Aus dem Physiologischen Institut der Tierärztlichen Hochschule
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Aus dem Physiologischen Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover und aus dem Universitätsklinikum Münster Medizinische Klinik und Poliklinik C (Kardiologie und Angiologie) __________________________________________________________ Kardiale Phänotypisierung heterozygoter Plakoglobin-defizienter Mäuse mittels Echokardiographie und Telemetrie INAUGURAL - DISSERTATION zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover vorgelegt von Melanie Zwiener aus Schloß Holte- Stukenbrock Hannover 2006 Wissenschaftliche Betreuung: Apl. Prof. Dr. Bernd Schröder Tierärztliche Hochschule Hannover PD Dr. Paulus Kirchhof Universitätsklinikum Münster 1. Gutachter: Apl. Prof. Dr. Bernd Schröder 2. Gutachter: Prof. Dr. Gregor Hauschild Tag der mündlichen Prüfung: 23.05.2006 Die Dissertation wurde angefertigt im Rahmen des Projektes Ki 099-04 des IZKF Münster mit Unterstützung der zentralen Projektgruppe „Kleintierphänotypisierung“ des IZKF Münster (ZPG 4). Meinem Mann und meinen Eltern gewidmet Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung..............................................................................................9 2. Stand der Forschung..........................................................................12 2.1 ARVC (Arrhythmogene rechtsventrikuläre Kardiomyopathie)................ 12 2.1.1 Naxos-Disease beim Menschen.......................................................... 17 2.1.2 ARVC bei Tieren ................................................................................. 19 2.1.2.1 Poll Hereford Kälber ........................................................................ 19 2.1.2.2 Hund ................................................................................................ 19 2.1.2.3 Katze ............................................................................................... 21 2.1.2.4 Maus................................................................................................ 21 2.2 Plakoglobin............................................................................................. 22 2.2.1 Aufbau................................................................................................. 22 2.2.2 Funktion .............................................................................................. 22 2.2.2.1 Intercalated Discs – Plakoglobin vs. β-Catenin ............................... 24 2.2.2.1.1 Desmosomen............................................................................... 25 2.2.2.1.2 Adherens Junctions ..................................................................... 26 2.2.2.2 Wnt-Signalweg ................................................................................ 26 2.2.2.3 Phosphorylierung............................................................................. 27 2.2.2.4 Plakoglobin als Transkriptionsfaktor ................................................ 29 2.2.2.5 Apoptose / Tumorentwicklung ......................................................... 30 2.3 Plakoglobin-Defizienz............................................................................. 32 2.4 Elektrokardiographie bei der Maus ........................................................ 34 2.5 Echokardiographie bei der Maus ........................................................... 36 2.6 Fragestellung.......................................................................................... 38 3. Experimenteller Teil............................................................................40 3.1 Tiere und Tierhaltung ............................................................................. 40 3.1.1 3.1.2 Plakoglobin-defiziente Mäuse ............................................................. 40 Tierhaltung .......................................................................................... 42 3.2 Elektrophysiologische Untersuchungen ................................................. 43 3.2.1 3.2.2 3.2.2.1 3.2.2.2 3.2.2.3 3.2.2.4 3.2.3 3.2.4 3.2.4.1 Erstellung des Oberflächenelektrokardiogramms................................ 43 Erstellung des telemetrischen Elektrokardiogramms .......................... 44 Aufbau der Anlage........................................................................... 44 Implantation des Transmitters ......................................................... 47 Erstellung des Ruhe-EKGs.............................................................. 49 Erstellung des Belastungs-EKGs..................................................... 49 Auswertung der Elektrokardiogramme ................................................ 50 Telemetrisches EKG mit sympathomimetisch wirksamen Pumpen..... 52 Implantation der Pumpen ................................................................ 52 3.3 Transthorakale Echokardiographie ........................................................ 53 3.3.1 3.3.2 Durchführung ...................................................................................... 53 Auswertung ......................................................................................... 58 3.4 Schwimmtraining .................................................................................... 63 3.4.1 3.4.2 Durchführung ...................................................................................... 63 Auswertung ......................................................................................... 63 3.5 Elektrophysiologische Untersuchung an isolierten Herzen .................... 65 3.5.1 3.5.2 Durchführung ...................................................................................... 65 Auswertung ......................................................................................... 69 3.6 Histologische Untersuchung................................................................... 71 3.7 Positronen Emissions Tomographie (PET) ............................................ 72 3.8 Versuchsablauf und Tierversuchsgruppen............................................. 73 3.9 Statistik................................................................................................... 78 4. Ergebnisse .........................................................................................79 4.1 Echokardiographie ................................................................................. 79 4.1.1 4.1.2 Altersabhängiger Vergleich ................................................................. 79 Auswirkung von Ausdauertraining....................................................... 88 4.2 Elektrokardiogramm ............................................................................. 102 4.2.1 Oberflächenelektrokardiogramm ............................................................ 102 4.2.2 Telemetrisches Elektrokardiogramm ...................................................... 104 4.3 Implantation von sympathomimetisch-wirksamen Pumpen ................. 109 4.4 Elektrophysiologische Untersuchung an isolierten Herzen .................. 112 4.5 Histologische Untersuchung................................................................. 116 5. Diskussion ........................................................................................117 5.1 Methodik............................................................................................... 117 5.1.1 Mausmodell ............................................................................................ 117 5.1.2 Echokardiographie.................................................................................. 118 5.1.3 EKG-Aufzeichnung ................................................................................. 120 5.1.4 Gabe von Sympathomimetika ................................................................ 122 5.2 Versuchsergebnisse............................................................................. 125 5.2.1 Zusammenfassung ................................................................................. 125 5.2.2 Rechtsventrikuläre Dilatation.................................................................. 126 5.2.3 Funktionsverminderung .......................................................................... 128 5.2.4 Arrhythmien ............................................................................................ 128 5.2.5 EKG-Morphologie ................................................................................... 130 5.3 Schlussfolgerungen.............................................................................. 132 6. Zusammenfassung...........................................................................134 7. Summary ..........................................................................................136 Literaturverzeichnis ..............................................................................137 Abbildungsverzeichnis..........................................................................177 Tabellenverzeichnis..............................................................................181 Abkürzungsverzeichnis ........................................................................182 Anhang .................................................................................................186 Geräte ........................................................................................................ 186 Verbrauchsmaterialien ............................................................................... 187 1. Einleitung 1. Einleitung Der plötzliche Herztod ist ein gefürchtetes Ereignis, das in Europa und den USA je ca. 300.000 Todesfälle pro Jahr verursacht (PRIORI et al. 2001). Er ist definiert als ein plötzlich und unerwartet auftretender Todesfall ohne vorausgehende Symptome oder mit einem Symptombeginn von maximal 24 Stunden vorher (KANNEL et al. 1982; ZIPES und WELLENS 1998). Verantwortlich dafür sind zumeist Kammertachykardien und Kammerflimmern. Diese Arrhythmien entstehen häufig in der linken Herzkammer. Allerdings wurden in Italien in 20% der Fälle bei jungen Menschen und Sportlern die arrhythmogene rechtsventrikuläre Kardiomyopathie (ARVC) als Ursache beschrieben (CORRADO et al. 2000a). Trotz zunehmender Erkenntnisse zur klinischen Manifestation und zum Krankheitsverlauf sind die pathogenetischen und -physiologischen Ursachen der ARVC und die Pathophysiologie der Arrhythmien bei ARVC noch weitgehend unbekannt. Verursacht wird der plötzliche arrhythmische Herztod durch Kammerflimmern und ventrikuläre Kammertachykardien, die zu einem Verlust der Pumpfunktion des Herzens und damit zu einem Kreislaufstillstand führen. Für diese Arrhythmien gibt es in einigen Fällen eine genetische Prädisposition. Neben dem langen QT-Syndrom und dem Brugada-Syndrom, die durch mutierte Ionenkanäle und primär elektrophysiologische Veränderungen verursacht werden, findet sich bei der ARVC ebenfalls eine genetisch bedingte Neigung zu Kammertachykardien und arrhythmischem Herztod. Eine Dilatation des rechten Ventrikels sowie Reduktion der rechtsventrikulären Ejektionsfraktion, ein Umbau des Myokards zu Fett- und Bindegewebe und ein Vorkommen von Epsilonwellen bzw. Verbreiterung des QRSKomplexes im EKG sind Hauptkriterien zur Diagnose von ARVC. Sie weist zwar charakteristische strukturelle Veränderungen des Herzens auf, geht jedoch zumeist primär mit Kammertachykardien und plötzlichem arrhythmischem Herztod einher (WICHTER et al. 2002). Die Arrhythmien treten bei ARVC-Patienten vor allem unter Belastung auf. Zudem scheint ein hoher Anteil von Kammertachykardien bei Sportlern mit inapparenten Formen der ARVC assoziiert zu sein (HEIDBUCHEL et al. 2003). Bei der ARVC gibt es bislang nur wenige Hinweise, dass die Zell-Kontakt- 9 1. Einleitung Proteine verändert sind, wohingegen Gendefekte als Ursache des langen QT- und Brugada-Syndroms schon länger bekannt sind (WICHTER et al. 2002). Bei Patienten mit Naxos disease, einer Sonderform der ARVC mit zusätzlicher palmo-plantarer Hyperkeratose und gelocktem Haar, finden sich Mutationen im Plakoglobin-Gen, die ein nicht-funktionales Protein codieren (McKOY et al. 2000; PROTONOTARIOS et al. 2002). In Untersuchungen des Universitätsklinikums Münster konnte nachgewiesen werden, dass bei Patienten mit typischer ARVC der Plakoglobin-Gehalt im Myokard selektiv im rechten Herzen vermindert ist (unveröffentlichte Daten). Diese Befunde legen nahe, dass eine reduzierte Expression von Plakoglobin ursächlich für die ARVC sein könnte. Plakoglobin ist ein zytoskelettäres Protein aus der Familie der Catenine (RUIZ et al. 1996). Es verbindet die Zytoskelettfilamente mit den Zellkontaktproteinen der so genannten Intercalated Discs. Es wird angenommen, dass bei einer Veränderung dieser Verbindung der Zellverband instabil wird (PROTONOTARIOS et al. 2002). Homozygot Plakoglobin-defiziente Tiere weisen einen embryonal letalen Phänotyp auf (RUIZ et al. 1996), der durch ein Fehlen der Desmosomen im Herzen und Rupturen der Herzwand charakterisiert ist. Dagegen erreichen heterozygote Tiere das Erwachsenenalter. Um dem postulierten vermehrten Vorkommen von Arrhythmien durch ARVC bei Ausdauersportlern Rechnung zu tragen, sollten in dieser Arbeit an einem transgenen Tiermodell mit verminderter Expression von Plakoglobin die Auswirkungen von akuter körperlicher und mentaler Belastung sowie von körperlichem Ausdauertraining auf kardiale Funktion und Arrhythmien untersucht werden. Im Einzelnen war es zunächst das Ziel der vorliegenden Studie, den Zusammenhang zwischen veränderter rechtsventrikulärer Plakoglobin-Expression Kardiomyopathie durch kardiale und arrhythmogener Phänotypisierung an heterozygoten Plakoglobin-defizienten Mäusen zu untersuchen. Des Weiteren sollten die pathophysiologischen Ursachen der ARVC anhand des Mausmodells näher charakterisiert werden. Hierzu 10 wurden echokardiographische, 1. Einleitung elektrokardiographische und elektrophysiologische In-vivo- und In-vitro- Untersuchungen durchgeführt, um folgende Fragen näher zu beleuchten: Hat das heterozygote Vorkommen des Plakoglobin-Gens Auswirkungen auf die Elektrophysiologie und die Morphologie des Herzens? Sind die Folgen einer heterozygoten Plakoglobin-Defizienz vom Alter der Tiere und/oder dem Trainingszustand abhängig? Treten unter Medikation mit β-Adreno-Rezeptor-Agonisten vermehrt Arrhythmien oder Funktionsstörungen auf? 11 2. Stand der Forschung 2. Stand der Forschung 2.1 ARVC (Arrhythmogene rechtsventrikuläre Kardiomyopathie) Im Jahr 1961 wurde die arrhythmogene rechtsventrikulare Dysplasie von DALLA VOLTA et al. zuerst beschrieben und anschließend von FONTAINE et al. (1977) charakterisiert. Eine familiäre Häufung ist bei 50% der Patienten nachweisbar. Hierfür werden bereits diagnostizierte ARVC, plötzliche Herztode (SCD) und ventrikuläre Tachykardien (VT) evaluiert. Eine variable Expression und eine unvollständige Penetranz (30%) liegen bei der Vererbung der autosomal dominanten Formen vor (McKENNA et al. 1994). Eine autosomal rezessive Form wurde in Verbindung mit der Naxos disease (PROTONOTARIOS et al. 1986; McKOY et al. 2000) und mit Mutationen im Desmoplakin-Gen beschrieben (ALCALAI et al. 2003). Es wurden bisher neun verschiedene Genloci entdeckt, die mit der ARVC in Zusammenhang gebracht werden (s. Tab. 2.1.1). 12 2. Stand der Forschung Tabelle 2.1.1: Mutationen, die mit der ARVC assoziiert sind ARVC= Arrhythmogene rechtsventrikuläre Kardiomyopathie; Aut.-dom.= Autosomal-dominant; Aut.rez.= Autosomal-rezessiv; in der Chromosomenspalte steht die erste Zahl für die Chromosomennummer, q steht für den langen Arm des Chromosoms und p für den kurzen Arm; RyR2= kardialer Ryanodinrezeptor2; ?= noch unbekannt Nach TOME ESTEBAN et al. 2004, McKOY et al. 2000 und ALCALAI et al. 2003 Lod- Mutiertes Score Gen Typ Modus Chromosom ARVC1 Aut.-dom. 14q23-q24 5.4 ARVC2 Aut.-dom. 1q42-q43 4.0 Transf. Wachstumsfaktor-β3 RyR2 (?) ARVC3 Aut.-dom. 14q12-q22 4.7 ? SEVERINI et al. 1996 ARVC4 Aut.-dom. 2q32.1-q32.3 3.5 ? RAMPAZZO et al. 1997 ARVC5 Aut.-dom. 3p23 6.9 ? AHMAD et al. 1998 ARVC6 Aut.-dom. 10p12-p14 3.9 ? LI et al. 2000 ARVC7 Aut.-dom. 10q22 3.1 ? MELBERG et al. 1999 ARVC8 Aut.-dom. 6p24 4.3 Desmoplakin RAMPAZZO et al. 2002 NAXOS Aut.-rez. 17q21 3.6 Plakoglobin COONAR et al. 1998 Aut.-rez. 6p24 ? Desmoplakin NORGETT et al. 2000 Carvajal Syndrom Quelle RAMPAZZO et al. 1994 BEFFAGNA et al. 2005 RAMPAZZO et al. 1995 Die ARVC führt vor allem bei jungen, männlichen, zuvor gesunden Patienten zu einem plötzlichen Herztod ohne vorherige Symptome. Der plötzliche Herztod (SCD) führt jährlich zu 300.000 Todesfällen in Europa (PRIORI et al. 2001). Allein in Italien verursachte ARVC 20% aller plötzlichen Herztode in Individuen unter 35 Jahren und 22% der plötzlichen Herztode bei Athleten (ASANO et al. 2004). Etwa 50-75% der plötzlichen arrhythmischen Todesfälle werden durch Kammerflimmern (KANNEL et al. 1982) und ventrikulären Kammertachykardien verursacht. Diese führen zu einem Verlust der Pumpfunktion des Herzens und damit zu einem Kreislaufstillstand. Für diese Arrhythmien gibt es in einigen Fällen eine genetische Prädisposition. Neben dem langen QT-Syndrom und dem Brugada-Syndrom, die durch mutierte Ionenkanäle und primär elektrophysiologische Veränderungen verursacht werden, findet sich bei der Arrhythmogenen rechtsventrikulären Kardiomyopathie (ARVC) 13 2. Stand der Forschung ebenfalls eine genetisch bedingte Neigung zu Kammertachykardien und arrhythmischem Herztod (WICHTER et al. 2002). Man teilt die ARVC in vier Stadien ein: 1. Die frühe und stille Phase, die meistens asymptomatisch verläuft. Es kann allerdings bereits zu der ersten Manifestation des plötzlichen Herztodes kommen (FURLANELLO et al. 1998). 2. Die instabile Phase, in der symptomatische Arrhythmien dominieren, vor allem in Form von Kammertachykardien mit Linksschenkelblock, also mit rechtsventrikulärem Ursprung. 3. Phase der rechtsventrikulären Fehlfunktion, mit einer noch relativ gut ausgeprägten linksventrikulären Funktion. 4. Finale Phase mit progressiver biventrikulärer Dilatation, oftmals nicht mehr von einer dilatativen Kardiomyopathie zu unterscheiden. Die häufigsten Komplikationen in diesem Stadium sind Thrombembolien und Vorhofflimmern (CORRADO et al. 2000a). Indirekte Hinweise lassen vermuten, dass Ausdauersport die Manifestation der ARVC begünstigt. In einer Erfassung von Sportlern mit Arrhythmien oder Synkopen hatten mehr als die Hälfte der Patienten rechtsventrikuläre Arrhythmien (HEIDBUCHEL et al. 2003). Bei der ARVC wurde eine Imbalanz der adrenergen Innervation als ein möglicher Faktor in der Genese von Arrhythmien beschrieben. In einer Studie von WICHTER et al. (2000) zeigte sich eine reduzierte β-adrenerge Rezeptorendichte bei ARVC-Patienten. So könnte bei einer verstärkten Katecholaminausschüttung die Neigung zu ventrikulären Arrhythmien vor allem bei sportlicher Belastung ansteigen (WICHTER et al. 2000). Die ARVC ist eine der häufigsten angeborenen degenerativen Herzmuskelerkrankungen, bei denen es zu einer Verdünnung der rechtsventrikulären Wand, aneurysmaler Dilatation des rechten Ventrikels und/oder dessen Dysfunktion kommen kann. Sie führt wahrscheinlich zu regional induzierter Apoptose (MALLAT et al. 1996) vorwiegend des rechtsventrikulären Myokards mit nachfolgendem Ersatz durch Fett- und/oder Bindegewebe (WICHTER et al. 2002). Hierbei erfolgt der 14 2. Stand der Forschung Umbau vom Subepicardium ausgehend zum Subendocardium (THIENE et al. 1988; CORRADO et al. 1997; MARCUS et al. 1982). Ebenso wurden in kleineren Bezirken inflammatorische Infiltrate (hauptsächlich Lymphozyten) beschrieben (THIENE et al. 1991). Aufgrund der Komplexität dieser Erkrankung wurden standardisierte diagnostische Kriterien von der ARVC-Arbeitsgruppe der “Myocardial and Pericardial Disease of the European Society of Cardiology” und von dem „Scientific Council on Cardiomyopathies of the International Society and Federation of Cardiology“ verfasst (McKENNA et al. 1994; s. Tab. 2.1.2). 15 2. Stand der Forschung Tabelle 2.1.2: Diagnostische Kriterien der ARVC Die Diagnose wird gestellt bei Vorliegen von mindestens zwei Hauptkriterien oder einem Hauptkriterium und zwei Nebenkriterien oder bei vier Nebenkriterien aus verschiedenen Diagnosekategorien (I-VI). EKG: Elektrokardiogramm; LV: linker Ventrikel; RV: rechter Ventrikel; VT: ventrikuläre Tachykardie a entdeckt mit Hilfe der Echokardiographie, Angiographie, MRI (magnetic resonance imaging) oder Radionuklid Szintigraphie I. Familiäre Häufung Hauptkriterium Familiäre Erkrankung bestätigt durch Autopsie oder Chirurgie Nebenkriterium Familiäres Vorkommen eines plötzlichen Todes im Alter von unter 35 Jahren und einer vermuteten klinischen Diagnose von ARVC bei Familienmitgliedern II. EKG Depolarisations Abnormalitäten Hauptkriterium Epsilonwellen oder Verbreiterung des QRS-Komplexes (≥110ms) in den Ableitungen V1-V3 Nebenkriterium Späte positive Potentiale III. EKG Repolarisations Abnormalitäten Nebenkriterium T-Wellen Inversion in den rechts präkordialen Ableitungen (V2-V3) bei Patienten über 12 Jahren ohne Rechtsschenkelblock IV. Arrhythmien Nebenkriterium Linksschenkelblock-Morphologie bei anhaltender oder nicht anhaltender VT im EKG, Holter monitoring oder unter Belastung V. Globale und/oder regionale Dysfunktion und strukturelle Abnormalitätena Hauptkriterium Deutliche Dilatation und Reduktion der RV Ejektionsfraktion, mit/ohne geringe Einbeziehung des LV RV Aneurysma (akinetische oder dyskinetische Regionen mit diastolischer Ausweitung) Deutliche segmentale Dilatation des RV Nebenkriterium Moderate globale RV Dilatation und Reduktion der RV Ejektionsfraktion mit normalem LV Moderate segmentale RV Dilatation Regionale RV Hypokinesie VI. Gewebecharakterisierung Hauptkriterium Umbau des Myokards mit Ersatz durch Fett- und/oder Bindegewebe bei einer endomyokardialen Biopsie Die medikamentöse Behandlung mit Sotalol und Amiodaron in Verbindung mit oder ohne Beta-Blocker hat sich als effektiv bei symptomatischen Arrhythmien bewährt (CORRADO et al. 2000b; DALIENTO et al. 1990). Bei Patienten mit einem erhöhten 16 2. Stand der Forschung Risiko sollte eine Implantation eines Defibrillators in Betracht gezogen werden (WICHTER et al., 2004). 2.1.1 Naxos-Disease beim Menschen Bei der Naxos-Disease, einer rezessiv vererbten Sonderform der ARVC, handelt es sich um eine 2-Basen-Deletion im Plakoglobin-Gen, die einen Frameshift verursacht, und dadurch zu einem vorzeitiger Kettenabbruch führt. Der Genlocus 17q21 ist die chromosomale Lokation von Plakoglobin und liegt auf dem langen Arm des Chromosoms 17 (COONAR et al., 1998; WICHTER et al., 2002; COWLEY et al., 1997). Die Mutationen im Plagoklobin-Gen codiert ein nicht-funktionales Protein und führt zu einem Abbruch im C-terminalen Ende nach der 56. Aminosäure (McKOY et al., 2000). Das mutierte Protein hat wahrscheinlich trotz der Abwesenheit des Cterminalen Endes noch einige funktionelle Aktivität, da der Phänotyp dieser Patienten bei weitem nicht so gravierend ist, als der von Plakoglobin-/- Mäusen (BIERKAMP et al., 1996; RUIZ et al., 1996). Bei Patienten mit Naxos-Disease geht die Erkrankung mit einer zusätzlichen palmoplantaren Hyperkeratose und gelocktem Haar einher (PROTONOTARIOS et al. 2002). Die Expression des Haut- und Haarphänotyps entwickelt sich bereits in der frühen Kindheit, wohingegen die pathologischen Anzeichen am Herzen sich erst im Erwachsenenalter zu einer 100%igen Penetranz manifestieren (PROTONOTARIOS et al. 1997). Eine Synkope ist meist das erste Anzeichen der kardialen Erkrankung. Mit einem 12-Kanal EKG und einer zweidimensionalen Echokardiographie kann man diese Form der ARVC nach den etablierten Kriterien (siehe Tab. 2.1.2) diagnostizieren (PROTONOTARIOS et al. 2002). Die charakteristische Ausprägung der kardialen Veränderung entspricht denen im ARVC-Kapitel beschriebenen. Es tritt eine rechtsventrikuläre Dilatation ein, die bei fortgeschrittenen Formen auch den linken Ventrikel betreffen kann. Die rechtsventrikuläre freie Wand ist dünner und geht mit fettig-fibrösem Ersatzgewebe im Einfluss- und/oder Ausflusstrakt des rechten Ventrikels sowie im rechtsventrikulären Apex einher. In einem 12-Kanal Ruhe-EKG findet man in 90% der Fälle kleinere, oft unspezifische Abweichungen bei erkrankten Adulten. Am häufigsten kommen T-Wellen-Inversion und QRS-Komplex- Verbreiterungen (>110 ms) in den Ableitungen V1 bis V3 vor (PROTONOTARIOS et 17 2. Stand der Forschung al. 2002). Inkompletter oder kompletter Rechtsschenkelblock liegt bei Naxos disease Patienten im gleichen Verhältnis, wie bei den anderen Formen der ARVC vor (MARCUS et al., 1982). Bei fortgeschrittener Progression mit Einbeziehung des linken Ventrikels zeigen einige Patienten auch einen Linksschenkelblock. Dies ist nicht zu verwechseln mit den linksschenkelblockähnlichen ventrikulären Extrasystolen, die beim Großteil der Patienten auftreten (PROTONOTARIOS et al. 2002). Andere Familien mit ähnlichen klinischen Manifestationen wurden dokumentiert (HAMMILL et al. 1988; TOSTI et al. 1994; CARVAJAL-HUERTA 1998). Bei einer weiteren Sonderform der ARVC in Ecuador befindet sich eine Mutation im Gen von Desmoplakin, einem weiteren zytoskelettären Protein, das an der Bildung der Desmosomen beteiligt ist. Dies führt zu einer klassischen, autosomal-dominant vererbten Form der ARVC (NORGETT et al. 2000). Interessanterweise liegt diese Mutation im Bereich einer Bindungsstelle am Plakoglobin (RAMPAZZO et al. 2002). Zusätzlich entdeckten ALCALAI et al. (2003) eine rezessive Mutation des Desmoplakingens, das zu ARVC, Hautveränderung und lockigem Haar führte. Aufgrund dieser Erkenntnisse wird vermutet, dass Veränderungen in den ZytoskelettProteinen, wie beispielsweise Plakoglobin, eine Pathogenese der ARVC spielen (WICHTER et al. 2002). 18 wesentliche Rolle bei der 2. Stand der Forschung 2.1.2 ARVC bei Tieren 2.1.2.1 Poll Hereford Kälber Ein letales, autosomal-rezessives, kardiokutanes Syndrom (CWH: Cardiomyopathy and wooly haircoat syndrome) wurde bei Poll Hereford Kälbern in Australien dokumentiert (WHITTINGTON und COOK 1988; COOK 2003). Betroffene Tiere können bereits bei der Geburt anhand des unverwechselbaren wolligen Haarkleides erkannt werden und leiden an ventrikulären Arrhythmien. In manchen Fällen entwickelt sich eine neonatale Keratitis. In der Elektrokardiographie werden geringe Amplituden, flache T-Wellen, ventrikuläre Extrasystolen und Episoden von nicht- anhaltenden ventrikulären Tachykardien registriert (WHITTINGTON und COOK 1988). Der Tod tritt meist innerhalb der ersten 12 Wochen nach der Geburt ein und kann plötzlich, aufgrund von Kammerflimmern (oft nach physischer Anstrengung), oder als Folge von einer Herzinsuffizienz auftreten. Der klinische Phänotyp der CHW teilt Ähnlichkeiten mit dem humanen kardiokutanen Syndrom der Naxos disease beim Haarphänotyp, bei kardialen Arrhythmien und elektrokardiographischen Abnormalitäten. Bei dem CWH-Syndrom können Schäden in beiden Herzkammern auftreten, die einen multifokalen bis lokalen extensiven Myokardmangel mit fibrösem Ersatzgewebe und gelegentlich kalzifizierte Bereiche beinhalten. Subepikardiale Fibrosen der rechtsventrikulären freien Wand sind meistens die führende Veränderung (COOK 2003). Das Fehlen einer fettigen Infiltration könnte eine schnelle Entwicklung der Krankheit in Kälbern widerspiegeln, die zu einem frühzeitigen Herztod führt. Die ventrikuläre Kalzifikation ist vergleichbar mit dem beschriebenen Phänomen bei einem Menschen mit einer homozygoten Mutation des Plakoglobin-Gens, wobei ebenso eine Kalzifikation der rechtsventrikulären freien Wand auftreten kann (BASSO et al. 2001). 2.1.2.2 Hund 1994 und 1995 wurden bereits Fallbeispiele von rechtsventrikulärer Kardiomyopathie bei Hunden beschrieben (SIMPSON et al. 1994; BRIGHT et al. 1995). Eine Dekade 19 2. Stand der Forschung später wurde von BASSO et al. (2004) eine Studie mit 23 Boxern erstellt, bei denen eine Form der ARVC und/oder ein plötzlicher Herztod eintrat. Die klinischen Profile sind plötzlicher Herztod, Synkopen und ventrikuläre Arrhythmien (vermutlich ausgehend von dem rechten Ventrikel). Die pathologischen Abnormalitäten sind rechtsventrikuläre Dilatation und Aneurysmata, rechtsventrikulärer Myokardschwund und fettiges oder fettig-fibröses Ersatzgewebe, Myokarditis und Apoptose. Die Kombination der klinischen Profile und der pathologischen Abnormalitäten scheint ein deutlicher Beleg für das canine Modell der ARVC zu sein. In der Studie starben 39% der Tiere plötzlich, wobei dies bei 78% während einer leichten oder stärkeren körperlichen Anstrengung passierte. Bei 83% der Tiere zeigten sich ventrikuläre Extrasystolen in einer Linksschenkelblock-Morphologie und in 48% traten ventrikuläre Tachykardien auf. Ein familiärer Zusammenhang konnte in 43% der Fälle dokumentiert werden. Bei allen Tieren wurde Myokard durch entweder fettiges (65%) oder fettig-fibröses (35%) Gewebe ersetzt, das sich vom Epikard zum Endokard ausbreitete. Myokarditis wurde beim größten Teil der Tiere sowohl im rechten als auch im linken Ventrikel und teilweise sogar im rechten oder linken Atrium entdeckt. Zusätzlich konnte eine Apoptose der Myozyten in 39% der Fälle histologisch belegt werden. Myokarditis und fettig-fibröses Ersatzgewebe waren charakteristisch für Boxer mit ARVC, die plötzlich verstorben sind (BASSO et al. 2004). Bei einer Untersuchung von SPIER und MEURS (2004a) wurden bei zehn Boxern, die an ARVC erkrankt waren, Langzeit-EKGs angefertigt. Hierbei zeigten sich Änderungen von ≤ 80% in der Häufigkeit von ventrikulären Arrhythmien, die wahrscheinlich in der spontanen Variabilität bei der caninen Form der ARVC begründet liegen (SPIER und MEURS 2004a). Weiter konnte eine verringerte Herzfrequenzvariabilität bei Boxern mit einer kongestiven Herzinsuffizienz gezeigt werden (SPIER und MEURS 2004b). Bei ARVC betroffenen Hunden mit ausgeprägten Arrhythmien werden momentan zwei Therapieprotokolle empfohlen: 1. Sotalol (1,5 – 2,0 mg/kg oral, 2x täglich) oder 2. eine Kombination aus Mexiletine (5-8 mg/kg oral, 3x täglich) und Atenolol (12,5 mg pro Hund, oral 3x täglich) (MEURS 2004). Aufgrund jüngster Studien kann bei der ARVC des Boxers eine Veränderung 20 2. Stand der Forschung im kardialen Ryanodinrezeptor vermutet werden (MEURS et al. 2005), wie sie auch in der ARVC 2 vorliegt. 2.1.2.3 Katze In einer Studie über ARVC bei Katzen, konnten 12 Tiere mit eindeutigen Symptomen beschrieben werden (FOX et al. 2000). Bei allen Tieren lag eine moderate bis erhebliche Rechtsherzvergrößerung mit gleichzeitiger Wandverdünnung und teilweise ein oder mehrere Aneurysmata vor. Ebenso konnten bei allen Tieren mit Hilfe einer histologischen Untersuchung eine rechtsventikuläre Schädigung (aufgrund von myozytärem Tod und Atrophie) sowie das Vorkommen von Ersatzgewebe (fettig oder fettig-fibrös) belegt werden. Diese histologisch erkennbaren Schäden waren bei dem Großteil der Tiere auch im linken Ventrikel und teilweise auch in den Vorhöfen darstellbar. Eine Myokarditis war in zehn Fällen und Apoptose in neun Fällen nachweisbar. Im EKG wurden supraventrikuläre Tachyarrhythmien, ventrikuläre Tachykardien, polymorphe ventrikuläre Arrhythmien und Rechtsschenkelblöcke beschrieben. 2.1.2.4 Maus ASANO et al. (2004) haben eine Mauslinie mit erblicher rechtsventrikulärer Dysplasie gefunden, verursacht durch eine Mutation des Laminin Rezeptor 1-Gens (Lamr1). Hierbei traten keine letalen Tachyarrhythmien auf, wie sie häufig bei der humanen ARVC zu finden sind. Im EKG wurden aber elektrische Übergangsleitungsinhomogenitäten, die zu einer verlängerten QRS-Dauer führten, entdeckt. Typischerweise wurde auch hier eine Degeneration der rechtsventrikulären Kardiomyozyten festgestellt. Dabei waren besonders die äußeren Kardiomyozyten betroffen. Aufgrund dessen wurde von den Autoren vermutet, dass ein erhöhter mechanischer Streß eine vermehrte Expression von zytoprotektiven Genen hervorruft. Dies würde den Unterschied zwischen links- und rechtsventrikulär sowie zwischen den inneren und äußeren Kardiomyozyten erklären (ASANO et al. 2004). Weiter wurden ähnliche rechtsventrikuläre Veränderungen bei einem Nerz beschrieben (ISHIKAWA et al. 1977). 21 2. Stand der Forschung 2.2 Plakoglobin 2.2.1 Aufbau Plakoglobin (COWIN et al. 1986), auch bekannt unter der Bezeichnung γ-Catenin (OZAWA et al. 1989), wurde als erstes Mitglied der Armadillo Protein Familie entdeckt (COWIN et al. 1986; FRANKE et al. 1989). Diese ist charakterisiert durch eine zentrale Domäne, die zusammengesetzt ist aus einer variablen Anzahl von arm (Armadillo) repeats. Diese Wiederholungen, die je 42 Aminosäuren beinhalten, wurden identifiziert als ein Genprodukt von Drosophila armadillo, das in die wingless Signalkette involviert ist (PFEIFER und WIESCHAUS 1990; PFEIFER et al. 1994; PFEIFER 1995). Weitere Mitglieder dieser Familie sind β-Catenin, α-Importin, p120ctn und das APC-(adenomatous polyposis coli) Genprodukt. Sie haben unterschiedlichste Funktionen, wie z.B. Kontrolle in der Embryogenese, Zell-ZellKontakte, Tumorprogression, Kernimport und Signaltransduktion (HÜLSKEN et al. 1994; KUSSEL und FRASCH 1995; TÖRÖK et al. 1995; PFEIFER 1996). Plakoglobin besteht aus drei Subdomänen. Die zentrale Domäne setzt sich aus 12 arm repeats zusammen. Diese Region weist einen hohen Homologitätsgrad (76-83% identisch) zwischen Plakoglobin und β-Catenin auf (WILLIAMS et al. 2000; BUTZ et al. 1992; FOUQUET et al. 1992). Es ist in einer Superhelix gefaltet, die sich aus 36 kleinen α-Helices (drei je armadillo repeat) zusammensetzt (HUBER et al. 1997). Die Armadillo repeat Domäne wird durch saure terminale Amino- und Carboxyl-Domänen begrenzt. Die Ähnlichkeit der Proteinendungen zwischen β-Catenin und Plakoglobin sind relativ gering: die C-terminale Domäne stimmt in 41-57% und die N-terminale Domäne in 15-29% überein (WILLIAMS et al., 2000; FOUQUET et al., 1992). 2.2.2 Funktion Plakoglobin dient als Komponente an verschiedenen Zell-Zellverbindungen einschließlich Desmosomen, Zonulae adherentes im Epithel, Belt-Plaques im Endothel und in Verbindungen ohne nachweisbare Filamente, wie im lymphatischen Endothel und Granularzellen der zerebellären Glomeruli (FRANKE et al. 1987; GARROD 1993; SCHMIDT et al. 1994; ROSE et al. 1995). Es ist das einzige Protein, 22 2. Stand der Forschung das sowohl in Desmosomen als auch in Adherens Junctions vorkommt (MATHUR et al. 1994; SACCO et al. 1995; CHITAEV et al. 1996; WITCHER et al. 1996). Plakoglobin liegt in freier und in gebundener Form im Zytosol vor. Abbildung 2.2.2: Die verschiedenen Funktionen von Plakoglobin (ZHURINSKY et al. 2000b) Plakoglobin (Pg) kann an dem zytoplasmatischen Ende des Cadherin AdhäsionsRezeptors in den Adherens Junctions (AJ) binden. Über α-Catenin (α) gehen Plakoglobin und β-Catenin (β) eine Cadherin-Verbindung mit dem Aktin-Zytoskelett ein. Plakoglobin kann im Gegensatz zum β-Catenin zusätzlich mit den desmosomalen Cadherinen Desmocollin und Desmoglein in den Desmosomen (DES) eine Verbindung eingehen, und über Desmoplakin (Dsp) und Plakophilin (Plp) auch mit intermediären Filamenten (IF). Wenn die Wnt (wingless bei Drosophila)-Signalkette nicht aktiviert ist, wird freies Plakoglobin in einem Multimolekularem Komplex abgebaut. Dieser beinhaltet den Tumor Supressor APC (adenomatous polyposis coli), Axin und GSK (Glykogen Synthase Kinase), die wiederum Plakoglobin phosphoriliert (PP). Dieser Komplex steht über die Ubiquitin Lygase β-TrCP in Verbindung mit dem UbiquitinProteasomen System, welche (zusammen mit Cul1 und Skp1) die Ubiquitination (Ub) von Plakoglobin vermittelt und somit zu dem Abbau durch Proteasomen führt. Die Verbindung von Wnt mit dem Frizzled (Frz)-Rezeptor aktiviert die WntSignalkette, und Dishevelled (Dsh) unterdrückt die Plakoglobin Phosphorilierung durch Hemmung der GSK-Aktivität. Dies führt zu einer Akkumulation von Plakoglobin. Die Fähigkeit von Plakoglobin zur Transkription in einem Komplex mit TCF (T-Zell Faktor) wird noch kontrovers diskutiert. 23 2. Stand der Forschung 2.2.2.1 Intercalated Discs – Plakoglobin vs. β-Catenin Plakoglobin ist ein zytoskelettäres Protein aus der Familie der Catenine (RUIZ et al. 1996). Es verbindet die Zytoskelettfilamente mit den Zellkontaktproteinen der Intercalated Discs (RUIZ et al. 1996) und spielt somit eine entscheidende Rolle in den Desmosomen und Adherens Junctions. Es dient als Stützpfeiler in der Architektur der Intercalated Discs und ist damit auch für die Stabilität des Herzgewebes verantwortlich (RUIZ et al. 1996). Bei einer Veränderung in diesen Verbindungen wird eine darauf folgende Instabilität des Zellverbandes vermutet (PROTONOTARIOS et al. 2002). Sowohl in kardialen als auch epidermalen Zell-Zell-Kontakten formt Plakoglobin zusammen mit Cateninen, klassischen und desmosomalen Cadherinen und Mitgliedern der Plakinfamilie die Kernstruktur für Adhäsion und interzelluläre Signalleitung (RUIZ et al. 1996). Plakoglobin kommt sowohl in den Desmosomen, als auch in den Adherens Junctions vor (COWIN et al. 1986; s. Abb. 2.2.2) und hat hier eine vergleichbare Funktion wie β-Catenin (COWIN und BURKE 1996; SCHMIDT et al. 1994). Ein Wettbewerb zwischen den klassischen und den desmosomalen Cadherinen um eine Plakoglobinbindung ist Bedingung für eine Regulation des Aufbaus dieser Zell-ZellVerbindungen (BEN-ZE’EV und GEIGER 1998; COWIN und BURKE 1996; LEWIS et al. 1997). Obwohl Plakoglobin die klassischen Cadherine über α-Catenin mit Aktin in den Adherens Junctions verankern kann, verliert es diese Fähigkeit, wenn es in den Desmosomen eingebunden ist (CHITAEV et al. 1998). Im Gegensatz zu den Arm-Domänen von β-Catenin und Plakoglobin sind die N- und C-terminalen Domänen nur in wenigen Bereichen ähnlich (COWIN und BURKE 1996). Weitere Studien belegen, dass die terminalen Domänen auch verantwortlich sind für die Interaktionen der Arm-Domäne mit anderen Proteinen (CHITAEV et al. 1996; PALKA und GREEN 1997; ZHURINSKY et al. 2000a). Zum Beispiel wird durch Deletion der C-terminalen Domäne die Bindung von Cateninen zu Cadherinen mit dem Arm repeats positiv beeinflusst (CHITAEV et al. 1996). Solch eine Deletion kann 24 2. Stand der Forschung ebenso den Aufbau von Plakoglobin-beinhaltenden Desmosomen stimulieren (PALKA und GREEN 1997). SCHNITTLER et al. (1997) haben eine verringerte Zelladhäsion bei Inhibition der Plakoglobinexpression in endothelialen Flüssigkeitsscherspannung ausgesetzt Zellen waren. Diese entdeckt, Entdeckung die lässt einer die Vermutung zu, dass Plakoglobin für die endothelialen interzellulären Verbindungen benötigt wird, um dem mechanischen Stress standzuhalten. Plakoglobin scheint somit eine entscheidende Rolle in der endothelialen Zell-Zell-Adhäsion und Barrierefunktion inne zu haben (VENKITESWARAN et al. 2002). 2.2.2.1.1 Desmosomen Desmosomen kommen gehäuft in Herzmuskelzellen und in Keratinozyten vor. Hier formen sie symmetrische Plaques, die mehrere Mikrometer im Durchmesser und ca. 100 nm dick sind. Jede Hälfte der Desmosomen ist abgeleitet von einer benachbarten Zelle, in welcher intermediäre Filamente einen Anker durch die zytoplasmatische Peripherie zu bilden scheinen (KELLY 1966). Plakoglobin bindet in den Desmosomen die desmosomalen Cadherine (Desmocollin und Desmoglein (TROYANOVSKY et al. 1994a,b)) an Desmoplakin, Plakophilin (KOWALCZYK et al. 1997) und epidermales Keratin (SMITH und FUCHS 1998). Plakoglobin stellt über Desmoplakin, Plakophilin und Keratin eine Verbindung zu dem intermediären Filamenten des Zytoskeletts her (SCHMIDT et al. 1994; s. Abb. 2.2.2). Besonders dokumentiert wurde die Verbindung zwischen Plakoglobin und Desmoglein, die stärker zu sein scheint als zwischen Plakoglobin und Desmocollin (MATHUR et al. 1994; TROYANOVSKY et al. 1994b; TROYANOVSKY et al. 1996; CHITAEV et al. 1996; WAHL et al. 1996; WITCHER et al. 1996; KOWALCZYK et al. 1997). Das Fehlen von Plakoglobin führt zu drastischen Veränderungen in der Architektur der Intercalated Discs: Typische Desmosomen fehlen in den Intercalated Discs von Plakoglobin-/- Mäusen (RUIZ et al. 1996). In epithelialen Zellen findet man stattdessen bei Plakoglobin Knockout-Mäusen β-Catenin in den sonst β-Cateninfreien Desmosomen. Trotzdem kann β-Catenin nicht alle desmosomalen Proteine mit 25 2. Stand der Forschung all ihren molekularen Interaktionen korrekt verbinden; dies erscheint besonders auffällig, wenn Zellen normalem mechanischen Stress ausgesetzt sind (BIERKAMP et al. 1999; RUIZ et al. 1996). SMITH und FUCHS (1998) haben auch in einer In vitro-Analyse eine Plakoglobin-unabhängige Verbindung zwischen desmosomalen Cadherinen und Desmoplakin darstellen können. Aufgrund von mutiertem Plakoglobin herrschte in einer anderen In-vitro-Studie eine Desmosomen-Dysfunktion, die wiederum zu einem progressiven Myozytensterben bei mechanischem Stress führte (RUIZ et al. 1996). 2.2.2.1.2 Adherens Junctions Adherens Junctions sind ebenso wie die Desmosomen für die Zell-Zell-Adhäsion verantwortlich. Sie setzen sich aus den klassischen Cadherinen (E-, N-, P- und VECadherin), Plakoglobin, β-Catenin und α-Catenin zusammen. In dieser Architektur bindet Plakoglobin zum einen an die distale Region des zytoplasmatischen Endes der Cadherine (catenin binding domain) (VINCENT et al. 2004) und zum anderen an α-Catenin und bildet über dieses Protein einen Anker zu dem Aktin-Zytoskelett für die Adherens Junctions (KNUDSEN et al. 1995; s. Abb. 2.2.2). Aufgrund des hohen Homologitätsgrades liegt ein Wettbewerb um dieselben Bindungsstellen zwischen β-Catenin und Plakoglobin nahe. So kann ein hoher Level an exogenem Plakoglobin dazu führen, dass endogenes β-Catenin von den Adherens Junctions verdrängt wird und zu dessen proteasomaler Degradation führt (SALOMON et al. 1997). 2.2.2.2 Wnt-Signalweg Die Wnt-Protein Familie spielt eine entscheidende Rolle als Wachstums- und Differenzierungsfaktor in der Spezifizierung der Zellen während der embryonalen Entwicklung. Wenn das abgesonderte wingless-Glycoprotein (Wnt) an einen Zelloberflächenrezeptor frizzled/ frizzled-2-type bindet (BHANOT et al. 1996; BHAT 1998; KENNERDELL und CARTHEW 1998; MULLER et al. 1999b), aktiviert es das zytoplasmatische Protein dishevelled (Dvl) (YANAGAWA et al. 1995), das wiederum 26 2. Stand der Forschung zu einer Inaktivierung der Glykogenkinase-3β (Gsk3b) führt (YOST et al. 1997). Gsk3b ist für die Phosphorylierung von β-Catenin und Plakoglobin verantwortlich (siehe Phosphorylierung). Die Beteiligung von Plakoglobin in der Wnt-Signalkaskade wird immer noch debattiert (KARNOVSKY und KLYMKOWSKY 1995; KOFRON et al. 1997; MILLER und MOON 1997; SIMCHA et al. 1998). In manchen Studien teilt man Plakoglobin eine einzigartige Rolle, die unterschiedlich zu der Funktion des β-Catenin ist, in diesem Signalweg zu (CHARPENTIER et al. 2000; SIMCHA et al. 1996; ZHURINSKY et al. 2000a). Auch wenn in verschiedenen Zelltypen eine Überexpression von Wnt zu einer Akkumulation von Plakoglobin führt (BRADLEY et al. 1993; PAPKOFF et al. 1996), ist die Beteiligung von Plakoglobin in dem Wnt-Signalweg in vivo immer noch umstritten, da Plakoglobin die Abwesenheit von β-Catenin bei Knockout-Mäusen nicht ausgleichen kann (BIERKAMP et al. 1996; HAEGEL et al. 1995; HÜLSKEN et al. 2000; RUIZ et al. 1996). Interessanterweise wurde in einer neueren Studie erkannt, dass eine Expression von Plakoglobin in der Haut von transgenen Mäusen (CHARPENTIER et al. 2000) zu einem anderen Phänotyp führt (verringerte epitheliale Proliferation und verringertes Haarwachstum) als bei einer β-Catenin Expression (de novo Haarfollikel Morphogenese und Tumorentwicklung) (GAT et al. 1998). Ein ähnlicher Phänotyp tritt auch auf, wenn spätere Komponenten im Wnt-Signalweg (WNT-3 oder DVL-2, eine Isoform von Dishevelled) in der Haut überexpremiert werden (MILLAR et al. 1999). Dies könnte ein Hinweis auf eine Beteiligung von Plakoglobin in dem WntSignalweg in einer Reaktion, die nach WNT-3 und DVL-2 auftritt, sein (MILLAR et al. 1999). 2.2.2.3 Phosphorylierung Bei den Cateninen wird Serin/Threonin und Tyrosin phosphoryliert, um die Reaktionen mit anderen Proteinen zur regulieren (YOST et al. 1996; HAMAGUCHI et al. 1993; MATSUYOSHI et al. 1992). 27 2. Stand der Forschung Plakoglobin ist Ziel des proteasomalen Abbaus mit Hilfe des Axin-APC-Komplexes (KODAMA et al. 1999; SADOT et al. 2000; s. Abb. 2.2.2). Plakoglobin kann einen Komplex mit APC (adenomatous polyposis Coli) (RUBINFELD et al. 1993; SHIBATA et al. 1994), Axin (BEHRENS et al. 1998; IKEDA et al. 1998; KODAMA et al. 1999) und Gsk3b (ABERLE et al. 1997) formen. Die N-terminale Domäne von Plakoglobin wird von Gsk3b (Glykogenkinase-3β) am Serin-Rest phosphoryliert (ABERLE et al. 1997; YOST et al. 1996; KODAMA et al. 1999). Die Gsk3b-vermittelte Phosphorylierung führt zum proteasomalen Abbau über eine Ubiquitination von Plakoglobin (ABERLE et al. 1997; SADOT et al. 2000). Solange Plakoglobin in den Desmosomen oder Adherens Junctions gebunden ist, ist es unzugänglich für die Degradationsmaschinerie (SADOT et al. 2000). Punktmutationen oder Deletion der N-terminalen Phosphorylierungsstelle haben keinen Effekt auf die Halbwertszeit von Plakoglobin (WILLIAMS et al. 2000). Trotzdem ist die N-terminale Gsk3b Phosphorilierungstelle wichtig für die Plakoglobinstabilität, da eine Überexpression von Axin, das die Gsk3b-abhängige Phosphorilierung fördert, zu einem Plakoglobinabbau führt (KODAMA et al. 1999). Plakoglobin kann ebenso am Tyrosin über eine Rezeptor-vermittelte und eine nicht Rezeptor-vermittelte Tyrosin-Kinase phosphoryliert werden (HAMAGUCHI et al. 1993; MATSUYOSHI et al. 1992). Der EGF-Rezeptor (epidermal growth factor) reagiert direkt mit Plakoglobin (HOSCHUETZKY et al. 1994; MATSUYOSHI et al. 1992) und phosphoriliert dabei Tyrosin, so dass eine Verbindung mit Desmoplakin, nicht aber mit Desmoglein verhindert wird (GAUDRY et al. 2001). Zusätzlich wurde entdeckt, dass Peroxyvanadat die Tyr(P)-Phophatase inhibiert. Dies führt zu einer verringerten Zell-Zell-Adhäsion, da die Verbindungen zwischen Plakoglobin mit αCatenin und E-Cadherin abnehmen. Dieser Effekt kann mit Hilfe der Tyr(P)Phosphatase wieder rückgängig gemacht werden (HU et al. 2001). Auch wenn βCatenin und Plakoglobin hochgradig verwandt sind, so phosphorilieren dieselben Kinasen doch unterschiedliche Stellen in den beiden Proteinen (SOLANAS et al. 2004). Darüber hinaus hat die Phosphorylierung an den entsprechenden gleichen Stellen verschiedene Effekte auf die Reaktionen von β-Catenin und Plakoglobin mit deren Zellpartnern (MIRAVET et al. 2003). 28 2. Stand der Forschung 2.2.2.4 Plakoglobin als Transkriptionsfaktor Plakoglobin kann an LEF/TCF (lymphocyte enhancer binding factor-1/ T-Zell Faktor) binden (HECHT et al. 1999; HUBER et al. 1996; SIMCHA et al. 1998; ZHURINSKY et al. 2000a) und hat einen Transaktivierungsbereich an der C-terminalen Domäne (HECHT et al. 1999; SIMCHA et al. 1998). Da β-Catenin vor allem mit seiner Arm-repeat-Domäne an die Transkriptionsfaktoren bindet, und diese mit der von Plakoglobin nahezu homolog ist (COWIN und BURKE 1996), liegt es nahe, dass Plakoglobin auch mit denselben Kernmolekülen interagiert. Plakoglobin kann einen Komplex mit LEF-1 eingehen, wenn eine Cotransfektion beider Moleküle in der Zelle durchgeführt wird (HUBER et al. 1996; SIMCHA et al. 1998). Catenine haben keine klassischen Kern- Lokalisationssignalsequenzen (NLSs) und sammeln sich über zwei verschiedene Mechanismen im Kern an. Zum einen konnte gezeigt werden, dass β-Catenin über einen Importin-unabhängigen Weg in einem semipermeablen Zellmodell für Kernimport in den Zellkern gelangt (FAGOTTO et al. 1998; YOKOYA et al. 1999). Dies könnte in einer Verbindung von β-Catenin und dem Nukleoporin Nup1 begründet liegen (FAGOTTO et al. 1998). Zum anderen führt eine Überexpression von LEF/TCF zu einer Akkumulation von β-Catenin in dem Zellkern (BEHRENS et al. 1996; MOLENAAR et al. 1996; SIMCHA et al. 1998). Es wird vermutet, dass der Kernimport von dem β-Catenin/LEF-, bzw. Plakoglobin/LEF-Komplex über die klassischen NLS der LEF/TCF-Proteine möglich ist. Nachdem ein Anstieg der intranukleären Plakoglobinkonzentration bei einem geringen Vorkommen von LEF/TCF festgestellt wird (SIMCHA et al. 1996, 1998), sind in vivo wahrscheinlich auch LEF/TCF-unabhängige Transportmechanismen von großer Bedeutung. Auch wenn Plakoglobin an LEF-1 genauso stark bindet wie β-Catenin, so ist doch die Verbindung von Plakoglobin-LEF-1 und DNA sehr schwach (ZHURINSKY et al. 2000a). Dies hängt wahrscheinlich mit der Struktur der terminalen Domänen von Plakoglobin zusammen, da ein Konstrukt, das nur die Arm-Domäne von Plakoglobin enthält, sehr wohl eine effektive Bindung des Dreifachkomplexes mit LEF-1 und DNA eingehen kann (ZHURINSKY et al. 2000a). Eine Bindung von Transkriptionsfaktoren (z.B. CBP, TBP) an die terminalen Domänen eines Catenins könnte eine erhöhte 29 2. Stand der Forschung Affinität des LEF-Catenin-Komplexes zur DNA hervorrufen (ZHURINSKY et al. 2000a). Es wird unter anderem vermutet, dass der positive Effekt von Plakoglobin auf TCF-vermittelte Transkription darin begründet liegt, dass ein verstärkter Transport von β-Catenin in den Zellkern stattfindet (ZHURINSKY et al. 2000b). Es wurde beobachtet, dass β-Catenin und Plakoglobin an verschiedenen Stellen von TCF-4 binden (MIRAVET et al. 2002): β-Catenin bindet an die Aminosäurensequenzen 1-51 und Plakoglobin an die Aminosäurensequenzen 51110 (SOLANAS et al. 2004). Die N- und C-Terminalen Domänen sind verantwortlich für die Spezifität von Plakoglobin, indem sie potenzielle Bindungstellen in den armadillo repeats verdecken (SOLANAS et al. 2004). Das führt dazu, dass Bindungspartner aus den Intercalated Discs und den Transkriptionellen Cofaktoren, auch wenn sie jeweils an den entsprechenden Stellen der arm repeats von β-Catenin und Plakoglobin binden könnten, über die unterschiedlichen terminalen Domänen reguliert werden (SOLANAS et al. 2004). 2.2.2.5 Apoptose / Tumorentwicklung In Tumorzellen ist häufig die Menge an Plakoglobin verringert (ABERLE et al. 1995; NAVARRO et al. 1993; SOMMERS et al. 1994). Eine Wiederherstellung der Plakoglobinexpression in hochgradig kanzerogenen Zellen konnte die Tumorgenese verringern (BEN-ZE’EV 1997; SIMCHA et al. 1996). Andererseits kann Plakoglobin auch die Apoptose inhibieren. Es wurden drei verschiedene Plakoglobinmutationen in chemisch induzierten murinen Blasentumoren beschrieben (SHIINA et al. 2001). Weiter konnte in einem Fall eine Plakoglobinmutation in einem Magentumor erkannt werden (CACA et al. 1999) und es wurde eine transformierende Aktivität von Plakoglobin beobachtet, indem es die Effizienz von einer MYC-Induktion erhöhte (KOLLIGS et al. 2000). Eine erhöhte Plakoglobinexpression verursachte zudem eine erhöhte Expression des anti-apoptotischen Proteins BCL-2 in SCC9-Zellen und führte somit zu unkontrolliertem Wachstum (HAKIMELAHI et al. 2000). Während des apoptotischen Zelltodes werden die Desmosomen mit Hilfe von Caspasen und Metalloproteinasen proteolisiert (WEISKE et al. 2001), wobei 30 2. Stand der Forschung Plakoglobin von Caspase-3 gespalten wird (BRANCOLINI et al. 1998; SCHMEISER et al. 1998). Die folgende Tabelle führt zusammenfassend alle bisher identifizierten Proteinpartner von Plakoglobin auf: Tabelle 2.2: Proteinpartner von Plakoglobin (nach ZHURINSKY et al. 2000b) ND = noch nicht ermittelt Proteinpartner Bindungsstelle an Plakoglobin Funktion der Verbindung Quelle Klassische Cadherine Arm repeats Adhäsion KEMLER 1993 Desmocollin Arm repeats Adhäsion Desmoglein Arm repeats Adhäsion Desmoplakin Arm repeats Adhäsion KOWALCZYK et al. 1997 Keratin 5 ND Adhäsion SMITH und FUCHS 1998 Protein-tyrosine phosphatase LAR ND Adhäsion MULLER et al. 1999a α -Catenin N Terminus und der erste arm repeat Adhäsion ABERLE et al. 1996 APC Arm repeats Degradation Axin/conductin Arm repeats Degradation β -TrCP N terminus Degradation Caveolin-1 ND Membran Lokalisation (?) GALBIATI et al. 2000 LEF-1 Arm repeats Transaktivierung BEHRENS et al. 1996; HUBER et al. 1996 TBP C Terminus Transaktivierung HECHT et al. 1999 TCF-4 (an den Aminosäuren 5180) Arm repeats Transaktivierung MIRAVET et al. 2002 31 TROYANOVSKY et al. 1994b TROYANOVSKY et al. 1994a RUBINFELD et al. 1993; SHIBATA et al., 1994 BEHRENS et al. 1998; IKEDA et al. 1998; KODAMA et al. 1999 HART et al. 1999; SADOT et al. 2000; WINSTON et al. 1999 2. Stand der Forschung 2.3 Plakoglobin-Defizienz Eine homozygote Deletion des Plakoglobin-Gens führt bei Mäusen zu einem Versterben der Tiere in der Embryogenese. Charakteristisch bei diesen Tieren sind rupturierte Ventrikel und ein Fehlen von Desmosomen (RUIZ et al. 1996). Häufig reißen die Hauptkammern des Herzens, und das Perikard füllt sich mit Blut, so dass die meisten Tiere am 12.-16. Tag der Embryogenese sterben. Die Plakoglobin-/Tiere waren am 12. Tag der Entwicklung im Wachstum zurückgeblieben, und die Blutzufuhr, vor allem in der Leber und der Plazenta war verringert (RUIZ et al. 1996). Die Gewebeinstabilität hängt mit dem Fehlen von Desmosomen im Herzen zusammen. Die epithelialen Organe (Haut und Darmtrakt) scheinen davon unberührt zu sein. Stattdessen finden sich verbreiterte Adherens Junctions (bis zu 4,5 µm) im Herzen, die desmosomale Proteine, wie z.B. Desmoplakin beinhalten (RUIZ et al. 1996). Überlebten die transgenen Mäuse bis zur Geburt, zeigte sich ein zusätzlicher Hautphänotyp, mit Blasenbildung und einer subcornealen Akantholyse (BIERKAMP et al. 1999). Hierbei ersetzte β-Catenin Plakoglobin in den epithelialen Desmosomen. Dies geschieht jedoch unzureichend in Bezug auf die Struktur und in einer verringerten Anzahl der Desmosomen (BIERKAMP et al., 1999). Der unterschiedliche Effekt von einem Plakoglobinmangel in den kardialen und epithelialen Desmosomen liegt wahrscheinlich in deren unterschiedlicher Zusammensetzung begründet. In den kardialen Desmosomen sind nur einige Proteine der Desmosomen ausgebildet: Desmoglein-2, Desmocollin-2 und Plakophilin-2. In den epithelialen Geweben sind 3 Desmogleine (1-3), 3 Desmocolline (1-3) und Plakophilin-1 ausgebildet (GARROD 1993; KOCH und FRANKE 1994; SCHMIDT et al. 1994; MERTENS et al. 1996). Ähnliche pathologische Veränderungen, auch in einem vergleichbaren Zeitfenster (10,5 – 12. Entwicklungstag), findet man bei Plakophilin-2 defizienten Tieren. Allerdings ist kein Desmoplakin bei dieser Mutation mit den Intercalated Discs assoziiert (GROSSMANN et al. 2004). Bei der Genentfernung des Zytoskelett- 32 2. Stand der Forschung verbindenden Desmoplakin (GALLICANO et al. 1998) oder des desmosomalen Cadherins Desmoglein-2 (ESHKIND et al. 2002) wird die Embryogenese schon früher unterbrochen. In einer In-vitro-Studie zeigte sich eine verringerte passive Compliance bei embryotischen Herzfasern von Plakoglobin-defizienten Mäusen gegenüber Wildtypen. Bei der Untersuchung des passiven Kraft-Dehnungsverhaltens dieser Fasern war die Dehnbarkeit vor allem bei einem geringen Extensionsgrad deutlich verringert. Da die Kontraktilitätsparameter keine Veränderungen aufwiesen, wurde postuliert, dass Plakoglobin nicht notwendig sei, um den myofibrillären Apparat über die Adherens Junctions zu befestigen, aber unabdingbar für die kardiale Compliance (ISAC et al. 1999). Heterozygote Tiere unterschieden sich nicht von den Wildtypen in der Morphologie während der Embryogenese und erreichen das Erwachsenenalter (RUIZ et al. 1996). Trotzdem konnte ein verringerter Plakoglobingehalt in murinen Herzfasern gegenüber Wildtypen festgestellt werden (ISAC et al. 1999). 33 2. Stand der Forschung 2.4 Elektrokardiographie bei der Maus 1929 wurde das erste murine Elektrokardiogramm (EKG) von AGDUHR und STENSTRÖM aufgezeichnet und darüber berichtet, dass keine deutliche T-Welle erkennbar war. Über 20 Jahre später wurde dann das EKG kleiner Säugetiere eingehender beschrieben (LOMBARD 1952; RICHARDS et al. 1953). Hierbei wurde wiederum berichtet, dass keine deutlichen T-Wellen entdeckt wurden, mit Ausnahme vom Meerschweinchen. Allerdings wurde in manchen Fällen eine Einkerbung am Ende des QRS-Komplexes als mutmaßliche T-Welle bezeichnet. Hierbei trat dann kein isoelektrisches ST-Segment auf. Des Weiteren zeigten sich verkürzte P-R und QRS-Intervalle und eine bis zu zehnfach schnellere Herzfrequenz im Vergleich zum Menschen. Diese Erkenntnisse belegten bereits die deutlichen Unterschiede in den Charakteristika der EKGs zwischen Mensch und Maus. Aufgrund des Phänomens, dass kein deutliches ST-Segment vorliegt, definierten GUSSAK et al. (1995) den JPunkt als Repolarisationsbeginn der Ventrikel und das Ende der T-Welle als Repolarisationsende. Der abrupte Übergang vom QRS-Komplex zum ST-Segment stellt den J-Punkt dar. Von einer J-Welle spricht man, wenn der J-Punkt nicht auf der isoelektrischen Linie liegt. Diese Definition wurde anschließend auch bei der Maus angewandt, bei der physiologischerweise kein isoelektrisches ST-Segment vorliegt (GUSSAK et al. 2000). Dieses Charakteristikum liegt darin begründet, dass bei der Maus die Repolarisation bereits beginnt, während in anderen Bereichen des Herzen noch die Depolarisation stattfindet. Erklärbar ist dies durch das Fehlen einer Plateauphase der Aktionspotentiale in erwachsenen Mäusen (LONDON 2001). Die Aktionspotentiale zeigen für eine kurze Zeit nach der Geburt eine Plateauphase, die dann aber mit zunehmenden Alter kürzer wird (GUSSAK et al. 2000). Hierbei resultiert eine altersabhängige Zunahme eines 4-AP-sensitiven Kaliumauswärtsstromes (ITO) in eine sehr schnelle Repolarisation. Bei ITO unterscheidet man ITO,f -Ströme (schnelle Öffnung, schnelle Inaktivierung) und ITO,sStröme (schnelle Öffnung, langsame Inaktivierung). In den Mausventrikelzellen adulter Tiere liegt eine hohe Dichte von ITO vor und diese korreliert direkt mit der verkürzten Plateauphase der Aktionspotentiale und der J-Welle im EKG (GUSSAK et 34 2. Stand der Forschung al. 2000). Interessanterweise ist ITO bei verschiedenen Herzerkrankungen bei Mensch und Hund reduziert (GUSSAK et al. 2000). Für die langsamere Repolarisationsphase und die Rückkehr der Zelle zum Ruhemembranpotential sind zwei weitere Kalium-Auswärtsströme (IK,s und Iss) verantwortlich (GUSSAK et al. 2000). In Abbildung 2.4 sind die verschieden aussehenden EKG-Kurven von Mensch und Maus dargestellt, die aus den beschriebenen elektrophysiologischen Besonderheiten resultieren. Abbildung 2.4: Schematische Darstellung der unterschiedlichen EKG-Kurven bei Mensch und Maus Im oberen Teil der Abbildung ist ein typisches Maus EKG, im unteren Teil das eines Menschen dargestellt. 35 2. Stand der Forschung 2.5 Echokardiographie bei der Maus MANNING et al. beschrieben 1994 den hochfrequenten kardialen Ultraschall bei Mäusen zur Errechnung der linksventrikulären Masse. HOIT et al. (1995) wandte die transthorakale Echokardiographie bei Mäusen an, um Unterschiede in der linksventrikulären Funktion darzustellen. transthorakale Die zwischen Wildtypen und Echokardiographie ist transgenen Mäusen eine invasive nicht Untersuchungsmethode, die eine morphologische und funktionale Charakterisierung des kardialen Phänotyps ermöglicht (TANAKA et al. 1996). Veränderungen des linken Ventrikels wie Kammergröße, Wanddicken, Masse und Funktion konnten durch diese Methode bereits in der Vergangenheit zuverlässig ermittelt werden. Neuere Untersuchungen bestätigen, dass die 2D Echokardiographie die Möglichkeit einer kostengünstigen, akkuraten und nicht invasiven Methode zur Beurteilung der kardiovasculären, strukturellen und funktionellen Veränderungen in den verschiedenen Mausmodellen bietet (COLLINS et al. 2003). 1998 zeigten STEUDEL et al. und SCHERRER-CROSBIE et al. zuerst eine transösophagiale Echokardiographiemethode zur Darstellung von Größe und Funktion des rechten Ventrikels bei Mäusen. Hierbei wurde ein intravasculärer Ultraschallkatheter in den Ösophagus eingeführt und es wurden vier bis sechs Querschnitte des rechten Ventrikels erstellt. In diesen verschiedenen Ebenen wurden sowohl die endo- als auch die epikardialen Wände umfahren und darüber die Fläche der freien rechtsventrikulären Wand und nach der Simpson-Methode auch das gesamte Volumen der rechtsventrikulären Wand sowie das rechtsventrikuläre Volumen an sich errechnet. Mit Hilfe des diastolischen und systolischen Volumens wurde ebenso das Schlagvolumen Anschließend wurde und die rechtsventrikuläre der Durchmesser der Ejektionsfraktion freien Wand ermittelt. unterhalb der Trikuspidalklappe direkt gemessen. Diese echokardiographische Methode erlaubte zum ersten Mal eine zuverlässige Visualisierung und Quantifizierung der rechtsventrikulären Struktur und Funktion bei Mäusen (SCHERRER-CROSBIE et al. 1998). Beim adulten Menschen wurde eine zuverlässige Vermessung des rechten 36 2. Stand der Forschung Ventrikels mit Hilfe der transthorakalen Echokardiographie bereits 1986 von FOALE et al. beschrieben. Hierbei wurden sieben verschiedene Einstellungen gewählt: 1. die parasternale lange Achse, 2. die parasternale lange Achse zur Darstellung der Trikuspidalklappe, 3. die parasternale kurze Achse in verschiedenen Ebenen (um auch eine Darstellung des rechtsventrikulären Ausflusstraktes zu ermöglichen), 4. den apikalen Vierkammerblick, 5. den apikalen Zweikammerblick, 6. die subcostale lange Achse, 7. die subcostale kurze Achse des rechtsventrikulären Ausfluss- und Einflusstraktes. Mit Hilfe dieser Schnitte konnte die Breite des rechtsventrikulären Ausfluss- und Einflusstraktes, sowie die Breite und Länge des rechten Ventrikels bestimmt werden (FOALE et al. 1986). Die Messung des Trikuspidal- und Pulmonalflusses mit Hilfe eines gepulsten Dopplers wurde auch mehrfach in der Humanmedizin beschrieben (DINI et al. 2004; JAUSSI et al. 1989; SHIMIZU et al. 2003). In einer Studie von ZHOU et al. (2003) wurden gepulste Dopplermessungen des Trikuspidalflusses bei neugeborenen und juvenilen Mäusen durchgeführt. 37 2. Stand der Forschung 2.6 Fragestellung Die molekularen Funktionen von Plakoglobin wurden bereits in verschiedenen Arbeiten beschrieben. Ebenso wurde ein Tiermodell von homozygoten Plakoglobindefizienten Mäusen bereits näher charakterisiert. Weitere Mausmodelle arbeiteten mit Tieren, bei denen eine Defizienz im Plakophilin-2-, Desmoplakin- und Desmoglein-2-Gen vorlag, die ebenso für die Zell-Zell-Adhäsion verantwortlich ist. Hier wurden hauptsächlich die homozygoten Tiere, die bereits in der Embryogenese verstarben, ausführlich beschrieben. Systematische Untersuchungen der heterozygoten Tiere zur Elektrophysiologie, Einfluss von Belastungen oder zur Morphologie im Rahmen von echokardiographischen Untersuchungen adulter Mäuse wurden bisher nicht durchgeführt. In der vorliegenden Arbeit wurden die Herzen der transgenen Mäuse in vivo phänotypisiert. Dies ermöglichte auch die Darstellung eines alters- und trainingsabhängigen Verlaufs eventuell auftretender Veränderungen. Die humane, autosomal-rezessive Plakoglobindefizienz-Erkrankung (Naxos Disease) zählt zu den arrhythmogenen rechtsventrikulären Kardiomyopathien (ARVC). Die phänotypische Ausprägung der ARVC findet man in juvenilen sowie adulten Menschen, und sie kann vermutlich durch Ausdauersport verstärkt werden. Hier tritt die letale Phase weitaus später als in den homozygoten Tiermodellen auf. Um die pathophysiologischen Ursachen der ARVC näher zu charakterisieren, sollen bei diesem Mausmodell echokardiographische, elektrokardiographische und elektrophysiologische Untersuchungen in vivo durchgeführt werden. Es sollen folgende Fragen untersucht werden: Hat das heterozygote Vorkommen des Plakoglobin-Gens Auswirkungen auf die Elektrophysiologie und die Morphologie des Herzens? Sind die Folgen einer heterozygoten Plakoglobin-Defizienz vom Alter der Tiere oder dem Trainingszustand abhängig? 38 2. Stand der Forschung Treten unter Medikation mit β-Adreno-Rezeptor-Agonisten vermehrt Arrhythmien oder Funktionsstörungen auf? 39 3. Experimenteller Teil 3. Experimenteller Teil 3.1 Tiere und Tierhaltung Sowohl der Entwurf als auch die Durchführung der Studie erfolgte nach den allgemeinen und lokalen Richtlinien des Tierschutzes (Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (NIH publication No. 85- 23, revised 1996)). 3.1.1 Plakoglobin-defiziente Mäuse Die Plakoglobin+/-Mäuse wurden im Max-Delbrück-Center für Molekularmedizin in Berlin für diese Studie gezüchtet und genotypisiert. Aufgrund dessen soll hier nur kurz auf die Verfahrensweise eingegangen werden. Ein Plakoglobin-Klon wurde aus einer 129/SV Maus Genom Bibliothek (Stratagene, La Jolla, CA, U.S.A.) ausgewählt, und es wurde ein Vektor aus einem 11-kb GenomFragment zusammengestellt. In diesem Vektor (Großteil des Exons 3) wurden die folgenden intrinsischen Sequenzen und die 5`Region des Exons 4 (verschlüsselt die Aminosäuren 70-160) durch eine Neomycin Gen Kassette (Neo) in derselben transkriptionellen Ausrichtung ersetzt. Eine Herpes-Simplex-Virus-Thymidine-KinaseGen-Kassette (HSV-TK) wurde an dem 3´Ende des Konstruktes eingefügt (MANSOUR et al. 1988; s. Abb. 3.1.1). Der linearisierte Vektor wurde mit Hilfe der Elektroporation in E14.1 murine embryonale Stammzellen (ES) transferiert. Die Integration und Rekombination dieser Konstruktion wurde durch Southern Blot verifiziert. Die Zellen wurden in Lysepuffer bei 55°C und mit 0,1 mg/ml Proteinase K verbracht und die genomische DNA wurde ausgefällt. Nach dem Aufschluss mit XhoI und XbaI wurden die Fragmente per Elektrophorese auf 0,8% Agarosegel separiert und auf Hybond-N+-Membranen (Amersham Corp., Arlington Heights, IL) übertragen. Mit 32 P-gekennzeichnete Proben wurden aus genomischen Plakoglobin-Sequenzen hergestellt, die für die Konstruktion des Zielvektors benutzt wurden. Nach Aufschluss mit BspEI und XabI (1.1 kb 3`externer Abschnitt) und mit BstEII und NdeI (1.3 kb interner Abschnitt) wurden Fragmente isoliert und mit Hilfe des multiprime labeling 40 3. Experimenteller Teil system (Amersham) gekennzeichnet. Die Hybridisierung erfolgte bei 65°C über Nacht in einem Hybridisationspuffer, und die Blots wurden für 24 h einem Röntgenfilm exponiert. ES-Zell Klone, die die gewünschte Integration beinhalteten, wurden in eine C57Bl/6-Empfänger-Blastocyste injiziert und diese in scheinschwangere NMRI Weibchen übertragen, um Mäusechimäre zu erzeugen (MANSOUR et al. 1988). Männliche Nachkommen mit deutlichem FellfarbenChimärismus wurden mit C57Bl/6 Weibchen gekreuzt. Um die Genotypen zu identifizieren, wurde isolierte DNA aus den Schwanzspitzen zuerst mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion (PCR) und dann mit Southern Blot analysiert. Für die PCR Genotypisierung wurden die Proben mit 0,1mg/ml Proteinase K aufgeschlossen und die DNA präzipitiert. Es wurden drei verschiedene Primer benutzt. Die Reaktionsprodukte wurden mit einer Ethidium-Bromid-Färbung auf 1,2% Agarosegel sichtbar gemacht. Abbildung 3.1.1: Eine Restriktionsübersichtstafel von dem genomischen Plakoglobin Klon, der für die Vektorkonstruktion genutzt wurde (oben), der Zielvektor für die Genentfernung (Mitte) und der Zielort (unten). Exon3 und 4 sind als graue Rechtecke dargestellt (ex3 und ex4). Die 1,1-kb lange externe Probe, die für die Southern Blot Analyse genutzt wird, ist als schwarzer Balken dargestellt (probe). Pfeile kennzeichnen die Restriktionsstelle für Xbal und Xhol. (RUIZ et al.1996) 41 3. Experimenteller Teil 3.1.2 Tierhaltung Alle Tiere wurden in Makrolonkäfigen Typ II auf staubfreiem Weichholzgranulat gehalten. Zusätzlich wurden die Käfige mit zwei Papiertüchern als Nestmaterial ausgestattet, um den Tieren eine Rückzugsmöglichkeit zu bieten. Tiere, die nur für elektro- oder echokardiographische Untersuchungen oder für das Schwimmtraining verwendet wurden, wurden in Gruppen mit bis zu vier Tieren aufgestallt. Während der Telemetriephase wurden die Tiere einzeln gehalten. Für alle Tiergruppen lag die Raumtemperatur bei 22 +/- 2°C, die relative Luftfeuchtigkeit bei 55 +/- 5% und die Belichtung fand von 07.00 bis 19.00 Uhr MEZ statt. Pelletiertes, autoklaviertes Haltungsfutter für Ratten/Mäuse der Firma Altromin GmbH (Lage, D) (Inhaltsstoffe: Rohprotein 19,0%, Rohfett 4,0%, Rohfaser 6,0%, Rohasche 7,0%, Calcium 0,9% und Phosphor 0,7%; Zusatzstoffe je kg: Vit. A 15.000 IE, Vit. D3 600 IE, Vit. E 75 mg, Kupfer 5 mg) wurde ad libidum gefüttert, zusätzlich wurde Leitungswasser aus Tränkeflaschen ad libidum bereitgestellt. Genehmigung Das Versuchsvorhaben wurde von der Bezirksregierung Münster unter der Nummer G 59/2003 genehmigt. 42 3. Experimenteller Teil 3.2 Elektrophysiologische Untersuchungen 3.2.1 Erstellung des Oberflächenelektrokardiogramms Es wurden ein digitales 6 Kanal EKG (EMKA Technologies ECG Auto user manual) und ein manuelles 6 Kanal EKG (Siemens Megacart, 1993 Siemens Erlangen) für mindestens zehn Sekunden erstellt (KORTE et al. 2002). Es wurden die bipolaren Standardableitungen I, II und III nach Einthoven, sowie die unipolaren Standardableitungen aVR, aVL, aVF nach Goldberger abgeleitet. Manuell wurden zusätzlich Brustwandableitungen geschrieben. Das manuelle EKG wurde bei einer Laufgeschwindigkeit von 20 mm/s und Amplitudenhöhe von 10 mm/mV auf handelsüblichem EKG-Papier ausgedruckt. Es wurde ein Tremorfilter 35Hz und ein Schwächungsfilter 100Hz verwendet. Vor jeder Aufzeichnung wurden die Mäuse mit dem jeweils entsprechenden Narkotikum für die darauf folgende Untersuchung narkotisiert bzw. sediert. Bei einer anstehenden echokardiographischen Untersuchung wurden die Tiere mit Diazepam (17,5 mg pro kg Körpergewicht) sediert, vor der Langendorff-Untersuchung mit Urethan (2 g pro kg Körpergewicht) und vor einer Transmitter-OP mit einem XylazinKetamin-Gemisch (50 mg Ketamin pro kg Körpergewicht und 10 mg Xylazin pro kg Körpergewicht) narkotisiert, jeweils über eine intraperitoneale Verabreichung. Im späteren Verlauf wurde die Transmitter-OP mit einer Isofluran-Inhalationsnarkose (2% Isofluran, 98% Sauerstoff) durchgeführt und unter dieser Medikation ein Oberflächen-EKG aufgezeichnet. Um die Qualität der Signalübertragung der Brustwandableitungen zu verbessern, wurde den Mäusen die Brust rasiert. Zur Aufzeichnung der Oberflächen-EKGs wurden die Mäuse zunächst in Rückenlage auf eine Wärmeplatte (40°C) gelegt. Die Gliedmaßen der Mäuse wurden mit Elektrodengel benetzt und Schlaufenelektroden aus weichem, geflochtenem, nichtoxidierbarem Stahldraht wurden sanft darüber gezogen. Die EKG-Schlaufenelektroden waren mit einem herkömmlichen EKG-Schreiber (Siemens Megacart, 1993 Siemens Erlangen) für die manuelle Aufzeichnung und gleichzeitig mit einem ITF 16 EKG Verstärker (EMKA Technologies, Paris, F) 43 3. Experimenteller Teil verbunden, so dass zusätzlich ein digitales EKG mit IOX-Software auf dem Computer aufgezeichnet werden konnte. 3.2.2 Erstellung des telemetrischen Elektrokardiogramms Die drahtlose Radiotelemetrie, die Messwerte mit Hilfe von Funkwellen überträgt, wurde zur telemetrischen Datenerfassung genutzt. 3.2.2.1 Aufbau der Anlage Abbildung 3.2.2.1: Schematische Darstellung des Aufbaus der Telemetrieanlage Radiotelemetrie, die zur Erfassung von Daten lebender Tiere dient, wird als Biotelemetrie bezeichnet (KRAMER et al. 2000). In dieser Arbeit wurden mit Hilfe der Biotelemetrie Elektrokardiogramme von Mäusen aufgezeichnet, die sich frei bewegen konnten. 44 3. Experimenteller Teil Die vom schlagenden Mausherzen erzeugten elektrischen Potentialänderungen wurden von einem in dem Mauskörper implantierten Transmitter registriert und die empfangenen Signale mit Hilfe von elektrischen Schaltsystemen innerhalb des Transmitters verstärkt und gefiltert. Die Signale wurden in Radiofrequenzsignale konvertiert und über weitere Schaltkreise und Antennen des Transmitters an einen Receiver (Empfänger) gesandt. Dieser Receiver deckte den gesamten Aktivitätsrahmen der Maus (z.B. beim Airjet) ab und hatte die Form einer Platte, die sich unter dem Käfig der Maus befand. Die vom Transmitter verstärkten Signale wurden als Radiofrequenzsignale von dem Receiver empfangen, und über ein Kabel an eine so genannte „Input-Matrix“ weitergeleitet. Die Input-Matrix digitalisiert und filtert die Signale. Über ein weiteres Kabel werden die Daten auf einen PC übertragen, der mit Hilfe des Computerprogramms der Firma „Data Science“ die Daten registriert und die Funktion der einzelnen Receiver überwacht. Über eine „Output-Matrix“ wurden die Informationen erneut analogisiert und anschließend an einen weiteren Computer, der die Daten mit Hilfe eines in der Arbeitsgruppe vorhandenen Programmes für die Auswertung von Maussignalen aufzeichnet, weitergeben. Dieses Programm basiert auf einer bereits veröffentlichten Software zur Analyse von monophasischen Aktionspotentialen (FRANZ et al. 1995). Mit einer Sampling rate von 1000 Hz wurden hier die Elektrokardiogramme aufgezeichnet und zur Offline-Analyse auf CD gespeichert. Es wurde ein kommerziell erhältlicher implantierbarer EKG-Transmitter bestehend aus einem versiegelten, biokompatiblen Plastikgehäuse verwand. Der Transmitter hatte ein Volumen von 1,9 ml und wiegt 4 g. Er enthält die Batterie, die für das hauptsächliche Volumen verantwortlich ist, einen Signalverstärker und Radiofrequenzelektronik. Der Transmitter entlässt am vorderen Ende zwei flexible, ca. 7 cm lange, rostfreie, flexible Stahldrähte, die mit farbigem Silikon zur Isolierung überzogen (rot (-) und weiß (+)) sind. Mit einem Magnet läßt sich der Transmitter aktivieren und deaktivieren. Mit einem handelsüblichen Radio kann der Aktivitätsstatus durch Empfang der Amplituden-modulierten Signale überprüft werden. Ist der Transmitter korrekt implantiert, ist für jeden Herzton ein „Piep“-Ton hörbar. 45 3. Experimenteller Teil Die Lokalisation der Drahtenden des Transmitters innerhalb des Mauskörpers (rechter Arm, linker Rippenbogen) ließen die Ableitung der Standardableitung II nach Einthoven zu. 46 3. Experimenteller Teil 3.2.2.2 Implantation des Transmitters Die Anästhesie erfolgte mit 50 mg Ketamin pro kg Körpergewicht und 10 mg Xylazin pro kg Körpergewicht, Inhalationsnarkose (2% intraperitoneal Isofluran, 98% injiziert, oder Sauerstoff). mit Zur einer Isofluran- Überprüfung der Narkosetiefe wurde der Zwischenzehen-Reflex genutzt. Nach dessen Ausfall wurde die Haut im Bereich des Bauches, großzügig rasiert, und anschließend mit einer medizinischen Enthaarungscreme vollständig von Haaren befreit. Die Maus wurde auf einer steril abgedeckten Wärmeplatte, die über die Rektaltemperatur geregelt wird, sanft fixiert. Ein handelsübliches Desinfektionsspray wurde zur Keimreduktion im Operationsfeld genutzt. Die Haut wurde mit einem 2 cm langen medianen Bauchschnitt durchtrennt. Anschließend wurde subkutan die Unterhaut von der Muskulatur abgehoben, so dass zwei Kanäle für die Transmitterkabel entstanden. Ein Kanal soll dabei bis zur rechten Achselhöhle führen, der andere bis kurz über den letzten linken Rippenbogen. Dann erfolgte eine 2 cm lange Inzision der darunterliegenden Bauchmuskulatur entlang der Linea alba, um die Bauchhöhle zu eröffnen. Der Transmitter wurde nun vollständig in die Bauchhöhle und vorsichtig auf das Darmkonvolut geschoben. Die Drähte zeigten dabei in kaudaler Richtung, die in den Transmitter eingelassenen "Fixierschlaufen" in Richtung des Betrachters. Ein Verrutschen des Transmitters in der Bauchhöhle wurde durch Fixierung der drei Schlaufen an der Bauchmuskelnaht verhindert. Im Bereich des kaudalen Wundwinkels wurde die Bauchmuskulatur auf der rechten Seite ca. 2 mm unterhalb des Wundrandes mit einem dünnen Trokar (1,2 mm x 40 mm) von außen nach innen durchstochen. Der rote Draht (negative Elektrode) wurde erst in eine Schleife gelegt, dann eingefädelt und nach außen gezogen. Mit dem weißen Draht (positive Elektrode) verfuhr man ebenso an der anderen Bauchwandseite. Nun wurde die restliche Bauchmuskulatur mit Einzelheften aus nicht resorbierbarem Nahtmaterial vollständig verschlossen. Anschließend wurden die Kabelenden mit Silikonhütchen versehen, um spätere Irritationen zu vermeiden und mit Hilfe einer Pinzette in die vorbereiteten subkutanen Kanäle eingelegt. Das rosafarbene Kabel sollte nun in der rechten Achselhöhle der Maus enden und an der rechten Flanke per Knopfheft an der Bauchmuskulatur festgenäht 47 3. Experimenteller Teil werden. Das weiße Kabel liegt an der linken Mausseite und die nicht isolierte Stelle soll so an den Muskel genäht werden, dass sie vollständig vom Muskel umgeben ist. Zu diesem Zeitpunkt konnte die Herzfrequenz mit Hilfe eines Radios bereits überprüft werden. Nun wurden die Hautwunden mit fortlaufenden Kürschnernähten aus resorbierbarem Nahtmaterial verschlossen. Die Hautnaht wurde zum Infektionsschutz mit einem handelsüblichen Sprühpflaster versehen. Die Gesamtzeit der Operation (Einleitung der Narkose bis Hautverschluss) betrug etwa 35 Minuten. Nach der Operation wurde die Maus in ihren Käfig gelegt. Zur Regulation des Flüssigkeitshaushaltes, sowie um einer Obstipation vorzubeugen, erhielten die Tiere innerhalb von 15 Minuten direkt im Anschluss 2 ml Stereofundin® subkutan in zwei bis vier Dosen. Zur Vermeidung eines Auskühlens in der postoperativen Aufwach- und Erholungsphase wurden die Mäuse noch 24h unter Rotlicht gehalten. Ein Analgetikum (Ibuprofen 7 mg/kg, GABRISCH u. ZWART (Hrsg.) 1998) wurde über vier bis fünf Tage über das Trinkwasser und über eingeweichte Futterpellets verabreicht. Im Bedarfsfall wurde über drei Tage zusätzlich ein Antibiotikum (Enrofloxacin 5 mg/kg, GABRISCH u. ZWART (Hrsg.) 1998) täglich subkutan injiziert. Abbildung 3.2.2.2: Postoperatives Röntgenbild nach Transmitterimplantation In der post-operativen Phase wurden die Tiere regelmäßig klinisch und über den implantierten Transmitter überwacht. Während dieser Zeit wurde täglich das Gewicht kontrolliert und es erfolgte eine kontinuierliche EKG-Überwachung. Nach einer 48 3. Experimenteller Teil ausreichenden Wundheilungsperiode, typischerweise 12-14 Tage nach dem Eingriff, begannen frühestens die Belastungstests. 3.2.2.3 Vor Erstellung des Ruhe-EKGs der jeweiligen Belastung und einer mindestens 2-stündigen Eingewöhnungsphase werden 15 Minuten aufgezeichnet, wobei jegliche Aufregung für das Tier vermieden werden soll. 3.2.2.4 Erstellung des Belastungs-EKGs Schwimmen Die Tiere wurden zum 6-minütigem Schwimmen in warmes Wasser (36°C) gesetzt. Ein Makrolonkäfig Typ II (20*35*13,5 cm) wurde als „Schwimmbecken“ genutzt. Die Belastung wurde bei bis zu vier Mäusen gleichzeitig unter ständiger Kontrolle durchgeführt. Das Schwimmen fand einzeln statt und mit genügend Abstand zwischen den Tieren, so dass jeder Maus ein Receiver zugeordnet werden konnte. Nach Ablauf der sechs Minuten wurde die Schwimmaufzeichnung gestoppt, gleichzeitig die Maus in ihren Käfig gesetzt, der Käfig auf einer Transponderplatte platziert und das EKG anschließend noch eine Stunde (Erholungs- /Reperfusionsphase) aufgezeichnet. Um die Trocknungsphase der Maus zu beschleunigen, wurde während der ersten halbe Stunde ein Teil des Käfigs mit Rotlicht ausgeleuchtet. Dies verringerte die Fellpflegeaktivität und sicherte somit eine bessere Qualität des EKGs. Airjetstreß Bei diesem Belastungs-EKG wurden die Tiere über 15 Minuten einem kontrolliertem „mentalen Stress“ (KNOLLMANN et al. 2003) unterzogen. Dabei saßen bis zu vier Tiere einzeln in luftdurchlässigen Gitterkäfigen (20*37*16 cm). Jeder dieser Käfige wurde auf einem Receiver platziert. Anschließend wurde mit Hilfe eines herkömmlichen Föns jede Maus für jeweils 15 Sekunden pro Minute über 15 Minuten einem mäßigen Luftstrom bei Raumtemperatur ausgesetzt. 49 3. Experimenteller Teil Nach Ablauf der 15 Minuten wurde die Maus in ihren Käfig gesetzt, der Käfig auf einer Transponderplatte platziert und das EKG anschließend noch eine Stunde (Erholungs- /Reperfusionsphase) aufgezeichnet. 3.2.3 Auswertung der Elektrokardiogramme Die Auswertung der Daten erfolgte bezüglich des Genotyps (Wildtyp, transgenes Tier) geblindet. Die Oberflächen-EKGs wurden digital und zum Teil manuell ausgewertet. Zur digitalen Auswertung wurde die Software „ECG Auto 1.5.7.36“ (EMKA Technologies, Paris, F) verwand. Hierbei wurden automatisch bis zu 20 einzelne Herzschläge übereinander gelegt und somit ein durchschnittlicher Komplex erstellt. Bei drei von diesen „average beats“ wurden folgende Punkte bestimmt: Anfang/ Höhepunkt/ Ende der P-Welle, Q, R, S, Anfang/ Ende der T-Welle und die Nulllinie. Aus diesen Daten errechnete das Programm den PR-Abstand (ms), P-Wellendauer (ms), QRS-Dauer (ms), QT-Dauer (ms), S bis Anfang T-Welle (ms), T-Wellendauer (ms), RR-Abstand (ms), P-Wellen-Amplitude (mV), Q-Amplitude (mV), R-Amplitude (mV), S-Amplitude (mV), T-Wellen-Amplitude (mV), relative/ absolute Fläche unter der P-Welle (mV*ms), relative/ absolute Fläche unter dem QRS-Komplex (mV*ms), relative/ absolute Fläche unter der T-Welle (mV*ms) und die Herzfrequenz (Schläge/min). Dies erfolgte für jede der Standardableitungen (I, II, III, aVR, aVL, aVF). Aus den drei Einzelwerten wurde der Mittelwert und die Standardabweichung für jeden Parameter ermittelt. Zur Überprüfung wurden von einigen Mäusen zusätzlich Papier-EKGs manuell ausgewertet. Dabei wurde der Herzrhythmus, die Amplitude und die Dauer der PWelle, die Amplitude des QRS-Komplexes, die Dauer des PQ sowie des RRIntervalls bestimmt. Aus zehn gemessenen Einzelwerten wurde der Mittelwert und die Herzfrequenz errechnet. Hierbei wurden ebenso alle Standardableitungen analysiert. Aufgrund der Lage der Drahtenden der jeweiligen Transmitter stand in der Telemetrie nur die Standardableitung II nach Einthoven zur Verfügung. 50 3. Experimenteller Teil Abbildung 3.2.3: Schematische Darstellung eines einkanaligen Maus-Elektrokardiogramms Quelle: HAGENDORFF et al. 1999 Die Analyse der telemetrischen Daten erfolgte mit einem halb-automatischen Analyseprogramm für die offline-Analyse von Maus-EKG-Signalen mit Hilfe eines in der Arbeitsgruppe Kirchhof / Fabritz in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Franz, Dept. of Pharmacology, Georgetown University, Washington DC, U.S.A. erstellten Labview-basierten-Programmes. Mit diesen Protokollen konnten Herzfrequenz, Herzfrequenzvariabilität, spontane Arrhythmien und die chronotrope Reaktion auf Belastung untersucht werden, indem die EKGs vollständig visuell kontrolliert wurden. Das Unterprogramm LabView-Atrial analyzer bestimmte die Länge der R-R-Intervalle und errechnete die Herzfrequenz automatisch. In Kooperation mit der Firma signetix wurde ein Programm zur Auswertung der Frequenzen entwickelt. Hierbei wurden eventuelle durch Rauschen oder Muskelartefakte bedingte „Ausreißer“ erkannt und eliminiert und aus den verbliebenen Werten ein Mittelwert, die Standardabweichung, sowie die Quantile berechnet und das maximale und minimale Intervall für jede Maus bestimmt. Diese Analyse erfolgte für die Aufzeichnungen der Ruhe-EKGs, der Belastungs-EKGs, als auch in der Erholungsphase. 51 3. Experimenteller Teil 3.2.4 Telemetrisches EKG mit sympathomimetisch wirksamen Pumpen Um die dauerhafte Wirkung von Sympathomimetika bei Plakoglobin-defizienten Tieren näher zu untersuchen, wurde bei zehn Tieren nach Abschluss der Belastungsversuche jeweils eine mikro-osmotische Pumpe (Alzet®, Model 1007D) unter Isoflurannarkose im Rückenbereich subkutan implantiert. Bei sechs Tieren wurde eine Dosierung von 3 mg/kg/d Isoprenalin und bei den anderen vier Tieren eine Dosierung von 30 mg/kg/d Isoprenalin, sowie 30 mg/kg/d Phenylephrin gewählt. Die osmotischen Pumpen geben bei einer Temperatur von 37°C kontinuierlich 0,5 µl/h (± 0,1 µl/h) der Lösung über eine Dauer von sieben Tagen ab. Über die gesamte Zeitspanne wurden telemetrische Aufzeichnungen angefertigt. 3.2.4.1 Implantation der Pumpen Die Tiere wurden kurz vor der Implantation gewogen und dementsprechend wurden die Pumpen mit einer gewichtsabhängigen Isoprenalindosis in Ascorbinsäurelösung beschickt. Die Pumpen wurden dann für eine Stunde in angewärmter physiologischer Kochsalzlösung gelegt, um die osmotische Pumpe zu aktivieren. Die Maus wurde unter Isoflurannarkose anästhesiert. In der Einschlafphase hat das Isofluran einen 4%igen Anteil der Beatmungsluft und wurde nach dem Ausfall des Zwischenzehenreflexes auf 2% Isofluran mit einem 98%igem Sauerstoffanteil reduziert. Die Maus wurde auf eine Metallwärmeplatte gelegt, und die Körpertemperatur wurde über einen rektalen Temperaturmessfühler erfasst. Über die gemessene Körpertemperatur reguliert ein Temperatur-Kontroll-Modul die Temperatur der Wärmeplatte. Anschließend wurde der Lendenbereich von dem Haarkleid befreit und ein 1 cm langer Schnitt quer zur Wirbelsäule gesetzt. Die Haut wurde von der Unterhaut in einem 2 cm langen Kanal abgelöst und die Pumpe, mit der Öffnung möglichst weit von der Inzision entfernt, eingeführt. Die Haut wurde mit einigen Knopfheften mit resorbierbarem Nahtmaterial verschlossen. 52 3. Experimenteller Teil 3.3 Transthorakale Echokardiographie 3.3.1 Durchführung Für die Ultraschalluntersuchung wurde die Maus zunächst sediert (17,5 mg Diazepam (Valium®) pro kg Körpergewicht, intraperitoneal). Anschließend wurden der Brustkorb- sowie der kraniale Bauchbereich großzügig mit einer medizinischen Enthaarungscreme vom Haarkleid befreit. Die sedierte Maus wurde in Rückenlage mit Hilfe von Leukosilk® an den Gliedmaßen auf einer Metallwärmeplatte sanft fixiert. Über einen rektal eingeführten Temperaturmessfühler wurde die Temperatur der Metallplatte automatisch, in Abhängigkeit von der Körpertemperatur der Maus, gegenreguliert. Mit Elektrodencreme benetzte EKG-Elektrodenplättchen wurden unter die beiden Vorderpfoten und die linke Hinterpfote geschoben und in die Fixation integriert. So konnte simultan mit der echokardiographischen Untersuchung ein Ein-Kanal-EKG aufgezeichnet werden. Das Ultraschallgerät HP Sonos 5500 (Firma Philips, Hamburg, Germany) bestimmt laufend die Herzfrequenz der Maus. Im seltenen Fall von tiefen Bradykardien (HF <200/min) wurde die Untersuchung abgebrochen und tachykardisierende Maßnahmen (externe Erwärmung, Körpermassage, Isoprenalingabe) eingeleitet. Der Brustkorb wurde nun mit zentrifugiertem und angewärmtem Ultraschallgel (frei von Lufteinschlüssen) ca. zwei Zentimeter dick bedeckt. Es wurden bekannte Standardeinstellungen mit geringfügigen Modifikationen zur Rechtsherzdarstellung aus der Echokardiographie des Menschen gewählt. Zunächst wurde mit einem 15 MHz Linearschallkopf ein Vierkammerblick dargestellt, indem der Schallkopf vom kaudalen Sternum zur linken Achselhöhle weisend, sanft in das Gelkissen eintaucht, ohne Druck auszuüben. In der bildlichen Darstellung lagen nun die beiden Vorhöfe seitenverkehrt in dem unteren Bildausschnitt. Die Hauptkammern schlossen sich den Vorhöfen im oberen Bildausschnitt an (s. Abb. 3.3.1.1). 53 3. Experimenteller Teil Abbildung 3.3.1.1: Schematische Darstellung einer echokardiographischen Vierkammeransicht des Herzens (modifiziert nach KÖHLER u. TATARU 2001) LA: LV: RA: RV: Linkes Atrium Linker Ventrikel Rechtes Atrium Rechter Ventrikel Danach wurde die Wärmeplatte in einem Winkel von 15° gekippt, so dass die Maus in linker Seitenlage zu Liegen kam. Nun wurde die parasternale lange Achsenansicht dargestellt, indem der Schallkopf zwischen dem linken Rippenbogen und der rechten Schulter liegt. Hierbei sollen die Aortenklappe, die Mitralklappe und der linke Ventrikel in einer Achse liegen. Bei geschlossener Aortenklappe erschien diese als Mittelecho innerhalb der Aorta. Der linke Ventrikel schloss sich im Bild waagerecht nach links weisend an. Weiterhin sichtbar waren das linke Atrium und der rechte Ventrikel. (s. Abb. 3.3.1.2). Abbildung 3.3.1.2: Schematische Darstellung einer echokardiographischen Längsachsenansicht des Herzens (modifiziert nach KÖHLER u. TATARU 2001) IVS: LA: LV: LVOT: LVW: RV: Interventrikuläres Septum Linkes Atrium Linker Ventrikel Linksventrikulärer Ausflusstrakt Hinterwand des linken Ventrikels Rechter Venrikel 54 3. Experimenteller Teil Durch Kippen des Schallkopfes um ca. 40° zur Leber hinweisend, Trikuspidalklappe bzw. den und kann die man die Pulmonalklappe, rechtsventrikulären Ausflusstrakt, (RVOT) visualisieren. (s. Abb. 3.3.1.3). Abbildung 3.3.1.3: Schematische Darstellung einer echokardiographischen Ansicht der Trikuspidal- und Pulmonalklappe des Herzens (modifiziert nach KÖHLER u. TATARU 2001) Ao: IVS: LA: LV: RA: RV: RVOT: Aorta Interventrikuläres Septum Linkes Atrium Linker Ventrikel Rechtes Atrium Rechter Venrikel Rechtsventrikulärer Ausflusstrakt In der parasternalen Querachsenansicht (Drehung des Schallkopfes um 90° im Uhrzeigersinn, ausgehend von der parasternalen Längsachsenansicht) wurde die Standardeinstellung durch die Papillarmuskelebene repräsentiert. Der rechte Ventrikel lag dem linken Ventrikel dabei im linken oberen Bildauschnitt an (s. Abb. 3.3.1.4). Abbildung 3.3.1.4: Schematische Darstellung einer echokardiographischen Querachsenansicht des Herzens (modifiziert nach KÖHLER u. TATARU 2001) IVS: LV: LVW: RV: Interventrikuläres Septum Linker Ventrikel Hinterwand des linken Ventrikels Rechter Venrikel 55 3. Experimenteller Teil Nähert man sich nun der Basis des Herzens von der parasternalen Querachsenansicht ausgehend, so wird die kurze Achse auf Höhe der Aortenklappe dargestellt (s. Abb. 3.3.1.5). Abbildung 3.3.1.5: Schematische Darstellung einer echokardiographischen Ansicht der kurzen Achse auf Höhe der Aortenklappe (modifiziert nach KÖHLER u. TATARU 2001) Ao: LA: RA: RV: Aorta Linkes Atrium Rechtes Atrium Rechter Venrikel Kippt man dann den Schallkopf erneut um ca. 30° zur linken Schulter hinweisend wird der rechtsventrikuläre Ausflusstrakt deutlich sichtbar (s. Abb. 3.3.1.6). Abbildung 3.3.1.6: Schematische Darstellung einer echokardiographischen Ansicht eines rechtsventrikulären Ausflusstraktes (von der parasternalen kurzen Achse ausgehend) des Herzens (modifiziert nach KÖHLER u. TATARU 2001) Ao: LA: RVOT: Aorta Linker Vorhof Rechtsventrikulärer Ausflusstrakt 56 3. Experimenteller Teil In Einzelfällen wurde ein Ultraschall-Kontrastmittel (Sonovue®) i.v. verabreicht, um die Darstellung des rechten Ventrikels zu verbessern. Time Motion-Modes (M-Mode) wurden in der parasternalen Längsachsenansicht dicht unterhalb der Mitralklappe mit Darstellung der rechten Ventrikelwand und des rechten Ventrikels, des interventrikulären Septums, des linken Ventrikels und der linken Ventrikelwand angefertigt. Bei den angefertigten M-Modes im Querschnitt wurde der Schallstrahl zwischen die Papillarmuskeln gelegt, um eine nahezu identische Einstellung der Strukturen zu bekommen. Zur Dopplerechokardiographie wurde ein 12 MHz Sektorschallkopf verwendet. Zur Linearisierung der Ultraschallsignale wurde eine ca. 1 cm lange Vorlaufstrecke (ein mit zentrifugiertem Ultraschallgel gefüllter Zeigefinger eines handelsüblichen puderfreien Latexhandschuhs) vorgeschaltet. Mittels CW-Doppler (continious wave) konnte der Blutstrom im Bereich der Aorten- und der Mitralklappe dargestellt werden. Hierbei werden kontinuierlich Ultraschallwellen ausgesandt und empfangen, wobei auch sehr schnelle Geschwindigkeiten registriert werden und die typischen Dopplerfrequenzspektren entstehen können. Aufgrund der Frequenzspektren kann der gedoppelte Gefäßbereich definiert und die Flussgeschwindigkeiten gemessen werden (POULSEN NAUTRUP und TOBIAS (Hrsg) 2001). Der Schallkopf wurde dabei so ausgerichtet, dass im 2-D-Bild eine Längsachsenansicht des Herzens dargestellt wird. Der Strahl wurde für die Aortendopplermessungen durch die Aorta und für die Mitraldopplermessungen (durch Neigen des Schallkopfes) durch die Mitralklappe gelegt. Hierbei entstanden Bilder, die denen des Menschen oder des Hundes ähneln. Zur Darstellung des Trikuspidalflusses wurde der Schallkopf so gestellt, dass der Strahl in seiner Verlängerung auf die rechte Schulter der Maus treffen würde (Annäherung an den apikalen 4-Kammerblick). Aufgrund der Häufung von kardialen Ereignissen unter Belastung wurde die Untersuchung in verkürzter Form (M-Mode-Bilder des Querschnittes und DopplerBilder) nach intraperitonealer Gabe eines Sympathomimetikums (2 µg/g Isoprenalin) wiederholt. 57 3. Experimenteller Teil Die Bilddaten wurden digital auf Magneto-Optical Disc zur offline Analyse gespeichert, hiermit wurde die Untersuchungszeit auf 25 bis 30 Minuten minimiert. Nach der Untersuchung wurde die Fixation der Maus vorsichtig gelöst. Das Ultraschallgel wurde sorgfältig von der Maus entfernt und unter Beobachtung leuchtete eine Rotlichtquelle den Käfig über zwei Stunden aus. 3.3.2 Auswertung Alle Messungen erfolgten offline durch einen bezüglich des Genotyps (transgennicht transgen) geblindeten Untersucher. Bei nicht optimal messbaren Variablen oder wenn die Anschallungsebene nicht den Standardschnitten entsprach, wurden diese nicht in der Auswertung berücksichtigt. Das Echokardiographiegerät besaß ein integriertes Messsystem, mit dem alle Messungen der verschiedenen Parameter erfasst wurden. Die „Leading-EdgeMethode“ (jeweils von der Vorderkante der betroffenen Echolinie messen) wurde bei quantitativen Distanzmessungen nach den Leitlinien der „Amerikanischen Gesellschaft für Echokardiographie“ angewendet. Es wurden zehn Parameter zur Rechtsherzbestimmung in den zweidimensionalen Standardeinstellungen gemessen (nach FOALE et al. 1986; s. Abb. 3.3.2). 58 3. Experimenteller Teil Abbildung 3.3.2: Gemessene Rechtherzparameter modifiziert nach FOALE (1986) TV: präsystolischer Durchmesser der Trikuspidalklappe, RVDd: diastolischer rechtsventrikulärer Diameter in der Längsachsenansicht RVLAX: Länge des rechten Ventrikels in der Diastole, RVSAX: Breite des rechten Ventrikels in der Diastole, RVIT3: Durchmesser des Einflusstraktes des rechten Ventrikels in der Diastole, RVOT1/ RVOT4: präsystolischer Durchmesser des rechtsventrikulären Ausflusstraktes bei gleichzeitiger Darstellung der Trikuspidalklappe/ vom Querschnitt ausgehend, RVd Vierkammer/ RVd lav/ RVd sav: diastolische Fläche des rechten Ventrikels gemessen im Vierkammerblick/ Längsachsenansicht/ Querachsenansicht 59 3. Experimenteller Teil Im apikalen Vierkammerblick wurde in der Diastole die rechtsventrikuläre Fläche (RVd Vierkammer) bestimmt. Zusätzlich wurde die rechtsventrikuläre Länge (RVLAX) von dem Mittelpunkt des Anulus fibrosus dexter bis zum rechtsventrikulären Apex und der rechtsventrikuläre Einflusstrakt (RVIT3) im ersten Drittel des rechten Ventrikels hinter dem Trikuspidalklappenring gemessen. Die maximale Ausdehnung im mittleren Drittel des rechten Ventrikels, der als Körper definiert wird, wird parallel zum Einflusstrakt als RVSAX gemessen. In der diastolischen Längsachsenansicht wurde die rechtsventrikuläre Fläche (RVd lav) und der rechtsventrikuläre Diameter (RVDd) gemessen. Letztere Messung wurde senkrecht zur Aortenwurzel von der rechtsventrikulären freien Wand zur vorderen Begrenzung der vorderen Aortenwand vorgenommen. In der gekippten Längsachsenansicht bei gleichzeitiger Darstellung der Trikuspidal- und Pulmonalklappe, wird präsystolisch die Trikuspidalklappe (TV) und der rechtsventrikuläre Ausflusstrakt (RVOT1) vermessen. In der parasternalen Kurzachsenansicht wird diastolisch die rechtsventrikuläre Fläche (RVd sav) bestimmt. In der (von der Querachsenansicht ausgehenden) rechtsventrikulären Ausflusstrakteinstellung wird präsystolisch kurz vor dem Pulmonalklappenring der rechtsventrikuläre Ausflusstrakt (RVOT4) gemessen. Des Weiteren wurden neun Parameter zur Linksherzbestimmung in den zweidimensionalen Standardeinstellungen vermessen. In der präsystolischen Längsachenansicht wurde der linksatriale Durchmesser (LA), der linksventrikuläre Ausflusstrakt (LVOT) und der Aortenwurzeldurchmesser (AoV) gemessen. Für jeden Parameter in den zweidimensionalen Einstellungen wurden drei Messungen vorgenommen und der jeweilige Mittelwert errechnet. Für die weitere Linksherzvermessung wurden im M-Mode die Wanddicken des Septums (IVSd / IVSs) und der linksventrikulären Kammerwand (LVWd / LVWs) sowie der linksventrikuläre Ventrikeldurchmesser (LVEDd / LVEDs) in der Diastole und in der Systole gemessen. 60 3. Experimenteller Teil Für jeden Parameter wurden zwei Messungen im M-Mode des Längsschnittes und drei Messungen im M-Mode des Querschnittes verwendet. Aus diesen fünf Einzelwerten wurde dann der Mittelwert für jeden Parameter bestimmt. Im CW-Doppler wurden weitere sieben Linksherz- und zwei Rechtsherz-Parameter gemessen. Im Aortendoppler wurde Folgendes bestimmt: • die maximale Flussgeschwindigkeit (AoVmax) als Punkt des frühsystolischen Geschwindigkeitsmaximums, • die Kontur des Aortenflusses, - als Geschwindigkeits-Zeit-Integral (VTI: velocity time integral), - und zur weiteren automatischen Errechnung des maximalen und durchschnittlichen Aortenflussdruckes (Ao max PG / Ao MPG), • und der Abstand zwischen zwei Aortenausschlägen (Ao R-R). Im Mitraldoppler wurde in der frühen Diastole die maximale Flussgeschwindigkeit (MV Vmax oder MV E Punkt) direkt nach der Mitralklappenöffnung gemessen. Von diesem Zeitpunkt der höchsten Flussgeschwindigkeit bis zum Ende des ersten Einstromes wurde die Dezelerationszeit (MV Decel-Zeit) in ms bestimmt. Am Ende der Diastole wurde der Punkt der höchsten Flussgeschwindigkeit zum Zeitpunkt der Vorhofkontraktion (MV A Punkt), der zweite Einstrom, ermittelt. Zusätzlich wurde die Kontur des Mitralflusses zur automatischen Errechnung des maximalen und durchschnittlichen Mitralflussdruckes (MV max PG / MV MPG) bestimmt. Im Trikuspidaldoppler wurde ebenso der Punkt der höchsten Flussgeschwindigkeit (TV max) gemessen. Im Gegensatz zum Mitraldoppler lag dieser meistens zum Zeitpunkt der Vorhofkontraktion (also bei dem zweiten Einstrom) vor. Weiter wurde, ebenso wie bereits beim Aorten- und Mitraldoppler, die Kontur des Flusses umfahren, um den maximalen und durchschnittlichen Trikuspidalflussdruck (TV max PG / TV MPG) automatisch zu errechnen. Für jeden Parameter wurden jeweils drei Einzelwerte bestimmt und aus diesen der Mittelwert errechnet. 61 3. Experimenteller Teil Aus den gemessenen Werten wurden folgende Parameter rechnerisch ermittelt: Tabelle 3.3.2: Errechnete Werte aus echokardiographischen Daten Parameter Abk. Formel Einheit Herzfrequenz HF 1000/AoRR* 60 Schläge/ min Linksventrikuläre Verkürzungsfraktion FS ((LVEDdLVEDs)/LVEDd)* 100 % Herzzeitvolumen HZV Schlagvolumen*Herzfrequenz ml/min Schlagvolumen (Aorta) SV (Ao) (AoV/2)2 * π * VTI/ 100 ml Schlagvolumen (LVOT) SV (LVOT) (LVOT/2)2 * π * VTI/ 100 ml Linksventrikuläre Ejektionszeit Verhältnis von E Punkt zum A Punkt LVET MV E/A Zeit in ms des Aortendopplersignals MV E Punkt (max)/ MV A Punkt (max) ((IVSd+LVEDd+LVWd)³-LVEDd³) * 1,055 ms Masse des linken Ventrikels LV Masse Verhältnis von der linksventrikulären Masse zum Körpergewicht LV/BW ratio LV Masse/ KG (g) Zirkuläre Faserverkürzung Vcf 10* FS/ LVET Circ/ s nach HF korrigiert Vcfc Vcf/ Wurzel (RR×100) Circ/ s Verhältnis vom HZV zum Körpergewicht Rechtsventrikuläres diastolisches Volumen nach Wübbeling Rechtsventrikuläres Volumen nach der ellipsoiden Methode Enddiastolisches Volumen des linken Ventrikels nach Teichholz Endsystolisches Volumen des linken Ventrikels nach Teichholz Cardiac index HZV/ KG in z.B. g ml/ min/ g RVDV nach Wübbeling ( RVDV nach ellipsoid 8 * π * RVd Vierkammer 2 3 * RVLAX mm3 EDV (7/(2,4+LVEDd))* LVEDd 3 mm2 ESV (7/(2,4+ LVEDs))* LVEDs3 mm2 Ejektionsfraktion des linken Ventrikels nach Teichholz EF nach Teichholz (EDV-ESV)/ EDV* 100 % 4 1 + ) * RVd sav* RVLAX 15 6 62 mg µl 3. Experimenteller Teil 3.4 Schwimmtraining 3.4.1 Durchführung Da vor allem bei Leistungsportlern plötzliche arrhythmische Herztode mit einer ARVC in Verbindung gebracht wurden (WICHTER et al. 2002), wurden durch ein Schwimmtraining ähnliche Bedingungen vorgegeben. Das hierfür genutzte Schwimmbecken war 35 cm breit, 55 cm lang und 30 cm tief. Die Wassertemperatur betrug 36°C. Um den Mäusen eine selbstbestimmte individuelle Trainingsintensität zu ermöglichen, wurde ein mit Klebeband umwickelter handelsüblicher 1-Liter Messbecher als freischwebendes Laufrad benutzt. Als Erholungsmöglichkeit wurde ein mit Wasser und Luft gefüllter Latexhandschuh ins Becken gegeben. Die Mäuse wurden in Gruppen von bis zu zehn Tieren, nach Geschlecht getrennt, schwimmen gelassen. Die anfängliche Trainingszeit betrug fünf Minuten und wurde dann in einem Zeitraum von acht Wochen im 5-Tage-Training-2Tage-Ruhe-Rhythmus auf 1,5 Stunden gesteigert. Zu Beginn des Trainings waren die Tiere durchschnittlich 13 Wochen alt. Sowohl vor als auch nach dem Training wurden eine echokardiographische Untersuchung durchgeführt und ein OberflächenEKG angefertigt. 3.4.2 Auswertung Am Ende der Trainingszeit wurde die Aktivität der einzelnen Tiere analysiert. Bei einer Trainingszeit von 90 Minuten wurden in den ersten 60 Minuten die Tiere bei Pausen, die länger als vier Sekunden dauerten, durch einen taktilen Reiz (sanftes „Anstupsen“) zum Weiterschwimmen animiert. Im 10-minütigen Abstand wurde die Anzahl der Fremdmotivationen pro Maus ausgezählt. Anschließend wurde jede Maus über fünf Minuten beobachtet, und es wurde detailliert registriert, wie viele Sekunden die Maus jeweils schwamm, sich ausruhte oder auf dem Laufrad rannte. Aufgrund dessen konnte jedem Tier eine Aktivitätszahl zugewiesen werden. 63 3. Experimenteller Teil Diese setzte sich wie folgt zusammen: • Für die Zeit der Ruhe wurden keine Aktivitätspunkte gegeben. • Die Sekunden der Schwimmphase wurden als Aktivitätspunkte gezählt. • Die Sekunden der Laufphase wurden mit 2 multipliziert, da das Rennen auf dem Laufrad die intensivste Bewegungsform darstellt, und als Aktivitätspunkte gezählt. 64 3. Experimenteller Teil 3.5 Elektrophysiologische Untersuchung an isolierten Herzen 3.5.1 Durchführung Die Mäuse wurden heparinisiert (250 IE Natrium-Heparin, Liquimin®, intraperitoneal), anästhesiert (2 g/kg KGW Urethan in einer 2 mg/kg KGW Natriumchloridlösung, intraperitoneal) und auf einer Wärmeplatte gelagert. Nach Ausfall des Zwischenzehenreflexes wurde die Maus auf dem Rücken gelagert und mit den Pfoten auf einer Styroporplatte mit Nadeln fixiert. Die Haut wurde entlang der Medianen vom Xiphoid bis zum Nabel durchtrennt. Die Bauchwand wurde frei präpariert und die Bauchhöhle intradiaphragmental entlang dem Rippenbogen eröffnet. Nun wurde das Diaphragma von der Bauchhöhle aus entlang des Rippenbogens durchtrennt. Die Brustwand wurde bilateral in kraniale Richtung mit der Schere zügig aufgeschnitten und ließ sich nun aufklappen. Die Vena Cava wurde am rechten Vorhof und die Aorta auf Höhe des Aortenbogens durchtrennt. Anschließend wurde das Herz mit anhängendem Lungengewebe entnommen. Der Organkomplex wurde unmittelbar nach der Entnahme in eine Petrischale mit einer 37ºC warmen präoxygenierten Krebs-Henseleit-Pufferlösung (s. Tab. 3.5.1) überführt. Tabelle 3.5.1: Zusammensetzung der Krebs Henseleit-Pufferlösung Der Puffer wurde mit einem Gasgemisch aus 95% O2 und 5% CO2 (Carbogen-Gas) equilibriert und mit Natronlauge (1 mol/l NaOH) oder Salzsäure (1 mol/l HCl) auf einen pH-Wert von 7,35 bis 7,45 titriert. Substanz mmol NaCl 118 NaHCO3 24,88 KH2PO 1,18 Glukose 5,55 Na- Pyruvat 2 MgSO4 0,83 CaCl2 1,8 KCl 4,7 65 3. Experimenteller Teil Die Lungen und das mediastinale Gewebe wurden entfernt und die Gefäßenden gekürzt. Die etwa 3 mm lange Aorta wurde über eine Kanüle (27 Gauche) gestülpt und mit einem Faden (Seide metric 3) fixiert. Das Herz wurde an die LangendorffApparatur angeschlossen (Hugo Sachs, March- Hugstetten, D), und retrograd mit einem Perfusionsdruck von 110±5 mmHg und einem konstanten Fluss von 4±1 ml/min mit 37ºC warmen oxygeniertem Krebs- Henseleit-Puffer perfundiert (s. Abb. 3.5.1). Abbildung 3.5.1: Der Versuchsaufbau einer Langendorffapparatur A Der schematische Aufbau einer Langendorffapparatur zur Aufzeichnung von monophasischen Aktionspotentialen am isolierten Mäuseherz B In der schematischen Zeichnung sind die Aufzeichnungslokalisationen im Mäuseherz dargestellt, zum einen die endocardialen Schrittmacher- und Aufzeichnungsstellen des oktapolaren Katheters, 2 epikardialen MAP-Aufnahmestellen und das Reizleitungssystem C Eine simultane Aufnahme von einem Elektrogramm des rechten Vorhofs (obere Aufnahme), einer epicardialen MAP-Aufnahme des rechten Ventrikels (zweite Aufnahme), der linksventrikulären freien Wand (dritte Aufnahme) und des linksseitigen Septums (vierte Aufnahme), und die erste Ableitung des EKGs (letzte Aufnahme) nach einem mechanisch gesetzten AV-Block. Der senkrechte Balken im linken unteren Bildrand entspricht 1mV, der waagerechte Balken entspricht 100 ms. 66 3. Experimenteller Teil Das Perfusat wurde über ein 39,8ºC warmes Wasserbad (Durchlauferhitzer, LAUDA ecoline® 003) erwärmt und über eine Glasfritte moderat mit Carbogen begast. Über eine Rollerpumpe (Isomatic® Hugo Sachs Electronic) und mit Hilfe eines Perfusionsautomaten (Perfusor® sacura B- Braun) erfolgte die Zufuhr der Wirkstofflösung. Der Zufluss war mit einem Überdruckabflusssystem versehen. Eine verstellbare Druckmembran diente der Injektionsdruckregulation. Um artifiziellen Gewebeschädigungen vorzubeugen wurde an der linksventrikulären Seite des Apex cordis eine Injektionskanüle (1,3 mm Durchmesser) gestochen, um den Druck im Ventrikel zu mindern. Ein 2.0 French oktapolarer elektrophysiologischer Mauskatheter mit 0,5 mm breiten Elektroden und 0,5 mm breiten Zwischenräumen (CIB´ER MOUSE, NuMED, Inc., Hopkinton, N.Y., U.S.A.) wurde über eine 2 mm große iatrogene Öffnung in den rechten Vorhof und weiter bis in den rechten Ventrikel in Septumnähe vorgeschoben, um zu stimulieren und ein intrakardiales Elektrogramm abzuleiten. EKG-Aufnahmen wurden über in Schwämme eingebettete Ag-AgCl Elektroden, die mit speziell angefertigten, gefederten Halterungen senkrecht an das Epikard gedrückt wurden, aufgezeichnet. Die EKG Signale wurden von einem Vorfilter mit einer Bandbreite von 0,1 – 300 Hz verstärkt und gefiltert (Hugo Sachs, March-Hugstetten, D). Über drei MAP-Katheter (monophasisches Aktionspotential) wurden simultan MAPs vom rechten und linken Ventrikel und vom Septum aufgezeichnet. Die MAP-Katheter wurden an speziell angefertigten gefederten Halterungen befestigt, die eine konstante Andruckstärke senkrecht zum Epikard gewährleisteten. Die MAPs wurden mit DC-gekoppelten Vorverstärkern verschaltet (Modell 2000, EP Technologie, San Jose, CA, U.S.A.). Alle vorverstärkten Signale wurden mit einer speziell angepassten halbautomatischen Software (Labview®) zur Analyse der Repolarisationen von Mäuseherzen digitalisiert und aufgezeichnet. Dieses Programm wurde in der Arbeitsgruppe Kirchhof / Fabritz in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe Franz, Dept. of Pharmacology, Georgetown University, Washington DC, U.S.A. erstellt. Zur Erzeugung eines AV-Blockes wurde eine kleine anatomische Adson-Pinzette in die 2 mm große Öffnung am rechten Vorhof eingeführt und bis zum septalen Anteil 67 3. Experimenteller Teil des Anulus fibrosus vorgeschoben und dieser hier vorsichtig komprimiert. Bei erfolgreicher Blockierung wird der Ventrikel elektrophysiologisch vom Vorhof dissoziiert und schlägt in einem langsameren ventrikulären Ersatzrhythmus um. Das Protokoll startete mit einer 10-minütigen Wartezeit, um eine Stabilität im Bezug auf die Signalqualität und des Sinusrhythmus zu gewährleisten. Anschließend wurde mit Hilfe des oktapolaren Katheters eine fixfrequente Vorhofstimulation bei 140 ms, 120 ms und 100 ms jeweils über 40 Sekunden durchgeführt. Die Veränderung der Zykluslänge bei der Stimulation dient zur Ermittlung der AV-Knotenüberleitungszeit (Wenckebach Punkt). Nach einer kurzen Pause wurde ein AV-Block induziert. Bei Persistieren des AV-Blocks, nach 5-minütiger Beobachtung durch Elektrogramm und MAP, und nach Registrierung der spontan auftretenden Arrhythmien, wurde der Versuch fortgesetzt. Mit einer darauf folgenden programmierten Kammerstimulation bei 200 ms, 150 ms und 100 ms (à 40 s) und jeweils einer zusätzlichen S2 Stimulation wurde das Auftreten von Arrhythmien provoziert und die effektive Refraktärperiode (ERP) bestimmt. Danach wurde in einer 5-minütigen Einlaufphase Orciprenalin (2,5 mg/l) dem Perfusat mit 90 ml/h hinzugefügt und über zehn Minuten aufgezeichnet. Anschließend wurde das Protokoll der ventrikulären Stimulation wiederholt. 68 3. Experimenteller Teil 3.5.2 Auswertung Alle Aufzeichnungen wurden offline vollständig visuell kontrolliert und manuell mit einer in der Arbeitsgruppe vorhandenen Software für MAP-Auswertungen analysiert. Bei der MAP-Analyse wurde die Aktionspotentialsdauer (APD) bei 50%, 70% und 90% der Repolarisation bestimmt (s. Abb. 3.5.2). Die einzelnen MAPs mussten folgende Qualitätskriterien erfüllen: stabile Grundlinie und eine MAP-Morphologie; ein gerader Aufstrich, dessen Dauer weniger als 2 ms beträgt und eine Amplitudenhöhe von wenigstens 1 mV erreicht, und eine schnelle erste Phase der Repolarisation ohne Plateau (KNOLLMANN et al. 2001). Abbildung 3.5.2: Monophasisches Aktionspotential einer Maus Die anfängliche schnelle Repolarisation geht direkt über in eine langsamere Phase der Repolarisation, die ein abfallendes Plateau beschreibt, um sich dann allmählich der diastolischen Grundlinie anzunähern. Die Aktionspotentialdauer wurde von der schnellsten Anstiegsgeschwindigkeit bis zu den verschiedenen Repolarisationslevel (APD50, APD70, APD90) gemessen. Da es bei der typischen murinen MAP-Form kein Plateau in der frühen Repolarisationsphase gibt, wurde der Beginn der Repolarisation (0%) mit dem Peak des MAPs definiert, und 100% der Repolarisation wurden in der elektrischen Diastole gemessen (GUSSAK et al. 2000). Die Dispersion der Repolarisation wurde definiert als Differenz der maximalen und minimalen APD von den simultan aufgenommenen MAPs (KIRCHHOF et al. 1996). 69 3. Experimenteller Teil Zusätzlich wurden alle Aufzeichnungen auf Arrhythmien überprüft. Hier wurde zwischen Spontanen und Induzierten unterschieden. Induzierte Arrhythmien traten bei der Kammerstimulation auf. Weiter werden monomorphe und polymorphe ventrikuläre Tachykardien, Bigemini, Tripletts und Quadrupletts angegeben. Bei der Analyse der Aktivierungszeiten (Überleitungszeiten) werden zum einen die Gesamtaktivierungszeiten der Zykluslängen im EKG (vom Anfang des Stimulus bis zum Beginn des MAP) und zum anderen die Aktivierungszeiten der einzelnen MAPs (linksventrikulär, rechtsventrikulär und septal) gemessen. Zur Ermittlung der Sinusknotenerholungszeit misst man den Abstand zwischen dem letzten MAP der Stimulation bis zum ersten spontanen Schlag. 70 3. Experimenteller Teil 3.6 Histologische Untersuchung Die Mäuse wurden mit Urethan (2g/kg Körpergewicht) tief narkotisiert. Dann wurde zügig der Brustkorb eröffnet, das Brustbein vom kaudalen Ende angehoben, die Rippen durchtrennt und das Herz von seiner Fixation gelöst. Nach Durchführung der elektrophysiologischen Untersuchungen in der Langendorff-Apparatur wurden die Herzen anschließend in Formalin (3,7%) fixiert. Die histologischen Untersuchungen wurden von Prof. B. Levkau am Institut für Pathophysiologie des Universitätsklinikums Essen durchgeführt. Hematoxylin-Eosin (HE) wurde zur Färbung der histomorphologischen Schnitte und Goldner`s Trichrome Färbung zur Beurteilung der Fibrosierung genutzt. In jedem Herzen wurde der Zelldurchmesser in 100 Zellen, sowohl im linken als auch im rechten Ventrikel, auf Höhe des Zellkerns vermessen. 71 3. Experimenteller Teil 3.7 Positronen Emissions Tomographie (PET) In der Medizinischen Klinik und Poliklinik für Nuklearmedizin des Universitätsklinikum Münster unter der Leitung von Prof. Dr. Michael Schäfers wurde die myokardiale Glucoseaufnahme von MTA Christine Bätza in vivo nicht invasiv bei Mäusen über die kardiale Aufnahme des Glucose Analogons [18F]Fluor-desoxy-glucose ([18F]FDG) beurteilt. Die Mäuse wurden anästhesiert mit Isoflurane (1,5%), bei 37°C gehalten und mit 10 MBq intravenös injiziert. 60 Minuten nach der Injektion wurde die Strahlung mit einer hochauflösenden Kleintier PET Kamera (quadHIDAC, Oxford Positron Ltd., Oxford, England) über 15 Minuten gemessen (SCHÄFERS et al. 2005). Die emittierenden Positronen kollidieren mit einem Elektron im Gewebe, hierbei entsteht eine Vernichtungsstrahlung unter Abgabe zweier Photonen mit einer Energie von 511 keV. Die Photonen bewegen sich in einem Winkel von 180° auseinander und diese Strahlung wird von ringförmig angeordneten Detektoren der Kamera gemessen (Gleichzeitigkeit zweier Gammastrahlen ermöglicht die Lokalisation des Zerfallsortes entlang der Verbindungslinie der beiden betroffenen Detektoren). Die Bilder wurden in eine Matrix mit einer Voxelgröße von 0,4 mm3 rekonstruiert. 72 3. Experimenteller Teil 3.8 Versuchsablauf und Tierversuchsgruppen Die Versuche wurden möglichst paarweise mit je einem transgenen und einem nichttransgenen Geschwistertier gleichen Geschlechts und gleichen Alters angeordnet. Die Durchführung erfolgte entweder gleichzeitig (Telemetrie) oder direkt hintereinander (Oberflächen-EKG, Echokardiographie, Langendorff). In der Planung der Protokollabschnitte wurde berücksichtigt, dass für jedes Tier sämtliche angesetzte Versuche (Oberflächen-EKG, Telemetrie, Echokardiographie, Training, Langendorff) nacheinander und mit genügendem Abstand zueinander durchgeführt wurden. Alle Tiere wurden nach Anlieferung in demselben Raum gehalten, in dem alle nachfolgenden Versuche stattfanden. Nachdem die Tiere für die Echokardiographie narkotisiert, bzw. sediert wurden, wurde ein Oberflächen-EKG geschrieben und danach die echokardiographische Untersuchung durchgeführt. Nach einer „Erholungsphase“ von zwei Tagen wurden die Tiere für weitere Versuche (Training, Telemetrie) eingesetzt. Für die telemetrischen Aufzeichnungen wurden die Tiere am Tag der Transmitterimplantation erneut narkotisiert. Wenn bei der Echokardiographie ein anderes Narkotikum benutzt wurde als bei der Transmitterimplantation, wurde ein weiteres Oberflächen-EKG geschrieben und die Mäuse anschließend operiert. Nach einer Zeitspanne von zehn bis 14 Tagen wurden die telemetrischen EKGs aufgezeichnet. Die unterschiedlichen Belastungs-EKGs wurden an aufeinander folgenden Tagen durchgeführt, um eine genügende Erholung zwischen den Belastungen zu gewährleisten. C57Bl/6 Mäuse wurden aufgrund ihres aggressiven Beißverhaltens nicht für das Training und nicht für die Echokardiographie ohne Anästhesie eingesetzt. Die Versuche wurden nur an adulten Tieren durchgeführt. Nur bei der ersten Versuchsgruppe wurde von dem oben genannten Protokoll abgewichen. Anfangs wurden drei transgene und drei nichttransgene weibliche 73 3. Experimenteller Teil 129/SV-Geschwistertiere im Alter von 29-31 Wochen und vier transgene (eins männlich, drei weiblich), sowie drei nichttransgene (zwei männlich, eins weiblich) C57Bl/6-Mäuse für die telemetrischen Untersuchungen verwendet. Die 129/SV-Tiere wurden mit 36 Wochen für die Echokardiographie ohne Anästhesie untersucht. Eine Woche später wurden dieselben Tiere mit Diazepam sediert und es erfolgte mit 38 Wochen eine erneute echokardiographische Untersuchung. Dieselbe Untersuchung wurde bei den C57Bl/6-Tieren, die bereits in der Telemetrie waren, mit 36-45 Wochen, und bei weiteren zwei transgenen männlichen C57Bl/6-Tieren mit 41 und 47 Wochen sowie bei drei zusätzlichen transgenen männlichen 129/SV-Mäusen durchgeführt. Bei einer transgenen weiblichen C57Bl/6-Maus und einer nichttransgenen weiblichen 129/SV-Maus wurden die telemetrischen Belastungen im Alter von 50 und 52 Wochen wiederholt. Kurz vor der Untersuchung am isolierten Herzen in der Langendorffapparatur wurde bei den bereits mit Urethan narkotisierten oben genannten Tieren eine stark verkürzte echokardiographische Untersuchung mit einem i.v. injizierten Kontrastmittel (Sonovue®) durchgeführt. In der zweiten Versuchsgruppe wurden 19 transgene (neun männlich, zehn weiblich) und 16 nichttransgene 129/SV-Mäuse (acht männlich, acht weiblich) mit 9-12 Wochen echokardiographisch unter Diazepam Anästhesie untersucht und anschließend über 8 Wochen mit regelmäßigem Schwimmen trainiert. Am Ende des Trainings wurden dieselben Tiere erneut mit Hilfe der Echokardiographie im Alter von 18-26 Wochen geschallt. Bei einem Pärchen wurde das Training verfrüht abgebrochen, da ein männliches transgenes Tier den Anforderungen nicht mehr gewachsen war. Hier wurde die abschließende Echokardiographie bereits im Alter von 19 Wochen durchgeführt. Zum besseren Vergleich existierte eine Kontrollgruppe mit neun transgenen und neun nichttransgenen 129/SV-Tieren (je zwei männlich, sieben weiblich), die im gleichen Alter echokardiographisch untersucht, aber nicht trainiert wurden. Bei vier transgenen und vier nichttransgenen dieser trainierten männlichen 129/SVTiere wurden Telemetrie-Transmitter 74 nach der echokardiographischen 3. Experimenteller Teil Abschlussuntersuchung implantiert. Im Alter von 21-22 Wochen wurden die Belastungsuntersuchungen durchgeführt. Um unter trainingsähnlichen Bedingungen gleichzeitig telemetrische EKGs aufzuzeichnen, wurden folgende Schritte unternommen: Bei vier transgenen und vier nichttransgenen männlichen C57Bl/6-Tieren wurde nach einer echokardiographischen Untersuchung unter Diazepam (im Alter von 13-14 Wochen) eine Transmitterimplantation mit anschließenden Belastungsuntersuchungen (im Alter von 16-20 Wochen) durchgeführt. Im Alter von 31-32 Wochen wurden bei drei Transgenen und drei Wildtypen osmotische Pumpen, die mit Isoprenalin (3 mg/kg/d) gefüllt waren, implantiert. Die Implantation erfolgte unter Isoflurannarkose, in der vorab noch eine kurze echokardiographische Untersuchung erfolgte. Über sieben Tage wurden telemetrische EKGs aufgezeichnet. Danach wurde die Echokardiographie unter Isofluran wiederholt und direkt im Anschluss erfolgte die Untersuchung an der Langendorffapparatur. In einer weiteren Versuchsgruppe wurden zwei transgene und zwei nichttransgene weibliche 129/SV-Mäuse im Alter von zehn Wochen unter Isofluran echokardiographisch untersucht, Telemetrie-Transmitter implantiert und im Alter von 14 Wochen Belastungenuntersuchungen durchgeführt. Mit 15 Wochen wurden den Tieren mit Isoprenalin und Phenylephrin (je 30 mg/kg/d) gefüllte osmotische Pumpen implantiert. Das Protokoll wurde nach aktuellen Literaturangaben (MAASS et al., 2004) erstellt. Die Belastung führte innerhalb von 24 h zu letalen Komplikationen. Um eine altersabhängige Entwicklung des kardialen Phänotyps zu untersuchen, wurden bei acht transgenen (zwei männlich, sechs weiblich) und neun nichttransgenen (zwei männlich, sieben weiblich) C57Bl/6-Tieren im Alter von 42-46 Wochen eine echokardiographische Untersuchung unter Diazepam durchgeführt. Bei allen Untersuchungen oder Maßnahmen, die unter Sedierung oder Narkose erfolgten (Echokardiographie, Transmitterimplantation, Langendorff), wurden jeweils Oberflächen-EKGs unter der jeweiligen Medikation vorab geschrieben. Tabelle 3.8 75 3. Experimenteller Teil stellt eine Übersicht über die verschiedenen Versuchsgruppen und deren Anzahl der ausgewerteten Tiere dar. 76 3. Experimenteller Teil Tabelle 3.8: Anzahl der Mäuse in den einzelnen Versuchsgruppen Bl6 untrainiert WT TG Maustyp Genotyp unsediert Echokardiographie Diazepam Isofluran Isofluran Urethan OberflächenEKG Ket/Xyl Diazepam Papier-EKG Diazepam Telemetrie mit Isoprenalin Pumpe mit PhenylephrinIsoprenalin Pumpe Urethan Langendorff mit Isoprenalin Pumpe Histologie SV untrainiert WT TG SV trainiert WT TG 36 Wochen - - 3 3 - - 9-12 Wochen 2 1 25 28 - - 13-26 Wochen 4 7 10 10 16 19 > 38 Wochen 12 14 3 7 - - vor/nach Isoprenalin Pumpe 2 3 - - - - 10-11 Wochen - - 3 3 - - 31-32 Wochen 3 3 - - - - 21-35 Wochen - - 6 8 7 10 42-53 Wochen 3 5 3 5 - - 7-17 Wochen 9 10 3 6 - - 10-19 Wochen - - 16 19 - - 18-31 Wochen - - - - 14 17 42-46 Wochen 12 13 2 5 - - 38-46 Wochen 3 5 2 2 - - 14-20 Wochen 4 4 2 2 - - 21-22 Wochen - - - - 4 4 29-39 Wochen 3 4 3 3 - - 50-52 Wochen - 1 1 - - - 31-33 Wochen 3 3 - - - - 15 Wochen - - 2 2 - - 16-34 Wochen 6 5 5 6 9 13 > 42 Wochen 4 8 3 5 - - 33 Wochen 3 3 - - - - 21-28 Wochen 1 - 3 2 6 11 > 42 Wochen 3 7 1 1 - - 77 3. Experimenteller Teil 3.9 Statistik Die Analyse erfolgte bezüglich des Genotyps geblindet. Alle Variablen wurden nach Genotypen mit Hilfe des Post-doc Student`s T test (Microsoft Excel 2000) und ANOVA Analyses (SPSS Version 12) verglichen. Der Fisher´s exact Test und der Chi square Test wurden benutzt, um Arrhythmien zwischen den Genotypen zu vergleichen. Um Korrelationen zu berechnen, wurde die Pearson Korrelation verwand. Als signifikant wurden Unterschiede anerkannt, die einen p-Wert < 0,05 zeigten. Alle Werte wurden als Mittelwert +/- Standardfehler angegeben. 78 4. Ergebnisse 4. Ergebnisse 4.1 Echokardiographie 4.1.1 Altersabhängiger Vergleich Die Ergebnisse der verschiedenen Untersuchungen wurden nach Altersklassen zusammengefasst. In den Altersklassen von neun bis 12 Wochen und 13 bis 26 Wochen konnten keine signifikanten Unterschiede in den echokardiographischen Parametern zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und den Wildtypen festgestellt werden. Im höheren Alter konnte auch kein Unterschied in den Linksherzparametern evaluiert werden. Die Untersuchungsergebnisse sind in Tabelle 4.1.1.1 zusammenfassend dargestellt. Tabelle 4.1.1.1: Echokardiographieergebnisse ausgewählter Linksherzparameter bei 9 bis 12 Wochen und über 38 Wochen alten Tieren Die Werte werden angegeben als Mittelwert ± Standardfehler. HF: Herzfrequenz, LA: linkes Atrium, MV E Punkt: höchster Punkt der E-Welle im Mitraldoppler, MV A Punkt: höchster Punkt der A-Welle im Mitraldoppler, MV Decel-Zeit: Dezelerationszeit der Mitralwelle, IVSd: Durchmesser des Interventrikulären Septums in der Diastole, LVEDd/LVEDs: linksventrikulärer Durchmesser diastolisch/systolisch, FS: Ventrikelverkürzungsfraktion, Ao Vmax: maximale Geschwindigkeit des Aortendopplers, HZV: Herzzeitvolumen, Vcf: zirkuläre Faserverkürzung, LV Masse: errechnete Masse des linken Ventrikels Parameter Atrium Ventrikel 9-12 Wochen >38 Wochen WT Plako +/- WT Plako +/- Körpergewicht (g) 23,5 ± 0,7 23,4 ± 0,6 31,3 ± 1,6 31,3 ± 0,9 HF (Schläge/min) 455 ± 8 458 ± 14 509 ± 36 486 ± 35 LA (mm) 2,07 ± 0,08 2,15 ± 0,07 2,39 ± 0,10 2,51 ± 0,05 MV E Punkt (cm/s) 71,1 ± 1,8 72,4 ± 1,3 56,2 ± 4,1 59,6 ± 3,5 MV A Punkt (cm/s) 55,3 ± 2,8 57,5 ± 2,8 38,4 ± 4,2 36,2 ± 5,6 MV Decel-Zeit (ms) 32,0 ± 1,2 33,9 ± 1,6 34,3 ± 2,5 38,6 ± 2,3 IVSd (mm) 0,88 ± 0,05 0,90 ± 0,03 0,93 ± 0,03 0,94 ± 0,04 LVEDd (mm) 3,18 ± 0,05 3,12 ± 0,06 3,1 ± 0,11 3,2 ± 0,07 LVEDs (mm) 1,55 ± 0,05 1,49 ± 0,05 1,62 ± 0,11 1,58 ± 0,11 FS (%) 51,2 ± 1,2 52 ± 1,6 47,9 ± 2,9 51,6 ± 2,7 Ao V max (cm/s) 61,3 ± 1,5 59,6 ± 1,3 81,8 ± 6,9 95,3 ± 6,4 HZV (ml/min) 15,8 ± 0,9 15 ± 0,9 13,73 ± 1,5 16,12 ± 1,3 Vcf (circ/s) 8,61 ± 0,34 8,9 ± 0,37 8,44 ± 0,79 9,28 ± 0,83 korrigiert Vcf (circ/s) 184 ± 8 191 ± 10 195,5 ± 24 212 ± 24 LV Masse (mg) 86,2 ± 4,7 82,9 ± 3,4 93,7 ± 6,2 105,5 ± 6,2 79 4. Ergebnisse In Tabelle 4.1.1.2 und 4.1.1.3 sind die Ergebnisse der Rechtsherzparameter dargestellt. Tabelle 4.1.1.2: Echokardiographieergebnisse ausgewählter Rechtsherzparameter bei 9 bis 12 Wochen alten Tieren Die Werte werden angegeben als Mittelwert ± Standardfehler (MW ± Stem) mit der dazugehörigen Anzahl (n) der ausgewerteten Tiere. TV: präsystolischer Durchmesser der Trikuspidalklappe, RVLAX: Länge des rechten Ventrikels in der Diastole, RVSAX: Breite des rechten Ventrikels in der Diastole, RVIT3: Durchmesser des Einflusstraktes des rechten Ventrikels in der Diastole, RVOT1/ RVOT4: präsystolischer Durchmesser des rechtsventrikulären Ausflusstraktes bei gleichzeitiger Darstellung der Trikuspidalklappe/ vom Querschnitt ausgehend, RVd Vierkammer (cm²)/ RVd lav (cm²)/ RVd sav (cm²): diastolische Fläche des rechten Ventrikels gemessen im Vierkammerblick/ Längsachsenansicht/ Querachsenansicht, RVdV (µl): errechnetes rechtsventrikuläres diastolisches Volumen nach Wübbeling Parameter TV (mm) RVLAX (mm) RVSAX (mm) RVIT3 (mm) RVOT1 (mm) RVOT4 (mm) RVd Vierkammer (mm²) RVd lav (mm²) RVd sav (mm²) RVdV (µl) WT MW ± Stem 2,14 ± 0,07 4,96 ± 0,24 1,24 ± 0,06 1,48 ± 0,06 1,14 ± 0,04 1,18 ± 0,03 7,85 ± 0,50 5,42 ± 0,22 3,20 ± 0,22 6,98 ± 0,47 n 21 23 15 22 23 22 15 26 26 23 Plako +/MW ± Stem 2,24 ± 0,09 5,07 ± 0,20 1,22 ± 0,07 1,45 ± 0,08 1,12 ± 0,03 1,15 ± 0,03 7,32 ± 0,62 6,06 ± 0,48 4,64 ± 0,96 8,94 ± 1,69 n 24 24 17 24 26 24 17 26 25 24 Tabelle 4.1.1.3: Echokardiographieergebnisse ausgewählter Rechtsherzparameter bei 13 bis 26 Wochen alten Tieren Die Werte werden angegeben als Mittelwert ± Standardfehler (MW ± Stem) mit der dazugehörigen Anzahl (n) der ausgewerteten Tiere. TV: präsystolischer Durchmesser der Trikuspidalklappe, RVLAX: Länge des rechten Ventrikels in der Diastole, RVSAX: Breite des rechten Ventrikels in der Diastole, RVIT3: Durchmesser des Einflusstraktes des rechten Ventrikels in der Diastole, RVOT1/ RVOT4: präsystolischer Durchmesser des rechtsventrikulären Ausflusstraktes bei gleichzeitiger Darstellung der Trikuspidalklappe/ vom Querschnitt ausgehend, RVd Vierkammer (cm²)/ RVd lav (cm²)/ RVd sav (cm²): diastolische Fläche des rechten Ventrikels gemessen im Vierkammerblick/ Längsachsenansicht/ Querachsenansicht, RVdV (µl): errechnetes rechtsventrikuläres diastolisches Volumen nach Wübbeling Parameter TV (mm) RVLAX (mm) RVSAX (mm) RVIT3 (mm) RVOT1 (mm) RVOT4 (mm) RVd Vierkammer (cm²) RVd lav (cm²) RVd sav (cm²) RVdV (µl) WT MW ± Stem 2,10 ± 0,07 4,35 ± 0,11 1,35 ± 0,11 1,40 ± 0,06 1,17 ± 0,03 1,18 ± 0,02 5,40 ± 0,62 7,20 ± 0,50 3,98 ± 0,53 7,80 ± 1,21 80 n 14 14 10 14 14 14 9 14 14 14 Plako +/MW ± Stem 2,09 ± 0,07 4,61 ± 0,20 1,51 ± 0,16 1,52 ± 0,11 1,11 ± 0,02 1,14 ± 0,03 5,94 ± 0,66 7,32 ± 0,43 4,72 ± 0,66 9,88 ± 1,50 n 14 14 10 14 14 14 10 17 17 14 4. Ergebnisse Bei transgenen Tieren, die älter als 38 Wochen waren, konnte eine signifikante Vergrößerung verschiedener Parameter des rechten Ventrikels dargestellt werden. Im Vierkammerblick unterschied sich die Fläche (RVd Vierkammer: 7,16 ± 0,44 mm² bei Wildtypen und 11,12 ± 0,76 mm² bei transgenen Tieren, p<0,05) sowie die Länge (RVLAX: 5,24 ± 0,26 mm bei Wildtypen und 5,97 ± 0,16 mm bei transgenen Tieren, p<0,05) und die Breite (RVSAX: 1,25 ± 0,06 mm bei Wildtypen und 1,81 ± 0,15 mm bei transgenen Tieren, p<0,05) des rechten Ventrikels, als auch der rechtsventrikuläre Einflusstrakt (RVIT3: 1,40 ± 0,06 mm bei Wildtypen und 1,79 ± 0,16 mm bei transgenen Tieren, p<0.05). Diese Vergrößerung der rechtsventrikulären Parameter im Vierkammerblick entsteht somit erst im höheren Alter der transgenen Tiere (s. Tab. 4.1.1.2 und 4.1.1.3 sowie Abb. 4.1.1.1 und 4.1.1.2). 180 % vs WT 160 WT 140 TG 120 * * * * 100 80 RVLAX Abbildung RVSAX RVIT3 RVd Vierkam 4.1.1.1: Vergleich der Rechtsherzparameter im Vierkammerblick Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen, die älter als 38 Wochen sind zwischen Es wird die Länge (RVLAX), die Breite (RVSAX), der Durchmesser des Einflusstraktes (RVIT3) und die Fläche (RVd Vierkam) des rechten Ventrikels im Vierkammerblick bei Plakoglobin+/-Mäusen (schwarzer Balken) und Wildtypen (weißer Balken) im Alter über 38 Wochen dargestellt. Sternchen (*) kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen transgenen Mäusen und Wildtypen. (MW±SE, n= 9 (WT) und 9 (TG), Student’s T-Test) 81 4. Ergebnisse Fläche des rechten Ventrikels im Vierkammerblick Abbildung 4.1.1.2: Beispielhafte echokardiographische Darstellung der Fläche des rechten Ventrikels im Vierkammerblick bei Mäusen, die älter als 38 Wochen sind Die diastolische rechtsventrikuläre Fläche wird durch die weiße Umrandung dargestellt A) Wildtyp B) Plakoglobin+/-Maus 82 4. Ergebnisse Auch in der Längsachsenansicht konnte eine Vergrößerung der Fläche des rechten Ventrikels mit zunehmendem Alter bei Plakoglobin+/-Mäusen festgestellt werden (s. Abb 4.1.1.3 u. 4.1.1.4). rechtsventrikuläre Fläche in der Längsachsenansicht 8,00 6,00 mm² * WT TG 4,00 2,00 0,00 9-12Wo >38Wo Abbildung 4.1.1.3: Vergleich der rechtsventrikulären Fläche in der Längsachsenansicht zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen im Alter von 9 bis 12 Wochen und älter als 38 Wochen Es wird die diastolische Fläche des rechten Ventrikels in der Längsachsenansicht bei Plakoglobin+/-Mäusen (schwarzer Balken) und Wildtypen (weißer Balken) im Alter von 9 bis 12 Wochen und älter als 38 Wochen dargestellt. Sternchen (*) kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen transgenen Mäusen und Wildtypen. (MW±SE, n= 9-12Wo: 26 (WT) und 26 (TG), <38Wo: 15 (WT) und 21 (TG), Student’s T-Test) Fläche des rechten Ventrikels in der Längsachsenansicht Abbildung 4.1.1.4: Beispielhafte echokardiographische Darstellung der Fläche des rechten Ventrikels in der Längsachsenansicht bei Mäusen, die älter als 38 Wochen sind Die diastolische rechtsventrikuläre Fläche wird durch die weiße Umrandung dargestellt A) Wildtyp B) Plakoglobin+/-Maus 83 4. Ergebnisse In der Querachsenansicht war auch die rechtsventrikuläre Fläche in der Diastole bei den transgenen Tieren (4,52 ± 0,29 mm² bei den Plakoglobin+/-Mäuse) gegenüber den Wildtypen (2,59 ± 0,22 mm², p<0,05) im höheren Alter vergrößert (s. Abb. 4.1.1.5 u. Abb. 4.1.1.6). 6,00 5,00 Rechtsventrikuläre Fläche in der Querachsenansicht * mm² 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 WT TG Abbildung 4.1.1.5: Vergleich der rechtsventrikulären Fläche in der Querachsenansicht zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen älter als 38 Wochen Es wird die diastolische Fläche des rechten Ventrikels in der Querachsenansicht bei Plakoglobin+/-Mäusen (schwarzer Balken) und Wildtypen (weißer Balken), die älter als 38 Wochen sind, dargestellt. Sternchen (*) kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen transgenen Mäusen und Wildtypen. (MW±SE, n= 15 (WT) und 21 (TG), Student’s T-Test) Fläche des rechten Ventrikels in der Querachsenansicht Abbildung 4.1.1.6: Beispielhafte echokardiographische Darstellung der Fläche des rechten Ventrikels in der Querachsenansicht bei Mäusen, die älter als 38 Wochen sind Die diastolische rechtsventrikuläre Fläche wird durch die weiße Umrandung dargestellt A) Wildtyp B) Plakoglobin+/-Maus 84 4. Ergebnisse Aufgrund der Fläche des rechten Ventrikels in der Querachsenansicht (RVd sav) und der Länge des rechten Ventrikels im Vierkammerblick (RVLAX) hat Dr. Frank Wübbeling von der Westfälischen Wilhelms-Universität Münster aus dem Fachbereich Mathematik und Informatik eine auf der Integralberechnung beruhenden Formel für das diastolische rechtsventrikuläre Volumen erstellt. Die Voraussetzung für diese Formel ist die Annahme, dass die Form der rechten Ventrikel immer den gleichen geometrischen Regeln folgt. Da dies in vivo aber nicht den natürlichen Schwankungen entspricht, kann es sich bei der Formel nur um eine stark vereinfachte Approximation handeln. Die geometrische Voraussetzung beinhaltet, dass die Abmessung der Querschnittsfläche (RVd sav) immer an der Stelle des größten Querschnitts genommen wird und dabei die Länge des rechten Ventrikels (RVLAX) in einem 1/3:2/3 Verhältnis teilt. Weiter wird angenommen, dass die Höhe des Querschnittes vom Apex zum Punkt der Querschnittsmessung im Verhältnis x zunimmt. Von der Basis bis zum Punkt der Querschnittsmessung soll die Höhe im Verhältnis x zunehmen. Demzufolge ergibt sich folgende Berechnungsformel: Diastolisches rechtsventrikuläres Volumen (nach Wübbeling) = ( 4 1 + ) * RVdsav * RVLAX 15 6 Mit Hilfe dieser Formel konnte auch ein deutlich erhöhtes Rechtsherzvolumen bei den über 38 Wochen alten Plakoglobin+/-Mäusen gegenüber den Wildtypen errechnet werden (12,79 ± 3,73 µl bei den transgenen Tieren und 4,98 ± 1,99 µl bei den Wildtypen, p<0,05)(s. Abb. 4.1.1.7). CLARK et al. (2002) haben folgenden Formel zur Errechnung des rechtsventrikulären Volumens bei Neugeborenen verwand: Rechtsventrikuläres Volumen nach der ellipsoiden Annäherungsmethode = 8 * π * RVd Vierkammer 2 3 * RVLAX Die Ergebnisse bei Verwendung dieser Formel in der altersabhängigen Studie waren vergleichbar mit denen, die mit der Formel nach Wübbeling erstellt wurden. 85 4. Ergebnisse Rechtsherzvolumen (µl) Rechtsherzvolumen nach Wübbeling 14 12 * WT TG 10 8 6 4 2 0 9-12 Wo 13-26 Wo >38 Wo Abbildung 4.1.1.7: Vergleich des rechtsventrikulären Volumens nach Wübbeling zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen im Alter von 9-12, 13-26 und über 38 Wochen Es wird das diastolische Volumen des rechten Ventrikels aufgrund der erstellten Integralen Berechnungsformel nach Wübbeling bei Plakoglobin+/-Mäusen (schwarzer Balken) und Wildtypen (weißer Balken) im Alter von 9-12, 13-26 und über 38 Wochen dargestellt. Sternchen (*) kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen transgenen Mäusen und Wildtypen. (MW±SE, n= 9-12Wo: 23 (WT) und 24 (TG), 13-26Wo: 14 (WT) und 14 (TG), <38Wo: 9 (WT) und 9 (TG), Student’s T-Test) Weiter wurde bei der gleichzeitigen Ansicht der Trikuspidalklappe und des rechtsventrikulären Ausflusstraktes eine signifikante Verbreiterung beider Parameter bei den älteren Plakoglobin+/-Mäusen erfasst. So wurde bei den Wildtypen der Durchmesser der Trikuspidalklappe mit 2,13 ± 0,08 mm und bei den transgenen Tieren mit 2,45 ± 0,11 mm gemessen (p<0,05). Der rechtsventrikuläre Ausflusstrakt bei gleichzeitiger Darstellung der Trikuspidalklappe betrug bei den Wildtypen 1,08 ± 0,03 mm und bei den Plakoglobin+/-Mäusen 1,34 ± 0,04 mm (p<0,05)(s. Abb. 4.1.1.8 u. 4.1.1.9). Auch bei der basaleren Einstellung des Querschnittes zur Messung des rechtsventrikulären Ausflusstraktes (RVOT4) wurde eine signifikante Verbreiterung bei den transgenen Mäusen mit 1,26 ± 0,05 mm gegenüber den Wildtypen mit 1,11 ± 0,04 mm (p<0,05) festgestellt. 86 4. Ergebnisse Trikuspidalklappe und rechtsventrikulärer Ausflußtrakt % vs WT 140 * 120 * WT TG 100 80 TV Abbildung RVOT1 4.1.1.8: Vergleich der Durchmesser der Trikuspidalklappe und des rechtsventrikulären Ausflusstraktes zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen, die älter als 38 Wochen sind Es wird der Durchmesser der Trikuspidalklappe (TV) und der Durchmesser des rechtsventrikulären Ausflusstraktes (RVOT1) bei Plakoglobin+/-Mäusen (schwarzer Balken) und Wildtypen (weißer Balken) im Alter über 38 Wochen dargestellt. Sternchen (*) kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen transgenen Mäusen und Wildtypen. (MW±SE, n= 8 (WT) und 9 (TG), Student’s T-Test) Trikuspidalklappe und rechtsventrikulärer Ausflusstrakt Abbildung 4.1.1.9: Beispielhafte echokardiographische Darstellung der Durchmesser der Trikuspidalklappe und des rechtsventrikulären Ausflusstraktes bei Mäusen, die älter als 38 Wochen sind Die präsystolisch gemessenen Durchmesser der Trikuspidalklappe (TV) und des rechtsventrikulären Ausflusstraktes (RVOT1) sind mit einem weißen Strich gekennzeichnet. Der Aortendurchmesser des Wildtypen beträgt 1,24 mm, der der transgenen Maus 1,37 mm. A) Wildtyp B) Plakoglobin+/-Maus 87 4. Ergebnisse 4.1.2 Auswirkung von Ausdauertraining Um die Bedeutung körperlichen Trainings für die Entwicklung der ARVC zu verstehen, wurden Untersuchungen vor und nach Training durchgeführt. Das mindestens achtwöchige Training startete mit einer 5-minütigen Schwimmphase im durchschnittlichen Alter von 13 Wochen, und wurde regelmäßig im 5-Tage-Training2-Tage-Ruhe-Rhythmus auf 1,5 h Schwimmen erhöht. Sowohl vor als auch nach der Trainingsphase wurden echokardiographische Untersuchungen durchgeführt. Am Ende der Trainingsphase wurden bei jedem Tier die unterschiedlichen Aktivitätsphasen am Ende einer Trainingseinheit über fünf Minuten ausgezählt. Hierbei wurde zwischen Ruhe, Schwimmen und Laufen auf dem freischwimmenden Rad unterschieden. Aufgrund dessen konnte jedem Tier eine Aktivitätszahl zugewiesen werden. Diese setzt sich wie folgt zusammen: • für die Zeit der Ruhe gab es keine Aktivitätspunkte, • die Sekunden der Schwimmphase wurden als Aktivitätspunkte gezählt, • die Sekunden der Laufphase wurden mit 2 multipliziert, da das Rennen auf dem Laufrad die intensivste Bewegungsform darstellt, und als Aktivitätspunkte gezählt (s. Tab. 4.1.2). Beispiel: Tabelle 4.1.2: Beispiel zur Errechnung der Aktivitätszahl Die Aktivitätszahl dieser Beispielmaus beträgt 303 Sekunden während einer 5minütigen Auszählphase Aktivitätspunkte Ruhe 87 0 Schwimmen 123 123 Laufen 90 180 Gesamt 300 303 88 4. Ergebnisse Bei dem Vergleich der Aktivitätszahlen und der benötigten Fremdmotivation konnte kein Unterschied zwischen den transgenen Mäusen und den Wildtypen festgestellt werden. Weiter wurde die prozentuale Entwicklung der Größenverhältnisse verschiedener Rechtsherzparameter vor und nach dem Training errechnet und mit der Aktivität verglichen (s. Abb. 4.1.2.1 u. 4.1.2.2 u. 4.1.2.3 u. 4.1.2.4). Dabei konnte bei den transgenen Tieren eine signifikante Korrelation zwischen einer hohen Aktivität im Training und einer Rechtherzvergrößerung festgestellt werden. In der Kontrollgruppe ohne Trainingseinfluss konnte kein Unterschied in dem entsprechendem Alter festgestellt werden (s. Tab. 4.1.1.3). 60 Veränderung der Länge des rechten Ventrikels im Verhältnis zur Aktivität RVLAX change (%) 50 40 r=0,859 p=0,000 30 20 10 0 0,00 -10 -20 100,00 200,00 300,00 400,00 500,00 600,00 Aktivität Abbildung 4.1.2.1: Korrelation der Länge des rechten Ventrikels im Verhältnis zur errechneten Aktivitätszahl Dargestellt ist der Zusammenhang (Pearson Korrelation) von intensiven Training (hohe Aktivitätszahl) und einer davon abhängigen prozentualen Verlängerung des rechten Ventrikels vor und nach einem 8-wöchigen Schwimmtraining der verschiedenen transgenen Mäusen. RVLAX change: Prozentuale Zunahme der Länge des rechten Ventrikels im Vierkammerblick gemessen Aktivität: Errechnete Aktivitätszahl der einzelnen transgenen Mäuse 89 4. Ergebnisse 300 RVd Vierkam change (%) 250 200 Veränderung der rechtsventrikulären Fläche im Vierkammerblick im Verhältnis zur Aktivität r=0,728 p=0,003 150 100 50 0 0,00 100,00 200,00 300,00 400,00 500,00 600,00 Aktivität Abbildung 4.1.2.2: Korrelation der rechtsventrikulären Fläche im Vierkammerblick im Verhältnis zur errechneten Aktivitätszahl Dargestellt ist der Zusammenhang (Pearson Korrelation) von intensiven Training (hohe Aktivitätszahl) und einer davon abhängigen prozentualen Vergrößerung der rechtsventrikulären Fläche vor und nach einem 8-wöchigen Schwimmtraining der verschiedenen transgenen Mäusen. RVd Vierkam change: Prozentuale Zunahme der rechtsventrikulären Fläche im Vierkammerblick gemessen Aktivität: Errechnete Aktivitätszahl der einzelnen transgenen Mäuse 250 RVIT3 change (%) 200 150 Veränderung der Breite des rechtsventrikulären Einflußtraktes im Verhältnis zur Aktivität r=0,605 p=0,013 100 50 0 0,00 100,00 200,00 300,00 400,00 500,00 600,00 -50 -100 Aktivität Abbildung 4.1.2.3: Korrelation des rechtsventrikulären Einflusstraktes im Verhältnis zur errechneten Aktivitätszahl Dargestellt ist der Zusammenhang (Pearson Korrelation) von intensiven Training (hohe Aktivitätszahl) und einer davon abhängigen prozentualen Verbreiterung des rechtsventrikulären Einflusstraktes vor und nach einem 8-wöchigen Schwimmtraining der verschiedenen transgenen Mäusen. RVIT3 change: Prozentuale Zunahme des rechtsventrikulären Einflusstraktes im Vierkammerblick gemessen Aktivität: Errechnete Aktivitätszahl der einzelnen transgenen Mäuse 90 4. Ergebnisse Veränderung der Fläche in der Längsachsenansicht im Verhältnis zur Aktivität 60 RV lav change(%) r=0,611 p=0,009 40 20 0 0,00 100,00 -20 200,00 300,00 400,00 500,00 600,00 Aktivität Abbildung 4.1.2.4: Korrelation des rechtsventrikulären Fläche in der Längsachsenansicht im Verhältnis zur errechneten Aktivitätszahl Dargestellt ist der Zusammenhang (Pearson Korrelation) von intensiven Training (hohe Aktivitätszahl) und einer davon abhängigen prozentualen Zunahme des rechtsventrikulären Fläche vor und nach einem 8-wöchigen Schwimmtraining der verschiedenen transgenen Mäusen. RV lav change: Prozentuale Zunahme des rechtsventrikulären Fläche in der Längsachsenansicht gemessen Aktivität: Errechnete Aktivitätszahl der einzelnen transgenen Mäuse Am Ende der Trainingsphase war bei der echokardiographischen Untersuchung der rechte Ventrikel der Plakoglobin+/-Mäuse gegenüber dem der Wildtypen vergrößert. Im Vierkammerblick unterschied sich bei allen Tieren die Fläche (RVd Vierkammer: 7,15 ± 0,58 mm² bei Wildtypen und 10,14 ± 1,07 mm² bei transgenen Tieren, p<0,05)(s. Abb. 4.1.2.5). Eine Tendenz in der Größenzunahme zeigte sich in der Länge (RVLAX: 5,35 ± 0,24 mm bei Wildtypen und 5,57 ± 0,19 mm bei transgenen Tieren) und der Breite (RVSAX: 1,39 ± 0,09 mm bei Wildtypen und 1,81 ± 0,15 mm bei transgenen Tieren) des rechten Ventrikels, als auch in der Breite des rechtsventrikulären Einflusstraktes (RVIT3: 1,50 ± 0,10 mm bei Wildtypen und 1,75 ± 0,15 mm bei transgenen Tieren). Betrachtet man gesondert die transgenen Tiere, die ein besonders hohes selbstgewähltes Trainingspensum absolvierten (Aktivitätszahl >300) und vergleicht dabei die Werte vor und nach dem Training, so sind alle im Vierkammerblick gemessenen Parameter signifikant erhöht (RVd Vierkammer: 4,48 ± 0,33 mm² vor und 10,00 ± 1,69 mm² nach dem Training, p<0,05; RVLAX: 4,09 ± 0,30 mm vor und 91 4. Ergebnisse 5,59 ± 0,36 nach dem Training, p<0,05; RVSAX: 0,93 ± 0,05 mm vor und 1,69 ± 0,32 mm nach dem Training, p<0,05; RVIT3: 1,07 ± 0,07 mm vor und 1,85 ± 0,25 mm nach dem Training, p<0,05). Diese Vergrößerung der rechtsventrikulären Parameter im Vierkammerblick entsteht somit nicht nur im höheren Alter der transgenen Tiere, sondern diese Entwicklung kann auch durch Training akzeleriert werden. 12 Rechtsventrikuläre Fläche im Vierkammerblick Fläche (mm²) 10 * WT TG 8 6 4 2 0 vor Training nach Training Abbildung 4.1.2.5: Vergleich der Fläche des rechten Ventrikels im Vierkammerblick zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen vor und nach Training Es wird die Fläche des rechten Ventrikels im Vierkammerblick bei Plakoglobin+/Mäusen (schwarzer Balken) und Wildtypen (weißer Balken) vor und nach Training dargestellt. Sternchen (*) kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen transgenen Mäusen und Wildtypen. (MW±SE, n= 16 (WT) und 19 (TG), Student’s T-Test) Auch bei der rechtsventrikulären Fläche in der Längsachsenansicht konnte eine signifikante Vergrößerung bei den trainierten transgenen Tieren gegenüber den trainierten Wildtypen festgestellt werden (5,80 ± 0,26 mm² bei den Wildtypen und 7,23 ± 0,62 mm² bei den Plakoglobin+/-Mäusen, p<0,05)(s. Abb. 4.1.2.6 u. 4.1.2.7). 92 4. Ergebnisse mm² Rechtsventrikuläre Fläche in der Längsachsenansicht 9 8 7 6 5 4 3 2 1 0 * WT TG vor Training nach Training Abbildung 4.1.2.6: Vergleich der Fläche des rechten Ventrikels in der Längsachsenansicht zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen vor und nach Training Es wird die Fläche des rechten Ventrikels im Vierkammerblicke bei Plakoglobin+/Mäusen (schwarzer Balken) und Wildtypen (weißer Balken) vor und nach Training dargestellt. Sternchen (*) kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen transgenen Mäusen und Wildtypen. (MW±SE, n= 16 (WT) und 19 (TG), Student’s T-Test) Fläche des rechten Ventrikels in der Längsachsenansicht Abbildung 4.1.2.7: Beispielhafte echokardiographische Darstellung der Fläche des rechten Ventrikels in der Längsachsenansicht bei Mäusen vor und nach Training Die diastolische rechtsventrikuläre Fläche wird durch die weiße Umrandung dargestellt A) Plakoglobin+/-Maus vor Training B) Plakoglobin+/-Maus nach Training C) Wildtyp nach Training 93 4. Ergebnisse Vergleicht man die Wildtypen mit den transgenen Tieren, die einen hohen Trainingseinsatz zeigten (Aktivitätszahl >300), wurde eine deutliche Vergrößerung der rechtsventrikulären Fläche in der parasternalen langen Achse (6,10 ± 0,28 mm² bei den Wildtypen und 8,14 ± 0,67 mm² bei den Plakoglobin+/-Mäusen, p<0,05), und in der parasternalen kurzen Achse (2,73 ± 0,29 mm² bei den Wildtypen und 4,76 ± 0,60 mm² bei den Plakoglobin+/-Mäusen, p<0,05) bei den transgenen Tieren sichtbar (s. Abb. 4.1.2.8 u. 4.1.2.9). RV Fläche nach intensivem Training WT vs. TG * 8 WT 4 TG * mm 2 6 2 0 RVd lav RVd sav Abbildung 4.1.2.8: Vergleich der Fläche des rechten Ventrikels in der Längs- und Querachsenansicht zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen nach Training Es wird die Fläche des rechten Ventrikels in der Längs- und Querachsenansicht (RVd lav / RVd sav) bei Plakoglobin+/-Mäusen (schwarzer Balken) und Wildtypen (weißer Balken) nach intensivem Training (Aktivitätszahl >300) dargestellt. Sternchen (*) kennzeichnen signifikante Unterschiede. (MW±SE, n= 6 (WT) und 5 (TG), Student’s T-Test) 94 4. Ergebnisse Fläche des rechten Ventrikels in der Querachsenansicht Abbildung 4.1.2.9: Beispielhafte echokardiographische Darstellung der Fläche des rechten Ventrikels in der Querachsenansicht bei Mäusen vor und nach Training Die diastolische rechtsventrikuläre Fläche wird durch die weiße Umrandung dargestellt. A) Plakoglobin+/-Maus vor Training B) Plakoglobin+/-Maus nach Training C) Wildtyp nach Training Weiter zeigte sich ein erhöhtes rechtsventrikuläres diastolisches Volumen (nach Wübbeling) bei den trainierten Plakoglobin+/-Tieren (6,31 ± 1,03 µl) gegenüber den Wildtypen (3,07 ± 0,51 µl, p<0,05) sowie ein vermindertes Schlagvolumen des linken Ventrikels der trainierten Tiere in Ruhe (27,0 ± 2,4 µl bei den transgenen Tieren und 37,8 ± 4,0 µl bei den Wildtypen), als auch nach einer Isoprenalingabe (29,2 ± 2,1 µl bei den transgenen Mäusen und 38,0 ± 3,0 µl bei den Wildtypen), wenn eine erhöhte Aktivität (Aktivitätszahl >300) in beiden Gruppen zu sehen war (s. Abb. 4.1.2.10). 95 4. Ergebnisse Schlagvolumen nach intensivem Training WT vs. TG 50 40 * * WT µl 30 TG 20 10 0 SV (Ruhe) SV (+Iso) Abbildung 4.1.2.10: Vergleich der Fläche des linksventrikulären Schlagvolumens zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen nach Training Es wird das linksventrikuläre Schlagvolumen in Ruhe und nach Isoprenalingabe (SV (Ruhe)/ SV (+Iso)) bei Plakoglobin+/-Mäusen (schwarzer Balken) und Wildtypen (weißer Balken) nach intensivem Training (Aktivitätszahl >300) dargestellt. Sternchen (*) kennzeichnen signifikante Unterschiede. (MW±SE, n= 6 (WT) und 5 (TG), Student’s T-Test) Eine weitere Folge des Trainings zeigte sich bei allen trainierten Tieren unter Isoprenalingabe in der M-Mode-Einstellung des linken Ventrikels. Hier fand sich ein erhöhter systolischer innerer Diameter des LV bei transgenen Tieren (TG: 1,12 ± 0,06 mm; WT: 0,97 ± 0,03 mm, p<0,05) und eine nahezu signifikant verringerte FS (TG: 58,87 ± 1,91 %; WT: 63,38 ± 1,11 %, p=0,051) gegenüber den Wildtypen. Das endsystolische Volumen nach Teichholz war dementsprechend bei den Plakoglobin+/-Tieren gegenüber den Wildtypen deutlich erhöht (1,95 ± 0,18 bei Wildtypen gegenüber 3,12 ± 0,42 bei transgenen Tieren, p<0,05). Aufgrund des höheren endsystolischen Volumens war auch der Auswurf des linken Ventrikels, gemessen als Ejektionsfraktion nach Teichholz geringer (92,43 ± 0,59 gegenüber 89,07 ± 1,23, p<0,05)(s. Abb. 4.1.2.11 u. 4.1.2.12). 96 4. Ergebnisse M-Mode-Darstellung des linken Ventrikels nach Isoprenalingabe Abbildung 4.1.2.11: Beispielhafte echokardiographische M-Mode-Darstellung des linken Ventrikels nach Isoprenalingabe vor und nach Training A) B) C) D) 200 % vs WT 160 120 Wildtyp vor Training Wildtyp nach Training Plakoglobin+/-Maus vor Training Plakoglobin+/-Maus nach Training WT vs. TG nach Training MMode + ISO * WT TG * * 80 40 0 FS (% ) LVEDs ESV EF nach Teichholz Abbildung 4.1.2.12: Vergleich der FS, des systolischen inneren LV-Diameters, des endsystolischen Volumens und der Ejektionsfraktion nach Teichholz des linken Ventrikels unter Isoprenalinwirkung nach Training Es wird das das fractional shortening (FS), der systolische innere Diameter (LVEDs), das endsystolische Volumen (ESV) und die Ejektionsfraktion nach Teichholz (EF nach Teichholz) nach Isoprenalingabe bei Plakoglobin+/-Mäusen (schwarz) und Wildtypen (weiß) nach Training dargestellt. Sternchen (*) kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen transgenen Mäusen und Wildtypen. (MW±SE, n= 16 (WT) und 19 (TG), Student’s T-Test) 97 4. Ergebnisse Des Weiteren entwickelte sich durch Trainingseinfluss eine verminderte Kontraktionskraft des rechten Atriums nach Isoprenalingabe bei Plakoglobin+/Mäusen, darstellbar mit Hilfe des Trikuspidaldopplers. So konnten signifikante Unterschiede in der maximalen Geschwindigkeit (76,3 ± 4,2 cm/s bei Wildtypen gegenüber 60,4 ± 4,2 cm/s bei transgenen Tieren, p<0,05), des maximalen Druckes (2,38 ± 0,26 mmHg bei Wildtypen gegenüber 1,51 ± 0,22 cm/s bei transgenen Tieren, p<0,05) und des mittleren Druckes (1,27 ± 0,14 mmHg bei Wildtypen gegenüber 0,81 ± 0,14 mmHg bei transgenen Tieren, p<0,05) im Trikuspidaldoppler festgestellt werden (s. Abb 4.1.2.13 u. 4.1.2.14). Trikuspidalfluß nach Isoprenalingabe trainierter Tiere 120 % vs WT 100 * * 80 WT TG * 60 40 20 0 TV max (cm/s) TV max PG (mmHg) TV MPG (mmHg) Abbildung 4.1.2.13: Vergleich der maximalen Geschwindigkeit, des maximalen Druckes und des mittleren Druckes im Trikuspidaldoppler unter Isoprenalinwirkung zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen nach Training Es wird die maximale Geschwindigkeit (TV max), der maximale Druck (TV max PG) und der mittlere Druck (TV MPG) im Trikuspidaldoppler nach Isoprenalingabe bei Plakoglobin+/-Mäusen (schwarzer Balken) und Wildtypen (weißer Balken) nach Training dargestellt. Sternchen (*) kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen transgenen Mäusen und Wildtypen. (MW±SE, n= 8 (WT) und 8 (TG), Student’s T-Test) 98 4. Ergebnisse Trikuspidaldoppler nach Isoprenalingabe trainierter Tiere Abbildung 4.1.2.14: Beispielhafte echokardiographische Trikuspidaldoppler-Darstellung nach Isoprenalingabe vor und nach Training A) B) C) D) Wildtyp vor Training Wildtyp nach Training Plakoglobin+/-Maus vor Training Plakoglobin+/-Maus nach Training 99 4. Ergebnisse Während der Trainingsphase wurde ein Tier besonders auffällig. Hierbei handelte es sich um eine Plakoglobin+/-Maus, die bereits vor der Trainingseinheit einen deutlich vergrößerten rechten Ventrikel zeigte, und innerhalb des Trainings auch den Anstrengungen nicht mehr gewachsen war, so dass dieses Tier vorzeitig aus dem Trainingsprogramm genommen wurde. Aber auch nach dem verkürzten 6-wöchigen Training konnte eine zusätzliche Vergrößerung des rechten Ventrikels gezeigt werden (s. Abb. 4.1.2.15 u. 4.1.2.16 u. 4.1.2.17). Fallbeispiel einer besonders stark ausgeprägten rechtsventrikulären Dilatation einer Plakoglobin+/-Maus: Abbildung 4.1.2.15: Beispielhafte echokardiographische Darstellung der Fläche des rechten Ventrikels im Vierkammerblick bei Maus-Nr.320 und Wildtyp nach Training Die diastolische rechtsventrikuläre Fläche wird durch die weiße Umrandung dargestellt A) Wildtyp nach Training B) Plakoglobin+/-Maus Nr. 320 nach Training Abbildung 4.1.2.16: Beispielhafte echokardiographische Darstellung der Fläche des rechten Ventrikels in der Längsachsenansicht bei Maus-Nr.320 und Wildtyp nach Training Die diastolische rechtsventrikuläre Fläche wird durch die weiße Umrandung dargestellt A) Wildtyp nach Training B) Plakoglobin+/-Maus Nr. 320 nach Training 100 4. Ergebnisse Mit Hilfe eines Kleintier-Positronen-Emissions-Tomographen konnten folgende Bilder derselben Maus in der Medizinischen Klinik und Poliklinik für Nuklearmedizin des Universitätsklinikum Münster unter der Leitung von Prof. Dr. Michael Schäfers von MTA Christine Bätza erstellt werden: Abbildung 4.1.2.17: PET Darstellung der Herzen von Maus-Nr.320 und eines Wildtyps vor und nach Training A) B) C) D) Wildtyp vor Training Wildtyp nach Training Plakoglobin+/-Maus Nr. 320 vor Training Plakoglobin+/-Maus Nr. 320 nach Training 101 4. Ergebnisse 4.2 Elektrokardiogramm 4.2.1 Oberflächenelektrokardiogramm Zur Erstellung der Oberflächen-EKG wurden Plakoglobin+/-Mäuse und Wildtypen in unterschiedlichen Altersgruppen untersucht. Es wurden dabei verschiedene Injektionsnarkotika (Diazepam, Ketamin/Xylazin und Urethan) als auch ein Inhalationsnarkotikum (Isofluran) verwendet (s. Tab. 3.8). Es wurden dabei unabhängig von den verschiedenen Narkotika keine signifikanten Unterschiede zwischen den Plakoglobin+/-Tieren und den Wildtypen festgestellt. Einzelne Untersuchungsergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammenfassend dargestellt. Tabelle 4.2.1: Oberflächen-EKG-Ergebnisse ausgewählter Parameter von 9 bis 15 Wochen und über 38 Wochen alten Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen unter Diazepamsedation Die Werte werden angegeben als Mittelwert ± Standardfehler. (n= 9-15 Wo: 11 (WT) und 12 (TG), >38 Wo: 13 (WT) und 16 (TG)) RR-Intervall (ms) PQ-Intervall (ms) QRS-Intervall (ms) QT-Intervall (ms) 9-15 Wochen WT TG 134 ± 6 129 ± 4 36 ± 0,5 35 ± 0,6 17 ± 0,4 18 ± 1,0 99 ± 6 94 ± 6 102 >38 Wochen WT TG 117 ± 33 135 ± 34 37 ± 10 33 ± 8 14 ± 3,9 14 ± 3,6 57 ± 16 65 ± 16 4. Ergebnisse Bei den trainierten Plakoglobin+/-Mäusen zeigte sich eine vermehrte, wenn auch nicht signifikante Anzahl der R´-Zacken in der 2. Brustwandableitung (V2) (bei den Wildtypen 1,86 ± 0,14 R´-Zacken gegenüber 2,42 ± 0,27 bei den transgenen Tieren, s. Abb. 4.2.1). Diese Entwicklung zeigte sich bei keiner anderen Versuchsgruppe, weder bei jungen noch bei älteren Tieren. Abbildung 4.2.1: Vergleich der ersten beiden Brustwandableitungen (V1, V2) bei Plakoglobin+/Mäusen und Wildtypen vor und nach Training (repräsentative EKGs) Die unterschiedliche Anzahl der R´Zacken ist mit den Pfeilen angedeutet. A) B) C) D) Wildtyp vor Training Wildtyp nach Training Plakoglobin+/-Maus vor Training Plakoglobin+/-Maus nach Training 103 4. Ergebnisse 4.2.2 Telemetrisches Elektrokardiogramm Bei den telemetrierten Mäusen herrschte sowohl unter Ruhe, bei Belastung als auch eine Stunde nach Belastung bei beiden Genotypen vorwiegend ein Sinusrhythmus. Allerdings traten eine Stunde nach Belastung vor allem bei transgenen Tieren eine oder mehrere ventrikuläre Extrasystolen auf. Dieses Ergebnis war unabhängig von der Züchtung (sowohl bei 129/SV als auch C57Bl/6) und wurde vorwiegend bei den männlichen Tieren beobachtet (s. Abb. 4.2.2.1, 4.2.2.2 und 4.2.2.3). VES nach Airjet-Belastung keine VES VES Anzahl der Tiere mit VES 18 16 * 14 12 10 8 6 4 2 0 WT TG Abbildung 4.2.2.1: Vergleich der spontanen ventrikulären Extrasystolen zwischen Wildtypen und Plakoglobin+/-Mäusen nach einer Airjet-Belastung Es wird das Verhältnis zwischen dem Vorkommen von spontanen ventrikulären Extrasystolen (VES, schwarzer Balken) gegenüber Tieren ohne Arrhythmie (weißer Balken) Wildtypen (WT) und Plakoglobin+/-Mäusen (TG) eine Stunde nach AirjetBelastung dargestellt. Sternchen(*) kennzeichnen signifikante Unterschiede gegenüber den Wildtypen. (Fisher´s exact Test und Chi square Test) 104 4. Ergebnisse Anzahl der Tiere mit VES VES nach Airjet-Belastung 12 10 * keine VES VES 8 * * 6 4 2 0 WT TG 129SV WT TG C57Bl/6 WT TG männl Abbildung 4.2.2.2: Vergleich der spontanen ventrikulären Extrasystolen zwischen Wildtypen und Plakoglobin+/-Mäusen bei den verschiedenen Züchtungen und bei männlichen Tieren nach einer Airjet-Belastung Es wird das Verhältnis zwischen dem Vorkommen von spontanen ventrikulären Extrasystolen (VES, schwarzer Balken) gegenüber Tieren ohne Arrhythmie (weißer Balken) bei Wildtypen (WT) und Plakoglobin+/-Mäusen (TG) in den verschiedenen Züchtungen (129/SV und C57Bl/6) und bei den männlichen Tieren eine Stunde nach einer Airjet-Belastung dargestellt. Sternchen(*) kennzeichnen signifikante Unterschiede gegenüber den Wildtypen. (Fisher´s exact Test und Chi square Test) Abbildung 4.2.2.3: Repräsentatives telemetrisches EKG einer Plakoglobin+/-Maus nach einer Airjet-Belastung Die Abbildung zeigt ein typisches EKG einer männlichen Plakoglobin+/-Maus (C57Bl/6) mit einem regelmäßigem Sinusrhythmus, der von einer ventrikulären Extrasystole (*) unterbrochen wird, 11 Minuten nach einer Airjet-Belastung. 105 4. Ergebnisse Zusätzlich konnte bei den C57Bl/6 Tieren ein signifikanter Unterschied im Vorkommen von ventrikulären Extrasystolen bei einer Airjet-Belastung zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen gezeigt werden (s. Abb. 4.2.2.4 und 4.2.2.5). Anzahl der Tiere mit VES VES unter Airjet-Belastung 9 keine VES VES 8 7 * 6 5 4 3 2 1 0 WT TG Abbildung 4.2.2.4: Vergleich der spontanen ventrikulären Extrasystolen zwischen Wildtypen und Plakoglobin+/-Mäusen bei der C57Bl/6-Züchtung während einer AirjetBelastung Es wird das Verhältnis zwischen dem Vorkommen von spontanen ventrikulären Extrasystolen (VES, schwarzer Balken) gegenüber Tieren ohne Arrhythmie (weißer Balken) bei Wildtypen (WT) und Plakoglobin+/-Mäusen (TG) bei der C57Bl/6-Züchtung während einer Airjet-Belastung dargestellt. Sternchen (*) kennzeichnen signifikante Unterschiede gegenüber den Wildtypen. (Fisher´s exact Test und Chi square Test) Abbildung 4.2.2.5: Repräsentatives telemetrisches EKG einer Plakoglobin+/-Maus während einer Airjet-Belastung Die Abbildung zeigt ein typisches EKG einer Plakoglobin+/-Maus (C57Bl/6) mit einem regelmäßigem Sinusrhythmus, der von einer ventrikulären Extrasystole (*) unterbrochen wird, während einer Airjet-Belastung. 106 4. Ergebnisse Bei den männlichen Tieren fiel ein vermehrtes Vorkommen von atrialen Extrasystolen unter Ruhe auf (s. Abb. 4.2.2.6 und 4.2.2.7). Anzahl der Tiere mit ES (n) 12 ES bei Ruhe 10 keine ES * ES 8 6 4 2 0 WT TG Abbildung 4.2.2.6: Vergleich der spontanen atrialen Extrasystolen zwischen Wildtypen und Plakoglobin+/-Mäusen bei den männlichen Tieren bei normaler Aktivität (Ruhe) Es wird das Verhältnis zwischen dem Vorkommen von spontanen atrialen Extrasystolen (ES, schwarzer Balken) gegenüber Tieren ohne Arrhythmie (weißer Balken) bei Wildtypen (WT) und Plakoglobin+/-Mäusen (TG) bei den männlichen Tieren bei normaler Aktivität (Ruhe) dargestellt. Sternchen (*) kennzeichnen signifikante Unterschiede gegenüber den Wildtypen. (Fisher´s exact Test und Chi square Test) Abbildung 4.2.2.7: Repräsentatives telemetrisches EKG einer Plakoglobin+/-Maus bei normaler Aktivität (Ruhe) Die Abbildung zeigt ein typisches EKG einer Plakoglobin+/-Maus (129/SV) mit einem regelmäßigem Sinusrhythmus, der von einer atrialen Extrasystole (*) unterbrochen wird. 107 4. Ergebnisse Es traten vereinzelt auch AV-Blöcke, tachykarde und bradykarde Phasen bei beiden Genotypen besonders in der ersten Stunde nach einer Belastung auf. Unterschiede in der Herzfrequenz zeigten sich in den verschiedenen Altersgruppen jedoch nicht. Bei den trainierten Plakoglobin+/-Mäusen entwickelte sich jedoch eine erhöhte minimale Herzfrequenz (285 ± 4 für Wildtypen, 393 ± 16 Schläge pro Minute für Plakoglobin+/-Mäuse, p<0,05) bei normaler Aktivität (Ruhe). Die maximal erreichte Herzfrequenz (für Wildtypen 847 ± 30, für transgene Tiere 840 ± 31 Schläge pro Minute) und der Mittelwert (492 ± 7, 534 ± 13 Schläge pro Minute) unterschieden sich nicht (s. Abb. 4.2.2.8). Ansonsten konnte keine Herzfrequenzvariabilität zwischen den Genotypen, weder bei Belastung, noch eine Stunde nach Belastung, in der Trainingsgruppe ermittelt werden. In der altersabhängigen Untersuchungsstudie zeigten sich ebenso keine Unterschiede in Herzfrequenz (Schläge/min) der Herzfrequenz. 900 800 700 600 500 400 Normale Aktivität nach Training WT TG * 300 200 100 0 Minimum Mittelwert Maximum Abbildung 4.2.2.8: Herzfrequenzvergleich zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen bei normaler Aktivität (Ruhe) nach Training Es wird die minimale, die durchschnittliche und die maximale Herzfrequenz für trainierte Plakoglobin+/-Mäuse (schwarze Balken) und trainierte Wildtypen (weiße Balken) während normaler Aktivität (Ruhe) dargestellt. Sternchen (*) kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen transgenen Mäusen und Wildtypen. Signifikant unterschiedlich ist die minimale Herzfrequenz. (MW±SE, n= 6 (WT) und 6 (TG), Student’s T-Test) 108 4. Ergebnisse 4.3 Implantation von sympathomimetisch-wirksamen Pumpen In der ersten Versuchsgruppe wurden osmotische Pumpen implantiert, die 3 mg/kg/d Isoprenalin über einen Zeitraum von sieben Tagen freisetzten. In dieser Gruppe konnte weder vorher, noch nach der 7-tägigen Belastung ein Unterschied mit Hilfe der Echokardiographie und des Oberflächenelektrokardiogramms zwischen den Genotypen festgestellt werden. Bei der Darstellung mit Hilfe des telemetrischen Elektrokardiogramms konnte bei einer Plakoglobin+/-Maus in den ersten 45 Minuten nach Implantation und einen Tag später jeweils eine ventrikuläre Tachykardie gezeigt werden (s. Abb. 4.3.1). Abbildung 4.3.1: Ventrikuläre Tachykardie bei einer Plakoglobin+/-Maus einen Tag nach Implantation einer osmotischen Pumpe, die 3mg/kg/d Isoprenalin freisetzt Bei einem Wildtyp trat ebenso eine ventrikuläre Tachykardie ca. 50 Minuten nach Implantation auf. Das EKG-Bild einer anderen Plakoglobin+/-Maus veränderte sich drei Stunden nach Implantation deutlich. Das QT-Intervall war verlägert, die T-Welle war invertiert und die P-Welle nicht mehr identifizierbar (s. Abb. 4.3.2). Diese Veränderung zeigte sich bei den späteren Aufzeichnungen nicht mehr. 109 4. Ergebnisse Abbildung 4.3.2: QRS-Morphologie nach Implantation einer Isoprenalin-freisetzenden Pumpe bei einer Plakoglobin+/-Maus A B 1,5h nach Implantation sind die P-Wellen noch deutlich sichtbar 3h nach Implantation ist das QT-Intervall verlängert und die T-Welle invertiert Ventrikuläre und atriale Extrasystolen, AV-Blöcke, tachykarde und bradykarde Phasen wurden bei beiden Genotypen registriert. 110 4. Ergebnisse In der zweiten Versuchgruppe wurde die Dosis des Isoprenalins auf 30 mg/kg/d erhöht und zusätzlich Phenylephrin in der gleichen Dosierung beigefügt. Alle Tiere der Versuchgruppe starben innerhalb der ersten 16 Stunden nach Implantation, jedoch verstarben die transgenen Tiere (ca. 7 ½ h und 10 h nach Implantation) deutlich vor den Wildtypen (ca. 11 ¾ h und 16 h nach Implantation). Bei einer transgenen Maus führte die Implantation nach zehn Stunden zu einer Ruptur des linken Ventrikels (s. Abb. 4.3.3). Abbildung 4.3.3: Rupturierter linker Ventrikel nach Implantation einer osmotisch wirksamen Isoprenalin-Phenylephrin-Pumpe bei einer transgenen Maus 111 4. Ergebnisse 4.4 Elektrophysiologische Untersuchung an isolierten Herzen Bei den von Daniela Volkery und Nina Kreienkamp durchgeführten Untersuchungen am isolierten Herzen mit Hilfe einer Langendorff-Apparatur ergaben sich keine Unterschiede in der Aktionspotentialsdauer zwischen den Genotypen. Jedoch zeigten sich vermehrt spontane Arrhythmien bei den über 42 Wochen alten Plakoglobin+/-Mäusen und bei den trainierten transgenen Tieren gegenüber den Wildtypen (s. Abb. 4.4.1 u. 4.4.2). Spontane Ventrikuläre Tachykardien Anzahl der Herzen mit VT 18 16 14 keine VT VT * * 12 10 8 6 4 2 0 WT (trainiert + alt) Plako +/- trainiert Plako +/- alt Abbildung 4.4.1: Vergleich der spontanen ventrikulären Tachykardien zwischen Wildtypen, trainierten und über 42 Wochen alten Plakoglobin+/-Mäusen Es wird das Verhältnis zwischen dem Vorkommen von spontanen ventrikulären Tachykardien (VT, schwarzer Balken) gegenüber Herzen ohne Arrhythmien (weißer Balken) in folgenden verschiedenen Versuchsgruppen dargestellt: Trainierte und über 42 Wochen alte Wildtypen (WT (trainiert + alt)), trainierte Plakoglobin+/-Mäuse (Plako +/trainiert) und über 42 Wochen alte Plakoglobin+/-Mäusen (Plako +/- alt). Sternchen (*) kennzeichnen signifikante Unterschiede gegenüber den Wildtypen. (Fisher´s exact Test und Chi square Test) 112 4. Ergebnisse Bei den trainierten Wildtypen zeigten zwei von neun Tieren spontane Arrhythmien, dem gegenüber standen sieben von 13 trainierte Plakoglobin+/-Mäuse mit einer ventrikulären Tachykardie. Bei den älteren Tieren erhöhte sich der Anteil der Tiere, die Arrhythmien zeigten, auf acht von 13 bei den transgenen Tieren, gegenüber eins von sieben bei den Wildtypen. Abbildung 4.4.2: Spontane ventrikuläre Tachykardie im monophasischen Aktionspotential und im Elektrokardiogramm eines Plakoglobin+/-Herzens in der Langendorff-Apparatur MAP: monophasisches Aktionspotential, EKG: Elektrokardiogramm In den Plakoglobin+/-Herzen hatten die Arrhythmien ihren Ursprung in der rechtsventrikulären freien Wand (n=6 Herzen) oder im Septum (n=11 Herzen), nicht jedoch in der linksventrikulären Wand. Demgegenüber entsprangen die spontanen Arrhythmien der Wildtypen mit gleichen Anteilen aus den drei verschiedenen Aufzeichnungslokalisationen (s. Abb. 4.4.3). 113 4. Ergebnisse Anzahl der Herzen (n) 12 Ursprung der spontanen Arrhythmien 10 8 6 WT TG 4 2 0 LV Septum RV Abbildung 4.4.3: Vergleich der Ursprungslokalisationen der spontanen Arrhythmien zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen Es wird die Verteilung der verschiedenen Ursprungsorte (LV, Septum und RV) der spontanen Arrhythmien im Vergleich zwischen den Plakoglobin+/-Mäusen (schwarze Balken) und den Wildtypen (weiße Balken) dargestellt. LV: Linksventrikuläre freie Wand, RV: Rechtsventrikuläre freie Wand Die rechtsventrikulären Überleitungszeiten waren in den älteren Plakoglobin+/Herzen während des endokardialen Pacings verlängert (Wildtypen: 3,11 ± 0,33 ms, Plakoglobin+/-Mäuse: 5,27 ± 0,8 ms; p<0,05), während die linksventrikulären Zeiten keinen Unterschied aufwiesen. Eine ähnliche Zunahme der rechtsventrikulären, nicht aber der linksventrikulären Überleitungszeiten, zeigte sich bei den trainierten Plakoglobin+/-Herzen (Wildtypen: 3,21 ± 0,32 ms, Plakoglobin+/-Mäuse: 5,0 ± 0,61 ms; p<0,05) (s. Abb. 4.4.4). 114 4. Ergebnisse Rechtsventrikuläre Überleitungszeiten rechtsventrikuläre Überleitungszeit (ms) 7 6 WT 5 TG * * 4 3 2 1 0 jung trainiert alt Abbildung 4.4.4: Vergleich der rechtsventrikulären Überleitungszeiten zwischen Plakoglobin+/Mäusen und Wildtypen Es sind die rechtsventrikulären Überleitungszeiten beim endokardialen Pacing in den verschiedenen Versuchgruppen (jung, trainiert und alt) der Plakoglobin+/-Herzen (schwarze Balken) und der Wildtypherzen (weiße Balken) dargestellt. (MW±SE, n= jung: 14 (WT) und 9 (TG), trainiert: 14 (WT) und 15 (TG), alt: 7 (WT) und 10 (TG), Student’s T-Test) Die pathologische Ausprägung dieses Erkrankungsbildes zeigt sich somit vor allem im Alter, und kann durch Training akzeleriert werden. Diese Ergebnisse decken sich mit denen der Echokardiographie. 115 4. Ergebnisse 4.5 Histologische Untersuchung Die Durchmesser der Kardiomyozyten wiesen keine signifikanten Unterschiede zwischen den Herzen der Wildtypen und der Plakoglobin+/-Mäuse (untrainiert/ jung, untrainiert/ alt und trainert/ jung) auf (s. Tab. 4.5). Ebenso zeigte sich kein vermehrtes Vorkommen von fibrös-fettigem Ersatzgewebes im rechtsventrikulären Myokard der Plakoglobin+/-Herzen im Vergleich zu den Wildtypen. Tabelle 4.5: Durchmesser der Kardiomyozyten in den Herzen von Plakoglobin+/-Tieren und Wildtypen Die Kardiomyozytengröße unterschied sich nicht bei den verschiedenen Genotypen. Weder Alter noch Trainingszustand wirkten sich in einem Größenunterschied aus. Wildtypen Plakoglobin +/- Rechter Ventrikel Linker Ventrikel Rechter Ventrikel Linker Ventrikel Untrainiert, 16-32 Wochen (µm) 11,3 ± 0,7 14,4 ± 1,2 10,4 ± 1,1 14,1 ± 1,5 Untrainert, >42 Wochen (µm) 10,6 ± 0,7 15,1 ± 1,2 10,7 ± 0,5 13,2 ± 0,9 Trainiert, 32 Wochen (µm) 10,6 ± 1,0 14,6 ± 0,9 11,7 ± 2,5 14,2 ± 1,0 116 5. Diskussion 5. Diskussion 5.1 Methodik Durch die Untersuchung heterozygot Plakoglobin-defizienter Mäuse konnte hier erstmals die funktionelle Bedeutung von Plakoglobin für die Entstehung einer ARVC gezeigt werden. Die elektrophysiologischen und funktionellen In-vivo-Auswirkungen der heterozygoten Plakoglobin-Defizienz wurden in der vorliegenden Arbeit mit Hilfe von elektro- und echokardiographischen Untersuchungen in vivo näher charakterisiert. 5.1.1 Mausmodell Aufgrund der strukturellen und elektrophysiologischen Unterschiede zwischen Maus und Mensch sollten Ergebnisse, die mit einem Mausmodell erarbeitet wurden, mit Vorsicht interpretiert werden (LONDON 2001, LONDON et al. 2003). Trotzdem ermöglichen sie ein erweitertes Veständnis von verschiedenen Erkrankungen (LONDON 2004) und können als Grundlage genutzt werden, um neue Hypothesen für humane Erkrankungen zu erarbeiten (GERULL et al. 2004). Ebenso werden entdeckte Genmutationen bei vorliegenden Erkrankungen genutzt, um Mausmodelle zu entwickeln, die die Entdeckungen stützen und/oder erweitern (GERULL et al. 2004). Allerdings handelt es sich bei den Mausmodellen häufig nur um eine bestimmte Genmutation, wohingegen ein Erkrankungsbild durchaus von verschiedenen Mutationslokalisationen ausgelöst werden kann (GERULL et al. 2004). Zudem kann es bei einer Mutation vorkommen, dass die Penetranz des Erkankungsbildes unterschiedlich ist (GERULL et al. 2004). Selbst bei einer gleichen Mutationslokalisation kann eine unterschiedliche phänotypische Ausprägung zwischen Individuen vorliegen (SYRRIS et al. 2006). So liegt auch eine unterschiedlich starke Ausprägung des Phänotyps zwischen der Naxos disease gegenüber der Mutation in diesem Mausmodell vor, auch wenn in beiden Fällen eine Veränderung im Plakoglobingen präsent ist (siehe auch S.17). Ebenso sind einige 117 5. Diskussion Symptome in der Naxos disease vorhanden, welche in diesem Mausmodell nicht dokumentiert werden konnten (Hyperkeratose, wolliges Haar und fibrös-fettiges Ersatzgewebe im Herzen). In dem kardiokutanen Syndrom bei Poll Hereford Rindern ist neben dem sehr ähnlichen Symptombild zur Naxos disease allerdings auch keine fettige Infiltration nachweisbar, so dass ein Artenunterschied immer berücksichtigt werden muss. Weitere Einschränkungen konnten im Vergleich von polymorphen ventrikulären Tachyarrhythmien entdeckt werden. So konnte JERON et al. (2000) diese Form der Arrhythmien nicht in Kontrollmäusen erzeugen. Diese Arrhythmieform kommt sehr wohl aber in gesunden Menschenherzen bei einem maximalen Stimulationsprotokoll vor, welches Isoprenalin enthält (JERON et al. 2000). Trotzdem werden transgene Mausmodelle häufig genutzt, um zum Beispiel kardiale Arrhythmien zu erforschen, da eine einfache Manipulierbarkeit des Mausgenoms möglich ist (LONDON 2001). So bleibt das transgene Mausmodell trotz der genannten Einschränkungen ein hervorragendes Instrument zur Erforschung von grundlegenden Mechanismen, denen auch das Herz anderer Arten unterliegt (LONDON 2001). In anderen Mausmodellen, die zur Erforschung der ARVC genutzt wurden (mit Veränderungen im Plakoglobin-, Plakophilin-2-, Desmoplakin- und Desmoglein2Gen), wurden vor allem die pathologischen Veränderungen in der Embryologie homozygoter Mäuse untersucht (RUIZ et al. 1996, GROSSMANN et al. 2004, GALLICANO et al. 1998, ESHKIND et al. 2002). ARVC-Veränderungen im Alter oder aufgrund einer sympathischen Stimulation (Training, Isoprenalin-Injektion) wurden an einem Mausmodell meines Wissen noch nicht erforscht. 5.1.2 Echokardiographie Die transthorakale Echokardiographie ist eine nichtinvasive Untersuchungsmethode, die eine morphologische als auch funktionelle Charakterisierung des kardialen Phänotyps von Mäusen ermöglicht (TANAKA et al. 1996). Linksventrikuläre Parameter wurden bei der transthorakalen Echokardiographie bereits ausgiebig beschrieben. So konnte man zuverlässig Veränderungen im linken Ventrikel, vor 118 5. Diskussion allem Kammergröße, Wanddicken, Masse und Funktion in vivo feststellen. Die Masse des Ventrikels kann dabei nach einer Formel berechnet werden (MANNING et al. 1994; GARDIN et al. 1995). Es können Motion (M)-Modes von der parasternalen kurzen und langen Achse angefertigt werden, um die Wanddicken und Ventrikeldurchmesser zu bestimmen. Mit einem nach apikal angenähertem Winkel von der parasternalen Längsachse ausgehend, kann im gepulsten Doppler das Maximum des Aortenflusses und des Mitralflusses bestimmt werden (TANAKA et al. 1996; STYPMANN et al. 2002). Die echokardiographische Vermessung des rechten Ventrikels wurde bei Mäusen bisher nur transösophageal durchgeführt (SCHERRERCROSBIE et al. 1998). Die transthorakale Echokardiographie zur Vermessung des rechten Ventrikels ist aber beim adulten und neugeborenen Menschen bereits beschrieben (FOALE et al. 1986; CLARK et al. 2002). Beim Menschen werden sieben Einstellungen (nach FOALE et al. 1986) in der 2D-Echokardiographie zur Untersuchung der ARVC-Patienten durchgeführt. In dieser Arbeit wurden die Einstellungen geringfügig modifiziert und auf sechs Schnitte beschränkt, um den Besonderheiten des kleinen Mäuseherzens gerecht zu werden, da einige Ansichten nicht mit einer genügenden Reproduzierbarkeit darstellbar waren. So wurden z.B. der subcostale Vierkammerblick sowie die rechtsventrikuläre Ausflusstraktansicht, die bereits beim adulten Menschen nur in einem geringen Maße reproduzierbar waren (FOALE et al. 1986), in dieser Studie nicht verwendet. Es wurden vor allem Messwerte genutzt, die auch beim Menschen eine geringe Variabilität der Messungen bei einem Untersucher ergaben (FOALE et al. 1986). Zusätzlich wurden rechtsventrikuläre verschiedenen Flächen Ansichten in drei sind Standardschnitten nötig zur zuverlässigen vermessen. Feststellung Diese von Kammergröße (Länge und Breite) sowie der Breite des Einfluss- und Ausflusstraktes, sowohl beim Menschen als auch bei der Maus. In dieser Arbeit wurden die Kammergrößen beider Ventrikel in der Diastole und die Breite der links- und rechtsventrikulären Ausflusstrakte sowie der linke Vorhof und der Aortendurchmesser präsystolisch bei der jeweils größten Ausdehnung vermessen. Es wurden nur Darstellungen in die Auswertung einbezogen, in denen die zu messenden Strukturen deutlich erkennbar waren. 119 5. Diskussion Im modifizierten apikalen Vierkammerblick wurde der Dopplerstrahl durch die Trikuspidalklappe gelegt. Eine gepulste Dopplermessung des Trikuspidalflusses wurde bereits bei neugeborenen bis juvenilen Mäusen in der Literatur beschrieben (ZHOU et al. 2003). Für die echokardiographischen Studien in der vorliegenden Arbeit wurde für die Sedierung der meisten Mäuse Diazepam, in einigen Fällen aber auch eine Inhalationsnarkose mit Isofluran, verwendet. Neben dem vergleichsweise geringen Einfluss auf die Herztätigkeit sind auch die Ergebnisse bei einer Isoflurannarkose im Gegensatz zur Injektionsanästhesie besser reproduzierbar. Die Isoflurannarkose ist somit auch Mittel der Wahl für die echokardiographische Untersuchung der Maus im Vergleich mit einem Ketamin/Xylazin-Gemisch, einem Ketamin/Midazolam-Gemisch, einer Halothannarkose und Tribromoethanol (CHAVES et al. 2001; ROTH et al. 2002). Der inotrope Effekt von Diazepam in vitro wurde unterschiedlich diskutiert. NONAKA et al. (1997) beschrieb einen negativ inotropen Effekt, indem Diazepam die Herzfrequenz und den Ca2+-Transienten (dynamischer intrazellulärer KalziumGehalt) herabsetzt. Demgegenüber entdeckte GIJON et al. (1988) einen positiv inotropen Effekt von Diazepam und einen erhöhten Kalziumeinstrom, sowie einen verringerten Natriumeinstrom bei auriculären Herzmuskelzellen. Bei unseren Untersuchungen zeigte sich die durchschnittliche Herzfrequenz bei einer Sedierung mit Diazepam (463 ± 15), gegenüber der Herzfrequenz bei einer Isoflurannarkose mit 438 ± 45 Schlägen/min (JANSSEN et al. 2004) oder der stressbedingten erhöhten Herzfrequenz bei einer echokardiographischen Untersuchung ohne eine vorherige Sedation (712 ± 6) am nächsten der Herzfrequenz von sich frei bewegenden Mäusen ohne Narkose (504 ± 15). Daher wurde in dieser Arbeit unter Abwägung der Vor- und Nachteile hauptsächlich eine Diazepamsedation für die echokardiographische Untersuchung verwendet. 5.1.3 EKG-Aufzeichnung Für die elektrokardiographischen Untersuchungen wurde ein 12-Kanal-OberflächenEKG von sedierten sowie EKGs mit einer Ableitung von sich frei bewegenden Mäusen erstellt. Vor- und Nachteile dieser Methode werden im Folgenden 120 5. Diskussion beschrieben. Die Durchführung des Oberflächen-EKGs ist nicht invasiv und aufgrund der sedierungsbedingten reduzierten Muskelaktivität nahezu artefaktfrei. Sie ist durch die sechs Extremitäten-Ableitungen und die sechs Brustwand-Ableitungen gut charakterisiert. Der Einsatz von verschiedenen Anästhetika beeinflusst die normale Herzaktivität. Die Wahl des Anästhetikums an sich kann schon Einfluss auf die zu gewinnenden Ergebnisse nehmen (CHAVES et al. 2003). Daher wurden in dieser Arbeit verschiedene Anästhetika verwendet: Diazepam, Ketamin/Xylazin, Urethan und Isofluran (Injektions- und Inhalationsanästhetika). Eine Sedierung mit Diazepam führt nicht zu einer tiefen Anästhesie und ist somit näher an der normalen Herzaktivität. Demgegenüber wirkt eine Anästhesie mit der Kombination von Ketamin und Xylazin kardiodepressiv, und die Herzfrequenz sinkt deutlich (ROTH et al. 2002). Deutlich höhere Herzfrequenzen und eine sehr tiefe Narkose, aus der die Tiere nur schlecht wieder erwachen, verursacht Urethan. Somit wurde dieses Injektionsanästhetikums nur für Terminalversuche verwendet. Nachdem das EKG geschrieben wurde, wurde das Herz für weitere Versuche entnommen. Der Einfluss von Anästhetika wird beim telemetrischen EKG ausgeschaltet. Hierbei werden physiologische EKGs von sich frei bewegenden Tieren aufgezeichnet (KRAMER et al. 1993). Analog zum Belastungs-EKG beim Menschen, kann die EKG-Aktivität in Ruhe und unter Belastung bei der Anwendung von definierten physiologischen Belastungsprotokollen aufgezeichnet werden. Aufgrund der invasiven Prozedur bei der Implantation des Transmitters verlieren die Mäuse nach der Operation zunächst an Gewicht und brauchen einige Tage, um sich vollständig zu erholen. Des Weiteren können auch Druck-/Volumenveränderungen im Brustkorb durch das Transmittervolumen entstehen und dadurch die Herztätigkeit beeinflussen. Die Methode ist jedoch für experimentelle Untersuchungen an Mäusen etabliert und validiert (KRAMER et al. 2003). Zur Nutzung der verschiedenen Vorteile und zur gegenseitigen Kontrolle der Oberflächen- und telemetrischen EKGs wurden beide Methoden kombiniert. 121 5. Diskussion 5.1.4 Gabe von Sympathomimetika Isoprenalin wirkt als β-Sympathomimetikum sowohl positiv chronotrop als auch positiv inotrop (OUEDRAOGO et al. 1997). Es koppelt an den adrenergen Rezeptor, so dass die stimulierende Untereinheit eines Gs-Proteins die Adenylatcyclaseaktivität erhöht. Dadurch erhöht Isoprenalin die cAMP-Konzentration und aktiviert darüber die Proteinkinase A, die dann Zielproteine (bspw. Ca2+-Kanäle) phosphoryliert. Diese Reaktionskette erhöht die intrazelluläre Kalziumkonzentration. Dieser Effekt wurde durch eine Isoprenalingabe während der echokardiographischen Untersuchung, sowie bei sich frei bewegenden Tieren, bei denen mit Hilfe der Telemetrie kontinuierlich ein EKG aufgezeichnet werden konnte, über eine osmotische Pumpe nachgeahmt. Körperliches Training, wie das angewandte Ausdauerschwimmtraining, bewirkt eine physiologische Sympathikusstimulierung. WICHTER et al. (2000) zeigten, dass bei Patienten mit ARVC die β-adrenerge Rezeptorendichte reduziert war. Dies ließe auf einen Zusammenhang von Ausdauertraining, verringerter β-Rezeptorendichte (aufgrund eines trainingsbedingten zeitweise erhöhten Sympathikotonus) und einer verringerten Ansprechbarkeit auf Isoprenalin (im Bezug auf die Kontraktionskraft) schließen bzw. eine entstehende autonome Dysbalance nach β1-Stimulation erklären. In einer zweiten Versuchsgruppe wurde Phenylephrin in einem 1:1 Verhältnis mit Isoprenalin gemischt und über eine osmotische Pumpe bei Mäusen in der Telemetrie freigesetzt. Phenylephrin zählt zu den α1-Sympathomimetika und bewirkt an der Gefäßmuskulatur eine Kontraktion. Hier aktiviert es rezeptorvermittelt ein Gq-Protein und reguliert darüber die Phospholipase C, die ein Substrat aus der Plasmamembran hydrolytisch in IP3 (Inositoltrisphosphat) und DAG (Diacylglycerol) spaltet. IP3 erhöht die zelluläre Kalziumkonzentration, indem es über einen Rezeptor die verstärkte Öffnung von Kalziumkanälen des sarkoplasmatischen Retikulums bewirkt. Vier Kalzium-Ionen binden an vier Stellen an Calmodulin und formen so einen KalziumCalmodulin-Komplex, der wiederum an eine inaktiven Myosinkinase (light chain) andockt. Die gesamte Verbindung reagiert nun als Holoenzym und katalysiert die Phosphorylation von Myosin. Myosin-P interagiert mit Aktin und löst darüber eine 122 5. Diskussion Kontraktion aus. DAG erhöht die MAPK-Konzentration, die verschiedene Zielproteine phosphoryliert. Dadurch vermittelt Phenylephrin einen α1-induzierten Blutdruckanstieg, der durch Konstriktion der glatten Gefäßmuskulatur verursacht wird. Die Dosierung von 30 mg/kg/d Phenylephrin und 30 mg/kg/d Isoprenalin, die in dieser Arbeit verwendet wurde, richtete sich nach den Untersuchungen von MAASS et al. (2004), die diese Dosierung bei Mäusen mit einer Mutation des kardialen Troponin T einsetzten. Bei den Versuchen von MAASS et al. (2004) verstarben alle männlichen transgenen Tiere, nicht aber die Weiblichen. In der vorliegenden Arbeit wurden nur weibliche Tiere in dieser Versuchsgruppe eingesetzt, hierbei verstarben allerdings alle Tiere innerhalb von 16 Stunden, sowohl die Transgenen als auch die Wildtypen. Die letale Wirkung zeigt sich bei den transgenen Tieren jedoch deutlich vor denen der Wildtypen. Der Tod einer Plakoglobin+/-Maus trat aufgrund einer Ventrikelruptur auf. Die Auswirkung von einem positiv inotropen und positiv chronotropen β1Sympathomimetikum bei gleichzeitig erhöhtem peripheren Widerstand, ausgelöst durch Phenylephrin, ist bei den Plakoglobin+/-Mäusen somit schneller fatal als bei den Wildtypen. Es traten Veränderungen in der EKG-Morphologie unter Einwirkung von Isoprenalin bei einer Plakoglobin+/-Maus auf. Nach einer anfänglichen Tachykardie zeigte sich eine QT-Verlängerung und einer T-Welleninversion, die später in eine eventuell auf Erschöpfung beruhende Bradykardie überging. Die P-Welle könnte durch die TWellenverbreiterung verdeckt oder aufgrund von AV-Blöcken dissoziiert sein. Die Deutung der T-Wellenverbreiterung ließe eine länger anhaltende Repolarisation zu, die wiederum bedingt sein kann durch eine inadäquate Energieversorgung der myokardialen Zellen bei einer lang anhaltenden sympathomimetischen Stimulation. Die Versorgung des linken Ventrikels über die Koronararterien ist nur in der Diastole gewährleistet. Wird bei einer positiv chronotropen Stimulation die Diastole verkürzt, so kann eine Ischämie in Bereichen des LV auftreten, die die Energieversorgung weiterhin verschlechtert. Auch eine Dilatation des dünnwandigen rechten Atriums könnte über die gleichen Bedingungen wie eine Dilatation des rechten Ventrikels 123 5. Diskussion entstehen. Solch eine Ausweitung des Vorhofes kann auch einen verringerten Trikuspidalfluss hervorrufen. 124 5. Diskussion 5.2 Versuchsergebnisse 5.2.1 Zusammenfassung Das heterozygote Vorkommen des Plakoglobin-Gens führt bei Mäusen zu einer rechtsventrikulären Dilatation im Alter. Die Dilatation kann in verschiedenen Bereichen und Einstellungen des rechten Ventrikels gemessen werden: im Ein- und Ausflusstrakt, in der Fläche/Volumen und in der Breite/Länge. Diese Entwicklung kann durch Ausdauertraining gefördert werden und steht in einem kausalen Zusammenhang zu der Trainingsintensität. Das selbstgewählte Trainingspensum unterschied sich nicht zwischen den Genotypen. Ebenso verursachte das Training eine rechtsventrikuläre Dysfunktion nach sympathomimetischer Stimulation, die sich in einem verringerten Trikuspidalfluss in der Dopplerechokardiographie ausdrückte. Körperliches Ausdauertraining führt zu einer Beschleunigung der ARVC in diesem Modell. Bei Plakoglobin+/-Mäusen mit einem hohen selbstgewählten Trainingspensum (Aktivitätszahl > 300) war die linksventrikuläre Funktion, sowohl in Ruhe als auch nach Isoprenalingabe, gemessen als Schlagvolumen, vermindert. Abgesehen von dieser Veränderung zeigte sich keine weitere linksventrikuläre Funktionsbeeinträchtigung bei den Plakoglobin+/-Mäusen gegenüber den Wildtypen. Rassenunabhängig traten bei den Plakoglobin+/-Mäusen vermehrt ventrikuläre Extrasystolen nach einer Belastung auf. Es zeigte sich ein geschlechtsspezifischer Unterschied. Männliche Tiere waren stärker betroffen von dieser Arrhythmieform. Versuche am isolierten Herzen korrelierten mit den morphologischen Veränderungen und bestätigten somit die Resultate der echokardiographischen Untersuchungen. So entwickelten vor allem ältere und trainierte Tiere spontane Arrhythmien mit rechtsventrikulären Ursprung und eine Verlängerung der rechtsventrikulären Überleitungszeiten. In den histologischen Untersuchungen zeigte sich weder eine kardiomyozytäre Hypertrophie, noch ein fibrös-fettiges Ersatzgewebe bei den Plakoglobin+/-Mäusen. In den elektrophysiologischen Untersuchungen sedierter Mäuse waren keine signifikanten Unterschiede in den EKGs erkennbar. In einer der rechtsventrikulären 125 5. Diskussion Brustwandableitungen (V2) ließ sich ein vermehrtes Vorkommen von R´Zacken bei trainierten Tieren vermuten. 5.2.2 Rechtsventrikuläre Dilatation Die Ursache der einseitigen Dilatation des rechten Ventrikels ist wahrscheinlich die starke passive Dehnungsbelastung des rechten Ventrikels im Gegensatz zu dem linken Ventrikel. Die besondere Betroffenheit des rechten Ventrikels bei der ARVC ist bislang noch nicht vollständig verstanden. Möglicherweise sterben myokardiale Zellen aufgrund einer Apoptose (MALLAT et al. 1996; VALENTE et al. 1998). Ein Defekt innerhalb des Zelladhäsionskomplexes würde beide Aspekte kombinieren. Der rechte Ventrikel hat eine relativ dünnere Wand und ist anfälliger bei steigender Wandbelastung (FIFER u. GROSSMAN 1986). Eine vermehrte Beanspruchung der Wand bei myokardialen Zellen, die einen Zelladhäsionsdefekt haben, kann zu einer Zelltrennung führen (McKOY et al. 2000). Vorherige Studien über die ARVC zeigten Veränderungen in der Zell-Zell-Verbindung, vor allem in Desmosomen und Adherens Junctions (GUIRAUDON 1989; RONCALI et al. 1989). Plakoglobin scheint ein essentieller Bestandteil der myokardialen Desmosomen zu sein, sowie unabdingbar in der Architektur der Intercalated Discs und der Stabilität des Herzgewebes und demzufolge auch der Herzfunktion (RUIZ et al. 1996). Studien mit kultivierten Gefässendothelzellen zeigten, dass bei steigenden Scherkräften eine Zellabtrennung bei Plakoglobindefizienz induziert wird (SCHNITTLER et al. 1997). Zellabtrennung kann als ein proapoptotisches Signal verantwortlich sein für den apoptotischen Zelltod (SARASTE u. PULKKI 2000). Plakoglobin wurde bereits in Verbindung gebracht mit dem Reaktionsweg der Apoptose (BRANCOLINI et al. 1998). So reguliert Plakoglobin die Expression des antiapoptotischen BLC-2 (HAKIMELAHI et al. 2000). Die jüngsten Studien krankheitsverursachender Mutationen führten zu pathogenetischen Theorien, basierend auf interzellulärem, mechanischem Stress. Deskriptive Studien indizieren, dass ein progressiver myokardialer Umbau in Fettund Bindegewebezellen nach einer übertriebenen Apoptose stattfindet (AHMAD et 126 5. Diskussion al., 2003; RUNGE et al., 2000; DIEZ, 2000). Tiermodelle lassen vermuten, dass zellulärer mechanischer Stress als ein Trigger der Apoptose wirkt (NAGATA et al., 2000; VALENTE et al., 1998). Die besondere Betroffenheit nach Ausübung von Ausdauersport könnte mit einer dauerhaften Dehnungsbelastung vor allem des rechten Ventrikels zusammenhängen. Eine elegante, aber bislang unbewiesene Hypothese verbindet die negativen Auswirkungen von körperlicher Belastung, Ausdauersportarten und gestörten interzellulären Verbindungen: Unter Belastung steigen die Drücke in den Herzkammern. Aufgrund seiner dünnen Wanddicke sind dabei besonders die Myozyten der rechten Herzkammer hohen Scherkräften ausgesetzt. So kann es bei einer entsprechenden genetischen Prädisposition zu einem akuten Verlust der interzellulären Kontakte kommen, was sowohl elektrophysiologische Auswirkungen haben kann, als auch proapoptotische Signalwege in Myozyten aktiviert (HERREN et al., 1998). Eine physiologische Reaktion auf eine erhöhte Dehnungsbelastung ist eine über den Wachstumsfaktor (EGF) vermittelte Hochregulierung von Plakoglobin (YAMADA et al., 2005; YIN et al., 2005). Diese Reaktion wird bei Plakoglobin+/Mäusen verringert sein. Die Hauptfunktion von Plakoglobin ist die mechanische Stabilisierung der myokardialen Synzytien über die Verbindung der Desmosomen mit den interzellulären intermediären Filamenten (TROYANOVSKI et al., 1993). Demzufolge wird eine verringerte Plakoglobinexpression zu einer Abnahme der adhäsiven Kräfte führen (YIN et al., 2005), die wahrscheinlich in einer reduzierten Anzahl von funktionalen Desmosomen begründet liegt (BIERKAMP et al., 1996). Dies könnte sich prädisponierend auf eine rechtsventrikuläre Dilatation auswirken, die zusätzlich aufgrund einer passiven Dehnungsbelastung der rechstventrikulären Wand verstärkt wird. Eine weitere physiologische Reaktion auf einen Dehnungsreiz ist mit dem Frank-Starling-Mechanismus beschrieben: Eine Dilatation des Ventrikels führt über eine bessere Vordehnung zu erhöhter systolischer Kraft; dieser Mechanismus funktioniert bei geschädigter Muskulatur nicht mehr. Wenn dieser Mechanismus auch bei der ARVC nur noch vermindert funktioniert, kann dies ein weiterer Faktor in der Entstehung einer Dilatation sein. 127 5. Diskussion 5.2.3 Funktionsverminderung Bei den transgenen trainierten, nicht aber bei den alten Tieren, zeigte sich eine tendenziell verringerte Kontraktion des linken Ventrikels und ein verminderter Trikuspidalfluss bei β1-Stimulierung. So deutet dies auf eine unterschiedliche Ausprägung der intensiven akuten gegenüber einer chronischen Belastung hin. Die Adaptation der kardialen Funktion bei einem kurzfristig erhöhten Isoprenalinspiegel scheint ohne einen erhöhten Sympathikustonus (ohne Training) eher gegeben zu sein. Demgegenüber steht die akute Belastung des trainierten Herzens, die schneller den funktionellen Tribut fordert. Die durch den Ausdauersport bedingte β1Stimulierung führt somit Kontraktionsverminderung bei Plakoglobin-defizienten gegenüber den Tieren altersbedingten zu einer Entwicklungen. Interessant wäre ein Vergleich zwischen den Auswirkungen auf die β-adrenergen Rezeptorendichte zwischen trainierten und gealterten transgenen Tieren, um eine unterschiedliche Entwicklung aufgrund von β-adrenerger Stimulation mit Hilfe von Ausdauersport gegenüber den natürlichen Alterungsprozessen darzustellen. 5.2.4 Arrhythmien Die deutlichste elektrophysiologische Veränderung zeigte sich in den verlängerten Überleitungszeiten in den rechten Ventrikeln der schlagenden Plakoglobin+/-Herzen. Die kardiale Repolarisation war allerdings in den betroffenen rechten Ventrikeln nicht verändert. Im Gegensatz zu der üblichen Annahme, dass eine Verlängerung der rechtsventrikulären Überleitungszeit in anatomischen Barrieren während der Aktivierung begründet liegt, wie zum Beispiel fokales fibrös-fettiges Ersatzgewebe (McKENNA et al. 1994), konnte in dieser Studie eine Überleitungszeitverlängerung ohne diese Veränderungen gezeigt werden. Dies läßt einen funktionalen Überleitungsdefekt in Plakoglobin+/-Mäusen vermuten. Das vermehrte Auftreten von ventrikulären Extrasystolen und ventrikulären Tachykardien nach Belastung und sympathomimetischer Stimulation bei den Plakoglobin-defizienten Mäusen könnte auch in einer autonomen Dysbalance 128 5. Diskussion begründet sein, wie es für die ARVC beim Menschen bereits diskutiert wird (WICHTER et al. 2002). In der ARVC treten VTs vor allem bei körperlicher Anstrengung und mentaler Belastung auf und können durch intravenöse Katecholamininfusion provoziert werden (Katecholaminsensibilität). Dagegen können ventrikuläre Tachykardien mit antiadrenergen Medikamenten unterdrückt werden (WICHTER et al. 2002). Bei ARVC-Patienten nachgewiesen konnte werden. Noradrenalinkonzentration eine Es im verringerte wird β-adrenerge vermutet, synaptischen Spalt dass zu Rezeptorendichte eine einer gesteigerte konsekutiven Herunterregulierung der β-Rezeptorendichte führt. Die Ursache der erhöhten Noradrenalinkonzentration kann in einem gestörten Uptake-Mechanismus in der präsynaptischen Membran oder in erhöhten Feuerungsraten der efferenten Neurone liegen (WICHTER et al. 2002). Dieser Mechanismus (Herunterregulierung der βRezeptorendichte) kann teilweise mit Hilfe von antiadrenergen Medikamenten (βBlocker) reversibel sein. Dies wäre auch eine Erklärung für die gute Ansprechbarkeit der ARVC-Patienten auf eine Behandlung mit β-Blockern zur Unterdrückung von ventrikulären Tachyarrhythmien (WICHTER et al. 2000). Der Mechanismus einer autonomen Dysbalance ist in der Abbildung 5.2.4 vereinfacht dargestellt. 129 5. Diskussion Abbildung 5.2.4: Autonome Dysbalance in ARVC (nach WICHTER et al. 2000) Bei einer Noradrenalinausschüttung in den synaptischen Spalt kommt es zur Aktivierung der β-adrenergen Rezeptoren, die über Gs zu einer Aktivierung der Adenylatcyclase mit nachfolgend steigendem cAMP-Spiegel, sowie einer erhöhten Aktivität der Proteinkinase A führen. Das darauffolgende Ansteigen des intrazelluären Kalziumspiegels triggert eventuell ventrikuläre Tachykardien. AC: Adenylatcyclase, ATP: Adenosintriphosphat, β-AR: β-adrenerger Rezeptor, cAMP: zyklisches Adenosinmonophosphat, Gs: stimulierendes G-Protein, NE: Noradrenalin, RE: Noradrenalinfreisetzung, UP: Noradrenalin-WiederaufnahmeMechanismus 5.2.5 EKG-Morphologie Die unterschiedlichen Befunde der EKG-Morphologie zwischen den hier beschriebenen Untersuchungsergebnissen und der Naxos Disease beim Menschen können in den Speziesunterschieden begründet liegen. So könnte die typisch auftretende T-Wellen Inversion bei der Plakoglobin-Defizienz beim Menschen eine andere Ausprägung bei der Maus haben, da hier die T-Welle sich dem QRSKomplex direkt anschließt und es kein physiologisches isoelektrisches STStreckensegment bei der Maus gibt. Auch die nicht deutlich erkennbare EpsilonWelle könnte mit artspezifischen Unterschieden erklärt werden. Eine Epsilon-Welle 130 5. Diskussion wird als spezifische Ausprägung bei ARVC geschildert (McKENNA et al. 1994). Sie ist wahrscheinlich das Resultat einer späten Aktivierung von abnormalen rechtsventrikulären myokardialen Muskelfasern, die zu einer Verlängerung der Depolarisation beim Oberflächen-EKG führt (FONTAINE et al. 1977). Folglich kann die Anwesenheit einer Epsilon-Welle vermutet werden, wenn die Differenz zwischen dem breitesten QRS-Komplex in den rechtspräkordialen Ableitungen (V1, V2 oder V3) minus V6 mehr als 25 ms ist (normale Differenz plus zwei Standardabweichungen). Dagegen könnte eine sporadisch vorkommende erhöhte Anzahl von R`Zacken in der rechtspräkordialen Brustwandableitung V2 bei den trainierten Mäusen einen Hinweis auf eine artspezifische Variante der Epsilon-Welle geben. 131 5. Diskussion 5.3 Schlussfolgerungen Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen zeigten die Veränderungen, die eine heterozygote Defizienz im Plakoglobin-Gen, in vivo über einen längeren Zeitraum betrachtet sowie unter anhaltender sportlicher Belastung, bewirken können. Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die heterozygote Deletion des Plakoglobin-Gens zum vollen Phänotyp der ARVC führt. Desmosomale Veränderungen scheinen somit an der Entstehung der Erkankung zumindest beteiligt zu sein. Weiter konnte dargestellt werden, dass ein körperliches Ausdauertraining das Auftreten der rechtsventrikulären Schädigung und von Kammertachykardien beschleunigt. Dieser Befund legt nahe, dass ARVC-Patienten kein Ausdauertraining ausüben sollten. Interessanterweise tritt der ARVC-Phänotyp ohne den typischen fibrös-fettigen Umbau von Myokard auf. Dies könnte ein Epiphänomen der ARVC sein. Die geschilderten Ergebnisse sind durch Beobachtungen transgener Mäuse in vivo gewonnen worden. Solche Untersuchungen an transgenen Tieren erlauben es, die physiologische Bedeutung definierter genetischer Defekte zu untersuchen. Die Methoden, die für diese Arbeit weiterentwickelt wurden, können für die phänotypische Untersuchung weiterer transgener Mausmodelle herangezogen werden. Obwohl deutliche Unterschiede in der Herzfrequenz, im Vorkommen und den Eigenschaften von Ionenkanälen und in der Größe von Herzen zwischen Mäusen, größeren Säugetieren und dem Menschen bestehen, und eine Übertragung von Forschungsergebnissen von der Maus auf den Menschen nur mit Vorsicht möglich ist, geben die in dieser Arbeit beobachteten Befunde doch eindeutige Hinweise, dass eine Plakoglobin-Defizienz über einen längeren Zeitraum zu morphologischen und elektrophysiologischen Veränderungen führen kann, und dass diese Entwicklungen durch Ausdauertraining akzeleriert werden. Die hypothetischen Schlussfolgerungen dieser Arbeit zur Pathophysiologie der Plakoglobin-Defizienz sind in der Abbildung 5.3 dargestellt. Für die weiteren Forschungen wäre es interessant, ob nicht nur die Arrhythmien, sondern auch die rechtsventrikulären Dilatation medikamentös, z.B. mit 132 5. Diskussion β-Blockern (Propranolol), hinausgezögert werden kann. Auch wenn hierüber der myokardiale Stretch nicht vermindert werden kann, so könnte eventuell der Faktor der autonomen Dysbalance und die dadurch getriggerte Apoptose verringert werden. Abbildung 5.3: Schematische Darstellung der hypothetischen Pathophysiologie bei Plakoglobindefizienz 133 6. Zusammenfassung 6. Zusammenfassung Melanie Zwiener: Kardiale Phänotypisierung heterozygoter Plakoglobin-defizienter Mäuse mittels Echokardiographie und Telemetrie Die rechtsventrikuläre Kardiomyopathie (ARVC) ist eine Herzmuskelerkrankung mit einer noch unzureichend aufgeklärten Ätiologie. Sie verursacht Arrhythmien, Herzversagen und plötzlichen Herztod. Die Diagnosestellung kann kompliziert sein, und dies behindert eine Untersuchung der molekularen Basis. Eine Veränderung im Plakoglobin-Gen führt zu einer Form der ARVC (Naxos disease). Plakoglobin ist als zytoskelettales Protein sowohl in den Desmosomen als auch in den Adherens Junctions vorhanden. Die genetische Inaktivierung führt zu einem embryonal letalen Phänotyp aufgrund einer Dysfunktion in den Intercalated Discs, die eine Einschränkung der Herzstabilität nach sich zieht. Um die phänotypischen Auswirkungen einer Plakoglobindefizienz zu untersuchen, wurden vergleichende elektro- und echokardiographische Untersuchungen sowie eine erhöhte β-adrenerge Stimulation (medikamentös oder mit Hilfe von Ausdauertraining) an Mäusen analysiert. EKGs wurden als 12-Kanal-Oberflächen-EKGs unter verschiedenen Narkosen, sowie als Langzeit-EKG bei adulten Tieren mit Hilfe eines telemetrischen, implantierten Transmitters bei sich frei bewegenden, sowie bei körperlich belasteten Mäusen durchgeführt. Es wurden alters- und trainingsabhängige serielle elektro- und echokardiographische Untersuchungen der Herzen vorgenommen. Eine heterozygote Plakoglobin-Defizienz resultiert in einer altersabhängigen rechtsventrikulären Dilatation, die durch Training akzeleriert werden kann. Eine verminderte Kontraktionskraft zeigt sich bei einer β-adrenergen Stimulation der trainierten Tiere. Ein verstärkte Neigung zu Arrhythmien wurde sowohl bei älteren als auch bei trainierten Mäusen sowie bei einer β1-Stimulation deutlich. Die Erklärung zu diesen Befunden scheint in einem multifaktoriellen Zusammenspiel von myokardialem Stretch mit der besonderen Dehnungsbelastung des rechten Ventrikels und zytoskelettalen Veränderungen 134 sowie einem funktionalen 6. Zusammenfassung Überleitungsdefekt bzw. einer autonomen Dysfunktion zu liegen, das zu apoptotischen Vorgängen und darüber zu einer myokardialen Atrophie führt. Aus diesen Faktoren können letzten Endes eine Herzinsuffizienz und Arrhythmien resultieren. 135 7. Summary 7. Summary Melanie Zwiener: Cardiac phenotype characterization of heterozygous plakoglobin deficient mice via echocardiography and telemetry The arrhythmogenic right ventricular disease (ARVC) is a heartmuscle disease of which we have insufficient knowledge about the etiology. It causes arrhythmias, heart failure and sudden cardiac death. It can be difficult to diagnose, which impedes the analysis of the molecular base. A change in the gene of plakoglobin results in a special type of ARVC (naxos disease). Plakoglobin is a cytoskeletal protein, which is present in desmosomes as well as in adherens junctions. The genetic inactivation leads to an embryonic lethal phenotype due to a dysfunction of the intercalated discs, which limits the heart stability. Experiments were conducted on mice in order to investigate electrophysiological and functional impact of plakoglobin deficiency. These experiments included electro- and echocardiographic studies as well as enhanced β-adrenergic stimulation (medicamentous or with endurance training). 12channel-surface-ECGs were carried out on adult mice under different narcosis, while long-term ECGs were realized using telemetric transmitter implants on freely moving and physically stressed adult mice. Age- and training-related echocardiographic and electrocardiographic examination series were conducted. Heterozygote plakoglobin deficiency results in an age-depending right ventricular dilatation, which training can accelerate. A reduced contractility shows after βadrenergic stimulation of trained mice. Older and trained mice reveal an increased predisposition to arrhythmia; furthermore β1-stimulation increases the risk. A multifactorial interaction of myocardial stretch (with enhanced strain forces of the right ventricle), cytoskeletal changes and a functional conduction defect/ autonome dysbalance could lead to apoptotic action and in addition to myocardial atrophy. These factors result in heart failure and arrhythmia. 136 Literaturverzeichnis Literaturverzeichnis ABERLE H, BIERKAMP C, TORCHARD D, SEROVA O, WAGNER T, NATT E, WIRSCHING J, HEIDKAMPER C, MONTAGNA M und LYNCH H (1995) The human plakoglobin gene localizes on chromosome 17q21 and is subjected to loss of heterozygosity in breast and ovarian cancers. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6384-6388, 1995 ABERLE H, SCHWARTZ H, HOSCHUETZKY H und KEMLER R (1996) Single amino acid substitutions in proteins of the armadillo gene family abolish their binding to alpha-catenin J Biol. 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TATARU 2001) .................................................................................................................54 Abbildung 3.3.1.2: Schematische Darstellung einer echokardiographischen Längsachsenansicht des Herzens (modifiziert nach KÖHLER u. TATARU 2001) .................................................................................................................54 Abbildung 3.3.1.3: Schematische Darstellung einer echokardiographischen Ansicht der Trikuspidal- und Pulmonalklappe des Herzens (modifiziert nach KÖHLER u. TATARU 2001) ..............................................................................55 Abbildung 3.3.1.4: Schematische Darstellung einer echokardiographischen Querachsenansicht des Herzens (modifiziert nach KÖHLER u. TATARU 2001) .................................................................................................................55 Abbildung 3.3.1.5: Schematische Darstellung einer echokardiographischen Ansicht der kurzen Achse auf Höhe der Aortenklappe (modifiziert nach KÖHLER u. TATARU 2001) ..............................................................................56 Abbildung 3.3.1.6: Schematische Darstellung einer echokardiographischen Ansicht eines rechtsventrikulären Ausflusstraktes (von der parasternalen kurzen Achse ausgehend) des Herzens (modifiziert nach KÖHLER u. TATARU 2001)..................................................................................................56 Abbildung 3.3.2: Gemessene Rechtherzparameter modifiziert nach FOALE (1986) ................................................................................................................59 Abbildung 3.5.1: Der Versuchsaufbau einer Langendorffapparatur..........................66 Abbildung 3.5.2: Monophasisches Aktionspotential einer Maus ...............................69 Abbildung 4.1.1.1: Vergleich der Rechtsherzparameter im Vierkammerblick zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen, die älter als 38 Wochen sind....................................................................................................................81 Abbildung 4.1.1.2: Beispielhafte echokardiographische Darstellung der Fläche des rechten Ventrikels im Vierkammerblick bei Mäusen, die älter als 38 Wochen sind......................................................................................................82 Abbildung 4.1.1.3: Vergleich der rechtsventrikulären Fläche in der Längsachsenansicht zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen im Alter von 9 bis 12 Wochen und älter als 38 Wochen .........................................83 177 Abbildungsverzeichnis Abbildung 4.1.1.4: Beispielhafte echokardiographische Darstellung der Fläche des rechten Ventrikels in der Längsachsenansicht bei Mäusen, die älter als 38 Wochen sind.................................................................................................83 Abbildung 4.1.1.5: Vergleich der rechtsventrikulären Fläche in der Querachsenansicht zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen älter als 38 Wochen ........................................................................................................84 Abbildung 4.1.1.6: Beispielhafte echokardiographische Darstellung der Fläche des rechten Ventrikels in der Querachsenansicht bei Mäusen, die älter als 38 Wochen sind.................................................................................................84 Abbildung 4.1.1.7: Vergleich des rechtsventrikulären Volumens nach Wübbeling zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen im Alter von 9-12, 13-26 und über 38 Wochen ................................................................................................86 Abbildung 4.1.1.8: Vergleich der Durchmesser der Trikuspidalklappe und des rechtsventrikulären Ausflusstraktes zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen, die älter als 38 Wochen sind............................................................87 Abbildung 4.1.1.9: Beispielhafte echokardiographische Darstellung der Durchmesser der Trikuspidalklappe und des rechtsventrikulären Ausflusstraktes bei Mäusen, die älter als 38 Wochen sind................................87 Abbildung 4.1.2.1: Korrelation der Länge des rechten Ventrikels im Verhältnis zur errechneten Aktivitätszahl .................................................................................89 Abbildung 4.1.2.2: Korrelation der rechtsventrikulären Fläche im Vierkammerblick im Verhältnis zur errechneten Aktivitätszahl ..........................90 Abbildung 4.1.2.3: Korrelation des rechtsventrikulären Einflusstraktes im Verhältnis zur errechneten Aktivitätszahl...........................................................90 Abbildung 4.1.2.4: Korrelation des rechtsventrikulären Fläche in der Längsachsenansicht im Verhältnis zur errechneten Aktivitätszahl ....................91 Abbildung 4.1.2.5: Vergleich der Fläche des rechten Ventrikels im Vierkammerblick zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen vor und nach Training.....................................................................................................92 Abbildung 4.1.2.6: Vergleich der Fläche des rechten Ventrikels in der Längsachsenansicht zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen vor und nach Training..............................................................................................93 Abbildung 4.1.2.7: Beispielhafte echokardiographische Darstellung der Fläche des rechten Ventrikels in der Längsachsenansicht bei Mäusen vor und nach Training .............................................................................................................93 Abbildung 4.1.2.8: Vergleich der Fläche des rechten Ventrikels in der Längs- und Querachsenansicht zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen nach Training .............................................................................................................94 Abbildung 4.1.2.9: Beispielhafte echokardiographische Darstellung der Fläche des rechten Ventrikels in der Querachsenansicht bei Mäusen vor und nach Training .............................................................................................................95 Abbildung 4.1.2.10: Vergleich der Fläche des linksventrikulären Schlagvolumens zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen nach Training .........................96 Abbildung 4.1.2.11: Beispielhafte echokardiographische M-Mode-Darstellung des linken Ventrikels nach Isoprenalingabe vor und nach Training...................97 178 Abbildungsverzeichnis Abbildung 4.1.2.12: Vergleich der FS, des systolischen inneren LV-Diameters, des endsystolischen Volumens und der Ejektionsfraktion nach Teichholz des linken Ventrikels unter Isoprenalinwirkung nach Training ...........................97 Abbildung 4.1.2.13: Vergleich der maximalen Geschwindigkeit, des maximalen Druckes und des mittleren Druckes im Trikuspidaldoppler unter Isoprenalinwirkung zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen nach Training .............................................................................................................98 Abbildung 4.1.2.14: Beispielhafte echokardiographische TrikuspidaldopplerDarstellung nach Isoprenalingabe vor und nach Training..................................99 Abbildung 4.1.2.15: Beispielhafte echokardiographische Darstellung der Fläche des rechten Ventrikels im Vierkammerblick bei Maus-Nr.320 und Wildtyp nach Training...................................................................................................100 Abbildung 4.1.2.16: Beispielhafte echokardiographische Darstellung der Fläche des rechten Ventrikels in der Längsachsenansicht bei Maus-Nr.320 und Wildtyp nach Training ......................................................................................100 Abbildung 4.1.2.17: PET Darstellung der Herzen von Maus-Nr.320 und eines Wildtyps vor und nach Training ......................................................................101 Abbildung 4.2.1: Vergleich der ersten beiden Brustwandableitungen (V1, V2) bei Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen vor und nach Training (repräsentative EKGs)..............................................................................................................103 Abbildung 4.2.2.1: Vergleich der spontanen ventrikulären Extrasystolen zwischen Wildtypen und Plakoglobin+/-Mäusen nach einer Airjet-Belastung .................104 Abbildung 4.2.2.2: Vergleich der spontanen ventrikulären Extrasystolen zwischen Wildtypen und Plakoglobin+/-Mäusen bei den verschiedenen Züchtungen und bei männlichen Tieren nach einer Airjet-Belastung ..................................105 Abbildung 4.2.2.3: Repräsentatives telemetrisches EKG einer Plakoglobin+/Maus nach einer Airjet-Belastung....................................................................105 Abbildung 4.2.2.4: Vergleich der spontanen ventrikulären Extrasystolen zwischen Wildtypen und Plakoglobin+/-Mäusen bei der C57Bl/6-Züchtung während einer Airjet-Belastung ......................................................................................106 Abbildung 4.2.2.5: Repräsentatives telemetrisches EKG einer Plakoglobin+/Maus während einer Airjet-Belastung..............................................................106 Abbildung 4.2.2.6: Vergleich der spontanen atrialen Extrasystolen zwischen Wildtypen und Plakoglobin+/-Mäusen bei den männlichen Tieren bei normaler Aktivität (Ruhe).................................................................................107 Abbildung 4.2.2.7: Repräsentatives telemetrisches EKG einer Plakoglobin+/Maus bei normaler Aktivität (Ruhe) ................................................................107 Abbildung 4.2.2.8: Herzfrequenzvergleich zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen bei normaler Aktivität (Ruhe) nach Training....................................108 Abbildung 4.3.1: Ventrikuläre Tachykardie bei einer Plakoglobin+/-Maus einen Tag nach Implantation einer osmotischen Pumpe, die 3mg/kg/d Isoprenalin freisetzt............................................................................................................109 Abbildung 4.3.2: QRS-Morphologie nach Implantation einer Isoprenalinfreisetzenden Pumpe bei einer Plakoglobin+/-Maus .......................................110 Abbildung 4.3.3: Rupturierter linker Ventrikel nach Implantation einer osmotisch wirksamen Isoprenalin-Phenylephrin-Pumpe bei einer transgenen Maus .......111 179 Abbildungsverzeichnis Abbildung 4.4.1: Vergleich der spontanen ventrikulären Tachykardien zwischen Wildtypen, trainierten und über 42 Wochen alten Plakoglobin+/-Mäusen ......112 Abbildung 4.4.2: Spontane ventrikuläre Tachykardie im monophasischen Aktionspotential und im Elektrokardiogramm eines Plakoglobin+/-Herzens in der Langendorff-Apparatur ..............................................................................113 Abbildung 4.4.3: Vergleich der Ursprungslokalisationen der spontanen Arrhythmien zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen .........................114 Abbildung 4.4.4: Vergleich der rechtsventrikulären Überleitungszeiten zwischen Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen .............................................................115 Abbildung 5.2.4: Autonome Dysbalance in ARVC (nach WICHTER et al. 2000)....130 Abbildung 5.3: Schematische Darstellung der hypothetischen Pathophysiologie bei Plakoglobindefizienz ..................................................................................133 180 Tabellenverzeichnis Tabellenverzeichnis Tabelle 2.1.1: Mutationen, die mit der ARVC assoziiert sind ....................................13 Tabelle 2.1.2: Diagnostische Kriterien der ARVC .....................................................16 Tabelle 2.2: Protein Partner von Plakoglobin (nach ZHURINSKY et al. 2000b) .......31 Tabelle 3.3.2: Errechnete Werte aus echokardiographischen Daten........................62 Tabelle 3.5.1: Zusammensetzung der Krebs Henseleit-Pufferlösung.......................65 Tabelle 3.8: Anzahl der Mäuse in den einzelnen Versuchsgruppen .........................77 Tabelle 4.1.1.1: Echokardiographieergebnisse ausgewählter Linksherzparameter bei 9 bis 12 Wochen und über 38 Wochen alten Tieren ................................................................................................................79 Tabelle 4.1.1.2: Echokardiographieergebnisse ausgewählter Rechtsherzparameter bei 9 bis 12 Wochen alten Tieren...................................80 Tabelle 4.1.1.3: Echokardiographieergebnisse ausgewählter Rechtsherzparameter bei 13 bis 26 Wochen alten Tieren.................................80 Tabelle 4.1.2: Beispiel zur Errechnung der Aktivitätszahl .........................................88 Tabelle 4.2.1: Oberflächen-EKG-Ergebnisse ausgewählter Parameter von 9 bis 15 Wochen und über 38 Wochen alten Plakoglobin+/-Mäusen und Wildtypen unter Diazepamsedation.................................................................102 Tabelle 4.5: Durchmesser der Kardiomyozyten in den Herzen von Plakoglobin+/-Tieren und Wildtypen................................................................116 181 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis 4-AP 4-Aminopyridine AC Adenylatcyclase AJ Adherens Junctions Ao Aorta Ao R-R zeitl. Abstand zweier Aortenausschläge im Doppler AoV Aortenwurzeldurchmesser AoVmax maximale Geschwindigkeit des Aortendopplers APC Adenomatous polyposis coli APD Aktionspotentialsdauer Arm Armadillo (von Drosophila armadillo) ARVC Arrhythmogene rechtsventrikuläre Kardiomyopathie Aut.-dom. Autosomal-dominant Aut.-rez. Autosomal-rezessiv AV-Knoten Atrioventrikularknoten β-AR β-adrenerger Rezeptor β-TrCP β-Transducin repeat containing protein (Ubiquitin Lygase) bzw beziehungsweise 2+ Ca Kalzium cAMP zyklisches Adenosinmonophosphat CBP CREB bindendes Protein CSQ Calsequestrin CW-Doppler Doppler im „continous wave“ Modus CWH Kardiokutanes Syndrom (Cardiomyopathy and wooly haircoat syndrome) DAG Diacylglycerol DES Desmosomen DNA Desoxyribonucleinsäure Dsh Disheveled Dsp Desmoplakin 182 Abkürzungsverzeichnis EDV Enddiastolisches Volumen EF Ejektionsfraktion EGF Epidermaler Wachstumsfaktor EKG Elektrokardiogramm ES embryonale Stammzellen ESV Endsystolisches Volumen Frz Frizzled-Rezeptor FS Ventrikelverkürzungsfraktion: „fractional shortening“ Gs stimulierendes G-Protein GSK/ Gsk3b Glykogen Synthase Kinase/ Glykogensynthasekinase-3β HF Herzfrequenz HSV-TK Herpes-Simplex-Virus-Thymidine-Kinase-Gen- Kassette HZV Herzzeitvolumen I() Ionenstrom IF Intermediäre Filamente IP3 Inositoltrisphosphat IVS Interventrikuläres Septum Kg Kilogramm KGW Körpergewicht LA Linkes Atrium Lav Längsachsenansicht LEF Lymphocyte enhancer binding factor LV Linker Ventrikel LVET linksventrikuläre Ejektionszeit LVOT Linksventrikulärer Ausflusstrakt LVW Hinterwand des linken Ventrikels MAP monophasisches Aktionspotential MAPK Mitogen-activated Protein Kinase M-Mode Time Motion Mode MRI Magnet Resonance Imaging MV A-Punkt Höchster Punkt der A-Welle im Mitraldoppler 183 Abkürzungsverzeichnis MV E-Punkt Höchster Punkt der E-Welle im Mitraldoppler MV-Decelzeit Dezelerationszeit der Mitralwelle in ms MV Vmax Maximale Geschwindigkeit des Mitraldopplers NA Noradrenalin ND noch nicht ermittelt (non determined) Neo Neomycin Gen Kassette NLS Kern Lokalisations Signal Sequenzen Nup Nukleoporin OP Operation PCR Polymerasekettenreaktion PG Plakoglobin Plp Plakophilin RA rechtes Atrium RV Rechter Ventrikel RVD rechtsventrikulärer Diameter RVDV Rechtsventrikuläres diastolisches Volumen RVIT rechtsventrikulärer Einflusstrakt RVLAX Länge des rechten Ventrikels RVOT rechtsventrikulärer Ausflusstrakt RVSAX Breite des rechten Ventrikels RyR2 Ryanodin Rezeptor2 Sav Querachsenansicht SCC9-Zellen squamöse Karzinom9-Zellen SCD Plötzlicher Herztod (sudden cardiac death) SV Schlagvolumen TBP TATA Bindeprotein TCF T-Zell-Faktor TG Transgenes Tier TV Trikuspidalklappe Tyr Tyrosin Vcf Zirkuläre Faserverkürzung 184 Abkürzungsverzeichnis VT Ventrikuläre Tachykardie VTI Geschwindigkeits-Zeit-Integral Wnt Wingless-Glycoprotein (von der Wingless-Signalkette) WT Wildtyp 185 Anhang Anhang Geräte Telemetrieanlage Transmitter TA10ETA-F20-L20 (Data Science, St. Paul, MN) Receiver RA1010 (Data Science, St. Paul, MN) Standardcomputer Input-Matrix Output-Matrix EKG-Gerät Megacart (1993, Siemens, Erlangen) AC 264 EKG Verstärker (EMKA Technologies, Paris) ITF16 EKG Verstärker (EMKA Technologies, Paris) Selbstangefertigte Schlaufenelektroden aus dünnem Stahldraht Ultraschallgerät Sonos 5500 (Philipps Medical Systems, Hamburg) 12 MHz Sektorschallkopf 15 MHz Linearschallkopf Zentrifuge Labofuge III (Heraeus) Wärmeplatten TKM – 0902 Temperatur-Kontrollmodul (FMI Föhr Medical Instruments, SeeheimOber Beerbach) IOW – 3700 Rektaltemperatur geregeltes, intraoperatives Tierbewärmungssystem für die Ratte oder die Maus (FMI Föhr Medical Instruments, Seeheim-Ober Beerbach) 186 Anhang Elektrischer Rasierer Golden A4, Model 5-55E (Oster, USA) Waage Sartorius CP 3202 S (Sartorius AG, Göttingen) Radio / Magnet Phapsody®, RY-103/H, AM/FM Radio, Dual Sound Magnet (DSI, Data Science International) Software iox1.6.7 Cardiology Research Software (EMKA Technologies, Paris) ecg Auto 1.5.7.36 Multi-species Multi-leads Analysis Software (EMKA Technologies, Paris) Datenakquisitions-Software, basierend auf der LabVIEW Programmiersprache Semi-automatisches EKG-Analyseprogramm, basierend auf der Programmiersprache EKG-Analyseprogramm, visual basic basiert (signetix, Bielefeld) Verbrauchsmaterialien Desinfektion Neo-Kodan, farblos (Schülke&Mayr, Norderstedt) Handschuhe SAFESKIN*PFE, Größe M (Kimberly-Clark, Belgien) SAFESKIN*Satin Plus*, Größe S (Kimberly-Clark, Belgien) Kanülen Terumo® Neolus 27G, 0,4 mm (TERUMO EUROPE N.V., Leuven, Belgien) Terumo® Luer 18G, 0,4 mm (TERUMO EUROPE N.V., Leuven, Belgien) 187 LabVIEW Anhang Klebeband Leukosilk® (BSN medical GmbH&Co.KG, Hamburg) Leukoplast® (BSN medical GmbH&Co.KG, Hamburg) Leukofix® (BSN medical GmbH&Co.KG, Hamburg) Medikamente Baytril® 10% (Bayer, Leverkusen) Ibuflam® 2% Sirup (Lichtenstein Pharmazeutika, Mühlheim-Kärlich) Bepanthen® Augen- und Nasensalbe (Hoffmann-La Roche AG, Grenzach-Wyhlen) Stereofundin® (Braun, Melsungen) Isoproterenol® Isoprenalin (Sigma-AldrichChemie GmbH, Steinheim) Nahtmaterial Ethicon PROLENE® , 4/0 (1,5 metric), P-3, 45 cm (Johnson+Johnson Intl, Brüssel) Ethicon VICRYL∗ , 4-0 (1,5 metric), P-3 (13,0 mm 3/8c) (Johnson+Johnson Intl, Brüssel) Narkose-Geräte RUS-13-GA Inhalationsnarkose System (FMI Föhr Medical Instruments, SeeheimOber Beerbach) Narkotika Xylazin® 2% (CEVA Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf) Ketamin 10% (CEVA Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf) Ketanest® S (Parke-Davis GmbH, Berlin) Isofluran Curamed (250ml, CuraMED Pharma GmbH, Karlsruhe) Sedativa: Diazepam-ratiopharm 10 Injektionslösung (Ratiopharm, Ulm) 188 Anhang OP-Unterlagen klinidrape® (Mölnlycke Health Care OY Fin, Finnland) Speichermedien Platinum® CD-R 80 min/700 MB Magneto optical Disk, Fujifilm 1.3 GB MO rewritable 10 Mbit-Ethernet-kompatibles Netzwerk (telemetrisches EKG) Spritzen Omnifix®-F 1ml (Braun, Melsungen) Amefa-Einmalspritzen, 20 ml (Braun, Melsungen) Ultraschallgel Aquasonic® 100 (Parker Laboratories, INC, Fairfield) Sonstiges Druckpapier für das Ultraschallgerät (Superior density printing paper, 110 mm × 18 m, Sony Corporation Tokyo Japan) EKG-Papier, handelsüblich Enthaarungscreme Pilca®med (ASID BONZ GmbH, Böblingen) Sprühpflaster (Johnson + Johnson, Norderstedt) Plastikröhrchen (50 ml) mit Schraubverschluss (Sarstedt, Nümbrecht) Papiertücher KIMWIPES® Lite (Kimberly-Clark, Belgien) Elektrodencreme (Marquette Hellige GmbH, Freiburg) 189 Anhang DANKSAGUNG Ich möchte mich an dieser Stelle bei allen, die mich in irgendeiner Form unterstützt und so zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben, ganz herzlich bedanken. Mein Dank gilt besonders: Herrn PD Dr. Paulus Kirchhof für die Überlassung des Themas und die freundliche Unterstützung bei der Planung und Ausführung der Experimente. Des Weiteren möchte ich mich für die hervorragende Betreuung und Unterstützung bei der Verfassung dieser Arbeit bedanken. Herrn Apl. Prof. Dr. Bernd Schröder (Physiologisches Institut der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover) danke ich für das Interesse und seine Bereitschaft, das Gutachten zu erstellen. Ein besonderes Dankeschön gilt auch Frau Dr. Larissa Fabritz für die unermüdliche fachliche und persönliche Unterstützung und die kompetente und herzliche Einarbeitung in die Echokardiographie der Maus. Marcel Tekook danke ich für die freundliche Einarbeitung in das Laborleben der Mäuseklinik. Für die wundervoll unterhaltsamen Kaffeepausen und das freundschaftliche Zusammenarbeiten danke ich Dr. Lisa Fortmüller, Nina Kreienkamp und Daniela Volkery. Meinen Versuchstieren danke ich für ihr friedliches Verhalten während der ganzen Zeit. Persönlich und von Herzen danken möchte ich meinem Mann, Michael Zwiener, und meinen Eltern, Franz und Ursula Graute, für die immer selbstverständliche Unterstützung und Aufmunterung während des Studiums und der Promotion. 190
