Vergleichende Analyse extrazellulärer Proteome von humanen

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Zusammenfassung
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ZUSAMMENFASSUNG
Ein wichtiges Ziel in der Krebsforschung ist die Identifizierung von Tumor-Biomarkern, die zur
Diagnose einer Krebserkrankung und zur Überwachung des Krankheitsverlaufs genutzt werden
können. Aufgrund der niedrigen Konzentration tumorassoziierter Proteine in Körperflüssigkeiten
wie z.B. im Serum gestaltet sich die Suche nach derartigen Markerproteinen trotz immer
sensitiver werdenden Analysemethoden als äußerst schwierig. In dieser Arbeit wurde als
alternative Quelle zur Suche nach potentiellen Markern das Sekretom humaner kolorektaler
Krebszelllinien
verwendet.
Als
Sekretom
wurde
hierbei
die
Gesamtheit
aller
durch
unterschiedliche Mechanismen in vitro freigesetzten Proteine definiert. Seine Bestandteile wurden
durch Isolation und Aufreinigung der Proteine aus den Zellkulturüberständen gewonnen und
anschließend über Massenspektrometrie identifiziert.
Die vorliegende Arbeit hatte zwei zentrale Zielsetzungen: die Funktionsanalyse des
Tumorsuppressors Smad4 sowie die Identifizierung von Tumor-Biomarkern. Um diese Ziele
miteinander zu verknüpfen, wurden vergleichende Analysen der Proteine des Sekretoms von
humanen Kolonkarzinom- und Adenomzelllinien durchgeführt, wobei die verwendeten Zellmodelle
die Tumorprogression in vitro widerspiegeln. Hierfür kamen neben zellbiologischen Methoden vor
allem moderne Trenn- und Analyseverfahren aus dem Bereich der Proteomics zum Einsatz.
Die Analysen des Sekretoms belegten, dass zusätzlich zur Sekretion und zur unspezifischen
Proteinfreisetzung durch Zelltod weitere Mechanismen wie das Ektodomänen Shedding von
Transmembranproteinen und die Freisetzung von Exosomen in signifikantem Umfang zur
Proteinzusammensetzung des Sekretoms beitragen. Ein Beispiel für den Prozess des Sheddings
markiert der Nachweis einer löslichen Form des E-Cadherins. Darüber hinaus wurde eine Reihe
von Proteinen im Sekretom identifiziert, die die Eignung des Sekretoms als Quelle potentieller
Biomarker unterstützen.
Für die differentielle Sekretomanalyse Smad4-defizienter und Smad4-reexprimierender Zellklone
wurde die Karzinomzelllinie SW620 verwendet. Die Proteine wurden dazu mit Hilfe der
hochauflösenden 2-dimensionalen differentiellen Gelelektrophorese (2D-DIGE-Technologie)
aufgetrennt und untersucht. Im Rahmen dieser Untersuchung wurden insgesamt 83 differentiell
exprimierte Proteine mittels Massenspektrometrie identifiziert und die differentielle Expression für
einige dieser Proteine mit Hilfe von Western Blot-Analysen bestätigt. Die von Smad4 negativ
regulierten Proteine könnten gleichzeitig Tumormarker-Kandidaten darstellen.
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Zusammenfassung
Im
Vergleich
zu
den
SW620-Zellen
repräsentieren
die
LT97-Zellen,
eine
humane
Adenomzelllinie, ein früheres Stadium innerhalb der Tumorgenese des Kolonkarzinoms. Der
qualitative Vergleich der Sekretome beider Zelllinien zeigte, dass die LT97-Zellen noch
differenziert sind, was sich auch in den Proteinen ihres Sekretoms widerspiegelt. Unter den 69
mittels nano HPLC/ESI-MS/MS identifizierten Proteinen fanden sich dementsprechend epithelkolonspezifische Proteine wie Desmocollin, Lipocalin 2, Fatty acid binding-protein und REG4. In
diesem Ansatz wurde eine lösliche Form des Cadherin-17 als hoch abundantes Potein im
Sekretom der Adenomzelllinie identifiziert. Das Protein stellt aufgrund seiner hohen
Gewebespezifität
für
das
Darmepithel
und
seiner
Freisetzung
ins
Sekretom
einen
vielversprechenden Tumormarker-Kandidaten dar. Aus diesem Grund wurde es zum Patent
angemeldet. Seine Eignung als diagnostischer Marker wird derzeit im Rahmen einer weiteren
Arbeit eingehend überprüft.
Da eine Detektion von Biomarkern zu einem frühen Zeitpunkt der Krebserkrankung
wünschenswert ist, wurde eine Katalogisierung der Proteine des Sekretoms von LT97-Zellen
vorgenommen. Nach einer Vorfraktionierung der Proteine im 1D-Gel gelang die Identifizierung
von 686 Proteinen mittels nano HPLC/ESI-MS/MS. Analog dazu wurden die Proteine einer durch
Ultrazentrifugation gewonnenen Exosomenpräparation von LT97-Zellen katalogisiert, da im
Verlauf der Arbeit belegt werden konnte, dass diese Membranvesikel endosomaler Herkunft
wesentlich an der Freisetzung von Proteinen ins Sekretom beteiligt sind. Die 702 identifizierten
Proteine der Exosomenpräparation ermöglichen einen Einblick in die Zusammensetzung der
Exosomen und geben erste Hinweise auf ihr mögliches Potential als Träger von Biomarkern.
Insgesamt hat die vorliegende Arbeit in erheblichem Maße dazu beigetragen, die Erkenntnisse
über die Zusammensetzung von Sekretomen unterschiedlicher Zellkulturmodelle zu erweitern.
Zudem bilden die Daten eine informative Basis zur Bearbeitung grundlegender Fragestellungen
der Tumorbiologie sowie eine reichhaltige Quelle für die Suche nach möglichen TumormarkerKandidaten.
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