5. Zusammenfassung

5. Zusammenfassung
5. Zusammenfassung
Die Infektion der für die Aktivierung der adaptiven Immunantwort essentiellen Antigenpräsentierenden Zellen durch MCMV führt zu einer Beeinträchtigung der Funktion
dieser Zellen. Ein Teil dieser Beeinflussung bezieht sich auf eine reduzierte
Oberflächenexpression von wichtigen Proteinen in MCMV-infizierten APC. Ziel dieser
Arbeit war es, die dafür verantwortlichen viralen Gene zu identifizieren.
Hierfür wurde zunächst ein Screeningsystem etabliert, das die effiziente Lokalisierung
und Eingrenzung von Genen ermöglichte, die einen Einfluss auf die Expression von
Zelloberflächenproteinen der APC haben. Dabei wurde von der Überlegung
ausgegangen,
dass
die
durch
das
Wildtypvirus
ausgelöste
Reduktion
von
Zelloberflächenproteinen in mit MCMV-Mutanten infizierten APC ausbleiben sollte,
wenn die hierfür verantwortlichen Gene in der Mutante inaktiviert wurden.
Die Komponenten des Screeningverfahrens waren die Zellinie RAW264.7, die Messung
der Oberflächenexpression der Ziel-Proteine mit der Durchflusszytometrie und eine
Reihe von MCMV-Mutanten, denen jeweils größere Genombereiche mit nichtessentiellen Genen fehlten.
Mit dem Screeningverfahren gelang zunächst die Identifzierung einer Region von ca. 12
kbp, in der virale Gene lokalisert sind, die einen negativen Einfluss auf die
Zelloberflächenexpression von CD40 und CD86 auf APC haben.
Die Identifizierung des für die Reduktion der Expression von CD86 essentiellen Gens
erfolgte durch eine schrittweise Eingrenzung der für diesen Effekt verantwortlichen
Region. Bei diesen Analysen wurde deutlich, dass weder einer der vorhergesagten
ORFs, noch eine kooperative Wirkung zweier vorhergesagter ORFs für den Effekt
verantwortlich war. Vielmehr wurden nicht zusammenhängende Sequenzen von zwei
verschiedenen ORFs als essentiell identifiziert. Mit RT-PCR-Analysen gelang die
Identifizierung des gespleißten Gens modB7-2. Der positive Nachweis, dass dieses
identifzierte Gen einen Einfluss auf die Expression von CD86 hat, wurde durch die
Insertion der modB7-2 cDNA in eine Loss-of-function Mutante geführt. Die resultierende
Virusrekombinante zeigte dadurch einen Gain-of-function Phänotyp. Dieses Ergebnis
war im Einklang mit der Beobachtung, dass eine selektive Unterbrechung des modB7-2
ORFs mit Stopcodons in einem Verlust der viralen Funktion resultierte. Das Produkt des
modB7-2-Gens interferiert gezielt mit der Zelloberflächenexpression von CD86 und hat
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keinen Einfluss auf die Expression von CD40, CD80 oder der MHC-Moleküle. Die
Expression des Proteins konnte bereits drei Stunden nach Infektion nachgewiesen
werden und der reduzierende Effekt auf die CD86-Expression sieben Stunden nach
Infektion.
Die genomische Region mit dem ORF m155 wurde als für die Reduzierung des
Proteins CD40 essentiell identifiziert. Der Nachweis eines dort kodierten Proteins
gelang bisher noch nicht. Da die Deletion des ORF m155 nur einen partiellen Verlust
des Phänotyps zur Folge hatte wurde geschlossen, dass das dort kodierte Protein nicht
das einzige Protein sein kann, welches mit der Expression von CD40 interferiert.
Aufgrund der Tatsache, dass die Mutante ∆6S3 einen vollständigen Ausfall der viralen
Funktion zeigte, wird vermutet, dass ein weiteres Protein, welches CD40 beeinflußt, im
durch die Deletion der Mutanten ∆6S3 definierten Bereich kodiert wird. Für die im
Bereich des ORFs m155 kodierte Funktion konnte nur ein Einfluss auf CD40, nicht
jedoch auf die Expression der MHC- oder der kostimulatorischen Moleküle CD80 und
CD86 nachgewiesen werden. Der Effekt auf die CD40-Expression zeichnet sich durch
eine schnelle Kinetik aus, so kann die Reduktion von CD40 in MCMV-infizierten Zellen
bereits sechs Stunden nach Infektion beobachtet werden.
Durch Inhibitionsversuche wurden die möglichen Wirkungsmechanismen der viralen
Gene eingegrenzt. Eine selektive Inhibierung der Translation der CD40- bzw. CD86mRNA durch die beiden viralen Gene konnte als alleiniger Grund für den beobachteten
Phänotyp ausgeschlossen werden. Ferner zeigte eine Untersuchung von infizierten
Zellen mit Immunfluoreszenz keine fundamentalen Umstrukturierungen von zellulären
Kompartimenten und auch keine Verringerung der Menge oder Veränderung der
intrazellulären Lokalisation von CD40 und CD86. Folglich konnten eine vollständige
Degradation der Targetproteine oder die Umstrukturierung des sekretorischen
Apparates als Ursache für den beobachteten Phänotyp ebenfalls ausgeschlossen
werden.
Ziel
der
weiterführenden
Untersuchungen
wird
es
sein,
den
Wirkungsmechanismus der viralen Proteine im Detail aufzuklären und die biologische
Bedeutung der immunmodulatorischen Virusfunktionen zu bestimmen.
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