
RyR2 16r
RyR2 17f
RyR2 17r
RyR2 18f
RyR2 18r
RyR2 19f
RyR2 19r
RyR2 20f
RyR2 20r
RyR2 21f
RyR2 21r
RyR2 22f
RyR2 22r
RyR2 23f
RyR2 23r
RyR2 24f
RyR2 24r
Sequenz
GCATTGGCCCTCAATCGGTACCTT
GTATTCCAACTTCTCAGGA
CAATGGACAAGTTAGCAAATG
GTTCTCCTTTGCTTCTGCTGC
GCAGACCTCTCTGCTCTGGAG
GCTGCTCGCTCTCGTGAAG
CCTTTCCTGTAGCATTTTTGG
GTGGGATTTTGACCAGTAG
GAAATCAACAACATGTCCTTC
TCTTCTGTTTCAATCCATGAC
GCTGATTCTTCTGTTTAGTC
ACAGGTCACAGGTGAACTCG
CCAAAGCTATACAAGTAGC
CATCTGTTTGCCAATTGTTC
GACAGTTCATATTTGATGTGG
GTTCCATCTTCTCTTTTTCTC
GGGAGAGGAAGCCCATGGAGACC
GGTTGCTCATGAGATCAC
GGATACTACTGCTTAAAAGTTC
GGAACTTTTAAGCAGTAG
CGTGCTATATGTTCCACATGTATG
CAACTCCTAGTTTCCACATC
CCAGCTAAATTAAACTGAGACC
GAGGTGCTGAGGGTCTCAG
Tabelle 8.8: Primer zur Überprüfung der cDNA des cardialen Ryanodin-Rezeptors, Teil2
123
8 Anhang
124
Abbildungsverzeichnis
1.1
1.2
EC-Kopplung im Herzen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Vergleich der drei für krankheitsbedingende Mutationen wichtige Regionen des RyR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
1.3 DCM Herz . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
15
16
3.1 FRET Prinzip der Real-Time PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.2 Aufbau der Anlage zur Einzelkanalmessung . . . . . . . . . . . . . . . . .
3.3 Ausbildung eines Lipidbilayers . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
42
44
45
4.1
4.2
4.3
4.4
4.5
4.6
4.7
4.8
4.9
4.10
4.11
4.12
4.13
4.14
4.15
4.16
Übersicht der SSCP-Gele, bei denen Abweichungen im Exon nachgewiesen
werden konnten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Sequenzierungen der Exons 3 (a), 15 (b), 49 (c), 53 (d), 71 (e) und 98 (f)
des humanen cardialen Ryanodin-Rezeptors im Bereich der Abweichungen
SSCP-Gel des Exons 37 des cardialen Ryanodin-Rezeptors . . . . . . . .
Sequenzierungen des Exons 37 des cardialen Ryanodin-Rezeptors im Bereich der Abweichungen. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Sequenzierungen der Plasmid-DNA des Exon 37 . . . . . . . . . . . . . .
Konstruktion der Sonden für die Schmelztemperturanalyse . . . . . . . .
Schmelztemperaturanalyse der reinen Proben . . . . . . . . . . . . . . .
Vergleich der Schmelztemperaturanalyse von Kontrollen und Patienten .
Vergleich der Allelverteilung zwischen Patienten und Kontrollen. . . . . .
Agarosegel von Klon E4950K . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Sucrosegradient und 3 H-Ryanodin Bindungstest aus der Aufarbeitung von
HEK 293-Zellen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Sucrosegradient und 3 H-Ryanodin Bindungstest nach SR Isolierung aus
humanem Herzgewebe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Sucrosegradient und 3 H- Ryanodin Bindungstest des nativen RyanodinRezeptors nach Anreicherung aus dem SR . . . . . . . . . . . . . . . . .
Kanaleigenschaften des Wildtyps des cardialen rekombinanten RyanodinRezeptors im künstlichen Lipidbilayer. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Öffnungswahrscheinlichkeit der Mutante E4950K nach EGTA-Zugabe . .
Kanaleigenschaften der c-terminale Mutante E4950K des cardialen rekombinanten Ryanodin-Rezeptors im künstlichen Lipidbilayer. . . . . . .
8
53
54
55
55
56
57
58
59
61
64
65
66
66
69
71
72
125
Abbildungsverzeichnis
4.17 Vergleich der zwei untersuchten Kanäle aus dem Patienten mit WildtypDNA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.18 Kanaleigenschaften des nativen Wildtyp Ca2+ -Freisetzungskanals im künstlichen Lipidbilayer. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.19 Einzelkanalmessungen des nativen Ca2+ -Freisetzungskanals mit den Mutationen G1885E und G1886S . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
4.20 Vergleich des nativen, mutierten Kanals vor und nach PP2A/ATP-Zugabe
4.21 Strom-Spannungskurve der vier vorgestellten Ca2+ -Freisetzungs-Kanäle .
5.1
5.2
5.3
5.4
126
multiples Alignment der Ryanodin-Rezeptoren . . . . . . . . . . . . . . .
Modell der Regulation des Kanals mit der Mutation E4950K . . . . . . .
Vergleich des FKBP-defizienten Kanals mit dem Kanal der ARVC Patienten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Modell zur Erklärung des Schaltverhaltens des Ryanodin Rezeptors bei
Patienten mit ARVC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
73
75
77
78
79
83
86
88
89
Tabellenverzeichnis
3.1
SDS-PAA Gelzusammensetzung für ein Gel . . . . . . . . . . . . . . . . .
36
4.1
4.2
4.3
4.4
Bei der SSCP gefundene Abweichungen im Exon flankierendem Intronbereich . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Bei der SSCP gefundene Abweichungen im Exon. . . . . . . . . . . . . .
Verteilung der Schmelztemperaturen bei Kontrollen und Patienten. . . .
Allelverteilung bei Patienten und Kontrollen nach Sequenzierung. . . . .
51
52
59
60
8.1
8.2
8.3
8.4
8.5
8.6
8.7
8.8
Primer
Primer
Primer
Primer
Primer
Primer
Primer
Primer
der
der
der
der
der
der
zur
zur
Bereiche 1-20 des RyR 2 für die SSCP Analyse . . .
Bereichs 21-37II des RyR 2 für die SSCP Analyse .
Bereichs 37III-55 des RyR 2 für die SSCP Analyse .
Bereichs 55-74 des RyR 2 für die SSCP Analyse . .
Bereichs 75-90V des RyR 2 für die SSCP Analyse .
Bereichs 90VI-105 des RyR 2 für die SSCP Analyse
Überprüfung der cDNA 1 . . . . . . . . . . . . . . .
Überprüfung der cDNA 2 . . . . . . . . . . . . . . .
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96
97
98
99
100
101
122
123
127
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137
Literaturverzeichnis
138
Danksagung
Obwohl eine Doktorarbeit eigenständiges Arbeiten lehren soll, gibt es doch eine Menge
Leute, die zum Gelingen dieser Arbeit maßgeblich beigetragen haben. Deshalb sage ich
Danke an:
• Simon für alles. (Besonders für die Einführung in LATEX)
• Frau Dr. Varsanyi, die mir immer hilfreich zur Seite stand. Nicht nur in fachlichen
Fragen fand ich bei ihr immer Hilfe und Rat. Die Diskussionen mit Ihr brachten
immer neue Ideen zur Verbesserung dieser Arbeit.
• Herrn Prof. Dr. Heilmeyer für ausgezeichnete Voraussetzungen zur Durchführung
der Arbeiten im Labor und hilfreiche Diskussionen bezüglich dieser Arbeit.
• Dr. Hendrik Milting für schier endlose Diskussionen und gute Ratschläge bezüglich
der Mutationsanalysen, auch für das Bereitstellen von Patientenmaterial.
• PD Dr. Rolf Thieleczek für die geduldige und fachlich kompetente Hilfe bei den
Einzelkanal-Experimenten. Ohne ihn wäre ich wohl bei der Auswertung verzweifelt.
• Prof. Dr. Jona für die Hilfe beim Aufbau der Anlage für die Einzelkanal-Experimente
und ihm und seiner Arbeitsgruppe aus Debrecen für einen angenehmen und lehrreichen Aufenthalt in Ungarn, bei dem ich in die ’Geheimnisse’ der EinzelkanalAnalyse eingewiesen wurde.
• Allen Mitstreitern wie Anja, Caroline, Ili und Sascha für ein angenehmes Arbeitsklima, Kummerbewältigung, Cocktailtreffen und einfach eine schöne Zeit auch außerhalb des Labors.
• Den Technikern Burckhard, Irene, Monika, Petra und Ulli für die tolle Stimmung
im Labor und die Hilfe bei den nahezu unendlichen Sequenzierungen, SSCPs und
Zellexperimenten sowie ganz ’plötzlichen und supereiligen’ Rezeptor-Aufarbeitungen.
• Den Mitarbeitern der Arbeitsgruppe aus Bad Oeynhausen, Ramona, Astrid und
Bärbel für die Aufreinigung hunderter Blutproben, die Einführung in die Schmelztemperaturanalyse und das Mutationsscreening im Calsequestrin.
139
Danksagung
• Ganz besonders auch meinen Eltern, die mir immer das richtige Maß an Unterstützung gegeben haben und mich aufgerichtet haben, wenn mal wieder Wochen
ohne Vorwärtskommen hinter mir lagen.
140
Lebenslauf
Persönliche Daten
Name
Nina Lukas, geb. Stephan
Geburtsdatum 06. Feb. 1975
Geburtsort
Gelsenkirchen
Heirat
05.Okt. 2001
Schul- und Hochschulbildung
1981 - 1984
1984 - 1994
12.05.1994
1994 - 2000
Nov 1999 - Apr 2000
23. April 2000
Grundschule an der Grillostr., Gelsenkirchen
Schalker Gymnasium, Gelsenkirchen
Allgemeine Hochschulreife
Studium der Biochemie, Ruhr-Universität Bochum
Diplomarbeit ’Versuche zur Identifizierung
vasoaktiver Nukleotide aus den
Granula von Rindernebennieren’
AG von PD Dr. H. Schlüter, Marienhospital, Herne
Diplom-Biochemikerin
Beruflicher Werdegang
April 2000- Dez 2000 Wiss. Mitarbeiter der med. Fakultät
der Universität Bonn, AG Prof. Dr. A. Sachinidis (in Kooperation mit D
seit Jan 2001
Wiss. Mitarb. der physiol. Chemie
der Ruhr-Universität Bochum, Prof. Heilmeyer, AG Dr. M. Varsanyi
141

Zugehörige Unterlagen

2. Vorlesung Die DNA - Das Genetische Material

Genetik

Identifizierung und elektrophysiologische Charakterisierung von

Zugehörige Unterlagen

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