Supprimierung der monozytenabhängigen Infektabwehr durch

Aus der Medizinische Klinik III Pneumologie, Allergologie, Schlaf- und Beatmungsmedizin
Berufsgenossenschaftliches Universitätsklinikum Bergmannsheil Bochum
der Ruhr-Universität Bochum
Direktor: Prof. Dr. med. Andrea Koch
Supprimierung der monozytenabhängigen Infektabwehr durch
Zigarettenrauch und COPD
Inaugurale-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum
Vorgelegt von
Susanne Panek
aus Duisburg
2016
Dekan
Referent
Korreferent
: Prof. Dr. med. Albrecht Bufe
: Prof. Dr. med. Andrea Koch
: Prof. Dr. med. Hans-Werner Duchna
Tag der mündlichen Prüfung: 18.05.2017
Diese Arbeit ist meiner Familie gewidmet,
die immer für mich da war, an mich geglaubt und mich immer unterstützt hat.
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
1.1.
1.2.
1.3.
1.4.
1.5.
1.6.
1.7.
1.7.1.
1.7.2.
Vorwort
Ausblick
COPD
Exazerbation
Spirometrie
Obstruktion
Therapie
Allgemeine Therapiemaßnahmen
Pharmakologische Therapie
S.12
S.12
S.13
S.14
S.16
S.18
S.19
S.20
S.21
1.8.
Das Problem der COPD und ihrer Therapie
1.9.
Das Immunsystem
1.9.1.
Das angeborene Immunsystem
1.9.2.
Das adaptive Immunsystem
S.24
S.24
S.25
S.25
1.10.
Die Zellen des Immunsystems
1.11.
Monozyten
1.12.
Signalwege
1.12.1. Toll-Like Rezeptoren
1.12.2. NOD
S.26
S.27
S.29
S.30
S.32
1.13.
1.14.
Signalkaskade
Der MyD88-abhängige Signalweg
S.34
S.34
1.15.
Stimulantien
1.15.1. Totalextrakte
1.15.1.1. Staphylococcus aureus
1.15.1.2. Streptococcus pneumoniae
S.36
S.37
S.37
1.15.2. Zellwandbestandteile gram-positiver Bakterien
1.15.2.1. Peptidoglycan PGN
1.15.2.2. Lipoteichonsäure LTA
1.15.2.3. Lipopeptid amiA
S.38
S.39
S.39
1.16.
Peptidoglykanerkennungsprotein
1.17.
Zytokine und Chemokine
1.17.1. IL-8
1.17.2. TNFα
1.17.3. GM-CSF
S.40
S.42
S.43
S.43
S.44
1.18.
1.19.
S.46
S.47
Die zugrundeliegende Hypothese dieser Arbeit
Eigene Untersuchungen
1
2. Zielsetzung/Fragestellung
S.48
3. Material und Methoden
3.1.
Material
3.1.1. Probanden
3.1.2. Studienpopulation
3.1.2.1. Fallzahlplanung
S.50
S.55
S.57
S.58
3.2.
3.2.1.
3.2.2.
3.2.3.
3.2.4.
3.2.5.
3.2.6.
S.58
S.59
S.59
S.60
S.61
Methoden
Hygiene
Blutentnahme
Blutbild
Färbung nach Pappenheim
Mikroskopische Zellzahlbestimmung
Isolation der mononukleären Zellen
des peripheren Blutes (PBMCs) aus Vollblut
3.2.7. Bestimmung der Zellzahl (PBMCs)
3.2.8. Monozytenisolation
3.2.9. Zellzahlbestimmung Monozyten
3.2.10. Kultivierung der isolierten Monozyten
3.2.11. Mediumwechsel, Stimulation und Ernte
3.2.11.1. Mediumwechsel
3.2.11.2. Stimulation
3.2.11.3. Ernte
S.61
S.64
S.65
S.67
S.68
S.69
S.69
S.71
3.2.12. Enzym-Linked-Immunosorbent-Assays (ELISA)
3.2.13. RNA-Isolation aus Monozyten
3.2.14. cDNA-Synthese
3.2.15. Polymerasekettenreaktion qRT-PCR
3.2.16. Gelelektrophorese und densitometrische Messung
3.2.16.1. Gellauf
3.2.16.2. Densitometrische Messung
S.71
S.73
S.75
S.76
S.80
S.81
S.81
3.2.17. Relative Quantifizierung der gemessenen PCR-Werte
S.82
4. Ergebnisse
4.1.
Vorversuche
S.83
4.2.
Monozyten-Response auf PAMPs
gram-positiver Bakterien
S.85
2
4.3.
4.3.1.
4.3.2.
4.3.3.
4.3.4.
4.3.5.
GM-CSF
Stimulation mit PGN
Stimulation mit LTA
Stimulation mit amiA
Stimulation mit S. aureus-Totalextrakt
Stimulation mit S. pneumoniae-Totalextrakt
S.87
S.90
S.94
S.97
S.101
4.4.
4.4.1.
4.4.2.
4.4.3.
4.4.4.
4.4.5.
IL-8
Stimulation mit PGN
Stimulation mit LTA
Stimulation mit amiA
Stimulation mit S. aureus-Totalextrakt
Stimulation mit S. pneumoniae-Totalextrakt
S.104
S.106
S.109
S.110
S.112
4.5.
4.5.1.
4.5.2.
4.5.3.
4.5.4.
4.5.5.
TNFα
Stimulation mit PGN
Stimulation mit LTA
Stimulation mit amiA
Stimulation mit S. aureus-Totalextrakt
Stimulation mit S. pneumoniae-Totalextrakt
S.113
S.117
S.120
S.123
S.126
4.6.
Expression der Rezeptoren NOD2 und TLR2,
sowie NOD1 und TLR1
S.130
TLR2
NOD2
TLR1
NOD1
S.132
S.133
S.134
S.135
4.6.1.
4.6.2.
4.6.3.
4.6.4.
4.7.
Unterschiede in der Expression von MyD88,
MyD88s, IRAK-M und A20, sowie des PGRP1,
vergleichend zwischen den Kohorten
4.7.1. PGRP1
4.7.2. MyD88
4.7.3. MyD88s, IRAK-M und A20
4.8.
4.9.
S.136
S.137
S.138
Korrelation der experimentellen Daten
mit klinischen Parametern (FEV1 & packyears (py))
S.140
Signifikante Reduktion der Monozytenzahl
S.141
3
5. Diskussion
5.1.
S.142
Reduzierte Monozytenzahl im Vollblut von
COPD-Erkrankten im Vergleich zu NieRauchern
S.144
5.2.
Konzentrations-Response-Experimente
S.145
5.3.
Die Baselinelevel der Zytokinexpression in Monozyten
im Vergleich zwischen den Kohorten
S.146
Nach Stimulation der Monozyten mit gram-positiven
Bakterien und deren Bestandteilen zeigten sich erhöhte
Zytokinexpressionen in allen vier Kohorten
S.151
Monozyten exprimieren die gemessenen PRRs
stimulationsabhängig
S.155
Die Expression der verschiedenen Rezeptoren wurden
weder durch PGN, LTA und amiA, noch durch die
Totalextrakte von S.aureus und S.pneumoniae
signifikant beeinflusst
S.157
Die PRR-Expression zeigt signifikante Unterschiede
zwischen den Kohorten
S.158
TLR-Adapterprotein MyD88 und die Signalwegsantagonisten MyD88s, IRAK-M und A20
S.161
Limitation
S.164
5.4.
5.5.
5.6.
5.7.
5.8.
5.9.
6. Zusammenfassung und Ausblick
6.1.
Methoden
6.2.
Ergebnisse
6.3.
Fazit und Ausblick
S.165
S.165
S.166
S.168
7. Literaturverzeichnis
S.171
8. Danksagung
9. Lebenslauf
4
Abkürzungen
Abb.
Abbildung
ACD
Acid-Citrate-Dextrose
AECOPD
Akute Exazerbation der COPD
AK
Antikörper
AM
Alveolarmakrophagen
ANOVO
Analysis of variance
aqua dest.
deionisiertes und destilliertes Wasser
BSA
Bovines/Rinder-serum-Albumin (engl.: bovine serum albumin)
cDNA
complementary DNA
COPD
Chronic Obstructive Pulmonary Disease
Diff.-BB
Differentialblutbild
DNA
Desoxyribonukleinsäure
dNTP
Desoxyribonukleotidtriphosphat
dsDNA
Doppelstrang-DNA
dsRNA
Doppelstrang-RNA
EDTA
Natriumsalz der Ethylendiamintetraessigsäure Na2H2EDTA
EF1α
Elongationsfaktor 1 alpha
ELISA
Enzyme-linked immunosorbent assay
Eppi
Eppendorf-Reaktionsgefäß , Eppendorf-Tube, Tube
EtBr
Ethidiumbromid (3,8-Diamino-5-ethyl-6-phenylphenanthridiniumbromide)
Fa.
Firma
FCS
Fetal-Calf-Serum
FEV1
Forciertes Exspiratorisches Volumen in einer Sekunde
for.
forward = vorwärts
FS
former smoker = ehemalige Raucher
FVC
forcierte Vitalkapazität
GM-CSF
Granulocyte macrophage colony-stimulating factor
GOLD
Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease
HCl
Salzsäure
5
HES
Hydroxyethylstärke (HAES 6%)
IL
Interleukin
LPS
Lipopolysaccharid
LTA
Lipoteichoic acid = Lipoteichonsäure
max.
maximal
MOI
Multiplicity of infection
MPS
Mononukleäres Phagozyten-System (=> MMS= MonozytenMakrophagen-System)
mRNA
engl.: messenger RNA
MRSA
Methicillin-/ Multi-resistenter Staphylococcus aureus
MW
Mittelwert
n
Fallzahl
NaOH
Natronlauge
NLR
NOD-like-Rezeptor
NOD
Nucleotide-binding oligomerization domain
NS
Non-Smoker = NieRaucher
OD
Optische Dichte
PAMP
Pathogen-associated molecular patterns
PBMC
Peripheral Blood Mononuclear Cell
PBS
Phosphate buffered saline
PCR
Polymerase chain reaction
Pen/Strep
Penicillin-Streptomycin
PGN
Peptidoglycan
pH
negativer dekadischer Logarithmus der Protonenkonzentration
PRR
Pattern-Recognition-Rezeptor
rev.
reverts = zurück
RNA
Ribonucleic acid
RNase
Ribonuklease
rpm
Rounds per minute
RPMI
Roswell Park Memorial Institute
RT
Raumtemperatur
RT-PCR
reverse transcripted polymerase chain reaction
6
S
Smoker = Raucher
S.a.
Staphylococcus aureus
S.a.E
Staphylococcus aureus Totalextrakt
SD
Standard deviation = Standardabweichung
SEM
Standard errror of the mean
S.p.
Streptococcus pneumoniae
S.p.E
Streptococcus pneumoniae Totalextrakt
Tab.
Tabelle
TAE
Tris-Acetat-EDTA (-Puffer)
TBS
Tris buffered saline
TLR
Toll-like Rezeptor
TMB
3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidin Flüssigsubstrat
TNFα
Tumor necrosis factor alpha
Tube
Eppendorf-Tube, Eppendorf-Reagiergefäß
Tween20
Polyoxyethylensorbitanmonolaurat
UV
Ultraviolett
ü.N.
über Nacht
vs.
versus
WHO
World Health Organization
Einheiten
A
Ampere
bp
Basenpaare
°C
Grad Celsius
g
Gramm
h
Stunde
l
Liter
m
Meter
M
molar
Min
Minute
sec
Sekunden
V
Volt
7
Präfixe
k
kilo (103)
μ
mikro (10-6)
m
milli (10-3)
M
mega (106)
n
nano (10-9)
Abbildungen
Abb. 1: Statische und dynamische Lungenfunktionsparameter
und maximale exspiratorische Flüsse.
S.17
Abb. 2: Fluss-Volumen-Kurve
S.19
Abb. 3: Stufentherapie der COPD
S.23
Abb. 4: Monozyt im Blutausstrich
S.29
Abb. 5: TLR abhängige Erkennung von mikrobiellen Komponenten.
S.33
Abb. 6: TLR-Signalweg
S.36
Abb. 7: Graphische Darstellung der Bakterienzellwand
gram-positiver Bakterien
S.38
Abb. 8: Blutausstrich auf Objektträger
S.60
Abb. 9: Darstellung des Einsatzes von Ficoll bei der Isolation
der PBMCs
S.63
Abb.10: Zytokinfreisetzung aus Monozyten von NS (n=10) im
Konzentrations-Response-Experiment
S.84
Abb.11: Baselinelevel von IL-8, GM-CSF und TNFα im Vergleich
zwischen den Kohorten
S.86
Abb.12: Konzentrations-Response-Modelle von GM-CSF nach
Monozytenstimulation mit PGN.
S.88
Abb.13: Fold Induktion: relative Werte (bezogen auf die Kontrolle)
der GM-CSF-Expression aller vier Kohorten.
S.89
Abb.14: Konzentrations-Response-Modell von GM-CSF nach
Monozytenstimulation mit LTA.
S.91
8
Abb.15: Fold Induktion: Relative Werte der GM-CSF-Expression
nach LTA-Stimulation.
S.93
Abb.16: Konzentrations-Response-Modell von GM-CSF nach
Monozytenstimulation mit amiA
S.95
Abb.17: Fold Induktion: Relative Werte der GM-CSF-Expression
nach amiA-Stimulation.
S.97
Abb.18: Konzentrations-Response-Modell von GM-CSF nach
Monozytenstimulation mit S.aureus-Totalextrakt
S.98
Abb.19: Fold Induktion: Relative Werte der GM-CSF-Expression
nach S.aureus-Stimulation.
S.100
Abb.20: Konzentrations-Response-Modell von GM-CSF nach
Monozytenstimulation mit S.pneumoniae-Totalextrakt.
S.102
Abb.21: Fold Induktion: Relative Werte der GM-CSF-Expression
nach S.pneumoniae-Stimulation.
S.103
Abb.22: Konzentrations-Response-Modell von IL-8 nach
Monozytenstimulation mit PGN
S.104
Abb.23: Fold Induktion: Relative Werte der IL-8-Expression
nach PGN-Stimulation.
S.106
Abb.24: Konzentrations-Response-Modell von IL-8 nach
Monozytenstimulation mit LTA.
S.107
Abb.25: Fold Induktion: Relative Werte der IL-8-Expression
nach LTA-Stimulation.
S.109
Abb.26: Konzentrations-Response-Modell von IL-8 nach
Monozytenstimulation mit amiA.
S.110
Abb.27: Konzentrations-Response-Modell von IL-8 nach
Monozytenstimulation mit Totalextrakten von S.aureus
S.111
Abb.28: Konzentrations-Response-Modell von IL-8 nach
Monozytenstimulation mit Totalextrakten von S.pneumoniae
S.112
Abb.29: Konzentrations-Response-Modell von TNFα nach
Monozytenstimulation mit PGN.
S.114
Abb.30: Fold Induktion TNFα-Expression aller vier Kohorten nach
Stimulation mit PGN
S.116
Abb.31: Konzentrations-Response-Modell von TNFα nach
Monozytenstimulation mit LTA.
S.118
9
Abb.32: Fold Induktion TNFα-Expression aller vier Kohorten
nach Stimulation mit LTA
S.119
Abb.33: Konzentrations-Response-Modell von TNFα nach
Monozytenstimulation mit amiA.
S.121
Abb.34: Fold Induktion TNFα-Expression aller vier Kohorten
nach Stimulation mit amiA
S.122
Abb.35: Konzentrations-Response-Modell von TNFα nach
Monozytenstimulation mit S.aureus
S.124
Abb.36: Fold Induktion TNFα-Expression aller vier Kohorten
nach Stimulation mit S.aureus
S.126
Abb.37: Konzentrations-Response-Modell von TNFα nach
Monozytenstimulation mit S.pneumoniae
S.127
Abb.38: Fold Induktion TNFα-Expression aller vier Kohorten
nach Stimulation mit S.pneumoniae
S.129
Abb.39: Relative Werte der mRNA-Level von TLR2 und NOD2 in
Monozyten der untersuchten Kohorten
S.130
Abb.40: Relative Werte der mRNA-Level von TLR1 und NOD1
in Monozyten
S.131
Abb.41: Relative Werte der mRNA-Expression von TLR2
in Monozyten aller vier Kohorten.
S.132
Abb.42: Relative Werte der mRNA-Expression von NOD2
in Monozyten aller vier Kohorten
S.133
Abb.43: Relative Werte der mRNA-Expression von TLR1
in Monozyten aller vier Kohorten
S.134
Abb.44: Relative Werte der mRNA-Expression von NOD1
in Monozyten aller vier Kohorten
S.135
Abb.45: Relative Werte der mRNA-Expression von PGRP1
in Monozyten aller vier Kohorten
S.136
Abb.46: Relative Werte der mRNA-Expression von MyD88
in Monozyten aller vier Kohorten
S.137
Abb.47: Relative Werte der mRNA-Expression von MyD88s in Monozyten.
S.138
Abb.48: Relative Werte der mRNA-Expression von IRAK-M in Monozyten.
S.139
Abb.49: Relative Werte der mRNA-Expression von A20 in Monozyten
S.139
Abb.50: Monozytenzahl [in %] im peripher, venösem Vollblut
unterteilt nach Kohorten
S.141
10
Tabellen
Tab. 1: Relevante spirometrische Parameter.
S.17
Tab. 2: mRNA-Expression von Toll-like Rezeptoren in humanen Blutzellen
S.30
Tab. 3: Wichtige Toll-Like-Rezeptoren und einige ihrer Liganden
S.32
Tab. 4: Verwendete Chemikalien
S.50
Tab. 5: Verwendete Medien, Lösungen und Puffer
S.51
Tab. 6: Verwendete Stimulantien
S.52
Tab. 7: Verwendete Kits und Materialien
S.52
Tab. 8: Verwendete Geräte
S.53
Tab. 9: Probandendaten Studienpopulation
S.57
Tab.10: Differentialblutbild
S.57
Tab.11: Arbeitsvolumina zur Isolation menschlicher Monozyten
S.65
Tab.12: Stimulationsplan 1
S.70
Tab.13: Stimulationsplan 2
S.77
Tab.14: Chemikalien Master-Mix cDNA-Synthese
S.75
Tab.15: Verwendete Primer und ihre Sequenzen
S.77
Tab.16: Chemikalien Master-Mix PCR
S.78
Tab.17: PCR-Cycler-Programm
S.79
Tab.18: Freigesetzte Zytokinkonzentration [pg/ml]
nach Stimulation vs. forciertes exspiratorisches Volumen
(FEV1 [%pred.]) und vs. Zigarettenkonsum (packyears).
S.140
11
1. Einleitung
1.1 Vorwort
Die chronisch obstruktive Lungenerkrankung, kurz COPD, ist eine schwere und
ernstzunehmende Erkrankung. Erst Anfang des Jahres 2015 kam Sie auf tragische Art
und Weise zu Ruhm, als Leonard Nimoy (Mr. Spock) den Folgen seiner im Endstadium
befindlichen COPD erlag.
Schon während seiner langjährigen Leidenszeit versuchte der Schauspieler die
Menschen über seine schwere Erkrankung aufzuklären und den Leuten zu
verdeutlichen, welche immense Rolle sein jahrelanger Zigarettenkonsum dabei
gespielt hat. Bis zu seinem Tod versuchte er den Menschen zu vermitteln wie
schwerwiegend diese Erkrankung ist und dass man nicht erst reagieren sollte, wenn
sich schon deutliche Symptome zeigen.
So traurig sein Tod war, ist es jedoch viel schlimmer, dass die COPD bisher noch
weitestgehend unbekannt und wenig erforscht ist. Die meisten Raucher haben zwar
die Angst auf Grund des Zigarettenkonsums an Lungenkrebs zu erkranken, aber es ist
ihnen nicht bewusst, dass auch das Risiko an COPD zu erkranken bei andauerndem
Rauchen deutlich weiter ansteigt.
Auch die Auswirkungen, die diese Erkrankung auf den gesamten Organismus hat,
werden uns erst nach und nach bewusst und bedürfen auch in den kommenden
Jahren weiterhin intensiver Forschung.
1.2 Ausblick
Die chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) ist laut WHO definiert als
chronische Obstruktion der Lungenventilation, die eine „normale“ Atmung
verhindert und nicht vollständig reversibel ist. COPD ist nicht einfach ein
"Raucherhusten",
sondern
eine
unterdiagnostizierte,
lebensbedrohliche
Lungenerkrankung. [297]
12
Bereits 2002 belegte die COPD den 5. Platz der 15 führenden Todesursachen
weltweit. Es wird ein weiterer Anstieg der Prävalenz, Morbidität und Mortalität
prognostiziert, sodass im Jahre 2030 Schätzungen zu Folge die COPD zu den drei
häufigsten Todesursachen weltweit gehören wird. [298]
1.3 COPD
Unter dem Begriff der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung wird
ein
Symptomenkomplex
aus
chronischer
Bronchitis,
chronischer
Atemwegsobstruktion und Lungenemphysem zusammengefasst [11].
Als chronische Bronchitis wurde von der WHO 1961 eine Erkrankung definiert, „die
gekennzeichnet ist durch übermäßige Schleimproduktion im Bronchialraum, die sich
manifestiert mit andauerndem oder immer wieder auftretendem Husten, mit oder
ohne Auswurf an den meisten Tagen von mindestens drei aufeinander folgenden
Monaten während mindestens zwei aufeinander folgender Jahre. Von der GOLDInitiative (Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease) wurde die COPD im
Jahr 2001 als eine progressiv verlaufende chronische Erkrankung beschrieben, die
durch eine nicht vollständig reversible Atemwegsobstruktion gekennzeichnet ist.
Ihr liegt eine entzündliche Reaktion der Atemwege zugrunde, die durch inhalative
Schadstoffe hervorgerufen wird [297].
Die COPD ist hauptsächlich durch eine Einschränkung der Lungenfunktion
charakterisiert, gilt aber neuesten Erkenntnissen nach als eine multifaktorielle
Systemerkrankung
und
ist
mit
Herz-Kreislauf-Erkrankungen
und
anderen
Komorbiditäten assoziiert [96, 26]. Sowohl Zigarettenrauch als, der mit Abstand
größte Risikofaktor, als auch andere Noxen, wie z. B. die langjährige Exposition
gegenüber Umweltschadstoffen und Stäuben beispielsweise aus der Industrie,
führen zu einer gesteigerten Entzündungsreaktion in der Lunge, welche die normalen
Reparatur- und Abwehrmechanismen stört.
In der COPD ist die Anzahl und Aktivität von angeborenen Immunzellen abnorm
erhöht und führt zu einer abnorm übersteigerten Reaktion, beispielsweise auf
PAMPs, was schließlich zu einer Verstärkung der lokalen Entzündung führt. [31, 151,
178].
13
Die broncho-pulmonale Entzündungsreaktion resultiert aus einer zuerst reaktiven,
später chronifizierenden Kumulation aktiver mononukleärer (Monozyten, alveolärer
Makrophagen) und granulozytärer Entzündungszellen, insbesondere in den kleinen
Atemwegen charakterisiert [114]. Die Makrophagen- und Neutrophilenzahl ist in den
Atemwegen, dem Lungenparenchym und der bronchoalveolären Lavage (BAL) von
Probanden mit COPD im Vergleich zu gesunden Personen 5- bis 10fach erhöht [144,
272, 282]. Die Zahl jeder dieser Entzündungszelltypen korreliert hierbei mit dem Grad
der Parenchymdestruktion und ist entscheidend für die Krankheitsprogression[77,
115].
Der Grad der Inflammation steigt mit der Schwere der Erkrankung, klassifiziert nach
GOLD [115]. Die Atemwegsinflammation führt zu irreversiblem Atemwegsremodeling, erhöhter Mukussekretion, Muskelproliferation mit resultierender
fixierter Obstruktion sowie zum Teil Lungenemphysem. [26, 115]
Eine Einteilung der COPD-Stadien erfolgt nach GOLD-Standard (definiert nach den
Richtlinien der Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease)
in vier
Schweregraden mittels eines Lungenfunktionstestes (Spirometrie) [96].
Zur Bestimmung einer vorliegenden COPD-Erkrankung dienen vor allem die per
Spirometrie ermittelten Parameter FEV1 und FVC, sowie der daraus resultierende
Tiffeneau-Wert. (Siehe Stadieneinteilung Abb.3, S.23)
1.4 Exazerbation
Bisher gab es schon viele Bemühungen, eine Exazerbation genau zu definieren,
insbesondere um die wirklichen Gefahren bei den besonders schweren Verläufen
besser erkennen zu können und entsprechend darauf zu reagieren. Leider konnte
bisher keine adäquate Definition gefunden werden. Prinzipiell beschreiben
Exazerbationen eine plötzliche, deutliche Verschlechterung im Verlauf der COPD
Erkrankung innerhalb eines kurzen Zeitraums. Beschrieben wird eine akute
Verschlechterung des Gesundheitszustandes über die normalen Schwankungen des
Verlaufs der COPD hinaus, mit verstärkter Dyspnoe, Zunahme des Auswurfvolumens
und/oder der Purulenz des Sputums mit oder ohne Symptomatik eines akuten Infekts
der oberen und/oder unteren Atemwege [14].
14
Die bei Weitem häufigste Ursache von Exazerbationen der COPD sind Infekte. Obwohl
auch Noxen wie Medikamente und Luftverunreinigung zu einer Exazerbation führen
können, stellt die Atemwegsinfektion, z.B. mit gram-positiven Bakterien wie
Streptococcus pneumoniae und in geringerem Ausmaß Staphylococcus aureus [290,
215], mit 50-70 % die mit Abstand häufigste Ursache für Exazerbationen dar. [26, 33,
49,19]
Bei einer bakteriellen Entzündung der unteren Atemwege kommt es zu einer Art
Circulus vitiosus, welcher über eine Schädigung der alveolären Epithelzellen, eine
Überproduktion des Bronchialsekrets sowie eine Infiltration des Gewebes mit
Entzündungszellen wie Monozyten die Lunge chronisch schädigen kann [112,257].
Bakterielle Infektionen der Atemwege lösen Exazerbationen bei COPD aus, die die
irreversible Progression der Erkrankung beschleunigen. Bakterien, wie z.B.
S. pneumoniae, finden sich in ca. 40-60 % der Fälle [245, 246] und sind von großer
Bedeutung für Exazerbationen, den klinischen Verlauf der COPD und den Rückgang
der Lungenfunktion [62]. Sie aktivieren die angeborene und adaptive Immunabwehr.
[25, 23]
Die unvollständige Elimination von bakteriellen Krankheitserregern trägt zur
kontinuierlichen Reizung und Aktivierung von Immuneffektormechanismen bei. [293]
Es wird angenommen, dass die chronische Entzündung der Atemwege, bei der
Entwicklung von Emphysemen und Fibrosen einen irreversiblen Gewebeumbau in
der Lunge auslöst, der die wichtigste Ursache für Atemwegsobstruktion in
fortgeschrittener COPD darstellt. Die Wechselwirkung zwischen Entzündung der
Atemwege und Umbauprozessen könnte erklären, warum Exazerbationen das
Fortschreiten der Erkrankung in einer irreversiblen Weise beschleunigen. Abgesehen
von einigen gram-negativen Bakterien sind die gram-positiven S. pneumoniae und
S. aureus oft an Exazerbationen der COPD beteiligt.
S.p. und S.a. synthetisieren beide LTA, ein PAMP das kritisch für die Aktivierung von
Immunzellen und die Infektionsabwehr ist. [168, 189, 242]
So induzieren Staphylokokken die Bildung von TNF-α [274] und des CXC-Chemokins
IL-8 [256] in humanen Monozyten.
15
Somit stellt eine gesteigerte, lokale und systemische Entzündungsreaktion einen
wesentlichen Faktor der Progression der COPD dar [26, 49].
Aktive Raucher weisen eine höhere Frequenz an Exazerbationen auf als Nichtraucher.
Nikotinkarrenz kann die Exazerbationsrate um etwa ein Drittel minimieren[140].
Akute Exazerbationen gehen einher mit erhöhten Morbiditäts- und Mortalitätsraten
[176].
1.5 Spirometrie
Die Spirometrie ist eine einfache, schnelle und nicht-invasive sowie preisgünstige
Untersuchung zur Messung von Lungenvolumina und Atemstromstärken. Ihr
besonderer Wert liegt in der Diagnostik der sehr häufigen obstruktiven
Ventilationsstörungen und der Fähigkeit, deren therapeutische Beeinflussbarkeit zu
objektivieren. In diesem Sinne dient sie zur Festlegung des Schweregrades der
Obstruktion und hilft bei der Beurteilung von Therapieerfolg, Krankheitsverlauf und
Prognose.
Um
eine
Standardisierung
und
Etablierung
der
Spirometrie
flächendeckend in Deutschland zu gewährleisten, wurden im Jahr 2006 eigene
Empfehlungen zur Spirometrie durch die Deutsche Atemwegsliga entwickelt und
veröffentlicht. Die vorliegende Leitlinie ist ein Update dieser Empfehlungen. Dieses
Update wurde erstellt, um die Empfehlungen mit den gewonnenen Erfahrungen und
der heute verfügbaren wissenschaftlichen Evidenz, insbesondere zu den neuen
Normwerten, zu aktualisieren und weiterzuentwickeln. [162]
Unter Spirometrie versteht man die Messung von (relativen) statischen und
dynamischen Lungenfunktionsparametern sowie Atemflüssen am Mund [162].
In der Spirometrie gibt es statische und dynamische Parameter, die je nach
Erkrankung variieren (Abb. 1, Tab. 1 S.17).
16
Abb. 1: Statische und dynamische Lungenfunktionsparameter
und maximale exspiratorische Flüsse.
Standardabfolge mit Bestimmung der inspiratorischen Vitalkapazität (IVC) mit
nachfolgender forcierter Spirometrie.
IRV = inspiratorisches Reservevolumen; ERV = exspiratorisches Reservevolumen;
VT = Atemzugvolumen; FRC = Funktionelle Residualkapazität;
TLC = Totale Lungenkapazität; IC = Inspiratorische Kapazität
Aus: S2k-Leitlinie Spirometrie der Deutschen Gesellschaft für Pneumologie und
Beatmungsmedizin (DGP). AWMF online (Stand 2015)
Tab. 1: Relevante spirometrische Parameter.
Aus: Leitlinien zur Spirometrie 2015 der Atemwegsliga
li.: Abkürzungen; mittig: Bezeichnung; re.: Erklärung
Spirometrische Parameter
[Normwerte gesunde Erwachsene]
FVC
Forcierte Vitalkapazität
Atemvolumen, welches nach kompletter
Inspiration forciert maximal ausgeatmet
werden kann [L]
FEV1
Forciertes exspiratorisches
1-Sekunden-Volumen
Einsekundenkapazität
Atemvolumen, welches nach maximaler
Inspiration forciert in 1 Sekunde ausgeatmet
werden kann [L]
FEV1 % pred
Abgewandelter, prädiktiver
Wert der FEV1 in %
FEV1 des untersuchten Probanden/Probanden
geteilt durch den Durchschnitts-FEV1 der
entsprechenden Population mit
vergleichbarem Alter, Geschlecht und
körperliche Konstitution [%]
FEV1/FVC
Relative Einsekundenkapazität, Tiffeneau-Index
Forciertes exspiratorisches Volumen in 1
Sekunde, ausgedrückt in % der forcierten
Vitalkapazität [%]
17
Das FEV1, oder auch Einsekundenkapazität, ist ein dynamischer, zeitabhängiger
Messparameter in der Lungenfunktionsdiagnostik und beschreibt das Luftvolumen,
dass nach maximaler Inspiration innerhalb einer Sekunde maximal ausgeatmet
werden kann. Dieser Parameter wird durch Obstruktion negativ beeinflusst und somit
verringert. Die FVC ist das Luftvolumen, das nach maximaler Inspiration, maximal
ausgeatmet werden kann. Die in der Lungenfunktionsuntersuchung gemessenen
individuellen Werte werden in Abhängigkeit von Alter, Geschlecht, Größe und
Gewicht in Beziehung zu Sollwert-Standardtabellen gesetzt.
Mit Hilfe der FEV1 und der FVC wird der Tiffeneau-Wert berechnet. Dieser Wert spielt
eine wichtige Rolle zur Beurteilung einer obstruktiven Erkrankung. Hierzu wird die
FEV1 durch die FVC geteilt und beträgt im Normalfall > 0,7. Dies bedeutet, dass der
Proband mehr als 70 % der forcierten Vitalkapazität innerhalb einer Sekunde
ausatmen kann und somit keine Obstruktion vorliegt.
Bei einer bestehenden COPD-Erkrankung liegt somit der Tiffeneau-Wert bei ≤ 70 %.
Liegt eine Obstruktion vor (FEV1/FVC ≤ 0,7), dient die FEV1 der Schweregradeinteilung
der COPD. So findet man bei einem Schweregrad I nach GOLD eine nahezu
normwertige FEV1 bei reduziertem Tiffeneau-Wert von ≤ 70 %.
Ab Grad II nach GOLD findet sich bereits eine deutliche Reduktion der FEV1, die mit
zunehmendem Schweregrad weiter abnimmt (Grad II: 50 % ≤ FEV1 < 70 %, Grad III:
30 % ≤ FEV1 < 50 %, Grad IV: FEV1 < 30 %). [96]
Der im Tiffeneau-Test ermittelte Wert ist ein Maß für den Strömungswiderstand der
Atemwege.
Eine Erniedrigung des Quotienten FEV1/FVK ist charakteristisch für eine obstruktive
Ventilationsstörung.
1.6 Obstruktion
Als Obstruktion bezeichnet man den teilweisen oder kompletten Verschluss des
Lumens eines Hohlorgans oder eines Abschnittes von Gang- oder Gefäßsystemen
durch Blockade von innen, in diesem Fall, der Atemwege (Abb. 2, S.19).
18
Abb. 2: Fluss-Volumen-Kurve
bei deutlicher Obstruktion( dunkelgrau) im Vergleich zum Normwert (grau)
(Aus: Leitlinien zur Spirometrie 2015 der Atemwegsliga)
1.7 Therapie
Die Langzeittherapie richtet sich nach dem Schweregrad der Erkrankung. Insgesamt
umfasst die COPD-Therapie medikamentöse und nicht-medikamentöse Maßnahmen
[298, 282], die in erster Linie auf eine Verbesserung der respiratorischen Symptome
wie Husten, Auswurf und Luftnot abzielen.
Des
Weiteren
ist
die
Beeinflussung
funktioneller
Parameter
wie
der
Einsekundenkapazität, des Atemwegswiederstandes und des Residualvolumens von
großer Bedeutung.
Das große Problem besteht in der Irreversibilität der Erkrankung.
Alles in allem ist eine Verbesserung des Allgemeinbefindens und der körperlichen
Belastbarkeit anzustreben.
Im Rahmen der akuten Exazerbation finden in der Regel eine Eskalation sowie eine
Intensivierung der Therapie statt. Zum Management der Grunderkrankung kommt
hier meist auch eine Therapie der Infektion (durch beispielsweise gram-positive
Bakterien) mittels Antibiotika hinzu.
19
Angefangen bei allgemeinen Therapiemaßnahmen, über eine pharmakologische
Stufentherapie, bis hin zur chirurgischen Intervention wird die Form der Behandlung
individuell den Bedürfnissen des Patienten angepasst.
1.7.1 Allgemeine Therapiemaßnahmen
Beendigung der Exposition mit Zigarettenrauch
Die meisten COPD-Patienten sind aktive oder ehemalige Raucher. Wichtigster
Baustein der COPD-Behandlung ist eine absolute Karenz vom Zigarettenrauch. Dies
schließt laut einiger Studien auch das Passivrauchen mit ein. [298, 282]
Impfung und Schulung
 Impfung
Eine Pneumokokken- und Grippeschutzimpfung wird durch die Ständige
Impfkommission (STIKO) unabhängig vom Schweregrad der Erkrankung, empfohlen.
 Schulungen
Eine eingehende Aufklärung über die Erkrankung, deren Selbstkontrolle sowie
korrekte Inhalationstechnik und das richtige Atmen (Lippenbremse) sind essentielle
Bestandteile der Therapie. [298, 282]
20
1.7.2 Pharmakologische Therapie
In der medikamentösen COPD-Therapie kommen verschiedene Wirkstoffgruppen
und Behandlungsschemata zum Einsatz. [298, 282]
Bronchodilatatoren
Bronchodilatatoren stellen die Basistherapie des symptomatischen Patienten mit
COPD dar. Durch Reduktion des Bronchialmuskeltonus und damit des
Atemwegswiderstandes und durch Abnahme der Lungenüberblähung führen sie zu
einer Symptomlinderung. [282] Sie verringern somit die Atemnot bei Belastung,
reduzieren die Anzahl der Exazerbationen, helfen gegen die Entzündung und lassen
die Schleimhaut abschwellen.
Zu den Bronchodilatatoren zählen Anticholinergika, Beta-2-Sympathomimetika und
Theophyllin. Eine Kombination dieser Medikamente kann die Behandlung
verbessern. [298, 282]
 Anticholinergika
Das kurz wirksame Ipratropium ist das bekannteste Anticholinergikum. Es erweitert
die Bronchien, vermindert die Schleimproduktion, verbessert die Atmung und damit
die körperliche Leistungsfähigkeit. Die volle Wirkung tritt nach 20 bis 30 Minuten ein.
[282]
Die Wirkung des lang wirksamen Anticholinergikums Tiotropiumbromid hält 24
Stunden an. Der Wirkstoff wird deshalb nur einmal am Tag eingenommen. Er
verringert die Überblähung der Lunge, die Atemnot und die Exazerbationen und
reduziert/ verkürzt somit die Krankenhausaufenthalte. [298, 282]
 Beta-2-Sympathomimetika
Bei akuter Atemnot werden kurz wirksame Beta-2-Sympathomimetika eingesetzt. Sie
wirken fast sofort. Die verwendeten Substanzen heißen Fenoterol, Salbutamol und
Terbutalin.
Lang wirksame Beta-2-Sympathomimetika wie Salmeterol und Formoterol wirken
etwa zwölf Stunden, Indacaterol sogar rund 24 Stunden.
21
Die Wirkstoffe helfen gegen Atemnot, verbessern die Lungenfunktion, reduzieren die
Überblähung der Lunge sowie Exazerbationen und führen damit zu einer
verbesserten Lebensqualität. Als Nebenwirkungen können Herzrhythmusstörungen
auftreten. [298, 282]
 Theophyllin
Traditionell wurde Theophyllin als Wirkstoff der dritten Wahl zur COPD-Behandlung
eingesetzt, der langfristig die Bronchien erweitert. Problematisch war bei der
Einnahme der benötigte hohe Wirkstoffspiegel, der häufig zu Nebenwirkungen führt.
Wegen der genannten Risiken ist Theophyllin umstritten. [298, 282]
Derzeit findet Theophyllin jedoch eher in deutlich geringeren Konzentrationen
Einsatz in der Therapie der COPD. Es wirkt unter anderem durch Verbesserung des
Effektes von Kortikosteroiden antiinflammatorisch bei deutlich geringeren
Nebenwirkungen. [53]
Kortison
Die Anwendung von Kortison wird in Erwägung gezogen, wenn die Einsekundenkapazität weniger als 50 Prozent des Normalwertes beträgt und wenn bei
Exazerbationen zusätzlich Steroide und/oder Antibiotika angewendet werden.
Gerade bei Probanden, die zusätzlich zur COPD unter Asthma leiden, wird Kortison
eingesetzt. [298, 282]
Mehrere, große Studien haben gezeigt, dass hohe Dosen inhalativer Kortikosteroide
nicht in der Lage sind die Progression der COPD zu unterbinden. [279, 219, 172, 38]
Außerdem konnte nur ein geringer Effekt in der Reduktion der Exazerbation gezeigt
werden[212].
Im Gegensatz dazu zeigte sich ein Benefit in der Anwendung systemischer
Kortikosteroide bei akuter Exazerbation der COPD mit verbessertem klinischen
Outcome und kürzerer Hospitalisationsdauer. [144, 56, 202]
Die Leitlinie der Deutschen Atemwegsliga empfiehlt bei der COPD-Therapie eine
stufenweise angepasste Behandlung, die sich nach dem Schweregrad der Symptome
richtet.
22
Von Stufe zu Stufe müssen zusätzlich mehr COPD-Medikamente angewendet
werden, wobei viele der Präparate inhalierbar sind. So müssen Probanden der Stufe
3 beispielsweise auch die Medikamente der Stufen 1 und 2 anwenden. [298, 282]
Abb. 3: Stufentherapie der COPD
aufgeteilt nach Schwere der Erkrankung und der entsprechenden Therapie beginnend von
der niedrigsten Stufe (Stadium I) aufsteigend (bis Stadium IV). (Therapie immer ergänzend
zu den vorherigen Stufen) Angelehnt an die GOLD-Guidelines COPD 2011 und nach den
Leitlinien der Deutschen Atemwegsliga [282]
Bei einer bakteriellen Infektion ist ggf. die Therapie mittels Antibiotika unablässig.
Probanden mit einer schwergradigen Exazerbation (schwere Atemnot, FEV1 < 30%,
rasche Verschlechterung, hohes Alter) müssen sich stationär in einer Klinik behandeln
lassen.
23
1.8 Das Problem der COPD und ihrer Therapie
Der Verlauf der COPD Erkrankung ist irreversibel und kann durch geeignete
Medikation nur verlangsamt aber nicht aufgehalten werden [218]. Zwei Punkte sind
entscheidend für die Tatsache, dass die momentanen Therapiemöglichkeiten nicht
ausreichend sind:
1. Atemwegs- und systemische Inflammation in der stabilen COPD sind
weitestgehend resistent gegenüber der anti-inflammatorischen Wirkung von
Kortikosteroiden [27] und
2. COPD-Erkrankte (wie auch Raucher mit normaler Lungenfunktion) sind anfälliger
für bakterielle (und möglicherweise auch virale) Infektionen als lungengesunde
Nichtraucher [83, 19, 34, 44, 192, 217]. Dies impliziert eine defekte Immunabwehr
gegen bakterielle Atemwegsinfektionen.
In unserer heutigen Gesellschafft wächst jedoch auch mit zunehmender Resistenz die
Rolle des S. aureus (MRSA). Bakterielle (und virale) Infektionen verstärken
Atemwegs- und systemische Inflammation. Dadurch verursachen Sie COPD
Exazerbationen, die im Laufe der Erkrankungsdauer meist an Häufigkeit zunehmen
und auf Grund eines beschleunigten Verlustes der Lungenfunktion, einen
entscheidenden prognostischen Faktor der COPD darstellen. [213, 289] Sie erfordern
somit eine Intensivierung der Therapie, die momentan unzureichend ist.
Es ist von immenser Bedeutung und Ziel dieser Arbeit, die dahinterstehenden
Mechanismen/ molekularen Pathologien aufzudecken und zu verstehen, um so
zielgerichtet neue therapeutische Targets zur Entwicklung von Strategien zur
Behandlung von Infekt-bedingten-Exazerbationen zu entschlüsseln.
1.9 Das Immunsystem
Das Immunsystem ist komplex und dient dem Schutz des Individuums. Beim
Menschen besteht das Immunsystem aus drei wichtigen Komponenten. Der
zellulären und humoralen Abwehr, sowie den Oberflächenbarrieren. Es wird in ein
angeborenes/unspezifisches und erworbenes/spezifisches Immunsystem unterteilt.
24
1.9.1 Das angeborene Immunsystem
Zum
angeborenen/unspezifischen
Immunsystem
zählen
neben
den
Oberflächenbarrieren die zelluläre Abwehr durch Makrophagen, Granulozyten,
dendritische Zellen, Monozyten, Mastzellen und natürliche Killerzellen. Im Bereich
der humoralen Abwehr zählen körpereigene Botenstoffe wie Zytokine, die in
verschiedener Form von den unterschiedlichsten Zellen des Körpers als Reaktion auf
eine Reizung exprimiert werden, dazu. Phagozytierende Zellen erkennen Pathogene
anhand charakteristischer Strukturmotive, die diese von körpereigenen Zellen
unterscheiden. Diese Strukturmotive, sogenannte pathogen-assoziierte molekulare
Muster (pathogen-associated molecular patterns, PAMPs), sind essentiell für das
Überleben der Pathogene und deshalb im Verlauf der Evolution hoch konserviert
[127, 136, 5]. Auf die PAMPs wird im Abschnitt 1.15 Stimulantien noch genauer
eingegangen. Die Aktivierung der angeborenen Immunabwehr ist eine wichtige
Voraussetzung für eine nachfolgende adaptive Immunantwort.
1.9.2 Das adaptive Immunsystem
Die spezifische oder adaptive Immunabwehr zeichnet sich durch große
Anpassungsfähigkeit
angeborenen
gegenüber
Immunsystem
Veränderungen
verwendet
das
aus.
Im
adaptive
Gegensatz
Immunsystem
zum
ein
umfangreiches Repertoire an Rezeptoren, die von rekombinierenden Genen codiert
werden. So kann eine große Vielfalt von Pathogenen antigenspezifisch erkannt
werden. Es entstehen antigenspezifische Effektorzellen und Gedächtniszellen, was
somit zur Ausbildung eines immunologischen Gedächtnisses führt.
Eine erneute Infektion mit demselben Pathogen kann somit frühzeitig unterbunden
werden[13, 185].
Das adaptive Immunsystem, das in der Evolution erst nach der angeborenen
Immunität entstanden ist, kommt nur bei Vertebraten vor [113]. Vor allem B- und TLymphozyten stellen zwei wichtige Elemente diesen Teils des Immunsystems dar. Sie
weisen auf ihrer Oberfläche sehr variable, antigenspezifische Rezeptoren auf, die
eine Erkennung einer Vielzahl von Antigenen ermöglichen[125].
25
Bei B-Lymphozyten liegen die antigenspezifischen Rezeptoren als Immunglobuline
auf der Oberfläche vor. Sie können im Extrazellulärraum vorliegende Antigene direkt
erkennen. Im Gegensatz dazu erkennen T-Lymphozyten Antigene über den
T-Zell-Rezeptor nur nach Prozessierung und Präsentation der Antigenpeptide im
Komplex
mit
MHC-Molekülen
(major
histocompatibility
complex).
Antigenpräsentierende Zellen erkennen mikrobielle Pathogene anhand von
pathogen-assoziierten, molekularen Mustern über Toll-like Rezeptoren auf ihrer
Oberfläche. Die Induktion der TLR-Signalkaskade bewirkt die Ausreifung der Zellen
und die Präsentation von Antigenpeptiden [214].
1.10 Die Zellen des Immunsystems
Ursprung aller Zellen des Immunsystems sind die pluripotenten, hämatopoetischen
Stammzellen. Diese können sich in myeloische oder in lymphatische Vorläuferzellen
differenzieren, welche als Beginn der Differenzierung in zwei verschiedene
Hauptlinien angesehen werden [232]. Aus der myeloischen Vorläuferzelle entsteht
neben Megakaryozyten, die wiederum Grundlage der Thrombozytogenese sind, die
Gruppe der Granulozyten. Dort wird später zwischen eosinophilen, neutrophilen und
basophilen Zellen unterschieden. Die sogenannte Mastzelle ähnelt dem basophilen
Granulozyten in vielen Eigenschaften, ist jedoch nur im Gewebe und nicht im
Kreislauf zu finden. Ihr Verwandtschaftsgrad zum Basophilen ist noch nicht
vollständig geklärt. Die monozytäre Entwicklungsreihe nimmt ihren Ursprung
ebenfalls in der myeloischen Vorläuferzelle. Aus ihr gehen Makrophagensubklassen
hervor, welche später in verschiedenen Organen anzutreffen sind, z.B. als
Alveolarmakrophagen der Lunge oder als Kupffer-Sternzellen in der Leber.
Polymorphkernige Granulozyten und monozytäre Zellen werden funktionell in der
Gruppe der Phagozyten zusammengefasst [232].
26
1.11 Monozyten
Zugehörig zu der Gruppe der Leukozyten (ca. 2-8% der Gesamtleukozytenpopulation) bilden sie einen wichtigen Bestandteil der zellulären Immunabwehr.
Im Knochenmark befindliche hämatopoetische Stammzellen können sich unter
Einfluss bestimmter Wachstumsfaktoren wie GM-CSF (Granulozyten-Makrophagen
Kolonie-stimulierender Faktor) und M-CSF (Makrophagen Kolonie-stimulierender
Faktor) in sogenannte Monoblasten entwickeln. Aus ihnen wiederum differenzieren
sich Monozyten, die dabei das Knochenmark verlassen und in den Blutkreislauf
übergehen. Dort zirkulieren sie für 1-3 Tage und bilden mit einem Durchmesser von
5–20 µm die größte Zellart des zirkulierenden Blutes. Mit einem Anteil von 4-10 %
(abweichend je nach Literatur) am Differentialblutbild, machen sie jedoch nur einen
kleinen Teil des Blutes aus.
Sie besitzen einen (von griech. monos, „einzig“) charakteristischen, großen Kern von
meist bohnenartiger Form und verhältnismäßig wenig Zytoplasma.
Der wichtigste Speicherort der Monozyten ist die rote Milzpulpa, von der sie bei
akuten Entzündungen in großer Zahl freigesetzt werden können.
Monozyten sind nicht terminal differenziert, sondern differenzieren sich bei Bedarf
zu Zellen des mononukleären Phagozytensystems (MPS). Bei einer akuten Infektion,
z.B. der Lunge, werden Monozyten aus dem peripheren Blut sehr schnell durch lokale
Signale aus ihrer Mikroumwelt aktiviert. Sie passieren daraufhin die pulmonalen
Blutgefäßwände und wandern in das Lungengewebe ein. [89, 121]
Die Zirkulationsdauer der Monozyten ist abhängig von den im Laufe der Inflammation
gebildeten Entzündungsmediatoren, welche die Chemotaxis und die Diapedese an
den Ort der Inflammation vermitteln. Aus der Blutbahn gelangen die Monozyten ins
Gewebe, wo sie sich als ortsständige Makrophagen gewebetypisch ausdifferenzieren
[197]. Zuvor üben sie jedoch auch selbst für eine kurze Zeit Effektorfunktionen aus
(z.B. Ausschüttung von Zytokinen) [89, 121].
Monozyten können eine Vielzahl von Krankheitserregern über PRRs erkennen und
durch Phagozytose, Antigenpräsentation und Zytokinexpression eliminieren, sowie
inflammatorische Antworten induzieren.
27
Die Aktivierung mit LPS führt zur Freisetzung von IL-8, TNFα und GM-CSF, alles
Zytokine, die entscheidend sowohl für die Infektabwehr als auch für die chronische
Atemwegs- und systemischen Inflammation in der COPD sind [49]. Diese erste
Ausschüttung von Effektorzytokinen durch Monozyten ist wichtig für die frühe
Bekämpfung von akuten bakteriellen Infektionen [89]. Ihre Aufgabe ist unter
anderem die Zerstörung körperfremder Strukturen durch Phagozytose und die
Aktivierung der erworbenen Immunabwehr mittels Antigenpräsentation. Sie
gehören somit zur angeborenen Immunantwort, beeinflussen in ihrer Funktion
jedoch auch das adaptive Abwehrsystem [76, 85].
Die exprimierten Zytokine führen dazu, dass weitere Monozyten sowie andere an der
Infektabwehr beteiligte Zellen zum Ort der Infektion gelockt werden (Chemotaxis
durch IL-8). Es treten weitere entzündungstypische Reaktionen auf.
Die Sekretion von TNFα durch den Monozyten erhöht z.B. die Gefäßpermeabilität,
sorgt für die Vasodilatation und induziert die Expression von Adhäsionsmolekülen,
die die Extravasation von Leukozyten an den Ort der Infektion zur Abwehr des
Pathogens ermöglichen.
Durch diese ersten Reaktionen der Monozyten auf einen eingedrungenen Erreger
setzen sie die „Akutphase-Reaktion“ in Gang. [156, 225]
Somit sind Monozyten auch in größerem Maße an der COPD-Erkrankung, sowie deren
Exazerbation beteiligt. [184, 181, 243]
28
Abb. 4: Monozyt im Blutausstrich (peripheres, venöses Blut)
Färbung nach Pappenheim/ May-Grünwald-Gimsa. Probenausstrich aus
eigener Studie. Mikroskopische Ansicht bei 400facher Vergrößerung
(nicht beschriftet, rund: Erythrozyten)
1.12 Signalwege
(Mustererkennende Rezeptoren (PRRs) und Pathogen-assoziierte molekulare
Muster (PAMPs))
Unter PAMPs versteht man spezifische Strukturmotive, die ein Erkennen von
Erregern wie Bakterien im Rahmen der Immunantwort ermöglichen [128].
Bei Bakterien sind Lipopolysaccharide und Peptidoglycan häufige PAMPs [128].
Erkannt werden die PAMPs von den Pattern-Recognition-Rezeptoren (PRRs), die als
Teil der angeborenen Immunantwort bereits beim ersten Kontakt eine Immunreaktion erzeugen und somit eine zentrale Stellung in den Abwehrprozessen
einnehmen [128].
29
PRRs funktionieren wie die klassischen Rezeptoren der gesamten Immunantwort: Sie
können beispielsweise als Rezeptoren bei der Phagozytose dienen, um Erreger
erstmals zu erkennen. Daraufhin können die Antigene auf den Oberflächen dieser
phagozytierenden Zellen dargestellt werden und so weitere Signalkaskaden der
Immunantwort auslösen. Sie dienen der Opsonierung, der Aktivierung, der
Komplement- oder Gerinnungskaskade, der Aktivierung pro-inflammatorischer
Signalwege oder der Induktion von Apoptose. Mustererkennende Rezeptoren (PRRs)
werden sowohl intrazellulär als auch auf der Oberfläche verschiedener Zellen
exprimiert oder werden in Blut oder Gewebsflüssigkeiten sezerniert. [128]
Im Rahmen dieser Arbeit spielen besonders die Toll-like-Rezeptoren (TLR1, TLR2) als
Oberflächenrezeptoren
und
die
NOD-like-Rezeptoren
(NOD1,
NOD2)
als
intrazelluläre PRRs eine wichtige Rolle. Sie werden besonders in und auf Monozyten
sowie deren nachfolgenden Entwicklungsstufen exprimiert [128].
1.12.1 Toll-like-Rezeptoren
Die
Familie
der
humanen
mustererkennenden
Toll-like
Rezeptoren
Rezeptoren,
(PRRs)
gehört,
die
zur
nimmt
Gruppe
der
durch
ihre
immunstimulierenden und -modulierenden Eigenschaften eine zentrale Stellung in
der angeborenen Immunantwort ein. TLRs werden auf verschiedenen Zelltypen des
Immunsystems exprimiert [306], hauptsächlich aber auf Zellen des MPS. In
nachfolgender Tabelle ist die mRNA-Expression der in dieser Arbeit gemessenen TLRs
auf studienrelevanten Zellen gezeigt.
Tab. 2: mRNA-Expression von Toll-like Rezeptoren in humanen Blutzellen.
+: niedrige Expression; ++: mittlere Expression; +++: sehr hohe Expression
[199, 188, 135]
TLR1
TLR2
Monozyten
++
+++
Makrophagen
+
+
Dendritische Zellen
+
30
Ihr Name leitet sich von ihrer strukturellen und funktionellen Homologie zu dem bei
der Taufliege Drosophila melanogaster entdeckten Rezeptor Toll ab. Da der Rezeptor
im zytoplasmatischen Anteil Sequenzhomologien zu dem in Säugetieren
vorkommenden IL-1-Rezeptor (IL-1R) aufweist, über den die Aktivierung von
Transkriptionsfaktoren der Nukleäre Faktor κB (NF-κB)-Familie induziert wird, wurde
vermutet, dass der Rezeptor Toll zusätzlich in Vorgänge der angeborenen
Immunantwort involviert ist [87]. In der Taufliege wird über den Toll-Signalweg die
Aktivierung von Transkriptionsfaktoren induziert, die ihrerseits Sequenzhomologien
zur NF-κB-Familie aufweisen [30]. Die Vermutung, dass Toll neben seiner Funktion in
der Entwicklung der Taufliege eine Rolle in deren Immunabwehr einnimmt, wurde
durch Untersuchungen an Drosophilastämmen bestätigt [163]. Die homologe,
zytoplasmatische Domäne der IL-1R-Familie und der Proteine der Toll-Familie, die
sogenannte TIR Domäne (Toll/IL-1R Domäne), lässt sich in einer Vielzahl von
Transmembranproteinen und zytoplasmatischen Proteinen nachweisen [206].
Proteine, die eine TIR Domäne aufweisen, sind in der Evolution hoch konserviert und
kommen neben Insekten wie Drosophila melanogaster und Säugetieren auch bei
Nematoden und Pflanzen vor. Ein Großteil von ihnen ist in Abwehrmechanismen ihrer
Immunsysteme involviert [16, 120].
1997 gelang der Arbeitsgruppe um Medzhitov und Janeway die Entdeckung des
ersten humanen Toll-Homologs, welches heute als Toll-like Rezeptor 4 bezeichnet
wird [183]. Bei Säugetieren sind inzwischen 11 Mitglieder der Familie der Toll-like
Rezeptoren (TLRs) identifiziert und für TLR1-9 sind bereits Liganden beschrieben.
Ein Großteil der Liganden gehört zu den pathogen-assoziierten, molekularen
Mustern. Da ich mich in meiner Arbeit mit TLR1 und TLR2 beschäftigt habe, ist vor
allem die TLR2-Subfamilie von Interesse[266, 264].
Toll-like Rezeptoren sind Transmembranproteine [183]. Eine Hauptfunktion scheint
die Vermittlung von Protein-Protein-Interaktionen zu sein wie die Erkennung und
Bindung von Liganden und Signalübertragung [153]. Das Expressionsmuster der
einzelnen Mitglieder der Toll-like Rezeptoren variiert zwischen den verschiedenen
Immunzellen. Monozyten scheinen alle TLRs (TLR1 - 11) zu exprimieren, während
andere Zelltypen nur bestimmte TLRs exprimieren [305, 116].
31
Darüber hinaus unterscheidet sich auch das Expressionsniveau der einzelnen Toll-like
Rezeptoren in den verschiedenen Immunzellen: Monozyten exprimieren z.B.,
verglichen mit B-Lymphozyten, CD4+ - bzw. CD8+ -Lymphozyten und NK-Zellen, die
höchsten Level an TLR2 [116].
Es konnten spezifische intrazelluläre Signalwege für verschiedene TLRs nachgewiesen
werden, die auf bestimmte PAMPs hin zur Freisetzung charakteristischer
Zytokinprofile führen (MyD88-abhängiger und -unabhängiger Signalweg). Des
Weiteren kann der gleiche Ligand über den gleichen Toll-like Rezeptor bei
verschiedenen Zelltypen die Produktion unterschiedlicher Zytokine induzieren.
Die meisten PAMPs werden in Form von TLR-Homodimeren erkannt, lediglich die
Rezeptoren 1 und 6 scheinen als Heterodimere mit TLR2 zu agieren [211]. Sie bilden
Rezeptorkomplexe, wodurch eine weitere Spezifizierung erreicht wird. So erkennt
das TLR1/TLR2-Heterodimer bakterielle, tri-acylierte Lipopeptide. [268, 165].
Tab. 3: Wichtige Toll-Like-Rezeptoren und einige ihrer Liganden [199, 135]
Toll-Like-Rezeptor
Ligand
Vorkommen
(Auswahl)
TLR2
TLR2/TLR1
LTA
(gram+ Bakterien)
PGN
(gram+ Bakterien)
Lipoprotein
(Bakterien)
Tri-acyl-Lipopeptide (amiA)
(Bakterien)
Monozyten
Makrophagen
Monozyten
1.12.2 NOD
Ein Beispiel für die Gruppe der intrazellulären PRRs und wichtiger Bestandteil meiner
Arbeit sind die NOD-Proteine (nucleotide-binding oligomerization domain, NOD).
Diese sind an der intrazellulären Erkennung mikrobieller Pathogene und ihrer
Produkte beteiligt. Dazu wird zunächst das Bakterium in unserem Fall von Monozyten
phagozytiert und in seine Bestandteile zerlegt, die daraufhin an NOD binden.
32
NOD1/CARD4 und NOD2/CARD15 wurden auf der Suche nach Proteinen mit
Homologie zu Apaf-1 entdeckt. NOD1 wird ubiquitär exprimiert, NOD2 hingegen
vorwiegend in myeloischen Zellen [32, 123]. NOD1 und NOD2 sind vorwiegend im
Zytosol lokalisiert. Es gibt jedoch Hinweise darauf, dass NOD2 in monozytären Zellen
zur Plasmamembran rekrutiert werden kann [28, 70]. Beide Moleküle aktivieren u.a.
den Transkriptionsaktivator NF-κB und nachfolgend eine NF-κB-abhängige
Genexpression [139, 45]. Ursprünglich wurde vermutet, dass NOD1 und NOD2
intrazelluläres LPS detektieren können [125]. Spätere Untersuchungen zeigten
jedoch, dass sie hochspezifische Peptidoglykanfragmente erkennen [95]. Die
minimale von NOD2 erkannte Struktur stellt das Muramyldipeptid (MDP) dar,
welches Peptidoglykanbestandteil sowohl Gram-positiver als auch Gram-negativer
Bakterien ist [95].
Abb. 5: TLR abhängige Erkennung von mikrobiellen Komponenten.
TLR2 ist an der Erkennung von Peptidoglycan (PGN) beteiligt. Allerdings konnte kürzlich
gezeigt werden, dass NOD1 und NOD2 ebenfalls Bestandteile des PGN erkennen. Es ist
außerdem möglich, dass TLR2 Lipoprotein-Kontamination in der PGN-Schicht erkennt [265]
33
1.13 Signalkaskade
Wie im vorangegangenen Abschnitt erwähnt, können über TLRs spezifische
intrazelluläre Signalwege induziert werden, so dass charakteristische Zytokinprofile
freigesetzt werden. Generell kann man in der TLR-Signalkaskade einen MyD88abhängigen Weg, den alle TLR-Mitglieder außer TLR3 nutzen, und einen MyD88unabhängigen Weg, über den nur einige TLRs Signale vermitteln, unterscheiden.
Da ich mich in meiner Arbeit mit den Rezeptoren TLR1 und TLR2, sowie NOD1 und
NOD2 befasse, beschränke ich mich im Folgenden nur auf den MyD88-abhängigen
Signalweg, der in Abb.5 (S.33) und Abb.6 (S.36) in modifizierter Form dargestellt ist.
1.14 Der MyD88-abhängige Signalweg
Das Myeloid differentiation primary response Gen MyD88 ist ein Adapterprotein an
Toll-like-Rezeptoren.
Es ist essentiell zur Fortführung der proinflammatorischen Kaskade und somit der
Expression inflammatorischer Zytokine wie TNFα. [270, 142, 240, 103]
Erkennt TLR2 ein eindringendes, potentiell pathogenes Bakterium beispielsweise
anhand von Peptidoglykanen in dessen Zellhülle, wird die TLR-Signalkaskade
aktiviert.
Das Adapterprotein MyD88 tritt infolge von Interaktionen zwischen TLRs und PAMPs
über seine C-terminale TIR-Domäne mit der TIR-Domäne des TLR in Wechselwirkung.
Über seine N-terminale „Todesdomäne“ (zuerst bei Proteinen gefunden, die in
Apoptoseprozesse involviert sind) bindet und aktiviert MyD88 die IL-1 Rezeptorassoziierte Kinase (IRAK) 4, was zur Phosphorylierung von IRAK-1 führt. An dieser
Stelle setzt nach Bedarf MyD88s, eine verkürzte Spleiß-Variante von MyD88 (s =
splice), an. Es bindet MyD88 und inhibiert so die Rekrutierung von IRAK-4 [129, 40].
Somit wirkt es antiinflammatorisch durch Negativregulation des TLR-Signalweges
[265].
Des Weiteren kann auch eine Negativregulation direkt am IRAK durch die nicht-aktive
Kinase IRAK-M stattfinden. IRAK-M wird ausschließlich in Monozyten und
Makrophagen exprimiert.
34
Während IRAK und IRAK-4 für die Aktivierung der Signalkaskade wichtig sind, nimmt
IRAK-M eine negativ regulatorische Rolle am TLR-Signalweg ein: es inhibiert die
Dissoziation von IRAK (-4) von MyD88 und die Komplexbildung mit TRAF-6 [291].
Somit wirkt dieses Protein inhibitorisch auf die an der proinflammatorischen Kaskade
des TLR-Signalweges beteiligten IRAK [265].
Kommt es an dieser Stelle zu keiner Inhibition bilden IRAK1 und -4 nachfolgend einen
Komplex mit TRAF6 (TNF-Rezeptor assoziierter Faktor 6).
Dieser Komplex aktiviert den IκB (inhibitory κB)-Kinase-Komplex (IKK) oder
mitogenaktivierte Proteinkinase-Kinasen (MAPKK). IκB hält NF-κB im Zytoplasma
zurück, bis es durch den IKK-Komplex, bestehend aus IKKα und -β sowie NEMO/IKKγ,
phosphoryliert wird. NF-κB kann nun in den Zellkern einwandern und die
Transkription von Genen inflammatorischer Zytokine induzieren. Auch an TRAF kann
eine Inhibition stattfinden. Das Zinkfingerprotein A20 (auch als TNFΑIP3 bekannt) ist
ein stark antiinflammatorisches Signalmolekül, das mehrere zelluläre Signalwege
einschränkt. So ist es unter anderem ein Negativregulator/ Inhibitor des
TLR-Signalwegs durch Deubiquitinierung von TRAF6 [18, 35].
Für TLR2 und TLR4 wird der MyD88-abhängige Weg zusätzlich über das TIR-Domäneenthaltende Adapterprotein TIRAP generiert, welches die Signaltransduktion
zwischen TLR und MyD88 transduziert [300].
35
Abb. 6: TLR-Signalweg
reduziert auf die hier untersuchten Bestandteile. Das Adapterprotein MyD88 bindet über
die TIR-Domäne an den Toll-Like-Rezeptor und rekrutiert darüber entsprechende IRAKs, die
daraufhin TRAF6 aktivieren. TRAF6 wiederum wirkt auf NF-kB und führt somit zur
Expression inflammatorischer Zytokine. NOD2 aktiviert ebenfalls NF-kB und führt somit zu
einer inflammatorischen Reaktion. Eine Negativregulation findet unter anderem über
MYD88s, IRAK-M und A20 statt. (Grafik entnommen und adaptiert aus: Negative regulation
of Toll-like receptor-mediated immune responses [81])
1.15 Stimulantien
1.15.1 Totalextrakte
Der menschliche, obere Atemtrakt ist laut Watson und Kollegen das Reservoire einer
Vielzahl von kommensalen Bakterien und potentiellen Pathogenen, einschließlich
Streptococcus pneumoniae und Staphylococcus aureus [288], die dort meist
asymptomatisch residieren.
In verschiedenen Studien wurde die Wichtigkeit besonders dieser beiden Bakterien
bezüglich der respiratorischen Erkrankung gezeigt.
36
Bakterielle Pneumonien werden vorrangig durch diese kommensalen Bakterien
verursacht. [234, 36]
Etwa 25-50% der COPD-Patienten sind chronische Keimträger.
Untersuchungen ergaben, dass die Keimbesiedlung der unteren Atemwege bei
diesen Patienten in enger Korrelation mit dem Schweregrad der Erkrankung steht
[191, 304]. Einige Studien haben ergeben, dass es während der Exazerbation der
COPD zu einer Zunahme der Bakterienzahl kommt [295].
Außerdem sind S. pneumoniae, gefolgt von H. influenzae und S. aureus die häufigsten
Ursachen für eine bakterielle Pneumonie bei Kindern unter fünf Jahren [234].
1.15.1.1
Staphylococcus aureus
S. aureus ist verantwortlich für eine große Anzahl von lebensbedrohlichen
Infektionen, die zu Erkrankungen wie Pneumonie führen [171]. Resistente S. aureusStämme (MRSA) sind auf dem Vormarsch und stellen eine ernsthafte Gefahr für die
menschliche Gesundheit dar [43]. Das Bakterium zählt mit ca. 29 % der ursächlichen
Erreger zu den wichtigsten Erregern nosokomialer erworbener Infektionen/
Pneumonien [71].
1.15.1.2
Streptococcus pneumoniae
Gram-positive Diplokokken wurden als eine Hauptursache von Pneumonien im
späten 19. Jahrhundert erkannt und sind Gegenstand zahlreicher Studien bezüglich
humoraler Immunität. Mit ca. 14% sind sie der häufigste Erreger der ambulant
erworbenen Pneumonie sowie der AECOPD. [236]
37
1.15.2 Zellwandbestandteile gram-positiver Bakterien
1.15.2.1
Peptidoglykan PGN
Die Zellhülle gram-positiver und -negativer Bakterien enthält als einen wesentlichen
Bestandteil Peptidoglykan (PGN) bzw. Murein oder seltener Polysaccharid-Peptid.
Gram-positive Bakterien weisen eine mehrschichtige Peptidoglykanschicht, gramnegative Bakterien nur eine einschichtige Mureinschicht zwischen der Zellmembran
und der äußeren Membran auf. Mit bis zu 40 Schichten bietet das PGN grampositiven Bakterien eine hohe Stabilität und Schutz. Das Peptidoglykan der
Bakterienzellwand ist aus Zuckerketten aufgebaut, die alternierend
N-actylglucosamin und N-Acetylmuraminsäure enthalten. Diese Zuckerketten sind
miteinander durch Oligopeptide quervernetzt. Das so entstehende Netzwerk ist
wesentlich für die Form und die mechanische Stabilität der Bakterienzelle
verantwortlich. Neben der Dicke der Peptidoglykanschicht unterscheiden sich grampositive und negative Bakterien auch in ihren vernetzenden Oligopeptiden. So weist
das PGN gram-negativer Bakterien, im Gegensatz zu PGN gram-positiver Bakterien,
neben Muramyldipeptiden (MDP) auch Muramyltripeptide auf. Die Stimulation mit
Peptidoglykan induziert zum Beispiel in Monozyten und Makrophagen, vermittelt
über die Toll-like Rezeptoren 2 und -6, die Produktion von TNFα und setzt somit die
Immunabwehr in Gang. [5, 103, 221].
Abb. 7: Graphische Darstellung der Bakterienzellwand gram-positiver Bakterien [253]
38
1.15.2.2
Lipoteichonsäure (Lipoteichoic acid, LTA)
Lipoteichonsäuren (LTA) kommen in der Zellwand gram-positiver Bakterien vor. Sie
sind, wie auch LPS, amphiphil, Sie weisen sowohl einen hydrophoben als auch einen
hydrophilen Anteil auf. Der hydrophile Anteil, ein Polyphosphatpolymer, ist über ein
Glykolipid an der äußeren Zytoplasmamembran verankert. Die chemische Struktur
der LTA variiert zwischen verschiedenen gram-positiven Bakterien. Die am weitesten
verbreitete LTA-Struktur, wie sie bei S. aureus zu finden ist, besteht aus einem
linearen Polymer aus Polyglycerolphosphat-Einheiten, die über eine Phosphodiesterbindung verbunden sind. Bakterien, die diesen klassischen LTA-Typ aufweisen,
unterscheiden sich in der Häufigkeit, in der D-Alanin oder D-Alanin mit einem
Glykosylrest an diese Kette substituiert sind. Je lipophiler diese Kette ist, desto höher
scheint die biologische Aktivität zu sein. So induziert LTA von S. aureus (hoher
Alaningehalt) eine stärkere Stickstoffmonoxid-Freisetzung in Makrophagen als LTA
von Bacillus subtilis, einem anderen gram-positiven Bakterium. Werden humane
Monozyten mit LTA stimuliert, werden pro-inflammatorische Zytokine wie TNFα
freigesetzt. Die Aktivierung von Immunzellen durch LTA erfolgt über TLR2. [273, 242].
1.15.2.3
Lipopeptid amiA (von S. pneumoniae)
Lipoproteine/Lipopeptide sind membrangebundene Lipoproteine der bakteriellen
Zellwand, die in einer Vielzahl von Bakterien u.a. S. pneumoniae vorkommen[2].
Zugehörig zu den ABC-Transportern induzieren Sie starke Entzündungsreaktionen,
wobei die proinflammatorischen Eigenschaften auf ihre N-terminalen CysteinEinheiten zurückzuführen sind. Man unterscheidet zwischen tri- und diacylierten
Lipopeptiden (Pam3Cys oder Pam2Cys). Bei dem Lipopeptid amiA handelt es sich um
ein triacyliertes Lipoprotein. Die Erkennung von triacylierten Lipopeptiden wird
vorwiegend über das TLR2/TLR1-Heterodimer vermittelt [241, 174].
39
1.16 Peptidoglykanerkennungsprotein
(engl. Peptidoglycan Recognition Protein PGRP)
Neben den NOD-Proteinen wurde eine weitere Familie von PeptidoglykanErkennungsproteinen beschrieben: die peptidoglycan recognition proteins (PGRPs).
Diese sind Teil der angeborenen Immunantwort auf bakterielle Infektionen. Das erste
PGRP wurde in der Seidenraupe (Bombyx mori) als ein Protein, welches bakterielles
Peptidoglykan erkennt und daraufhin die Aktivierung der Prophenol-Oxidase Kaskade
initiiert, entdeckt [302].
Insekten haben bis zu 19 PGRPs, Säugetiere besitzen 4 PGLYRPs, welche sezerniert
werden [137, 167]. Säugetiere besitzen eine Familie aus vier PGRPs, die zunächst
analog zu den Insekten-PGRPs als PGRP-S, PGRP-L, PGRP-Iα und PGRP-Iß (für short,
long, intermediate) bezeichnet wurden [167]. Diese Namen wurden später durch das
„Human Genome Organization Gene Nomenclature Committee“ in PGLYRP-1 – 4
umbenannt. Die Säugetier-PGLYRPs übernehmen wichtige Funktionen bei der
angeborenen Immunität gegenüber pathogenen Bakterien. Im Gegensatz zu den
Insekten PGRPs erkennen Säugetier-PGLYRPs bakterielles Peptidoglykan nicht nur,
sondern wirken auch direkt bakterizid [66]. Alle vier PGLYRPs sind lösliche
intrazelluläre oder sezernierte Moleküle. PGLYRP-1, PGLYRP-3 und PGLYRP-4 haben
eine antibakterielle Aktivität [233, 173].
Säugetier-PGLYRPs spielen keine Rolle beim TLR-induzierten Signalweg. Alle PGRPs
besitzen mindestens eine C-terminale PGRP-Domäne (ca. 165 Aminosäurereste), die
homolog zur Bakteriophagen und bakteriellen Typ 2 Amidase ist [137, 167].
Kristallographische Messungen konnten zeigten, dass humanes PGLYRP-1, die
C-terminale PGRP-Domäne von PGLYRP-3 sowie Insekten PGRP-LB, -SA und -LCa
Liganden-Bindungsstellen besitzen, welche Peptidoglykan binden und spezifisch für
Muramyl-Tripeptide sind [100, 99]. Eine hochaffine Bindung von Peptidoglykan durch
die PGLYRPs wird dadurch ermöglicht, dass sowohl die Peptide als auch die
MurNAcAnteile des Peptidoglykans in der tiefen Bindungs-Spalte festgehalten
werden [99]. Sowohl LTA als auch LPS kann von PGRPs gebunden werden, die
Lokalisation der Bindungsstelle ist aber noch unbekannt [166]. Die Säugetier-PGLYRPs
werden in den verschiedenen Organen und Geweben unterschiedlich exprimiert.
40
PGLYRP-1 wird hauptsächlich in polymorphnukleären Leukozyten (PMN) und im
Knochenmark [137, 167] exprimiert. Es wirkt direkt bakterizid gegenüber grampositiven (und gram-negativen) Bakterien [173, 277]. Beispielweise konnte gezeigt
werden, dass PGLYRP-1 Knockout-Mäuse stärker anfällig für Infektionen mit einigen
grampositiven Bakterien sind und ihre PMNs Defekte beim Abtöten und beim Verdau
gram-positiver Bakterien aufweisen [67].
Humane PGLYRP-1, PGLYRP-3 und PGLYRP-4 sind direkt bakterizid für viele
pathogene und nicht-pathogene grampositive und gramnegative Bakterien [173,
286]. Daneben wirken sie bei Mäusen auch in vivo auf der Mukosa bakterizid
gegenüber einer intranasalen Infektion mit Staphylococcus aureus [173]. Allerdings
ist der Umfang der bakteriziden Aktivität der verschiedenen PGLYRPs unterschiedlich.
Der Mechanismus, mit dem PGLYRPs Bakterien abtöten scheint einheitlich zu sein,
unterscheidet sich allerdings von den Mechanismen der bekannten antibakteriell
wirksamen Substanzen. PGLYRPs permeabilisieren die Zytoplasmamembran nicht, sie
wirken auch nicht hydrolytisch auf Peptidoglykan. Ihr Wirkmechanismus scheint am
ehesten dem Effekt von Antibiotika zu ähneln, welche die Peptidoglykan-Synthese
blockieren [173, 286].
Die Erkennung von Peptidoglykan erfolgt in Säugetieren u.a. durch TLR2. Ein Abbau
des Peptidoglykans durch Amidasen reduziert folglich die Menge des TLR2-Liganden
[186, 65]. Intrazellulär erfolgt die Erkennung von Peptidoglykan-Fragmenten durch
NOD1 und NOD2. Kommt es zu einem Verdau von Peptidoglykan durch die AmidaseAktivität werden so auch die Liganden für NOD2 (MDP) abgebaut [95]. Andererseits
werden bei einem Verdau von Peptidoglykan-Polymeren auch
NOD1-Liganden (meso-DAP) erzeugt, die nach Erkennung zu einer verstärkten
antimikrobiellen Reaktion führen [92]. Die NOD-Signalwege sind demzufolge mit den
PGRP-Signalwegen verbunden. Durch die Muramidase-Aktivität der PGLYRPs werden
vermehrt Muramylpeptide (Peptidoglykan-Fragmente) bereitgestellt, welche durch
NOD1-Proteine erkannt werden. Extrazellulär wird Peptidoglykan durch TLR2 und
CD14 erkannt, intrazellulär durch NOD1 und NOD2. Es kommt zur Aktivierung des
Transkriptionsfaktors NF- B und dessen Zielgenen, welche für pro-inflammatorische
Zytokine codieren.
41
Der NOD-Signalweg andererseits spielt eine große Rolle bei der Expression der
PGLYRPs. Eine vermehrte Zytokin-Produktion, ausgelöst durch eine erhöhte Menge
an Muramylpeptiden, führt zu einer Induktion der Expression von PGLYRPs.
1.17 Zytokine und Chemokine
Zytokine und Chemokine sind kleine transient exprimierte und sezernierte Proteine
oder Glykoproteine (8 – 40 kDa), welche das Wachstum und die Differenzierung von
Zellen regulieren sowie einen entscheidenden Einfluss auf fast jeden Aspekt der
Immunität besitzen [60]. Zytokine bzw. Chemokine dienen als Botenstoffe, die infolge
einer TLR- oder NLR-Aktivierung durch z. B. bakterielle/virale Antigene sezerniert
werden. So regulieren sie von der Induktion der angeborenen Immunantwort über
die Bildung zytotoxischer T-Zellen hin zur Entstehung von Antikörpern durch das
adaptive Immunsystem eine Vielzahl von Mechanismen [133, 198, 51]. Das
Zytokinexpressionsprofil bestimmt, welcher Arm des Immunsystems aktiviert wird.
Zytokine erzielen ihre Effekte schon bei sehr geringen Konzentrationen, allerdings
haben sie eine geringe Halbwertszeit und damit auch eine begrenzte Reichweite [170,
83]. Sie können autokrin (auf die produzierende Zelle) oder parakrin (in der Nähe der
produzierenden Zelle), seltener auch endokrin (auf entfernt liegende Zellen) wirken
[198]. Zytokine werden im Gegensatz zu den klassischen Hormonen von einer Vielzahl
von Zelltypen an unterschiedlichen Stellen im Körper, hauptsächlich von Monozyten,
Makrophagen, T- und B-Lymphozyten, Endothelzellen, Neutrophilen, natürlichen
Killerzellen, Fibroblasten, sowie von Epithelzellen, gebildet [134, 200]. Die Expression
kann
sowohl
konstitutiv
als
auch
nach
einer
Stimulierung
erfolgen.
Zytokine/Chemokine können entsprechend ihrer Rolle bei einer Infektion/
Entzündungsreaktion in zwei Gruppen eingeteilt werden. Zum einen die proinflammatorischen Zytokine wie z.B. TNFα und Interleukine(IL)-8, zum anderen die
antiinflammatorischen Zytokine, wie z. B. Interleukin-10 [60]. Zytokine der
angeborenen
Immunantwort
(proinflammatorische
Zytokine)
werden
von
mononukleären Phagozyten nach Stimulation mit z.B. Bakterien freigesetzt. Neben
der pro-inflammatorischen Wirkung haben diese Zytokine auch regulatorische
Funktionen, indem sie die Freisetzung anderer Zytokine veranlassen [51, 200, 306].
42
1.17.1 IL-8
Interleukin-8 oder auch CXCL8 (für CXC-Motiv-Chemokin 8) wird insbesondere von
Endothelzellen, Monozyten, Epithelzellen und Fibroblasten produziert und dient als
Entzündungsmediator. Dieses Zytokin ist unter anderem an der chemotaktischen
Rekrutierung von Leukozyten, insbesondere neutrophile Granulozyten, in das
entzündete Gewebe beteiligt. [20, 147]
IL-8/CXCL8 wurde erstmals 1987 nach Aufreinigung aus dem Überstand LPSstimulierter humaner Monozyten als chemotaktischer Faktor für Neutrophile
beschrieben [303]. Die chemotaktische Wirkung von IL-8/CXCL8 ist besonders stark
[159] und gilt als langanhaltend [258]. Gebildet wird IL-8/CXCL8 von leukozytären
Zellen und nicht leukozytären Zellen, darunter Endothelzellen [259].
Bei den Chemokinen handelt es sich um niedermolekulare (8-14kDa) Proteine, die an
ihrem aminoterminalen Ende durch Cysteine charakterisiert sind und nach deren
Anzahl und Verteilung in die 4 Untergruppen CXC, CC, CX3C (je 4–6 Cysteine) und C
(2 Cysteine) unterteilt werden. IL-8/CXCL8 gehört zur Gruppe der CXC Chemokine,
deren erste beiden Cysteine durch eine interponierende Aminosäure (X) getrennt
sind. Die Mitglieder der CXC-(ELR+)-Gruppe, zu denen auch IL-8/CXCL8 gehört, sind
funktionell durch starke chemotaktische Wirkung insbesondere auf neutrophile
Granulozyten und eine starke angiogenetische Potenz gekennzeichnet [260].
Zielzellen sind neben neutrophilen Granulozyten [159] auch Monozyten und nicht
leukozytäre Zellen [196].
1.17.2 TNFα
Der Tumor-Nekrose-Faktor-alpha ist in gelöster Form ein ca. 17kDa großes Protein,
das hauptsächlich von Monozyten, aber auch von Makrophagen, neutrophilen
Granulozyten und Endothelzellen synthetisiert wird.
Es wurde ursprünglich, wie der Name andeutet, als ein Serum-Faktor identifiziert, der
durch Endotoxin induziert wird und im Tierexperiment die Nekrose von
transplantierten Tumoren und in vitro Nekrose von neoplastischen Zell-Linien
hervorrief [42].
43
Schon damals nahm man an, dass aktivierte Makrophagen den Faktor sezernieren.
Zehn Jahre später gelang die Reinigung des Proteins sowie die Klonierung des
menschlichen Gens für Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNFα) [251, 284].
TNFα ist Auslöser verschiedenster Prozesse, zu denen Apoptose, Zellproliferation,
Zelldifferenzierung und die Ausschüttung weiterer Zytokine zählen. Es fördert
Migration und Phagozytose [228].
Zu den systemischen Wirkungen gehören, neben Fieber und Appetitlosigkeit, vor
allem eine allgemeine Förderung lokaler und systemischer Entzündungen [205].
TNFα ist Auslöser verschiedenster Prozesse, zu denen Apoptose, Zellproliferation,
Zelldifferenzierung und die Ausschüttung weiterer Zytokine zählen. Es fördert
Migration und Phagozytose [228]. TNFα ist ein wichtiger Bestandteil der akuten
Inflammation durch Zigarettenrauch und führt unter Anderem zu gesteigerter
Rekrutierung von Neutrophilen und Makrophagen in die Lunge [50]
Ursachen für die vielfältigen, zum Teil entgegengesetzten Wirkungen des Zytokins
sind das Vorhandensein von TNF-Rezeptoren auf nahezu jedem bislang untersuchten
Zelltyp sowie die Vielfalt und Vernetzung der den TNF-Rezeptoren nachgeschalteten
Signaltransduktionskaskaden. Ferner hängen die Effekte von TNFα davon ab, welcher
Rezeptor aktiviert wird.
1.17.3 GM-CSF
(engl. granulocyte macrophage colony-stimulating factor)
Der Granulozyten Makrophagen – Kolonie Stimulierender Faktor (GM-CSF) ist ein
23kDa großes Glykoprotein, das in den 1970er Jahren erstmals aus dem
Lungengewebe von Mäusen nach Stimulation mit LPS isoliert werden konnte [39,
248]. GM-CSF ist ein zentraler Regulator von Zellzahl und Aktivierungszustand der
Granulozyten- und Makrophagen-Linien in allen Entwicklungsstufen [107] und somit
ein wesentlicher Mediator der Immunaktivierung im Rahmen der unspezifischen
Abwehrreaktion gegenüber Pathogenen.
44
Unter dem Einfluss von GM-CSF steigt unter anderem die Anzahl zirkulierender
Monozyten [296] und durch Unterbindung der Apoptose wird ihr Überleben
verlängert [68]. GM-CSF aktiviert die unspezifische Immunabwehr durch zahlreiche
Effekte auf die reifen hämatopoetischen Zellen. Hierzu zählt eine verstärkte Sekretion
chemotaktischer Botenstoffe und proinflammatorischer Zytokine wie z.B. TNFα
durch Granulozyten und Makrophagen, wodurch GM-CSF eine Amplifikation
inflammatorischer Prozesse vermittelt [79]. Des Weiteren bewirkt GM-CSF eine
verstärkte Expression von Zelloberflächen-Adhäsionsmolekülen, z.B. ß-Integrine
sowie von Rezeptoren für die Fc-Segmente von IgG und solchen für aktivierte
Komplementfaktoren [17]. Durch Letztere kommt es zu einer Steigerung der
Phagozytosekapazität. GM-CSF steigert direkt das zytotoxische Potential von
Alveolarmakrophagen u.a. durch die Produktion von freien Sauerstoffradikalen wie
Superoxid und Hydrogenperoxid und unterstützt dadurch die effektive Eliminierung
von Pathogenen aus der Lunge [164]. Von besonderer Bedeutung ist das Zytokin für
die
terminale
Differenzierung
von
dendritischen
Zellen
[306]
und
Alveolarmakrophagen [4, 201, 249], zwei Zelltypen, denen im Immunsystem der
Lunge wesentliche Aufgaben zukommen. Neben diesen vorteilhaften Eigenschaften
kann eine übermäßige Freisetzung von GM-CSF allerdings auch deletäre Effekte
haben. So ist GM-CSF impliziert in der Pathogenese von Autoimmunerkrankungen
und inflammatorischen Lungenerkrankungen wie COPD und Asthma [107, 75].
GM-CSF ist von zentraler Bedeutung im Stoffwechsel der Lunge, sowohl unter
physiologischen als auch unter pathophysiologischen Bedingungen. Im Gegensatz zu
praktisch allen anderen Geweben lässt sich GM-CSF in der Lunge in einer geringen
basalen Konzentration bereits unter physiologischen Bedingungen nachweisen [37].
Dies mag sich daraus erklären, dass der Großteil der Zellen des Respirationstraktes
fähig ist, GM-CSF zu synthetisieren, darunter Monozyten/Makrophagen,
B-Lymphozyten, Neutrophile, Eosinophile, Typ II-Alveolarzellen, Fibroblasten, glatte
Muskelzellen und andere Epithelzellen [255, 271, 309]. GM-CSF kann sowohl die
Funktion von Alveolarmakrophagen als auch das Wachstum von Alveolarepithel
stimulieren [4, 119] und spielt somit unter physiologischen Bedingungen eine
wichtige Rolle in der Aufrechterhaltung der pulmonalen Homöostase.
45
Im Kontext der Immunabwehr vermittelt GM-CSF eine erhöhte antimikrobielle
Aktivität der Alveolarmakrophagen gegenüber Bakterien, Viren, Pilzen und Protozoen
und ein Mangel an GM-CSF äußert sich in einer beeinträchtigten Eliminierung dieser
Pathogene [164, 98, 132].
1.18 Die zugrundeliegende Hypothese dieser Arbeit
Aktive Komponenten des Zigarettenrauchs verursachen anhaltende Defekte (z.B. an
Signaltransduktionswegen) in zirkulierenden Immunzellen von COPD-Erkrankten. Als
Folge dieser systemischen Defekte können die Immunzellen bei einer akuten
Atemwegsinfektion nach ihrer Aktivierung und Rekrutierung in die Lunge nicht mehr
ausreichend auf PAMPs von pathogenen Mikroorganismen mit der Freisetzung von
Zytokinen/ Chemokinen reagieren. Dadurch steigt die Häufigkeit der Infektionen in
der COPD, was zu Exazerbationen führt.
Diese Hypothese konnte bereits in einer früheren Studie unserer Arbeitsgruppe
durch Untersuchungen an CD4 + T-Zellen/TH1-Zellen unterstützt werden [151]:
TH1-Zellen in der COPD zeigten eine reduzierte Antwort auf Lipopolysaccharid (LPS)
aufgrund einer Endotoxin-Toleranz, die bereits in zirkulierenden CD4+ T-Zellen
etabliert wird und über ihre Aktivierung und Differenzierung zu TH1-Zellen hinaus
erhalten bleibt. Da dies auch bei Rauchern ohne COPD nachweisbar ist, ist das
Zigarettenrauchen der Auslöser.
In der hier vorliegenden Arbeit wurde diese Hypothese in Bezug auf zirkulierende
Monozyten überprüft.
Eine (im Vergleich zu lungengesunden Nichtrauchern) reduzierte Antwort von
Monozyten auf TLR-Agonisten in der COPD kann zur erhöhten Anfälligkeit für
bakterielle Infektionen wesentlich beitragen. Die ermittelten Daten tragen so zum
besseren Verständnis der Rolle von Immunzellen bei der bakteriellen Infektabwehr
bei. Die zugrunde liegenden, molekularen Ursachen und die damit verbundenen
systemischen Veränderungen durch das Zigarettenrauchen führen schließlich zur
Entwicklung von innovativen, therapeutischen Strategien zur Reduzierung von
Exazerbationsraten. Untersuchungen in diese Richtung werden von führenden
internationalen Experten im Feld als wichtig in Bezug auf die Entwicklung neuer
Therapien angesehen [24, 31].
46
1.19 Eigene Untersuchungen
Die Monozyten wurden aus dem peripheren Blut isoliert und ex vivo mit den
Gefahrensignalen PGN, LTA, Oligopeptide-binding protein amiA (Pam3Cys) (ein
Lipopeptid, Toll-like Rezeptor (TLR) 2 Agonist), mit Staphyiococcus aureus Extrakt und
Streptococcus pneumoniae Extrakt aktiviert. Diese wichtigen PAMPs (pathogenassociated molecular patterns) gram-positiver Bakterien lösen eine Zytokinantwort
aus, die entscheidend für die Etablierung der Abwehr gegen akute Infektionen ist.
In
diesem
Zusammenhang
werden
zirkulierende
Monozyten
bei
einer
Atemwegsinfektion in die Lunge rekrutiert und reagieren auf PAMPs mit der
Produktion von Zytokinen wie GM-CSF und TNFα, um die frühe Infektabwehr
einzuleiten, bevor sie dann ggf. zu Makrophagen oder Dendritischen Zellen
differenzieren.
Gemessen wurden die Freisetzung von inflammatorischen Mediatoren mit hoher
Relevanz für die COPD und Infektabwehr: (MMP-9,) IL-8, GM-CSF und TNFα sowie die
Expression von NOD1, NOD2, TLR1, TLR2, EF1α, PGRP1 und assoziierter Faktoren im
Rezeptorkomplex und Signalweg (MyD88, MyD88s, IRAK-M, A20)
vergleichend
zwischen lungengesunden Nichtrauchern, Rauchern mit normaler Lungenfunktion,
Rauchern mit COPD und ehemaligen Rauchern. Durch den Vergleich sollten, wie im
weiteren Verlauf der Arbeit beschrieben, mögliche Unterschiede in der jeweiligen
Expression detektiert werden. Die Gruppe der ehemaligen Raucher wurde im Laufe
der Studie in die Untersuchungen mit einbezogen, um erste Erkenntnisse gewinnen
zu können, inwieweit durch das Rauchen induzierte Veränderungen möglicherweise
reversibel sind.
47
2. Zielsetzung und Fragestellung
Im Rahmen dieser Arbeit wurde zunächst ein primärer Endpunkt formuliert. Hier
sollte die Zytokinproduktion und die Aktivierung von assoziierten PRR-Signalwegen
von primären, humanen, zirkulierenden Monozyten als Antwort auf bakterielle
pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) und auf Bakterien-Totalextrakte
zwischen lungengesunden Nie-Rauchern (NS), aktuellen Rauchern ohne obstruktive
Lungenerkrankung (S) und Rauchern mit obstruktive Lungenerkrankung (COPD)
verglichen werden. Dadurch sollen mögliche molekulare Pathologien aufgeklärt
werden, die für erhöhte Infektanfälligkeit bei COPD verantwortlich sind und sich als
therapeutische Targets zur Verbesserung der Infektabwehr und zur Reduktion von
Exazerbationsraten oder -dauer eignen.
Nachdem sich die ersten Ergebnisse herauskristallisierten, wurde eine weitere
Gruppe, die der lungengesunden Exrauchern ohne COPD (FS), der Studie hinzugefügt
und ein sekundärer Endpunkt formuliert. Hier sollen Unterschiede in der durch
PAMPs-induzierten Zytokinfreisetzung von Monozyten mit den anderen Gruppen
verglichen und Unterschiede herausgearbeitet werden. Des Weiteren sollen
Unterschiede in der mRNA-Expression von PRR-Signalmolekülen in Monozyten
zwischen den vier Kohorten verglichen werden.
Im Genauen wurde folgenden Fragen nachgegangen:
 Werden die hier untersuchten Zytokine und Rezeptormoleküle von
Monozyten exprimiert?
 Wird die Expression durch vorherige Stimulation mit den hier verwendeten
PAMPs und Totalextrakten beeinflusst und steigt die Zytokinexpression
konzentrationsabhängig mit Höhe der Stimulantien an? (Vergleich der
einzelnen Stimulationen, mit der unstimmulierten Kontrolle)
 Welchen Einfluss haben das Zigarettenrauchen und die COPD- Erkrankung auf
die durch bakterielle PAMPs induzierte Freisetzung von Zytokinen aus
Monozyten? (ELISA-Messung und Vergleich zwischen den Kohorten)
48
 Sind erwartete Unterschiede in der Zytokinexpression bedingt durch
Pathologien in der Signaltransduktion (TLR1/2, NOD1/2; MyD88, MyD88s,
IRAK-M, A20, PGRP1)? (Quantitative Messung der mRNA-Expression und
Vergleich zwischen den Kohorten)
 Besteht eine Korrelation zwischen experimentellen Daten und klinischen
Parametern (FEV1 und packyears (py))?
 Bestehen Unterschiede im Blutbild?
 Regulieren
sich
mögliche,
zelluläre
Pathologien
nach
Stopp
der
Zigarettenrauch-exposition? (Untersuchung der Monozyten von ehemaligen
Rauchern und Vergleich zu den anderen Kohorten)
49
3. Material und Methoden
3.1 Material
Chemikalien, Lösungen, Medien, Reagenzien, Kits und Material
Tab. 4: Verwendete Chemikalien (alphabetisch geordnet)
Chemikalien
Firma
Katalognummer
ACD : Acid-Citrate-Dextrose
Sigma-Aldrich
#C3821
Agarose A9539-500G
Sigma-Aldrich
#EEO 0.09-0.13
Amphotericin B 250µg/ml
Sigma-Aldrich
#A2942
BSA
Sigma-Aldrich
#A7030
DNA Loading Dye 6x
Thermo Scientific
#R0611
EDTA
Sigma-Aldrich
#E6758
Ethanol 70%
Roth
#T913.1
Ethidiumbromid 1mg/ml
BIO RAD
#161-0433
FCS
PAN BIOTECH
#P30-1506
Ficoll-Paque Plus
GE Healthcare life science
#17-1440-02
GeneRuler 100bp DNA Ladder
Thermo Scientific
#SM0241
Giemsa Lösung
MERCK
#1.09204
HAES 6%
Fresenius Kabi
n.a.
H2SO4 Schwefelsäure 95%
ROTH
#X873.1
Hank's Balanced Salt Solution
Sigma-Aldrich
#H6648
HotStarTaq DNA-Polymerase
Qiagen
#203205
L-Glutamin 200mM
Sigma-Aldrich
#G7513
May-Grünwald-Lösung
MERCK
#1.01424.0500
NaCl 0,9%
Fresenius Kabi
PBS
Sigma-Aldrich
#P4417
Pen/Stren : Penicillin-
Sigma-Aldrich
#P0781
Random Primer
Promega
#C1181
Recombinant RNasin
Promega
#N2511
Streptomycin (10,000 U,
10mg/mL)
50
RPMI-1640-Medium
Sigma-Aldrich
#R7638
Streptavidin-HRP-Lösung
R&D Systems
#893975
TBS
Sigma-Aldrich
#T5030
TMB
Sigma-Aldrich
#T0440
Trypan Blue Solution (o,4%)
Sigma-Aldrich
#T8154
Tween20
Sigma-Aldrich
#P9416
Tab. 5: Verwendete Medien, Lösungen und Puffer (alphabetisch geordnet)
Medien, Lösungen, Puffer
Bestandteile
Lysepuffer
Je Well:
Monozytenpuffer: Buffer1
Reagent Diluent
TNFα/GM-CSF
IL-8
Monozytenkulturmedium
RPMI-Medium all in
1%/10%
TAE-Puffer =
TRIS-Acetat-EDTA-Puffer
Waschpuffer (ELISA)
Firma/Katalognummer
350µl RLT-Puffer +
Qiagen #79216
10µl ß-Mercaptoethanol
Sigma-Aldrich #M6250
PBS w/0,1 % BSA +
2mM EDTA (pH 7,4)
Sigma-Aldrich #P4417,
#A7030, #E6758
1%BSA in PBS
Sigma-Aldrich #A7030,
#P4417
Sigma-Aldrich #A7030,
#P9416, #T5030
Sigma-Aldrich #R7638
PAN BIOTECH
#P30-1506
Sigma-Aldrich #G7513
Sigma-Aldrich #A2942
Sigma-Aldrich #P0781
0,1%BSA, 0,05% Tween20
in TBS (pH 7,2- 7,4)
500ml RPMI-Medium
50ml(=>10 %)/5ml (=>1 %)
FCS
5ml Glutamin
500µl Amphotericin B
1ml/10.000U Pen/Strep
50xTAE (ad 1L
microfiltriertes aqua dest.)
242 g Tris Base (Endkonz.:
40 mM)
57,1 ml Eisessig (Endkonz.:
20 mM)
100ml EDTA 0,5M pH8
(Endkonz.: 50 mM)
End-pH : 8,3
Verdünnung zu 1xTAE vor
gebrauch mittels
mikrofiltriertem aqua dest.
PBS +
0,05% Tween20
Sigma-Aldrich #T1503
Sigma-Aldrich #695092
Sigma-Aldrich #E6758
Sigma-Aldrich #P4417,
#P9416
51
Tab. 6: Verwendete Stimulantien
(alphabetisch geordnet)
Stimulantien
Stock
Firma/ Katalognummer
amiA
1mg/ml
EMC Microcollections GmbH
#L2000
LTA
1mg/ml
Invivogen # tlrl-pslta
PGN
200µg/ml
Invivogen # tlrl-pgns2
S. aureus
1010 Cells/ml
Invivogen # tlrl-hksa
S. pneumoniae
1010 Cells/ml
Invivogen # tlrl-hksp
Tab. 7: Verwendete Kits und Materialien
(alphabetisch geordnet)
Kits, Material
Firma
Zusatzinformationen
24-Well- Zellkulturplatten
SARSTEDT Inc
#83.1836
96- MicroWell - NUNC-
Sigma-Aldrich
#M9410
Abdeckfolie Parafilm M
Bemis Parafilm
#PM999
Combitips advanced 5ml
Eppendorf
#0030089456
dNTP Set 100mM
Invitrogen
#10297-018
DuoSet® ELISA :
R&D Systems; Wiesbaden
immuno ELISA-Platten
Human GM-CSF
#DY215
Human IL-8/ CXCL8 Human
#DY208
TNF-alpha
#DY210
Human MMp-9
#DY911
Dynabeads® Untouched™
Invitrogen Dynal®
#113-50D
Erlenmeyerkolben 250ml
Duran
#2122636
Falcon-Tube 50ml/15ml
SARSTEDT
Kombistopper
Braun Melsungen AG
#62.547.254
#62.553.542
#4495101
Oberflächendesinfektions –
spray Fermacidal D2
Objektträger
IC Products SA
#n.a. 1L Sprühflasche
VWR
#092815
Omniscript RT Kit
Qiagen
#205113
Human Monocytes Kit
52
Pasteurpipetten Glas
VWR
#612-1702
Perfusorspritze 50ml
BRAUN
#8728810F
Pipettenspitzen
SARSTEDT
#70.762
#70.1115
Punktionskanülen Sterican®
Braun
# 4657519
Reagiergefäße
SARSTEDT
#72.737 / #72.735 / #72.706
0,2ml/0,5ml/1,5ml/2ml
RNase away Spray
/ #72.695.500
Molecular BioProducts Inc.
#17810-491
VWR
RNase-Free DNase Set
Qiagen
#79254
RNeasy Mini Kit
Qiagen
#74104
Safety-Multifly 21G
SARSTEDT
#85.1638.235
Serologische Pipetten
SARSTEDT
Skinsept F
Hautdesinfektionsspray
Spritzen Injekt 20ml/5ml/
ECOLAB GmbH
#86.1685.001
#86.1254.001
#86.1252.001
#30 037 30
BRAUN
#4606205V
1ml (Luer)
BD Plastipak
#300013
Spritzenfilter 0,2µm
RENNER GmbH
#06001
Transferpipette 3,5 ml
SARSTEDT
#86.1171.001
25ml/10ml/2ml
Tab. 8: Verwendete Geräte
(alphabetisch geordnet)
Geräte
Firma
Zusatzinformation
Agarosegelelektrophoresekammer Biomed. Analytik
Amersham pharmacia
Agagel Midi-Wide Biometra
GmbH
biotech EPS 1001
Autoklav VX-120
Systec
n.a.
Einkanal-Pipetten variabel
Eppendorf
#3120000020
#3120000038
#3120000054
#3120000062
Electrophoresis Power Supply EPS
amersham pharmacia
1001
biotech
n.a.
53
Feinwaage CP423 S
Sartorius
n.a. (CPA423S)
FluorChem SP Imaging System
Alpha Innotech
Software Version 1.3.0.7.
Inkubationsschrank BBD 6220
Thermo SCIENTIFIC
51020241
Magnet Dynal MPC – L
Dynal, Norway
#120.21D
Magnetrührer
VWR International
442-0883
Microplate Reader 680
BIO-RAD Laboratories
Microplate Manager
Version 5.2.1 Build 106
Microplate reader
protocoll 450 vs 540 /
620 vs 540 (TMB
unstopped)
Mikroskop
Axiostar plus
Carl Zeiss
Lichtmikroskope normal
Axiovert 40 CFL
MicroImaging GmbH
und invert
Pipettierhilfe accu-jet
BRAND
#26300
Reinstwassersystem Milli-q plus
MERCK Millipore
n.a.
Schwenkmischer Duomax 1030
Heidolph
#543-32210-00
Sterilbank Safe 2020 1.2
Thermo Scientific
#51026638
Thermocycler PTC-200
MJ Research Inc.
n.a.
Vortexer IKA VF2
Janke & Kunkel
n.a.
Zählkammer (Neubauer)
MARIENFELD Superior
#0640110
Tischzentrifuge 32R
Hettich
n.a.
Centrifuge 5415 R
Eppendorf AG
0,0025mm2
Zentrifugen
54
3.1.1 Probanden
Die Untersuchungen in diesem Projekt werden an primären, humanen Monozyten
aus dem peripheren, venösen Blut von Probanden durchgeführt. Hierzu wurden
jedem Probanden 80 ml Vollblut peripher-venös entnommen und Monozyten
isoliert. Die Monozyten wurden kultiviert und mittels PAMPs stimuliert.
Im Anschluss wurden sowohl die Zytokinexpression der Monozyten im Überstand der
Monozytenkultur (mittels ELISA), als auch die Rezeptor-/Signalmolekül-expression in
den isolierten Monozyten (mittels PCR) gemessen.
Des Weiteren wurden jedem Probanden im Zuge dieser Blutentnahme weitere 5 ml
peripher-venöses
Blut
in
einer
EDTA-Monovette
zur
Blutbildbestimmung
entnommen.
Initial unterzog sich jeder Proband einem Lungenfunktionstest.
Alle untersuchten Probanden nahmen freiwillig an der Studie teil, wurden über die
Ziele und Inhalte ausführlich durch die zuständige, leitende Ärztin aufgeklärt und
gaben ihr schriftliches Einverständnis.
Ein positives Ethikvotum der Ethikkommission der Medizinischen Fakultät der RuhrUniversität Bochum für dieses Projekt vom 20.01.2011 liegt vor (Reg.-Nr.: 4257-12).
Die Studienpopulation besteht aus vier verschiedenen Kohorten:

NS = (Non-Smoker) Nichtraucher
lungengesunde Probanden mit normwertiger Lungenfunktion
(FEV1/FVC > 70 %, FEV1 % pred. > 80 %)
Lebenslanger, bisheriger Zigarettenkonsum unter 100 Stück insges.
Keine vorliegenden Atemwegserkrankung wie z. B. Asthma bronchiale

S = (Smoker) Raucher
lungengesunde Probanden mit normwertiger Lungenfunktion
(FEV1/FVC > 70 %, FEV1 % pred. > 80 %)
Aktive Raucher mit einem Zigarettenkonsum von >10 packyears
Keine vorliegenden Atemwegserkrankung wie z. B. Asthma bronchiale
55

FS = (Former Smoker) ehemalige Raucher
lungengesunde Probanden mit normwertiger Lungenfunktion
(FEV1/FVC > 70 %, FEV1 % pred. > 80 %)
ehemalige Raucher mit einem Zigarettenkonsum von >10 packyears, die seit
mind. 10 Jahren rauchfrei sind
Keine vorliegenden Atemwegserkrankung wie z. B. Asthma bronchiale

COPD = COPD-Erkrankter Stadium II-III
Chronisch obstruktive pulmonale Erkrankung; definiert nach GOLDStandard[31]; aktive Raucher; Zigarettenkonsum >10 packyears; mit
Ausnahme zweier COPD-Probanden befanden sich zum Zeitpunkt der Studie
alle COPD-Probanden in ambulanter Betreuung durch das Klinikum
Bergmannsheil in Bochum)
Packyears (py) ist die Einheit, in der die Rauchdosis von Zigarettenrauchern
beschrieben wird. Damit lässt sich die Anzahl konsumierter Zigaretten abschätzen.
Man errechnet die Anzahl der Packungsjahre, indem man die Zahl der pro Tag
gerauchten Zigarettenpackungen mit der Zahl der Raucherjahre multipliziert.
Die untersuchten Probanden mit COPD waren zum Zeitpunkt der Blutabnahme noch
aktive Raucher.
Keiner der Probanden erhielt orale oder inhalative Kortikosteroide, befand sich zum
Zeitpunkt der Untersuchung in immunsuppressiver Behandlung oder berichtete über
eine andere schwere Erkrankung oder eine akute Infektion während der letzten drei
Monate vor dem Test. Des Weiteren wurden Probanden mit anamnestischen
Allergien oder Asthma, chronischen, immunologischen und inflammatorischen
Erkrankungen, sowie akuten Infekten oder Verletzungen ausgeschlossen.
Das Mindestalter beträgt 40 Lebensjahre. Raucher und COPD-Erkrankte müssen
einen Zigarettenkonsum von mindestens 10 packyears aufweisen. COPD-Erkrankte
werden nach den aktuellen GOLD-Leitlinien definiert.
56
3.1.2 Studienpopulation
Tab. 9: Probandendaten Studienpopulation
aufgeteilt nach den untersuchten Kohorten; N: Probandenzahl; NS: Nichtraucher;
S: aktuelle Raucher ohne COPD (≥10 py); FS: ehemalige Raucher ohne COPD (≥10 py); COPD:
aktuelle Raucher mit chronisch obstruktiver Lungenerkrankung GOLD Stadium II-III (≥10 py);
FEV1: forciertes Exspirationsvolumen in 1 sek.; FVC: forcierte Vitalkapazität;
(*** P<0,001 im Vergleich zu NS, FS und S; ** P<0,01 im Vergleich zu NS; * P<0,05 im
Vergleich zu NS) Es zeigte sich kein signifikanter Unterschied zwischen den packyears oder
dem Alter; Alle Daten (Alter, Lungenfunktionwerte, packyears) sind als Mittelwert ± SEM
dargestellt; Datenanalyse mittels Graph Pad Prism5, One way Anova, Bonferroni`s multiple
comparison test
NS
FS
S
COPD
N
10
12
10
14
Alter (Jahre)
63,30 ± 4,13
64,42 ± 2,90
57,90 ± 2,30
63,14 ± 2,01
Geschlecht (m:w) 5:5
5:7
4:6
6:8
FEV1 (% pred.)
122,11 ± 6,30 101,25 ± 2,26 * 96,43 ± 6,05 **
58,31 ± 3,98 ***
FEV1/FVC (%)
82,65 ± 1,72
87,37 ± 1,80
79,56 ± 1,66
53,71 ± 2,78 ***
Packyears (py)
0
44,83 ± 4,57
48,50 ± 2,69
47,86 ± 2,14
Eine vergleichbare Studienpopulation fand sich unter anderem in einer durch unsere
Arbeitsgruppe veröffentlichte Studie zur Immunresponse von Th-Zellen, sowie in
einer Arbeit zur Immunresponse von Alveolarmakrophagen [151, 149].
Tab. 10: Differentialblutbild
unterteilt nach Kohorten mit Referenzwert
(Alle gewonnenen Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt; der Referenzwert bildet sich
aus dem Mittelwert der in verschiedenen Literaturen zu findenden Angaben; Es zeigte sich
eine signifikant erniedrigte Zellzahl in Monozyten von COPD im Vergleich zu NS (**p<0,01);
ansonsten zeigten sich keine signifikanten Unterschiede; Datenanalyse mittels Graph Pad
Prism5, One way Anova, Bonferroni`s multiple comparison test
Diff.-BB (%)
NS
FS
S
COPD
Referenzwerte
(%)
Lymphozyten 34,8 ± 1,23
34,33 ±
1,61
54,42 ±
1,50
33,2 ± 1,81
37 ± 1,31
15-50
56,3 ± 1,89
53,21 ±
1,29
30-80
Neutrophile
Gran.
53,4 ± 1,08
Eosinophile
Gran.
1,9 ± 0,23
1,83 ± 0,24
1,9 ± 0,23
1,64 ± 0,20
0-6
Monozyten
9,9 ± 0,32
8,58 ± 0,58
8,6 ± 0,37
8,14 ± 0,39
**
1-12
57
3.1.2.1
Fallzahlplanung
Primärer Endpunkt:
Unterschiede in der durch PAMPs induzierten Zytokinfreisetzung von Monozyten
gesunder Nieraucher, aktueller Raucher ohne COPD und Rauchern mit COPD.
Sekundäre Endpunkte:
- Unterschiede zu Ex-Rauchern ohne COPD in der durch PAMPs-induzierten
Zytokinfreisetzung von Monozyten
- Unterschiede in der mRNA-Expression von PRR-Signalmolekülen in Monozyten
zwischen den vier Gruppen.
Auf der Basis von Voruntersuchungen an n=4 Probanden je Gruppe wurde unter
Verwendung eines one-Way ANOVA Designs bei einer Power von 1-beta = 0.8 und
einem alpha <0.05 eine Fallzahl von n=10 je Gruppe ermittelt. Die COPD-Gruppe
wurde zunächst aufgestockt, um ggf. Unterschiede bzgl. der Schweregrade zu
erkennen. Als sich dafür jedoch kein Trend andeutete, wurde die Rekrutierung bei
n=14 beendet.
3.2 Methoden
3.2.1 Hygiene
Die üblichen Standards nach den Empfehlungen und Richtlinien des Robert-KochInstitutes wurden eingehalten [231]. Die Isolation der Zellen und alle weiteren
Schritte bis hin zur Gewinnung und Verbringung der endgültigen Proben in
Eppendorfgefäßen wurden unter einer Sterilbank durchgeführt.
58
3.2.2 Blutentnahme
Zunächst erfolgt die Vorbereitung der für diesen Schritt benötigten Materialien.
Hierzu werden je Proband 4 x 20 ml Spritzen mittels einer 5 ml Spritze und einer
Kanüle mit je 2 ml Acid-Citrate-Dextrose (ACD; Antikoagulanz) befüllt und die
restliche Luft aus der 20 ml Spritze evakuiert, sodass das ACD die Spritze ausfüllt.
Die vier präparierten 20 ml Spritzen, eine EDTA-Monovette, ein Adapter und eine
Butterfly-Kanüle werden zur Blutentnahme parat gelegt.
Nach erfolgter Aufklärung und regulärer Vorbereitung erfolgt das Stauen der Venen
am Arm durch Anlage eines Stauschlauches am Oberarm des/der Probanden/-din.
Nach Aufsuchen der Vene erfolgt, nach gründlicher Hautdesinfektion, die Punktion
der Vene mittels Butterflykanüle und die Entnahme von insgesamt 85 ml periphervenösen Blutes.
Die 20 ml Spritzen müssen nach Blutentnahme vorsichtig geschwenkt werden, sodass
sich das Blut gleichmäßig mit dem ACD vermischt. Es ergibt sich eine ACDKonzentration von 10 %.
Die Weiterverarbeitung der Blutproben sollte innerhalb einer Stunde geschehen. Bis
zu diesem Zeitpunkt, können die Spritzen zum Schutz mit Kombistoppern
verschlossen werden.
3.2.3 Blutbild
Die Blutbildbestimmung erfolgt manuell mittels Ausstrich.
Hierzu wird zunächst die mit peripher-venösem Blut gefüllte EDTA-Monovette
vorsichtig geschwenkt um eine gute Durchmischung zu gewährleisten. Nun wird
mittels Pipette 10 µl des Blut-EDTA-Gemisches entnommen und wie in Abbildung 8
auf Seite 60 gezeigt auf einem Objektträger aufgetragen. Mittels eines zweiten
Objektträgers erfolgt der Ausstrich des Blutes entlang des ersten Objektträgers.
Nach vollständiger Trocknung des Ausstriches, erfolgt die Färbung nach Pappenheim,
sowie das Auszählen der Zellzahlen wie im nächsten Abschnitt beschrieben.
59
Abb.8: Blutausstrich auf Objektträger
(Auftragen eines 10 µl großen Blutstropfen
Beim Ausstrich sollt auf einen Winkel von ca. 30°
zwischen den Objektträgern geachtet werden.
Der Ausstrich soll bei konstanter, zügiger
Geschwindigkeit erfolgen.)
3.2.4 Färbung nach Pappenheim (May-Grünwald-Giemsa)
Die Pappenheim-Färbung ist eine sogenannte "panoptische" Differentialfärbung, die
sich das Färbeverhalten der Giemsa- und der May-Grünwald-Färbung zunutze macht
und zur Zelldifferenzierung in Ausstrichen genutzt wird.
Die May-Grünwald-Giemsa-Färbemethode ist das in Deutschland am meisten
verbreitete Verfahren zur Einfärbung von Blutausstrichen. [310]
Nach Lufttrocknung erfolgt zunächst die Färbung des Ausstriches mittels 1:10
verdünnter May-Grünwald-Färbung. Dazu wird der Objektträger für 3 Minuten
komplett in die Lösung getaucht. Der Objektträger wird nun vorsichtig dem Färbebad
entnommen und vorsichtig in aqua dest. gespült. Nach abtropfen der Spülflüssigkeit
wird mit einer 1:25 verdünnten Gimsa-Färbung für 15 Minuten gegengefärbt. Der
Objektträger wird auch hier komplett im Färbebad untergetaucht und nach Ablauf
der Zeit vorsichtig entnommen.
Nach erneutem, vorsichtigem Spülen mit aqua dest. und abtropfen der restlichen
Spülflüssigkeit wird der nun gefärbte Ausstrich an der Luft getrocknet.
60
Während des kompletten Färbevorganges ist es wichtig, den Objektträger mit
größter Vorsicht zu behandeln, da sich die Zellen bei Kontakt ablösen würden. Sobald
der nun gefärbte Ausstrich vollkommen durchgetrocknet ist, kann das Blutbild
ausgezählt und die Zellen dabei beurteilt werden.
3.2.5 Mikroskopische Zellzahlbestimmung
Unter einem Mikroskop mit einer 200-fachen Vergrößerung schließt sich nun die
Auszählung und Differenzierung von 100 Zellen an. Es erfolgt somit eine prozentuale,
keine absolute Auswertung des Blutausstriches. Allerdings ermöglicht ein manuelles
Blutbild eine genaue Beurteilung der Morphologie der ausgestrichenen Zellen.
(Zusammengefasste Ergebnisse der von mir durchgeführten Blutbilduntersuchungen
siehe Tab.10, S.57)
3.2.6 Isolation der mononukleären Zellen des peripheren Blutes (PBMCs) aus
Vollblut
(engl. Peripheral Blood Mononuclear Cell = Lymphozyten und Monozyten, sowie
zirkulierende dendritische Zellen und Makrophagen (<2%))
Die Isolierung von mononukleären Zellen des peripheren Bluts aus antikoaguliertem
Vollblut der Probanden erfolgte mittels Dichtegradientzentrifugation. Bei dieser Art
der Gradientenzentrifugation wird die zu trennende Suspension über eine geeignete
Trennlösung (hier Ficoll) geschichtet und anschließend bis zum Erreichen des
Sedimentationsgleichgewichts ohne Bremse zentrifugiert, so dass sich die
unterschiedlichen Zellfraktionen entsprechend ihrer Dichte auftrennen.
Nach Abschluss der Zentrifugation befinden sich die mononukleären Zellen (vor allem
Lymphozyten und Monozyten) in der als weißlicher Ring erkennbaren Interphase.
Hierzu wurden zunächst pro Patient/Proband vier 50 ml Falcon vorbereitet.
Dazu wird je Falcon eine Lösung aus 4 ml eines ACD/NaCl 0,9 %-Gemischs (1:10) + 16
ml HAES 6 % hergestellt. Das HAES (Hydroxyethylstärke) dient als Volumenexpander/
kolloidaler Volumenersatz und ersetzt den nichtzellulären Teil des Blutes.
61
Zu 20 ml Lösung pro Falcon werden nun je 20 ml des Vollblut-ACD-Gemisches
(beschrieben in Kapittel 3.2.2) zugefügt und unter vorsichtigem Schwenken gut
gemischt.
Das Gemisch wurde anschließend blasenfrei in je ein neues 50 ml Falcon überführt.
Die verschlossenen Falcon wurden bei Raumtemperatur eine Stunde unter der
Sterilbank belassen, sodass sich deutlich die schweren Bestandteile des Blutes wie
Erythrozyten am Boden des Falcon absetzen konnten.
Während dieser Zeit wurden je Patient/Proband zwei 15 ml Falcon-Tubes mit je 6 ml
Ficoll vorbereitet. Ficoll ist ein Saccharose-Epichlorhydrin-Copolymer, das in der
biologischen und medizinischen Forschung und Diagnostik zur Isolierung von
mononukleären Zellen (PBMC) verwendet wird; Dank seiner hohen Dichte dient es
der Gradientenzentrifugation (Dichte von 1 bis 1,2 g/ml).
Nach einer Wartezeit von einer Stunde erfolgte die vorsichtige Überführung der
oberen, dünnen Phase des Blut-HES-Gemischs in je ein neues 50 ml Falcon-Tube
mittels Stripette. Hier muss penibel darauf geachtet werden, dass die untere,
schwere Schicht mit den Erythrozyten etc. nicht angerührt wird. Die untere Phase
wurde in den alten Falcon-Tubes verworfen.
Die in nun neuen Falcon-Tubes überführte, obere Phase des Gemischs wurde mit
Hanks auf 45 ml aufgefüllt und das verschlossene Falcon in einer Tischzentrifuge bei
1700 rpm, 5 Min bei 4 °C mit eingeschalteter Bremse zentrifugiert.
Anschließend wurde der Überstand mit einer Pumpe und Glaspipetten vorsichtig
abgesaugt, sodass das entstandene Zellpallett möglichst unangerührt blieb.
Auf diese Weise entstanden je Patient/Proband 4 Zellpalletts die je in 1 ml Hanks
resuspendiert wurden.
Das zuvor vorbereitete Ficoll wurde nun vorsichtig mit je 2 ml der Zellsuspension
überschichtet (2x1 ml auf 6ml Ficoll) und verschlossen in die Zentrifuge verbracht.
Zentrifugiert wurde bei 1700 rpm, 30 Min bei 20°C ohne Bremse.
Durch diese Methode sollte eine Phasentrennung wie in Abb. 9 stattfinden.
62
Abb. 9: Darstellung des Einsatzes von Ficoll bei der Isolation der PBMCs
li.: Vor der Zentrifugation; Ficoll überschichtet mit peripher venösem Blut;
re.: Phasentrennung nach Zentrifugation (1700 rpm, bei 20°C, 30 Min ohne Bremse);
weißlich, wolkiger Ring aus PBMCs auf dem Ficoll
Der schmale Ring aus mononukleären Zellen, der sich nun als kleine wolkenartige
Struktur in Mitten des Falcon-Tubes zeigte, konnte sorgsam mittels einer 3,5 ml
Pasteurpipette in ein neues 50 ml Falcon (je Patient/Proband) überführt werden.
Die gesammelten PBMCs wurden mit Hanks auf 30 ml aufgefüllt und anschließend
bei 1700 rpm, 10 Min bei 4°C mit Bremse zentrifugiert.
Der Überstand wurde abgesaugt, das Pallet in 30 ml Hanks resuspendiert und erneut
bei 1700 rpm, 10 Min bei 4°C mit Bremse zentrifugiert. Dieser Schritt wurde
anschließend noch ein weiteres Mal wiederholt.
Die zur kurzzeitigen Verdünnung und Spülung der Zellen genutzte Hank's Balanced
Salt Solution (mit Phenol-rot als Kontaminationsindikator), ist ein Puffer der dem
Erhalt des pH-Wertes, sowie der osmotischen Balance dient. Es versorgt die Zellen
mit Wasser und lebenswichtigen, anorganischen Metallen.
Nach der letzten Zentrifugation wurde der Überstand abgesaugt und das entstandene Zellpallett in 5 ml RPMI-Medium (all-in 10 %; entwickelt von Moore et al.)
resuspendiert um eine Zählung der Monozyten anzuschließen.
63
3.2.7 Bestimmung der Zellzahl
Der am Ende des vorherigen Schrittes angefertigten Monozytensuspension werden
mittels Pipette und steriler Spitze 10 µl entnommen und mit 90 µl (1:10 vedünnter)
Trypan Blue Solution in ein 1,5 ml Reagiergefäß überführt und gefärbt. Die Trypan
Blue Solution dient der mikroskopischen Bestimmung der Zellzahl, sowie der
Detektion toter Zellen (stark erhöhte Anfärbbarkeit toter Zellen), die sich unter dem
Mikroskop nach Anfärbung schwarz-blau präsentieren.
Durch das Vorbereiten der Zählkammer mittels sorgfältiger Reinigung sowie auflegen
des entsprechenden Objektträgers entsteht ein Kapillareffekt, der dazu führt, dass
die (vorsichtig) seitlich aufgetragene Suspension in die Kammer gezogen wird. Es
werden immer beide Zählkammern des Trägers genutzt. Je Kammer werden ca. 10 µl
der gefärbten Suspension mittels 10 µl-Pipette aufgetragen.
Die Auszählung der Monozyten (Mittelwert der Ergebnisse beider Kammern) bei
einer 200fachen Vergrößerung.
Die Bestimmung der Zellzahl erfolgt anhand folgender Rechnung für die gesamte
Zellsuspension (Monozyten in 5ml RPMI all in):
Zellzahl in Zählkammer x 5 x 100.000 = Gesamtzellzahl Suspension
Abgestorbene, deutlich dunkler gefärbte Zellen wurden ausgeschlossen.
Anhand der bestimmten Gesamtzellzahl an PBMCs, wird die Chemikalienmenge für
die nächsten Schritte betimmt und alles entsprechend vorbereitet.
64
3.2.8 Monozytenisolation
Die Expression charakteristischer Oberflächenantigene kann zur Isolierung von
einzelnen Zellpopulationen genutzt werden. Bei der magnetischen Zellseparation
werden spezifische Antikörper, die an magnetische Partikel gekoppelt
sind, gegen Oberflächenantigene eingesetzt. In dieser Arbeit wurde eine
Negativisolation durchgeführt, bei der sich die magnetischen Partikel an die
„ungewollten“ Zellen haften. Die Zellen, die isoliert werden sollen (in diesem Fall die
Monozyten), bleiben somit unangetastet.
Zunächst wurden die benötigten Arbeitsvolumina anhand der Tabelle 11 bestimmt.
Alle benutzten Substanzen außer dem verwendet Monozytenpuffer werden
ausschließlich dem Invitrogen Dynal® Monocyte Negative Isolation Kit entnommen.
Die einzelnen Arbeitsschritte sowie die verwendeten Chemikalien wurden der
beiligenden Isolationsanleitung des Kits entnommen
Tab.11: Arbeitsvolumina zur Isolation menschlicher Monozyten
(Invitrogen Dynal® Monocyte Negative Isolation Kit) li.: die einzelnen Schritte
entsprechend des Isolationsplans re.: Arbeitsvolumina (Anpassung entsprechend der
Zellzahl)
Step
Working Volume per 1 x 107
PBMCs
Cell Volume (Step1)
100 µl
Blocking Reagent (Step2)
20 µl
Antibody Mix (Step3)
20 µl
Washing (Step5)
2 ml (Max. 40 ml when scaled up)
Resuspension (Step6)
900 µl (Max. 5 ml when scaled up)
Depletion Dynabeads (Step7)
Increase volume (Step10)
100 µl
1 ml (Max. 35 ml when scaled up)
65
Vor Beginn der Isolation muss zunächst der in der Isolationsanleitung des Invitrogen
Dynal®
Monocyte
Negative
Isolation
Kit
beschriebene
Monozytenpuffer
(Isolationspuffer; Buffer1) angesetzt werden. Hierzu werden zunächst die in
Tabelle 11 beschriebene Chemikalien (je nach benötigter Menge an Puffer)
abgemessen und in entsprechender Menge microfiltriertem aqua dest. gelöst.
Vor Gebrauch wird der so hergestellte Puffer steril filtriert.
Nach Bestimmung der Arbeitsvolumina werden die in 5 ml RPMI-Medium gelösten
PBMCs bei 1700 rpm, 10 Min bei 4°C zu einem Pallet zentrifugiert. Der Überstand
wird mittels Saugpumpe und steriler Glaspipetten abgesaugt und das Zellpallett in
zuvor bestimmter Menge Monozytenpuffer resuspendiert.
Die so entstandene Zellsuspension wurde in ein 15 ml Falcon-Tube je
Patient/Proband überführt und die entsprechenden Mengen Blocking-Reagenz,
sowie Antikörper-Mix zugefügt (siehe Tab.11).
Das Falcon-Tube wurde verschlossen und die Suspension bei 4°C im Kühlschrank über
20 Min inkubiert. (Anleitung Isolationskit Step 2-3)
Während der zwanzigminütigen Wartezeit wurde die entsprechende (zuvor
bestimmte) Menge Dynabeads aus dem Kit entnommen und durch waschen aktiviert.
Dazu werden die Dynabeads in ein (ggf. zwei), 2 ml Reagiergefäß überführt und mit
entsprechender Menge Monozytenpuffer verdünnt. Das Reagiergefäß wird an einen
zum Kit gehörenden Magneten für 3 Min verbracht, sodass der Überstand abgesaugt
werden kann, ohne das Dynabeads verloren gehen.
Das Reagiergefäß mit den Dynabeads wurde anschließend vom Magneten entfernt
und die Dynabeads in vorher berechneter Menge Monozytenpuffer resuspendiert.
(Anleitung Isolationskit Step 4)
Im Anschluss an die oben beschriebene Inkubation wurden die Zellen gewaschen um
überschüssige Antikörper und Blocking-Reagenz zu entfernen.
Dazu wurde eine vorher bestimmte Menge Monozytenpuffer zur Suspension
hinzugefügt, das Gemisch bei 1700 rpm, 8 Min bei 4°C zentrifugiert und der
Überstand abgesaugt. (Anleitung Isolationskit Step 5)
66
Das entstandene Zellpallett wurde in entsprechender Menge Monozytenpuffer
resuspendiert und die zuvor gewaschenen Dynabeads hinzugefügt. (Anleitung
Isolationskit Step 6)
Die entstandene Zell-Dynabeads-Puffer-Suspension wurde in einem Kühlraum bei
4°C unter konstantem schwenken auf einem Schwenkmischer 15 Min inkubiert.
(Anleitung Isolationskit Step 7)
Im Anschluss wurde die Suspension aufpipettiert und mit Puffer entsprechend
aufgefüllt. (Anleitung Isolationskit Step 10) So wurde eine bessere Verteilung der
einzelnen Bestandteile der Suspension gewährleistet. Das Falcon wurde vor einen,
zum Kit gehörigen, Magneten verbracht.
Der Überstand wurde sorgfältig in 2 ml Reagiergefäße überführt und erneut vor den
Magneten verbracht, sodass gewährleistet werden konnte, dass alle Dynabeads und
somit die ungewollten Zellen aus der Zellsuspension eliminiert wurden.
Der aufgefangene Überstand wurde ein letztes Mal bei 1700 rpm, 10 Min bei 4°C
zentrifugiert, das entstandene Zellpallett möglichst vollständig von überstehender
Flüssigkeit befreit und anschließend in 5 ml RPMI-Medium (all-in 10 %) resuspendiert.
3.2.9 Zellzahlbestimmung Monozyten
Den sorgfältig resuspendierten Monozyten wurden 10 µl Suspension entnommen, in
ein 1,5 ml Reagiergefäß überführt und mit 90 µl Trypan-blau gefärbt.
Zwei Neubauer-Zählkammern wurden mit je 10 µl der gefärbten Suspension bestückt
und die Monozyten bei einer 200fachen Vergrößerung ausgezählt.
Abgestorbene, deutlich dunkler gefärbte Zellen wurden ausgeschlossen.
Anhand der bereits zuvor aufgeführten Rechnung (Abschnitt 3.2.7, S.64) wurde die
Monozytenzahl für die komplette Suspension bestimmt.
67
3.2.10 Kultivierung der isolierten Monozyten
Das Volumen der oben entstandenen Zellsuspension wird anhand der
Monozytenzahl angepasst, sodass 1 Mio. Zellen in 1 ml RPMI-Medium all in 10 %
gelöst sind. Direkt im Anschluss werden die Monozyten zu 5x105 Zellen pro
Stimulation/Well auf einer 24-Well-Zellkulturplatte ausplattiert und im Inkubator bei
37°C inkubiert. Je Patient/Proband werden zwei 24-Well-Zellkulturplatten angelegt.
Auf einer der Platten werden 19 Wells (zur späteren ELISA-Messung), auf der zweiten
Zellkulturplatte 6 Wells (für anschließende PCR-Untersuchungen) bestückt (siehe
Stimulationsplan Tab.12 und Tab.13, S.70).
Auf Grund der zuvor aufgeführten Bestandteile (Tab.5, Abschnitt 3.1) des RPMI-all inMediums, zeigt sich dieses als ideales Kulturmedium zur Kultivierung der hier
isolierten, reinen Monozytenkultur. So enthält das FCS eine Vielzahl von Proteinen
und Wachstumsfaktoren, die für die Zellkultivierung unerlässlich sind. Das Glutamin
dient als Nährstoff und Energieträger für die Zellen (ATP). Sowohl das Amphotericin
B (Antimycotikum; Fungizid) als auch das Pen/Strep (Antibiotika gegen gram-positive
und gram-negative Bakterien) dienen der Verhinderung einer Kontamination der
Zellkultur.
Nach Anlage der Monozytenkultur werden die Monozyten mikroskopisch bei einer
200fachen Vergrößerung jeweils vor und nach Mediumwechsel (siehe folgenden
Abschnitt), sowie 24 Stunden nach Stimulation auf Aussehen (Veränderungen, etc.)
und Haftung am Plattenboden hin untersucht.
Wichtige Erkenntnisse (z.B.: große Mengen an Zellschrott) werden im Laborbuch
dokumentiert und in die später folgenden Ergebnisse mit einbezogen.
So wurden auf Grund des hohen Anteils an Zellschrott und einer geringen Anzahl
intakter/lebender Monozyten in Kombination mit der fehlenden Gesamtresponse in
den angeschlossenen Untersuchungen, sieben Probanden (3 NS; 2 S; 2 COPD) von der
Studie ausgeschlossen.
68
3.2.11 Mediumwechsel, Stimulation und Ernte
3.2.11.1
Mediumwechsel
Nach vierzehnstündiger Inkubation, erfolgt ein Wechsel des Mediums von RPMI allin mit 10 % Fetales Kälberserum (FCS) auf RPMI-all-in mit 1 % FCS, um die bis dahin
möglicherweise entstandenen Zytokine und abgestorbenen Zellen zu eliminieren. In
Vorversuchen konnte vorab gezeigt werden, dass der Wechsel auf ein Medium mit
1% FCS die Vitalität von Monozyten nicht beeinflusste bzw. nicht zum Absterben der
Zellen führt. Die Verringerung des FCS soll die Zellen auf die folgende Stimulation
vorbereiten. Durch dieses Verfahren sind die Ausgangsvoraussetzungen bei jeder
Probe gleichbleibend.
3.2.11.2
Stimulation
Die Wells der Zellkulturplatten werden nummeriert und zwei Stunden nach
Mediumwechsel, nach genauem, gleichbleibendem Plan mit den entsprechenden
PAMPs (und deren Verdünnungsschritten) stimuliert (Tab. 12 und Tab. 13, S70).
69
Tab. 12: Stimulationsplan 1
5x105 Monozyten pro 0,5ml Zellsuspension auf 24-Well-Zellkulturplatte zur
späteren ELISA-Messung der exprimierten Zytokine.
Die Monozyten in Kammer 1 und 2 blieben zur Kontrolle unstimmuliert
MOI= Verhältnis Bakterien/ Monozyten
Stimulantien
1
-
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
PGN
PGN
PGN
PGN
LTA
LTA
LTA
LTA
amiA
amiA
amiA
S. aureus
S. aureus
S. aureus
S. pneumoniae
S. pneumoniae
S. pneumoniae
Konzentrationen
10ng/ml
100ng/ml
1µg/ml
10µg/ml
10ng/ml
100ng/ml
1µg/ml
10µg/ml
1ng/ml
10ng/ml
100ng/ml
MOI : 1/1
MOI : 10/1
MOI : 100/1
MOI : 1/1
MOI : 10/1
MOI : 100/1
Tab. 13: Stimulationsplan 2
5x105 Monozyten pro 0,5ml Zellsuspension auf 24-Well-Zellkulturplatte zur späteren
PCR-Messung der Rezeptor-/ Proteinexpression in Monozyten ohne und nach
Stimulation
Die Monozyten in Kammer 1 blieben zur Kontrolle unstimmuliert
MOI= Verhältnis Bakterien/ Monozyten
Stimulantien
Konzentration
1
-
2
PGN
10µg/ml
3
LTA
10µg/ml
4
amiA
100ng/ml
5
S. aureus
MOI : 100/1
6
S. pneumoniae
MOI : 100/1
70
3.2.11.3
Ernte
Nach vierundzwanzigstündiger Inkubation wird der Überstand, der mit 19 Wells
bestückten Zellkulturplatte, vorsichtig abpipettiert, in 1,5 ml Reagiergefäße überführt
und für eine zweitzeitig anschließende ELISA-Messung bei -80°C eingefroren.
Der Überstand der mit 6 Wells bestückten Zellkulturplatte wird bereits nach
vierstündiger Inkubation verworfen, da nicht die Produkte der Zellen, sondern die
Zellen selber im Fokus dieser Untersuchungen stehen.
Dazu weren die Zellen zunächst vorsichtig mit Hanks gespühlt, im Well auf Eis gelagert
und anschließend mit Hilfe des in Tabelle 5, auf Seite 51, beschriebenen Lysepuffers
abgelöst. Nach zehnminütiger Wartezeit wird das Puffer-Zell-Gemisch aufpipettiert,
in vorher beschriftete 1,5 ml Reagiergefäße überführt und ebenfalls bei -80°C
eingefroren.
Der RLT-Lysepuffer wurde dem verwendeten RNeasy Mini Kit von Qiagen
entnommen. Er enthält das Salz Guanidinisothiocyanat, das die Zellen zunächst
lysiert und die Proteine denaturiert.
Um die hier wichtige RNA zu schützen, wird dem Puffer ß-Mercaptoethanol zugefügt.
Dieser inaktiviert durch Denaturierung die bei der Lyse freiwerdenden RNasen, die
andernfalls die RNA verdauen würden.
3.2.12 Enzym-linked Immunosorbent Assays (ELISA)
Es erfolgt die Messung der Konzentrationen von IL-8, TNFα und GM-CSF im zuvor
gewonnenen Überstand der Monozytenstimulationen.
Je 96-Well-ELISA-Platte (NUNC Inc.) wurde die Konzentration eines Zytokins von je
zwei Probanden in Doppelbestimmung gemessen.
Die Platten wurden zunächst über Nacht mit 100 μl eines monoklonalen Antikörpers
mit einer Konzentration von 2 μg/ml inkubiert.
Anschließend wurden die Platten viermalig mit PBS-Tween-20®-Waschpuffer
gewaschen.
71
Nun erfolgte die Blockierung des Antikörpers mit 300 μl/Well Blocking-Puffer für eine
Stunde.
Nach Wiederholung des Waschvorgangs mit PBS-Tween-20® wurden die
entsprechenden Standartds (aus dem jeweiligen Duo Set kit) sowie die Proben
aufgetragen und für 2 Stunden bei RT inkubiert. Die Proben zur Messung der GMCSF- und TNFα-Exprimierung wurden unverdünnt gemessen, die Proben zur Messung
der Exprimierung von IL-8 wurden 1:100 mit entsprechendem Reagent Diluent
verdünnt.
Nach erneuter Wiederholung des Waschvorgangs mit PBS-Tween-20®-Waschpuffer
werden 100 μl eines entsprechenden, sekundären biotinylierten anti-human
Antikörpers (ebenfalls aus dem entsprechenden DuoSet kit) in entsprechendem
Reagent Diluent appliziert.
Nach einstündiger Inkubation sowie erneutem Waschvorgang erfolgte die Zugabe
von 100 μl Streptavidin-HRP (R&D Systems, cat# DY998).
Wiederholung des Waschvorganges mit PBS-Tween-20®.
Applikation von 100 μl TMB-Substratlösung (Fa. Sigma, München; cat# T8665) pro
Well. Das TMB entwickelt ein blaues Reaktionsprodukt, das bei 370 oder 655 nm
ausgelesen werden kann.
Variierende Inkubationszeit bis zur Entwicklung der Farbreaktion.
Kontrolle der Farbstärke mit Hilfe des Microplate Managers (Version 5.2.1;
Microplate Reader Protokoll 620 vs. 540 (TMB unstopped)).
Die Reaktion wird mittels 50 μl/Well einer einmolaren H2SO4 -Lösung gestoppt. Nach
Zugabe der Säure entwickelt sich ein gelbes Reaktionsprodukt, dessen optische
Dichte im Photometer bei einer Wellenlänge von 450 nm
(+ Referenz 540 nm) gemessen werden kann.
Dazu wird das Programm Microplate Manager (Version 5.2.1; Microplate Reader
Protokoll 450 vs 540) verwendet.
Die Werte wurden anhand einer Standardkurve quantifiziert, in eine Exeldatei
exportiert und der Auswertung zugeführt.
72
3.2.13 RNA-Isolation aus Monozyten
Vor Beginn der Isolation erfolgte zunächst die vorherige, gründliche Reinigung des
Arbeitsplatzes mit Ethanol und RNase-away-Spray.
Zur Isolation der RNA aus den entsprechenden Monozytenproben wurde das RNeasy
Mini Kit (Kat.Nr.74106) der Firma Qiagen verwendet. Die Durchführung erfolgte
anhand des im RNeasy Handbuchs angegeben Protokolls „Purification of total RNA
from animal cells using spin technology“, beginnend auf Seite 25 mit Schritt 3c, unter
Einbeziehung des Appendix D: “Optional On-Column DNase Digestion with RNaseFree DNase Set”.
Die Proben befinden sich zu Beginn der Isolation, wie zuvor beschrieben, als Lysat zu
je 350 µl Volumen in Lysepuffer.
Die Zentrifugation erfolgt in einer Eppendorf 5415 R Tischzentrifuge bei RT.
Zunächst wird das Lysat, nachdem es vollständig aufgetaut ist, mittels einer Spritze
sieben Mal durch eine Sterican Kanüle 20G 0,9x50 mm pipettiert.
Im Anschluss wird das in 1,5 ml Reagiergefäßen aufbewahrte Lysat zu je 350 µl mit
70 %igem Ethanol (70 % EtOH) versetzt.
Es wird je Probe eine RNeasy-Säule vorbereitet und beschriftet. Die Ethanol-LysatMischung (700 µl) wird nun vorsichtig auf die RNeasy-Säule mit Silicamembran (an
die enthaltene Nukleinsäuren binden) transferiert und die Säule verschlossen.
Es folgt die Zentrifugation der Säulen bei 10000 rpm für 15 Sek.
Der Filter der Säule wird von dem 2 ml Auffangtube entfernt und das Eluat verworfen.
Der Filter wird zurück auf die Tube gesteckt.
Nach Schritt 5 des oben beschriebenen Protokolls wird an dieser Stelle der optionale
Schritt „DNase Verdau“ eingefügt (S.70 D1-D4 des Handbuchs)
Hierzu wird das RNase-Free DNase Set von Qiagen (# 79254) verwendet.
Zur Vorbereitung wird das Set aufgetaut und ein „Verdau-Mix“ (70 µl RDD-Puffer +
10 µl DNase 1 Stock-Lösung je Säule) angefertigt.
73
Zu Beginn dieses Abschnitts wird ein Waschschritt mit 350 µl RW1 Puffer
durchgeführt und das Eluat verworfen.
Zum Verdau der DNA wurden nun je 80 µl
des „Verdau-Mix“ auf die Säule
aufgetragen und 15 Min bei Raumtemperatur inkubiert.
Während dieser Wartezeit wurden die neuen 1,5 ml Reagiergefäße zum Auffangen
und zur Aufbewahrung der RNA vorbereitet und beschriftet.
Nach 15 Min wird erneut ein Waschschritt mit 350 µl RW1 Puffer durchgeführt und
das Eluat verworfen.
Im Anschluss an diesen eingefügten Abschnitt wird mit dem Punkt 7. des
ursprünglichen Protokolls fortgefahren.
Es werden 500 µl des RPE-Puffers auf jede RNeasy-Säule gegeben und diese dann bei
10000 rpm zentrifugiert. Das Eluat wird verworfen und dieser Schritt zwecks
vollständiger Entfernung des Verdau-Mixes wiederholt. Um die komplette Flüssigkeit
vom Filter zu entfernen, werden die Säulen im Anschluss noch einmal für 2 Min
zentrifugiert.
Die Filter werden nun von den alten Tubs getrennt. Diese werden mit dem
abzentrifugierten Eluat verworfen und die Filter auf die zuvor vorbereiteten und
beschrifteten neuen 1,5 ml Reagiergefäße verbracht.
Mit größter Vorsicht gibt man nun 35 µl RNase-freies Wasser je Säule auf die Filter
und zentrifugiert diese bei 10000 rpm für 1 Min. Diesen letzten Schritt wiederholt
man mit dem aufgefangenen Eluat um möglichst viel RNA von dem Filter in dem
Wasser zu lösen.
Auf diese Weise gewinnt man pro Probe 35 µl RNA-Lösung, die im Anschluss zur
cDNA-Synthese genutzt oder für spätere Verwendung bei -80°C eingefroren werden
kann.
74
3.2.14 cDNA-Synthese
Die zuvor extrahierte Gesamt-RNA ist ein Gemisch aus ribosomaler RNA (rRNA),
Transfer-RNA (tRNA) und nur zu 2% messenger RNA (mRNA). In somatischen Zellen
sieht die RNA-Verteilung ungefähr folgendermaßen aus: 80- 85 % rRNA, 15- 20 %
tRNA und die restlichen 1- 5 % setzen sich aus mRNA, small nuclear RNAs (snRNA)
und ncRNAs zusammen [6]. Um die RNA in einer anschließenden Polymerase-KettenReaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR) einsetzen zu können, muss Sie zunächst
in komplementäre DNA, sogenannte complementary DNA (cDNA), umgeschrieben
werden. Da die cDNA in dieser Arbeit als Ausgangsmaterial in einer PCR eingesetzt
werden sollte und somit die anschließende Amplifikationsrate sehr hoch war, reichte
die Gesamt-RNA trotz ihres geringen Anteils an mRNA aus.
Zur Synthese der cDNA werden die zuvor hergestellten RNA-Proben, sowie das
Omniscript RT Kit von Qiagen (Kat.Nr.205113) verwendet. Omniscript weist eine
Ribonuklease-Aktivität (RNase H) auf. Der Vorteil ist, dass jede in der Probe
enthaltene mRNA nur einmal in cDNA umgeschrieben wird, da RNA in RNA:DNAHybride degradiert wird. Die verwendeten Random Primer sind zufällige
Hexamerprimer, die irgendwo an der mRNA binden, sodass anschließend alle mRNABereiche in der cDNA vertreten sind.
Pro Proband/Patient wurden nach dem festgelegten PCR-Plan sechs verschiedene
Proben hergestellt.
Für jede der sechs RNA-Proben wird ein 0,5 ml Reagiergefäß zur cDNA-Synthese und
-Aufbewahrung vorbereitet und beschriftet. Zur Vereinfachung der Schritte wurde
zunächst ein Master-Mix (n+1) anhand der folgenden Tabelle angesetzt.
Tab. 14: Chemikalien Master-Mix cDNA-Synthese
nach Plan Qiagen Omniscript RT; Ansatz für alle Proben n+1 eines Probanden
Chemikalien/ Bestandteile
Mengenangabe Einfachansatz (µl)
RNase freies Wasser
5,75
10x RT-Puffer
2,00
dNTPs (je5mM)
2,00
Random Primer (10µM)
1,00
RNasin
0,25
Omniscript RT
1,00
75
Es werden nun 12 µl dieses Master-Mix je Probe auf die vorher beschrifteten 0,5 ml
Reagiergefäße verteilt und 8 µl der entsprechenden RNA-Probe zu jedem
Reagiergefäß hinzugefügt. Dies ergibt eine Probenmenge je Reagiergefäß von 20 µl.
Die Reagiergefäße werden in den Cycler verbracht und das Programm RT
(37°C für 1h, 93°C für 5Min, 4°C bis zur Entnahme der Proben) mit Beheizung des
Deckels ausgewählt.
Die so hergestellte cDNA kann sofort im Anschluss weiterverarbeitet (hierzu Lagerung
auf Eis) oder bei -20°C für einen späteren Gebrauch eingefroren werden.
3.2.15 Polymerase-Kettenreaktion qRT-PCR
(engl. Polymerase Chain Reaction, PCR)
Diese Methode dient der In-vitro-Vervielfältigung spezifischer DNA-Abschnitte
mittels entsprechender Primer. Primer sind Oligonukleotide, die als Startpunkt für
DNA-replizierende Enzyme wie die DNA-Polymerase dienen. Zur In-vitroAmplifikation von DNA bei der PCR werden in der Regel Primer mit einer Länge von
18-30 Nukleotiden verwendet [48]. In vivo ist die DNA-Polymerase während der
Zellteilung hauptverantwortlich für die semikonservative Replikation der DNA, da sie
die komplementären Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTPs) an der in zwei
Einzelstränge gespaltenen DNA neu verknüpft. Die DNA-Polymerase kann jedoch
nicht de novo die Synthese beginnen. [72]
Sie benötigt dazu ein freies 3'-OH-Ende eines Starter-Oligonukleotids (Primer),
welches mit dem komplementären DNA-Einzelstrang bereits einen partiellen
Doppelstrang ausgebildet hat. Es müssen daher bei jeder PCR pro zu amplifizierender
Sequenz zwei verschiedene Primer mit gegensinniger Orientierung verwendet
werden. Mit diesen Primern kann ein beliebiges Stück der DNA ausgewählt und
vervielfältigt werden. [48]
Die verwendeten Primer und ihre Sequenzen sind in Tabelle 15, Seite 77 aufgeführt.
76
Tab. 15: Verwendete Primer und ihre Sequenzen
Die von mir verwendeten Primer sind zuvor per Primer3-Tool (http://simgene.com/Primer3)
und Primer-Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) designed und von der
Firma Sigma-Aldrich Bzw. MWG/VBC Biotech hergestellt worden.
Primer
Primersequenzen
Firma
A20
For.
Rev.
For.
Rev.
For.
Rev.
For.
Rev.
For.
Rev.
For.
Rev.
For.
Rev.
For.
Rev.
For.
Rev.
For.
Rev.
Sigma-Aldrich
EF1α
IRAK-m
MyD88
MyD88s
NOD1
NOD2
PGRP1
TLR1
TLR2
5`-TCCAGAACACCATTCCGTG-3´
5`-TGAGGTGCTTTGTGTGGTTC-3´
5`-GGGATGGAAAGTCACCCGTA-3´
5`-GCCGTGTGGCAATCCAAT-3´
5`-GTACATCAGACAGGGGAAACT-3´
5`-GACATGAATCCAGGCCTCTC-3´
5`-ATATCTTGAAGCAGCAGCAGG-3´
5`-TTTGTCTGTTCCAGTTGCC-3´
5`-GGGACACAGCATTGGGCATA-3´
5`-ACATTCCTTGCTCTGCAGGT-3´
5`-CCCTTCTGCTGAGAGGACAC-3´
5`-TTGACCACGACTTTGCTCTG-3´
5'-CGGCGTTCCTCAGGAAGTAC-3'
5`- ACCCCGGGCTCATGATG-3'
5`-TGTGCAGCACTACCACATGA-3´
5`-GTAGAGCTGGTTGCCTGGAG-3´
5`-AAACGGTCTCATCCACGTTC-3´
5`-GAGCAATTGGCAGCACACTA-3´
5`-GGCCAGCAAATTACCTGTGT-3´
5`-TTCTCCACCCAGTAGGCATC-3´
VBC Biotech
Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich
Sigma-Aldrich
MWG Biotech AG
Das Prinzip der PCR besteht in dem mehrfachen Durchlaufen eines Reaktionszyklus.
Während jedes Zyklus wird an jedem vorhandenen DNA-Einzelstrang ein
komplementärer
DNA-Strang
synthetisiert.
Dadurch
ist
theoretisch
eine
exponentielle Vervielfältigung des gesuchten DNA-Abschnitts möglich. Ein
Reaktionszyklus besteht aus drei Schritten: Im ersten Schritt, der Denaturierung, wird
ein Gemisch aus DNA, dNTPs, zweier sequenzspezifischer Primer und einer DNAPolymerase in einem Reaktionspuffer auf 95° Celsius erhitzt und eine Auftrennung
des DNA-Doppelstrangs in seine Einzelstränge erreicht. Schnelles Abkühlen der
Reaktionstemperatur verhindert die Reassoziation der beiden Einzelstränge.
77
Im nächsten Schritt, der Anlagerung (Annealing), kommt es bei einer Temperatur von
60° C zu einer Anlagerung der Primer an die beiden Einzelstränge, wobei diese so
gewählt sind, dass sich der eine am Anfang und der andere am Ende der zu
amplifizierenden
Nukleotidsequenz
anlagert.
Im
letzten
Schritt,
der
Komplementärstrangsynthese (Elongation), erfolgt bei einer Temperatur von 72° C
mit Hilfe der DNA-Polymerase die Neusynthese einer Doppelstrang-DNA ausgehend
von den zuvor angelagerten Primern, die im nächsten Zyklus wiederum als Template
für Denaturierung, Annealing und Neusynthese dienen können. Normale DNAPolymerasen, die eine Eiweißstruktur haben, würden bei diesem Vorgang
hitzebedingt denaturieren. Daher verwendet man für die PCR als Enzym der Wahl die
hitzebeständige Taq-Polymerase, welche die initiale Denaturierungstemperatur von
95°C übersteht und daher eine Automatisierung der PCR und eine große Anzahl von
PCR-Zyklen hintereinander ermöglicht. [72]
Zur Durchführung der PCR wurden die von mir zuvor hergestellten cDNA-Proben
sowie das Hot-Star-Taq-DNA-Polymerase-Kit von Qiagen (# 203205) verwendet.
Die verwendeten Primer und deren entsprechenden Sequenzen sind bereits in
Tabelle 15 aufgeführt und wurden genspezifisch und (wenn möglich) Intronübergreifend ausgewählt. Das Housekeeping-Gen EF1α wurde als Referenz
verwendet. Die durchgeführten PCRs erfolgten unter linearen, zuvor ausgetesteten
Verfahren.
Zunächst wird ein PCR-Master-Mix für jedes zu messende Primerpaar anhand der
Tabelle 16 angefertigt (n+1). Das bedeutet, dass für jeden Probanden/Probanden, ein
7-facher Ansatz je Primerpaar hergestellt wird.
Tab. 16: Chemikalien Master-Mix PCR
nach Plan Qiagen Omniscript RT; Ansatz für alle Proben n+1 eines Probanden
Chemikalien/Bestandteile
Einfacher Ansatz
RNase freies Wasser
Puffer
MgCl2
dNTPs (je 5 mM)
Primer For/Rev
Qiagen Hot Star Taq (Polimerase)
15,92 µl
2,50 µl
2,50 µl
1,00 µl
Je 0,50 µl
0,08 µl
78
Zunächst erfolgen die Ansätze der primerspezifischen Master-Mixe sowie die
Vorbereitung und Beschriftung der benötigten 0,2 ml PCR-Tubes mit
Probanden-/Probanden-Nummer, zu messendem Primer und Probennummer.
In jede PCR-Tube werden sowohl 23 µl des Master-Mix als auch 2 µl der
entsprechenden cDNA- Probe blasenfrei pipettiert.
Die Ansätze (je 25 µl) werden in den Cycler verbracht und das entsprechende PCRProgramm ausgewählt (Tab.17).
Tab. 17: PCR-Cycler-Programm
(40 Wiederholungszyklen bei einer Anlagerungstemperatur von 60°C)
PCR-Schritt
Temperatur
Zeit
Initiale Denaturierung
95°C
10 min
Denaturierung
95°C
30 sek
Annealing
60°C
30 sek
Elongation
72°C
30 sek
Abschließende
Elongation
72°C
10 min
Stopp/ Kühlung
4°C
10 min
40
Wiederholung
s-zyklen
Nach Ablauf des Programms werden die Proben auf Eis gekühlt.
Die Gelelektrophorese kann dann direkt angeschlossen oder die Proben für einen
späteren Zeitpunkt bei -20°C eingefroren werden.
79
3.2.16 Gelelektrophorese und densitometrische Messung
Vorbereitung des Agarosegels (2 %)
Glaskolben: 3 g Agarosepulver werden in 150 ml TAE gelöst und bei 600 kWatt für
3 Min in der Mikrowelle bis zur vollständigen Lösung des Pulvers aufgekocht. Das
noch heiße und flüssige Gel wird mittels Rührfisch auf dem Magnetrührer gut
durchmischt und auf ca. 50°C abgekühlt. Währenddessen werden unter Rühren 10 µl
Ethidiumbromid hinzugegeben, sodass eine gleichmäßige Verteilung gewährleistet
ist. Ethidiumbromid (3,8-Diamino-5-ethyl-6-phenylphenanthridinium bromide) ist
ein roter Phenanthridin-Farbstoff, der bei der Gelelektrophorese zum Nachweis der
Nukleinsäuren, DNA und RNA verwendet wird. Einzelne Ethidiumbromid-Moleküle
interkalieren dabei zwischen die Basen der DNA bzw. RNA (Einlagerung im Abstand
von 10 Basenpaaren), wodurch sich das Anregungsspektrum von Ethidiumbromid
verändert und so die Fluoreszenz der Substanz bei Anregung mit ultraviolettem Licht
stark erhöht wird. Auf diese Weise leuchten im Agarosegel die Stellen, an denen sich
Nukleinsäuren befinden, hell auf, während Stellen ohne Nukleinsäuren dunkel
erscheinen.
Vorbereitung der Gelkammer und gießen des Gels
Der Schlitten der Kammer wird mit den zwei Wandblöcken zusammengesteckt und
die entsprechenden Kämme aufgesetzt. Es ist wichtig, dass die Kammer vollkommen
waagerecht steht und die Kämme grade sind, damit das Gel später gleichmäßig dick
ist und die Kammern für die Proben in derselben Ebene liegen.
Das noch flüssige, ca. 50°C heiße Gel wird nun blasenfrei in die vorbereitete Kammer
gegossen. Bis zum Erkalten und Aushärten des Gels nach ca. 20 Min darf die Kammer
nicht bewegt werden.
Ist das Gel ausgehärtet, können die Kämme und die Seitenwände vorsichtig gelöst
und entfernt werden.
80
3.2.16.1
Gellauf
Der Schlitten wird nun mit dem fertigen Gel in die zuvor mit TAE-Puffer gefüllte
Elektrophoresekammer eingesetzt. Es ist wichtig darauf zu achten, dass die Pole
richtig angeschlossen sind, damit der Gellauf in die gewünschte Richtung erfolgt.
Zu jeder Probe von 25 µl wird 5 µl 6 x Loading Dye zugefügt und vorsichtig unter
pipettieren durchmischt.
Die erste Kammer der zwei Kammreihen wird ausgespart, um einen sauberen Gellauf
zu gewährleisten. In der darauffolgenden Kammer werden je Kammreihe
8 µl einer
100 bp DNA-Ladder aufgetragen. Auch zwischen der DNA-Ladder und den zu
messenden Proben sowie den verschiedenen Primern wird eine Kammer
freigelassen.
Die Proben werden dann der Reihe nach und nach Primern getrennt zu je 8 µl auf das
Gel aufgetragen. Nach 26 Min. bei 100 V und 396 mA wird der Gellauf gestoppt und
das Gel im Schlitten, aus der Kammer entnommen.
3.2.16.2
Densitometrische Messung
Nach beendeter Elektrophorese wurden die Gele in einen UV-Transilluminator (Alpha
Innotech, FluorChem SP, Prog. 2) verbracht und die DNA-Fragmente durch das
interkalierte EtBr, das bei einer Wellenlänge von 302 nm fluoresziert, sichtbar
gemacht. Die PCR-Bedingungen wurden für jedes Primerpaar im exponentiellen
Bereich
etabliert,
was
die
Quantifizierung
von
Signalintensitäten
nach
Ethidiumbromidfärbung und Standard-Agarose-Gelelektrophorese durch eine
densitometrische Messung unter Verwendung von Alpha Innotech (San Leandro, CA)
Software, Version 1.3.0.7 ermöglicht. Um die Größe der DNA-Fragmente bestimmen
zu können, wurde zusätzlich zu den Proben, wie zuvor beschrieben, ein DNAGrößenstandard auf die Agarosegele aufgetragen. Der von mir in dieser Arbeit
verwendete Größenstandard ist eine 100-Basenpaar-DNA-Leiter der Firma Thermo
Scientific.
81
Als Voraussetzung für eine zuverlässige Quantifizierung der Signalintensitäten
erkennt die Alpha Innotech Software Übersättigung (durch überladen des
Agarosegel) und nicht lineare Gamma- oder Kontrastkorrektur der Signale und
deaktiviert in diesen Fällen das Densitometrie-Programm / Densitometer. Somit ist
eine Quantifizierung nur im linearen Bereich möglich.
Die Werte der Zielgene unter den verschiedenen Stimulationsbedingungen wurden
auf die EF1α-Referenz-Signale normalisiert, um vermeintliche Unterschiede in der
RNA / cDNA-Beladung zu korrigieren. Die Primersequenzen für GM-CSF und IL-8
wurden bereits zuvor verwendet und veröffentlicht [152, 150].
Die gewonnen Werte werden mittels einer eigens erstellten Exeldatei
weiterverarbeitet.
3.2.17 Relative Quantifizierung der gemessenen PCR-Werte
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Expression der in Tab. 15 (S. 77) aufgeführten,
exprimierten Rezeptoren und Signalwegsmoleküle gemessen und auf einen
möglichen quantitativen Unterschied zwischen den Kohorten untersucht.
Da hierfür nicht die Ermittlung der exakten Kopienzahlen der Proben, sondern nur
das Verhältnis der Gruppen zueinander entscheidend ist, wurde relativ quantifiziert.
Hierbei wird die Expression eines Zielgens auf die Expression eines nicht regulierten,
konstant exprimierten Referenzgens (houskeeping gene; hier EF1α) bezogen. Man
nennt diesen Vorgang auch Normalisierung der Expressionsergebnisse [229].
Die in den Versuchen erstellten Daten wurden mit Hilfe von Prism5 (GraphPad
Software, San Diego, CA, USA) analysiert.
Zum Vergleich der Ergebnisse zwischen den Kohorten und innerhalb einer Kohorte,
zwischen den einzelnen Stimulationspunkten und der Kontrolle wurde der paired
T-Test sowie One-way ANOVA: Bonferroni's Multiple Comparison Test mit 95%
Konfidenzintervall verwendet.
Ergebnisse wurden bei einem P-Wert von p<0,05 als signifikant angesehen.
Die Signifikanz wurde in drei Qualitäten differenziert p<0,05 = *, p<0,01 = **,
p<0,001 = ***.
82
4 Ergebnisse
4.1 Vorversuche
In den Konzentrations-Response-Experimenten der Voruntersuchungen konnte
gezeigt werden, dass die isolierten Monozyten der Nie-Raucher (NS) auf die
ausgewählten PAMPs wie gewünscht reagierten. PGN, LTA (jeweils von S. aureus) und
Lipopeptid amiA (von S. pneumoniae) induzierten jeweils die Freisetzung von GMCSF, TNFα und IL-8. Da MMP-9 weder konzentrationsabhängig exprimiert wurde,
noch eine Induktion zu verzeichnen war, wurde es an dieser Stelle nicht weiter
verfolgt (Daten nicht gezeigt). Um die klinisch/therapeutische Relevanz zu erhöhen,
wurde ebenfalls die zelluläre Response auf Total-Extrakte von S. aureus und
S. pneumoniae untersucht. Die Höhe der Zytokinexpression stieg in Korrelation zur
Konzentration der PAMPs die der Monozytenkultur zur Stimulation zugefügt wurden
an. Ausnahme war hier die gemessene IL-8-Konzentration nach Stimulation mit LTA,
da nach Stimulation mit der Höchsten hier verwendeten Konzentration an LTA ein
Abfall
der
IL-8-Expression
im
Vergleich
zur
nächst
niedrigeren
Stimulanzienkonzentration zu verzeichnen war. (Abb.10)
a
83
b
c
Abb. 10: Zytokinfreisetzung aus Monozyten von NS (n=10) im Konzentrations-ResponseExperiment
Kultivierte humane Monozyten wurden mit gram-positiven PAMPs über 24 Std. inkubiert.
Anschließend wurde die Zytokinfreisetzung im Überstand der Monozytenkulturen in
entsprechenden ELISA-Messungen bestimmt. Sowohl IL-8 (a), als auch GM-CSF (b) und TNFα
(c) werden konzentrationsabhängig exprimiert; 1way ANOVA Bonferroni`s Multiple
Comparison Test; Darstellung der Mittelwerte + SEM; Y-Achse: Zytokinexpression;
X-Achse: entsprechend Stimulantien in den beschriebenen Konzentrationen; Verglichen
wurde die Zytokinexpression nach Stimulation im Vergleich zur jeweiligen Kontrolle;
Signifikant erhöhte Werte wurden gekennzeichnet. Signifikanz: p<0,01=**, p<0,001=***
84
Da in den Vorversuchen keine Induktion durch die verwendeten PAMPs bei MMP9
gezeigt werden konnte und auch keine signifikante Erhöhung der Zytokinexpression
nach Stimulation mit den in Tab.6, S.52 aufgeführten Stimulantien im Vergleich zu
Baseline stattfand, wurde dieses Zytokin von weiteren Untersuchungen
ausgeschlossen. (Daten nicht gezeigt)
4.2 Monozyten-Response auf PAMPs gram-positiver Bakterien
Die Baselinelevel von GM-CSF, TNFα und IL-8 waren ohne statistisch signifikante
Unterschiede in Monozyten von NS, S und COPD.
In Monozyten von FS zeigten sich statistisch signifikant erniedrigte Baselinelevel von
GM-CSF im Vergleich zu NS und S sowie statistisch signifikant erniedrigte
Baselinelevel von TNFα im Vergleich zu S und COPD. Die Baselinelevel von IL-8 zeigten
im Vergleich zwischen den Kohorten keine statistisch signifikanten Unterschiede.
(Abb. 11)
a
85
b
c
Abb. 11: Baselinelevel von IL-8, GM-CSF und TNFα im Vergleich zwischen den Kohorten
Y-Achse: IL-8 (a), GM-CSF (b) und TNFα (c)-Konzentration im Überstand der unstimulierten
Monozytenkulturen in pg/ml, X-Achse: Untersuchte Kohorten NS, FS, S und COPD im
Vergleich; n-Zahlen: NS: n = 10, FS: n= 12, S: n= 10, COPD: n= 14; 1way ANOVA Bonferroni`s
Multiple Comparison Test; unpaired T-Test; Darstellung der Mittelwerte + SEM; Verglichen
wurde die Zytokinexpression der unstimulierten Kontrollen im Vergleich zwischen den
Kohorten; Signifikant erhöhte Werte wurden gekennzeichnet: Signifikanz: p<0,05=*,
p<0,01=**, p<0,001=***.
Wie schon in den Voruntersuchungen gezeigt, konnte eine deutliche Response der
isolierten Monozyten auf gram-positive PAMPs nachgewiesen werden. Dies fand sich
nicht nur im Überstand der Monozytenkultur von NS, sondern auch in den anderen
drei
Kohorten.
Die
Zytokinexpression
stieg
mit
Zunahme
der
Stimulanzienkonzentration entsprechend an, was in den Messungen von GM-CSF und
TNFα in allen vier Kohorten verzeichnet werden konnte, während die Expression von
IL-8 nur teilweise entsprechend der Stimulanzienkonzentration anstieg.
Die Messdaten wurden anhand einer logarithmischen Standardkurve quantitativ
ausgewertet. Hierzu wurde entsprechend zum Standard eine Verdünnungsreihe
angefertigt und doppelt aufgetragen. Die gemessenen Werte, sowohl der höchsten,
als auch der niedrigsten Standardkonzentration, fungierten als Grenzen des
Messbereiches. Alle, durch ELISA von mir gemessenen Werte, lagen innerhalb dieser
Grenzen, für das jeweils entsprechende Zytokin und sind somit echte Werte.
Signifikante Unterschiede zwischen den Kohorten werden in den folgenden
Abschnitten gezeigt.
86
4.3 GM-CSF
4.3.1 Stimulation mit PGN
Konzentrationen bis 100 ng/ml PGN führten in keiner der untersuchten Kohorten zu
einer Induktion der GM-CSF Freisetzung aus Monozyten. (Daten nicht gezeigt)
Nach Stimulation mit PGN 1 µg/ml zeigte sich eine signifikante Induktion der GM-CSFFreisetzung aus Monozyten von NS, S, und COPD; FS zeigten hier keinen signifikanten
Unterschied (Daten gezeigt in Abb. 12 b).
10 µg/ml PGN führten zu einer signifikanten Induktion der GM-CSF-Freisetzung aus
Monozyten in allen vier Kohorten (Abb. 12 c).
Unterschiede der Zytokinexpression von GM-CSF zwischen den einzelnen Kohorten
Die GM-CSF-Level nach Exposition mit 1 µg/ml PGN waren in NS im Vergleich zu COPD
und FS erhöht (Abb. 12 b).
Die GM-CSF-Level nach Exposition mit 10 µg/ml PGN waren in NS im Vergleich zu S,
COPD und FS erhöht (Abb. 12 c).
a
87
b
c
Abb. 12: Konzentrations-Response-Modelle von GM-CSF nach Monozytenstimulation mit
PGN.
a: Vergleich der Expressionen aller vier Stimulationskonzentrationen sowie ohne Stimulation
zwischen den Kohorten; b: Vergleich der Expression aller vier Kohorten ohne Stimulation und
nach Stimulation mit PGN 1 µg/ml; c: Vergleich der Expressionen aller vier Kohorten ohne
Stimulation und nach Stimulation mit PGN 10 µg/ml; 1way ANOVA Bonferroni`s Multiple
Comparison Test; paired t-test; Darstellung der Mittelwerte + SEM; Signifikanz: p<0,05=*,
p<0,01=**, p<0,001=***
Da sich in den absoluten Zahlen ein signifikanter Unterschied der Baselinelevel zeigte,
wurden auch die fold-Induktion Werte (relative Werte) untersucht.
Hier sollte gezeigt werden, ob die signifikanten Unterschiede tatsächlich auf die
Induktion zurückzuführen sind, oder durch die unterschiedlichen Baselinelevel
verursacht wurden.
Fold-Induktion Werte
So zeigten sich im Vergleich der relativen Werte bei einer Konzentration bis
100 ng/ml PGN keine signifikanten Unterschiede in der GM-CSF Freisetzung aus
Monozyten. (Daten nicht gezeigt)
Nach Stimulation mit PGN 1 µg/ml zeigte sich eine signifikant erhöhte Induktion der
GM-CSF Freisetzung aus Monozyten von S und COPD (Abb. 13 b).
10 µg/ml PGN führten zu einer signifikanten Induktion der GM-CSF Freisetzung aus
Monozyten in allen vier Kohorten (Abb. 13 c).
88
Im Vergleich der Kohorten untereinander zeigten sich die GM-CSF-Level nach
Exposition mit 1 µg/ml PGN in NS im Vergleich zu S signifikant erhöht (Abb. 13 b).
Die GM-CSF-Level nach Exposition mit 10 µg/ml PGN waren in NS gegenüber S und
COPD, sowie in FS gegenüber NS, S und COPD signifikant erhöht (Abb. 13 c).
a
b
c
Abb. 13: Fold Induktion: relative Werte (bezogen auf die Kontrolle) der GM-CSF-Expression
aller vier Kohorten.
Nach Stimulation und vierundzwanzigstündiger Inkubation mit PGN in den vier angegeben
Stimulanzienkonzentrationen erfolgte die Messung der GM-CSF-Expression im Überstand
der Monozytenkulturen. a: alle vier Stimulationskonzentrationen im Vergleich der
Kohorten; b:Induktion in RV bei Stimulation mit PGN 1µg/ml; c: Induktion in RV bei
Stimulation mit PGN 10 µg/ml; Verglichen wurde die Induktion zwischen den Kohorten;
1way ANOVA Bonferroni`s Multiple Comparison Test; paired t-test; Darstellung der
Mittelwerte + SEM; Signifikanz: p<0,05=*, p<0,001=***
89
4.3.2 Stimulation mit LTA
Eine Stimulation mit 10 ng/ml LTA führte in keiner der untersuchten Kohorten zu
einer Induktion der GM-CSF Freisetzung aus Monozyten. (Daten gezeigt in Abb. 14b)
Nach Stimulation mit LTA 100 ng/ml zeigte sich eine signifikante Induktion der
GM-CSF-Freisetzung aus Monozyten von NS, S und FS; COPD zeigten hier keinen
signifikanten Unterschied (Daten gezeigt in Abb. 14 c).
1 µg/ml, sowie 10 µg/ml LTA führten zu einer signifikanten Induktion der GM-CSFFreisetzung aus Monozyten aller vier Kohorten (Abb. 14 d, e).
Unterschiede der Zytokinexpression von GM-CSF zwischen den einzelnen Kohorten
Die GM-CSF-Level nach Exposition mit 10 ng/ml , sowie 100 ng/ml LTA waren in NS
im Vergleich zu COPD und FS erhöht; die anderen Kohorten zeigten hier im Vergleich
untereinander keine signifikanten Unterschiede (Abb. 14 b, c).
Die GM-CSF-Level nach Exposition mit 1 µg/ml, sowie 10 µg/ml LTA waren in NS im
Vergleich zu S, COPD und FS erhöht (Abb. 14 d, e).
a
90
b
c
d
e
Abb. 14: Konzentrations-Response-Modell von GM-CSF nach Monozytenstimulation mit
LTA.
Die Messung erfolgt mittels ELISA im Überstand der Monozytenkulturen nach
vierundzwanzigstündiger Inkubation mit den entsprechenden LTA-Konzentrationen.
a: Vergleich der Expressionen aller vier Stimulationskonzentrationen sowie ohne Stimulation
zwischen den Kohorten; b: Vergleich der Expression aller vier Kohorten ohne Stimulation (-)
und nach Stimulation (+) mit LTA 10 ng/ml; c: Vergleich Expression aller vier Kohorten ohne
Stimulation (-) und nach Stimulation(+) mit LTA 100ng/ml; d: Vergleich der Expression aller
vier Kohorten ohne Stimulation (-) und nach Stimulation (+) mit LTA 1 µg/ml. e: Vergleich der
Expression aller vier Kohorten ohne Stimulation (-) und nach Stimulation (+) mit LTA 10
µg/ml; 1way ANOVA Bonferroni`s Multiple Comparison Test; paired t-test; Darstellung der
Mittelwerte + SEM; Vergleich der Induktion zwischen den Kohorten : Signifikanz: p<0,05=*,
p<0,01=**, p<0,001=***
91
Da sich in den absoluten Zahlen ein signifikanter Unterschied der Baselinelevel fand,
wurden auch hier die relativen Werte untersucht.
Hier sollte gezeigt werden, ob die signifikanten Unterschiede tatsächlich auf die
Induktion zurückzuführen sind, oder durch die unterschiedlichen Baselinelevel
verursacht wurden.
Fold-Induktion Werte
Nach Stimulation mit LTA 10 ng/ml zeigte sich eine signifikant erhöhte Induktion der
GM-CSF Freisetzung aus Monozyten von NS und FS (Abb. 15 b).
Ab einer Stimulanzienkonzentration von 100 ng/ml zeigten sich in allen vier Kohorten
signifikante Induktionen der GM-CSF-Expression (Abb. 15 c-e).
Im Vergleich der Kohorten untereinander zeigten sich, die GM-CSF-Level nach
Exposition mit 10 ng/ml LTA in NS im Vergleich zu S und COPD signifikant erhöht (Abb.
15 b).
Die GM-CSF-Level waren in NS gegenüber S und COPD, sowie in FS gegenüber NS, S
und COPD ab einer Exposition mit 100 ng/ml LTA signifikant erhöht (Abb 15 c-e).
a
92
b
c
d
e
Abb. 15: Fold Induktion: Relative Werte der GM-CSF-Expression nach LTA-Stimulation.
Nach Stimulation und vierundzwanzigstündiger Inkubation mit LTA in den vier angegeben
Stimulanzienkonzentrationen erfolgt die Messung der GM-CSF-Expression im Überstand der
Monozytenkulturen. a: alle vier Stimulationskonzentrationen im Vergleich der Kohorten;
b:Induktion in RV bei Stimulation mit PGN 10 ng/ml; c: Induktion in RV bei Stimulation mit
LTA 100ng/ml d: Induktion in RV bei Stimulation mit LTA 1 µg/ml; e: Induktion in RV bei
Stimulation mit LTA 10 µg/ml; 1way ANOVA Bonferroni`s Multiple Comparison Test;
paired t-test; Darstellung der Mittelwerte + SEM;
Signifikanz: p<0,05=*, p<0,01=**, p<0,001=***
93
4.3.3 Stimulation mit amiA
Eine Stimulation mit 1 ng/ml amiA führte in keiner der untersuchten Kohorten zu
einer Induktion der GM-CSF Freisetzung aus Monozyten. (Daten gezeigt in Abb. 16b)
Nach Stimulation mit amiA 10 ng/ml zeigte sich eine signifikante Induktion der
GM-CSF Freisetzung aus Monozyten von NS und S (Daten gezeigt in Abb. 16 c).
100 ng/ml amiA führten zu einer signifikanten Induktion der GM-CSF Freisetzung aus
Monozyten von NS und FS (Abb. 16 d).
Hier ist besonders zu vermerken, dass es nicht zu einem konstanten Anstieg der
Zytokinexpression mit Zunahme der Stimulanzienkonzentration kam.
Wie in Abb. 16 a deutlich zu sehen nimmt die amiA-Expression von der vorletzten zur
letzten von mir verwendeten Konzentrationshöhe wieder ab. Lediglich im Überstand
der Monozytenkulturen von NS und FS ist eine konstante Zunahme der amiAExpression mit Anstieg der Stimulanzienkonzentration zu verzeichnen.
Unterschiede der Zytokinexpression von GM-CSF zwischen den einzelnen Kohorten
Die GM-CSF-Level nach Exposition mit 1 ng/ml amiA waren in NS im Vergleich zu FS
erhöht (Abb. 16 b).
Die GM-CSF-Level nach Exposition mit 10 ng/ml amiA waren in NS im Vergleich zu
COPD und FS statistisch signifikant erhöht (Abb. 16 c).
Die GM-CSF-Level nach Exposition mit 100 ng/ml amiA waren in NS im Vergleich zu S,
COPD und FS signifikant erhöht (Abb. 16 d).
94
a
b
c
d
Abb. 16: Konzentrations-Response-Modell von GM-CSF nach Monozytenstimulation mit
amiA
Die Messung erfolgt mittels ELISA im Überstand der Monozytenkulturen nach 24stündiger
Inkubation mit den entsprechenden amiA-Konzentrationen.
a: Vergleich der Expressionen aller drei Stimulationskonzentrationen sowie ohne Stimulation
zwischen den Kohorten; b: Vergleich der Expression aller vier Kohorten ohne Stimulation (-)
und nach Stimulation (+) mit amiA 1 ng/ml; c: Vergleich Expression aller vier Kohorten ohne
Stimulation (-) und nach Stimulation(+) mit amiA 10ng/ml; d: Vergleich der Expression aller
vier Kohorten ohne Stimulation (-) und nach Stimulation (+) mit amiA 100 ng/ml; 1way
ANOVA Bonferroni`s Multiple Comparison Test; paired t-test; Darstellung der Mittelwerte +
SEM; Signifikanz: p<0,05=*, p<0,01=**, p<0,001=***
Da sich in den absoluten Zahlen ein signifikanter Unterschied der Baselinelevel zeigte,
wurden auch hier die relativen Werte untersucht.
95
Hier sollte gezeigt werden, ob die signifikanten Unterschiede tatsächlich auf die
Induktion zurückzuführen sind, oder durch die unterschiedlichen Baselinelevel
verursacht wurden.
Fold-Induktion Werte
Nach Stimulation mit amiA 1 ng/ml zeigte sich eine signifikant erhöhte Induktion der
GM-CSF Freisetzung aus Monozyten von S und COPD (Abb. 17 b).
Bei einer Stimulanzienkonzentration von 10 ng/ml amiA zeigten sich signifikante
Induktionen der GM-CSF-Expression in NS, S und COPD (Abb. 17 c).
100 ng/ml amiA führten zu einer signifikanten Induktion der GM-CSF Freisetzung aus
Monozyten von NS, COPD und FS (Abb. 17 d).
Im Vergleich der Kohorten untereinander zeigten die GM-CSF-Level bis zu einer
Exposition mit 10 ng/ml amiA keine signifikanten Unterschiede (Abb. 17 b, c).
Die GM-CSF-Level zeigten bei einer Exposition mit 100 ng/ml amiA signifikant erhöhte
Induktionen in NS im Vergleich zu S (Abb. 17 d).
a
b
96
c
d
Abb.17: Fold Induktion: Relative Werte der GM-CSF-Expression nach amiA-Stimulation.
Nach Stimulation und vierundzwanzigstündiger Inkubation mit amiA in den drei angegeben
Stimulanzienkonzentrationen erfolgt die Messung der GM-CSF-Expression im Überstand der
Monozytenkulturen. a: alle drei Stimulationskonzentrationen im Vergleich der Kohorten;
b:Induktion in RV bei Stimulation mit amiA 1 ng/ml; c: Induktion in RV bei Stimulation mit
amiA 10 ng/ml d: Induktion in RV bei Stimulation mit amiA 100 ng/ml;
1way ANOVA Bonferroni`s Multiple Comparison Test; paired t-test;
Darstellung der Mittelwerte + SEM; Signifikanz: p<0,05 = *
4.3.4 Stimulation mit S. aureus-Totalextrakte
Eine Stimulation mit S. aureus MOI 1:1 führte in NS und FS zu einer Induktion der
GM-CSF-Freisetzung aus Monozyten (Daten gezeigt in Abb. 18 b).
Ab einer Stimulation mit S. aureus MOI 10:1 zeigten sich signifikante Induktionen der
GM-CSF-Freisetzung aus Monozyten aller vier Kohorten (Daten gezeigt in
Abb. 18 c, d).
Unterschiede der Zytokinexpression von GM-CSF zwischen den einzelnen Kohorten
Die GM-CSF-Level nach Exposition mit S. aureus MOI 1:1 waren in NS im Vergleich zu
COPD und FS sowie in S im Vergleich zu FS signifikant erhöht (Abb. 18 b).
Die GM-CSF-Level nach Exposition mit S. aureus MOI 10:1 waren in NS im Vergleich
zu S, COPD und FS, sowie in S gegenüber FS statistisch signifikant erhöht (Abb. 18 c).
Die GM-CSF-Level nach Exposition mit S. aureus MOI 100:1 waren in NS im Vergleich
zu S und COPD statistisch signifikant erhöht (Abb. 18 d).
97
a
b
c
d
Abb. 18: Konzentrations-Response-Modell von GM-CSF nach Monozytenstimulation mit
S.aureus-Totalextrakt
Die Messung erfolgt mittels ELISA im Überstand der Monozytenkulturen nach
vierundzwanzigstündiger Inkubation mit den entsprechenden S.aureus-Konzentrationen.
a: Vergleich der Expressionen aller drei Stimulationskonzentrationen sowie ohne
Stimulation zwischen den Kohorten; b: Vergleich der Expression aller vier Kohorten ohne
Stimulation (-) und nach Stimulation (+) mit S.aureus MOI 1:1; c: Vergleich Expression aller
vier Kohorten ohne Stimulation (-) und nach Stimulation(+) mit S.aureus MOI 10:1;
d: Vergleich der Expression aller vier Kohorten ohne Stimulation (-) und nach Stimulation (+)
mit S.aureus MOI 100:1; 1way ANOVA Bonferroni`s Multiple Comparison Test; paired t-test;
Darstellung der Mittelwerte + SEM; Signifikanz: p<0,05=*, p<0,01=**, p<0,001=***
Da sich in den absoluten Zahlen ein signifikanter Unterschied der Baselinelevel zeigte,
wurden auch hier die relativen Werte untersucht.
98
Hier sollte gezeigt werden, ob die signifikanten Unterschiede tatsächlich auf die
Induktion zurückzuführen sind, oder durch die unterschiedlichen Baselinelevel
verursacht wurden.
Fold-Induktion Werte
Nach Stimulation mit S.aureus MOI 1:1 zeigte sich eine signifikant erhöhte Induktion
der GM-CSF-Freisetzung aus Monozyten von FS und COPD (Abb. 19 b).
Bei einer Stimulanzienkonzentration von S.aureus MOI 10:1 zeigten sich signifikante
Induktionen der GM-CSF-Expression in allen vier Kohorten (Abb. 19 c).
S. aureus MOI 100:1 führte zu einer signifikanten Induktion der GM-CSF-Freisetzung
aus Monozyten von S, COPD und FS (Abb. 19 d).
Im Vergleich der Kohorten untereinander zeigten die GM-CSF-Level bei einer
Exposition mit S.aureus MOI 1:1 keine signifikanten Unterschiede (Abb 18 b).
Die GM-CSF-Level zeigten bei einer Exposition mit S.aureus MOI 10:1 signifikant
erhöhte Induktionen in NS im Vergleich zu S und COPD (Abb. 18 c).
Die GM-CSF-Level zeigten bei einer Exposition mit S.aureus MOI 100:1 signifikant
erhöhte Induktionen in FS im Vergleich zu NS, S und COPD (Abb. 18 d).
99
a
b
c
d
Abb. 19: Fold Induktion: Relative Werte der GM-CSF-Expression nach S.aureus-Stimulation.
Nach Stimulation und vierundzwanzigstündiger Inkubation mit S.aureus in den drei
angegeben Stimulanzienkonzentrationen erfolgt die Messung der GM-CSF-Expression im
Überstand der Monozytenkulturen. a: alle drei Stimulationskonzentrationen im Vergleich
der Kohorten; b: Induktion in RV bei Stimulation mit S.aureus MOI 1:1; c: Induktion in RV
bei der Stimulation mit S.aureus MOI 10:1 d: Induktion in RV bei Stimulation mit S.aureus
MOI 100:1; 1way ANOVA Bonferroni`s Multiple Comparison Test; paired t-test;
Darstellung der Mittelwerte + SEM; Signifikanz: p<0,05=*, p<0,01=**, p<0,001=***
100
4.3.5 Stimulation mit S. pneumoniae-Totalextrakte
Eine Stimulation mit S. pneumoniae MOI 1:1 führte zu keiner Induktion der GM-CSFFreisetzung aus Monozyten (Daten gezeigt in Abb. 20 b).
Bei einer Stimulation mit S. pneumoniae MOI 10:1 zeigten sich signifikante
Induktionen der GM-CSF-Freisetzung aus Monozyten von NS (Daten gezeigt in
Abb. 20 c).
Nach Stimulation mit S. pneumoniae MOI 100:1 zeigten sich signifikante Induktionen
der GM-CSF-Freisetzung aus Monozyten aller vier Kohorten (Daten gezeigt in Abb.
20 d).
Unterschiede der Zytokinexpression von GM-CSF zwischen den einzelnen Kohorten
Die GM-CSF-Level nach Exposition mit S. pneumoniae MOI 1:1 waren in NS im
Vergleich zu FS signifikant erhöht (Abb. 20 b).
Die GM-CSF-Level nach Exposition mit S. pneumoniae MOI 10:1 waren in NS im
Vergleich zu COPD und FS statistisch signifikant erhöht (Abb. 20 c).
Die GM-CSF-Level nach Exposition mit S. pneumoniae MOI 100:1 waren in NS im
Vergleich zu S, FS und COPD statistisch signifikant erhöht (Abb. 20 d).
a
b
101
c
d
Abb. 20: Konzentrations-Response-Modell von GM-CSF nach Monozytenstimulation mit
S. pneumoniae-Totalextrakt.
Die Messung erfolgt mittels ELISA im Überstand der Monozytenkulturen nach
vierundzwanzigstündiger Inkubation mit den entsprechenden S.pneumoniaeKonzentrationen. a: Vergleich der Expressionen aller drei Stimulationskonzentrationen sowie
ohne Stimulation zwischen den Kohorten; b: Vergleich der Expression aller vier Kohorten
ohne Stimulation (-) und nach Stimulation (+) mit S.pneumoniae MOI 1:1; c: Vergleich
Expression aller vier Kohorten ohne Stimulation (-) und nach Stimulation(+) mit
S.pneumoniae MOI 10:1; d: Vergleich der Expression aller vier Kohorten ohne Stimulation(-)
und nach Stimulation (+) mit S.pneumoniae MOI 100:1; 1way ANOVA Bonferroni`s Multiple
Comparison Test; paired t-test; Darstellung der Mittelwerte + SEM; Signifikanz: p<0,05=*,
p<0,01=**, p<0,001=***
Da sich in den absoluten Zahlen ein signifikanter Unterschied der Baselinelevel zeigte,
wurden auch hier die relativen Werte untersucht.
Hier sollte gezeigt werden, ob die signifikanten Unterschiede tatsächlich auf die
Induktion zurückzuführen sind oder durch die unterschiedlichen Baselinelevel
verursacht wurden.
Fold-Induktion Werte
Nach Stimulation mit S. pneumoniae MOI 1:1, sowie S. pneumoniae MOI 10:1 zeigte
sich eine signifikant erhöhte Induktion der GM-CSF-Freisetzung aus Monozyten von
FS und COPD (Abb. 21 b, c).
S. pneumoniae MOI 100:1 führte zu einer signifikanten Induktion der GM-CSFFreisetzung aus Monozyten von NS (Abb. 21 d).
102
Im Vergleich der Kohorten untereinander zeigten die GM-CSF-Level bei einer
Exposition mit S. pneumoniae MOI 1:1 eine signifikante Erhöhung von FS im Vergleich
zu NS (Abb. 21 b). Die GM-CSF-Level zeigten bei einer Exposition mit S. p. MOI 10:1
keine signifikant erhöhte Induktion im Vergleich der Kohorten.
Die GM-CSF-Level zeigten bei einer Exposition mit S. pneumoniae MOI 100:1
signifikant erhöhte Induktionen in FS im Vergleich zu COPD (Abb. 21 d).
a
b
c
d
Abb. 21: Fold Induktion: Relative Werte der GM-CSF-Expression nach S.pneumoniaeStimulation.
Nach Stimulation und 24stündiger Inkubation mit S.pneumoniae in den drei angegeben
Stimulanzienkonzentrationen erfolgt die Messung der GM-CSF-Expression im Überstand der
Monozytenkulturen. a: alle drei Stimulationskonzentrationen im Vergleich der Kohorten;
b: Induktion in RV bei Stimulation mit S.pneumoniae MOI 1:1; c: Induktion in RV bei
Stimulation mit S.p MOI 10:1 d: Induktion in RV bei Stimulation mit S.p MOI 100:1;
1way ANOVA Bonferroni`s Multiple Comparison Test; paired t-test;
Darstellung der Mittelwerte + SEM; Signifikanz: p<0,05=*, p<0,01=**
103
4.4 IL-8
4.4.1 Stimulation mit PGN
Konzentrationen bis 1 µg/ml PGN führten in keiner der untersuchten Kohorten zu
einer Induktion der IL-8-Freisetzung aus Monozyten. (Daten nicht gezeigt)
Nach Stimulation mit PGN 10 µg/ml zeigte sich eine signifikante Induktion der IL-8Freisetzung aus Monozyten von S, FS und COPD; NS zeigten hier keinen signifikanten
Unterschied (Daten gezeigt in Abb. 22 b).
Unterschiede der Zytokinexpression von IL-8 zwischen den einzelnen Kohorten
konnten nach Exposition mit PGN nicht gezeigt werden.
a
b
Abb. 22: Konzentrations-Response-Modell von IL-8 nach Monozytenstimulation mit PGN
a: Vergleich der Expressionen aller vier Stimulationskonzentrationen sowie ohne Stimulation
zwischen den Kohorten; b: Vergleich der Expression aller vier Kohorten ohne Stimulation(-)
und nach Stimulation(+) mit PGN 10 µg/ml; 1way ANOVA Bonferroni`s Multiple Comparison
Test; paired t-test; Darstellung der Mittelwerte + SEM;
Signifikanz: p<0,05=*, p<0,01=**
Obwohl sich, wie bereits zuvor in Abb.11 gezeigt, in den absoluten Zahlen kein
signifikanter Unterschied der Baselinelevel zeigte, wurden auch die relativen Werte
der Zytokinexpression untersucht, um sicher zu stellen ob die zwar nicht
signifikanten, jedoch vorhandenen Unterschiede in der Baseline-Expression
Auswirkungen auf die Ergebnisse haben.
104
Fold-Induktion Werte
So zeigten sich im Vergleich der relativen Werte bei einer Konzentration von
100 ng/ml PGN signifikante Unterschiede in der IL-8- Freisetzung aus Monozyten von
S, COPD und FS (Daten gezeigt in Abb. 23 b).
Nach Stimulation mit PGN 1 µg/ml zeigte sich eine signifikant erhöhte Induktion der
IL-8-Freisetzung aus Monozyten von NS, FS und COPD (Abb. 23 c).
10 µg/ml PGN führten zu einer signifikanten Induktion der IL-8-Freisetzung aus
Monozyten in S, FS und COPD (Abb.22 d).
Im Vergleich der Kohorten untereinander zeigten sich die IL-8-Level nach Exposition
mit 10 µg/ml PGN in FS gegenüber COPD signifikant erhöht (Abb. 23 d).
a
b
105
c
d
Abb. 23: Fold Induktion: Relative Werte der IL-8-Expression nach PGN-Stimulation.
Nach Stimulation und vierundzwanzigstündiger Inkubation mit PGN in den vier angegeben
Stimulanzienkonzentrationen erfolgt die Messung der IL-8-Expression im Überstand der
Monozytenkulturen. a: alle vier Stimulationskonzentrationen im Vergleich der Kohorten;
b: Induktion in RV bei Stimulation mit PGN 100 ng/ml; c: Induktion in RV bei Stimulation mit
PGN 1 µg/ml d: Induktion in RV bei Stimulation mit PGN 10 µg/ml; 1way ANOVA
Bonferroni`s Multiple Comparison Test; paired t-test; Darstellung der Mittelwerte + SEM;
Signifikanz: p<0,05=*, p<0,01=**, p<0,001=***
4.4.2 Stimulation mit LTA
Eine Stimulation mit 10 ng/ml LTA führte in keiner der untersuchten Kohorten zu
einer Induktion der IL-8- Freisetzung aus Monozyten (Daten nicht gezeigt).
Nach Stimulation mit LTA 100 ng/ml zeigte sich eine signifikante Induktion der IL-8Freisetzung aus Monozyten von FS (Daten gezeigt in Abb. 24 b).
1 µg/ml, sowie 10 µg/ml LTA führten zu einer signifikanten Induktion der IL-8Freisetzung aus Monozyten von S, COPD und FS (Abb. 24 c, d).
Hier ist besonders zu vermerken, dass es nicht zu einem konstanten Anstieg der
Zytokinexpression mit Zunahme der Stimulanzienkonzentration kam. Wie in Abb. 24a
deutlich zu sehen, nimmt die LTA-Expression von der vorletzten zur letzten
Konzentration wieder ab. Lediglich im Überstand der Monozytenkulturen von FS, ist
eine
konstante
Zunahme
der
LTA-Expression
mit
Anstieg
der
Stimulanzienkonzentration zu verzeichnen.
106
Unterschiede der Zytokinexpression von IL-8 zwischen den einzelnen Kohorten
konnte für IL-8 nach Exposition mit LTA nicht gezeigt werden.
a
b
c
d
Abb. 24: Konzentrations-Response-Modell von IL-8 nach Monozytenstimulation mit LTA.
Die Messung erfolgt mittels ELISA im Überstand der Monozytenkulturen nach
vierundzwanzigstündiger Inkubation mit den entsprechenden LTA-Konzentrationen.
a: Vergleich der Expressionen aller vier Stimulationskonzentrationen sowie ohne Stimulation
zwischen den Kohorten; b: Vergleich Expression aller vier Kohorten ohne Stimulation (-) und
nach Stimulation(+) mit LTA 100ng/ml; c: Vergleich der Expression aller vier Kohorten ohne
Stimulation (-) und nach Stimulation (+) mit LTA 1 µg/ml. d: Vergleich der Expression aller vier
Kohorten ohne Stimulation (-) und nach Stimulation (+) mit LTA 10 µg/ml; 1way ANOVA
Bonferroni`s Multiple Comparison Test; paired t-test; Darstellung der Mittelwerte + SEM;
Signifikanz: p<0,05=*, p<0,01=**, p<0,001=***
Obwohl sich, wie bereits zuvor in Abb.11, S.86 gezeigt, in den absoluten Zahlen kein
signifikanter Unterschied der Baselinelevel zeigte, wurden auch die relativen Werte
der Zytokinexpression untersucht.
107
So sollte sichergestellt werden, ob die Unterschiede in der Baseline-Expression auch
hier Auswirkungen auf die Ergebnisse haben.
Fold-Induktion Werte
Nach Stimulation mit LTA 10 ng/ml zeigte sich keine signifikant erhöhte Induktion der
IL-8-Freisetzung aus Monozyten aller vier Kohorten (Daten nicht gezeigt).
Bei einer Stimulanzienkonzentration von 100 ng/ml zeigten sich signifikante
Induktionen der IL-8-Expression in FS (Abb. 25 b). Nach Stimulation mit LTA 1 µg/ml
zeigte sich eine signifikant erhöhte Induktion der IL-8-Freisetzung aus Monozyten
von S und FS (Abb. 25 c). LTA 10 µg/ml führte zu einer signifikant gesteigerten
Induktion in S, COPD und FS (Abb. 25 d).
Im Vergleich der Kohorten untereinander zeigten sich keine erhöhten IL-8-Level nach
Exposition mit 10 ng/ml LTA (Daten nicht gezeigt). Die IL-8-Level bei einer Exposition
mit 100 ng/ml LTA waren in FS gegenüber NS, S und COPD signifikant erhöht (Abb. 25
b). Bei einer Exposition mit 1 µg/ml, sowie 10 µg/ml LTA zeigten sich signifikant
erhöhte IL-8-Level in FS gegenüber S und COPD (Abb. 25c, d).
a
b
108
c
d
Abb. 25: Fold Induktion: Relative Werte der IL-8-Expression nach LTA-Stimulation.
Nach Stimulation und vierundzwanzigstündiger Inkubation mit LTA in den vier angegeben
Stimulanzienkonzentrationen erfolgt die Messung der IL-8-Expression im Überstand der
Monozytenkulturen. a: alle vier Stimulationskonzentrationen im Vergleich der Kohorten;
b: Induktion in RV bei Stimulation mit LTA 100 ng/ml; c: Induktion in RV bei Stimulation mit
LTA 1 µg/ml d: Induktion in RV bei Stimulation mit LTA 10 µg/ml; 1way ANOVA Bonferroni`s
Multiple Comparison Test; paired t-test; Darstellung der Mittelwerte + SEM;
Signifikanz: p<0,05=*, p<0,01=**, p<0,001=***
4.4.3 Stimulation mit amiA
Eine Stimulation mit 1 ng/ml, sowie 10 ng/ml amiA führte in keiner der untersuchten
Kohorten zu einer Induktion der IL-8- Freisetzung aus Monozyten. (Daten nicht
gezeigt)
100 ng/ml amiA führten zu einer signifikanten Induktion der IL-8- Freisetzung aus
Monozyten von FS (Abb. 26 b).
Hier ist besonders zu vermerken, dass es im Überstand der Monozytenkulturen von
COPD nicht zu einem konstanten Anstieg der Zytokinexpression mit Zunahme der
Stimulanzienkonzentration kam. Wie in Abbildung 26 a zu sehen, nimmt die amiAExpression von der vorletzten zur letzten Konzentrationshöhe wieder ab.
Unterschiede der Zytokinexpression von IL-8 zwischen den einzelnen Kohorten
konnte nach Exposition mit amiA nicht gezeigt werden.
109
a
b
Abb. 26: Konzentrations-Response-Modell von IL-8 nach Monozytenstimulation mit amiA.
Die Messung erfolgt mittels ELISA im Überstand der Monozytenkulturen nach 24stündiger
Inkubation mit den entsprechenden amiA-Konzentrationen.
a: Vergleich der Expressionen aller vier Stimulationskonzentrationen sowie ohne Stimulation
zwischen den Kohorten; b: Vergleich Expression aller vier Kohorten ohne Stimulation (-) und
nach Stimulation(+) mit amiA 100 ng/ml; 1way ANOVA Bonferroni`s Multiple Comparison
Test; paired t-test; Darstellung der Mittelwerte + SEM; Signifikanz: p<0,05=*
Da sowohl die Baselinelevel, als auch die Stimulationen mit amiA keine signifikanten
Unterschiede im Vergleich zwischen den Kohorten aufwiesen, wurde auf die
Darstellung der relativen Werte verzichtet.
4.4.4 Stimulation mit S. aureus-Totalextrakte
Eine Stimulation mit S. aureus MOI 1:1 führte zu keiner signifikanten Induktion der
IL-8- Freisetzung aus Monozyten (Daten nicht gezeigt).
Bei einer Stimulation mit S. aureus MOI 10:1 zeigten sich signifikante Induktionen der
IL-8-Freisetzung aus Monozyten in COPD und FS (Daten gezeigt in Abb. 27 b).
S. aureus MOI 100:1 führte zu einer Induktion der IL-8-Expression in allen vier
Kohorten (Abb. 27 c).
Unterschiede der Zytokinexpression von IL-8 zwischen den einzelnen Kohorten
konnten nach Exposition mit S. aureus nicht gezeigt werden.
110
a
b
c
Abb. 27: Konzentrations-Response-Modell von IL-8 nach Monozytenstimulation mit
Totalextrakten von S.aureus
Die Messung erfolgt mittels ELISA im Überstand der Monozytenkulturen nach
vierundzwanzigstündiger Inkubation mit den entsprechenden S.a.-Konzentrationen.
a: Vergleich der Expressionen aller vier Stimulationskonzentrationen sowie ohne Stimulation
zwischen den Kohorten; b: Vergleich Expression aller vier Kohorten ohne Stimulation (-) und
nach Stimulation(+) mit S.aureus MOI 10:1; c: Vergleich Expression aller vier Kohorten ohne
Stimulation (-) und nach Stimulation(+) mit S.aureus MOI 100:1;
1way ANOVA Bonferroni`s Multiple Comparison Test; paired t-test; Darstellung der
Mittelwerte + SEM; Signifikanz: p<0,05=*, p<0,01=**, p<0,001=***
Da sowohl die Baselinelevel, als auch die Stimulationen mit amiA keine signifikanten
Unterschiede im Vergleich zwischen den Kohorten aufwiesen, wurde auf die
Darstellung der relativen Werte verzichtet.
111
4.4.5 Stimulation mit S. pneumoniae-Totalextrakte
Eine Stimulation mit S. pneumoniae MOI 1:1 sowie MOI 10:1 führte zu keiner
signifikanten Induktion der IL-8-Freisetzung aus Monozyten (Daten nicht gezeigt).
Nach Stimulation mit S. pneumoniae MOI 100:1 zeigten sich signifikante Induktionen
der IL-8-Freisetzung aus COPD und FS (Daten gezeigt in Abb. 28 b).
Unterschiede der Zytokinexpression von IL-8 zwischen den einzelnen Kohorten
konnten nach Exposition mit S. pneumoniae nicht gezeigt werden.
a
b
Abb. 28: Konzentrations-Response-Modell von IL-8 nach Monozytenstimulation mit
Totalextrakten von S. pneumoniae
Die Messung erfolgt mittels ELISA im Überstand der Monozytenkulturen nach
vierundzwanzigstündiger Inkubation mit den entsprechenden S. pneumoniaeKonzentrationen. a: Vergleich der Expressionen aller vier Stimulationskonzentrationen sowie
ohne Stimulation zwischen den Kohorten; b: Vergleich Expression aller vier Kohorten ohne
Stimulation (-) und nach Stimulation(+) mit S.p. MOI 10:1; 1way ANOVA Bonferroni`s Multiple
Comparison Test; paired t-test; Darstellung der Mittelwerte + SEM; Signifikanz: p<0,05=*,
p<0,01=**
Da sowohl die Baselinelevel, als auch die Stimulationen mit amiA keine signifikanten
Unterschiede im Vergleich zwischen den Kohorten aufwiesen, wurde auf die
Darstellung der relativen Werte verzichtet.
112
4.5 TNFα
4.5.1 Stimulation mit PGN
Nach Stimulation mit 10 ng/ml PGN konnte eine Induktion der TNFα- Freisetzung aus
Monozyten in S und FS gezeigt werden (Abb. 29 b).
100 ng/ml PGN führten zu einer signifikanten Induktion der TNFα-Freisetzung aus
Monozyten von NS und S (Abb. 29 c).
Es konnte eine signifikante TNFα-Induktion nach Exposition mit 1 µg/ml PGN in allen
vier Kohorten gezeigt werden.
10 µg/ml PGN führten zu einer signifikanten Induktion der TNFα-Freisetzung aus
Monozyten von NS, S und COPD.
Unterschiede der Zytokinexpression von TNFα zwischen den einzelnen Kohorten
Die TNFα-Level nach Exposition mit 10 ng/ml sowie 100 ng/ml PGN war in S im
Vergleich zu FS signifikant erhöht (Abb. 29 b, c).
1 µg/ml PGN führten zu keiner signifikanten Induktion der TNFα-Freisetzung im
Vergleich der Kohorten.
Die TNFα-Level nach Exposition mt 10 µg/ml PGN war in NS im Vergleich zu S und
COPD signifikant erhöht (Abb. 29 e).
a
113
b
c
d
e
Abb. 29: Konzentrations-Response-Modell von TNFα nach Monozytenstimulation mit PGN.
Die Messung erfolgt mittels ELISA im Überstand der Monozytenkulturen nach
vierundzwanzigstündiger Inkubation mit den entsprechenden PGN-Konzentrationen.
a: Vergleich der Expressionen aller vier Stimulationskonzentrationen sowie ohne Stimulation
zwischen den Kohorten; b: Vergleich Expression aller vier Kohorten ohne Stimulation (-) und
nach Stimulation(+) mit PGN 10ng/ml; c: Vergleich Expression aller vier Kohorten ohne
Stimulation (-) und nach Stimulation(+) mit PGN 100ng/ml; d: Vergleich Expression aller vier
Kohorten ohne Stimulation (-) und nach Stimulation(+) mit PGN 1µg/ml; e: Vergleich
Expression aller vier Kohorten ohne Stimulation (-) und nach Stimulation(+) mit PGN 10µg/ml;
1way ANOVA Bonferroni`s Multiple Comparison Test; paired t-test; Darstellung der
Mittelwerte + SEM; Signifikanz: p<0,05=*, p<0,01=**, p<0,001=***
Da sich in den absoluten Zahlen ein signifikanter Unterschied der Baselinelevel zeigte,
wurden auch die relativen Werte untersucht.
Hier sollte gezeigt werden, ob die signifikanten Unterschiede tatsächlich auf die
Induktion zurückzuführen sind, oder durch die unterschiedlichen Baselinelevel
verursacht wurden.
114
Fold-Induktion Werte
So zeigten sich im Vergleich der relativen Werte bei einer Konzentration von
10 ng/ml PGN signifikante Unterschiede in der TNFα- Freisetzung aus Monozyten in
S und FS (Abb. 30 b)
Nach Stimulation mit PGN 100 ng/ml zeigte sich eine signifikant erhöhte Induktion
der TNFα- Freisetzung aus Monozyten von S und COPD (Abb. 30 c).
1 µg/ml, sowie 10 µg/ml PGN führten zu einer signifikanten Induktion der TNFαFreisetzung aus Monozyten in allen vier Kohorten (Abb. 30 d, e).
Im Vergleich der Kohorten untereinander zeigten sich, die TNFα- Level nach
Exposition mit 10 ng/ml PGN in S im Vergleich zu NS und COPD signifikant erhöht
(Abb. 30 b).
Die TNFα- Level nach Exposition mit 100 ng/ml PGN waren in NS gegenüber COPD
signifikant erhöht (Abb. 30 c).
Die TNFα- Level nach Exposition mit 1 µg/ml PGN waren in NS gegenüber S, FS und
COPD signifikant erhöht (Abb. 30 d).
Die TNFα- Level nach Exposition mit 10 µg/ml PGN waren in NS gegenüber S und
COPD sowie in FS gegenüber COPD signifikant erhöht (Abb. 30 e).
115
a
b
c
d
e
Abb. 30: Fold Induktion TNFα-Expression aller vier Kohorten nach Stimulation mit PGN
Nach Stimulation und vierundzwanzigstündiger Inkubation mit PGN in den vier angegeben
Stimulanzienkonzentrationen erfolgt die Messung der TNFα-Expression im Überstand der
Monozytenkulturen. a: alle vier Stimulationskonzentrationen im Vergleich der Kohorten;
b: Induktion in RV bei Stimulation mit PGN 10 ng/ml; c: Induktion in RV bei Stimulation mit
PGN 100 ng/ml; d: Induktion in RV bei Stimulation mit PGN 1 µg/ml; e: Induktion in RV bei
Stimulation mit PGN 10 µg/ml; 1way ANOVA Bonferroni`s Multiple Comparison Test;
paired t-test; Darstellung der Mittelwerte + SEM; Signifikanz: p<0,05=*, p<0,01=**,
p<0,001=***
116
4.5.2 Stimulation mit LTA
Eine Stimulation mit 10 ng/ml LTA führte in keiner der untersuchten Kohorten zu
einer Induktion der TNFα- Freisetzung aus Monozyten (Daten nicht gezeigt).
Nach Stimulation mit LTA 100 ng/ml zeigte sich eine signifikante Induktion der TNFαFreisetzung aus Monozyten von NS und S (Daten gezeigt in Abb. 31 b).
1 µg/ml LTA führten zu einer signifikanten Induktion der TNFα- Freisetzung aus
Monozyten NS, S und COPD (Abb. 31 c).
10 µg/ml LTA führten zu einer signifikanten Induktion der TNFα- Freisetzung aus
Monozyten aller vier Kohorten (Abb. 31 d).
Unterschiede der Zytokinexpression von TNFα zwischen den einzelnen Kohorten
konnten nach Exposition mit LTA nicht gezeigt werden
a
b
117
c
d
Abb. 31: Konzentrations-Response-Modell von TNFα nach Monozytenstimulation mit LTA.
Die Messung erfolgt mittels ELISA im Überstand der Monozytenkulturen nach
vierundzwanzigstündiger Inkubation mit den entsprechenden LTA-Konzentrationen.
a: Vergleich der Expressionen aller vier Stimulationskonzentrationen sowie ohne Stimulation
zwischen den Kohorten; b: Vergleich Expression aller vier Kohorten ohne Stimulation (-) und
nach Stimulation(+) mit LTA 100ng/ml; c: Vergleich Expression aller vier Kohorten ohne
Stimulation (-) und nach Stimulation(+) mit LTA 1µg/ml; d: Vergleich Expression aller vier
Kohorten ohne Stimulation (-) und nach Stimulation(+) mit LTA 10µg/ml; 1way ANOVA
Bonferroni`s Multiple Comparison Test; paired t-test; Darstellung der Mittelwerte + SEM;
Signifikanz: p<0,05=*, p<0,01=**, p<0,001=***
Da sich in den absoluten Zahlen ein signifikanter Unterschied der Baselinelevel zeigte,
wurden auch die relativen Werte untersucht.
Hier sollte gezeigt werden, ob die signifikanten Unterschiede tatsächlich auf die
Induktion zurückzuführen sind, oder durch die unterschiedlichen Baselinelevel
verursacht wurden.
Fold-Induktion Werte
Nach Stimulation mit LTA 10 ng/ml zeigte sich eine signifikant erhöhte Induktion der
TNFα- Freisetzung aus Monozyten von NS, S und FS (Daten nicht gezeigt).
Bei einer Stimulanzienkonzentration von 100 ng/ml zeigten sich signifikante
Induktionen der TNFα-Expression in NS, S und COPD(Abb. 32 b).
Ab einer Stimulanzienkonzentration von 1 µg/ml zeigten sich signifikante Induktionen
der TNFα-Expression in allen vier Kohorten (Abb. 32 c, d).
118
Im Vergleich der Kohorten untereinander zeigten die TNFα-Level nach Exposition mit
10 ng/ml keinen signifikanten Unterschied zwichen den Kohorten (Daten nicht
gezeigt). Nach Stimulation mit 100 ng/ml LTA zeigten sich die TNFα-Level in NS im
Vergleich zu S und COPD signifikant erhöht (Abb. 32 b). Bei einer Exposition mit 1
µg/ml LTA waren die TNFα-Level in FS gegenüber COPD signifikant erhöht (Abb. 32c).
1 µg/ml LTA führte zu signifikant erhöhten TNFα-Level in NS gegenüber COPD
(Abb. 32 d).
a
b
d
e
Abb. 32: Fold Induktion TNFα-Expression aller vier Kohorten nach Stimulation mit LTA
Nach Stimulation und vierundzwanzigstündiger Inkubation mit LTA in den vier angegeben
Stimulanzienkonzentrationen erfolgt die Messung der TNFα-Expression im Überstand der
Monozytenkulturen. a: alle vier Stimulationskonzentrationen im Vergleich der Kohorten;
b: Induktion in RV bei Stimulation mit LTA 10 ng/ml; c: Induktion in RV bei Stimulation mit
LTA 100 ng/ml; d: Induktion in RV bei Stimulation mit LTA 1 µg/ml; e: Induktion in RV bei
Stimulation mit LTA 10 µg/ml; 1way ANOVA Bonferroni`s Multiple Comparison Test;
paired t-test; Darstellung der Mittelwerte + SEM; Signifikanz: p<0,05=*, p<0,01=**,
p<0,001=***
119
4.5.3 Stimulation mit amiA
Eine Stimulation mit 1 ng/ml amiA führte zu einer Induktion der TNFα- Freisetzung
aus Monozyten in NS und S (Daten gezeigt in Abb. 33 b)
Nach Stimulation mit amiA 10 ng/ml zeigte sich eine signifikante Induktion der TNFαFreisetzung aus Monozyten von NS und COPD (Abb. 33 c).
100 ng/ml amiA führten zu einer signifikanten Induktion der TNFα-Freisetzung aus
Monozyten aller vier Kohorten (Abb. 33 d).
Unterschiede der Zytokinexpression von TNFα zwischen den einzelnen Kohorten
konnte nach Exposition mit amiA nicht gezeigt werden.
a
b
120
c
d
Abb. 33: Konzentrations-Response-Modell von TNFα nach Monozytenstimulation mit amiA.
Die Messung erfolgt mittels ELISA im Überstand der Monozytenkulturen nach
vierundzwanzigstündiger Inkubation mit den entsprechenden amiA-Konzentrationen.
a: Vergleich der Expressionen aller vier Stimulationskonzentrationen sowie ohne Stimulation
zwischen den Kohorten; b: Vergleich Expression aller vier Kohorten ohne Stimulation (-) und
nach Stimulation(+) mit amiA 1ng/ml; c: Vergleich Expression aller vier Kohorten ohne
Stimulation (-) und nach Stimulation(+) mit amiA 10ng/ml; d: Vergleich Expression aller vier
Kohorten ohne Stimulation (-) und nach Stimulation(+) mit amiA 100ng/ml; 1way ANOVA
Bonferroni`s Multiple Comparison Test; paired t-test; Darstellung der Mittelwerte + SEM;
Signifikanz: p<0,05=*
Da sich in den absoluten Zahlen ein signifikanter Unterschied der Baselinelevel
gezeigt hatte, wurden auch die relativen Werte untersucht.
Hier sollte gezeigt werden, ob die signifikanten Unterschiede tatsächlich auf die
Induktion zurückzuführen sind, oder durch die unterschiedlichen Baselinelevel
verursacht wurden.
Fold-Induktion Werte
Nach Stimulation mit amiA 1 ng/ml zeigte sich eine signifikant erhöhte Induktion der
TNFα -Freisetzung aus Monozyten von NS und S (Abb. 34 b).
Bei einer Stimulanzienkonzentration von 10 ng/ml amiA zeigten sich signifikante
Induktionen der TNFα -Expression in NS, S und FS (Abb. 34 c).
100 ng/ml amiA führten zu einer signifikanten Induktion der TNFα -Freisetzung aus
Monozyten aller vier Kohorten (Abb. 34 d).
121
a
b
c
d
Abb. 34: Fold Induktion TNFα-Expression aller vier Kohorten nach Stimulation mit amiA
Nach Stimulation und vierundzwanzigstündiger Inkubation mit amiA in den vier angegeben
Stimulanzienkonzentrationen erfolgt die Messung der TNFα-Expression im Überstand der
Monozytenkulturen. a: alle vier Stimulationskonzentrationen im Vergleich der Kohorten;
b: Induktion in RV bei Stimulation mit amiA 1 ng/ml; c: Induktion in RV bei Stimulation mit
amiA 10 ng/ml; d: Induktion in RV bei Stimulation mit amiA 100ng/ml; 1way ANOVA
Bonferroni`s Multiple Comparison Test; paired t-test; Darstellung der Mittelwerte + SEM;
Signifikanz: p<0,05=*, p<0,01=**, p<0,001=***
122
4.5.4 Stimulation mit S. aureus-Totalextrakte
Eine Stimulation mit S. aureus MOI 1:1 führte zu einer Induktion der
TNFα-Freisetzung aus Monozyten in NS (Daten gezeigt in Abb. 35 b).
Ab einer Stimulation mit S. aureus MOI 10:1 zeigten sich signifikante Induktionen der
TNFα-Freisetzung aus Monozyten aller vier Kohorten (Abb. 35 c, d).
Unterschiede der Zytokinexpression von TNFα zwischen den einzelnen Kohorten
Die TNFα-Level nach Exposition mit S. aureus MOI 1:1 zeigten im Vergleich keine
signifikanten Unterschiede (Abb. 35 b).
Die TNFα-Level waren nach Exposition mit S. aureus MOI 10:1 in NS im Vergleich zu S
und COPD statistisch signifikant erhöht (Abb. 35 c).
Die TNFα-Level waren nach Exposition mit S. aureus MOI 100:1 in NS im Vergleich zu
COPD sowie FS im Vergleich zu S und COPD, statistisch signifikant erhöht (Abb. 35 d).
123
a
b
c
d
Abb. 35: Konzentrations-Response-Modell von TNFα nach Monozytenstimulation mit
S. aureus
Die Messung erfolgt mittels ELISA im Überstand der Monozytenkulturen nach
vierundzwanzigstündiger Inkubation mit den entsprechenden amiA-Konzentrationen.
a: Vergleich der Expressionen aller vier Stimulationskonzentrationen sowie ohne Stimulation
zwischen den Kohorten; b: Vergleich Expression aller vier Kohorten ohne Stimulation (-) und
nach Stimulation(+) mit S. aureus MOI 1:1; c: Vergleich Expression aller vier Kohorten ohne
Stimulation (-) und nach Stimulation(+) mit S. aureus MOI 10:1; d: Vergleich Expression aller
vier Kohorten ohne Stimulation (-) und nach Stimulation(+) mit S. aureus MOI 100:1; 1way
ANOVA Bonferroni`s Multiple Comparison Test; paired t-test; Darstellung der Mittelwerte +
SEM; Signifikanz: p<0,05=*, p<0,01=**, p<0,001=***
Da sich in den absoluten Zahlen ein signifikanter Unterschied der Baselinelevel
gezeigt hatte, wurden auch die relativen Werte untersucht.
124
Hier sollte gezeigt werden, ob die signifikanten Unterschiede tatsächlich auf die
Induktion zurückzuführen sind, oder durch die unterschiedlichen Baselinelevel
verursacht wurden.
Fold-Induktion Werte
Nach Stimulation mit S. aureus MOI 1:1 zeigte sich eine signifikant erhöhte Induktion
der TNFα-Freisetzung aus Monozyten in FS (Abb. 36 b).
Bei einer Stimulanzienkonzentration von S. aureus MOI 10:1 zeigten sich signifikante
Induktionen der TNFα-Expression in NS, S und COPD (Abb. 36 c).
S. aureus MOI 100:1 führte zu einer signifikanten Induktion der TNFα-Freisetzung aus
Monozyten von NS, S und FS (Abb. 36 d).
Im Vergleich der Kohorten untereinander zeigten die GM-CSF-Level bei einer
Exposition mit S. aureus MOI 1:1 keine signifikanten Unterschiede (Abb 36 b).
Die GM-CSF-Level zeigten bei einer Exposition mit S. aureus MOI 10:1 signifikant
erhöhte Induktionen in NS im Vergleich zu S und COPD (Abb. 36 c).
Die GM-CSF-Level zeigten bei einer Exposition mit S. aureus MOI 100:1 signifikant
erhöhte Induktionen in NS im Vergleich zu COPD sowie in FS im Vergleich zu S und
COPD (Abb. 36 d).
a
b
125
c
d
Abb. 36: Fold Induktion TNFα-Expression aller vier Kohorten nach Stimulation mit S. aureus
Nach Stimulation und vierundzwanzigstündiger Inkubation mit S.a. in den vier angegeben
Stimulanzienkonzentrationen erfolgt die Messung der TNFα-Expression im Überstand der
Monozytenkulturen. a: alle vier Stimulationskonzentrationen im Vergleich der Kohorten;
b: Induktion in RV bei Stimulation mit S.a. MOI 1:1; c: Induktion in RV bei Stimulation mit S.a.
MOI 10:1; d: Induktion in RV bei Stimulation mit S.a. MOI 100:1; 1way ANOVA Bonferroni`s
Multiple Comparison Test; paired t-test; Darstellung der Mittelwerte + SEM; Signifikanz:
p<0,05=*, p<0,01=**, p<0,001=***
4.5.5 Stimulation mit S.pneumoniae-Totalextrakte
Eine Stimulation mit S. pneumoniae MOI 1:1 sowie MOI 10:1 führte zu einer Induktion
der TNFα-Freisetzung aus Monozyten in allen vier Kohorten (Abb. 37 b, c).
Nach Stimulation mit S. pneumoniae MOI 100:1 zeigten sich signifikante Induktionen
der TNFα-Freisetzung aus Monozyten in NS, S und COPD (Abb.37 d).
Unterschiede der Zytokinexpression von TNFα zwischen den einzelnen Kohorten
Die TNFα-Level nach Exposition mit S. pneumoniae MOI 1:1 waren in S im Vergleich
zu FS signifikant erhöht (Abb. 37 b), während nach Exposition mit S. pneumoniae MOI
10:1 keine signifikante Erhöhung gezeigt werden konnte (Abb. 37 c).
Die TNFα-Level nach Exposition mit S. pneumoniae MOI 100:1 waren in NS im
Vergleich zu COPD statistisch signifikant erhöht (Abb. 37 d).
126
a
b
c
d
Abb. 37: Konzentrations-Response-Modell von TNFα nach Monozytenstimulation mit
S. pneumoniae
Die Messung erfolgt mittels ELISA im Überstand der Monozytenkulturen nach
vierundzwanzigstündiger Inkubation mit den entsprechenden S.p.-Konzentrationen.
a: Vergleich der Expressionen aller vier Stimulationskonzentrationen sowie ohne Stimulation
zwischen den Kohorten; b: Vergleich Expression aller vier Kohorten ohne Stimulation (-) und
nach Stimulation(+) mit S. pneumoniae MOI 1:1; c: Vergleich Expression aller vier Kohorten
ohne Stimulation (-) und nach Stimulation(+) mit S. pneumoniae MOI 10:1; d: Vergleich
Expression aller vier Kohorten ohne Stimulation (-) und nach Stimulation(+) mit S.p. MOI
100:1; 1way ANOVA Bonferroni`s Multiple Comparison Test; paired t-test; Darstellung der
Mittelwerte + SEM; Signifikanz: p<0,05=*, p<0,01=**, p<0,001=***
Da sich in den absoluten Zahlen ein signifikanter Unterschied der Baselinelevel
gezeigt hatte, wurden auch die relativen Werte untersucht.
127
Hier sollte gezeigt werden, ob die signifikanten Unterschiede tatsächlich auf die
Induktion zurückzuführen sind, oder durch die unterschiedlichen Baselinelevel
verursacht wurden.
Fold-Induktion Werte
Nach Stimulation mit S. pneumoniae MOI 1:1 zeigte sich eine signifikant erhöhte
Induktion der TNFα- Freisetzung aus Monozyten aller vier Kohorten (Abb. 38 b).
S. pneumoniae MOI 10:1 führte zu einer signifikanten Induktion der TNFαFreisetzung aus Monozyten von NS, S und COPD (Abb. 38 c).
S. pneumoniae MOI 100:1 führte zu einer signifikanten Induktion der TNFαFreisetzung aus Monozyten von NS und S (Abb. 38 d).
Im Vergleich der Kohorten untereinander zeigten die TNFα-Level bei einer Exposition
mit S. pneumoniae MOI 1:1 signifikant erniedrigte Werte in COPD im Vergleich zu NS
und S (Abb. 38 b).
Die GM-CSF-Level zeigten bei einer Exposition mit S. pneumoniae MOI 10:1 eine
signifikant erhöhte Induktion in NS im Vergleich zu COPD (Abb. 38 c).
Die GM-CSF-Level zeigten bei einer Exposition mit S. pneumoniae MOI 100:1
signifikant erhöhte Induktionen in NS, gegenüber S und COPD sowie in FS im Vergleich
zu COPD (Abb. 38 d).
a
b
128
b
d
Abb. 38: Fold Induktion TNFα-Expression aller vier Kohorten nach Stimulation mit
S. pneumoniae
Nach Stimulation und vierundzwanzigstündiger Inkubation mit S. pneumoniae in den vier
angegeben Stimulanzienkonzentrationen erfolgt die Messung der TNFα-Expression im
Überstand der Monozytenkulturen. a: alle vier Stimulations-konzentrationen im Vergleich
der Kohorten; b: Induktion in RV bei Stimulation mit S. pneumoniae MOI 1:1; c: Induktion in
RV bei Stimulation mit S.p. MOI 10:1; d: Induktion in RV bei Stimulation mit S.p. MOI 100:1;
1way ANOVA Bonferroni`s Multiple Comparison Test; paired t-test; Darstellung der
Mittelwerte + SEM; Signifikanz: p<0,05=*, p<0,01=**, p<0,001=***
Die bisher vorgestellten Daten zeigten, dass die Zytokinresponse von Monozyten auf
gram-positive Bakterien durch das Zigarettenrauchen und bei COPD-Erkrankten
reduziert ist und dass dies wahrscheinlich die Folge einer gestörten Response auf
PGN, LTA und Lipopeptide ist. Um die zugrundeliegende molekulare Pathologie zu
untersuchen, wurde als nächstes die Expression der in diesem Fall wichtigen, an der
Abwehrreaktion beteiligten Rezeptoren und Signalmoleküle (Tab.15, S.77)
untersucht. Hierzu wurden wie in Abschnitt Methoden beschrieben zunächst die
jeweilige mRNA aus den Monozyten isoliert, um später mittels spezifischer PCR die
Expression der Einzelnen Rezeptoren und Proteine zu quantifizieren.
Hierzu wurden, wie bereits zuvor beschrieben, die Monozyten derselben Population
verwendet.
129
4.6 Expression der Rezeptoren NOD2 und TLR2 sowie NOD1 und TLR1
Monozyten exprimieren sowohl TLR2 und NOD2, als auch TLR1 und NOD1. Die
Expression der verschiedenen Rezeptoren wurde weder durch PGN, LTA und amiA
noch durch die Totalextrakte von S. aureus und S. pneumoniae beeinflusst (Abb. 39
und Abb. 40).
a
b
Abb. 39: Relative Werte der mRNA-Level von TLR2 und NOD2 in Monozyten der
untersuchten Kohorten
Nach Isolation sowie Stimulation der Monozyten über 4 Std. der untersuchten Population
wurde die entsprechende mRNA isoliert und mittels RT-PCR im linearen Bereich und
densitometrischer Analyse der Signale quantitativ die jeweilige Expression bestimmt.
(Genauere Verfahrensangaben siehe Kapitel 3.2 Methoden, S.58 ff)
Es konnten keine statistisch signifikanten Unterschiede bezüglich der Expression zwischen
den einzelnen Stimulationen und der Kontrolle gezeigt werden.
a: Expression der mRNA von TLR2, angegeben als relative Werte aller Probanden im
Vergleich der hier verwendeten Stimulationen und der unstimulierten Kontrolle;
b: Expression der mRNA von NOD2, angegeben als relative Werte aller Probanden im
Vergleich der hier verwendeten Stimulationen und der unstimulierten Kontrolle;
1way ANOVA Bonferroni`s Multiple Comparison Test;
Darstellung der Mittelwerte + SEM; n = 46
130
a
b
Abb. 40: Relative Werte der mRNA-Level von TLR1 und NOD1 in Monozyten
Nach Isolation sowie Stimulation der Monozyten über 4 Std. der untersuchten Population
wurde die entsprechende mRNA isoliert und mittels RT-PCR im lineraren Bereich und
densitometrischer Analyse der Signale quantitativ die jeweilige Expression bestimmt.
(Genauere Verfahrensangaben siehe Kapitel 3.2 Methoden, S.58 ff)
Es konnten keine statistisch signifikanten Unterschiede bezüglich der Expression zwischen
den einzelnen Stimulationen und der Kontrolle gezeigt werden.
a: Expression der mRNA von TLR1, angegeben als relative Werte aller Probanden im Vergleich
der hier verwendeten Stimulationen und der unstimulierten Kontrolle; b: Expression der
mRNA von NOD1, angegeben als relative Werte aller Probanden im Vergleich der hier
verwendeten Stimulationen und der unstimulierten Kontrolle; 1way ANOVA Bonferroni`s
Multiple Comparison Test; Darstellung der Mittelwerte + SEM; n=46
Da keine signifikanten Unterschiede im Vergleich der Expressionen in Monozyten
ohne und nach entsprechender Stimulation gezeigt werden konnten, wurden im
Weiteren nur die unstimmulierten Kontrollen der jeweiligen Kohorte miteinander
verglichen.
131
4.6.1 TLR2
Die Baseline RNA-Level von TLR2 waren ohne statistisch signifikanten Unterschied
zwischen NS, S und COPD. In Monozyten von FS zeigten sich signifikant niedrigere
Baseline-RNA-Level von TRL2 im Vergleich zu S. (Abb. 41)
Abb. 41: Relative Werte der mRNA-Expression von TLR2 in Monozyten aller vier Kohorten.
Verglichen wurden hier die mRNA-Level als relative Werte der entsprechenden,
unstimulierten Kontrollen der verschiedenen Kohorten miteinander.
Nach Isolation sowie Stimulation der Monozyten über 4 Std. der untersuchten Population
wurde die entsprechende mRNA isoliert und mittels PCR quantitativ die jeweilige Expression
bestimmt. (Genauere Verfahrensangaben siehe Kapitel 3.2 Methoden, S.58 ff)
Zwischen FS und S konnten statistisch signifikante Unterschiede gezeigt werden.
NS: n= 10, S: n= 10, COPD: n= 14, FS: n= 12; 1way ANOVA Bonferroni`s Multiple Comparison
Test; Darstellung der Daten als Mittelwert + SEM; Signifikanz: p<0,05=*
132
4.6.2 NOD2
Die Baseline RNA-Level von NOD2 waren in Monozyten von S und COPD im Vergleich
zu NS signifikant reduziert (Abb. 42).
Abb. 42: Relative Werte der mRNA-Expression von NOD2 in Monozyten aller vier Kohorten
Verglichen wurden hier die mRNA-Level als relative Werte der entsprechenden,
unstimulierten Kontrollen der verschiedenen Kohorten miteinander.
Nach Isolation sowie Stimulation der Monozyten über 4 Std. der untersuchten Population
wurde die entsprechende mRNA isoliert und mittels PCR quantitativ die jeweilige
Expression bestimmt. (Genauere Verfahrensangaben siehe Kapitel 3.2 Methoden, S.58 ff)
In Monozyten von NS konnten signifikant höhere Werte im Vergleich zu S und COPD gezeigt
werden. NS: n= 10, S: n= 10, COPD: n= 14, FS: n= 12; 1way ANOVA Bonferroni`s Multiple
Comparison Test; Darstellung der Daten als Mittelwert + SEM; Signifikanz p< 0,01 = **
Das weist daraufhin, dass die verminderte Zytokin-Response auf PGN bei S und COPD
durch eine verminderte NOD2 Expression zu erklären sein könnte.
Da die verminderte Zytokinresponse von Monozyten von S und COPD auf LTA und
amiA wahrscheinlich nicht auf die reduzierte NOD2 Expression zurückzuführen sein
kann, wurde nach anderen molekularen Ursachen gesucht. Somit wurde auch die
Expression (RNA-Level) von TLR1 und NOD1 zwischen den Kohorten verglichen.
133
4.6.3 TLR1
Die Baseline RNA-Level von TLR1 zeigten im Vergleich zwischen NS und S einen
statistisch signifikanten Unterschied in Form einer deutlich erhöhten Expression von
TLR1 in Monozyten von S. Des Weiteren zeichnete sich auch hier im Vergleich der
Kohorten untereinander ein Trend ab. So zeigt sich hier die TLR1-Expression in
Monozyten von FS gegenüber NS sowie S gegenüber FS erhöht. Die PGRP1-Expression
in COPD liegt in etwa auf Höher der Expression in FS. (Abb. 43)
Abb. 43: Relative Werte der mRNA-Expression von TLR1 in Monozyten aller vier Kohorten
Verglichen wurden hier die mRNA-Level als relative Werte der entsprechenden,
unstimulierten Kontrollen der verschiedenen Kohorten miteinander.
Nach Isolation sowie Stimulation der Monozyten über 4 Std. der untersuchten Population
wurde die entsprechende mRNA isoliert und mittels PCR quantitativ die jeweilige Expression
bestimmt. (Genauere Verfahrensangaben siehe Abschnitt Methoden)
In Monozyten von S konnten signifikant höhere Werte im Vergleich zu NS gezeigt werden.
NS: n= 10, S: n= 10, COPD: n= 14, FS: n= 12; 1way ANOVA Bonferroni`s Multiple Comparison
Test; Darstellung der Daten als Mittelwert + SEM; Signifikanz: p<0,05=*
134
4.6.4 NOD1
Die Baseline RNA-Level von NOD1 waren ohne statistisch signifikanten Unterschied
zwischen den Kohorten. Jedoch zeichnete sich auch hier im Vergleich der Kohorten
untereinander eine deutliche Tendenz ab. Obwohl nicht signifikant, zeigt sich hier die
NOD1-Expression in Monozyten von FS gegenüber NS sowie S gegenüber FS erhöht.
Die PGRP1-Expression in COPD liegt in etwa auf Höher der Expression in FS. (Abb. 44)
Abb. 44: Relative Werte der mRNA-Expression von NOD1 in Monozyten aller vier Kohorten
Verglichen wurden hier die mRNA-Level als relative Werte der entsprechenden,
unstimulierten Kontrollen der verschiedenen Kohorten miteinander.
Nach Isolation sowie Stimulation der Monozyten über 4 Std. der untersuchten Population
wurde die entsprechende mRNA isoliert und mittels PCR quantitativ die jeweilige
Expression bestimmt. (Genauere Verfahrensangaben siehe Abschnitt Methoden)
Trotz der abgebildeten Tendenz konnten keine signifikanten Unterschiede gezeigt werden;
NS: n= 10, S: n= 10, COPD: n= 14, FS: n= 12; 1way ANOVA Bonferroni`s Multiple Comparison
Test; Darstellung der Daten als Mittelwert + SEM
Um noch genauere Rückschlüsse auf zelluläre Pathologien bedingt durch den Einfluss
von Zigarettenrauch schließen zu können, wurden auch einige wichtige, an der
Signaltransduktion
der
gemessenen
Rezeptoren
beteiligte,
Signalmoleküle
untersucht.
135
4.7 Unterschiede in der Expression von MyD88, MyD88s, IRAK-M und A20, sowie
des PGRP1 vergleichend zwischen den Kohorten
4.7.1 PGRP1
In dieser Studie konnte gezeigt werden, das PGRP1 auch in Monozyten exprimiert
wird. Die Expression von PGRP1 wurde weder durch PGN, LTA und amiA noch durch
die Extrakte von S. aureus und S. pneumoniae beeinflusst. Die Baseline RNA-Level von
PGRP1 zeigten keine statistisch signifikanten Unterschiede zwischen den Kohorten.
Es ist eine deutliche Tendenz zu verzeichnen. Obwohl nicht signifikant, zeigt sich hier
die PGRP1-Expression in Monozyten von FS gegenüber NS sowie S gegenüber FS
erhöht. Die PGRP1-Expression in COPD liegt in etwa auf Höher der Expression in FS.
(Abb. 45)
a
b
Abb. 45: Relative Werte der mRNA-Expression von PGRP1 in Monozyten aller vier Kohorten
Nach Isolation sowie Stimulation der Monozyten über 4 Std. der untersuchten Population
wurde die entsprechende mRNA isoliert und mittels PCR quantitativ die jeweilige
Expression bestimmt. (Genauere Verfahrensangaben siehe Kapitel 3.2 Methoden, S.58 ff)
Es konnten keine signifikanten Unterschiede gezeigt werden;
a: Vergleich der mRNA-Expression in Monozyten aller hier untersuchten Probanden (n= 46)
nach Stimulation mit den aufgeführten Stimulantien, sowie ohne Stimulation; b: PGRP1
mRNA-Level im Vergleich der Kontrollen der Einzelnen Kohorten (NS: n= 10, S: n= 10, COPD:
n= 14, FS: n= 12); statistischer Test: 1Way ANOVA, Bonferroni`s multiple comparison test;
Darstellung der Daten als Mittelwert + SEM
136
4.7.2 MyD88
Auch die Expression von MyD88 konnte in Monozyten gezeigt werden.
Die Expression von MyD88 wurde in allen vier Gruppen weder durch PGN, LTA und
amiA noch durch die Extrakte von S. aureus und S. pneumoniae beeinflusst (Abb. 46
a). Die Baseline RNA-Level von MyD88 zeigten im Vergleich zwischen NS und FS einen
statistisch signifikanten Unterschied in Form einer deutlich erhöhten Expression in
Monozyten von FS (Abb. 46 b).
Des Weiteren zeichnete sich auch hier im Vergleich der Kohorten untereinander eine
deutliche Tendenz ab. So zeigt sich hier die MyD88-Expression in Monozyten von FS,
gegenüber NS, sowie S gegenüber FS erhöht. Die PGRP1-Expression in COPD liegt in
etwa auf Höher der Expression in NS.
a
b
Abb. 46: Relative Werte der mRNA-Expression von MyD88 in Monozyten aller vier Kohorten
Nach Isolation sowie Stimulation der Monozyten über 4Std. der untersuchten Population
wurde die entsprechende mRNA isoliert und mittels PCR quantitativ die jeweilige Expression
bestimmt. (Genauere Verfahrensangaben siehe Abschnitt Methoden) a: Vergleich der mRNAExpression in Monozyten aller hier untersuchten Probanden (n= 46) nach Stimulation mit
den aufgeführten Stimulantien sowie ohne Stimulation; b: MyD88-mRNA-Level im Vergleich
der Kontrollen der Einzelnen Kohorten (NS: n= 10, S: n= 10, COPD: n= 14, FS: n= 12). Hier zeigt
sich ein signifikanter Unterschied zwischen der mRNA-Expression von NS und FS; 1way
ANOVA Bonferroni`s Multiple Comparison Test; Darstellung der Daten als Mittelwert + SEM;
Signifikanz p< 0,01 = **
137
4.7.3 MyD88s, IRAK-M und A20
Die Expression von MyD88s, IRAK-M und A20 konnte in Monozyten aller vier
Kohorten gezeigt werden. Sowohl die Expression von MyD88s und IRAK-M als auch
die von A20 wurde in allen vier Gruppen weder durch PGN, LTA und amiA noch durch
die Extrakte von S. aureus und S. pneumoniae beeinflusst (Abb. 47 a, Abb. 48 a und
Abb. 49 a). Die Baseline-RNA-Level von MyD88s, IRAK-M und A20 waren ohne
statistisch signifikanten Unterschied zwischen den Kohorten (Abb. 47 b, Abb. 48 b
und Abb. 49 b).
Jedoch zeichnete sich auch hier im Vergleich der Kohorten untereinander ein
deutlicher Trend ab. So zeigte sich die mRNA-Expression in FS gegenüber NS sowie S
gegenüber FS erhöht. Die mRNA-Expression in Monozyten von COPD lag in etwa auf
der Höhe von NS (Abb. 47 b, Abb. 48 b und Abb. 49 b).
a
b
Abb. 47: Relative Werte der mRNA-Expression von MyD88s in Monozyten.
Nach Isolation sowie Stimulation der Monozyten über 4 Std. der untersuchten Population
wurde die entsprechende mRNA isoliert und mittels PCR quantitativ die jeweilige
Expression bestimmt. (Genauere Verfahrensangaben siehe Kapitel 3.2 Methoden, S.58 ff)
Es konnten keine signifikanten Unterschiede gezeigt werden;
a: Vergleich der mRNA-Expression in Monozyten aller hier untersuchten Probanden (n= 46)
nach Stimulation mit den aufgeführten Stimulantien, sowie ohne Stimulation; b: MyD88smRNA-Level im Vergleich der Kontrollen der Einzelnen Kohorten (NS: n= 10, S: n= 10,
COPD: n= 14, FS: n= 12); 1way ANOVA Bonferroni`s Multiple Comparison Test;
Darstellung der Daten als Mittelwert + SEM
138
a
b
Abb. 48: Relative Werte der mRNA-Expression von IRAK-M in Monozyten.
Nach Isolation sowie Stimulation der Monozyten über 4 Std. der untersuchten Population
wurde die entsprechende mRNA isoliert und mittels PCR quantitativ die jeweilige
Expression bestimmt. (Genauere Verfahrensangaben siehe Kapitel 3.2 Methoden, S.58 ff)
Es konnten keine signifikanten Unterschiede gezeigt werden;
a: Vergleich der mRNA-Expression in Monozyten aller hier untersuchten Probanden (n= 46)
nach Stimulation mit den aufgeführten Stimulantien sowie ohne Stimulation; b: IRAK-MmRNA-Level im Vergleich der Kontrollen der Einzelnen Kohorten (NS: n= 10, S: n= 10,
COPD: n= 14, FS: n= 12); 1way ANOVA Bonferroni`s Multiple Comparison Test;
Darstellung der Daten als Mittelwert + SEM
a
b
Abb. 49: Relative Werte der mRNA-Expression von A20 in Monozyten
Nach Isolation sowie Stimulation der Monozyten über 4 Std. der untersuchten Population
wurde die entsprechende mRNA isoliert und mittels PCR quantitativ die jeweilige
Expression bestimmt. (Genauere Verfahrensangaben siehe Kapitel 3.2 Methoden, S.58 ff)
Es konnten keine signifikanten Unterschiede gezeigt werden; a: Vergleich der mRNAExpression in Monozyten aller hier untersuchten Probanden (n= 46) nach Stimulation mit den
aufgeführten Stimulantien sowie ohne Stimulation; b: MyD88-mRNA-Level im Vergleich der
Kontrollen der Einzelnen Kohorten (NS: n= 10, S: n= 10, COPD: n= 14, FS: n= 12); 1way ANOVA
Bonferroni`s Multiple Comparison Test; Darstellung der Daten als Mittelwert + SEM
139
4.8.
Korrelation der experimentellen Daten mit klinischen Parametern (FEV1 &
packyears (py))
Die Kohorte der ehemaligen Raucher wurde aus diesem Teil der Untersuchung
ausgeschlossen.
Die PGN- und SaE-induzierte Freisetzung von TNF ist bei R und COPD im Vergleich
zu NR signifikant reduziert und korreliert positiv zur FEV1 [% pred.] und negativ zu den
packyears; Die SpE-induziere Freisetzung von TNF korreliert hier ebenfalls negativ
zu den packyears (Tab. 18).
Die PGN-, LTA-, amiA-, SaE-und SpE-induzierte Freisetzung von GM-CSF ist bei R und
COPD im Vergleich zu NR reduziert und korreliert jeweils positiv zur FEV 1 [% pred.]
(LTA* p<0,05; amiA** & S.a. ** je p< 0,01) und negativ zu den packyears (jeweils***
p<0.001). Darüber hinaus ist die SaE-induzierte GM-CSF Freisetzung bei COPD im
Vergleich zu R reduziert (p<0.05). (Tab. 18)
Tab. 18: Freigesetzte Zytokinkonzentration [pg/ml] nach Stimulation vs. forciertes
exspiratorisches Volumen (FEV1 [%pred.]) und vs. Zigarettenkonsum (packyears).
Methode: Lineare Regression; NS= 10, S= 10, COPD= 14
Stimulus
PGN
(10 µg/ml)
Zytokin
GM-CSF
TNFα
GM-CSF
LTA
(10µg/ml)
TNFα
GM-CSF
amiA
(100 ng/ml)
TNFα
GM-CSF
S.a.
(MOI 10:1)
TNFα
GM-CSF
S.a.
(MOI 100:1)
TNFα
GM-CSF
S.p
(MOI 100:1)
TNFα
Parameter
FEV1 [% pred.]
packyears
FEV1 [% pred.]
packyears
FEV1 [% pred.]
packyears
FEV1 [% pred.]
packyears
FEV1 [% pred.]
packyears
FEV1 [% pred.]
packyears
FEV1 [% pred.]
packyears
FEV1 [% pred.]
packyears
FEV1 [% pred.]
packyears
FEV1 [% pred.]
packyears
FEV1 [% pred.]
packyears
FEV1 [% pred.]
packyears
Korrelationstyp
positiv
negativ
positiv
negativ
positiv
negativ
positive
negative
positiv
negativ
positiv
negativ
positiv
negativ
negativ
positiv
negativ
negativ
p-Wert
0,0061
< 0.0001
0,0467
0,0004
0,0226
0.0002
0,3090
0,0655
0,0013
< 0.0001
0,8236
0,4731
0,0004
< 0.0001
0,0079
0,0012
0,0014
<0,0001
0,2024
0,0399
0,0352
<0,0001
0,2401
0,0080
140
4.9.
Signifikante Reduktion der Monozytenzahl
Es konnte ein signifikanter Unterschied der im Differentialblutbild bestimmten
Monozytenzahl gezeigt werden (Abb. 50). (Werte: Kapitel 3.1.2, Tab. 10, S. 57)
Abb. 50: Monozytenzahl [in %] im peripher, venösem Vollblut unterteilt nach Kohorten
Manuelle Bestimmung der Zellzahlen in Prozent am Vollblut (genauere Beschreibung siehe
Kapitel 3.2 Methoden, S.58 ff; Erythrozyten und Thrombozyten wurden von der Zählung
ausgeschlossen) 1way ANOVA Bonferroni`s Multiple Comparison Test; n= 46 (Signifikanz:
p<0,01=**)
Die Monozyten im peripheren venösen Blut von COPD-Erkrankten zeigten im
Vergleich zu Nie-Rauchern eine signifikant erniedrigte Zellzahl.
Die anderen im Blutbildausstrich bestimmten Zellzahlen zeigten keine statistisch
signifikanten Unterschiede im Vergleich der Kohorten (Daten nicht gezeigt).
141
5. Diskussion
In der Pathogenese der COPD spielt nicht nur die lokale, sondern auch die
systemische Inflammation eine wichtige Rolle. In diesem Zusammenhang treten
besonders wichtige Punkte wie die zelluläre Immunabwehr in den Vordergrund.
Besonders in den letzten Jahren sind einige Studien zu diesem Thema veröffentlicht
worden. Insgesamt jedoch kratzen auch diese Studien erst an der Oberfläche.
Vor allem die Auswirkung von Zigarettenrauch und der COPD-Erkrankung auf die
zelluläre Immunabwehr sind bei weitem noch nicht ausreichend geklärt.
Wie bereits durch mehrere Studien bestätigt wurde, zeigten sich bei Rauchern und
COPD erkrankten Menschen besonders die Atemwege als eine gefährliche
Schwachstelle in der Infektabwehr und zeigten hier eine erhöhte Anfälligkeit für
bakterielle Infektionen. [204, 19]
Abgesehen von einigen gram-negativen Bakterien sind das gram-positive
S. pneumoniae und S. aureus, von denen beide LTA (ein PAMP, das kritisch für die
Aktivierung von Immunzellen und die Infektionsabwehr ist ) synthetisieren, oft an
Exazerbationen der COPD beteiligt [168, 189, 242].
So induzieren Staphylokokken die Bildung von TNF-α [274] und des CXC-Chemokins
IL-8 [256] in humanen Monozyten. Dies war unter anderem ein Grund die hier
untersuchten Bakterien und deren Bestandteile sowie die gemessenen Zytokine
auszuwählen und zu untersuchen.
Das Wissen über die zugrunde liegenden immunologischen Defekte kann helfen neue
Therapien zur Reduktion der Exazerbationsraten zu entwickeln. Toll-like Rezeptoren
(TLR) sind geeignete therapeutische Ziele in Infektions- und Entzündungskrankheiten.
Sie sind an der angeborenen Immunabwehr beteiligt und erkennen Krankheitserreger wie gram-positive Bakterien und deren Bestandteile. [207]
Raucher mit und ohne chronisch-obstruktiver Lungenerkrankung (COPD) haben eine
erhöhte Anfälligkeit für bakterielle Infektionen, die für Exazerbationen bei COPD
entscheidend ist.
142
Die Mechanismen der erhöhten Anfälligkeit für bakterielle Infektionen sind noch
gering erforscht, allerdings scheint die mangelhafte Funktion des angeborenen
Immunsystems von Bedeutung zu sein. [223].
Daher sollte erforscht werden, ob Zigarettenrauch bei gesunden Rauchern und
Rauchern mit COPD die direkte Ansprechbarkeit von Monozyten auf gram-positive
PAMPs verändern könnte.
Obwohl es bisher mehrere Studien gibt, die sich z.B. mit Alveolarmakrophagen oder
der Zytokinkonzentration in Sputum, BAL und Blut beschäftigen und zirkulierende
Monozyten einen wichtigen und interessanten Bestandteil der Infektabwehr
darstellen, wurden Sie bisher vernachlässigt.
In der hier, von mir durchgeführten Studie wurden die Monozyten von NS, S, FS und
COPD
aus
peripherem
venösem
Vollblut
isoliert
und
die
jeweilige
Zytokinausschüttung vor und nach Stimulation untersucht und verglichen.
Um die Aussagekraft der durch ELISA gewonnenen Daten zu erhöhen und mögliche
Ursachen der signifikanten Unterschiede aufdecken zu können, wurden wie zuvor
beschrieben ebenfalls die entsprechenden Rezeptoren und Signalwege untersucht
und zwischen den Kohorten verglichen.
Zunächst erfolgte die Isolation von Monozyten aus peripher, venösem Blut von
Nichtrauchern. Hierzu wurde ein Isolationsverfahren durch Dichtezentrifugation und
eine
Negativisolation
mittels
Dynabeads
durchgeführt
um
eine
reine
Monozytenkultur zu erhalten.
Wie bereits in vielen Studien vorher dargestellt, zeigt sich die Zellisolation mittels
magnetischer Beads als sichere Methode zur Herstellung möglichst reiner
Zellkulturen. Im Durchschnitt konnte eine Reinheit der in den einzelnen Studien
erzeugten Zellkulturen von ca. 98 % dargestellt werden [157, 160].
Die Vitalität der gewonnen Zellen wurde nicht negativ beeinflusst. Somit war
sichergestellt,
dass
Unterschiede
in
der
Zytokinproduktion
nicht
auf
Vitalitätsunterschieden der Zellen beruhten. Die magnetische Zellsortierung stellte
sich als effektive Methode zur Gewinnung ausreichend großer Mengen vitaler, sehr
reiner Monozytenkulturen aus PBMC dar.
143
Die so isolierten Monozyten wurden kultiviert. Um ausschließen zu können, dass
unterschiedliche Zytokinexpressionen durch das Isolationsverfahren die Messungen
verfälschen, wurde vor Stimulation immer ein Wechsel des Mediums durchgeführt
und so die bisher entstandenen Zytokine eliminiert. Des Weiteren führte der Wechsel
von 10% FCS-Medium auf ein Medium mit 1% FCS dazu, dass die Zellen so
„ausgehungert“ wurden. Wenn es darum geht die Effekte von Bakterien und deren
Bestandteile auf Zellen zu untersuchen, ist der Wechsel auf ein Hungermedium eine
übliche Methode, um eine unerwünschte Stimulation zu vermeiden. [47] Somit
wurde eine größere Response auf einen Stimulus erzielt, da das System nicht durch
den hohen FCS-Gehalt gesättigt war. In einer Studie von Aldonyte und Kollegen [8]
wurde sogar (bei einer kürzeren Inkubationszeit) komplett auf die Verwendung eines
Serums verzichtet. Auch hier konnte gezeigt werden, dass dies die Zellen nicht
negativ beeinflusst bzw. getötet hat.
5.1 Reduzierte Monozytenzahl im Vollblut von COPD-Erkrankten im Vergleich zu
NieRauchern
Durch Aktivierung des Immunsystems und Ausschütten der entsprechenden Zytokine
erfolgt eine chemotaktische Anlockung der an der Infektabwehr beteiligten Zellen,
wie z.B. in diesem Fall der Monozyten. Diese dienen der primären Infektabwehr und
differenzieren nach Migration entsprechend des Ortes der Reizung, wie z.B. in diesem
Fall zu Alveolarmakrophagen (AM). [23, 37]
Dies wurde bereits in zahlreichen verschiedenen Studien gezeigt. Die Migration als
Reaktion auf die Reizung führt dazu, dass sich die zirkulierenden, peripheren
Monozyten in ihrer Anzahl reduzieren. Dies konnte auch hier in dieser Untersuchung
statistisch signifikant dargestellt werden.
144
5.2 Konzentrations-Response-Experimente
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die zuvor aus Vollblut isolierten
Monozyten auf die Stimulation mit gram-positiven PAMPs sowie den Totalextrakten
von S.aureus und S. pneumoniae mit der Freisetzung von IL-8, TNFα und GM-CSF,
alles Zytokine, die entscheidend sowohl für die Infektabwehr als auch für die
chronische Atemwegs- und systemischen Inflammation in der COPD sind, reagierten
[50].
Diese erste Ausschüttung von Effektorzytokinen durch Monozyten ist wichtig für die
frühe Bekämpfung von akuten bakteriellen Infektionen [44].
So konnte in einer Studie von Pons und Kollegen [222] gezeigt werden, dass (aus
venösem Blut, isolierte) zirkulierende humane Monozyten nach Stimulation mit
1µg/ml Peptidoglykan (PGN) vermehrt TLR2 exprimierten und auch die Expression
von TNFα anstieg.
In einer Studie von Arakaki und Kollegen [15] konnte gezeigt werden, dass
mononukleäre Zellen (PBMCs) auf die Stimulation mit Lipoteichonsäure (LTA) mit der
vermehrten Expression von IL-8 und TNFα reagierten. Hierzu wurde eine
Konzentration des LTA von 100ng/ml, 1µg/ml und 10µg/ml verwendet.
Vergleichbares konnte in einer Studie von Hasannejad und Kollegen [109] bezüglich
der Stimulation von PBMCs mit amiA/Pam3Cys (100ng/ml, 1µg/ml, 10µg/ml) gezeigt
werden. Auch hier stieg nach Stimulation die Zytokinexpression von TNFα.
Daten zu einer Stimulation einer reinen Monozytenkultur mit LTA oder amiA wurden
bisher nicht gezeigt. Allerdings war auf Grund der in den vorherigen Studien
gezeigten Daten eine Response auf die gewählten TLR2-Agonisten zu erwarten. Bei
der Höhe der verwendeten Stimulanzienkonzentrationen habe ich mich an den
bereits in anderen Studien verwendeten Konzentrationen orientiert.
Die hier gemessenen Zytokine IL-8, GM-CSF und TNFα wurden von Monozyten
konzentrationsabhängig exprimiert. Dies konnte bereits in vorherigen Studien gezeigt
werden [283, 195, 104].
145
Obwohl allseits bekannt ist, dass Monozyten MMPs produzieren und auch in einigen
Studien gezeigt werden konnte, dass MMP-9 in Monozyten und Makrophagen von
COPD-Erkrankten erhöht waren [8, 78, 233], konnte in dieser Arbeit weder eine
konzentrationsabhängige Response noch Expressions-unterschiede zwischen den
Kohorten gezeigt werden. Daher wurde die Expression von MMP-9 in Monozyten hier
nicht weiter untersucht.
Ein Grund dafür könnten die unterschiedlichen Studienmodelle sein. In den
bisherigen Studien erfolgte eine Stimulation der untersuchten Zellen meist mittels
LPS gram-negativer Bakterien [78]. Dadurch wurde auch ein anderer Rezeptor
aktiviert, was zu unterschiedlichen Expressionsleveln führen kann. Des Weiteren
erfolgten die meisten Untersuchungen an Makrophagen, die nach ihrer
Differenzierung auch unterschiedliche Funktionen als die hier untersuchten
Monozyten einnehmen.
Diese Unterschiede konnten auch in einer Studie von Westra und Kollegen [292]
gezeigt werden. Hier wurden Expressionsunterschiede von MMP-9 zwischen
Monozyten und Makrophagen aufgezeigt. So führte die Stimulation mit LPS in
Monozyten nur zu einer geringen Expression von MMP-9, während Makrophagen
hier ein Vielfaches an MMP-9 exprimierten.
5.3 Die Baselinelevel der Zytokinexpression in Monozyten im Vergleich zwischen
den Kohorten
Nachdem gezeigt werden konnte, dass die Monozyten von Nichtrauchern sowohl
ohne als auch nach Stimulation (konzentrationsabhängig) die von mir gemessenen
Zytokine IL-8, GM-CSF und TNFα exprimieren,
wurden nach entsprechender
Fallzahlbestimmung Proben aller vier Kohorten gewonnen und analysiert.
Sowohl für GM-CSF und TNFα, als auch für IL-8 konnte kein signifikanter Unterschied
zwischen den Kohorten von NS, S und COPD festgestellt werden. Während im
Überstand der Monozytenkulturen von FS in der Baseline-Expression von IL-8
ebenfalls kein signifikanter Unterschied gezeigt werden konnte, zeigten sich für TNFα
und GM-CSF signifikante Unterschiede.
146
Die Baselinelevel von GM-CSF in Monozyten von FS im Vergleich zu allen drei anderen
Kohorten zeigten sich signifikant erniedrigt. Die Baselinelevel von TNFα zeigten im
Überstand der Monozytenkulturen von FS statistisch signifikant niedrigere Werte im
Vergleich zu S und COPD.
Auch in der Arbeit von Metcalfe und Kollegen [187] konnte gezeigt werden, dass
Zigarettenrauch keinen Einfluss auf die Baseline-Expression von Zytokinen wie TNFα
und IL-8 hat. Untersucht wurde hier die Response in AM von NS und COPD.
Diese Ergebnisse sind somit vergleichbar mit den von mir gezeigten Daten.
Im Gegensatz dazu zeigte zum Beispiel die Studie von Ruta Aldonyte [8] und Kollegen,
dass die Baselinelevel von IL-8 in Monozyten von stabilen COPD-Erkrankten im
Vergleich zu den Baselinelevel von gesunden Probanden niedriger waren.
Andere Studien wie z.B. die von Kang-Yun Lee und Kollegen [138] wiederum zeigten
eine Baseline-level-erhöhung von IL-8 in Monozyten bzw. PBMCs von COPD im
Vergleich zu S und NS.
Allerdings wurden die Probanden von mir nicht nach Schwere der COPD in Gruppen
unterteilt, wie es der Fall in der Studie von Kang-Yun Lee und Kollegen war.
So wurden in meiner Studie nur Probanden eingeschlossen, die sich im Stadium II-III
der Erkrankung nach GOLD befanden.
Wie von Kang-Yun Lee und Kollegen [138] beschrieben, traten auch erst in der
Kohorte der COPD-Erkrankten in Stadium III+IV nach GOLD signifikant erhöhte Werte
auf.
Erhöhte Baselinelevel der Zytokinexpression in Monozyten von COPD im Vergleich zu
NS und S treten möglicherweise erst ab einer bestimmten Schwere der Erkrankung
auf. Da keine Probanden von mir in die Untersuchung mit einbezogen wurden, die
schwerer als GOLD III erkrankt waren, könnte dies ein Grund sein, dass die
Baselinelevel in meiner Arbeit keine signifikanten Erhöhungen aufwiesen.
Dies wird auch durch die weiteren Ergebnisse der Studie von Kang-Yun Lee und
Kollegen [138] gestützt. Hier wird festgestellt, dass in der Kohorte der COPDProbanden mit einem Schweregrad nach GOLD von I-II keine signifikant erhöhten
Baselinelevel im Vergleich zu Nichtrauchern gefunden wurden.
147
Wenn man die gefundenen Ergebnisse meiner Studie betrachtet wäre eine mögliche
Erklärung bezüglich der Baseline-Expressionen, dass die von mir in dieser Studie
eingeschlossenen COPD-Probanden alle noch aktive Raucher waren. Wie in vielen
Untersuchungen beschrieben, ist Zigarettenrauch ein wirksames Stimulanz, das einen
konstanten Reiz ausübt und zur erhöhten Zytokinexpression führt. [75, 226, 227, 141,
193]
Es wäre vorstellbar, dass dieser konstante Reiz eine Art Toleranzentwicklung bewirkt.
Der Körper stuft diesen konstanten Reizzustand als normal ein. Dies würde erklären,
dass die Baselinelevel der konstanten Raucher auf Höhe der gesunden NR liegt.
Wenn nun der konstante Reiz durch Zigarettenrauch-Karenz wegfällt, sinken die
Baselinelevel der ehemaligen Raucher unter das Normalniveau.
Obwohl diese Theorie bisher so noch nicht in anderen Studien gezeigt wurde, ist seit
Jahren das Phänomen der LPS-Toleranz bekannt.
Die prophylaktische Gabe von klinisch ungefährlichen Dosen Endotoxin erzeugte in
einer Vielzahl von Studien einen Schutz gegenüber der entzündungsbedingten
Schädigung bei einer erneuten LPS-Exposition. Dieses Phänomen wird als LPS- oder
Endotoxin-Toleranz bezeichnet und wird seit Jahrzehnten intensiv untersucht. [161]
Diese unspezifische Toleranz resultiert unter anderem aus einer verminderten
Präsentation von TLR4 auf der Zelloberfläche von Immunzellen und verschwindet
nach einigen Tagen [203]. Die reduzierte Ausschüttung von IL-6 und anderen
Mediatoren im Rahmen der LPS-Toleranz ist eine gut belegte Tatsache und wurde
beim Menschen sowie bei zahlreichen anderen Spezies in vivo und in vitro
nachgewiesen. [161]
Analog zur LPS-Toleranz führt die repetitive Stimulation verschiedener TLRs mit ihrem
eigenen Liganden ebenfalls zu einer Abschwächung der immunologischen Antwort.
Diese Toleranzentwicklung konnte neben TLR4 für die Liganden von TLR2 (plus TLR1
oder TLR6), TLR3, TLR5, TLR7 und TLR9 in vivo und in vitro nachgewiesen werden
[237, 238].
Vorstellbar wären natürlich auch andere Erklärungen z.B. bezüglich der hier nicht
miteinbezogenen aktuellen Medikation, wie in der Studie von Ruta Aldonyte und
Kollegen [8] vermutet.
148
Frühere Studien haben gezeigt, dass die Konzentration von GM-CSF in BAL-Flüssigkeit
[21] und Sputum [190, 276] bei stabiler COPD und während einer Exazerbation erhöht
ist.
In dieser Untersuchung zeigte die Expression von GM-CSF in Monozyten von NS, S
und COPD bezüglich der Baselinelevel keinen signifikanten Unterschied. Allerdings
zeigte sich die Baseline von GM-CSF in Monozyten von ehemaligen Rauchern im
Vergleich zu den anderen Kohorten signifikant erniedrigt. Wie bereits zuvor
beschrieben könnte dies ebenfalls durch eine Art Gewöhnung/ Toleranzentwicklung
bezüglich der Zigarettenrauchexposition verursacht worden sein.
TNFα ist ein wichtiger Bestandteil der akuten Inflammation durch Zigarettenrauch
und führt unter anderem zu gesteigerter Rekrutierung von Neutrophilen und
Makrophagen in die Lunge [50].
Kuschner und Mitarbeiter [158] berichteten, dass Raucher höhere TNFα-Level in der
BAL zeigten als Nichtraucher; Keatings und Mitarbeiter [145] hingegen untersuchten
induziertes Sputum und beobachteten erhöhte TNFα-Level nur bei Rauchern mit
COPD und nicht in asymptomatischen Rauchern. Takabatake und Mitarbeiter [261]
stellten fest, dass COPD-Probanden, die chronisch hypoxisch waren, erhöhte TNFαSpiegel hatten; Die gleiche Gruppe [262] zeigte, dass Raucher mit COPD höhere
Serum TNFα-Level hatten als gesunde Nie-Raucher der Kontrollgruppe, jedoch lag der
Unterschied nur bei etwa 20 %.
Da es bisher kaum vergleichbare Studien gibt, die sich mit reinen, humanen
Monozytenkulturen befassen, ist ein direkter Vergleich der hier gewonnenen Daten
nicht ganz einfach. In einer Studie von Aldonyte und Kollegen [8] wurde unter
anderem die Expression von IL-8 und MMP-9 in Monozyten zwischen COPDErkrankten und einer gesunden Kontrollgruppe untersucht. Da in dieser Studie
jedoch LPS (Bestandteil gram-negativer Bakterien) zur Stimulation verwendet wurde,
sind auf Grund eines, durch einen anderen TLR bedingten, leicht abweichenden
Signalwegs, die Ergebnisse nur bedingt vergleichbar.
Die meisten Studien, die sich mit den hier untersuchten Zytokinen beschäftigen,
haben diese jedoch, wie zuvor bereits beschrieben, entweder bezogen auf kleine
Zellgruppen (z.B.: PBMCs) oder in Flüssigkeiten wie Sputum oder BALF gemessen.
In fast allen Fällen war es jedoch eine Gesamtexpression der verschiedenen Zellen.
149
Allerdings haben Studien gezeigt, dass Makrophagen (deren Vorläuferzellen,
Monozyten sind) eine entscheidende Rolle in der Pathophysiologie der COPD spielen
[248]. Es gibt einen deutlichen Anstieg (5- bis 10-fach) in der Zahl der Makrophagen
in den Atemwegen, im Lungenparenchym, in der Bronchio-alveolaere LavageFlüssigkeit (BALF) und im Sputum von Probanden mit COPD [220, 145]. Eine
morphometrische Analyse der Makrophagenzahlen im Parenchym von Probanden
mit Emphysem zeigte eine 25-fache Erhöhung in der Anzahl von Makrophagen im
Gewebe und Alveolarraum im Vergleich zu Rauchern mit normaler Lungenfunktion
[230]. Es besteht eine positive Korrelation zwischen Makrophagen-Zahlen in den
Atemwegen und der Schwere der COPD [61].
Darüber hinaus konnte eine pathologische Rolle für Makrophagen nachgewiesen
werden. Makrophagen werden durch Zigarettenrauch und andere Reizstoffe aktiviert
und setzen Entzündungsmediatoren frei, die denen der Monozyten weitestgehend
entsprechen
[29].
In
einer
Studie
unseres
Arbeitskreises
wurden
Alveolarmakrophagen aus BAL-Flüssigkeit gewonnen und kultiviert. In dieser Arbeit
von Knobloch und Kollegen [149] konnte bereits bezüglich der Zytokinexpression in
Alveolarmakrophagen gezeigt werden, dass kein signifikanter Unterschied in der
Baselineexpression von IL-8 und GM-CSF sowie weiteren Zytokinen zwischen NS, S
und COPD besteht. Alveolarmakrophagen entwickeln sich aus den in das Gewebe
eingewanderten Monozyten und stellen somit eine vergleichbare Zellart dar. Des
Weiteren sind auch die Kriterien der Studienpopulation zwischen der von Knobloch
und Kollegen [149] und der hier vorliegenden Arbeit vergleichbar. So unterstützt dies
die in dieser Arbeit gezeigten Ergebnisse. Vergleichbare Ergebnisse wurden bezüglich
der GM-CSF Baselineexpression auch in einer Studie von Culpitt und Kollegen [57]
gezeigt. Hier fanden sich ähnliche Werte der Baselineexpression in Makrophagen,
gewonnen aus einer bronchoalveolären Lavage (BAL), zwischen R und COPD.
Im Kontrast dazu wurde in der selben Studie von Culpitt und Kollegen [57] ein
signifikanter Unterschied in der Baselineexpression von IL-8 im Vergleich zwischen R
und COPD gezeigt werden. So zeigte sich in Makrophagen von COPD eine fünffach
erhöhte Zytokinexpression im Vergleich zu Makrophagen von S.
150
Sowohl die Unterschiede in der Zellart als auch die in der Zellisolation können
natürlich ein Grund für die hier gezeigten Unterschiede bezüglich der ZytokinExpression sein. So wurden hier die Makrophagen mittels Filterung der BAL sowie
Trennung der Zellen mittels Adhäsionsverfahre gewonnen. Unterschiedliche
Verfahren der Isolation bewirken eine unterschiedliche Reizung während dieses
Vorgangs sowie unterschiedliche Reinheit der Zellkultur. Des Weiteren wurde hier
auf ein “Aushungern“ der Zellen mittels Wechsel auf ein Medium mit 1% FCS
verzichtet, was sich ebenfalls auf die Zytokinexpression auswirken kann.
Eine Studie von Morimoto und Kollegen wiederum zeigte, dass es keinen Unterschied
in der Baseline-Expression von TNFα in AM von Ratten zwischen zigarettenrauchexponierten und nichtexponierten Ratten im Vergleich gab [194].
5.4 Nach Stimulation der Monozyten mit gram-positiven Bakterien und deren
Bestandteilen zeigten sich erhöhte Zytokinexpressionen in allen vier
Kohorten
Nach Stimulation der Monozyten der jeweiligen Kohorten konnte ein Anstieg der
IL-8-Expression in allen Kohorten verzeichnet werden. Häufig war diese Erhöhung
signifikant in allen Kohorten im Vergleich zu den jeweiligen nicht-stimulierten
Kontrollen. Obwohl die Expression von IL-8 in Monozyten von S nach Stimulation
leicht höhere Werte als die der anderen Kohorten zeigten, konnten keine
signifikanten Unterschiede der Expression zwischen den Kohorten verzeichnet
werden. Auch im Vergleich der relativen Werte konnte zwischen NS, S und COPD kein
signifikanter Unterschied gezeigt werden, während FS im Vergleich diesbezüglich
signifikante Werte zeigten.
Die signifikant erhöhten Werte von FS in Bezug auf die Induktion der Expression von
IL-8 sind somit auf die zuvor erwähnten niedrigeren Baselinelevel zurückzuführen, da
die Baseline-Expression jeweils von der Gesamt-Expression subtrahiert wurde.
So konnte die reine Induktion ohne die konstant bestehende Grund-Expression
dargestellt werden. In der Studie von Knobloch und Kollegen [149] konnte gezeigt
werden, dass AM nach Stimulation mit LPS mit der Ausschüttung von IL-8 reagieren.
151
Hier konnte sogar ein signifikanter Unterschied zwischen den Kohorten gezeigt
werden.
Während in dieser Arbeit nur ein geringer Anstieg der IL-8-Expression in Monozyten
von S nach Stimulation gezeigt werden konnte, zeigte sich in der Studie von Knobloch
und Kollegen [149] eine signifikante Erhöhung in AM von S gegenüber NS und in AM
von COPD wiederum gegenüber S. Der Unterschied in den Ergebnissen zwischen
beiden Studien kann zum Einen an der Weiterentwicklung der untersuchten Zellarten
(Monozyten sind Vorläuferzellen der Alveolarmakrophagen) und damit an den
veränderten Aufgaben der Zellen liegen, zum Anderen liegt bei der Arbeit von
Knobloch und Kollegen [149] eine Stimulation durch Bestandteile gram-negativer
Bakterien vor und daher auch der Signalweg über einen anderen Toll-like-Rezeptor
(TLR4 statt TLR2). Somit sind die durch meine Arbeit gezeigten Daten eine gute
Ergänzung zu den bereits in vorherigen Studien gefundenen Erkenntnissen. In einer
kürzlich veröffentlichten Arbeit von Metcalfe und Kollegen [187] wurde gezeigt, dass
Zigarettenrauchextrakt keine Wirkung auf die IL-8-Expression in AM hat. Nach
Stimulation mit TLR-Agonisten (LPS und anderen Bakterienbestandteilen) zeigte sich
kein signifikanter Unterschied zwischen gesunden Nichtrauchern und Probanden mit
COPD. Diese Daten sind vergleichbar mit den in meiner Arbeit gezeigten Ergebnissen,
obwohl berücksichtigt werden muss, dass andere Stimulantien verwendet und die
Wirkung auf AM, eine Weiterentwicklung der Monozyten, untersucht wurde.
In der Studie von Zhang und Kollegen [307] sowie in anderen Arbeiten wurde gezeigt,
dass IL-8 hier ebenfalls in der BAL-Flüssigkeit bei Rauchern und COPD-Probanden
erhöht ist. Die deutlich höhere IL-8-Expression war jedoch auch hier größtenteils auf
die Expression in AM und Neutrophilen zurückzuführen [145, 299]. Es besteht eine
Korrelation zwischen IL-8-Konzentration und der Bakterienkolonie-anzahl im
Sputum.
Diese Tatsache lässt vermuten, dass bakterielle Infektionen zumindest teilweise
über die Induktion der IL-8-Freisetzung in den Atemwegen neutrophile
Inflammationen induzieren [112, 216].
152
Somit ist zu sagen, dass die von mir gezeigten Daten nicht den bisher gefundenen
Erkenntnissen widersprechen, sondern einen Beitrag zum weitern Verständnis der zu
Grunde liegenden Mechanismen leisten.
Bezüglich der GM-CSF-Expression konnten signifikant erniedrigte Werte in
Monozyten von FS, S und COPD gegenüber NS nach Stimulation mit allen hier
verwendeten Stimulantien gezeigt werden.
Dies entspricht den in der Studie von Knobloch und Kollegen [149] gefundenen Daten
bezüglich der GM-CSF-Expression in AM nach Stimulation mit LPS. Auch hier war die
Expression von GM-CSF bei S und COPD gegenüber NS deutlich erniedrigt.
So konnte in dieser Studie gezeigt werden, dass Zigarettenrauch nicht nur die LPS
induzierte Freisetzung von GM-CSF in AM beeinträchtigt, sondern auch deren
Vorläuferzellen, die Monozyten, betroffen sind. Es konnte hier eindeutig die
Beeinträchtigung der monozytären GM-CSF-Expression nach Stimulation mit grampositiven Erregern durch Zigarettenrauch gezeigt werden.
In der Untersuchung der Fold-Induktion Werte konnten diese signifikant erniedrigten
Expressionen von GM-CSF in Monozyten von S und COPD besonders nach der
Stimulation mit PGN und LTA gezeigt werden. Dies weist vor allem auf Pathologien
im Bereich des NOD2 bzw. TLR2 hin. Die Expression von GM-CSF nach Stimulation mit
PGN, LTA und S. aureus zeigte auch, bedingt durch die niedrige Baseline-Expression,
eine signifikant höhere Induktion in Monozyten von FS gegenüber den drei anderen
Kohorten. Durch diese Daten konnte gezeigt werden, dass durch den Zigarettenrauch
entstandene Pathologien nach Beendigung der Exposition zumindest teilweise
reversibel sind.
Im Vergleich zu den gewonnenen Daten in der Expression von GM-CSF zeigten sich
für die Expression von TNFα im Überstand der kultivierten Monozyten nur nach
Stimulation mit PGN, S. a. und S. p. statistisch signifikant erniedrigte Werte (sowohl
absolut, als auch relativ) für S und COPD im Vergleich zu NS. Dies weist wie zuvor
schon erwähnt auf eine Pathologie in der Signalverarbeitung über NOD2 hin.
McCrea und Kollegen [180] zeigten in einer Studie, dass die TNFα-Level in der BALFlüssigkeit von Rauchern nach Stimulation mit LPS signifikant niedriger waren als in
der BAL-Flüssigkeit von NR.
153
In einer Studie von Yamaguchi und Kollegen mit vergleichbarem Versuchsaufbau,
zeigten sich erniedrigte Werte bezüglich der TNFα-Expression in AM von S im
Vergleich zu NS nach Stimulation mit LPS.
Dies entspricht den von mir gefundenen Ergebnissen und ist vergleichbar mit den
Studienergebnissen bezüglich der GM-CSF-Expression, beschrieben in der Arbeit von
Knobloch und Kollegen [149].
Die Werte von TNFα in Monozyten von FS lagen entweder in etwa auf derselben Höhe
oder höher wie die von NS. Nach Stimulation mit S.aureus zeigten sich in Monozyten
von FS signifikant erhöhte Werte im Vergleich zu S und COPD.
Die Ergebnisse bezüglich der TNFα-Expression zeigten deutlich verminderte Werte
nach Zigarettenrauchexposition. Allerdings weisen sie ebenfalls darauf hin, dass die
zugrundeliegende Pathologie, die zur Reduktion der TNFα-Expression führte, nach
Zigarettenrauchkarenz reversibel zu sein scheint.
Auch in der Arbeit von Metcalfe und Kollegen [187] konnte gezeigt werden, dass
Zigarettenrauch einen signifikanten Einfluss auf die TLR-stimulierte TNFα-Expression
in Alveolarmakrophagen hat und diese signifikant erniedrigt.
Meine Ergebnisse fügen sich in das dadurch entstehende Bild der zellulären
Pathologien gut ein und tragen zur Vervollständigung des Gesamtbildes bei.
Wie zuvor beschrieben konnte bisher gezeigt werden, dass die Zytokinresponse von
Monozyten auf gram-positive Bakterien durch das Zigarettenrauchen und bei COPD
Erkrankten reduziert ist und dass dies die Folge einer gestörten Response auf die
verwendeten Stimuli (hier besonders PGN) ist. Die Expression von TNFα zeigt nach
Stimulation mit PGN signifikant niedrigere Werte in Monozyten von S und COPD
gegenüber NS. Dies konnte auch im Vergleich der relativen Werte gezeigt werden.
Erniedrigte Werte der TNFα –Expression in AM von R im Vergleich zu NS (nach LPSStimulation) konnte bereits in mehreren Studien gezeigt werden [180, 46, 110,117].
Nach Stimulation mit LTA und amiA zeigten sich keine signifikant erniedrigten Werte
in der TNFα –Expression von S und COPD gegenüber NS.
Auch diese hier von mir gezeigten Ergebnisse weisen auf eine Pathologie des NOD2Rezeptors und der damit verbundenen Signalkaskade hin.
154
5.5 Monozyten exprimieren die gemessenen PRRs Stimulationsunabhängig
Pathogen-recognition-Rezeptors PRR, die unter Anderem von Monozyten exprimiert
werden, vermitteln die Interaktion zwischen den pathogen assoziierten molekularen
Mustern (PAMPs) und der Wirtszelle [156].
TLRs und NOD-like Rezeptoren (NLR) sind die beiden wichtigsten Mitglieder der
Familie der Mustererkennungs-Rezeptoren (PRR) und sind an der Erkennung von
eindringenden mikrobiellen Krankheitserregern beteiligt. Sowohl TLR, als auch NOD
wirken synergistisch bei der Aktivierung der angeborenen Immunantwort des Wirtes
auf bakterielle Infektion. Dies beinhaltet die Aktivierung von intrazellulären
Signalwegen und gipfelt in der Produktion und Freisetzung von proinflammatorischen
Zytokinen. Diese Signalmoleküle sowie exprimierte Zytokine stellen potentielle
therapeutische Targets in der Behandlung der COPD dar. Leider gibt es bis heute
keine erfolgreichen therapeutischen Strategien zur Behandlung bzw. Heilung der
COPD. Disparitäten in der Probandenpopulation und Komorbiditäten erschweren die
Entwicklung erfolgreicher Strategien, um in die verschiedenen Schritte der
Signalwege einzugreifen.
Toll-like Rezeptoren (TLR) werden von allen Monozyten-Untergruppen exprimiert.
Das Auslösen von TLRs durch verschiedene Stimuli führt zur Aktivierung
entsprechender Signalwege, die in der Produktion von proinflammatorischen
Zytokinen gipfelt [97].
Ziel der vorliegenden Arbeit war es herauszuarbeiten, ob oder inwieweit sich die
Expressionsprofile von TLR1 und TLR2 sowie NOD und NOD2 zwischen den einzelnen
untersuchten Kohorten unterscheiden.
Es wurde eine qRT-PCR zur quantitativen Bestimmung der mRNA-Expression der
Rezeptoren in den untersuchten Monozyten durchgeführt. Diese Analysenmethode
hat bestimmte Vor- und Nachteile. Derzeit existieren neben dem in dieser Arbeit
angewandten Verfahren weitere verschiedene Prinzipien wie z.B. molecular beacon,
hybridizyation probes oder die Verwendung von SYBR Green I. Der Vorteil dieses PCRVerfahrens ist seine hohe Spezifität. Nur wenn das Probenmaterial die Zielsequenz
aufweist, kann eine sequenzspezifische Hybridisierung stattfinden und ein
entsprechendes Fluoreszenzsignal freigesetzt werden.
155
Das bedeutet, dass entstehende Primerdimere oder andere unspezifische Produkte
nicht zu einem Anstieg des Messsignals führen. Dass jeweils nur eins, und zwar das
gewollte, PCR-Produkt entstand, konnte im jeweilig durchgeführten Agarosegellauf
gezeigt werden. Es zeigte sich jeweils nur ein Balken. Die Größe des jeweiligen
Produkts wurde hier anhand der verwendeten DNA-Ladder überprüft und stimmte
mit der erwarteten Größe überein.
Andere Methoden zur Quantifizierung von Nukleinsäuren wie z.B. der Northern Blot
oder der RNase Protection Assay haben den Nachteil, dass hierfür eine hohe Menge
an Ausgangsmaterial benötigt wird und sie eine vergleichsweise niedrigere
Sensitivität aufweisen [41, 64].
Es ist wichtig, eine sorgfältige Auswahl der Primer zu treffen. Daher wurden von mir
nur Primer verwendet, die bereits in unserer Arbeitsgruppe bei ähnlichen Messungen
verwendet wurden und/oder in Voruntersuchungen von mir getestet wurden.
Zur relativen Quantifizierung wird in der PCR die Genexpression eines Zielgens auf
das sogenannte Houskeeping-gen (HKG) bezogen. Dies führt zu Reduzierung der
Varianzen der Expressionsergebnisse; Unterschiedliche RNA-Isolierungseffizienzen,
Fehler bei der reversen Transkriptase und Matrixeffelte werden ausgeglichen, da
diese gleichermaßen das HKG und das Zielgen betreffen. Ein Nachteil dieser Methode
ist, dass die gemessene, quantitative mRNA-Menge nicht unbedingt die tatsächliche
Proteinmenge wiederspiegelt [102].
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Monozyten sowohl TLR1 und
TLR2 als auch NOD1 und NOD2 exprimieren. Dies entspricht vorherigen Studien wie
der von Fritz und Kollegen [84] oder Abhijit Shiny und Kollegen [250], in denen gezeigt
werden konnte, dass sowohl NOD2 als auch NOD1 von humanen Monozyten
exprimiert wird. Ebenso wurde bereits in anderen Studien wie der von Visintin und
Kollegen [280] gezeigt, dass Monozyten auch Toll-like-Rezeptoren exprimieren.
Monozyten sind in der Literatur als die Zellpopulation beschrieben, die verglichen mit
anderen mononukleären Zellen des peripheren Bluts am stärksten TLR2 exprimieren
[116].
156
5.6 Die Expression der verschiedenen Rezeptoren wurde weder durch PGN, LTA
und amiA, noch durch die Totalextrakte von S. aureus und S. pneumoniae
signifikant beeinflusst.
Die Expression der verschiedenen Rezeptoren wurde weder durch PGN, LTA und
amiA noch durch die Totalextrakte von S. aureus und S. pneumoniae signifikant
beeinflusst. Wenn man vorherige Studien in Betracht zieht, war ein derartiges
Ergebnis der Untersuchungen nicht unbedingt zu erwarten. So ist seit Langem
bekannt, dass die Induktion der TLR2-Genexpression in Makrophagen durch TNFα
beeinflusst wird [179].
Da Monozyten die Vorläuferzellen der Makrophagen darstellen und die Expression
von TNFα auch in dieser Studie gezeigt werden konnte, wäre ein Einfluss durch das
im Zellüberstand befindliche TNFα auf die TLR2-Expression möglich gewesen. In der
Studie von Flo und Kollegen [80] konnte gezeigt werden, dass eine 20-stündige
Inkubation mit LPS, GM-CSF, IL-1, und IL-10 die TLR2-Expression in Monozyten
deutlich erhöhte. TNFα hingegen zeigte hier eine Herunterregulation der TLR2Expression. Nach einer kürzeren Inkubationszeit von 2 Stunden konnte jedoch auch
in der Arbeit von Flo und Kollegen [80] kein signifikanter Unterschied der TLR2Expression in Monozyten gezeigt werden. Somit könnte die kurze Inkubationszeit
(4 Stunden) ein Grund dafür sein, dass hier in meiner Arbeit keine signifikanten
Unterschiede bezüglich der TLR2-Expression innerhalb einer Kohorte nach
Stimulation gezeigt werden konnte. Des Weiteren implizieren die Ergebnisse von Flo
und Kollegen [80], dass unterschiedliche Stimuli unterschiedliche Expressionsänderungen hervorrufen.
In einer Studie von Skinner und Kollegen [254] konnte, vergleichbar zu meinen
Studiendaten, kein signifikanter Unterschied der TLR2-Expression in Monozyten nach
Stimulation mit PGN gezeigt werden. In der Arbeit von S. C. Cotofana [54] konnte
gezeigt werden, dass die Expression von NOD2 in Monozyten keine signifikante
Änderung nach Stimulation mit LPS aufwies. Dies ist wiederum, trotz der Verwendung
eines anderen PAMP, mit den von mir gezeigten Daten vergleichbar. Möglich ist, dass
sowohl die Konzentration der Stimulantien als auch die Stimulationsdauer
Auswirkungen auf die Rezeptor-Expression haben.
157
Auch die Wahl der Stimulantien variiert das Ergebnis. In diesem Studienmodel
konnten jedenfalls keine signifikanten Unterschiede zwischen den Stimulationen und
der Kontrolle innerhalb der Kohorten gezeigt werden.
Anders war dies im Vergleich der einzelnen Rezeptorexpressionen zwischen den
beobachteten Kohorten.
5.7 Die PRR-Expression zeigte signifikante Unterschiede zwischen den Kohorten
Da sich zwischen den unstimulierten Kontrollen und nach Stimulation mit den
entsprechenden PAMPs kein signifikanter Unterschied in der Expression der PRRs
innerhalb einer Kohorte zeigte, wurden im weiteren Verlauf der Studie nur die
unstimulierten Kontrollen/ Baselinelevel zwischen den Kohorten verglichen.
In der Untersuchung der Baseline-RNA-Expression von TLR1 als auch NOD1 zeichnete
sich im Vergleich der Kohorten untereinander ein deutlicher Trend ab. So zeigte sich
eine höhere (jedoch nicht signifikante für NOD1) mRNA-Expression in FS gegenüber
NS sowie S gegenüber FS; Die mRNA-Expression in Monozyten von COPD lag wieder
deutlich unterhalb der Expression in S. In der TLR1-Expression konnte so eine
signifikante Erhöhung der mRNA-Expression in Monozyten von S im Vergleich zu NS
gezeigt werden.
Der Anstieg der Rezeptorexpression ist vermutlich auf den konstanten Reiz des
Zigarettenrauches zurück zu führen, während ein deutlicher Rückgang der Expression
in Monozyten von COPD eher eine Zelluläre/ molekulare Schädigung vermuten lässt.
Diese Theorie würde zu den hier gezeigten Daten passen, kann jedoch nicht anhand
derzeitiger Literatur bestätigt werden.
Ein ähnlicher Trend konnte auch in der Expression von TLR2 gezeigt werden.
Hier führten jedoch erniedrigte Werte der Baseline-RNA-Expression von TLR2 in
Monozyten von FS zu einem statistisch signifikanten Unterschied im Vergleich zur
Expression in Monozyten von S.
Obwohl die TLR1- und TLR2-Expression in Monozyten von S signifikant erhöht war,
zeigte sich keine signifikante Erhöhung der entsprechenden Zytokinexpression.
158
TLR2 bildet Heterodimere mit TLR1 oder TLR6, und ist ein funktioneller Rezeptor für
Bestandteile gram-positiver Bakterien, einschließlich LTA, Peptidoglycan (PGN) und
bakteriellen Lipopeptiden. [122, 244, 9, 2]. Obwohl TLR6, wie eben erwähnt, ein
Heterodimer mit dem hier untersuchten TLR2 bildet und u.a. auf Monozyten
exprimiert wird, war es für diese Studie nicht von Interesse. Es detektiert keinen der
hier verwendeten Liganden und spielt eher eine Rolle in der Erkennung von
Mykoplasmen/ Mykobakterien [175]. Somit fehlt der Bezug zu der hier im
Vordergrund stehende COPD-Erkrankung.
Durch die große Anzahl an Liganden, die durch TLR2 erkannt werden, liegt die
Vermutung nahe, dass dieser Rezeptor, höchst wahrscheinlich eine wichtige Rolle in
der Infektabwehr und in Bezug auf einige Erkrankungen spielt. Somit ist er ein
nützlicher, therapeutischer Angriffspunkt. In einer frühen Studie von Takeuchi und
Kollegen, zeigten sich TLR2-defiziente Mäuse als sehr anfällig für gram-positive
S.aureus-Infektion bei deutlich abgeschwächter TNFα -Produktion [269].
Diverse Studien legen nahe, dass TLR2 ebenfalls eine wichtige Rolle bei der
Pathogenese nach Infektion mit anderen, gram-positiven Bakterien wie
S. pneumoniae [177] und anderen Bakterien, sowie Viren [52] spielt.
Auch in meiner Studie zeigten sich bezüglich dieser hier verwendeten Stimulantien
und der gemessenen Zytokinexpression (wie zuvor beschrieben) entsprechende
Werte.
Die erniedrigte Zytokinexpression, als Antwort auf die Stimulation mit
TLR2-spezifischen Liganden, ist durch die hier gezeigte Rezeptorexpression nicht zu
erklären.
Daher war es von großem Interesse, die am TLR-Signalweg beteiligten Proteine
dahingehend zu untersuchen, ob eine molekulare Pathologie der Signaltransduktion
vorliegt bzw. was dazu führt, dass bei erhöhter Rezeptorexpression eine Erniedrigung
der Zytokinexpression vorliegt. Einiger der an der Signaltransduktion des TLRSignalweges beteiligten Proteine wurden daher untersucht und die Ergebnisse im
folgenden Abschnitt besprochen.
159
Besonderes Augenmerk fiel in der hier vorliegenden Arbeit jedoch durch die bereits
zuvor beschriebenen Unterschiede in der Zytokinexpression nach Stimulation mit
entsprechenden PAMPs auf die NOD2-RNA-Expression.
Die im Zytosol gelegenen Proteine des angeborenen Immunsystems sind dafür
bekannt, dass sie inflammatorische Signale als Reaktion auf eine Stimulation mit PGN
weiterleiten [92, 12].
Des Weiteren wurde in anderen Untersuchungen gezeigt, dass zytoplasmatisch
gelegene PRRs wie NOD1 und NOD2 Bakterien wie S.aureus und S.pneumoniae
erkennen. [208, 118, 59].
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Baseline-RNA-Level von NOD2 in
Monozyten von S und COPD im Vergleich zu NS signifikant reduziert waren. Auch die
Werte von FS waren im Vergleich zu NS reduziert, wiesen jedoch keine signifikanten
Unterschiede auf.
Das zeigte, dass durch den Zigarettenrauch entstandene molekulare Pathologien in
Bezug auf den NOD2-Rezeptor, zumindest teilweise, die verminderte zelluläre
Response auf PGN bewirken.
In einer aktuellen Studie von Aldhous und Kollegen [7] konnte Vergleichbares in
Epithelzellen des Darms gezeigt werden. Nach Behandlung der Epithelzellen mit
Zigarettenrauch und Nikotin zeigte sich eine verringerte NOD2 mRNA-Expression und
wurde mit abnormer NOD2/ RIPK2 Interaktion, reduzierter NFkB-Aktivität und
verringerter Chemokin-Produktion assoziiert. Diese Effekte können weitreichende
Auswirkungen für den Effekt des Rauchens auf NOD2-vermittelte Reaktionen haben.
Eine gestörte Regulation von PRR auf Monozyten und AM kann Einfluss auf die
Erkennung von bakteriellen Krankheitserregern haben und intrazelluläre Signalwege
sowie resultierende Effektormechanismen beeinflussen.
Eine Änderung in der PRR-Expression auf Monozyten und Makrophagen von COPDProbanden könnte daher am Prozess der kontinuierlichen Inflammation und
bakteriellen Besiedelung beteiligt sein. [286]
Die in der hier vorliegenden Arbeit gezeigten Daten unterstützen diese These und
geben weitere Anhaltspunkte für eine gezielte Therapie.
160
Um die zuvor beschriebenen Pathologien bezüglich der hier gemessenen Toll-likeRezeptoren bzw. der Signalweiterleitung genauer zu beleuchten, wurden auch die
Expression der entsprechenden Signalwegbestandteile untersucht.
5.8 TLR-Adapterprotein MyD88 und die Signalwegsantagonisten MyD88s,
IRAK-M und A20
TLR und NOD1/ NOD2 kooperieren miteinander, um eine ausgeglichene und
effiziente angeborene Immunantwort auf mikrobielle Pathogene zu gewährleisten.
Beide, TLR und NOD1 / NOD2, reagieren auf unterschiedliche PAMPs, die in einigen
Fällen innerhalb eines Bakteriums zu finden sind.
Die meisten TLRs (außer TLR3) aktivieren den Downstream-NF-kappaB und MAPK Signalweg durch Rekrutierung und Aktivierung ihres Adapterprotein MyD88,
während NOD1 und NOD2 die nachgeschalteten NF-kappaB Signalweg durch
Rekrutierung und Aktivierung ihrer Adapterproteine RIP2 und card9 aktivieren[263].
Makrophagen und DCs, die aus MyD88-defizienten Mäusen isoliert wurden, zeigten
sich als nicht in der Lage auf bestimmte TLR-Liganden zu reagieren.
Das weist darauf hin, dass diese TLR abhängig vom MyD88-Signalweg sind um den
NF-κB-Signalweg zu aktivieren [143].
Auch das direkte Adapterprotein am Toll-like-Rezeptor, MyD88, sowie die
Signalwegsantagonisten MyD88s, IRAK-M und A20 wurden durch Monozyten
aller vier Kohorten exprimiert und weder durch die verschiedenen PAMPs, noch die
Totalextrakte in ihrer Expression beeinflusst.
Obwohl nur die Expression von MyD88 in Monozyten von FS im Vergleich zu NS eine
statistisch signifikante Erhöhung zeigte, zeichnete sich auch hier bei den einzelnen
Signalproteinen ein deutlicher Trend ab. Während die Expressionslevel bei NS sich
konstant auf relativ niedrigem Niveau befanden, konnte ein Anstieg in Monozyten
von FS und S verzeichnet werden.
Die Expression der jeweiligen Signalproteine in Monozyten von COPD entsprach auch
hier wieder in etwa der in Monozyten von NS.
Wie schon in anderen Studien gezeigt werden konnte führt eine bakterielle Reizung
bzw. Infektion zu Erhöhung der Expression inhibitorischer Proteine.
161
So wurde z.B. in der Studie von Fan und Kollegen gezeigt, dass ein Hepatitis B –
Leberversagen mit einer erhöhten A20-Expression vergesellschaftet ist. Die Schwere
der Erkrankung konnte hier mit der A20-mRNA-Expression in mononukleären Zellen
des peripheren Blutes in Zusammenhang gebracht werden. [74]
In einer Arbeit von Adib-Conquy und Kollegen [3] konnte gezeigt werden, dass
proinflammatorische Zytokine in Monozyten septischer Probanden nach Stimulation
im Vergleich zu gesunden Probanden reduziert waren und dies zum Teil auf die
gesteigerte mRNA-Expression von MyD88s zurückzuführen war.
Die niedrige Expression von Signalmolekülen in Monozyten von COPD weist auf eine
zelluläre/ molekulare Schädigung hin.
Da in Monozyten von S nicht nur die
Rezeptorexpression von TLR1 und TLR2 sowie deren Adapterprotein MyD88 erhöht
sind, sondern auch die entsprechenden Signalwegsantagonisten, ist dies eine
Erklärung, weshalb die Zytokinexpression in Monozyten von S im Vergleich zu NS
ohne signifikanten Unterschied oder sogar statistisch signifikant niedriger ist.
Die niedrigen Werte bezüglich der Rezeptor- sowie Signalproteinexpression in
Monozyten von COPD entsprechen den niedrigen Zytokinexpressionen und sind
wahrscheinlich durch eine zelluläre/ molekulare Schädigung zu erklären.
Auch PGRP1 wurde in dieser Studie untersucht. Es konnte eine Expression in
Monozyten aller vier Kohorten gezeigt werden.
Die Expression zeigte sich unabhängig von den Stimulationen mit den hier
verwendeten PAMPs sowie Total-Extrakten. Obwohl im Vergleich der Kohorten
untereinander kein signifikanter Unterschied gezeigt werden konnte, zeichnete sich
auch hier der zuvor beschriebene Trend ab.
Wenn man nun alle Ergebnisse dieser Studie zusammenfasst zeigt sich die von mir
aufgestellte Hypothese als bestätigt.
Das Zigarettenrauchen verursacht eine systemische molekulare Pathologie in
Monozyten. Monozyten sind bei akuten Atemwegsinfektionen mit gram-positiven
Bakterien nach ihrer Aktivierung und Rekrutierung in die Lunge nicht mehr in der Lage
mit einer adäquaten Produktion von Zytokinen und Chemokinen, welche die
Infektabwehr einleiten, auf PAMPs zu reagieren.
162
Da die PAMP-induzierte Zytokinproduktion (GM-CSF, TNFα) mit der FEV1 positiv
korreliert, wird dieser Defekt bei fortschreitender COPD-Erkrankung verstärkt. Nach
Korrelation der hier gewonnenen Daten mit den entsprechenden klinischen
Parametern bezüglich der FEV1 sowie den packyears konnte gezeigt werden, dass die
Zytokinexpression von TNFα und GM-CSF mit Zunahme der FEV1 statistisch signifikant
ansteigt, während sie mit Zunahme der py deutlich abfällt. Das impliziert eine
gestörte monozyten-anhängige Immunantwort auf bakterielle Infektionen bei
Rauchern und vor allem bei COPD.
Da die in der hier vorliegenden Arbeit gefundenen Pathologien der Signaltransduktion in Monozyten auch bei Rauchern ohne COPD gezeigt werden konnten
und in Monozyten von ehemaligen Rauchern bereits in Remission befindlich waren,
konnte Zigarettenrauch als Ursache festgelegt werden. Die zugrundeliegende
molekulare Pathologie basiert zumindest teilweise auf einer ebenfalls durch das
Zigarettenrauchen und durch die COPD-Erkrankung verursachten Reduktion
der Expression des PAMP-Rezeptors NOD2 sowie einer Überexpression der
inhibierenden Moleküle des TLR-Signalweges. Vergleichbare Pathologien fanden sich
wie bereits zuvor beschrieben schon in anderen, an der Immunabwehr beteiligten
Zellen wie den Makrophagen.
Knobloch und Kollegen [151] konnten in einer Studie zeigten, dass Th1-Zellen von
COPD-Erkrankten im Vergleich zu gesunden Nie-Rauchern eine verminderte
Response auf eine Stimulation mit gram-negativen Bakterienbestandteilen (LPS)
aufweisen.
Die hier gezeigten Ergebnisse fügen sich somit in das bereits in Anfängen bestehende
Konzept einer zellulären/ molekularen Schädigung ein und verdeutlicht das Bild einer
insuffizienten angeborenen Immunabwehr. Dies hat wiederum auch Auswirkungen
auf das erworbene Immunsystem. Das kann zur Erklärung beitragen weshalb Raucher
und COPD-Erkrankte anfälliger für bakterielle Infektionen sind als gesunde NieRaucher. Durch die geschwächte Infektabwehr steigt die Häufigkeit der Infektionen.
Bakterielle Infektionen der Atemwege lösen wiederum Exazerbationen bei COPD aus,
die die irreversible Progression der Erkrankung beschleunigen. Bakterien, z.B. grampositive Bakterien wie Streptococcus pneumoniae und in geringerem Ausmaß
Staphylococcus aureus [290, 215], finden sich in ca. 40-70 % der Exazerbationen [245]
163
und stellen somit die mit Abstand häufigste Ursache dar [19, 26, 33, 49]. Bakterielle
Infekte sind somit von großer Bedeutung für den klinischen Verlauf der COPD und
den Rückgang der Lungenfunktion [62]. Die unvollständige Elimination von
bakteriellen Krankheitserregern trägt zur kontinuierlichen Reizung und Aktivierung
von Immuneffektormechanismen bei. [293]
Die von mir erhobenen Daten tragen zum besseren Verständnis der Rolle der
Immunzellen bei der bakteriellen Infektabwehr und den damit verbundenen
systemischen Veränderungen durch die COPD und das Zigarettenrauchen bei.
Assoziierte Signalmechanismen könnten geeignete molekulare Targets zur Stärkung
der Infektabwehr und zur Reduzierung von Exazerbationsraten oder -dauern bei
COPD darstellen. Sie können somit zur Entwicklung von innovativen therapeutischen
Strategien zur Reduzierung von Exazerbationsraten beitragen.
5.9 Limitation
Obwohl diese Studie weiteren Aufschluss über die zu Grunde liegenden Pathologien
der COPD, ihrer Exazerbation und der diesbezüglichen, gestörten Infektabwehr gibt,
ist es nur ein weiteres Puzzleteil in einem sehr komplexen System, in dem eine Unzahl
von weiteren Faktoren Einfluss nehmen.
Dies und die Tatsache, dass dieses Gebiet erst in Ansätzen erforscht ist, führt auch
dazu, dass es bisher keine erfolgreichen Therapien zur Verhinderung weiterer
Exazerbationen und gar zur Heilung der COPD gibt.
Es ist nun wichtig den bereits eingeschlagenen Weg weiter zu verfolgen, um dieses
Komplexe System der Immunabwehr und der in der COPD zugrunde liegenden
Pathologien zu entschlüsseln.
Hierzu sollten auch die anderen Zellen und Mechanismen, die an der Immunabwehr
beteiligt sind, in diesem Zusammenhang untersucht werden.
Da der hier untersuchte Signalweg von fast allen humanen TLRs genutzt wird und
TLRs auch auf anderen Zellen des Immunsystems zu finden sind, kann man hier zum
Beispiel davon ausgehen, dass die in dieser Studie gezeigten Pathologien bezüglich
des TLR-Signalweges, auch in anderen Zellen gefunden werden können.
164
6 Zusammenfassung und Ausblick
Das Thema der vorliegenden Dissertation ist die Monozytenabhängige Infektabwehr
im Vergleich zwischen gesunden Nie-Rauchern (NS; n=10), gesunden Exrauchern (FS;
n=12), gesunden Rauchern (S; n=10) und Rauchern mit COPD (COPD (GOLD II-III) ohne
akute Infektion/Exazerbation; n=14). (Es lagen zum Zeitpunkt der Untersuchung
sowie drei Monate zuvor keine Infektion der Probanden vor.)
Atemwegs- und systemische Inflammation, oft bakteriell bedingt, sind entscheidende
Trigger der COPD Pathogenese. Eine infektionsbedingte Verstärkung der
Inflammation führt zu Exazerbationen, beeinflussen den Krankheitsverlauf der COPD
schwerwiegend und können momentan nur unzureichend behandelt werden.
Das Ziel dieser experimentellen Studie ist es, molekulare Pathologien, die die erhöhte
Infektanfälligkeit bei COPD und damit die gestörte Immunantwort auf bakterielle
Infektionen erklären können, aufzudecken.
Die Hypothese ist, dass aktive Komponenten des Zigarettenrauchs molekulare
Pathologien (z.B. an Signalnetzwerken) in zirkulierenden Monozyten von Rauchern
und COPD-Erkrankten verursachen und so die Monozyten-abhängige Infektabwehr
beeinträchtigt.
Als Folge dieser systemischen Defekte können die Immunzellen bei akuten
Atemwegsinfektionen nach ihrer Aktivierung und Rekrutierung in die Lunge nicht
mehr
ausreichend
auf
bakterielle
PAMPs
mit
der
Freisetzung
von
Zytokinen/Chemokinen reagieren. Das schwächt die Infektabwehr und dadurch steigt
die Häufigkeit der Infektionen bei COPD Probanden, was zu Exazerbationen führt.
Diese Hypothese konnte bereits durch erste Untersuchungen an T-Zellen vor Beginn
dieser Studie unterstützt werden.
6.1 Methoden
Blutabnahme von 80 ml peripher-venösem Blut je Proband
Eingeschlossen wurden vier verschiedene Kohorten: NieRaucher (NS; n=10),
lungengesunde Raucher (S; n=10), ehemalige Raucher (FS; n=12) und Raucher mit
COPD (COPD; n= 14)
165
Isolation und magnetic beads-basierte Aufreinigung (Negativselektion) von
Monozyten aus dem peripheren Blut
Zellkultur
Ex vivo-Stimulation der Monozyten in Reinkultur mit PAMPs gram-positiver Bakterien
Peptidoglycan (PGN), Lipoteichonsäure (LTA) und Oligopeptide-binding protein amiA
(Pam3Cys) sowie mit Totalextrakten von Staphylococcus aureus und Streptococcus
pneumoniae in Konzentrations-Wirkungs-Experimenten.
Messung der exprimierten Zytokine IL-8, GM-CSF und TNFα (inflammatorischen
Mediatoren mit hoher Relevanz für die COPD und Infektabwehr) mittels ELISA
sowie Vergleich der gewonnenen Ergebnisse zwischen den Kohorten und Korrelation
mit klinischen Parametern.
Des Weiteren wird die Expression von TLR1/ 2 und NOD1/ 2, sowie wichtiger
Komponenten der entsprechenden Signalkaskade (MyD88, MyD88s, IRAK-M, A20)
und PGRP1 als Teil der angeborenen Infektabwehr mittels quantitativer RT-PCR
gemessen und zwischen den Kohorten verglichen.
6.2 Ergebnisse
In Konzentrations-Response Experimenten induzierten PGN, LTA (jeweils von S.
aureus), Lipopeptid amiA (von S. pneumoniae), S. aureus-Totalextrakt (SaE) und S.
pneumoniae-Totalextrakt (SpE) jeweils konzentrationsabhängig die Freisetzung von
GM-CSF, TNFα und IL-8 aus Monozyten, die aus dem peripheren Blut von NieRauchern isoliert wurden.
Die Baselinelevel von GM-CSF, TNFα und IL-8 waren ohne statistisch signifikante
Unterschiede in Monozyten von NS, S und COPD. Die Baselinelevel von GM-CSF und
TNFα in Monozyten von FS waren im Vergleich zu den anderen Kohorten signifikant
erniedrigt.
Die PGN-, SaE- und SpE-induzierte Freisetzung von TNFα ist bei S und COPD im
Vergleich zu NS reduziert und korreliert bei PGN(p<0,001) und S.a.E (p<0,05) negativ
zu den packyears und bei S.a.E (p<0,05) positiv zur FEV1 [% pred.].
166
Die PGN-, LTA-, amiA-, SaE- und SpE-induzierte Freisetzung von GM-CSF ist bei FS, S
und COPD im Vergleich zu NS reduziert und korreliert jeweils negativ zu den
packyears (jeweils p<0,001) und positiv zur FEV1 [% pred.](außer PGN und S.p.E)
(je p<0,05, amiA & S.a.E.: p<0,01).
Bei der Korrelation mit klinischen Parametern wurde die Gruppe der ehemaligen
Raucher von den Untersuchungen ausgeschlossen. Jeder der untersuchten,
ehemaligen Raucher, hatte zum Zeitpunkt der Untersuchung bereits mehr als zehn
Jahre vollkommen rauchfrei gelebt, sodass in dieser Zeit bereits regeneratorische
Prozesse eingesetzt haben [294].
Des Weiteren fiel die konstante Reizung durch den Zigarettenrauch weg, sodass
meiner Meinung nach eine verlässliche Korrelation an dieser Stelle nicht möglich ist.
Dies würde nur die bereits gewonnen Ergebnisse verfälschen.
Die Zytokinfreisetzung von IL-8 zeigte keinerlei signifikante Unterschiede.
Um die zugrundeliegende molekulare Pathologie zu untersuchen, wurde als nächstes
die Expression der entsprechenden Rezeptoren und Signalmoleküle gemessen.
Monozyten exprimieren TLR1, TLR2, NOD1, NOD2 und PGRP1 sowie die
Signalmoleküle MyD88, MyD88s, IRAK-M und A20. Die Expression dieser Rezeptoren
und Signalmoleküle wurde weder durch PGN, LTA und amiA noch durch die Extrakte
von S. aureus und S. pneumoniae beeinflusst.
Die Baseline RNA-Level von NOD1, PGRP1, MyD88s, IRAK-M und A20 waren ohne
statistisch signifikanten Unterschied zwischen den NS, S und COPD.
In Monozyten von FS waren die Baseline RNA-Level von TLR2 im Vergleich zu S
signifikant reduziert. Die Baseline RNA-Level von TLR1 in Monozyten von S zeigten
signifikant erhöhte Werte im Vergleich zu NS. Auch bei der Expression von MyD88
zeigten sich signifikant erhöhte Werte in Monozyten von FS im Vergleich zu NS.
Die Baseline-RNA-Level von NOD2 in Monozyten von S und COPD waren im Vergleich
zu NS signifikant reduziert.
Die Monozytenzahl zeigte sich im Blut von COPD im Vergleich zu NS signifikant
reduziert.
167
6.3 Fazit & Ausblick
Das Zigarettenrauchen verursacht eine systemische molekulare Pathologie in
Monozyten. Dadurch sind Monozyten bei Infektionen mit (gram-positiven) Bakterien
nicht mehr in der Lage mit einer adäquaten Produktion von Zytokinen, welche die
Infektabwehr einleiten, auf PAMPs zu reagieren. Da die PAMP-induzierte
Zytokinproduktion (GM-CSF, TNFα) mit der FEV1 positiv korreliert, wird dieser Defekt
bei fortschreitender COPD-Erkrankung verstärkt.
Das impliziert eine gestörte Monozyten-anhängige Immunantwort auf bakterielle
Infektionen bei Rauchern und vor allem bei COPD. Das kann zur Erklärung beitragen
warum Raucher und COPD-Probanden anfälliger für bakterielle Infektionen sind als
gesunde Nichtraucher. Die zugrundeliegende molekulare Pathologie basiert
zumindest teilweise auf einer ebenfalls durch das Zigarettenrauchen und durch die
COPD-Erkrankung verursachten Reduktion der Expression des PAMP-Rezeptors
NOD2.
Obwohl die gesundheitsschädliche Wirkung von Zigarettenrauch bereits hinreichend
bekannt ist, konnte auch hier gezeigt werden, dass dadurch weitere Pathologien
entstehen und eine Zigarettenrauch-Karenz einen positiven Einfluss auf die
Gesundheit nimmt. So konnte in dieser Studie gezeigt werden, dass entstandene
Pathologien nach Stopp der Zigarettenrauchexposition zumindest teilweise
reversibel sind und die Entstehung einer COPD so unwahrscheinlich wird. In
verschiedensten,
klinischen
Studien
konnte
die
positive
Wirkung
einer
Zigarettenrauchabstinenz bereits gezeigt werden [294]. Die durch die WHO
herausgegeben Empfehlung der Zigarettenrauchkarenz kann somit nur unterstützt
und sogar auf zellulärer Ebene bestätigt werden.
Medikamente die auf TLRs abzielen beinhalten hauptsächlich entweder TLRAgonisten um Immunreaktionen gegen Infektionserreger zu verbessern, oder
Antagonisten, die entwickelt wurden um Entzündungen aufgrund einer Infektion
oder Autoimmunreaktionen zu reduzieren [88]. Auf Grund der von mir gezeigten
Daten kann man darauf schließen, dass eine Therapie mittels sowohl Agonisten als
auch Antagonisten nicht sinnvoll bzw. sogar unwirksam ist, da es sich hier um
168
systemische Pathologien bezüglich der Rezeptor-, sowie Signalmolekül-Expression
handelt.
So würde eine Blockade der Negativregulatoren einen besseren therapeutischen
Ansatz darstellen. Die assoziierten Signalmechanismen könnten geeignete
molekulare therapeutische Targets zur Stärkung der Infektabwehr und zur
Reduzierung von Exazerbationsraten oder -dauern bei COPD darstellen.
Denkbar wäre eine phasenabhängige Therapie, die zunächst die Erstreaktion des
Immunsystems unterstützt.
Dies könnte zum Beispiel durch Erhöhung der Zirkulationsdauer von Immunzellen wie
Monozyten im Blut positiv beeinflusst werden. Verzögert man die Migration und
somit die gewebespezifische Differenzierung wirkt man nicht nur der hier gezeigten
Verringerung der im Blut zirkulierenden Monozyten entgegen, sondern reduziert
auch die in der COPD bereits beschriebene, kritische Akkumulation von
Alveolarmakrophagen in der Lunge. Die so gesteigerte Zahl an zirkulierenden
Monozyten wirkt der hier verringerten Abwehrfunktion durch eine reduzierte
Rezeptorexpression entgegen.
Es gibt bereits mehrere Versuche der Therapie mittels direkter Blockierung der
inflammatorischen Zytokine wie TNFα. TNFα-Blocker wie Infliximab zeigten sich in
der Therapie chronisch entzündlicher Erkrankungen wie M. Crohn als überaus
wirksam. Leider konnten diese Resultate nicht in der Therapie der COPD gezeigt
werden. Hier waren TNF-α-Antagonisten nicht wirksam, erhöhten jedoch das
Infektionsrisiko.
Wenn man die in dieser Studie gezeigten Ergebnisse diesbezüglich in Betracht zieht
ist die TNFα-Blockade nicht sinnvoll, da die TNFα-Expression nach Stimulation
(= Infektion) z.B. in Monozyten von COPD im Vergleich zu NS bereits erniedrigt ist.
Somit würden infektbedigte Exazerbationen verstärkt und ein negatives Outcome in
klinischen Studien erklärt.
In einer großen, randomisierten Kontrollstudie, der TORCH-Studie, konnte gezeigt
werden, dass das Risiko von COPD-Probanden an Pneumonie zu erkranken durch die
Anwendung von Kortikosteroiden deutlich erhöht wird [55]. Dies unterstreicht
ebenfalls die hier vorgestellten Ergebnisse. Eine Supprimierung der bereits
169
gestörten/ reduzierten Infektabwehr macht den Körper gegenüber bakterieller
Angriffe verwundbar.
Obwohl es bereits mehrere Ansätze einer Therapie der COPD und ihrer Exazerbation
auf zellulärer Ebene gibt, konnte bisher kein wirklich effektives Medikament
gefunden werden. Dies liegt auch daran, dass es sich bei der menschlichen
Immunabwehr um ein sehr komplexes System handelt. Besonders die COPD erweist
sich als eine sehr schwierige und komplexe Erkrankung.
Wie gezeigt besteht Sie nicht allein aus einer überzogenen Immunreaktion mit starker
Zellmigration, sondern gleichzeitig auch aus einer insuffizienten, angeborenen
Infektabwehr, die dazu führt, dass Erreger in der Lunge persistieren und
Exazerbationen auslösen.
Daher ist es umso wichtiger, die genauen Abläufe und Pathologien zu entschlüsseln.
Wie bereits erwähnt konnte ich durch diese Arbeit ein weiteres Puzzleteil in das
Gesamtbild einfügen, was dazu führt, dass sich neue Angriffspunkte für
medikamentöse Therapien zeigten.
170
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8 Danksagung
Mein Dank geht an…
Fr. Prof. Dr. med. Andrea Koch
Für die Überlassung des Themas und damit der Chance an etwas Neuem und Spannendem
mitzuwirken. Für ihre Geduld, Energie und Ihr Angagement.
Dr. rer. nat. Jürgen Knobloch
Für die kompetente und engagierte Betreuung, egal zu welcher Tageszeit und an welchem
Wochentag. Für die Gespräche, die Unterstützung und die fachliche Kompetenz.
Sandra Körber und Carmen Meinig
Für die praktische Anleitung und Einarbeitung. Für die Unterstützung und dafür, dass Ihr
mir die Arbeit ein wenig erleichtert habt.
meine Freunde, Kollegen und Komilitonen
Für die tatkräftige Hilfe bei der Aquirierung der Probanden und Probanden. Hier gilt auch
besonderer Dank Birgit Schärling und Claudia Hoque für die Durchführung der
Lungenfunktionstests.
alle Probanden
Für die Teilnahme an dieser Studie, die tapfere Spende des Blutes und die investierte Zeit.
meine Familie
Ohne deren unablässliche Unterstützung und Glauben an mich die Durchführung und
Fertigstellung dieser Arbeit, sowie die Beendigung des Studiums nicht möglich gewesen
wäre.
9 Lebenslauf
Persönliche Daten
Name
Susanne Panek
Geburtdatum/-ort
07.11.1982 in Duisburg
Staatsangehörigkeit
Deutsch
Familienstand
Ledig
Sprachen
Deutsch, Englisch
Schulausbildung
1989 – 1993
Heinrich-Bongers-Schule, Duisburg
(Grundschule)
1993 - 2002
Max-Planck-Gymnasium, Duisburg
Berufsausbildung
2002 – 2005
Krankenpflegeschule Duisburg e.V.,
Ausbildung am Malteser Krankenh.
St. Johannes-Stift Duisburg-Homberg
Hochschulausbildung
2007 – 2014
Studium der Humanmedizin an der
Ruhr-Universität Bochum
09/2010
Erster Abschnitt der
ärztlichen Prüfung
2013/2014
Praktisches Jahr
2014
Zweiter Abschnitt der ärztlichen Prüfung
Berufliche Tätigkeit
2005 – 2014
Ausgebildete Krankenschwester
am Malteser Krankenhaus
St. Johannes Stift
in Duisburg-Homberg
2005 – 2007
Vollzeitbeschäftigt :
zunächst auf der Station für Geriatrie
und Frührehabilitation für ½ Jahr,
danach für 1 ½ Jahre auf der Station für
Allgemein- und Unfallchirurgie
2007 – 2014
Arbeit als Krankenschwester neben dem
Studium in Teilzeit
2011
Beginn der Tätigkeit im Labor von Fr.
Prof. Dr. med. Koch (zur Promotion)
2014 – 31.Mai 2015
Arbeit als Krankenschwester in
Teilzeit
Seit 1. Juni 2015
Assistenzärztin Orthopädie und
Unfallchirurgie im St.Vinzenz-Hospital
in Dinslaken