Bedeutung von uPA und PAI-1 bei nodal
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Ruhr-Universität Bochum Prof. Dr. med. S. Philippou Dienstort: Augusta Krankenanstalt Abt.: Institut für Pathologie und Zytologie Bedeutung von uPA und PAI-1 bei nodal-negativem Mammakarzinom Korrelation mit dem Tumorstadium, Grading und Manifestationsalter Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Ilka Streckert aus Witten 2009 Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr Referent: Prof. Dr. med. S. Philippou Korreferent: Prof. Dr. med. A. Tannapfel Tag der Mündlichen Prüfung: 23.11.2010 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1.1 Vorwort 1.2 Struktur und Funktionskreislauf des Urokinasesystems 1.2.1 Urokinase Plasminogenaktivator (uPA) 1.2.2 Urokinase Plasminogenaktivator Rezeptor (uPAR) 1.2.3 Urokinase Plasminogenaktivator Inhibitor (PAI-1) 1.2.4 Urokinase Plasminogenaktivator-System 1.3 Nachweisverfahren 1.4 Zielsetzung der Dissertation 2 Patientinnen, Material und Methoden 2.1 Patientinnenkollektiv 2.1.1 Charakterisierung des Patientinnenkollektivs 2.1.2 Tumorklassifikation 2.2 Nachweis von uPA und PAI-1 durch einen zweifach standardisierten ELISA im Tumorgewebe der intraoperativ gewonnenen Proben 2.2.1 Gewinnung und Aufbewahrung 2.2.2 Bestimmung der uPA- und PAI-1-Gewebekonzentration 2.2.2.1 Tumoraufbereitung und Cytosolherstellung 2.2.2.2 Proteinbestimmung 2.2.2.3 Durchführung des uPA-/PAI-1-ELISAs 2.2.2.4 Auswertung 2.2.2.5 Cut-off-Werte 2.3 Statistische Auswertung 2.3.1 Elementare Statistiken und Aufzählungen 2.3.2 Gruppenvergleich 2.4 Verwendete Geräte und Reagenzien 2.4.1 Geräteliste 2.4.2 Chemikalienliste 3 Ergebnisse 3.1 Methodische Ergebnisse 3.1.1 Proteinbestimmung 3.1.2 Eichfunktion des FEMTELLE-ELISAs 3.1.3 Reproduzierbarkeiten 3.2 Proteasenbestimmung im Patientinnenkollektiv 3.2.1 Allgemeine Ergebnisse 3.2.2 Korrelation der Messwerte mit der Größe der Tumoren 3.2.2.1 Untersuchungen zu uPA 3.2.2.2 Untersuchungen zu PAI-1 3.2.3 Korrelation der Messwerte mit dem Differenzierungsgrad der Tumoren 7 7 7 7 8 9 10 12 13 14 14 14 14 17 17 18 18 19 20 21 23 23 24 24 24 24 25 26 26 26 28 30 31 31 32 34 35 36 1 3.2.3.1 Untersuchungen zu uPA 3.2.3.2 Untersuchungen zu PAI-1 3.2.4 Korrelation der Messwerte mit dem Alter der Patientinnen 3.2.5 Korrelation der uPA- und PAI-1-Werte 4 Diskussion 4.1 Methodische Probleme 4.2 Klinische Bedeutung von uPA und PAI-1 für Prognose und Prädiktion 4.2.1 Verankerung der uPA-/PAI-1-Messungen in Leitlinien 4.2.2 Laufende Studien 4.2.3 Bisherige Publikationen 4.3 Untermauerung des Stellenwertes des Urokinasesystems als prognostischer Parameter 4.3.1 Korrelation der uPA- und PAI-1-Werte mit der Tumorgröße 4.3.2 Korrelation der uPA- und PAI-1-Werte mit der Tumordifferenzierung 4.3.3 Korrelation der uPA- und PAI-1-Werte mit dem Patientinnenalter 4.4 Ausblick 37 38 39 41 42 42 43 43 43 44 45 46 47 47 48 5 Zusammenfassung 50 6 Literaturverzeichnis 52 7 Danksagung 8 Curriculum vitae 2 Abkürzungen A. Arteria Abb. Abbildung Abs. Absorption ADEBAR Adjuvant Docetaxel vs. Epirubicin Based Regimen Trial AGO Arbeitsgemeinschaft Gynäkologische Onkologie Ala Alanin ASCO American Society of Clinical Oncology BCA Bicinchoninsäure BSA Bovines Serum Albumin Ca Carcinom CMF Cyclophosphamid, Methotrexat, 5-Fluoruracil Cys Cystein DNA Desoxyribonucleinacid EC-Doc Epirubicin/Cyclophosphamid-Docetaxel ECM Extrazellular Matrix EGFR epidermal growth factor receptor ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay FEC 5-Fluoruracil, Epirubicin, Cyclophosphamid GBG German Breast Group Glu Glutaminsäure H2SO4 Schwefelsäure HER human epidermal growth factor receptor HMW-uPA high molecular weight uPA Ile Isoleucin ISTO Informationszentrum für Standards in der Onkologie Jak Januskinase kDA Kilo Dalton LDLR low density lipoprotein receptor LK Lymphknoten LMW-uPA low molecular weight uPA LoE Level of Evidence 3 LRP low density lipoprotein receptor-related protein Lys Lysin NNBC node negativ breast cancer PAI Urokinase Plasminogenaktivator Inhibitor PBS Phosphat buffer salin pTNM pathologische TNM-Klassifikation pTT partielle Thromboplastinzeit RT-PCR Reverse Transskriptase Polymerase Kettenreaktion Ref. Referenz STAT Signal Transducers and Activators of Transcription TBS Tris buffer salin TNM Tumor/ Nodus/ Metastase tPA tissue Plasminogenaktivator U min-1 Units per Minute UICC Uniquely to the global control of cancer u-PA Urokinase Plasminogenaktivator u-PAR Urokinase Plasminogenaktivator Rezeptor VEGF vascular endothelial growth factor WHO World Health Organization 4 Verzeichnis der Tabellen Tabelle 1 Reststreuung von Verdünnungsreihen von 4 Gewebeaufarbeitungen 27 Tabelle 2 Sollwerte der Referenzproben 28 Tabelle 3 Sollwertabweichungen der uPA-Referenzproben 29 Tabelle 4 Sollwertabweichung der PAI-1-Referenzproben 29 Tabelle 5 Interassayreproduzierbarkeit der Proteinbestimmung (BCA-Test) sowie der uPA- und PAI-1 Messwerte bei 10 Wiederholungsmessungen 30 Tabelle 6 Korrelation der uPA- und PAI-1-Werte zur Tumorgröße 32 Tabelle 7 Korrelation zwischen Tumorgröße und uPA-Wert 34 Tabelle 8 Korrelation der PAI-1-Werte mit der Tumorgröße 35 Tabelle 9 Korrelation der uPA- und PAI-1-Werte zum Differenzierungsgrad des Tumors Tabelle 10 Korrelation der uPA-Werte zum Differenzierungsgrad des Tumors Tabelle 11 37 Korrelation der uPA-Werte zum Differenzierungsgrad des Tumors Tabelle 12 36 38 positive uPA- und PAI-1-Werte in Abhängigkeit vom Patientinnenalter 40 Verzeichnis der Abbildungen Abbildung 1 Aktivierung von Plasminogen zu Plasmin 10 Abbildung 2 Urokinasezyklus 12 Abbildung 3 Zerkleinerung der Probe mit dem Skalpell 18 Abbildung 4 Pulverisierung im Dismembranator 18 Abbildung 5 Gewebeextrakt 19 Abbildung 6 BCA Protein Assay 20 Abbildung 7 uPA-Wells nach der Stoppreaktion 21 Abbildung 8 PAI-1-Wells nach der Stoppreaktion 21 Abbildung 9 Beispiel einer BCA-Eichkurve 22 5 Abbildung 10 Beispiel einer PAI-1-Eichkurve 22 Abbildung 11 Eichfunktion der Proteinbestimmung (Lot IK 117541) 26 Abbildung 12 Konzentrationsreihen verschiedener Proteinproben im BCA-Test 28 Abbildung 13 Lineare und quadratische Anpassung der uPA-Eichfunktion 29 Abbildung 14 Lineare und quadratische Anpassung der PAI-1-Eichfunktion 30 Abbildung 15 Prozentualer Anteil der Patientinnen mit niedrigen uPAund PAI-1-Werten im entsprechenden Tumorstadium 33 Abbildung 16 Prozentualer Anteil der Patientinnen mit niedrigen uPA-Werten im entsprechenden Tumorstadium 34 Abbildung 17 Prozentualer Anteil der Patientinnen mit niedrigen PAI-1-Werten im entsprechenden Tumorstadium 36 Abbildung 18 Prozentualer Anteil der Patientinnen mit niedrigen uPA- und PAI-1-Werten im entsprechenden Tumorstadium 37 Abbildung 19 Prozentualer Anteil der Patientinnen mit niedrigen uPA-Werten im entsprechenden Tumorstadium 38 Abbildung 20 Prozentualer Anteil der Patientinnen mit niedrigen PAI-1-Werten im entsprechenden Tumorstadium 39 Abbildung 21 Prozentualer Anteil der Patientinnen mit negativen uPA- und PAI-1-Werten im entsprechenden Alter Abbildung 22 Korrelation der uPA- und PAI-1-Wert 40 41 6 1 Einleitung 1.1 Vorwort Das Mammakarzinom ist die häufigste Krebsart bei Frauen. Bei circa 55000 Neuerkrankungen pro Jahr, erkrankt in Deutschland etwa jede neunte Frau in ihrem Leben an Brustkrebs. Zusätzlich ist die Inzidenz des Mammakarzinoms steigend und hat sich in den letzten 50 Jahren in etwa verdoppelt. Auch bei der Krebssterblichkeit belegt das Mammakarzinom mit 18% bei Frauen den ersten Rang, jedoch sinkt die Mortalität trotz der steigenden Inzidenz, auf Grund der konsequenteren Therapie, der verbesserten Therapieformen und den erweiterten Maßnahmen zur Früherkennung. [12] Die Risikobeurteilung des Mammakarzinoms erfolgt anhand von den Prognosefaktoren Tumorgröße (T), Lymphknotenbefall (N), Grading (G), Alter, histologischen Typ, Hormonrezeptor-Status sowie HER-2-Status. In den letzten Jahren haben auch die tumorassoziierten Proteolysefaktoren uPA und PAI-1 immer mehr an Bedeutung gewonnen. 1.2 Struktur und Funktionskreislauf des Urokinasesystems 1.2.1 Urokinasetyp Plasminogenaktivator (uPA) Urokinasetyp Plasminogenaktivator (uPA) ist eine Serinprotease mit einem Molekulargewicht von 55 kDa, und auf dem Chromosom 10q24-qter lokalisiert. Die Serinprotease besteht aus zwei Polypetidketten A (18 kD, uPA1-158) und B (33 kD, uPA159-411), die über 2 Disulfidbrücken zwischen Cys148 und Cys279 verbunden sind. [8] Am C-terminalen Ende der Polypetidkette befindet sich eine Serinproteasen-Domäne und am N-terminalen Ende eine A-Kette, welche eine Kringle- und eine Wachstumsfaktordomäne enthält. Frisch synthetisiertes uPA besteht aus einer aus Polypeptiden gebildeten Einzelkette und wird als pro-uPA bezeichnet. Pro-uPA hat eine geringere intrinsische Aktivität als uPA. Die proteolytische Aktivierung von pro-uPA zu uPA („high molecular weight uPA“) wird durch Plasmin oder andere Proteasen 7 (Kathepsin B oder L, Kallikrein oder Faktor XIIa) nach der Bindung von pro-uPA an den uPAR katalysiert. Hierbei wird die Peptidbindung zwischen Lys158 und Ile159 enzymatisch gespalten. [5] Anschließend kann HMW-uPA durch weitere Proteolyse in das aminoterminale Fragment (ATF, uPA1-135) und „low molecular weight uPA“ (LMW-uPA, uPA136-411) gespalten werden. LMW-uPA kann nicht mehr vom uPAR gebunden werden, besitzt aber noch die gleiche proteolytische Aktivität wie HMW-uPA. Dadurch, dass uPA die Aktivierung von Plasminogen zu Plasmin katalysiert, resultiert bei der Aktivierung von pro-uPA zu uPA durch Plasmin ein starker positiver Feedbackmechanismus. An den uPAR gebundenes uPA hat eine Halbwertszeit von vier bis fünf Stunden. [29] 1.2.2 Urokinase Plasminogenaktivator Rezeptor (uPAR) Der uPAR ist ein cysteinreicher, glykolisierter Zelloberflächen Rezeptor, der durch einen Glycosylphosphatidylinositol-Anker an der Zellmembran befestigt ist. Er hat ein Molekulargewicht von 55 kD und sein Genort befindet sich auf Chromosom 19q13, er wird von Monozyten, Fibroblasten, Endothelzellen, aktivierten T-Zellen und einer Vielzahl von Tumorzellen exprimiert. Die Expression des uPAR kann durch Wachstumsfaktoren moduliert werden. [7] Der uPAR setzt sich aus drei homologen repetitiven Sequenzen zusammen, den Domänen I, II und III. Für die Bindung von uPA ist die Domäne I entscheidend. Hier besteht eine hohe Bindungsaffinität für die A-Kette von uPA, wobei uPA und pro-uPA mit der gleichen Affinität gebunden werden. Es ist beschrieben, dass die Bindung von uPA an den uPAR mitotische Signalwege der Zelle aktiviert und die zelluläre Migration erhöht. [6] Des Weiteren können auch Integrine mit dem uPAR einen stabilen Komplex bilden, dieser Komplex führt zu einer Interaktion mit Vitronectin an der Ligandenbindungstelle des uPAR. Die Interaktion von Vitronectin hat Folgen bei 8 der Zellmigration, Signaltransduktion und Adhäsion. Dadurch ist das uPASystem direkt an der Tumorausbreitung und Metastasierung beteiligt. 1.2.3 Urokinase Plasminogenaktivator Inhibitor Typ 1 (PAI-1) Bis jetzt konnten vier verschiedene Inhibitoren der Plasminogenaktivatoren identifiziert werden, welche alle zu der Familie der Serpine (Serin Protease Inhibitoren) gehören und als Plasminogenaktivator Inhibitor (Typ 1 bis Typ 4) bezeichnet werden. Die wesentlichen physiologischen Inhibitoren für den Urokinase Plasminogenaktivator stellen die Serpine PAI-1 und PAI-2 dar, die auch als Serpin E1 und Serpin B2 bezeichnet werden. Die beiden Proteine weisen eine 24%ige Homologie in der Primärstruktur auf, unterscheiden sich aber in der Konformation u. a. durch den sogenannten CD-Loop aus 33 Aminosäuren (Ala65-Glu96). Beide Inhibitoren binden an uPA, wobei PAI-1 auch eine hohe Affinität für den tissue Plasminogenaktivator (tPA) aufweist. Die Interaktion mit der Zielprotease erfolgt durch den reactive centre loop (RCL). [8] PAI-1 ist ein 52 kD großes Glykoprotein und wird von den Endothelzellen als aktive Antiprotease sezerniert. Seine Genregion befindet sich auf Chromosom 7q21.3-q22. Aktives PAI-1 ist nur metastabil mit einer Halbwertszeit von 2 Stunden, daher wird es schnell in eine inaktive Form umgewandelt; durch Exposition der Substrate oder von Phospholipiden kann PAI-1 reaktiviert werden. [23] Durch Bindung der Somatomedin-B-Domäne des Vitronectins an PAI-1 wird die aktive Form stabilisiert; die Halbwertszeit beträgt in dieser Stabilisierung 4 Stunden. [5] Unabhängig von uPA, tPA und Vitronectin kann PAI-1 auch die Zellmigration beeinflussen. Durch direkte Interaktion von PAI-1 mit dem LRP (low density lipoprotein receptor-related protein) wird der Jak/STAT-Signalweg aktiviert; dies führt zur Polarisation von Aktinfilamenten, der Translokation des aktivierten STAT1 in den Zellkern und zu einer erhöhten Zellmigration. [8] 9 1.2.4 Urokinase Plasminogenaktivator-System In vielen Prozessen spielen Proteasen eine entscheidende Rolle, diese Prozesse reichen von der Blutkoagulation bis hin zu Apoptose und Angiogenese. Als Konsequenz führt die unregulierte Proteolyse zu einer Vielzahl von Krankheiten, wie Arthritis, Emphysemen, Demenz und Krebs. [6] In der proteolytischen Kaskade sowohl in physiologischen als auch in pathophysiologischen Zuständen tragen uPA und PAI-1 eine Schlüsselrolle beim Abbau und Umbau der extrazellulären Matrix (ECM) sowie bei der Stimulation der Zellmigration. [11] [18] Das Urokinasesystem wird durch verschiedene intra- oder extrazelluläre Vorgänge aktiviert. Dies führt in einer Aktivierungskaskade zur perizellulären Proteolyse. Das frisch sezernierte pro-uPA bindet entweder an den auf der Zellmembran befindlichen uPAR oder katalysiert die Proteolyse von Plasminogen zu Plasmin. Am uPAR gebundenes pro-uPA wird dann, wie oben beschrieben, durch Plasmin und andere Proteasen in aktives uPA enzymatisch gespalten. Da uPA auch die Proteolyse von Plasminogen zu Plasmin katalysiert, handelt es sich hier um einen starken positiven Feedbackmechanismus (Abb. 1). [29] PAI-1 und PAI-2 uPA Plasminogen Plasmin Abb. 1: Aktivierung von Plasminogen zu Plasmin Physiologischerweise löst Plasmin zahlreiche Komponenten der extrazellulären Matrix auf sowie bei Malignität auch das Tumor umgebende Stroma. Im Falle eines metastasierenden Krebses kommt es durch die Deregulierung der uPAExpression zu einer erhöhten Plasminaktivierung, die, wie oben beschrieben, einen Abbau der extrazellulären Matrix bewirkt und damit die Metastasierung fördert. [6] 10 Da es sich beim uPA-Rezeptor nicht um einen Transmembranrezeptor handelt, ist das uPA-System zur Stimulierung zellulärer Prozesse auf die Interaktion mit Integrinen und Korezeptoren wie EGFR (epidermal growth factor receptor) [19] und der LDLR-Familie (low density lipoprotein receptor) [28] angewiesen. Die Interaktion von Integrinen und Vitronectin mit dem uPA-uPAR-Komplex führt außerdem zu einer Steigerung von uPA zum Substrat sowie zur vermehrten Bindung von PAI-1 und PAI-2. Wenn das an den uPAR gebundene uPA mit PAI-1 einen Komplex eingeht, wird dieser ternäre Komplex in die Zelle internalisiert. Anschließend werden uPA und PAI-1 lysosomal abgebaut und der uPAR wieder recycelt. Damit ist die Aktivität der perizellulären Proteolyse wieder hergestellt. [24] 11 Abb. 2: Urokinasezyklus 1.3 Nachweisverfahren Zum Nachweis von uPA und PAI-1 gibt es mehrere Möglichkeiten. Prinzipiell stehen immunhistochemische Methoden, ELISA (Enzyme Linked 12 Immunosorbent Assay) und RT-PCR (Reverse Transskriptase Polymerase Kettenreaktion) zur Verfügung. Allerdings kann bei der immunhistochemischen Bestimmung die heterogene Anfärbung im Gewebe nicht reproduzierbar beurteilt werden, von daher ist dieses Verfahren nicht standardisiert. Bei der Bestimmung durch real time quantitative RT-PCR erhält man vergleichbare Ergebnisse, wie die auf der Proteinbestimmung basierenden. [27] Als validiertes Verfahren zur quantitativen Bestimmung von uPA und PAI-1 im Tumorgewebe ist deshalb der FEMTELLE ELISA der Firma American Diagnostica seit 2002 von der AGO (Arbeitsgemeinschaft Gynäkologische Onkologie) empfohlen. In unserem Labor wird die Bestimmung von uPA und PAI-1 mit dem FEMTELLE ELISA seit 2005 durchgeführt. 1.4 Zielsetzung In verschiedenen vorangegangenen Studien wurden uPA- und PAI-1 bereits als neue Prognosefaktoren für maligne Tumoren beschrieben. In dieser Arbeit soll untersucht werden, ob eine Korrelation der uPA- und PAI-1Konzentration mit den klassischen pathologischen Parametern Tumorgröße und Grading besteht. Zusätzlich soll festgestellt werden, ob ein Zusammenhang dieser neuen Prognosefaktoren mit dem Manifestationsalter bei Patientinnen mit nodal-negativem Mammakarzinom besteht. Diese Studien können dazu dienen, die Prognosefaktoren genauer zu charakterisieren. Bedeutung der neuen Eine genaue Definition der Aussagefähigkeit des Verfahrens ist für die optimale Nutzung im täglichen Einsatz unbedingt erforderlich. 13 2 Patientinnen, Material und Methoden An dieser Stelle wird das Patientinnenkollektiv charakterisiert und die methodische Aufarbeitung des untersuchten Tumorgewebes beschrieben. 2.1 Patientinnenkollektiv 2.1.1 Charakterisierung des Patientinnenkollektivs Das Patientinnenkollektiv setzt sich aus 309 Patientinnen mit nodal-negativem Mamma-Ca aus der Augusta Krankenanstalt in Bochum, dem Malteser Krankenhaus St. Anna in Duisburg und dem evangelischen Krankenhaus in Herne im Zeitraum von Dezember 2005 bis August 2008 zusammen. Es handelt sich um 309 Patientinnen und einen Patienten im Alter von 34 bis 89 Jahren, das durchschnittliche Alter liegt bei 63 Jahren. 2.1.2 Tumorklassifikation Die intraoperativ entnommenen Gewebeproben wurden durch das Pathologische Institut an den Augusta Krankenanstalten Bochum anhand des TNM-Status und des Gradings eingeteilt. Der Lymphknotenstatus wurde entweder durch den Sentinel-Lymphknoten oder durch eine axilläre Lymphadenektomie bestimmt. Die Tumorklassifikation des Kollektivs setzt sich wie folgt zusammen: pT-Stadium pT 1a 3 pT 1b 41 pT 1bm pT 1c 2 207 pT is 3 pT 2 51 pT 3 1 14 Sonstiges 1 pN-Stadium pN 0 Grading 265 pN 1mi 12 PN 1a 18 pN 1b 0 pN 1c 0 pN 1 1 pN 2a 5 pN 2b 0 pN 2c 0 pN 2 1 pN 3a 2 pN X 5 G1 48 G2 186 G3 74 GX 1 Die Einteilung erfolgte anhand der WHO-Klassifikation des histologischen Tumortyps nach pTNM-Klassifikation (UICC TNM, 6.Auflage, 2002): pTNM-Klassifikation der Mammakarzinome (2002) T Primärtumor TX Primärtumor nicht beurteilbar Tis Carcinoma in situ T1 Tumorgröße bis max. 2 cm T1mic Mikroinvasion 0,1 cm oder weniger T1a > 0,1 bis max. 0,5 cm T1b > 0,5 bis max. 1 cm T1c > 1 cm bis max. 2 cm T2 > 2 cm bis max. 5 cm T3 > 5 cm Tumor jeder Größe mit Ausdehnung auf die Haut oder T4 Brustwand T4a Mit Ausdehnung auf die Brustwand Mit Ödem, Ulzeration oder Hautmetastasen der gleichen T4b Brust T4c 4a und 4b 15 T4d Inflammatorisches Karzinom N Regionäre Lymphknoten NX Regionäre Lymphknoten nicht berurteilbar N0 Keine Lymphknotenmetastasen N1mi Mikrometastasen > 0,2 mm bis max. 2 mm Metastasen in 1 - 3 ipsilateralen, axillären Lymphknoten und/ oder in ipsilateralen Lymphknoten entlang der A. mammaria interna mit mikroskopischen Metastasen, die bei der Sentinellymphknoten-Dissektion entdeckt wurden, aber N1 nicht klinisch auffällig waren N1a 1 - 3 Lymphknoten, mindestens eine > 2 mm Ausdehnung Metastasen in ipsilateralen Lymphknoten mit mikroskopischen Metastasen, die bei der Sentinellymphknotendissektion entdeckt wurden, aber nicht N1b klinisch auffällig waren Metastasen in 1 - 3 ipsilateralen, axillären Lymphknoten mit mikroskopische Metastasen, die bei der Sentinellymphknotendissektion entdeckt wurden, aber nicht N1c klinisch auffällig waren Metastasen in 4 - 9 ipsilateralen, axillären Lymphknoten oder in Lymphknoten entlang der ipsilateralen A. mammaria interna, klinisch erkennbar, in Abwesenheit von axillären N2 Lymphknotenmetastasen N2a 4 - 9 Lymphknoten, mindestens eine > 2 mm Ausdehnung Metastasen in Lymphknoten entlang der ipsilateralen A. mammaria interna, klinisch erkennbar, in Abwesenheit von N2b axillären Lymphknotenmetastasen Metastasen in mindestens 10 ipsilateralen, axillären Lymphknoten oder in ipsilateralen, infraklavikulären Lymphknoten oder in klinisch auffälligen Lymphknoten entlang der A. mammaria interna bei Vorliegen von mindestens einem positiven axillären Lymphknoten oder in mehr als 3 axillären Lymphknoten mit klinisch negativen mikroskopischen Metastasen in Lymphknoten entlang der A. mammaria interna oder in ipsilateralen supraklavikulären N3 Lymphknoten M Fernmetastasen MX Nicht beurteilbar M0 Keine Fernmetastasen 16 M1 Fernmetastasen G Grading GX Differenzierungsgrad nicht beurteilbar G1 Gut differenziert G2 Mäßig differenziert G3 Schlecht differenziert Aus der TNM-Klassifikation ergibt sich die Stadiengruppierung nach UICC (TNM 6. Aufl., 2003) wie folgt: Stadieneinteilung nach UICC (2003) Stadium 0 Tis N0 M0 Stadium I T1 N0 M0 Stadium IIA T0,T1 N1 M0 T2 N0 M0 T2 N1 M0 T3 N0 M0 T0,T1,T2 N2 M0 T3 N1,N2 M0 Stadium IIIB T4 N0,N1,N2 M0 Stadium IIIC Jedes T N3 M0 Stadium IV Jedes T Jedes N M1 Stadium IIB Stadium IIIA 2.2 Nachweis von uPA und PAI-1 durch einen zweifach standardisierten ELISA im Tumorgewebe der intraoperativ gewonnenen Proben 2.2.1 Gewinnung und Aufbewahrung Die Gewinnung der Proben geschieht intraoperativ, wobei die Operation meist einige Tage nach der Stanze zur Biopsie durchgeführt wird. Das entnommene Material wird sofort auf Eis gelagert, und nach der Diagnostik durch die Pathologie wird ein ca. 50 mg großes Stück Tumorgewebe mit möglichst geringem Fettgewebsanteil entnommen, bei -20 °C ein gefroren und bis zur uPA- und PAI-1-Bestimmung unfixiert und gefroren gelagert. Der Transport ins Labor wird auf Trockeneis vorgenommen. 17 2.2.2 Bestimmung der uPA- und PAI-1-Gewebekonzentration Die Bestimmung der uPA- und PAI-1-Gewebekonzentrationen erfolgt durch den FEMTELLE uPA/PAI-1 Prognose Test von American Diagnostica. Der Test basiert auf einem gegen humanes uPA bzw. humanes PAI-1 gerichteten, hoch spezifischen monoklonalen Maus Fängerantikörper. Der ELISA ist zweifach standardisiert, zum einen über die Eichgrade und zum anderen über die Normierung pro Gramm Tumorgewebe durch den Proteinassay. Die Bearbeitung des Probenmaterials umfasst drei aufeinanderfolgende Tage, am ersten Tag erfolgt die Cytosolherstellung mit anschließender Inkubation über Nacht, am zweiten Tag werden die Testplatten für den Proteinassay belegt und der uPA- und PAI-1-ELISA angesetzt. Am dritten Tag wird der BCAProtein-Assay ausgewertet und der ELISA-Test durchgeführt. Anschließend werden die uPA- und PAI-1-Konzentrationen im Gesamtgewebe berechnet. 2.2.2.1 Tumoraufbereitung und Cytosolherstellung Die Tumorproben werden aus dem Kühlschrank entnommen; davon werden 200 mg Gewebe abgewogen und mit dem Skalpell zerkleinert (Abb. 3). Abb. 3: Zerkleinerung der Probe mit dem Abb. 4: Pulverisierung im Dismembranator Skalpell 18 Das Gewebe wird in vorgekühlten Teflongefäßen mit Wolframkugeln N2-liqu. gekühlt und im Dismembranator für 30 s bei 2000 U min-1 dismembraniert (Abb. 4). Das Gewebepulver wird in Sarstedtgefäßen mit Vorlage von 600 µl TBSGebrauchslösung gelöst, danach werden die Zellen durch Zugabe von 67 µl 10 % Tritron X-100-Lösung lysiert. Die Gewebesuspension wird für 14 - 16 Stunden bei 4 °C auf dem Rollenmischer gerührt. Darauf folgt die Zentrifugation der Cytosole für 45 min mit 14000 U min-1 bei 4 °C. Die Lipidschicht wird, wenn nötig, entfernt u nd aus der klaren Cytosolschicht werden aliquote Anteile für die Analysen entnommen (Abb. 5). Lipide Gewebeextrakt Sediment Abb. 5: Gewebeextrakt 2.2.2.2 Proteinbestimmung Die Proteinbestimmung wird mit dem BCA Proteintest von Pierce (Pierce BCA Protein Assay Kit) durchgeführt, da dieser nicht durch die Detergenzien des Femtelle-Testes gestört wird. Zunächst wird der BCA-Verdünnungspuffer hergestellt, danach werden nach Schema mit Waschpuffer die Proteinstandards im Probenröhrchen angesetzt, dann wird die Farblösung für den BCA Assay angesetzt. Entsprechend dem Pipettierplan werden 50 µl Proteinprobe pro Well in eine Mikrotiterplatte gegeben, 200 µl Farblösung pro Well werden hinzugefügt. Die Platte wird mit Folie abgedeckt und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. 19 Der Farbumschlag nach Hellblau (Abb. 6) wird im ELISA-Reader bei 550 nm ausgewertet. Schließlich werden die Werte ins Ecxelprogramm importiert, und die Auswertung wird kontrolliert. Abb. 6: BCA Protein Assay 2.2.2.3 Durchführung des uPA-/PAI-1-ELISAs Zuerst werden die uPA- und PAI-1-Standards, der Waschpuffer und der Probenpuffer hergestellt. Für die uPA- und PAI-1-Bestimmungen werden 1 : 20 und (für hohe Aktivität) 1 : 40 Verdünnungen hergestellt. Der Belegplan der Mikrotiterplatten wird vorbereitet, und auf Eis oder bei 4 °C werden je 100 µl Standard in die Wells pipettiert, danach werden je 100 µl Probenmaterial zugefügt. Die Wells werden mit Folie abgedeckt und über Nacht bei 4 °C im Kühlschrank inkubiert. Am folgenden Tag werden die Detektionsantikörper hergestellt, und die H2SO4Lösung (Stopplösung) wird bereitgehalten. Die Wells werden 4-mal gewaschen, und anschließend werden je 100 µl uPA Detektionsantikörper in die uPA-Wells sowie je 100 µl PAI-1 Detektionsantikörper in die PAI-1-Wells gegeben. Die Platten werden mit Folie abgedeckt und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Während der Inkubation wird der Enzymkonjugatverdünner zubereitet, und damit werden die uPA- und PAI-1-Enzymkonjugate hergestellt. Nach der Inkubation werden die Wells wieder 4-mal gewaschen, und 100 µl uPA- oder PAI-1-Enzymkonjugat in die entsprechenden Wells pipettiert. Die Wells werden noch einmal für 1 Stunde gut abgedeckt, bei Raumtemperatur inkubiert und 20 wieder 4-mal gewaschen. Danach werden 100 µl TMB-Substratlösung in die Wells gefüllt und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert (blaue Farbentwicklung). Nach 20 Minuten wird die Reaktion durch Zugabe von 50 µl Stopplösung gestoppt (Farbumschlag nach Gelb) (Abb. 7 und Abb. 8). Die Messung ist innerhalb von 15 Minuten bei 450 nm (Referenzwert 620 nm) vorzunehmen. Die Werte werden ins Excelprogramm importiert, und die Auswertung wird kontrolliert. Abb. 7: uPA-Wells nach der Stoppreaktion Abb. 8: PAI-1-Wells nach der Stoppreaktion 2.2.2.4 Auswertung Die Auswertung erfolgt durch das Excelprogramm uPA-PAI-Assay. Zuerst wird die BCA-Eichkurve (Abb. 9) aus den Mittelwerten der jeweiligen Doppelbestimmung berechnet. Hieraus wird die Trendlinie y = mx + b (m steht für die Steigung und b für den x-Achsenabschnitt) mit y = Absorption und x = Konzentration bestimmt. Die Bestimmung der Konzentration der verdünnten Patientinnenproben ergibt sich aus der Trendlinie nach x = (y – b)/m. Anschließend wird mit dem Verdünnungsfaktor multipliziert, und die Werte werden von µg/ml in mg/ml umgerechnet. Das Programm wirft als Zwischenergebnisse die Proteinkonzentration der Patientinnenproben in mg/ml aus. Zur Kontrolle dienen die BCA-Eichkurve und die Regressionsparameter. 21 BCA-Eichkurve 29.02.200 8 1,200 1,000 Abs. (550 nm) 0,800 0,600 y = 0,0021x + 0,1011 0,400 R2 = 0,9935 0,200 0,000 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Proteinkonzentration (µg/ml) Abb. 9: Beispiel einer BCA-Eichkurve Nach Eingabe der uPA- und PAI-1-Messwerte und des Verdünnungsfaktors der Patientinnenproben, werden die uPA-Eichkurve aus den uPA-Standards und die PAI-1-Eichkurve (Abb. 10) aus den PAI-1-Standards berechnet. Hieraus wird wieder die Trendlinie y = mx + b mit y = Absorption und x = Konzentration bestimmt. Die Bestimmung der Konzentration der verdünnten Patientinnenproben erfolgt aus der Trendlinie nach x = (y - b)/m und Multiplikation mit dem Verdünnungsfaktor der Proben (uPA-/PAI-1-Werte in ng/ml). Die uPA-PAI-1-Werte [ng/ml] werden durch den Proteingehalt der Proben [mg/ml] aus dem Datenblatt der BCA-Auswertung dividiert. Es erfolgt die Ausgabe der uPA- und PAI-1-Werte in ng/mg Gewebe. Zur Kontrolle dienen die uPA-Eichkurve bzw. die PAI-1-Eichkurve sowie die Regressionsparameter. 22 PAI-1-Eichkurve 29.02.200 1,4 1,2 Abs. (450 nm) 1 0,8 y = 0,1154x + 0,0992 R2 = 0,993 0,6 0,4 0,2 0 0 2 4 6 8 10 12 c (ng/ml) Abb. 10: Beispiel einer PAI-1-Eichkurve 2.2.2.5 Cut-off-Werte In großen Studien hat sich gezeigt, dass zur Abschätzung des Rezidivrisikos und des Ansprechens auf eine Chemotherapie bei nodal-negativem Mamma-Ca der cut-off-Wert für uPA in Tumorgewebe 3 ng/mg Gesamtprotein beträgt. Für PAI-1 liegt der cut-off-Wert bei 14 ng/mg Gesamtprotein. Das Risiko ist jedoch bereits erhöht, wenn eine der beiden Substanzen größer als der Grenzwert ist. 2.3 Statistische Auswertung Die statistische Auswertung wurde mit dem Programm Microsoft Excel 2002 durchgeführt. 23 2.3.1 Elementare Statistiken und Aufzählungen Das Kollektiv wurde in den Untergruppen uPA und PAI-1 beschrieben. Hierzu wurden sowohl das arithmetische Mittel als auch der Median berechnet. Die Häufigkeitsauszählung aller verschiedenen Werte von u-PA und PAI-1 wird ausgegeben mit Angabe von Maximum, Minimum, Varianz und Standardfehler. Zur Beschreibung des arithmetischen Mittels wurde das 95 % Konfidenzintervall definiert. Die Güte des Mittelwertes wurde über die Definition des Standardfehlers kontrolliert. Die relative Standardabweichung wurde durch den Variationskoeffizienten ermittelt. Die Signifikanz wurde nach Fischer berechnet. 2.3.2 Gruppenvergleich Der Gruppenvergleich wurde aufgetragen in einem Exceldiagramm. Es wurden die uPA- und PAI-1-Werte korreliert. Anschließend wurde durch Excel eine Regressionsgerade bestimmt. 2.4 Verwendete Geräte und Reagenzien 2.4.1 Geräteliste - Dismembranator: Mikro-Dismembrator S, Sartorius, Göttingen - Mixer, Uzusio VTX-3000L, LMS, Japan - Kühlzentrifuge, 5417 R, Eppendorf, Hamburg - Laborwaage, 440-33N, KERN, Deutschland - Rollenmischer, RM 5, Assistent, Sontheim - Pipettensatz, Eppendorf, Hamburg - Elisa-Photometer, Spectra Mini, Tecan, Crailsheim - Kryobehälter, 18HC, Taylor-Wharton, USA - Kryogefäße, Cryo-Tube, Nunc, Wiesbaden - Mikrotiterplatten, Sarstedt, Nümbrecht 24 2.4.2 Chemikalienliste - uPA/PAI-1 Test, FEMTELLE, Best.-Nr.: 899, American Diagnostica inc., Pfungstadt - BCA Protein Assay Kit, Prod.-Nr.: 23225, Thermo Scientific, Bonn - Albumin Standard, Prod.-Nr.: 23209, Thermo Scientific, Bonn - Protein Standard, Precinorm, Prod.-Nr.: 10557897, Roche Diagnostics, Mannheim - uPA/PAI-1-Qualitätskontrollproben, Radbound Universität, Nijmegen, NL - Bovines Serumalbumin (BSA), Best.-Nr.: A7030, Sigma, Taufkirchen - Schwefelsäure, Best.-Nr.: 84718, Sigma (Fluka), Taufkirchen 25 3 Ergebnisse Die Resultate der Untersuchungen werden im Folgenden beschrieben. Dabei erfolgt eine Unterteilung in methodische Ergebnisse und Ergebnisse der Proteasenbestimmung im Patientinnenkollektiv. 3.1 Methodische Ergebnisse 3.1.1 Proteinbestimmung Die Proteinbestimmung erfolgt mit dem BCA Protein Assay (Thermo Scientific, 23255). Zur Eichung wird BSA eingesetzt, das in Ampullen aliquotiert im Testkit vorhanden ist. BCA-Eichkurve 24.06.2008 1,200 1,000 Abs. (550 nm) 0,800 0,600 y = 0,0012x + 0,1005 2 R = 0,9982 0,400 0,200 0,000 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 Proteinkonzentration (µg/ml) Abb. 11: Eichfunktion der Proteinbestimmung (Lot IK 117541) Der ermittelte Korrelationskoeffizient (>0,99) bestätigt die gute Anpassung der Ausgleichsgeraden im Messbereich. Nach Angaben des Herstellers (Instructions for use) ist bis zu einer Proteinkonzentration von 2000 µg/ml ein linearer Verlauf der Eichfunktion zu erwarten. 26 Zur Überprüfung der Richtigkeit der Proteinbestimmung wurde eine Eichproteinmischung der Firma Roche Diagnostics eingesetzt (Precinorm 10557897, Lot 170856). Den Hauptbestandteil dieser Proteinmischung stellt Albumin dar. Da bei einer Precinormkontrolle der ermittelte Messwert und der Sollwert im BCA-Test unzureichend übereinstimmten, wurde eine Konzentrationsreihe dieser Proteinmischung gemessen. Das Ergebnis ist in Abbildung 12 wiedergegeben. Das Eichprotein BSA und die Proteinmischung Precinorm werden mit einer unterschiedlichen Steigung der Eichgeraden, d. h. mit einer unterschiedlichen Nachweisempfindlichkeit, bestimmt. Es ist zwar bekannt, dass unterschiedliche Proteine mit unterschiedlichen Nachweisempfindlichkeiten im BCA-Test erkannt werden, das ermittelte Ergebnis ist allerdings unerwartet, weil Albumin die Hauptkomponente der Precinorm-Proteinmischung darstellt. Um auszuschließen, dass die Ursache der unterschiedlichen Testempfindlichkeit zwischen BSA und Precinorm in der Herkunft des Albumins zu suchen ist (bovin – human), wurden Gewebeaufarbeitungen von 4 Patientinnen, deren Proteinkonzentration vorher bestimmt war, in den Verdünnungen 1 : 10, 1 : 20, 1 : 40 und 1 : 80 eingesetzt. Wie aus Abb. 12 ersichtlich, entspricht die Testempfindlichkeit der Patientinnenproben weitgehend dem Verlauf der BSA-Eichkurve. Die Reststreuung zur BSAEichkurve wurde jeweils für alle Patientinnenmesspunkte als Maß für den zu erwartenden Fehler nach der folgenden Funktion ermittelt: R = ΣSoll-Ist/ΣIst Tab. 1: Reststreuung von Verdünnungsreihen von 4 Gewebeaufarbeitungen Pat. 1 Reststreuung in 13 % Pat. 2 Pat. 3 Pat. 4 20 % 17 % 16 % % Hierbei ist zu berücksichtigen, dass die Gewebeaufarbeitungen für diesen Versuch erneut aufgetaut werden mussten. Die Proben sind nicht homogen, sondern es befinden sich drei Phasen in dem eingefrorenen Zentrifugenröhrchen. Weiterhin müssen Pipettierfehler und Verdünnungsfehler 27 berücksichtigt werden. Vor diesem Hintergrund ist die Präzision der Proteinbestimmung akzeptabel. 1,2 BSA 1 Abs. (550 nm) 0,8 Patient 2 Precinorm Patient 4 0,6 Patient 3 0,4 Patient 1 0,2 0 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 Proteinkonzentration (µg/ml) Abb. 12: Konzentrationsreihen verschiedener Proteinproben im BCA-Test 3.1.2 Eichfunktion des FEMTELLE ELISAS Zur Bestimmung der Richtigkeit der uPA- und PAI-1-Bestimmung im ELISA wurden zwei Qualitätskontrollproben aus der Radboud Universität, Nijmegen, NL eingesetzt. Es handelt sich hierbei um Tumorzellextrakte aus Nacktmäusen, die durch die humane Brustzelllinie MDA-MB231 induziert waren. Tab. 2: Sollwerte der Referenzproben Referenzprobe uPA (ng/ml) PAI-1 (ng/ml) 1. (210800) 0,31 5,50 2. (281107) 0,52 5,89 Für die quantitative uPA- und PAI-1-Bestimmung wurde mit den Standardproben des FEMTELLE-Tests (American Diagnostica, Ref. 899; Lot 071024) eine Eichfunktion berechnet. Die Eichfunktion wurde nach dem Verfahren der Minimierung der Reststreuung angepasst. Es wurden jeweils eine 28 lineare und eine quadratische Eichfunktion ermittelt und zur Berechnung der Sollwerte verwendet. Die Eichfunktionen sind in der Abb. 13 (uPA) und Abb. 14 (PAI-1) dargestellt. Tab. 3: Sollwertabweichungen der uPA-Referenzproben Messwerte linear Differenz quadratisch (linear) in % Differenz (quadratisch) in % uPA-Referenz 1 0,35 12,9 0,30 3,2 uPA-Referenz 2 0,56 7,6 0,49 5,8 quadratisch Differenz Tab. 4: Sollwertabweichung der PAI-1-Referenzproben Messwerte linear Differenz (linear) in % (quadratisch) in % PAI-1-Referenz 1 5,80 5,5 5,12 6,9 PAI-1-Referenz 2 6,04 2,5 4,84 17,8 uPA-Eichkurve 24.06.2008 2,5 Abs (450 nm) 2 1,5 y = 1,7641x + 0,1749 R 2 = 0,9782 1 y = -0,8794x2 + 2,63x + 0,0759 2 R = 0,996 0,5 0 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 c (ng/ml) Abb. 13: Lineare und quadratische Anpassung der uPA-Eichfunktion 29 PAI-1-Eichkurve 24.06.2008 2,5 Abs. (450 nm) 2 1,5 y = 0,1754x + 0,1582 R2 = 0,98 1 2 y = -0,0092x + 0,2658x + 0,0549 R2 = 0,9997 0,5 0 0 2 4 6 8 10 12 c (ng/ml) Abb. 14: Lineare und quadratische Anpassung der PAI-1-Eichfunktion Es ist den Abbildungen zu entnehmen, dass sowohl die lineare als auch die quadratische Anpassung eine geeignete Eichfunktion darstellen. Die Korrelationskoeffizienten aller Regressionsfunktionen sind besser als 0,97. 3.1.3 Reproduzierbarkeiten Zur Bestimmung der Reproduzierbarkeit der uPA- und PAI-1-Bestimmungen mit den FEMTELLE ELISAs wurde eine Probe aus einem Pool von 4 Einzelproben hergestellt, aliquotiert und bei -20 °C eingefroren . Die aliquotierten Poolproben lieferten über 10 Monate relativ reproduzierbare Ergebnisse, danach fingen die Messwerte an, stärker zu streuen, was auf das Ablaufen der Haltbarkeit zurückgeführt wurde. Tab. 5: Interassayreproduzierbarkeit der Proteinbestimmung (BCA-Test) sowie der uPA- und PAI-1 Messwerte bei 10 Wiederholungsmessungen Proteinbestimmung uPA (ng/mg) PAI-1 (ng/mg) 2,50 5,2 31,4 2,56 4,3 28,7 (ng/mg) 30 2,52 5,0 27,4 2,54 4,4 29,4 2,53 5,5 29,8 2,38 5,5 26,2 2,55 5,1 28,3 2,57 5,0 24,3 2,73 5,8 26,5 2,73 5,2 25,7 Mittelwert 2,55 5,1 27,8 Standardabweichung 0,098 0,469 2,151 Variationskoeffizient 3,85 % 9,20 % 7,75 % Die Proteinbestimmung weist mit einer Interassayreproduzierbarkeit von 3,85 % eine sehr gute Präzision auf. Die Streuung der Proteinbestimmung geht in die Berechnung der uPA- und PAI-1-Konzentrationen im Tumorgewebe direkt ein, da die im jeweiligen Elisa ermittelten Konzentrationen pro Volumeneinheit in Konzentration pro mg Tumorgewebe umgerechnet werden. Die ermittelten Interassayreproduzierbarkeiten von 9,2 % für die uPA-Bestimmung und 7,8 % für die PAI-1-Bestimmung im Tumorgewebe sind als gut zu bewerten. 3.2 Proteasenbestimmung im Patientinnenkollektiv 3.2.1 Allgemeine Ergebnisse Das Patientinnenkollektiv umfasst 309 Fälle. Zum Zeitpunkt der Operation waren die Patientinnen in einem Alter zwischen 34 und 89 Jahren; das durchschnittliche Alter betrug 63,13 Jahre. Die cut-off-Werte wurden nach dem FEMTELLE-Protokoll von American Diagnostica GmbH festgelegt, und zwar für uPA bei 3 ng/mg und für PAI-1 bei 14 ng/mg. Da Werte unterhalb des cut-offs ein negatives Testergebnis, aber ein positives Ergebnis für die Patientin beinhalten, werden im weiteren Verlauf die Messwerte als hohe Werte (Werte oberhalb des cut-offs) und niedrige Werte (Werte unterhalb des cut-offs) bezeichnet, um Verwechslungen vorzubeugen. 31 Insgesamt wurden unabhängig von Tumorgröße und -differenzierung sowie dem Alter der Patientinnen bei 19,74 % der Proben uPA- und PAI-1-Konzentrationen unterhalb der cut-off-Werte von 3 ng/mg (uPA) und 14 ng/mg (PAI-1) im Tumorzytosol gemessen. Die uPA-Werte erstrecken sich zwischen 0 und 33,3 ng/mg mit einem arithmetischen Mittel von 5,42 ng/mg, wobei der Standardfehler 0,12 beträgt und das 95 %-Konfidenzintervall bei 4,34 ng/mg liegt; der Median ist 4,2 ng/mg. Die Standardabweichung der uPA-Werte beläuft sich auf 4,43 mit einer Varianz von 19,72 und einem Variationskoeffizienten von 0,82. Insgesamt blieben 35,28 % der Patientinnen unter dem festgelegten cut-offWert von 3 ng/mg. Für die PAI-1-Werte wurden die gleichen statistischen Methoden verwendet; daraus ergeben sich folgende Werte; für das arithmetische Mittel 42,58 ng/mg mit einem Standardfehler von 0,35 sowie für das 95 %-Konfidenzintervall 15,04 ng/mg und 33,1 ng/mg für den Median. Die PAI-1-Werte erstrecken sich von 0 ng/mg bis zu einem Maximum von 270,2 ng/mg. In dieser Datengruppe beträgt die Standardabweichung 38,37 mit einer Varianz von 1477,27 und einem Variationskoeffizienten von 0,9. Hier lagen insgesamt 19,74 % der Patientinnenproben unter dem festgelegten cut-off-Wert von 14 ng/mg. 3.2.2 Korrelation der Messwerte mit der Tumorgröße Es besteht in diesem Kollektiv ein signifikanter Zusammenhang zwischen der Tumorgröße der Patientinnen und der Konzentration im Tumorzytosol von uPA und PAI-1 oberhalb der jeweiligen cut-off-Werte von 3 ng/mg bzw. 14 ng/mg mit p = 0,09 (Tab. 6). Tab. 6: Korrelation der uPA- und PAI-1-Werte zur Tumorgröße Anzahl der Patientinnen uPA >3 ng/mg PAI-1 >14 ng/mg pT 1a 3 1 3 pT 1b 41 21 27 32 pT 1bm 2 2 2 207 137 170 pT is 3 1 2 pT 2 51 38 43 pT 3 1 0 1 Sonstiges 1 0 0 309 200 248 pT 1c Gesamt Patientinnen mit niedrigen uPA- und PAI-1-Werten 100 90 80 Prozent 70 60 50 pT 1b 34,15 40 pT 1c 17,87 30 20 10 pT 1a 0,00 pT 2 15,69 pT 3 0,00 0 1 Prozentualer Anteil der Patientinnen mit niedrigen uPA-und PAI-1-Werten im entsprechenden Tumorstadium Abb. 15: Prozentualer Anteil der Patientinnen mit niedrigen uPA- und PAI-1-Werten im entsprechenden Tumorstadium Im Tumorstadium pT 1b haben 34,15 % der Patientinnen niedrige Werte, das heißt, sowohl der uPA- als auch der PAI-1-Wert liegen unterhalb des cut-offWertes. Dieser Prozentsatz fällt im Tumorstadium pT 1c auf 17,87 % ab und im Tumorstadium pT 2 haben dann nur noch 15,69 % der Patientinnen sowohl niedrige uPA- als auch niedrige PAI-1-Werte, dieser geringe Unterschied ist dadurch zu erklären, dass sich aus unserem Kollektiv 51 Patienten im Stadium pT 2 jedoch 207 im Stadium pT 1c befinden. Da im Tumorstadium pT 1a nur drei Patientinnen im Kollektiv vorhanden sind, welche alle hohe PAI-1-Werte aufwiesen, liegt in dieser Gruppe der Wert bei 0 %. Das gleiche Problem findet sich in der Gruppe pT 3, da in unserem Kollektiv nur bei einer Patientin das Tumorstadium pT 3 festgestellt wurde, diese Patientin hatte zwar einen niedrigen uPA-Wert, der PAI-1-Wert war jedoch mit 34,1 ng/mg hoch (Abb. 15). 33 3.2.2.1 Untersuchungen zu uPA In diesem Kollektiv ergibt sich nach Berechnung der Signifikanz nach Fischer ein signifikanter Zusammenhang (p = 0,09) zwischen der uPA-Konzentration im Tumorzytosol und der Tumorgröße der Patientinnen (Tab. 7). Tab. 7: Korrelation zwischen Tumorgröße und uPA-Wert Anzahl der Patientinnen Patientinnen < 3 ng/mg Patientinnen > 3 ng/mg pT 1a 3 1 1 pT 1b 41 20 21 pT 1c 207 70 137 pT 2 51 13 38 pT 3 1 0 0 Sonstiges 1 1 0 Patientinnen mit niedrigen uPA-Werten 100,00 90,00 80,00 Prozent 70,00 60,00 pT 3 100,00 50,00 40,00 30,00 pT 1a 66,67 20,00 10,00 pT 1b 48,78 pT 1c 33,82 pT 2 25,49 0,00 Prozentualer Anteil der Patientinnen mit niedrigen uPA-Werten im entsprechenden Tumorstadium Abb. 16: Prozentualer Anteil der Patientinnen mit niedrigen uPA-Werten im entsprechenden Tumorstadium Es erweist sich, dass der prozentuale Anteil der Patientinnen mit uPA-Werten unterhalb des cut-off-Wertes mit zunehmender Tumorgröße abnimmt. Im Tumorstadium pT 1a (66,67 % der Proben unterhalb des cut-offs) ist der Anteil der Patientinnen mit niedrigen uPA-Werten noch deutlich höher als im Stadium pT 1b (48,78 % der Proben unterhalb des cut-offs), allerdings sind nur drei 34 Patientinnen im Stadium 1a, jedoch 41 Patientinnen im Stadium 1b. Jedoch erfolgt ein weiterer Abfall der niedrigen uPA-Werte zu pT 1c und pT 2 mit nun nur noch 33,82 % beziehungsweise 25,49 % der Proben, die unterhalb des cutoffs liegen. Da im Kollektiv nur eine Patientin das Tumorstadium pT 3 hatte und bei dieser ein uPA-Wert von 2,8 ng/mg im Tumorzytosol gemessen wurde, liegen hier formal 100 % niedrige Werte im Tumorstadium pT 3 vor (Abb. 16). 3.2.2.2 Untersuchungen zu PAI-1 Wie oben für die uPA-Werte beschrieben, besteht in diesem Kollektiv auch ein signifikanter Zusammenhang zwischen den PAI-1-Konzentrationen im Tumorzytosol und der Tumorgröße der Patientinnen mit p = 0,09 (Tab. 8). Tab. 8: Korrelation der PAI-1-Werte mit der Tumorgröße Anzahl der Patientinnen Patientinnen < 14 ng/mg Patientinnen > 14 ng/mg pT 1a 3 0 3 pT 1b 41 14 27 pT 1c 207 37 170 pT 2 51 8 43 pT 3 1 0 1 Sonstiges 1 1 0 Da mehr PAI-1-Werte als uPA-Werte oberhalb des cut-off-Wertes lagen, ergibt sich für die Betrachtung der PAI-1-Werte das gleiche Ergebnis wie für die Betrachtung, wenn mindestens ein Wert hoch war. 35 Patientinnen mit niedrigen PAI-1-Werten 40,00 pT 1b 34,15 35,00 30,00 Prozent 25,00 pT 1c 17,87 20,00 pT 2 15,69 15,00 10,00 5,00 pT 1a 0,00 pT 3 0,00 0,00 Prozentualer Anteil der Patientinnen mit niedrigen PAI-1-Werten im entsprechenden Tumorstadium Abb. 17: Prozentualer Anteil der Patientinnen mit niedrigen PAI-1-Werten im entsprechenden Tumorstadium 3.2.3 Korrelation der Messwerte mit dem Differenzierungsgrad der Tumoren Im Folgenden wurden die uPA- und PAI-1-Messwerte im Tumorzytosol mit dem Differenzierungsgrad der Tumoren korreliert. Wenn beide Messwerte unterhalb der cut-off-Werte lagen, also sowohl der uPA- als auch PAI-1-Wert niedrig waren, besteht ein signifikanter Zusammenhang zum Differenzierungsgrad der Tumoren (p = 0,06) (Tab. 9). Tab. 9: Korrelation der uPA- und PAI-1-Werte zum Differenzierungsgrad des Tumors Anzahl der Patientinnen uPA > 3 ng/mg PAI >14 ng/mg G1 48 26 32 G2 186 109 145 G3 74 65 70 GX 1 0 1 Es ist eine deutliche Zunahme der hohen Messwerte bei abnehmender Differenzierung der Tumoren zu beobachten. Im gut differenzierten 36 Tumorstadium G1 sind 33,33 % der Patientenproben unterhalb des cut-offWertes, im Stadium G2 gibt es 22,04 % niedrige Werte, und im schlecht differenzierten Stadium G3 befinden sich nur noch bei 5,41 % der Patientinnenproben uPA- und PAI-1-Werte unterhalb des cut-off-Wertes (Abb. 18). Patientinnen mit niedrigen uPA- und PAI-1-Werten 100 90 80 Prozent 70 60 50 G1 33,33 40 30 G2 22,04 20 G3 5,41 10 0 G1 Prozentualer Anteil der Patientinnen mit niedrigen uPA- und PAI-1-Werten im entsprechenden Tumorstadium Abb. 18: Prozentualer Anteil der Patientinnen mit niedrigen uPA- und PAI-1-Werten im entsprechenden Tumorstadium 3.2.3.1 Untersuchungen zu uPA Bezogen auf die uPA-Werte im Tumorzytosol ergibt sich eine signifikante Korrelation (p = 0,07) zum Differenzierungsgrad des Tumors (Tab. 10). Tab. 10: Korrelation der uPA-Werte zum Differenzierungsgrad des Tumors Anzahl der Patientinnen Patientinnen < 3 ng/mg Patientinnen > 3 ng/mg G1 48 22 26 G2 186 77 109 G3 74 9 65 GX 1 1 0 37 Im Tumorstadium G1, also in einem gut differenzierten Stadium, sind bei 45,83 % der Patientinnen die uPA-Konzentrationen im Tumorzytosol kleiner als 3 ng/mg und damit unterhalb des cut-off-Wertes. Bei mäßig differenzierten Tumoren finden sich im Tumorstadium G2 bei 41,4 % niedrige uPA-Werte. Allerdings haben im Tumorstadium G3 bei schlecht differenzierten Tumoren nur noch 12,16 % der Patientinnen eine uPA-Konzentration unter den cut-offWerten im Tumorzytosol (Abb. 19). Patientinnen mit niedrigen uPA-Werten 50,00 45,00 40,00 Prozent 35,00 30,00 25,00 G1 45,83 20,00 G2 41,40 15,00 10,00 G3 12,16 5,00 0,00 Prozentualer Anteil der Patientinnen mit niedrigen uPA-Werten im entsprechenden Tumorstadium Abb. 19: Prozentualer Anteil der Patientinnen mit niedrigen uPA-Werten im entsprechenden Tumorstadium 3.2.3.2 Untersuchungen zu PAI-1 Auch hier zeigt sich eine signifikante Korrelation der Tumordifferenzierung zu der Konzentration der PAI-1-Werte im Tumorzytosol (p = 0,06). Tab. 11: Korrelation der uPA-Werte zum Differenzierungsgrad des Tumors Anzahl der Patientinnen Patientinnen < 14 ng/mg Patientinnen > 14 ng/mg G1 48 16 32 G2 186 41 145 G3 74 4 70 38 GX 1 0 1 Wie schon bei der Korrelation der PAI-1-Werte mit der Tumorgröße beschrieben, waren auch hier mehr PAI-1-Werte hoch als uPA-Werte, so dass sich das gleiche Ergebnis ergibt wie für die Betrachtung, wenn sowohl uPA als auch PAI-1 unterhalb der jeweiligen cut-off-Werte liegen (Abb. 20). Patientinnen mit niedrigen PAI-1-Werten 35,00 30,00 Prozent 25,00 20,00 G1 33,33 15,00 G2 22,04 10,00 5,00 G3 5,41 0,00 Prozentualer Anteil der Patientinnen mit niedrigen PAI-1-Werten im entsprechenden Tumorstadium Abb. 20: Prozentualer Anteil der Patientinnen mit niedrigen PAI-1-Werten im entsprechenden Tumorstadium 3.2.4 Korrelation der Messwerte mit dem Alter der Patientinnen Das durchschnittliche Patientinnenalter in unserem Kollektiv liegt bei 63,13 Jahren. Der Median liegt bei 64 Jahren, dass heißt, dass es keine wesentlichen Ausreißer in Bezug auf die Altersverteilung in diesem Kollektiv gibt. Allerdings besteht keine signifikante lineare Korrelation zwischen dem Alter der Patientinnen und den uPA- und PAI-1-Konzentrationen im Tumorzytosol (p = 0,28) (Tab. 12). 39 Tab. 12: positive uPA- und PAI-1-Werte in Abhängigkeit vom Patientinnenalter Anzahl der Alter (in Jahren) Patientinnen uPA > 3 ng/mg PAI-1 > 14 ng/mg 90-100 0 0 0 80-90 22 13 19 70-80 70 38 58 60-70 103 68 80 50-60 78 56 62 40-50 31 21 25 30-40 5 4 4 Das Patientinnenalter erstreckt sich zwischen 34 und 89 Jahren. Den höchsten Anteil an niedrigen Werten haben mit 22,33 % Patientinnen zwischen 60 und 69 Jahren. Bei jüngeren Patientinnen liegt in diesem Kollektiv der Anteil an niedrigen Werten bei 20 % für die 30 – 39-Jährigen, bei 19,35 % für die 40 – 49-Jährigen sowie bei 20,51 % für die 50 – 59-Jährigen. In diesem Bereich gibt es bezüglich des Alters also keine große Variation des Anteils an niedrigen Werten. Allerdings sinkt der Anteil an niedrigen Werten ab der Gruppe der 70 79-Jährigen auf 17,14 % und in der Gruppe der 80 – 89-Jährigen auf 13,64 % rapide ab. Patientinnen mit niedrigen uPA- und PAI-1-Werten 25,00 20,00 Prozent 15,00 60-69 22,33 10,00 80-89 13,64 70-79 17,14 50-59 20,51 40-49 19,35 30-39 20,00 5,00 90-99 0,00 0,00 Abb. 21: Prozentualer Anteil der Patientinnen mit negativen uPA- und PAI-1-Werten im entsprechenden Alter 40 3.2.5. Korrelation der uPA und PAI-1-Werte Insgesamt haben 23,62 % der Patientinnen komplett niedrige Werte, das heißt, der uPA-Wert liegt unterhalb von 3 ng/mg, und der PAI-1-Wert ist kleiner als 14 ng/mg. Allerdings haben mehr Patientinnen uPA-Werte unterhalb des cut-off-Wertes als PAI-1-Werte. Der Anteil an niedrigen uPA-Werten liegt bei 35 %, der Anteil an niedrigen PAI-1-Werten bei 20 %. Des Weiteren streuen die PAI-1-Werte größer als die uPA-Werte, das arithmetische Mittel der PAI-1-Werte befindet sich bei 42,58 ng/mg mit einem Median von 33,1 ng/mg und einer Standardabweichung von 38,37. Dahingegen liegt das arithmetische Mittel der uPA-Werte bei 5,42 ng/mg mit einem Median von 4,2 ng/mg; der Median ist hier viel näher am Mittelwert, das heißt, dass es nicht so viele Ausreißerwerte gibt. Außerdem zeigt die Standardabweichung von 4,43 ng/mg, dass sich die uPAWerte mehr einander annähern als die PAI-1-Werte. Korrelation zwischen uPA- und PAI-1-Werten 250 PAI-1-Werte [ng/mg] 200 150 100 50 0 0 5 10 15 20 25 30 35 uPA-Werte [ng/mg] Abb. 22: Korrelation der uPA- und PAI-1-Werte 41 4 Diskussion 4.1 Methodische Probleme Da die Untersuchungen an Tumorzytosolen durchgeführt wurden, ist das Einhalten einer lückenlosen Kühlkette von der Gewebeentnahme über die Gewebeaufarbeitung bis zur definitiven Bestimmung der Proteasenkonzentrationen im Zytosol Vorraussetzung. In dieser Arbeit wurden die Proben bei –20 °C eingefroren und gelagert und auf Trockeneis transportiert, dies entspricht den Empfehlungen von american diagnostics von September 2006. Die Proteinbestimmung erfolgt mit dem BCA Protein Assay (Thermo Scientific, 23255). Zur Eichung wird BSA eingesetzt, das in Ampullen aliquotiert im Testkit vorhanden ist (siehe Abb.11). Der ermittelte Korrelationskoeffizient (>0,99) bestätigt die gute Anpassung der Ausgleichsgeraden im Messbereich. Zur Ermittlung der Eichfunktion des FEMTELLE ELISAs wurden sowohl die lineare als auch die quadratische Regression berechnet. Es ist den Abbildungen 13 und 14 zu entnehmen, dass sowohl die lineare als auch die quadratische Anpassung eine geeignete Eichfunktion darstellen. Die Korrelationskoeffizienten aller Regressionsfunktionen sind besser als 0,97. Aus medizinischer Sicht ist die lineare Anpassung das geeignetere Modell, da im mittleren Messbereich durch den flacheren Verlauf der Eichkurve höhere Messwerte ermittelt werden. Da der Test z. Zt. aber nur therapeutische Konsequenzen für Messwerte unterhalb vorgegebener Schwellenwerte hat, ist das Risiko einer Falschaussage bei der linearen Regression geringer. 42 4.2 Klinische Bedeutung von uPA- und PAI-1 für Prognose und Prädiktion 4.2.1 Verankerung der uPA-/PAI-1-Messungen in Leitlinien Seit 2002 werden Arbeitsgemeinschaft uPAfür und PAI-1-Konzentrationen Gynäkologische Onkologie von der (AGO) als Prognosefaktoren auf höchstem Evidenzniveau LoE 1a beim nodal-negativen Mammakarzinom bewertet. Zusätzlich werden die uPA- und PAI-1- Konzentrationen von der AGO als prädiktiver Faktor für die Chemotherapie empfohlen (LoE 2a). [2] Die ISTO (Informationszentrum für Standards in der Onkologie) S3-Leitline benutzt seit 2004 die uPA- und PAI-1-Konzentrationen als alternatives Verfahren für die Therapieentscheidung beim Mammakarzinom. [15] In den ASCO Leitlinien der amerikanischen Krebsgesellschaft sind uPA und PAI-1 seit 2007 verankert. Hier wird zusätzlich für Patienten mit hohen uPAund PAI-1-Werten eine CMF (Cyclophosphamid, Methotrexat, 5-Fluoruracil) basierte adjuvante Therapie empfohlen. [3] 4.2.2 Laufende Studien Zurzeit werden in Deutschland zwei Studien durchgeführt, bei denen die Stratifizierung der teilnehmenden Patientinnen anhand der Tumorfaktoren uPA und PAI-1 erfolgt. Zum einen die NNBC-3-Studie (node negativ breast cancer III), eine gemeinsame Studie der AGO, GBG und EROTEC Receptor and Biomarker Group unter Leitung von Prof. Dr. C. Thomssoen. Hier wird bei Patientinnen mit nodal-negativem Mammakarzinom und hohem Rezidivrisiko die Risikoabschätzung mittels traditioneller klinischpathologischer Faktoren mit der Risikoabschätzung mittels tumorbiologischen Faktoren verglichen. Außerdem wird die adjuvante Kombinationstherapie mit 6 Zyklen FEC (5-Fluoruracil, Epirubicin, Cyclophosphamid) mit einer sequentiellen Therapie mit 3 Zyklen FEC, gefolgt von 3 Zyklen Docetexal verglichen. In dieser Studie werden Patientinnen mit niedrigem Rezidivrisiko beobachtet. [25] 43 Des Weiteren läuft die ADEBAR-Studie (Adjuvant Docetaxel vs. Epirubicin Based Regimen Trial, Leitung: Prof. Dr. H. Sommer, Prof. Dr. M. Kiechle, München), eine randomisierte Phase III Studie, welche FEC (5-Fluoruracil, Epirubicin, Cyclophosphamid)- mit EC-Doc (Epirubicin/Cyclophosphamid- Docetaxel)-Chemotherapie in der adjuvanten Therapie des Mammakarzinoms mit LK ≥ 4 vergleicht. [1] 4.2.3 Bisherige Publikationen In einer gepoolten Studie wurden 8377 Patientinnen mit Mammakarzinom beobachtet, die mediane Nachbeobachtungszeit lag bei 79 Monaten. Hier konnte sowohl bei nodal-positiven als auch bei nodal-negativen Patientinnen, überzeugend gezeigt werden, dass hohe uPA und PAI-1-Werte den stärksten Einfluss auf das Gesamtüberleben und das rezidivfreie Intervall haben. Des Weiteren wurde festgestellt, dass uPA- und PAI-1-Werte bei nodal-negativen Patientinnen eine große prognostische Aussagekraft haben [20]. Auch bei einer Studie in Zusammenarbeit von drei medizinischen Zentren in Frankreich stellte sich eine prognostische Aussagekraft von PAI-1 heraus, wobei in dieser Studie interessanterweise die Höhe der PAI-1-Werte unabhängig von Tumorgröße und nodalem Status waren. [9] Eine weitere Studie an 3424 Mammakarzinom-Patientinnen bezüglich des Ansprechens auf adjuvante Chemotherapie und endokrine Therapie in Abhängigkeit vom uPA- und PAI-1-Wert, ließ erkennen, dass Patientinnen mit hohen Werten einen größeren effektiven Nutzen von einer adjuvanten Chemotherapie haben und dass es keine signifikante Korrelation zwischen den Werten und einer endokrinen Therapie gibt. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass uPA- und PAI-1-Werte eine signifikante Aussagekraft bezüglich des rezidivfreien Intervalls und des Ansprechens auf eine adjuvante Chemotherapie haben. [14] Weiter konnte in einer niederländischen Studie mit 1119 Tumorproben deutlich gemacht werden, dass hohe Werte von uPA- und PAI-1-Komplexen mit einem ungünstigen histologischen Status und einem kürzeren rezidivfreien Intervall korrelieren - unabhängig von Alter, Tumorgröße, Hormonstatus, Anzahl der befallenen Lymphknoten und Chemotherapie. Die 44 Konzentration von uPA, PAI-1 sowie des uPA-PAI-1-Komplexes wurden hier durch einen quantitativen ELISA gemessen. Zusätzlich konnte auch hier gezeigt werden, dass Patientinnen mit hohen Werten des uPA-PAI-1-Komplexes einen größeren effektiven Nutzen von einer adjuvanten Chemotherapie haben. [13] Leisner et al. untersuchten in einem Kollektiv von 87 Patientinnen mit Hormonrezeptor-positivem und nodal-positivem Brustkrebs die uPA- und PAI-1 m-RNA mittels quantitativer real-time RT-PCR. Hierbei erwies sich ausschließlich die PAI-1-Genexpression als prognostischer Faktor für die Bildung von Metastasen und das Überleben. Hohe PAI-1-Expression korrelierte signifikant mit einer schlechten Gesamtprognose. Weitere signifikante Aussagen wurden für die Tumorgröße und das Alter der Patientinnen ermittelt. Die uPA-Konzentration, der nodale Status sowie die histologische Einteilung ließen keine Korrelation zum weiteren Krankheitsverlauf erkennen. [18] Schon 1995 konnte in einer niederländischen Studie gezeigt werden, dass es keine signifikante Korrelation zwischen PAI-2 und der Prognose gibt, dass allerdings in Tumoren mit hohen PAI-1 Werten hohe PAI-2-Werte mit einem längeren Rezidiv- und Metastasen-freien Intervall sowie mit einem längeren Gesamtüberleben korrelieren. [11] Auf ähnliche Ergebnisse kamen auch Spyratos et al. im Jahr 2002, wobei er zusätzlich darlegen konnte, dass bei der Analyse von uPA, PAI-1 und PAI-2 per quantitativer RT-PCR vergleichbare Ergebnisse wie bei der Analyse mit einem ELISA herauskamen. [27] 4.3 Untermauerung des Stellenwertes des Urokinasesystems als prognostischer Parameter Neben den Standardfaktoren wie Tumorgröße, Tumordifferenzierung und Alter der Patientinnen sowie Hormonrezeptorstatus gewinnen mittlerweile uPA und PAI-1 als prognostische Faktoren immer mehr an Bedeutung, da klar ersichtlich wurde, dass die Wachstums- und Metastasierungsfähigkeit eines Tumors von diesen Faktoren abhängig ist. [6] In dieser Arbeit wurde untersucht, ob die uPAund PAI-1-Werte mit Tumorgröße, Tumordifferenzierung und Patientinnenalter in Relation zu setzen sind. 45 Unabhängig von Tumorgröße, Tumordifferenzierung und dem Alter der Patientinnen lagen bei insgesamt 19,74 % der Proben uPA- und PAI-1Messwerte unterhalb der festgelegten cut-off-Werte von 3 ng/mg (uPA) beziehungsweise 14 ng/mg (PAI-1). Diese low-risk-Gruppe ist damit deutlich kleiner als in anderen untersuchten Kollektiven. Ursachen hierfür könnten zum einen Variablen im Patientinnenkollektiv sein wie Alter oder mehr Patienten mit größeren und schlechter differenzierten Tumoren. Ein weiterer möglicher Confounder könnte auch die vorangehende Stanzbiopsie sein. Durch die Gewebeverletzung wird das Gewebe zur Remodellierung angeregt, und daher könnten die uPA- und PAI-1-Werte erhöht sein. Je nach Zeitpunkt der Stanze könnten somit die Messwerte beeinflusst werden. [13] Die uPA-Messwerte korrelieren linear mit den PAI-1-Werten. Es ist jedoch auffällig, dass mehr Patientinnen uPA-Werte unterhalb des cut-off-Wertes haben (35,28 %), wobei der Anteil der niedrigen PAI-1-Werte lediglich bei 19,74 % liegt. Die PAI-1-Werte sind auch ansonsten unbeständiger als die uPAWerte, zum Beispiel haben die PAI-1-Werte eine größere Standardabweichung und größere Streubreite. Das lässt vermuten, dass PAI-1 der Wert ist, der empfindlicher reagiert als uPA, zum Beispiel auf eine Stanzbiopsie. 4.3.1 Korrelation der uPA- und PAI-1-Werte mit der Tumorgröße In unserer Studie korrelieren die uPA- und PAI-1-Werte im Tumorzytosol deutlich mit der Tumorgröße (p = 0,09). Je größer der Tumor ist, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass man einen uPA- und/oder PAI-1-Wert oberhalb der festgesetzten cut-off-Werte misst. Es hat sich gezeigt, dass das uPA- und PAI-1-System zur Wachstumsfähigkeit eines Tumors beiträgt; deshalb ist davon auszugehen, dass bei größeren Tumoren höhere uPA- und PAI-1-Werte gemessen werden, da diese das bisherige Wachstum der Tumoren mit beeinflusst haben. Unsere Ergebnisse bestätigen daher Ergebnisse aus vorangegangenen Studien, dass uPA- und PAI-1-Konzentrationen im Tumorzytosol im Zusammenhang mit der Größe der Tumoren stehen. [22] 46 4.3.2 Korrelation der uPA- und PAI-1-Werte mit der Tumordifferenzierung Je weniger differenziert ein Tumor ist, desto schlechter ist auch die damit einhergehende Prognose. Bei unseren Messungen stellte sich ein signifikanter Zusammenhang zwischen dem Differenzierungsgrad der Tumoren und den gemessenen uPA- und PAI-1-Konzentrationen dar (p = 0,06). Im Tumorstadium G3 hatten nur 5,41 % der Patienten niedrige Werte, wohingegen im Stadium G2 22,04 % der Patientinnen niedrige Werte hatten und im Tumorstadium G1 sogar 33,33 % der Patientinnen. Es scheint also ein großer Unterschied bezüglich der uPA- und PAI-1-Werte zwischen Tumorstadium G2 und G3 zu bestehen. Auch für uPA und PAI-1, unabhängig voneinander betrachtet, liegt ein großer Unterschied im prozentualen Anteil der niedrigen Werte zwischen Tumorstadium G2 und G3. Dies ist dadurch zu erklären, dass uPA und PAI-1 wesentlich am Umbau von Gewebe beteiligt sind; da bei G3 das Gewebe deutlich unstrukturierter ist als im Stadium G2, sind hier also höhere uPA- und PAI-1-Konzentrationen im Tumorzytosol zu erwarten. [29] 4.3.3 Korrelation der uPA- und PAI-1-Werte mit Patientinnenalter In Bezug auf die Korrelation der uPA- und PAI-1-Werte mit dem Patientinnenalter ist interessant zu sehen, dass die Gruppe der 60 – 69-Jährigen am meisten von einer uPA- und PAI-1-Messung profitieren, da dies die Gruppe mit dem größten Anteil an niedrigen Werten ist, insgesamt liegen 22,3 % unterhalb der cut-off-Werte. Bei den jüngeren Patientinnen liegen immer um die 20,0 % der Proben unterhalb der cut-off-Werte. Dieser Unterschied könnte darin begründet sein, dass Frauen, die in jüngeren Jahren an MammaCa erkranken, in der Regel auch an aggressiveren Tumoren leiden. [4] Weiterhin ist es interessant, dass ab dem Alter von 70 Jahren der Anteil an Patientinnen mit niedrigen Messergebnissen deutlich zurückgeht. Bezüglich des Patientinnenalters besteht keine lineare oder quadratische Korrelation mit den uPA- und PAI-1-Werten (p = 0,28). Die Verteilung der Werte lässt allerdings vermuten, dass bei einem größeren Patientinnenkollektiv eine 47 statistische Signifikanz in Form einer quadratischen Korrelation bestehen könnte. 4.4 Ausblick Der Urokinase Plasminogenaktivator (uPA) und der Plasminogenaktivatorinhibitor Typ 1 (PAI-1) gehören zu den so genannten neuen Prognosefaktoren. So konnte gezeigt werden, dass Patientinnen mit Brustkrebs, bei denen niedrige uPA- und PAI-1-Werte im Primärtumor festgestellt wurden und bei denen die regionalen Lymphknoten keine Metastasen aufwiesen, eine sehr gute Prognose für ein rezidivfreies Überleben haben. [16] Eine Studie an 3424 Brustkrebspatientinnen lieferte zudem erste Hinweise auf die prädiktive Bedeutung dieser Faktoren für das Therapieansprechen. [14] Erhöhte uPA-/PAI-1-Konzentrationen wurden weiterhin in Ovarialkarzinomen, Pankreaskarzinomen, Blasenkrebs [10] und interessanterweise im Sputum von Patientinnen mit allergischem Asthma [17] gemessen. In Zukunft wird die uPA- und PAI-1-Testung jedoch nicht mehr ausschließlich für nodal-negative Patientinnen, mit uPA- und PAI-1-Konzentrationen unterhalb der cut-off-Werte therapieentscheidende Konsequenzen haben, da sich inzwischen Medikamente, die gezielt das uPA-System angreifen, in der klinischen Entwicklung befinden. Ein von der Firma Wilex entwickelter molekularer Inhibitor von uPA und anderen Serinproteasen (WX-UK1), welcher intravenös verabreicht wird, führte in präklinischen Studien zu einer Verringerung des Primärtumorwachstums und zu einer verminderten Metastasenbildung. Die Wirksamkeit dieser Substanz wird z. Zt. in einer Phase II-Studie bei Brustkrebs und in Kombination mit Capecitabine in einer Phase I-Studie bei soliden Tumoren überprüft. [30] Ein weiterer Medikamentenkanditat der Firma Wilex ist WX-671, das oral verfügbare pro-drug von WX-UK1; dieser hat auch schon in klinischen Studien eine gute Bioverfügbarkeit bei einer guten Toleranz gezeigt und führte zu einer guten Inhibition des Tumorwachstums. [31] 48 Andere Therapieansätze sind anti-VEGF Antikörper (Bevacizumab), die in das Urokinasesystem hemmend eingreifen sollen, diese befinden sich allerdings noch in der präklinischen Entwicklung. [26] Weitere Versuchsreihen werden derzeit durchgeführt, bei denen uPA- Antikörper nicht nur uPA sondern auch die uPAR-Expression herunterregulieren. [21] 49 5 Zusammenfassung Der Plasminogenaktivator vom Urokinasetyp (uPA) und sein Inhibitor (PAI-1) gelten als neue prognostische Faktoren beim nodal-negativen Mammakarzinom. Das Urokinasesystem spielt eine Schlüsselrolle bei der Wundheilung, der Angiogenese und der Metastasierung von Tumoren durch die perizelluläre Aktivierung von Plasminogen und den Abbau der Basalmembran. Im Falle eines metastasierenden Krebses kommt es durch die Deregulierung der uPAExpression zu einer erhöhten Plasminaktivierung, die einen Abbau der extrazellulären Matrix bewirkt und damit die Metastasierung fördert. Bei 309 Patientinnen aus der Augusta Krankenanstalt in Bochum und dem Malteser Krankenhaus St. Anna in Duisburg mit nodal-negativem Mamma-Ca wurden aus einer Gewebeprobe durch den FEMTELLE uPA/PAI-1-Test von American Diagnostica die Konzentrationen von uPA und PAI-1 bestimmt. Aus ca. 0,2 g schockgefrorenen Tumorextrakten, welche entsprechend der TNMKlassifikation eingeteilt waren, wurden die uPA/PAI-1-Bestimmungen laut FEMTELLE Protokoll (09/06) durchgeführt. Die Proteinbestimmung erfolgte mit dem Pierce BCA Assay. Die cut-off-Werte wurden für uPA bei 3 ng/mg und für PAI-1 bei 14 ng/mg festgelegt. Das Durchschnittsalter der Patientinnen betrug 63,13 Jahre. Eine hohe Konzentration von uPA und PAI-1 korreliert mit einem erhöhten Metastasierungsrisiko des Tumors und einem kürzeren Gesamtüberleben der Patientinnen bei nodal-negativen Tumoren. Andererseits haben nodal-negative Patientinnen mit uPA- und PAI-1-Werten unterhalb der cut-off-Werte eine sehr gute Überlebenswahrscheinlichkeit, sodass eine adjuvante Chemotherapie nicht unbedingt indiziert ist. Patientinnen mit hohen uPA- und PAI-1-Werten haben folglich einen höheren Nutzen von einer adjuvanten Chemotherapie und in Zukunft auch von anderen in dieses System eingreifenden Medikamenten, die sich z. Zt. noch in der klinischen Entwicklung befinden. In dieser Untersuchung wurden für 19,74 % des Patientinnenkollektivs uPAund PAI-1-Messwerte unterhalb der cut-off-Werte bestimmt, damit ist die uPA/PAI-1-low-risk-Gruppe des gesamten Patientinnenkollektivs kleiner als in anderen untersuchten Kollektiven, die Ursachen hierfür könnten unter anderem 50 der Zeitpunkt der vorangegangenen Stanzbiopsie und Unterschiede im Patientinnenkollektiv sein. Des Weiteren korrelieren in dieser Studie die uPA- und PAI-1-Messwerte sowohl mit der Tumorgröße als auch mit der Tumordifferenzierung. Allerdings ließ sich keine signifikante Korrelation zum Patientinnenalter aufzeigen, wobei die Gruppe der 60 – 69-Jährigen den größten Anteil an Patientinnen mit niedrigen Konzentrationen aufweist; diese Gruppe scheint also überproportional von der uPA/PAI-1-Testung zu profitieren. 51 6 Literaturverzeichnis [1] ADEBAR-Studie (2006). (Zugriff vom 08.09.2008). http://www.estimate.de/adebar [2] AGO-Leitlinie (2001). 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Herrn Prof. Dr. med. S. Phillipou danke ich sehr herzlich für die Überlassung des Themas sowie die fürsorgliche Betreuung. Bei allen Mitarbeitern des Instituts für Pathologie und Zytologie an der Augusta Krankenanstalt bedanke ich mich für die stets gute Zusammenarbeit und die angenehme Zeit im Labor. Mein besonderer Dank gilt auch Frau PD Dr. med. G. Bonatz und Herrn Dr. med. K. Kucharski für ihre Unterstützung innerhalb ihrer Abteilungen und die Überlassung des Probenmaterials. Besonders bedanken möchte ich mich bei Frau S. Wienand für das Korrekturlesen und die redaktionellen Tipps. Last but not least danke ich meiner Familie für die vielen Anregungen und Diskussionen sowie die fortwährende Unterstützung während meines Studiums. 8 Curriculum vitae Persönliche Daten Name: Ilka Streckert Geburtsdatum: 29. April 1984 in Witten Familienstand: ledig Konfession: katholisch Schulbildung 1990 - 1994 Grundschule am Brenschen, Witten 1994 - 2003 Ruhrgymnasium, Witten 2003 Erlangen der allgemeinen Hochschulreife Studium 2003 - 2006 Studium der Humanmedizin, Ruhr-Universität Bochum 2006 - 2010 Studium der Humanmedizin, Universität Duisburg-Essen Publikationen 1. I. Streckert, uPA und PAI-1 als pognostische Faktoren bei nodal-negativen invasiven Brustkrebs, Vortrag 28.03.2007, Augusta Krankenanstalten Bochum 2. I. Streckert et al., Study on the prognostic impact of uPA and PAI-1 for nodal negative invasive breast cancer, Pathology research and practice 203 (2007) 303-304 3. S.K. Seelig, G. Bonatz, I. Streckert, S. Philippou, K. Kucharski, W. Marek, H.J. Streckert, Ein Jahr Followup primärer nodalnegativer BrustkrebsPatientinnen mit uPA- und PAI-1-Level, 27. Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Senologie, 21.-23. Juni 2007, Lübeck 4. I. Streckert et al., Klinische Bedeutung und Zukunft der prognostischen Faktoren uPA und PAI-1 bei nodal-negativem invasiven Brustkrebs, 207. Tagung der NWGGG, 23.-25. April 2008, Bochum 5. I. Streckert, G. Bonatz, K. Kucharski, G. Richartz, W. Marek, S. Philippou, H.-J. Streckert, Korrelation der PAI-2-Konzentration im Zytosol nodalnegativer Mammatumore mit klassischen pathologischen Parametern, 208. Tagung der NWGGG, 17.-19. Juni 2009, Köln 6. Submitted for publication: I. Streckert, G. Bonatz, K. Kucharski, G. Richartz, W. Marek, S. Philippou, H.-J. Streckert, The Regulatory Function of PAI-2 in Breast Cancer
