Expression antimikrobieller Peptide in Bronchialkarzinomen Dietlind

Aus der
Klinik für Innere Medizin
Schwerpunkt Pneumologie
Direktor: Prof. Dr. C. Vogelmeier
des Fachbereichs Medizin der Philipps-Universität in
Zusammenarbeit mit dem Universitätsklinikum
Gießen und Marburg GmbH, Standort Marburg
Expression antimikrobieller Peptide in
Bronchialkarzinomen
Inauguraldissertation zur Erlangung des Doktorgrades der
gesamten Medizin
dem Fachbereich Medizin der Philipps- Universität Marburg
vorgelegt von
Dietlind Reimer geb. Görner
aus Kiel
Marburg 2008
angenommen vom Fachbereich für Humanmedizin
der Philipps-Universität Marburg
am: 08.04.08
Gedruckt mit Genehmigung des Fachbereiches
Dekan:
Prof. Dr. M. Rothmund
Referent: Prof. Dr. Dr. R. Bals
Koreferent: Prof. Dr. M. Lohoff
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung............................................................... 5
1.1 Allgemeines über antimikrobielle Peptide .................................................................5
1.2 Nomenklatur und Struktur............................................................................................6
1.2.1 Defensine ....................................................................................................................7
1.2.1.1 α-Defensine ............................................................................................... 7
1.2.1.2 β-Defensine ............................................................................................... 7
1.2.2 Cathelizidine ...............................................................................................................9
1.3 Funktionen antimikrobieller Peptide .........................................................................11
1.3.1Antimikrobielle Wirkung............................................................................................11
1.3.2 Nicht-antimikrobielle Funktionen ...........................................................................12
1.4 Bronchialkarzinom.......................................................................................................13
1.5 Tumorangiogenese .....................................................................................................15
1.5.1 Interaktion von AMPs und Tumorzellen ...............................................................16
1.6 Fragestellung ...............................................................................................................17
2. Material und Methoden ..................................... 18
2.1 Geräte ...........................................................................................................................18
2.2 Chemikalien..................................................................................................................18
2.3 Lösungen und Puffer ..................................................................................................18
2.4 Untersuchungsmaterial ..............................................................................................19
2.5 Immunhistochemischer Nachweis ............................................................................19
2.6 Kontrollen......................................................................................................................21
2.7 Quantitative Auswertung der Färberesultate ..........................................................21
2.8 Statistik..........................................................................................................................21
3. Ergebnisse........................................................... 23
3.1 Humane β-Defensine werden in NSCLC exprimiert..............................................23
3.2 Cathelizidine werden in NSCLC exprimiert.............................................................25
3.3 FPRL-1, der Rezeptor für LL-37, wird in NSCLC exprimiert ................................25
3.4 Der von Willebrand Faktor stellt Gefäßendothel in NSCLC dar ..........................28
3.5 Der Proliferationsfaktor Ki-67 ....................................................................................29
3.6 AMPs scheinen über HLA die Tumorprogression zu fördern...............................29
3.7 AMPs werden nicht in kleinzellige Bronchialtumoren exprimiert .........................30
4. Diskussion ........................................................... 32
4.1 Expression von AMPs in der Lunge .........................................................................32
4.2 Expression von AMPs in Tumoren ...........................................................................32
4.3 Antimikrobielle Peptide sind potentielle Wachstumsfaktoren...............................34
4.4 FPRL-1wird in NSCLC exprimiert.............................................................................35
4.5 Angiogenese im Tumor ..............................................................................................36
4.6 AMPs sind mit erhöhter Zellproliferation in Bronchialkarzinomen assoziiert.....37
4.7 AMPs fördern Vaskulogenese in Bronchialtumoren über dendritische
Zellen ...................................................................................................................................38
5. Zusammenfassung ............................................ 39
6. Summary .............................................................. 40
7. Anhang ................................................................. 41
Literaturverzeichnis............................................................................................................42
Curriculum Vitae.................................................................................................................52
Danksagung........................................................................................................................53
Akademische Lehrer..........................................................................................................54
Ehrenwörtliche Erklärung..................................................................................................55
1. Einleitung
1.1 Allgemeines über antimikrobielle Peptide
Antimikrobielle Peptide (AMPs) kommen ubiquitär in allen Eukaryonten, wie
Säugetieren, Amphibien, Insekten, Pflanzen und Protozoen, vor (Gabay 1994)
und stellen so einen konservativen Mechanismen der Evolution dar, den
eigenen Organismus gegen Mikroorganismen zu schützen (Ganz, Lehrer 1995;
Ganz, Weiss 1997; Lehrer, Ganz 1999).
Untersuchungen am Menschen haben ergeben, dass individuelle AMPs
verschiedene
Aktivitäten
haben,
die
über
die
antifungale,
antivirale,
antiparasitäre Abwehr hinaus in zahlreiche Prozesse eingehen (Hancock,
Chapple 1999).
Organismen, die über ein Immunsystem verfügen, das ohne B- und T-Zellen
auskommt, sind in der Lage, sich gegen eindringende Mikroorganismen zu
schützen (Charlet et al 1996). Einige Teile dieses Abwehrsystems sind auch
beim Menschen vorhanden und haben nicht nur die Aufgabe der Abwehr,
sondern auch die, das adaptive Immunsystem zu regulieren. Dieses
angeborene Immunsystem ist eine erste Barriere gegen pathologische
Einflüsse von außen (Fearon et al 1996; Matzinger 1998; Medzhitov, Janeway
1997) und steht zeitlich und räumlich vor dem adaptiven Immunsystem. Das
angeborene Immunsystem hat also folgende Aufgaben: 1. Erkennung von
Mikroorganismen als fremd, 2. initiale Bekämpfung und Eliminierung des
Pathogens, 3. Aktivierung des adaptiven Immunsystems. AMPs sind mit ihrer
Funktion
als
mikrobizide
Substanzen
und
als
Entzündungsmediatoren
insbesondere an den Punkten 2 und 3 beteiligt und dienen damit als
Effektorsubstanzen des angeborenen Immunsystems (Bals 2000).
5
1.2 Nomenklatur und Struktur
Als AMPs werden Peptidmoleküle bezeichnet, die antimikrobielle Aktivität
besitzen, weniger als 100 Aminosäuren lang und von individuellen Genen
kodiert sind (Bals 2000).
Da sie schnell produziert werden und weitverbreitet sind, scheinen sie ideal für
eine schnelle und effektive Abwehr gegen Mikroben zu sein (Nissen-Meyer
1997). Alle antimikrobiellen Peptide sind kationisch oder amphiphil und dieses
Merkmal bestimmt den Modus ihrer antimikrobiellen Aktion. Sie bestehen aus
Clustern von hydrophoben und kationischen Aminosäuren, die in Sektoren des
Moleküls organisiert sind (Zasloff 2002).
Die Gene antimikrobieller Peptide von Eukaryonten weisen Intron-ExonStrukturen auf (Ganz, Lehrer 1994). Alle AMPs leiten sich vom großen
Precursor eingeschlossen einer Signalsequenz ab (Zasloff 2002). Das primäre
Translationsprodukt ist ein Präpropeptid, dessen N-terminales Targetingpeptid
beim Eintritt in das endoplasmatische Retikulum abgespalten wird. Der
Propeptidanteil, welcher oft negativ geladen ist, hat wahrscheinlich die
Funktion, die Aktivität des eigentlichen Peptids durch ladungsabhängige
Interaktionen zu inhibieren. Das Propeptid kann intrazellulär gespeichert
werden. Die Aktivierung durch Abspaltung des Propeptidanteils erfolgt
möglicherweise für einige Peptide noch intrazellulär (Bals 2000).
Die Unterschiede in den Sequenzen sind so groß, dass die gleiche
Peptidsequenz selten bei zwei verschiedenen Spezies von Tieren, auch nicht
bei
eng
verwandten,
wiedergefunden
wird.
Die
Diversität
reflektiert
wahrscheinlich die Adaption der Spezies an die individuellen mikrobiellen
Entwicklungen, die die besetzte Nische charakterisieren (Simmaco et al 1998;
Boman 2000).
Bis jetzt wurden mehr als 800 AMPs isoliert und beschrieben (Kamysz et al
2002). Beim Menschen sind bisher Substanzen der Defensin-, Cathelizidin- und
Histatinfamilie isoliert worden (Bals 2000).
6
1.2.1 Defensine
Defensine sind AMPs, die drei intramolekulare Disulfidbrücken von Cystein,
einen hohen Anteil an Arginin besitzen und hauptsächlich β-Faltblattstruktur
aufweisen (Ganz et al 1985). Sie werden in zwei Untergruppen geteilt, die αund β-Defensine, die sich u.a. in der Ausbildung ihrer Disulfidbrücken
unterscheiden.
1.2.1.1 α-Defensine
Humane α-Defensine sind zwischen 29 und 35 Aminosäuren lang und weisen
eine dreisträngige β-Blattstruktur auf. Die α-Defensine des Menschen, human
neutrophil peptides 1-4 (HNP1-4), finden sich vor allem in den primären
(azurophilen) Granula neutrophiler Granulozyten, wo sie einen Hauptteil des
Granulainhalts ausmachen und einen wichtigen nicht oxidativen Mechanismus
zur Abtötung von Mikroorganismen darstellen (Lehrer et al 1991). Sie wurden
auch in der Wand von Koronargefäßen beschrieben (Barnathan et al 1997),
sowie in Gewebe epithelialer Tumoren (Abiko et al 1999; Bateman et al 1992;
Mizukawa et al 2000).
Human Defensin 5 und 6 (HD-5, HD-6) werden in den Paneth-Zellen des
Dünndarms und teilweise im Urogenitaltrakt exprimiert (Bevins et al 1996), aber
auch in den Atemwegen. HD-5 wird auch in Vagina und Ektocervix exprimiert.
In
Endocervix,
Endometrium
Maximalkonzentration
Menstruationszyklus,
während
was
darauf
und
der
Eileiter
erreicht
sekretorischen
hindeutet,
dass
die
HD-5
seine
Phase
des
Expression
von
hormonalen Faktoren abhängt (Quayle et al 1998). Außer der antimikrobiellen
Funktion weisen sie auch eine Funktion als Entzündungsmediatoren (Hiemstra
et al 1998) und Ionenkanäle (Lencer et al 1997; Maget-Dana, Ptak 1997) auf.
1.2.1.2 β-Defensine
Humane β-Defensine sind zwischen 36 und 42 Aminosäuren lang und werden
insbesondere an epithelialen Oberflächen produziert. Beim Menschen wurden
bis jetzt die β-Defensine 1-4 isoliert (Bals et al 1998; Bensch et al 1995; Harder
et al 1997). β-Defensine werden in verschiedenen Epithelien induziert, wie u.a.
im Gastrointestinaltrakt (O’Neil et al 1999), Respirationstrakt (Singh et al 1998;
7
Harder et al 2000), Urogenitaltrakt und in der Haut (Harder et al 1997).
Humanes β-Defensin-1 (hBD-1) wird konstitutiv exprimiert, die Transkription
und Sekretion von hBD-2 dagegen werden durch inflammatorische Mediatoren
stimuliert. hBD-1 wird als 68-Aminosäuren-Precursor synthetisiert, der sich
später
amino-terminal
proteolytischen
Prozessen
unterzieht.
Hohe
Konzentrationen von hBD-1 mRNA erscheinen sowohl in den Henle Schleifen,
distalen Tubuli und den Sammelrohren der Niere, als auch in Vagina, Cervix,
Uterus und Eileiter. Rekombinante und natürliche Formen von hBD-1 sind in
mikromolaren Konzentrationen antimikrobiell gegen E. Coli. Ihre Aktivität wird
generell unter hohen Salzkonzentrationen gehemmt, aber es zeigt sich kein
Effekt bei niedrigem pH-Wert (Zucht et al 1998). Ein murines Homolog von
hBD-1 wird in vielen Geweben, u.a. im Respirationstrakt und distalen Nephron
ausgeschüttet. Das murine Peptid demonstriert salzsensitive antimikrobielle
Aktivität gegen Pseudomonas earoginosa und ist inaktiv gegen Burkholderia
cepacia (Morrison et al 1998; Bals et al 1998b). hBD-2 wird vom
Atemwegsepithel gebildet, sowohl vom Oberflächenepithel als auch von
submukösen Drüsen. Diese Peptide zeigen eine salzsensitive antimikrobielle
Aktivität über ein breites Spektrum und Synergien mit Lysozymen und
Lactoferrin (Bals et al 1998).
Defensine sind in vitro unter niedrig-Salz Konditionen mikrobizidal in
mikromolaren
(~µg/ml)
Konzentrationen
gramnegative
Bakterien,
Hefen,
Pilze
gegen
und
viele
einige
grampositive
Viren.
und
Erhöhte
Salzkonzentrationen hemmen kompetitiv die Defensinaktivität, wobei der
inhibitorische Effekt durch die Eigenschaften der Zielmikroben beeinflusst wird.
Defensine permeabilisieren mikrobielle Membranen, die reich an anionischen
Phospholipiden sind und einen geringeren Gehalt an cholesterol- und neutralen
phopholipidreichen Zellmembranen haben (Ganz 2002).
Die mRNAs von hBD-2 und hBD-3 werden vor allem im Epithel entzündeter
Haut produziert, aber auch wie hBD-1 im Respirationstrakt (Harder et al 2001).
AMPs steigern auch indirekt die Abwehr. Beispielsweise scheinen Defensine
die Widerstandsfähigkeit von Mäusen gegen lokale Infektionen zu erhöhen,
indem die Rekrutierung von Neutrophilen in infizierten Geweben erhöht wird
(Welling et al 1998).
8
Die Menge an Neutrophilen und die Konzentration von epithelialen Defensinen
in respiratorischer Flüssigkeit wechselt dramatisch bei akuter Entzündung. Im
Sputum von Patienten mit zystischer Fibrose reicht die Konzentration von
neutrophilen Defensinen von 300 µg/ml bis zu 2 mg/ml (Soong et al 1997). Die
Konzentration
in
BALF
von
Patienten
ohne
klinische
Zeichen
von
Entzündungen liegt nur um 100 ng/ml (Schnapp et al 1998). Die Expression von
antimikrobiellen
Polypeptiden
ist
bei
Entzündungen
lokal
moduliert.
Entzündliche Stimuli setzen Chemokine frei, die Neutrophile rekrutieren, welche
eine große Menge an Lysozym, Laktoferrin und neutrophilen Defensinen
enthalten.
Diese
Stimuli
steigern
die
Synthese
von
β-Defensinen
in
Epithelzellen (Singh 1998; Becker et al 2000). Bei chronischer Freisetzung
induzieren sie die Differenzierung von respiratorischen Epithelzellen in
sekretorische Zelltypen (Ganz 2002).
1.2.2 Cathelizidine
Beim Menschen wurde bis jetzt nur ein Vertreter dieser Familie nachgewiesen,
das LL-37, benannt nach den beiden N-terminalen Aminosäuren des aktiven
Peptids, oder hCAP-18 (human cationic antimicrobial peptide). Cathelizidin ist
charakterisiert durch eine hohe konservierte Signalsequenz und Pro-Region,
zeigt aber substantielle Heterogenität in der C-terminalen Domaine, die das
reife Peptid encodiert (Lehrer, Ganz 2002). Cathelizidin wird als Präpropeptid
synthetisiert und zeichnet sich durch eine konservierte amino-terminale
Sequenz
aus,
bei
der
die
variable
carboxy-terminale
Domaine
die
antimikrobielle Aktivität enthält. Die Pro-Sequenz wird „cathelin“ genannt, nach
ihrer Funktion, die Aktivität von Cathepsin L zu hemmen und ist 99 bis 114
Aminosäuren lang (Zanetti et al 1995).
LL-37 wird in neutrophilen Granulozyten, B-Zellen und Makrophagen,
eingeschlossen Alveolarmakrophagen, gebildet (Agerberth et al 2000), wo es
zum sauerstoffunabhängigen Mechanismus der antimikrobiellen Aktivität
beiträgt (Gudmundsson et al 1996; Cowland et al 1995). Außerdem wird es auf
Körperoberflächen wie der Haut gefunden (Frohm et al 1997; Frohm et al
1996), sowie auch im Gastrointestinal- und Respirationstrakt und in serösen
9
und mukösen Zellen von submukosalen Drüsen (Bals et al 1998c). Die mRNA
wurde auch in den Testes, in entzündeten humanen Keratinozyten (Frohm et al
1997), im squamösen Epithel von Mund, Zunge, Ösophagus, Cervix und Vagina
(Frohm et al 1999) und im Respirationsepithel (Bals et al 1998c) nachgewiesen.
LL-37 zeigt eine ungeordnete Struktur in Wasser, aber ist α-helikal in ionischer
Umgebung von Plasma und intrazellulärer oder interstitialer Flüssigkeit. Bei
ungefähr 50-100 µg/ml ist das Peptid cytotoxisch. Diese Aktivität wird durch
humanes Serum gehemmt (Johansson et al 1998).
Die Konzentration von LL-37 wurde schon in verschiedenen Körperflüssigkeiten
bestimmt, wo sie hohe Konzentrationen in Höhe von 1-5 µg/ml im Serum
(Sorensen et al 1997), in Atemwegsflüssigkeit (Agerberth et al 1999; Bals et al
1998d; Schaller-Bals et al 2002), in Wunden und in Blasenflüssigkeit (Frohm et
al 1996) während Infektionen und Entzündungen erreichte.
Cathelizidine interagieren mit der inneren und der äußeren Membran von
gramnegativen Mikroorganismen (Gutsmann et al 1999; Gutsmann et al 2000).
Die Wechselwirkung der AMPs mit Lipoplysacchariden (LPS) besteht an der
Oberfläche gramnegativer Bakterien, um an der Oberfläche zu akkumulieren
und die mikrobielle Zelle zu durchbohren (Hancock 1997). Einige grampositive
Bakterien sind in geringer Konzentration anfällig auf Cathelizidine (Turner et al
1998).
Außerdem zeigt LL-37 eine geringe Salzsensitivität. Das Peptid bindet LPS
kooperativ und mit hoher Affinität (Turner et al 1998) und inaktiviert so dessen
Aktivität (Nagaoka et al 2002, 2001).
Synthetisches
LL-37
ist
aktiv
Organismen,
eingeschlossen
gegen
gramnegative
Pseudomonas
und
aeruginosa
grampositive
und
wirkt
wahrscheinlich synergistisch mit anderen Abwehrmolekülen wie Lactoferrin und
Lysozym (Bals et al 1998c).
In den Atemwegen wird LL-37 in den gleichen Zelltypen produziert, in denen
auch β-Defensine und andere Abwehrsubstanzen gebildet werden (Bals et al
1998). Nach intrazellulärer Speicherung wird LL-37 bei der Sekretion durch
Endoproteolyse
aktiviert.
Die
Überexpression
von
LL-37
mittels
Gentransfermethoden resultiert in einer Steigerung der lokalen Infektabwehr in
Tiermodellen von zystischer Fibrose, Lungenentzündung oder septischem
Schock (Bals et al 1999; Bals et al 1998).
10
Neben der direkten antimikrobiellen Funktion haben Cathelizidine verschiedene
Rollen als Mediatoren von Entzündungen. Sie beeinflussen diverse Prozesse
wie die Zellproliferation und Migration, Immunmodulation, Wundheilung und
Angiogenese (Bals, Wilson 2002). Sie stimulieren auch Mastzellen, Zytokine
und Histamin freizusetzen (Niyonsaba 2001). LL-37 bindet an FPRL-1, einem
G-Protein-gekoppelten,
verschiedenen
sieben-transmembranen
Zelltypen
einschließlich
Zellrezeptor,
Makrophagen,
der
in
Neutrophilen
und
Untergruppen von Lymphozyten gefunden wurde (Yang et al 2000).
1.3 Funktionen antimikrobieller Peptide
Das Wirkungsspektrum antimikrobieller Peptide ist breit und umfasst nicht nur
grampositive und gramnegative Bakterien, sondern auch Pilze und Viren mit
Lipidhülle. Die antimikrobielle Aktivität ist in vitro nicht so hoch wie die einiger
konventioneller Antibiotika, doch sie töten Bakterien im Gegensatz dazu im
Verlauf weniger Minuten; sie sind mikrobizid. Es besteht eine geringe Tendenz
zur
Ausbildung
von
Resistenzentwicklung
Resistenzen
umfassen
(Hancock
bei
1997).
β-Defensinen
Mechanismen
Veränderungen
zur
von
Effluxpumpensystemen (Shafer et al 1998) oder die Modifikation von
Oberflächenbestandteilen der äußeren Hülle von Mikroorganismen (Lysenko et
al 2000; Peschel et al 1999).
1.3.1Antimikrobielle Wirkung
AMPs spielen eine wichtige Rolle in der erfolgreichen Entwicklung komplexer
multizellulärer Organismen (Zasloff 2002).
Die meisten antimikrobiellen Peptide sind bei physiologischem pH-Wert positiv
geladen. Dadurch kommt es zu Interaktionen mit negativen Ladungen auf der
Oberfläche von Mikroorganismen, insbesondere mit LPS (Zasloff 2002), welche
die Hauptkomponente der äußeren Membran von gramnegativen Bakterien sind
(Kamysz et al 2003). Es führt schließlich zu ihrer Permeabilisierung, da die
11
Peptide komplett die LPS-gebundenen divalenten Kationen ersetzen, die die
Struktur der Membran stabilisieren (Hancock 1999).
Die LPS-bindende Kapazität der antimikrobiellen Peptide ist wichtig für die
klinischen Vorteile gegenüber klassischen Antibiotika, da sie eine Endotoxämie
verhindert (Gough 1996).
Die Selektivität der antimikrobiellen Peptide besteht in der unterschiedlichen
Membranzusammensetzung von höheren Eukaryonten und Mikroben. Die
äußere
Membran
Phospholipiden,
wie
höherer
Eukaryonten
Phosphatidylcholin
ist
und
aus
elektrisch
Sphingomyelin,
neutralen
aufgebaut,
während bakterielle Membranen negativ geladenes Phosphatidylglycerol und
Cardiolipin besitzen (Matsuzaki 1999). Ein anderer Unterschied ist der Mangel
an Cholesterol in der bakteriellen Membran. Diese Parameter scheinen wichtig
für die Selektivität antimikrobieller Peptide zu sein (Andreu et al 1998).
Einige Peptide töten Bakterien, ohne die Membran zu permeabilisieren. Sie
penetrieren Zellen und interagieren mit physiologischen Prozessen. Z.B.
können Defensine Einzelstrang-DNA aufbrechen (Bateman et al 1991).
Defensine und Histatine töten Pilze durch nichtlytische Freisetzung zellulären
ATPs, welches sich anschließend an mutmaßliche purinerge Rezeptoren bindet
und den zytotoxischen Weg aktiviert (Edgerton et al 2000). Defensine
verhindern die Infektfähigkeit einiger Viren (Daher et al 1986, Aboudy et al
1994). Dieser Effekt wird durch das Binden des Peptids an die virale Hülle
verursacht, während analog dazu unbehüllte Viren in ihrem infektiösen Potential
nicht beeinflusst werden (Kamysz et al 2003).
1.3.2 Nicht-antimikrobielle Funktionen
AMPs werden aufgrund ihrer membranpermeabilisierenden Eigenschaften für
ein
weites
Mikrobenspektrum
als
Effektormoleküle
dem
angeborenen
Immunsystem zugeordnet. Neben ihrer direkten antimikrobiellen Merkmale
können diese Peptide Komponenten des angeborenen Immunsystems
modellieren (Kamysz et al 2003). Defensine und PR-39 wirken als Chemokine
für Monocyten und Neutrophile (Territo et al 1989; Huang et al 1997). Defensine
erhöhen die antigenspezifische Immunantwort, indem sie die Produktion von
12
Lymphokinen induzieren, welche die adaptive Immunantwort unterstützen
(Kamysz et al 2003). Außerdem beeinflussen sie die Produktion verschiedener
Zytokine.
Defensine können an den CCR6 Chemokin-Rezeptor binden und andere CCR6
Liganden kompetitiv hemmen. Die mit CCR6 beladenen Zellen stellen eine
chemotaktische Antwort zu den Defensinen dar (Yang 1999). Defensine
induzieren die Migration humaner natürlicher T-Zellen und unreifer dendritischer
Zellen (Yang 2000b). Die chemotaktische Aktivität der Defensine wird generell
bei Konzentrationen beobachtet, die nicht bakterizid sind.
In Monozyten stimulieren Defensine die Expression von TNF-alpha und IL-1
(Chaly et al 2000), während sie in Lungenepithelzellen die Expression von IL-8
erhöhen (van Wetering et al 1997).
AMPs spielen auch eine Rolle bei der Angiogenese und der Wundheilung
(Gennaro et al 2002) und können mitogene Eigenschaften aufweisen (Murphy
et al 1993). So stimulieren Defensine das Wachstum von Fibroblasten und
Epithelzellen in vitro. Aus diesem Grund ist die effektive Konzentration der
Defensine vergleichbar mit der erwarteten Konzentration während der
Wundheilung in vivo. Diese Daten legen nahe, dass Defensine eine Doppelrolle
bei Hautverletzungen spielen. Neben der Vorbeugung mikrobieller Infektionen
können sie auch den Wundheilungsprozess induzieren. Defensine, die eine
Konzentration von 10 µg/ml nicht überschritten, steigerten die Proliferation von
A549 Lungenepithelzellen (Aarbiou et al 2002). Biopsien von renalem
Karzinomgewebe zeigten die intrazelluläre Expression von diesen Defensinen
und in vitro wurde demonstriert, dass Defensine in renalen Karzinomzelllinien
bei einer Konzentration von nicht mehr als 25 µg/ml die DNA Synthese
stimulierten. Dieses mag eine mögliche Rolle der α-Defensine in der
Proliferation bei normalen oder Tumorzellen in der Niere spielen (Müller et al
2002).
1.4 Bronchialkarzinom
Mit 25% aller Karzinome ist das Bronchialkarzinom weltweit beim Mann der
häufigste Tumor, der zum Tode führt. Bei der Frau steht er an zweiter Stelle der
13
Krebstodesursache. Das Bronchialkarzinom ist für 95-98% aller bösartigen
Tumoren der Lunge verantwortlich.
Histologisch
werden
Bronchialkarzinome
nach
der
WHO-Klassifikation
eingeteilt. Klinisch ist die Unterteilung in kleinzellige Karzinome (SCLC) und
nichtkleinzellige Karzinome (NSCLC) für Therapie und Prognose von
besonderer Bedeutung. Es kommen aber häufig Kombinationen aus den
verschiedenen Tumortypen vor.
Beim SCLC liegt die Häufigkeit bei 20%, es hat die schlechteste Prognose, da
es in 80% der Fälle bei Diagnosestellung schon weit fortgeschritten und
metastasiert ist. Das SCLC tritt vorwiegend im Bereich der zentralen und
intermediären Segment- und Segmentbronchien auf. Diese Tumoren sind durch
ein
manschettenförmiges,
Wachstumsmuster
intramural-bronchiales
gekennzeichnet.
Kleinzellige
und
Karzinome
perivasales
sind
nach
Stromadestruktion durch eine frühzeitige Intravasation mit Anschluss an die
Lymph- und Blutgefäße und eine dadurch bedingte frühzeitige Entwicklung von
Lymphknotenmetastasen bzw. hämatogener Metastasierung charakterisiert.
Das histomorphologische Bild wird von kleinen, nacktkernig erscheinenden,
zytoplasmaarmen Zellen mit hyperchromatischen pleomorphen Kernen geprägt.
Zell- und Kerndurchmesser variieren zwischen 4 und 9 µm.
Die WHO-Klassifikation von 1999 unterscheidet bei den epithelialen bösartigen
Neubildungen 4 Hauptgruppen nichtkleinzelliger Karzinome:
-
Plattenepithelkarzinome
-
Adenokarzinome
-
Großzellige Karzinome
-
Kombinierte adenosquamöse Karzinome
Plattenepithelkarzinome
sind
mit
30-40%
aller
Bronchialkarzinome
die
häufigsten. Sie entwickeln sich als isolierte Rundherde in der Peripherie oder im
Bereich der Segment- und Subsegmentbronchien als stenosierend wachsende
Tumoren. Besonders bei Patienten im höheren Lebensalter zeigen sich im
fortgeschrittenen Tumorstadium häufig Nekrosen und ausgedehnte Kavernen.
Mikroskopisch zeichnen sich die Karzinome durch den mehr oder weniger
deutlichen Aufbau von epidermisähnlichen Epithelverbänden aus.
14
Das Adenokarzinom tritt vor allem in der Lungenperipherie auf. Als Folge
ausgeprägter Regressionsphänomene im Bereich der Blutgefäße der zentralen
Stromateile und bei offensichtlich besonderer angioinvasiver Tendenz der
Tumorzellen sind häufig zentrale Nekrosen und Vernarbungen anzutreffen.
Mikroskopisch erkennt man atypische drüsenähnliche Strukturen. In diesen
atypischen
Zellen
können
histochemisch
Schleimsubstanzen
oder
Sekretvakuolen nachgewiesen werden, auch mehrkernige Riesenzellen treten
auf.
Das großzellige Karzinom tritt in weniger als 10% der Fälle auf. Meist handelt
es sich um Tumoren mit führender plattenepithelialer oder adenoider
Komponente, in denen herdförmig auch gehäuft mehrkernige Riesenzellen
entwickelt sind.
(Thieme Innere Medizin, Ukena, Schlimmer et Sybrecht; Herold Innere Medizin;
Classen, Diehl, Kochsiek Innere Medizin)
1.5 Tumorangiogenese
Angiogenese und Formation neugebildeter Gefäße im Tumor sind entscheidend
für seine Entwicklung und Progression. Die Gefäße zeigen inkomplette und
unreife Strukturen mit veränderter Funktion. Die Morphologie variiert in
verschiedenen Tumoren von vorläufigen Endothelzellproliferationen bis hin zu
großen Gefäßen mit dicker Wand ohne Muskelschicht. Es zeigt sich ein
unkontrolliertes,
nichtlimitiertes
Wachstum
und
Hypertrophie
der
Endothelzellen. Hypoxie ist ein wichtiger Stimulus in der Tumorangiogenese. Im
Tumorgewebe
bewirkt
Hypoxie
Zelltod
und
induziert
die
Expression
verschiedener Angiogenesefaktoren (Bian et al 2004). Auch Chemokine und
ihre Rezeptoren tragen durch direkte Aktivierung von Tumorzellen und
Förderung der Angiogenese via Endothelzellen zum Tumorwachstum bei
(Balkwill 2004; Wang et al 1998).
LL-37 induziert die Angio- und Arteriogenese. Die angiogene Aktivität von LL-37
wird durch eine direkte Aktion der endothelialen Zellen vermittelt (Koczulla et al
2003).
15
1.5.1 Interaktion von AMPs und Tumorzellen
Wie schon gesagt, stammt die grundsätzliche Aktivität der antimikrobiellen
Peptide von ihrer Möglichkeit, mit negativ geladenen Molekülen ihrer
Zielmembran
zu
interagieren.
Tumorzellen
können
sich
in
ihrer
Membranzusammensetzung von nichttransformierten Zellen unterscheiden. In
der Membran von Melanom- und Karzinomzellen wurde ein 3-7-fach höherer
Phosphatidylseringehalt im Vergleich zu normalen humanen Keratinocyten
gefunden (Utsugi et al 1991). Solche Differenzen können eine höhere
Anfälligkeit der Tumorzellen für membranpermeabilisierende Peptide ergeben.
Defensine induzieren Tumorzelllyse in Abhängigkeit von ihrer Konzentration.
Dieser Effekt wird nach 3 Stunden mit einem Plateau zwischen 8-14 Stunden
beobachtet.
Allerdings
wird
lytische
Aktivität
durch
Serum
gehemmt.
Peptidneutralisation und Abbau in extrazellulären Kompartimenten kann ein
Problem in ihrem klinischen Nutzen darstellen (Kamysz et al 2003). Ersetzen
der L-Aminosäuren durch ihre D-Isomere oder Modifikationen von Peptidenden
kann dem Abbau vorbeugen und die tumorizidale Aktivität insgesamt erhöhen
(Moore et al 1994). Der Verlust der Aktivität könnte durch Insertion der Gene,
die für AMPs kodieren, direkt in die Tumorzelle vermieden werden.
Tumorwachstum wurde auch reduziert oder ganz gehemmt, wenn diese
transformierten Zellen in Nacktmäuse gespritzt wurden (Winder et al 1998).
Über Expression antimikrobieller Peptide wurde bei mehreren Tumorzelllinien
berichtet, wo sie abhängig von ihrer Konzentration mitogene oder nekrotische
Aktivität ausüben (Müller et al 2002).
hBD-1 wird in Nierenzell- und Prostatakarzinomen signifikant herunterreguliert
(Donald et al 2003). Nierenzellkarzinome haben eine 7-fach niedrigere
Expression von hBD-1 als gesundes renales Gewebe (Young et al 2001).
Außerdem treten im Nierenzellkarzinom am chromosomalen Ort von hBD-1
(8p23) Deletionen mit nachfolgendem Heterozygotieverlust innerhalb der
schmalsten überlappenden Region auf (Schullerus et al 1999).
hBD-2 wird in oralem Squamosazellkarzinom exprimiert (Yoshimoto et al 2003;
Sawaki et al 2002). In oralem mukoepidermoid Karzinomgewebe wurden auch
HNP und hBD-2 nachgewiesen (Mizukawa et al 2001).
16
HNP-1, -2, und -3 sind nicht nur zytotoxische Peptide mit begrenzter Expression
in Neutrophilen und in einigen Lymphozyten, sondern werden auch in
Nierenzellkarzinomen ausgeschüttet (Müller et al 2002). In physiologischen
Konzentrationen stimulierten HNP-1, -2 und -3 die Zellproliferation in selektiven
Nierenzellkarzinomzelllinien in vitro, aber in hohen Konzentrationen waren sie
für alle Nierenzellkarzinomzelllinien zytotoxisch.
Welche biologische Aktivität AMPs ausüben, ist häufig abhängig von ihrer
Konzentration,
z.B.
beeinflussen
sie
in
niedriger
Konzentration
die
Signaltransduktion oder Proliferation und in höherer die Tumorzelllyse und Lyse
von Mikroben (Kamysz et al 2003).
1.6 Fragestellung
Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, die Expression antimikrobieller Peptide
qualitativ und quantitativ in Bronchialkarzinomen nachzuweisen. AMPs spielen
nicht nur in der Abwehr von Organismen eine Rolle, sondern sind auch
Mediatoren in Entzündungen und beteiligt an Wundheilung, Chemotaxis und
Angiogenese. Sie werden u. a. im Atemwegsepithel und in Abwehrzellen
exprimiert.
In verschiedenen Studien konnten AMPs auch in Tumoren nachgewiesen
werden. Insgesamt ist die Rolle von AMPs in Tumoren noch unklar und es gibt
einige widersprüchliche Daten. Die Vielzahl der bisher isolierten AMPs deutet
jedoch auf ein komplexes Wirkungssystem hin.
In dieser Arbeit wurden Gewebeschnitte von verschiedenen Lungenkarzinomen
immunhistochemisch auf hBD-1, hBD-2, LL-37 und FPRL-1, den LL-37Rezeptor, untersucht und deren Auftreten in nichtkleinzelligen und kleinzelligen
Karzinomen quantifiziert. Außerdem wurden die Tumoren noch auf den von
Willebrand Faktor, Ki-67, HLA und FPRL-1 getestet und diese Ergebnisse mit
denen der AMPs verglichen.
17
2. Material und Methoden
2.1 Geräte
-
Mikroskop (Leitz Laborlux12)
-
Objektträger (Fa. Menzel GmbH / Braunschweig)
-
Deckglas (Fa. Menzel GmbH / Braunschweig)
-
Microtom (Leica SM 2000R)
-
Brutschrank (Fa. Joucon EB 170 ELEC SANS THERM)
-
Mikrowelle (AEG Micromat Duo)
2.2 Chemikalien
-
Xylol
-
Ethanol (unvergällt)
-
3% H2O2
-
Aqua dest.
-
Mayer’s Hämalaun
2.3 Lösungen und Puffer
-
PBST: 200 mg/l KCl; 200 mg/l KH2PO4; 8 g/l NaCl; 1,15 g/l Na2HPO4;
0,05% Tween
-
Ethanol (100%, 96%, 80% 70% und 50%): unvergälltes Ethanol wurde
durch Verdünnung mit Aqua dest. auf die entsprechende Konzentration
eingestellt
18
2.4 Untersuchungsmaterial
Es wurden 53 verschiedene nichtkleinzellige Bronchialtumoren bearbeitet,
davon waren 18 Plattenepithelkarzinome, 26 Adenokarzinome, 5 großzellige
Karzinome und 4 adenosquamöse Karzinome. Außerdem wurden noch 5
kleinzellige Bronchialtumoren untersucht.
Die Tumoren stammten aus der Pathologie der Philipps-Universität Marburg
und waren von Patienten, die im Uniklinikum operiert wurden, sowie von einer
Studie aus Hamburg. Die retrospektive Auswertung des Untersuchungsgutes
wurde von der Ethikkommission Marburg genehmigt.
2.5 Immunhistochemischer Nachweis
Die Tumorgewebe waren in Paraffinblöcke eingebettet. Von den Blöcken
wurden am Mikrotom 3 µm dicke Schnitte angefertigt. Die Schnitte wurden auf
einen Objektträger aufgebracht und über Nacht bei 37° C getrocknet.
Die Schnitte wurden entparaffiniert, indem sie zwei mal zehn Minuten in Xylol
getaucht wurden. Darauf folgte das Rehydrieren in absteigender Alkoholreihe
mit 100%, 96%, 80%, 70% und 50% Ethanol. Die Schnitte wurden kurz in Aqua
dest. getaucht, danach kamen sie 5 Minuten in 3% H202 in Aqua dest., um die
endogene Peroxidase zu eliminieren. Es folgte wieder Aqua dest. und
anschließend phosphatgepufferte Salzlösung mit Tween (PBST).
Die immunhistochemische Untersuchung wurde mit dem Histostain-Plus Kit von
Zymed durchgeführt. Dabei wurde darauf geachtet, dass die Gewebeschnitte
nie austrockneten. Die Präparate wurden für 10 Minuten mit 2 Tropfen (100 µl)
von der Serum-Blocklösung behandelt, um unspezifische Hintergrundfärbung
zu reduzieren. Nach dem Entfernen der Lösung folgte die Gabe des ersten
Antikörpers auf die Schnitte mit je 100 µl. Als Antikörper gegen humanes βDefensin 1 (hBD-1), humanes β-Defensin 2 (hBD-2), Cathelicidin (LL-37),
formyl peptide receptor like 1 (FPRL 1), sowie Ki-67 , HLA und den von
Willebrand Faktor (vWF) wurden verwendet:
19
Antikörper
Produkte, Typ
anti-humanes
Polyklonales Antiserum im Hasen gegen rekombi-
β-Defensin 1 (hBD-1)
nantes hBD-1
anti-humanes
Polyklonales Antiserum im Hasen gegen rekombi-
β-Defensin 2 (hBD-2)
nantes hBD-2
anti-Cathelizidin
Polyklonales Antiserum im Hasen gegen rekombi-
(LL-37)
nantes LL-37
anti-formyl peptide
Polyklonales
receptor like1 (FPRL-1)
Serhan (Boston, USA)
anti-von Willebrand
Rabbit Anti-Human von Willebrand Factor Code No.
Faktor (vWF)
A 0082 (DakoCytomation)
anti-Ki-67
Clone Ki-S5 M7187 (DakoCytomation)
anti-HLA
Clone CR3/43 M0775 (DakoCytomation)
Antiserum,
bezogen
von
Charles
Antikörper gegen hBD-1 und hBD-2 wurden 1:100, gegen LL-37 1:50 und
gegen FPRL-1, vWF, HLA und Ki-67 1:200 in PBS verdünnt. Nach einer
Inkubationszeit von 60 Minuten wurden die Schnitte für drei mal 5 Minuten mit
PBST unter leichtem Schütteln gewaschen. Vom biotinbehandelten zweiten
Antikörper (Reagens B vom Histostain-Plus Kit), der als Verbindungsstück
zwischen erstem Antikörper und dem Streptavidin-Peroxidase Konjugat diente,
wurden 2 Tropfen (100 µl) für 10 Minuten aufgetragen. Nach dreimaligem
Waschen mit PBST für je 5 Minuten wurden die Schnitte für 10 Minuten mit 2
Tropfen (100 µl) Streptavidin-Peroxidase Konjugat behandelt. Dieses bindet an
den Biotinrest des zweiten Antikörpers. Es folgte wieder das Waschen mit
PBST für drei mal 5 Minuten. Jeder Schnitt wurde dann für 10 Minuten mit 2
Tropfen (100 µl) AEC, der Substrat-Chromogen-Lösung behandelt. Die
Peroxidase katalysiert das Substrat und konvertiert das Chromogen zu einer
roten Ablagerung, welches die Lokalisation der Antikörper demonstriert. Darauf
folgte noch ein Waschen mit Aqua dest.. Zur Gegenfärbung wurden die Schnitte
für 30 Sekunden in Hämalaun getaucht, danach für 15 Minuten unter
Leitungswasser gespült und mit Aquatex eingedeckt.
20
2.6 Kontrollen
Bei allen immunhistochemischen Färbungen wurden parallel positive und
negative Kontrollen mitgeführt, um die Qualität des Nachweises der
verschiedenen Antikörper zu überprüfen. Zur Kontrolle des Färbeprozesses
diente der Antikörper gegen den vWF, da dieser stets positiv war. Als
Negativkontrolle
dienten
histologische
Schnitte,
welche
statt
mit
dem
Primärantikörper mit PBST unter ansonsten gleichen Bedingungen inkubiert
wurden.
2.7 Quantitative Auswertung der Färberesultate
Die Schnitte wurden mit Hilfe eines Mikroskops bei einer Vergrößerung von
10 x 20 ausgewertet, ob sich eine Anfärbung zeigt. An vier verschiedenen
Stellen wurden in vier Feldern durch ein Gitterraster am Objektiv (0,025cm2) die
Anzahl der Tumorzellen insgesamt und die angefärbten Tumorzellen gezählt.
Außerdem wurden die Tumorschnitte nach ihrer Intensität von 0 bis 3 eingeteilt.
Dabei war 0 keine Färbung, 1 geringe, 2 mittlere und 3 sehr starke Färbung.
Beim vWF wurden ausgewertet, wie viele Gefäße im Tumor vorkommen. Bei
positiven Schnitten wurden an 4 x 4 unabhängigen Stellen die Gefäße im
Tumor pro Gitterrasterausschnitt gezählt.
Die Negativ-Kontrollen zeigten kein Signal.
2.8 Statistik
Der Anteil der LL-37-, hBD-1-, hBD-2-, FPRL-1-, Ki-67- und HLA-positiven
Zellen an der Gesamttumorzellzahl wurde in Prozent als LL-37-, hBD-1-, hBD2-, FPRL-1-, Ki-67- und HLA-Index angegeben. Es wurden der Mittelwert sowie
die Standardabweichung der Färbeindices in den unterschiedlichen Gruppen
berechnet. Mit Hilfe des Friedmann Tests und des Chi2-Tests wurden die
unabhängigen
Gruppen
miteinander
21
verglichen
und
auf
signifikante
Unterschiede
untersucht.
Als
statistisch
angesehen.
22
signifikant
wurde
ein
p<0,05
3. Ergebnisse
3.1 Humane β-Defensine werden in NSCLC exprimiert
In früheren Studien wurden humane β-Defensine im Gastrointestinaltrakt
(O’Neil et al 1999), Respirationstrakt (Singh et al 1998; Harder et al 2000),
Urogenitaltrakt und in der Haut (Harder et al 1997) nachgewiesen. In dieser
Arbeit wurde untersucht, ob hBD-1 und hBD-2 in Bronchialtumoren vorkommen.
Dabei zeigte sich, dass sich bei hBD-1 in 91% der bearbeiteten NSCLCSchnitte Tumorzellen anfärbten, wohingegen sich bei hBD-2 Tumorzellen in nur
38% der Schnitte färbten. Positive Tumorzellen waren meist diffus im gesamten
Tumor nachweisbar, bei wenigen Schnitten zeigten sich punktuell positive
Zellnester (Abb. 1).
Bei den positiven NSCLC-Schnitten färbten sich mit den Antikörpern gegen βDefensine knapp ein Drittel der Tumorzellen an (hBD-1 64% +/-28% SD, hBD-2
61% +/-32% SD) (Abb. 2).
Bei hBD-1 hatten 36% aller Schnitte eine sehr starke, 32% eine mittlere und
23% eine geringe Färbung. Wohingegen sich bei hBD-2 nur 4% der Schnitte
stark färbten, 19% mittel und 17% gering (Abb. 4).
23
A
B
C
D
E
F
G
H
50 µm
50 µm
Abb. 1: Nachweis von hBD-1 und hBD-2 in Bronchialtumoren. (A, B, D: hBD-1 in
Plattenepithelkarzinomen. C: hBD-1 in adenosquamösem Karzinom. E – H: hBD-2 in
Plattenepithelkarzinom. Vergrößerung bei A, E, F, H 200-fach; bei B, C, D, G 400-fach)
24
3.2 Cathelizidine werden in NSCLC exprimiert
Wir untersuchten, ob LL-37 in Bronchialtumoren nachweisbar ist, da dieses
Peptid eine Rolle als Wachstumsfaktoren spielen kann und in anderen
Tumoren,
wie
beispielsweise
in
Mammakarzinomen
und
oralen
Squamosazelltumoren, nachgewiesen wurde (Heilborn et al 2004; Mizukawa et
al 2000).
Die Ergebnisse (Abb. 2) zeigten, dass 53% der NSCLC-Schnitte eine
Anfärbung der Tumorzellen aufwiesen. Bei den positiven Tumoren färbten sich
im Durchschnitt 55% +/-32% SD der Tumorzellen an. Die positiven Zellen
waren diffus im gesamten Tumor nachweisbar.
15% aller Schnitte zeigten eine geringe Färbung, 26% eine mittlere und 11%
eine starke Färbung (Abb. 4).
A
B
100%
Anteil an angefärbten Tumorenzellen/Tumor
angefärbte
Tumorzellen/Tumor
angefärbte Tumoren
angefärbteTumoren bei AMPs
80%
60%
40%
20%
0%
1
hBD-1
2
hBD-2
3
LL-37
100%
80%
60%
40%
20%
0%
1
4
FPRL-1
hBD-1
2
3
hBD-2
Abb. 2: Nachweis von AMPs in Bronchialtumoren (A) und Anteil angefärbter Zellen (B)
3.3 FPRL-1, der Rezeptor für LL-37, wird in NSCLC exprimiert
Da FPRL-1 LL-37 als Rezeptor zur Aktivierung von Neutrophilen, Monozyten
und T-Zellen dient, stellte sich die Frage, ob FPRL-1 in Tumorgewebe der
Lunge vorhanden ist und ob ein Zusammenhang zu LL-37 besteht, so dass LL37, das von Tumorzellen abgegeben wird, die Aktivität des Tumors direkt über
FPRL-1 beeinflusst.
Die Ergebnisse zeigten, dass FPRL-1 in 80% der untersuchten NSCLC-Schnitte
anfärbbar war (Abb.3).
25
LL-37
In 27 % wiesen die Tumorschnitte eine starke Intensität auf, in 31% eine
mittlere und in 22% eine geringe.
Beim Vergleich des Vorkommens von LL-37 und FPRL-1 waren von 51
bearbeiteten Schnitten 26 Tumorschnitte bei beiden Antikörpern positiv. Wenn
LL-37 positiv ist, ist FPRL-1 zu 96% auch positiv (26 von 27 Schnitten).
Umgekehrt ist LL-37 zu 90% negativ, wenn FPRL-1 negativ ist (9 von 10
Schnitten). Es besteht ein hochsignifikanter Zusammenhang im Auftreten von
LL-37 und FPRL-1 (Fisher's exact test p=0,004; Tab. 1).
Tab. 1: Auftreten von FPRL-1 und LL-37 in Bronchialtumoren
LL-37
FPRL-1
positiv
negativ
gesamt
positiv
26
15
41
negativ
1
9
10
gesamt
27
24
51
26
A
B
50µm
50 µm
C
D
50µm
50 µm
E
F
50µm
100 µm
G
H
100 µm
50µm
Abb. 3: Nachweis von LL-37 und FPRL-1 in verschiedenen Bronchialtumoren. (A, B, D: LL-37
in Plattenepithelkarzinomen. C: LL-37 im adenosquamösen Karzinom E, F: FPRL-1 in
Plattenepithelkarzinomen, G, H: FPRL-1 in Adenokarzinomen. Vergrößerung bei A, B, F, H 200fach; C, D 400-fach; E, G 100-fach)
27
Verteilung der Intensität bei NSCLS
70%
60%
50%
0
40%
1
30%
2
20%
3
10%
0%
LL-37
hBD-1
hBD-2
FPRL-1
Ki-67
HLA
AMP
Abb. 4: Intensität des Färbung von AMP in Bronchialtumoren in drei Intensitätsstufen, 0 =
Keine, 3 = sehr starke Färbung.
3.4 Der von Willebrand Faktor stellt Gefäßendothel in NSCLC dar
Wir untersuchten die Expression des vWF, der in Gefäßendothelien vorhanden
ist, da LL-37 Angiogenese induziert und sich die Frage stellte, inwieweit dieser
Prozess auch in NSCLC stattfindet. Es wurde gezeigt, dass Gefäße in NSCLC
vorkommen. In 57% der Tumorenschnitte fanden sich Strukturen, die vWFpositiv waren. Im Durchschnitt waren in positiven Tumorschnitten 9 +/- 6
angefärbte Gefäße pro Gesichtsfeld darstellbar.
Vergleicht man die Expression des vWF mit der von AMPs, so zeigt sich, dass
bei positivem LL-37 mehr Gefäße pro Gesichtsfeld auftreten als bei negativen
LL-37 Tumorschnitten. Im Vergleich dazu ist es bei hBD-1 umgekehrt, während
hBD-2 fast keinen Unterschied in der Gefäßanzahl zeigt. Die Ergebnisse waren
jedoch nicht signifikant (LL-37: p = 0,232; hBD-1: p = 0,872; hBD-2: p = 0,698)
Tab. 2: Vergleich vWF (durchschnittliche Gefäßzahl) und Auftreten von AMPs
LL-37
vWF
hBD-1
hBD-2
pos
neg
pos
neg
pos
neg
5,96
4,00
4,74
7,81
5,17
4,95
28
3.5 Der Proliferationsfaktor Ki-67
Hier wurde untersucht, ob ein Zusammenhang zwischen der Expression des
Proliferationsfaktor Ki-67 und der Expression der AMPs besteht, da auch AMPs
an der Regulation der Epithelzellproliferation beteiligt sind (Heilborn et al 2003).
Bei Ki-67 sind in 87% der Tumorschnitte positive Tumorzellen nachweisbar
(Abb. 5). Von den positiven Schnitten werden im Durchschnitt 11% ± 9% SD
der Tumorzellen angefärbt.
Vergleicht man Ki-67 mit den AMPs, so zeigt sich, dass Ki-67 bei positivem
AMP-Ergebnis immer eine höhere Anzahl positiver Tumorzellen pro Tumor
aufweist als bei einem negativen AMP-Ergebnis (Tab. 3). hBD-1 weist den
größten Unterschied auf, der auch signifikant ist (p < 0,001; LL-37: p = 0,732;
hBD-2 p = 0,398). Dieser Wert deutet darauf hin, dass AMPs an der
Tumorproliferation beteiligt sein können.
3.6 AMPs scheinen über HLA die Tumorprogression zu fördern
Es wurde untersucht, ob ein Zusammenhang zwischen der Expression von
AMPs und HLA, das als Nachweis für dendritische Zellen (DC) verwendet
wurde, besteht. DC spielen eine Rolle in der Initiation der primären
antigenspezifischen Immunantwort und vermitteln auch die Vaskularisierung
von Tumoren (Conejo-Garcia et al 2004).
HLA ist in 98% der Schnitte im Tumor nachweisbar (Abb. 5). Dabei färben sich
bei positiven Schnitten durchschnittlich 13% ± 16% SD der Tumorzellen an.
Vergleicht man HLA mit den AMPs ergibt sich bei einem positiven AMPErgebnis für HLA immer eine höhere Anzahl angefärbter Tumorzellen als bei
negativem AMP-Ergebnis (Tab 3). Auch hier zeigt hBD-1 einen signifikanten
Unterschied (hBD-1: p < 0,001; hBD-2: p = 0,398; LL-37: p = 0,655).
29
Tab. 3: Vergleich AMP und HLA
LL-37
hBD-1
hBD-2
pos
neg
pos
neg
pos
neg
Ki-67
11%
8%
10%
2%
11%
8%
HLA
14%
11%
13%
4%
15%
11%
3.7 AMPs werden nicht in kleinzellige Bronchialtumoren exprimiert
Bei den SCLC zeigte sich in keinem der untersuchten Schnitte eine Färbung.
30
A
B
C
D
E
F
200µm
G
H
50µm
Abb. 5: Darstellung des von Willebrand Faktor, KI-67 und HLA in Bronchialtumoren. (A: vWF im
Plattenepithelkarzinom. B: vWF im Adenokarzinom. C, D: vWF im großzelligen Karzinom. E – G: KI-67
in Plattenepithelkarzinomen. H: HLA im Adenokarzinom. Vergrößerung bei B, C, D, F, G H 200-fach;
bei A, E 100-fach)
31
4. Diskussion
Die wesentliche Erkenntnis dieser Arbeit ist, dass Bronchialkarzinome des
Menschen
AMPs
produzieren.
Alle
untersuchten
AMPs
sind
in
unterschiedlichem Ausmaß in NSCLC exprimiert. Die Produktion von AMPs
korrelierte mit der Expression von HLA und Ki-67.
4.1 Expression von AMPs in der Lunge
Es ist bekannt, dass LL-37/hCAP-18 im normalen Respirationstrakt in serösen
und mukösen Drüsen und im Oberflächenepithel der Luftwege exprimiert wird,
wo es eine breite antimikrobielle Aktivität am Oberflächenepithel aufweist (Bals
et al 1998).
Die mRNA von hBD-1 und hBD-2 wird auch in der gesunden Lunge in
Oberflächen- und submucosalen Drüsen des Epithels exprimiert (Bals et al
1998). Die Expression von hBD-2 wird durch Entzündungsmediatoren induziert,
wohingegen hBD-1 unabhängig von Entzündungen exprimiert (Singh et al
1998) und nicht durch Zytokine, Lipopolysaccharide oder Phorbolester induziert
wird (22,6 Zhao et al 1996). Goldman et al (1997) berichteten über eine starke
Expression von hBD-1 in einem trachealen Xenograft Modell, das keine
Exposition zu irgendeinem Entzündungsmediator aufwies.
4.2 Expression von AMPs in Tumoren
Da AMPs möglicherweise eine potentielle Rolle als Wachstumsfaktoren spielen,
stellte sich die Frage, inwieweit sie Einfluss auf Tumoren ausüben. In dieser
Arbeit konnten AMPs mittels Immunhistochemie in Bronchialkarzinomen
nachgewiesen werden. Dabei konnte hBD-1 in über 90% der untersuchten
Schnitte nachgewiesen werden. Bei positiven Schnitten waren in über der
Hälfte bis zwei Drittel der Zellen Antikörper gegen AMPs nachweisbar.
32
Auch andere Untersuchungen bestätigten eine Assoziation der AMPExpression mit dem Tumorwachstum.
Untersuchungen von hBD-1 und hBD-2 im Serum zeigten bei Patienten mit
Bronchialkarzinom höhere Konzentrationen als bei gesunden (Arimura et al
2004).
In
anderen
Tumoren
konnte
die
Expression
antimikrobieller
Peptide
nachgewiesen werden. In oralen Squamosazelltumoren und in oralen
Mucoepidermoidtumoren wurden hohe Konzentrationen von hBD-2 gefunden
(Mizukawa et al 2000, 2001; Sawaki et al 2002). In humanem Vulvaepithel
konnte
eine
höhere
Konzentration
von
hBD-3
bei
malignen
Zellen
nachgewiesen werden als bei gesunden (Shnitsar et al 2004). Humanes βDefensin-4 konnte in den meisten Ovarialkarzinomen mit starker Expression in
Tumorinseln nachgewiesen werden (Conejo-Garcia et al 2004). In Nieren- und
Prostatakarzinomen dagegen wurde geringere Mengen an β-Defensinen
gefunden als im gesunden Gewebe (Young et al 2001; Donald et al 2003).
Die Expression von LL-37 in Neutrophilen war signifikant niedriger bei Patienten
mit akuter myeloischer Leukämie, besonders bei jenen mit Infektionen. Auf der
Ebene der mRNA zeigte sich jedoch kein signifikanter Unterschied. Da LL-37
eine Rolle in der Abwehr spielt, kann der Mangel an LL-37 bei akuter
myeloischer Leukämie eine Erklärung für die Anfälligkeit für Infektionen sein (An
et al 2005).
Bei Mammakarzinomen wurde gezeigt, dass die LL-37-Expression nicht
einheitlich ist, da sich nicht alle Tumorzellen auf LL-37 anfärben ließen. Es
wurden aber deutlich positive Zellen angrenzend an Zellen ohne feststellbare
LL-37 mRNA und Protein gefunden. Der Grad der Expression variierte
bedeutend in allen Zellen aller Tumortypen (Heilborn et al 2004).
Nierenzellkarzinome zeigten eine siebenfach geringere Expression von βDefensingenen als gesundes Nierengewebe (Young et al 2001). Die hBD-1Expression nahm in malignen Epithelzellen von humanen Nierenzell- und
Prostatakarzinomen im Vergleich zu gesundem Gewebe ab. Auch konnte eine
direkte zytotoxische Aktivität von hBD-1 gegenüber Zellen nachgewiesen
werden (Donald et al 2003).
In Nierenzellkarzinomen stimulierten die humanen α-Defensine HNP-1, -2 und –
3 die Proliferation von Zelllinien in physiologischen Konzentrationen, in hohen
33
Konzentrationen
waren
sie
jedoch
für
alle
Nierenzellkarzinomzelllinien
zytotoxisch (Müller et al 2002).
4.3 Antimikrobielle Peptide sind potentielle Wachstumsfaktoren
AMPs scheinen eine wichtige Rolle für die Biologie von Tumoren zu spielen und
das Tumorwachstum sowie die Neovaskularisation zu unterstützen. In dieser
Arbeit konnten LL-37, hBD-1 und hBD-2 in NSCLC in unterschiedlichen
Anteilen an angefärbten Tumorzellen und in unterschiedlicher Anzahl an
positiven Versuchen nachgewiesen werden. Dieses weist darauf hin, dass
AMPs das Tumorwachstum beeinflussen. Humane Tumorzelllinien exprimieren
LL-37 in unterschiedlichen Anteilen. Exogene Applikation von LL-37 zu
Tumorzelllinien führt zu einer zunehmenden Proliferation und zum gesteigerten
Wachstum anheftungs-unabhängiger Kolonien (von Haussen et al 2007).
Heilborn et al (2004) nahmen nach verschiedenen Versuchen mit Brusttumoren
an, dass LL-37 das Tumorwachstum in Mammakarzinomen fördert. Die
hCAP18 Expression von high-grade Tumoren war signifikant höher als im
normalen Brustgewebe. Diese hCAP18/LL-37 Expression könnte einen
Wachstumsvorteil für diese Tumoren wiederspiegeln. So erfolgte eine
Transfektion der humanen Zelllinie HEK293 und HaCaT mit einem hCAP18
Expressionsvektor. Es konnte eine signifikant höhere Proliferationsrate der
transfizierten Zellen nachgewiesen werden (Heilborn et al 2004).
LL-37 stimuliert die Wundheilung in humanen Lungenepithelzellen, sowie die
Proliferation und Migration der Lungenepithelzellen (Shaykhiev et al 2005). LL37 reguliert auch die Reparatur von Hautwunden (Heilborn et al 2003).
hBD-2 könnte eine Rolle in Squamosazelltumoren spielen, da es dort wie auch
im angrenzenden gesunden Gewebe vorkommt, welches zu dem Schluss
führen könnte, dass hBD-2 zum Tod von normalen an Squamosazelltumoren
angrenzende Keratinocyten führt und so indirekt in der Multiplikation von
Tumorzellen assistiert (Yoshimoto et al 2003).
Auf der anderen Seite induziert hCAP18(109-135) in vitro in humanen oralen
Squamosazelltumoren Apoptose und mitochondriale Depolarisation in SAS-H1
34
Zellen, jedoch nicht in gesunden humanen gingivalen Fibroblasten und
humanen Keratinocytenzelllininen (Okumura et al 2004).
Da AMPs in der vorliegenden Arbeit in NSCLS nachgewiesen wurden, scheinen
sie am Tumorwachstum beteiligt zu sein.
Andere Autoren zeigten bei der Expression von AMPs in humanen Zellen einen
Antitumoreffekt. So führt die Expression von Cecropin in einigen Tumorzelllinien
zu einem kompletten Verlust oder zu einem reduzierten Tumorwachstum
(Winder et al 1998). Die transgene Expression des Cathelizidin PR-39 des
Schweins reduziert die Invasivität vom humanen hepatocellulären Karzinom
(Ohtake et al 1999).
Defensine in humanen Granulozyten induzierten Tumorzelllyse. Dieser Effekt
wurde nach 3 Stunden mit einem Plateau bei 8-14 Stunden beobachtet
(Kamysz et al 2003). In vitro wurde bei einer Inkubation von murinen
Teratokarzinomzellen mit Defensinen ihre Onkogenität in vivo reduziert
(Lichtenstein et al 1986).
Einige Autoren wiederum vermuten, dass die erhöhte AMP-Konzentration in
Karzinomen das Ergebnis von Infektionen oder der Stimulation durch Zytokine
sein könnte (Mizukawa et al 2000, 2001; Sawaki et al 2002). Durch die
Abnahme von LL-37 konnte bei Patienten mit akuter myeloischer Leukämie die
größere Infektanfälligkeit erklärt werden (An et al 2005).
4.4 FPRL-1 wird in NSCLC exprimiert
FPRL-1 dient LL-37 als Rezeptor zur Aktivierung von Neutrophilen, Monozyten
und T-Zellen (Yang et al 2000, Agerberth et al 2000).
In dieser Arbeit konnte der G-protein-gebundene, siebentransmembrane
Zellrezeptor FPRL-1 in Bronchialtumorgewebe nachgewiesen werden. Es
besteht ein signifikanter Zusammenhang mit der Expression von LL-37. LL-37
könnte die Aktivität von Tumorzellen direkt über FPRL-1 beeinflussen.
LL-37 stimuliert die Proliferation von Epithelzellen teilweise durch FPRL-1. Der
Proliferationseffekt von LL-37 nahm um 50% ab, wenn der Rezeptor mit
35
Pertussis-Toxin geblockt wurde (Heilborn et al 2004). Dieses weist darauf hin,
dass FPRL-1 beteiligt ist und LL-37 somit über einen autokrinen Effekt eine
Rolle im Tumorwachstum spielt.
4.5 Angiogenese im Tumor
Angiogenese ist die Voraussetzung für Tumorwachstum, -invasion und
Metastasierung (Vermeulen et al 1996). Verschiedene Studien untersuchten
den Zusammenhang zwischen Tumorzellproliferation und intratumoraler
Mikrogefäßdichte (Vermeulen et al 1995, Fox et al 1993, Mattern et al 1996).
Angiogenese beeinflusst Tumorwachstum durch den Perfusionseffekt und
durch parakrine Effekte der Endothelzellen auf Tumorzellen. Neugebildete
Gefäße schaffen die Möglichkeit, dass Tumorzellen in die Zirkulation eintreten
und so Fernmetastasen bilden (Vermeulen et al 1996). Die Zahl der
Mikrogefäße
und
Angiogenese
beeinflussen
die
Prognose
von
Lungenkarzinomen (Jin et al 2000). Das Zytoplasma von Bronchialkapillaren,
Venolen und Arteriolen und größeren Gefäßen der Lunge schüttet kontinuierlich
den vWF aus (Kawanami et al 2000). Die steigende Ausschüttung des vWF ist
mit Regeneration und Hypertrophie endothelialer Zellen nach Verletzung
verbunden (Reidy et al 1989). Angiogenese ist mit einer schlechten Prognose
bei NSCLC assoziiert (Shijubo et al 2000).
In dieser Arbeit konnten Gefäße im Tumor mit dem endothelialen Marker vWF
nachgewiesen werden. Dabei konnte jedoch beim Nachweis von LL-37, hBD-1
und hBD-2 kein signifikantes Ergebnis in Bezug auf die Gefäßdichte
nachgewiesen werden.
Ein neuer pathogener Mechanismus zur Unterstützung der Vaskulogenese in
Tumoren konnte beschrieben werden (Conejo-Garcia et al 2004). β-Defensine
und der vascular endothelial growth factor-A (Vegf-A) kooperieren, um die
Tumorvaskulogenese zu unterstützen. β-Defensine aktivieren dendritische ZellPrecursor mit CCR6 im Tumor. Vegf-A transformiert diese in endothelähnliche
Zellen, die in die Vaskulogenese und die Funktion als Promotor von
Tumorprogression verwickelt sind. Die Coexpression von Defb29 und Vegfa in
36
Tumoren von Mäusen förderte das Tumorwachstum durch die Akkumulation
von CD11c+ DC mit vaskulärer Kompetenz. Die Höhe dieser Coexpression
entspricht der von Defb4 und Vegfa in humanen Ovarialkarzinomen (ConejoGarcia et al 2004).
LL-37 induziert die Angiogenese durch FPRL-1. Das Peptid aktiviert direkt die
Endothelzellen, daraus resultiert eine Proliferation und Formation von
Gefäßstrukturen in Endothelzellen in Kultur (Koczulla et al 2003). Die Formation
neuer
Gefäße
ist
für
Gewebereparatur und Wundheilung
erforderlich
(Buschmann et al 2000; Carmeliet 2000). Die Zahl der Mikrogefäße, die in
primären Adenokarzinomen der Lunge gefunden wurde, zeigt eine positive
Korrelation mit Rückfall und Metastasen der Tumoren (Shibusa et al 1998;
Yuan et al 1995). In dieser Arbeit konnte kein signifikanter Zusammenhang
zwischen dem Nachweis von LL-37 und der Gefäßdichte nachgewiesen
werden.
4.6 AMPs sind mit erhöhter Zellproliferation in Bronchialkarzinomen
assoziiert
LL-37 spielt eine Rolle in der Epithelzellproliferation (Heilborn et al 2003). In
dieser Arbeit konnte bei Tumoren, die mit Ki-67 behandelt wurden, eine erhöhte
Anzahl positiver Tumorzellen nachgewiesen werden, wenn sie auch positiv auf
AMPs reagierten. Ein signifikanter Zusammenhang konnte zwischen dem
Vorkommen von hBD-1 und Ki-67 gezeigt werden.
Ki-67 ist in die Zellproliferationsregulation involviert und so ein etablierter
prognostischer Faktor für Lungenkarzinome (Martin et al 2004). Es besteht ein
Zusammenhang zwischen hoher Zellproliferationsrate und Tumoraggressivität
(Tubiana et al 1989). Die Expression von Ki-67 ist ein Faktor für eine schlechte
Überlebensprognose bei NSCLC (Martin et al 2004).
Wie der Zusammenhang zwischen AMPs und dem Proliferationsfaktor Ki-67
zeigt, ist LL-37 nicht nur in die Reepithelialisierung von Hautwunden und
chronischen Ulcera involviert (Heilborn et al 2003), sondern bewirkt auch in
Lungentumoren eine Proliferation.
37
4.7 AMPs fördern Vaskulogenese in Bronchialtumoren über dendritische
Zellen
Dendritischen Zellen (DC) vermitteln bei der Vaskularisierung von Tumoren
durch Kooperation mit β-Defensinen und Vegf-A. β-Defensine fördern so die
Tumorprogression (Conejo-Garcia et al 2004).
In der vorliegenden Arbeit wurde der Zusammenhang zwischen AMPs und DC
in Bronchialkarzinomen untersucht. Als Nachweis für DC wurde HLA
verwendet. Die Zahl HLA-positiver Zellen war signifikant höher, wenn die
Tumorschnitte bei LL-37, hBD-1 oder hBD-2 positiv waren. DC sind
antigenpräsentierenden Zellen (APC) und spielen eine Rolle in der Initiation der
primären antigenspezifischen Immunantwort (Banchereau et al 1998, Sallusto
et al 1999).
HLA wird nicht nur in Immunsystemzellen sondern auch in Epithelzellen
exprimiert (Hirschberg et al 1982, Concha et al 1995). Bronchialtumoren, die
HLA II exprimieren, gehören zu den gutdifferenzierten Epidermoid und
Adenokarzinomen, wohingegen in SCLC keine Expression stattfindet (Redondo
et al 1991). Dieses konnte in dieser Arbeit auch nachgewiesen werden. Bei
einer Anfärbung der NSCLC-Schnitte mit HLA-Antikörpern waren 98% der
Schnitte positiv. Es konnte ein signifikanter Zusammenhang zwischen dem
Vorkommen von hBD-1 und HLA in NSCLC gezeigt werden.
38
5. Zusammenfassung
Antimikrobielle Peptide (AMPs) sind Effektormoleküle des angeborenen
Immunsystems. Sie werden in Epithel- und Abwehrzellen exprimiert. AMPs
inaktivieren Mikroben und beeinflussen zelluläre Prozesse, wie Angiogenese,
Entzündungen und Zellwachtum. Daraus ergibt sich, dass AMPs auch eine
Rolle in der Biologie von Tumoren spielen können. Defensine und Cathelizidine
sind AMPs, die in der Lunge exprimiert werden und so möglicherweise auch in
Lungenkarzinomen. Ziel dieser Arbeit war, zu untersuchen, ob AMPs in
Lungenkarzinomen exprimiert werden.
Die Versuche erfolgten an nichtkleinzelligen (NSCLC) und kleinzelligen (SCLC)
Bronchialkarzinomschnitten mittels immunhistochemischer Methoden. Dabei
wurde die Farbreaktion der Antikörper LL-37, hBD-1, hBD-2, FPRL-1, Ki-67 und
HLA quantitativ und qualitativ ausgewertet. Die Arbeit zeigt, dass AMPs in
NSCLC exprimiert werden. hBD-1 wurde in 91%, hBD-2 in 38% und LL-37 in
55% nachgewiesen. In SCLC werden keine AMPs exprimiert.
Bei positivem Nachweis von LL-37, hBD-2 und vor allem hBD-1 konnte eine
vermehrte Anzahl von dendritischen Zellen (DC) sowie von Zellen mit dem
Proliferationsfaktor Ki-67 gezeigt werden.
In dieser Arbeit zeigt sich auch ein signifikanter Zusammenhang zwischen der
Expression von LL-37 und FPRL-1 in Bronchialtumoren.
Bei positivem Ergebnis von LL-37 konnten vermehrt Gefäße nachgewiesen
werden, während sich bei hBD-1 kein bzw. bei hBD-2 ein umgekehrtes
Ergebnis zeigte. Die Bildung von LL-37/hCAP-18 könnte die Tumorvaskularisation begünstigen, auch wenn das Ausmaß der Gefäßdichte nicht mit
der AMP-Expression assoziiert war. LL-37 könnte in zweifacher Weise das
Tumorwachstum fördern, einmal durch direkte Aktivierung von Tumorzellen
oder indirekt über die Gefäßproliferation.
Zusammenfassend konnte gezeigt werden, dass AMPs als Abwehrsubstanzen,
mit Funktion in Wundheilung und Gefäßwachstum, in Lungenkarzinomen
exprimiert werden und möglicherweise auch das Wachstum von Tumorzellen
beeinflussen.
39
6. Summary
Antimicroial peptides (AMPs) are effector molecules of the innate host defense
system. They are produced by epithelial and host defense cells. AMPs
inactivate microbes and, in addition, impact on cellular processes such as
angiogenesis, inflammation, or cell growth. These findings implicate a role of
AMPs in cancer biology. Defensins and cathelicidins are families of AMPs that
are expressed in the human lung and thus potentially also in epithelial lung
cancers. It has been the aim of this study to examine whether AMPs are
expressed in lung cancer.
Paraffin-embedded samples of human lung cancer were immunostained for LL37, hBD-1, hBD-2, FPRL-1, HLA, Ki-67 and vWF using polyclonal antibodies.
The results are analysed quantitative and qualitative. This study showes, that
AMPs are expressed in NSCLC. HBD-1 was detected in 91%, hBD-2 in 38%
and LL-37 in 55%. In SCLC there are not any expression.
If LL-37, hBD-1 and hBD-2 were positive, there were more dendritic cell and
cells with Ki-67.
This study shows a significant correlation between the expression of LL-37 and
FPRL-1 in lung carcinomas.
If LL-37 was positive, there were more vessels, whereas hBD-1 showed no and
hBD-2
a
reversed
result.
LL-37/hCAP-18
could
favour
the
tumour
vasculogenese, also there was no significance. The vascularisation could be by
a direct effect from FPRL-1 at the endothelial cells. LL-37 could support the
tumour growth in two ways: It could activate tumour cells direct or indirect
through vessel proliferation.
In summary, AMPs of the defensin and cathelicidin family are expressed in
human lung cancer. They potentially are involved in tumor generation and
growth.
40
7. Anhang
41
Literaturverzeichnis
Aarbiou J, Ertmann M van Wetering S, et al. Human neutrophil defensins
induce lung epithelial cell proliferation in vitro. J Leukoc Biol 2002;72:167-174
Abiko Y, Mitamura J, Nishimura M, et al. Pattern of expression of beta
defensins in oral squamous cell carcinoma. Cancer Lett 1999; 143:37-43
Aboudy Y, Mendelson E, Shalit I, et al. Activity of two synthetic amphiphilic
peptides and magainin-2 against herpes simplex virus types 1 and 2. Int J Pept
Protein Res 1994; 43:573-582
Agerberth B, Grunewald J, Castanos-Velez E, et al. Antibacterial components in
bronchoalveolar lavage fluid from healthy individuals and sarcoidosis patients.
Am J Respir Crit Care Med 1999;160:283-290
Agerberth B, Charo J, Werr J, et al. The human antimicrobial and chemotactic
peptides LL-37 and alph-defensins are expressed by specific lymphocyte and
monocyte populations. Blood 2000; 96:3086-3093
An LL, Ma XT, Yang YH, et al. Marked reduction of LL-37/hCAP-18, an
antimicrobial peptide, in patients with acute myeloid leukemia. Int J Hematol
2005; 81:45-47
Andreu D, Rivas L. Animal antimicrobial peptides: an overview. Biopolymers
1998;47:415-433
Arimura Y, Ashitani JI, Yanagi S, et al. Elevated serum β-defensins
concentrations in patients with lung cancer. Anticancer research 2004; 24:40514058
Balkwill F. Cancer and the chemokine network. Nar Rev Cancer 2004; 4:540550
Bals R, Wang X, Wu Z, et al. Human beta-derensin 2 is a salt-sensitive peptide
antibiotic expressed in human lung. J Clin Invest 1998; 102:874-80
Bals R, Goldman MJ, Wilson JM. Mouse β-defensin 1 is a salt-sensitive
antimicrobial peptide present in epithelia of the lung. Infect Immun 1998b;
66:1225-1232
Bals R, Wang X, Zasloff M, et al. The peptide antibiotic LL-37/CAP-18 is
expressed in epithelia of the human lung where it has broad antimicrobial
activity at the airway surface. Proc Natl Acad Sci USA 1998c; 95:9541-9546
Bals R, Weiner DJ, Meegalla RL, et al. Transfer of a cathelicidin peptide
antibiotic gene restores bacterial killing in a cystic fibrosis xenograft model. J
Clin Invest 1998d
42
Bals R, Weiner DJ, Moscioni A; et al. Augmentation of innate host defense by
expression of a cathelicidin antimicrobial peptide. Infect Immun 1999; 67:6084608
Bals R. Antimikrobielle Peptide und Peptidantibiotika. Med Klin 2000; 95:496502
Bals R, Wilson JM. Cathelicidin – a family of multifunctional antimicrobial
peptides. Cell Mol Life Sci 2003; 60:711-720
Banchereau J, Steinmann RM. Dendritic cells and the control of immunity.
Nature 1998; 392:245
Barnathan PS, Raghunath PN, Tomaszewski JE, et al. Immunohistochemical
localization of defensin in human coronary vessels. Am J Pathol 1997;
150:1009-1020
Bateman A, Singh A, Congote LF, et al. The effect of HP-1 and related
neutrophil granule peptides on DNA synthesis in HL-60 cells. Regul Pept 1991;
13:135-143
Bateman A, Singh A, Jothy S, et al. The levels and biologic action of the human
neutrophil granule peptide HP-1 in lung tumors. Peptides 1992; 13:133-139
Becker MN, Diamond G, Verghese MW, et al. CD 14-dependent
lipopolysaccharide-induced beta-defensin-2 expression in human
tracheobronchial epithelium. J Biol Chem 2000; 275:29731-29736
Bensch KW, Raida M, Magert H-J, et al. hBD-1: anovel b-defensin from human
plasma. FEBS Lett 1995; 368:331-5
Bevins CL, Jones DE, Dutra A, et al. Human enteric defensins genes:
chromosomal map position and a model for possible evolutionary relationships.
Genomics 1996; 31:95-106
Bian XW, Chen JH, Jiang XF, et al. Angiogenesis as an immunopharmacologic
target in inflammation and cance. Int Immunopharmacol 2004; 4: 1537-1547
Boman HG. Innate immunity and the normal microflora. Immunol Rev 2000;
173:5-16
Buschmann I, Schaper W. The pathophysiology of the collateral circulation
(arteriogenesis). J Pathol 2000;190:338-342
Carmeliet P Mechanisms of angiogenesis and arteriogenesis. Nat Med 2000;
6:389-395
Chaly YV, Paleolog EM, Kolesnikova TS et al. Neutrophil alpha-defensin human
neutrophil peptide modulates cytokine production in human monocytes and
adhesion molecule exprssion in endothelial cells. Eur Cytoline Netw 2000;
11:257-266
43
Charlet M, Chernysh S, Philippe H, et al. Innate immunity. Isolation of several
cysteine-rich antimicrobial peptides from the blood of a mollusc, Mytilus edulis.
J Bilo Chem1996; 271:21808-13
Concha A, Ruiz-Cabello F, Cabrera T, et al. Different patterns of HLA-DR
antigen expression in normal epithelium, hyperplastic and neoplastic malignant
lesions of the breast. European Journal of Immunogenetics 1995; 22:299
Conejo-Garcia JR, Benencia F, Courreges MC, et al. Tumor-infiltrating dendritic
cell precursors recruited by a β-defensin contribute to vasculogenesis under the
influence of Vegf-A. Nat Med 2004; 10:950-958
Cowland J, Johnsen A, Borregaard N. hCap-18, a cathelin/pro-bactenecin-like
protein of human neutrophil specific granules. FEBS Lett 1995; 368:173-176
Daher KA, Selsted ME, Lehrer RI. Direct inactivation of viruses by human
granulocyte defensins J Virol 1986; 60:1068-1074
Donald CD, Sun CQ, Lim SD, et al. Cancer-specific loss of β-defensin 1 in renal
and prostatic carcinomas. Lab Invest 2003; 83:501-505
Edgerton M Koshlukova SE, Araujo MW et al. Salivary histatin 5 and human
neutrophil defensin 1 kill Candida albicans via shared pathways. Antimicrob
Agents Chemother 2000;44:3310-3316
Fearon D, Locksley R. The instructive rolle of innate immunitiy in the acquired
immune response. Science1996; 272:50-4
Fox BS, Gatter KC, Bickness R, et al. Relationship of endothelial cell
proliferation to tumor vascularity in human breast cancer. Cancer Res 1993
Frohm M, Gunne H, Bergman AC, et al. Biochemical and antibacterial analysis
of human wound and blister fluid. Eur J Biochem 1996; 237:86-92
Frohm M, Agerberth B, Ahangari G, et al. The expression of the gene coding for
the antibacterial peptide LL-37 is induced in human keratinocytes during
inflammatory disorders. J Biol Chem 1997; 272:15258-63
Frohm NM, Sandstedt B, Sorensen O, et al. The human cationic antimicrobial
protein (hCAP18), a peptide antibiotic, is widely expressed in human squamous
epithelia and colocalizes with interleukin-6. Infect. Immun 1999; 67:2561-2566
Gabay JE. Ubiquitous natural antibiotics. Science 1994; 264: 373-4
Ganz T, Lehrer RI Defensins. Pharmac Ther 1995; 66:191-205
Ganz T, Selsted M, Szklarek D, et al. Defensins: natural peptide antibiotics of
human neutrophils. J Clin Invest 1985; 76:1427-1435
Ganz T, Weiss J. Antimicrobial peptides of phagocytes and epithelia. Semin
Hematol 1997; 34:343-54
44
Ganz T. Antimicrobial polypeptides in host defense of the respiratory tract. J
Clin Invest 2002; 109:693-697
Gennaro R, Zanetti M, Benincasa M, et al. Pro-rich antimicrobial peptides from
animals: structure, biological functions and mechanism of action. Curr Pharm
Des 2002; 8:763-778
Goldman MJ, Anderson MG, Stolzenberg ED, et al. Human beta-defensin-1 is a
salt-sensitive antibiotic in lung that is inactivated in cystic fibrosis. Cell 1997; 88,
1-9
Gough M, Hancock RE, Kelly NM. Antiendotoxic potential of cationic peptide
antimicrobials. Infect Immun 1996; 64:4922-4927
Gudmundsson GH, Agerberth B, Odeberg J,et al. The human gene FALL39 and
processing of the cathelin precursor to the antibacterial peptide LL-37 in
granulocytes. Eur J Biochem 1996; 238:325-332
Gutsmann T, Larrick JW, Weydel U et al. Molecular machanisms of interaction
of rabbit CAP18 with outer membranes of gram-negative bacteria. Biochemistry
1999; 38:13643-13653
Gutsmann T, Fix M Larrick JW, et al. Mechanisms of action of rabbit CAP18 on
monolayers and liposomes made from endotoxins or phospholipids. J Membr
Biol 2000; 176:223-236
Hancock REW. Peptide antibiotics. Lancet 1997; 349:412-422
Hancock R, Chapple D. Peptide Antibiotics. Antimicrob agents and Chemother
1999; 43:1317-1323
Harder J, Bartels J, Christophers E, et al. A peptide antibiotic from human skin.
Nature 1997; 387:861
Harder J, et al. Mucoid Pseudomonas aeruginosa, TNF-α, and ILL-1β, but not
IL-6, induce humanβ defensin-2 in respiratory epithelia. Am J Resp Cell Mol Biol
2000; 22:714-721
Harder J, Bartels J, Christophers E, et al. Isolation and characterization of
human beta-defensin-3, a novel humaninducible peptide antibiotic. J Biol Chem
2001; 276:5707-5713
Haussen von J, Koczulla R, Shaykhiev R, et al. The host defence peptide LL37/hCAP-18 is a growth factor for lung cancer cells. Int J Cancer 2007
Heilborn JD, Nilsson MF, Kratz G, et al. The Cathelicidin anti-microbial peptide
LL-37 is involved in re-epithelialization of human skin wounds and is lacking in
chronic ulcer epithelium. J Invest Dermatol 2003; 120:379-389
45
Heilborn JD, Nilsson MF, Jimenez CI, et al. Antimicrobial protein hCAP18/LL-37
is highly in breast cancer and is a putative growth factor for epithelial cells. Int J
Cancer 2005; 114:713-719
Hiemstra P, van Weteering S, Stolk J. Neutrophil serine proteinases and
defensins in chronic obstructive pulmonary disease: effects on pulmonary
epithelium. Eur Respir J 1998; 12:1200-1208
Hirschberg H, Braathen LR, Thorsby E. Antigen presentation by vascular
endothelial cells and epidermal Langerhans cells: the role of HLA-DR.
Immunological Review 1982; 66:57
Huang HJ, Ross CR, Blecha F. Chemoattractant properties of PR-39, a
neutrophil antibacterial peptide. J Leukoc Biol 1997; 61:624-629
Jin E, Ghazizadeh M, Fujiwara, M, et al. Angiogenesis and phenotypic alteration
of alveolar capillary endothelium in areas of neoplastic cell spread in primary
lung adenocarcinoma. Pathol Int 2001; 51:691-700
Johansson J, Gudmundsson GH, Rottenberg ME, et al. Conformationdependent antibacterial activity of the naturally occuring human peptide LL-37. J
Biol Chem 1998; 273:3718-3724
Kamysz W, Okroj M, Lukasiak J. Novel properties of antimicrobial peptides.
Acta Biochimica Polonica 2003; 50:461-469
Kawanami O, Jin EJ, Ghazizadeh M, et al. Heterogeneous distribution of
thrombomodulin and von Willebrand factor in endothelial cells in the human
pulmonary microvessels. J Nippon Med Sch 2000; 67:118-125
Koczulla R, von Degenfeld G, Kupatt C, et al. An angiogenic role for the human
peptide antibiotic LL-37/hCAP-18. J Clin Invest 2003; 111:1665-1672
Lehrer R, Ganz T Sested M. Defensins: endogenous antibiotic peptide of animal
cells. Cell 1991:229-30
Lehrer R, Ganz T. Antimicrobial peptides in mammalian and isect host defense.
Curr Opin Immunol 1999; 11:23-7
Lehrer RI, Ganz T. cathelicidins: a family of endogenous antimicrobial peptides.
Curr Opin Hematol 2002;9:18-22
Lencer W, Cheung G, StrohmeierG, et al. Induction of epithelial chloride
secretion by channel-forming cryptdins 2 and 3. Proc Natl Acad Sci USA 1997;
94:8585-9
Lichtenstein A, Ganz T, Selsted ME, et al. In vitro tumour cell cytolysis mediated
by peptide defensin of human and rabbit granulocytes. Blood 1986; 65:14071410
46
Lysenko ES, Gould J, Bals R, et al. Bacterial phosphorylcholine decreases
susceptibility to the antimicrobial peptide LL-37/hCAP18 expressed in the upper
respiratory tract. Infect Immun 2000; 68:1664-1671
Maget-Dana R, Ptak M. Penetration of the insect defensin A into phospholipid
monolayers and formation of defensin A-lipid complexes. Biophys J 1997;
73:2527-33
Martin B, Paesmans M, Mascaux C, et al. Ki-67 expression and patients
survival in lung cancer: systematic review of the literature with meta-analysis. Br
J Cancer 2004; 1-8
Matsuzaki K. Why and how are peptide-lipid interactions utilized for selfdefensine? Magainins and tachylepsins as archetypes. Biochem Biophys Acta
1999; 1426:1-10
Mattern J, Koomägi R, Volm M. Association of vascular endothelial growth
factor expression with intratumoral microvessel density and tumour cell
proliferation in human epidermoid lung cancer. Br J Cancer 1996; 73:931-934
Matzinger P. An innate sense of danger. Semin Immunol 1998; 10:399-415
Medzhitov R, Janeway C. Innate immunity: the virtues of a nonclonal system of
recognition. Cell 1997; 91:295-8
Mizukawa N, Sugiyama K, Kamio M, et al. Immunohistochemical staining of
human α-defensin-1 in the submandibular glands of patients with oral
carcinomas. Anticancer Res 2000;20:1125-1127
Mizukawa N, Sawaki K, Yamachika E, et al. Presence of human beta-defensin2 in oral squamous cell carcinoma. Anticancer Res 2000b; 20:2005-2007
Mizukawa N, Sawaki K, Nagatsuka H, et al. Human alpha- and beta-defensin
immunoreactivity in oral mucoepidermoid carcinomas. Anticancer Res 2001;
21:2171-2174
Müller CA, Markovic-Lipkovski J, Klatt T, et al. Human α-Defensins HNP-1, -2,
and –3 in renal cell carcinoma. American Journal of Pathology 2002; 160:13111324
Murphy CJ, Foster, BA, Mannis MJ, et al. Defensins are mitogenic for epithelial
cells and fibroblasts. J Cell Physiol 1993; 155:408-413
Murphy JE, Robert C, Kupper TS. Interleukin-1 and cutaneous inflammmation:
a crucial link between innate and acquired immunity. J Invest Dermatol 2000;
114:602-608
Moore AJ, Devine DA, Bibby MC. Preliminary experimental anticancer activity of
crecropins. Pept Res 1994; 7:265-269
47
MorrisonGM, Davidson DJ, Kianowski FM, et al. Mouse beta defensin-1 is a
functional homolog of human beta defensin-1. Mamm Genome 1998; 9:453-457
Nagaoka I, Hirota S, Niyonsaba F,et al. Cathelicidin family of antibacterial
peptides CAP18 and CAP11 inhibit the expression of TNF-alpha by blocking the
binding of LPS to CD14(+) cells. J Immunol 2001; 167:3329-3338
Nagaoka I, Hirota S, Niyonsaba F,et al. Augmentation of the lipopolysaccharideneutralizing activities of human Cathelicidin CAP18/LL-37-derived antimicrobial
peptides by replacement with hydrophobic and cationic amino acid residues.
Clin Diagn Lab Immunol 2002; 9:972-982
Niyonsaba F, Someya A, Hirata M; et al. Evaluation of the effects of peptide
antibiotics human beta-defensins-1/-2 and LL-37 on histamine release and
prostaglandin D(2) production from mast cells. Eur J Immunol 2001;31:10661075
Nissen-Meyer J, Nes IF. Ribosomally synthesized antimicrobial peptides: their
function, structure, biogenesis and mechanism of action. Arch Microbiol 1997;
167:67-77
Ohtake T, Fujimoto Y, Ikuta K, et al. Proline-rich antimicrobial peptide, PR-39
gene transduction altered invasive activity and actin structure in human
hepatocellular carcinoma cells.Br J Cancer 1999; 81:393-403
Okumura K, Itoh A, Isogai E,et al. C-terminal domain of human CAP18
antimicrobial peptide induces apoptosis in oral squamous cell carcinoma SASH1 cells. Cancer Lett 2004; 212:185-194
O’Neil DA, et al.Expression on regulation of the human β-defensins HBD-1 and
HBD-2 inintestinal epithelium. J Immunol 1999;163:6718-6724
Peschel A, Otto M, Jack R, et al. Inactivation of the dlt operon in
Staphylococcus aureus confers sensitivity to defensins, protegrins and other
antimicrobial peptides. J Biol Chem1999; 274:8405-8410
Quayle AJ, Porter EM, Nussbaum AA, et al. Gene expression,
immunolocalization, and secretion of human defensin-5 in human female
reproductive tract. Am J Pathol 1998; 152:1247-1258
Redondo M, Ruiz-Cabello F, Concha A, et al. Differential expression of MHC
class II genes in lung tumour cell lines. European Journal of Immunogenetics
1991; 25:385-391
Reidy MA, Chopek M, Chao S, et al. Injury induces increase of von Willebrand
factor in rat endothelial cells. Am J Pathol 1989; 134:857-864
Sallusto F, Lanzavecchia A. Mobilizing dendritic cells for tolerance, priming, and
chronic inflammation.J Exp Med 1999; 189:611
48
Sawaki K, Mizukawa N, Yamaai T, et al. High concentration of beta-defensin-2
in oral squamous cell carcinoma. Anitcancer Res 2002; 22:2103-2107
Schaller-Bals S, Schulze A, Bals R. Increased levels of antimicrobial peptides in
tracheal aspirates of newborn infants during infection. Am J Resp Crit Care Med
2002; 165:992-995
Schnapp D, Harris A. Antibacterial peptides in bronchoalveolar lavage fluid. Am
J Respir Cell Mol Biol 1998; 19:352-356
Schullerus D, von Knobloch R, Chudek J, et al. Microsatellite analysis reveals
deletion of a large region at chromosome 8p in conventional renal cell
carcinoma. Int J Cancer 1999;80:22-24
Shafer WM, Qu X, Waring AJ, et al. Modulation of neisseria gonorrhoeae
susceptibility to vertebrate antibacterial peptides due to a member of the
resistance/nodulation/division efflux pump family. Proc Natl Acad Sci USA 1998;
95:1829-1833
Shaykhiev R, Beißwenger C, Kändler K, et al. Human endogenous LL-37
stimulates airway epithelial cell proliferation and wound closure. Am J Physiol
Lung Cell Mol Physiol 2005; 289:L842-L848
Shibusa T, Shijubo N, Abe S. Tumor angiogenesis and vascular endothelial
growth factor expression in stage I lung adenocarcinoma. Clin Cancer Res
1998; 4:1483-1487
Shijubo N, Uede T, Kon S, et al. Vascular endothelial growth factor and
osteopontin in tumor biology. Crit Rev Oncol 2000; 11:135-146
Shnitsar VM, Lisovskiy IL, Soldatkina MA, et al. Human beta-defensin 3
expression in A431 cell line and human vulval tumors. Exp Oncol 2004; 26:328330
Simmaco M, Mignigna G, Barra D. Antimicrobial peptides from amphibian skin:
what do they tell us? Biopolymers 1998; 47:435-450
Singh PK, Jia HP, Wiles K, et al. Production of β-defensins by human airway
epithelia. Proc Natl Acad Sci USA 1998;95:14961-14966
Soong LB, Ganz T, Ellison A, et al. Purification and characterization of
defensins from cystic fibrosis sputum. Inflamm Res 1997; 46:98-102
Sorensen O, Cowland J, Askaa J et al. An ELISA for hCAP-18, the cathelicidine
present in human neutrophils and plasma. FEBS Lett 1997; 206:53-59
Tani K Murphy WJ, Chertov O et al. Defensins act as potent adjuvants that
promote cellular and humpral immune responses in mice to a lymphoma
idiotype and carrier antigens. Int Immunol 2000; 12:691-700
49
Territo MC, Ganz T, Selsted ME et al. Monocyte-chemotactic activity of
defensins from human neutrophils J Clin Invest 1989; 84:2017-2020
Tubiana M, Courdi A. Cell proliferation kinetics in human solid tumors: relation
to probability of metastatic dissemination and longterm survival. Radiother
Oncol 1989; 15:1-18
Turner J, Cho Y, Dinh NN, et al. Activities of LL-37, a cathelin-associated
antimicrobial peptide of human neutrophils. Antimicrob Agents Chemother
1998; 42:2206-2214
UtsugiT, Schroit AJ, Connor J, et al. Elevated expression of phosphatidylserine
in the outer membrane leaflet of human tumour cells and recognition by
activated human blood monocytes. Cancer Res 1991;51:3062.3066
van Wetering S, Mannesse-Lazeroms SP, Dijkman JH. Effect of neutrophil
serine proteinases and defensins on lung epithelial cells: modulation of
cytotoxicity and IL-8 production. J Leukoc Biol 1997; 62:217-226
Vermeulen PB, Verhoeven D, Hubens G, et al. Microvessel density, endothelial
cell proliferation and tumour cell proliferation in human colorectal
adenocarcinomas. Ann Oncol 1995; 6:59-64
Vermeulen PB, Gasparini G, Fox SB, et al. Quantification of Angiogenesis in
solid human tumours: an international consensus on the methodology and
criteria of evaluation. Europ J Cancer 1996; 32A:2474-2484
Wang JM, Deng X, Gong W, et al. Chemokines and their role in tumor growth
and metastasis. J Immunol Methods 1998; 220:1-17
Welling MM, Hiemstra PS, van den Barselaar MT, et al. Antibacterial activity of
human neutrophil defensins in experimental infections in mice is accompanied
by increases leukocyte accumulation. J Clin Invest 1998; 102: 1583-1590
Winder D, Gunzburg WH, Erfle V, et al. Expression of antimicrobial peptides
has an antitumor effect in human cells. Biochem Biophys Res Commun 1998;
242:608-612
Yang D Chertov O, Byskovskaia SN et al. Beta-Defensins : linking innate and
adaptive immunity through dendritic and T cell CCR6 Science 1999; 286:525528
Yang D, Chen Q, Schmidt AP, et al. LL-37, the neutrophil granule- and epithelial
cell-derived cathelicidin, utilized formyl peptide receptor-like 1 (FPRL!) as a
receptor to chemoattract human peripheral blood neutrophils, monocytes and Tcells. J Exp Med 2000;192:1069-1074
Yang D, Chen Q, Chertov O, et al. Human neutrophil defensins selectively
chemoattract naïve T and immature dendritic cells. J Leukoc Biol 2000b; 68:914
50
Yoshimoto I, Yamaai T, Mizukawa N, et al. Different expression patterns of
beta-defensins in human squamous cell carcinomas. Anticancer Res 2003;
23:4629-33
Young AN, Amin MB, Moreno CS, et al. Expression profiling of renal epithelial
neoplasms: a method for tumor classification and discovery of diagnostic
molecular markers. Am J Pathol 2001; 158:1639-1651
Yuan A, Yang PC, Yu CJ, et al. Tumor angiogenesis correlates with histologic
type and metastasis in non-small-cell lung cancer. Am J Respir Care Med 1995;
152:2157-2162
Zanetti M, Gennaro R, Romeo D. Cathelicidins: a novel protein family with a
common proregion and a variable C-terminal antimicrobial domain. FEBS Lett
1995; 374:1-5
Zhao C, Wang I, Lehrer RI. Widespread expression of beta-defensin hBD-1 in
human secretory glands and epithelial cells. FEBS Lett 1996; 369:319-322
Zasloff M. Antimicrobial peptides of multicellular organisms. Nature 2002; 415
Zucht HD, Grabowsky J, Schrader M, et al. Human beta-defensin-1: a urinary
peptide present in variant molecular forms and ist putative functional
implication. Eur Med Res 1998; 3:315-323
51
Curriculum Vitae
Persönliche Daten
Name:
Dietlind Reimer, geb. Görner
Anschrift:
Hohlweg 5, 37217 Witzenhausen
Geburtsdaten:
24.09.1977 in Kiel
Familienstand:
verheiratet, 1 Tochter
Schulbildung
1984–1988
Grundschule Russee, Kiel
1988-1997
Gymnasium im Bildungszentrum Mettenhof, Kiel
1997
Abitur
Freiwilliges Soziales Jahr
1997–1998
Kurheim Köhlbrand in St. Peter-Ording
Studium
1998-2005
Medizinstudium an der Philipps-Universität Marburg
März 2001
Physikum
März 2002
1. Staatsexamen
März 2004
2. Staatsexamen
2004-2005
Praktisches Jahr im Roten Kreuz Krankenhaus, Kassel
(Innere Medizin und Chirurgie) und im Klinikum Kassel
(Gynäkologie)
Juni 2005
3. Staatsexamen
Famulaturen
2001
Innere Medizin im ev. Krankenhaus Weende, Göttingen
2002
Gesundheitsamt Marburg-Biedenkopf
2003
Gynäkologie im Neu-Mariahilf Krankenhaus, Göttingen
Anästhesie im Neu-Mariahilf Krankenhaus, Göttingen
Berufstätigkeit
ab Juli 2005
Assistenzärztin im Kreiskrankenhaus Wittgenstein,
Bad Berleburg, Innere Medizin; Dr. Kolbe
52
Danksagung
Meinem Betreuer, PD Dr. med. Dr. rer. nat. R. Bals, danke ich für das Thema
dieser Arbeit, für die vielfältigen Anregungen bei der Versuchsdurchführung und
nicht zuletzt bei der kritischen Durchsicht meiner Textentwürfe.
Prof. Dr. med. C. Vogelmeier danke ich für die Schaffung der Rahmenbedingungen innerhalb seiner Klinik, die mir die Durchführung der experimentellen
Untersuchungen ermöglichten.
Bedanken möchte ich mich bei der AG Bals für die nette Aufnahme und die
Hilfsbereitschaft in der Einarbeitung in die Labortechnik.
Insbesondere bin ich Annette Püchner zu Dank verpflichtet, die bei praktischen
Problemen immer eine Lösung wußte.
Der Pathologie danke ich für die Lungenkarzinompräparate und technische
Unterstützung
Recht herzlich bedanken möchte ich mich bei Christine Burr für das
Korrekturlesen der Arbeit.
Ganz herzlich danke ich auch meinem Mann Dr. agr. Lars Reimer für die Hilfe
bei der statistischen Datenanalyse sowie für die mentale Unterstützung.
53
Akademische Lehrer
Meine Akademischen Lehrer an der Universität Marburg (einschließlich
Rotes Kreuz Krankenhaus Kassel und Klinikum Kassel) waren die Damen
und Herren Professoren/Hochschuldozenten:
Arnold, Aumüller, Bals, Barth, Basler, Baum, Bien, Cetin, Dimpfl, Duda, Gemsa,
Görg, Gotzen, Gudermann, Hadji, Happle, Hasilik, Hesterberg, Kern, Klaus,
Klingmüller, Kretschmer, Krieg, Kroll, Lill, Löffler, Löser, Lohoff, Lorenz, Maisch,
Mennel, Moll, Mueller, Neubauer, Oertel, Remschmidt, Renz, Röhm, Rothmund,
Schäfer, Sommer, Vogelmeier, Voigt, Wagner, Werner, Wulf
54
Ehrenwörtliche Erklärung
Ich erkläre ehrenwörtlich, dass ich die dem Fachbereich Humanmedizin Marburg zur Promotionsprüfung eingereichte Arbeit mit dem Titel:
„Expression antimikrobieller Peptide in Bronchialkarzinomen“
im Zentrum für Innere Medizin, Schwerpunkt Pneumologie, der PhilippsUniversität Marburg unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. C. Vogelmeier mit der
Unterstützung durch Herrn PD Dr. Dr. R. Bals ohne sonstige Hilfe selbst durchgeführt und bei der Abfassung keine anderen als die in der Dissertation angeführten Hilfsmittel benutzt habe.
Ich habe bisher an keinem in- oder ausländischem Medizinischen Fachbereich
ein Gesuch um Zulassung zur Promotion eingereicht noch die vorliegende oder
eine andere Arbeit als Dissertation vorgelegt.
Marburg, im April 2008
Dietlind Reimer
55