KULTIVIERUNG VON MIKROORGANISMEN

KULTIVIERUNG VON
MIKROORGANISMEN
KULTIVIERUNG VON MIKROORGANISMEN
Verfahren, das Bakterien außerhalb
des natürlichen Standortes zur
Vermehrung bringt (unbelebte
Substrate oder Zellkulturen)
1
Voraussetzungen für
Bakterienwachstum

Nährmedium

Temperaturoptimum

pH-Wert

Sauerstoff
(aerob/anaerob)
Bakterienwachstum durch binäre Teilung
Pro Stunde = 2 Teilungen
Anfangskeimzahl
1
1
Stunde
4
2
Stunden
16
3
Stunden
64
4
Stunden
256
5
Stunden
1024
6
Stunden
4096
7
Stunden
16384
8
Stunden
65536
9
Stunden
262144
 10
Stunden
 11
Stunden
1048576
4194304
 12
Stunden
16777216
 13
Stunden
67108864
 14
Stunden
268435456
 15
Stunden
1073741842
 16
Stunden
4294967296
 17
Stunden
17179869184
2
Nährmedien-Zusammensetzung

Fleischwasser od. Hefe-Extrakt (Coenzyme, anorganische
Ionen)

Pepton (Aminosäuren)

Glucose (Energie)

Feste Nährmedien enthalten zusätzlich ein
Verfestigungsmittel, z.B. Agar-Agar (aus Rotalgen
gewonnen)
Nährmedien

flüssig
3
Nährmedien

fest
Nährmedien
Streptococcus pneumoniae
auf Blutagar

Minimalmedium: enthält nur essentielle
Bestandteile

Optimalmedium: komplexes
Naturprodukt, ermöglicht optimales
Wachstum
4
Nährmedien

Minimalmedium

Optimalmedium

Selektivmedium: enthält Nährstoffe, die nur von
bestimmten Bakterien verwertet werden
können oder Wirkstoffe, die gezielt das
Wachstum mancher Arten unterdrücken
S. epidermidis und E. coli
auf Blut- und Endo-Agar
5
Nährmedien




Minimalmedium
Optimalmedium
Selektivmedium
Differenzierungsmedium:
Unterscheidung zwischen Bakterien auf
Basis von Stoffwechselleistungen
E. coli und P. mirabilis auf CLED-Agar
E. coli
P. mirabilis
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Identifizierung von Bakterien

Morphologische Merkmale
–
–
–
–
–
–

Gramverhalten
Form
Größe
Kapsel
Kolonieform
Farbe
Physiologische Merkmale
– Nachweis verschiedener Enzyme (Bunte Reihe, API)

Chemische Merkmale
– Zellwand
– Antigene
– DNA
KULTIVIERUNG VON
MIKROORGANISMEN
 Bakterien bilden auf festen Nährböden Kolonien. Man versteht
darunter mit bloßem Auge sichtbare Teilaggregationen, die infolge
einer einzelnen Bakterienzelle entstanden sind.
 Kolonien entstehen nicht nur unter Laborbedingungen (künstlichen
Bedingungen), sondern auch unter natürlichen Bedingungen auf
Substraten mit fester Oberfläche (z.B. auf Kartoffeln, Fleischwaren,
Früchten).
 Form, Struktur und Farbe der am Kolonieaufbau beteiligten Einzelzellen
bestimmen u.a. die Koloniemerkmale (Morphologie).
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KULTIVIERUNG VON
MIKROORGANISMEN
 Farbe:
 Koloniegröße:
 Oberfläche:
 Konsistenz:
 Geruch:
 Profil:
 Kolonieform:
 Kolonierand:
KEIMZAHLBESTIMMUNGEN
 Verdünnungsreihen müssen angelegt werden, um bei der
späteren Kultivierung auswertbare Koloniezahlen auf dem Agar
zu erhalten.
 In der Praxis ist die dezimale Verdünnung am gebräuchlichsten.
 Zum Anlegen einer Verdünnungsreihe wird die Originalprobe
(Verdünnungsstufe 0) 1:10 verdünnt.
 10 g auf 100 ml mit Verdünnungsflüssigkeit auffüllen,
Verdünnungsstufe 1.
8
KEIMZAHLBESTIMMUNGEN
 Aus dieser Stufe wird 1 ml entnommen und zu 9 ml
Verdünnungsflüssigkeit pipettiert (Verdünnungsstufe 2).
 Nach dem Durchmischen auf dem Reagenzglasschüttler werden weitere
Dezimalverdünnungen angelegt.
 Für jede Verdünnungsstufe wird eine frische Pipette verwendet.
 Benutzte Pipetten werden in einer Desinfektionslösung abgestellt.
 Aus der zuvor hergestellten Verdünnungsreihe werden genau
abgemessene Mengen zur Anzüchtung von Mikroorganismen verwendet
(1ml für Plattengussverfahren und 0,1 ml für Oberflächenverfahren.
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Plattengussverfahren
• 1 ml einer Verdünnungsstufe wird mit einer sterilen
Pipette in eine leere, sterile Petrischale eingebracht.
• Dazu gibt man ca. 10-15 ml verflüssigten und ca. 40°C
warmen Agar (z. B. PCA).
• Diese beiden Lösungen werden durch kreisende
Bewegungen (in Form einer 8) verteilt.
• Die verschlossene Petrischale bleibt bis zum Erstarren
des Nährbodens stehen und wird anschließend mit dem
Deckel nach unten bebrütet.
Oberflächenspatelverfahren
• 0,1 ml einer Verdünnungsstufe wird mit einer
sterilen Pipette auf eine fertig gegossene
Agarplatte aufgebracht.
• Der Tropfen wird mit einem sterilen gebogenen
Glasstab (Drigalski-Spatel) gleichmäßig auf der Platte
verteilt.
• Die Petrischale wird mit dem Deckel verschlossen.
• Erst wenn der Ausstrich getrocknet ist, wird die
Schale mit dem Deckel nach unten bebrütet.
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Plattengussverfahren
Oberflächenspatelverfahren
DI
Ü3
VERDÜNNUNGSREIHE (Gruppenbeispiel)


Anlegen einer Verdünnungsreihe aus einer Mischkultur (0rginal Probe, 1, 2, 3, 4)
Bestimmung der Kolonie Bildende Einheiten KBE/ml einer Keimsuspension mittels
Koch'schem Plattenverfahren
– Gesamtkeimzahl (GP, PCA Agar, 22°C),
– E. coli und coliformen Bakterien (OF, CCA Agar, 37°C),
– Enterokokken (OF, KANA Agar, 44°C),
– S. aureus (OF, BP Agar, 37°C).
STUFE
Gesamt Keimzahl PCA,
22°C/2d
Coliforme Bakterien/E. coli
CCA,37°C/ 1d
0
/
1
/
2
/
3
/
4
/
Ergebnis
(Mittelwert)KBE/ml
/
Enterokokken
KANA, 44°C/1d
S. aureusBP, 37°C/1d
11

Auswertung

Auswertung
Gesamtkeimzahl (PCA)
Coliforme, E. coli (CCA)
12

Auswertung

Auswertung
Staphylokokken (BP)
Enterokokken (KANA)
13

Auswertung
Berechnung am Beispiel PCA
Stufe
Wert
2
418
x
102
=
418
x
102
3
34
x
103
=
340
x
102
4
4
x
104
=
400
x
102
1158
x
102
1158
x
102
3,9
x
104
Mittelwert bilden
Ergebnis
:3 =
386x102
14