Vergleichende Analyse extrazellulärer Proteome von humanen
Werbung
Zusammenfassung 6 ZUSAMMENFASSUNG Ein wichtiges Ziel in der Krebsforschung ist die Identifizierung von Tumor-Biomarkern, die zur Diagnose einer Krebserkrankung und zur Überwachung des Krankheitsverlaufs genutzt werden können. Aufgrund der niedrigen Konzentration tumorassoziierter Proteine in Körperflüssigkeiten wie z.B. im Serum gestaltet sich die Suche nach derartigen Markerproteinen trotz immer sensitiver werdenden Analysemethoden als äußerst schwierig. In dieser Arbeit wurde als alternative Quelle zur Suche nach potentiellen Markern das Sekretom humaner kolorektaler Krebszelllinien verwendet. Als Sekretom wurde hierbei die Gesamtheit aller durch unterschiedliche Mechanismen in vitro freigesetzten Proteine definiert. Seine Bestandteile wurden durch Isolation und Aufreinigung der Proteine aus den Zellkulturüberständen gewonnen und anschließend über Massenspektrometrie identifiziert. Die vorliegende Arbeit hatte zwei zentrale Zielsetzungen: die Funktionsanalyse des Tumorsuppressors Smad4 sowie die Identifizierung von Tumor-Biomarkern. Um diese Ziele miteinander zu verknüpfen, wurden vergleichende Analysen der Proteine des Sekretoms von humanen Kolonkarzinom- und Adenomzelllinien durchgeführt, wobei die verwendeten Zellmodelle die Tumorprogression in vitro widerspiegeln. Hierfür kamen neben zellbiologischen Methoden vor allem moderne Trenn- und Analyseverfahren aus dem Bereich der Proteomics zum Einsatz. Die Analysen des Sekretoms belegten, dass zusätzlich zur Sekretion und zur unspezifischen Proteinfreisetzung durch Zelltod weitere Mechanismen wie das Ektodomänen Shedding von Transmembranproteinen und die Freisetzung von Exosomen in signifikantem Umfang zur Proteinzusammensetzung des Sekretoms beitragen. Ein Beispiel für den Prozess des Sheddings markiert der Nachweis einer löslichen Form des E-Cadherins. Darüber hinaus wurde eine Reihe von Proteinen im Sekretom identifiziert, die die Eignung des Sekretoms als Quelle potentieller Biomarker unterstützen. Für die differentielle Sekretomanalyse Smad4-defizienter und Smad4-reexprimierender Zellklone wurde die Karzinomzelllinie SW620 verwendet. Die Proteine wurden dazu mit Hilfe der hochauflösenden 2-dimensionalen differentiellen Gelelektrophorese (2D-DIGE-Technologie) aufgetrennt und untersucht. Im Rahmen dieser Untersuchung wurden insgesamt 83 differentiell exprimierte Proteine mittels Massenspektrometrie identifiziert und die differentielle Expression für einige dieser Proteine mit Hilfe von Western Blot-Analysen bestätigt. Die von Smad4 negativ regulierten Proteine könnten gleichzeitig Tumormarker-Kandidaten darstellen. 115 Zusammenfassung Im Vergleich zu den SW620-Zellen repräsentieren die LT97-Zellen, eine humane Adenomzelllinie, ein früheres Stadium innerhalb der Tumorgenese des Kolonkarzinoms. Der qualitative Vergleich der Sekretome beider Zelllinien zeigte, dass die LT97-Zellen noch differenziert sind, was sich auch in den Proteinen ihres Sekretoms widerspiegelt. Unter den 69 mittels nano HPLC/ESI-MS/MS identifizierten Proteinen fanden sich dementsprechend epithelkolonspezifische Proteine wie Desmocollin, Lipocalin 2, Fatty acid binding-protein und REG4. In diesem Ansatz wurde eine lösliche Form des Cadherin-17 als hoch abundantes Potein im Sekretom der Adenomzelllinie identifiziert. Das Protein stellt aufgrund seiner hohen Gewebespezifität für das Darmepithel und seiner Freisetzung ins Sekretom einen vielversprechenden Tumormarker-Kandidaten dar. Aus diesem Grund wurde es zum Patent angemeldet. Seine Eignung als diagnostischer Marker wird derzeit im Rahmen einer weiteren Arbeit eingehend überprüft. Da eine Detektion von Biomarkern zu einem frühen Zeitpunkt der Krebserkrankung wünschenswert ist, wurde eine Katalogisierung der Proteine des Sekretoms von LT97-Zellen vorgenommen. Nach einer Vorfraktionierung der Proteine im 1D-Gel gelang die Identifizierung von 686 Proteinen mittels nano HPLC/ESI-MS/MS. Analog dazu wurden die Proteine einer durch Ultrazentrifugation gewonnenen Exosomenpräparation von LT97-Zellen katalogisiert, da im Verlauf der Arbeit belegt werden konnte, dass diese Membranvesikel endosomaler Herkunft wesentlich an der Freisetzung von Proteinen ins Sekretom beteiligt sind. Die 702 identifizierten Proteine der Exosomenpräparation ermöglichen einen Einblick in die Zusammensetzung der Exosomen und geben erste Hinweise auf ihr mögliches Potential als Träger von Biomarkern. Insgesamt hat die vorliegende Arbeit in erheblichem Maße dazu beigetragen, die Erkenntnisse über die Zusammensetzung von Sekretomen unterschiedlicher Zellkulturmodelle zu erweitern. Zudem bilden die Daten eine informative Basis zur Bearbeitung grundlegender Fragestellungen der Tumorbiologie sowie eine reichhaltige Quelle für die Suche nach möglichen TumormarkerKandidaten. 116
