ChaperoneActivityand Oligomerizationof Bacterial - ETH E
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Research Collection Doctoral Thesis Chaperone activity and oligomerization of bacterial small heat shock proteins Author(s): Studer, Sonja Publication Date: 2002 Permanent Link: https://doi.org/10.3929/ethz-a-004355045 Rights / License: In Copyright - Non-Commercial Use Permitted This page was generated automatically upon download from the ETH Zurich Research Collection. For more information please consult the Terms of use. ETH Library Diss. ETH Nr. 14550 Chaperone Activity and Oligomerizationof Bacterial Small Heat Shock Proteins A dissertationsubmitted to the SWISS FEDERAL INSTITUTEOF TECHNOLOGYZÜRICH For the degree of DOCTOR OF NATURAL SCIENCES presentedby Sonja Studer Dipl. Natw. ETH born on December28, 1972 from Zürich accepted on the recommendationof Hennecke,examiner PD Dr. Franz Narberhaus, co-examiner Prof. Dr. Pierre Goloubinoff,co-examiner Prof. Dr. Hauke Zürich 2002 Abstract / Kurzfassung Abstract The heat shock response is a universal mechanism allowing organisms to cope with the elevated temperatures. Small heat shock proteins unfolding of cellular proteins at (sHsps) are among the least studied components of the intricate network of chaperones and proteases known as heat shock proteins (Hsps). Numerousin vitro studies indicate that sHsps may act as ATP-independentchaperones, but their actual functions and implications in vivo are still poorly understood. Small heat shock protein genes have been identified in most genomes from bacteria to men. Many eukaryotes induce multiple sHsps, a phenomenon that is rather unusual for bacteria. So far, rhizobia are the only bacteria known to induce multiple sHsps. The record is presently held by Bradyrhizobium japonicum, which possesses at least ten sHsps belonging to two distinct classes, A and B. B. japonicum serves thus as a suitable model organism for studying functions and interactions of bacterial sHsps. Two class A (HspB and HspH) and two class B proteins (HspC and HspF) were chosen as representative examples and thoroughly analyzed in vivo and in vitro. The results of these studies are reported in this thesis. Expression and complementation studies in an Escherichia coli System provided neither direct nor indirect evidence for chaperone function of the selected sHsps in vivo. No enhancementof heat and cold tolerance was observed in E. coli cultures overex- pressing B. japonicum sHsps, and inactivation of the model Substrate luciferase could not be prevented. Growth of an E. coli dnaK ibpAB triple mutant at elevated tempe¬ ratures was partially restored by controlled expression of the E. coli sHsps IbpA and IbpB, but not by B. japonicum proteins. Apparently, E. coli cells do not benefit from individually expressed B. japonicum sHsps, neither at physiological temperatures nor under heat stress. Rather on the contrary, it seems that overproduction of individual sHsps exerts a detrimental effect on cell growth. It could be envisaged that the small heat shock proteins ofB. japonicum fulfil functions differentfrom their E. coli counterparts, or that their activitydepends on interaction with other sHsps. For further biochemical characterization, the four selected proteins were provided with a carboxyterminal hexahistidine-tag, overproduced and purified by affinity chromatography. A hallmark of sHsps is their assemblyinto large oligomericcomplexes. In electron micrographs, the purified B. japonicum proteins appeared as large, roughly spherical particles. Size exclusion chromatographyconfirmed the formation of com- Abstract / Kurzfassung plexes with a molecular mass of 400-500 kDa, comprising approximately 24 subunits. These complexesefficiently protected the model Substrate citrate synthase against thermally induced aggregation in vitro, indicating that HspB, HspC, HspF and HspH are true ATP-independentchaperones despite their apparent lack of function in vivo. Co-purification assays with hexahistidine-tagged and untagged sHsps demonstrated that B. japonicumsHsps are able to interact in vitro. Heterooligomers, whose chaperone activity was indistinguishable from homooligomeric complexes, were formed of diffe¬ rent sHsps belonging to the same class. Interestingly, B. japonicum proteins also interacted with sHsps of the same class derived from other organisms, but not with B. japo¬ nicum sHsps from the other class. Thus, heterooligomerformation of sHsps is clearly a class-specific process. sHsps from different classes share no more than approximately 25% sequence identity. Sequence divergence between class A and B is particularly pronouncedin the Nand C-terminal parts of the proteins regions that might play a crucial role in classspecific subunit interactions. Stepwise truncation of the N-terminal region and C-termi¬ nal extension allowed mapping protein regions that are critical for both oligomerization and chaperone activity. Truncations in the N-terminal region as well as the C-terminal extension were associated with incomplete sHsp oligomerizationand a lack of chape¬ rone activity. Formation of distinct dimeric to octameric complexes suggested that oligomerizationtakes place in a stepwise manner. A dimer formed by the central acrystallin domain and parts of the N-terminal region was identified as basic building - block. Site-directed mutagenesis of conserved residues further narrowed down the inter- acting sites in the C-terminalextension. A conserved isoleucine x isoleucine motif proved to be of particular interest, since individual isoleucine exchanges affecting this motif sufficed to impair oligomerizationof B. japonicumHspH. The mutated proteins formed small, presumably dimeric complexes devoid of chaperone activity. Further structural and functional characterization should help to expand our knowledge of the dynamic behaviour of small heat shockproteins in the future. - - Abstract/ Kurzfassung Kurzfassung Die Hitzeschockantwort ist ein universeller Mechanismus, mit dem sich Organismen der Entfaltung von Proteinen bei erhöhten Temperaturen schützen. Die kleinen Hitzeschockproteine(sHsps) zählen zu den am wenigsten erforschten Bestandteilen dieses komplexen Netzwerks aus Chaperonen und Proteasen, die zusammengefasstals Hitzeschockproteine bekannt sind. Zahlreiche in vtYro-Studien haben gezeigt, dass sHsps als ATP-unabhängige Chaperone wirken können, doch über ihre tatsächliche Funktion in vivo ist wenig bekannt. Gene, die für kleine Hitzeschockproteinecodieren, vor sind in den meisten Genomen Eukaryoten Bakterien bis hin von zum Menschen zu finden. Viele sHsps, ein für Bakterien eher ungewöhnliches Phäno¬ men. Die Induktion mehrerer sHsps ist bisher nur bei Rhizobien bekannt. Den Rekord hält derzeit Bradyrhizobium japonicum mit mindestens zehn sHsps, die sich in zwei induzierenmehrere verschiedene Klassen (A und geeigneten Modellorganismus B) einteilen lassen. Dies macht B. für Untersuchungenzur Funktion japonicum zu einem und Interaktion von bakteriellen kleinen Hitzeschockproteinen.Stellvertretend für die Vielfalt der sHsps in B. japonicum wurden je zwei Proteine der Klassen A (HspB und HspH) und B (HspC und HspF) in vivo und in vitro analysiert. Die vorliegende Dissertation stellt die Ergeb¬ nisse dieser Untersuchungen vor. Expressions- und Komplementationsstudien in Escherichia coli konnten weder direkte noch indirekte Hinweise auf eine Chaperonfunktion dieser ausgewählten sHsps in vivo liefern. Überproduktion von B. japonicum sHsps machteE. coli Kulturen nicht toleranter gegenüber Hitze- und Kältestress und konnte die Inaktivierung des Modell¬ substrates Luciferase nicht verhindern. Ein E. coli Stamm mit Mutationen in den dnaKund ibpAB-Genen zeigt bei erhöhten Temperaturen ein verlangsamtes Dieser Wachstumsdefektkonnte durch kontrollierte Expression der E. coli Wachstum. sHsps IbpA und IbpB teilweise behoben werden, nicht aber durch B. japonicum sHsps. Offenbar profitieren E. co/i-Zellen weder bei physiologischen Temperaturen noch unter Hitzestress von der Gegenwart einzeln exprimierter B. japonicumsHsps. Die Überproduktion einzelner sHsps wirkt sich sogar schädlich aufs Zellwachstum aus. Möglicherweise erfüllen die kleinen Hitzeschockproteinevon B. japonicum andere Aufgaben als IbpA und IbpB in E. coli, oder aber sie können ihre Aktivität nur durch Interaktionmit andern sHsps entfalten. Abstract/ Kurzfassung weitergehende biochemische Charakterisierungwurden die vier ausgewähl¬ ten Proteine am Carboxylterminus mit einer Hexahistidin-Markierung versehen, über¬ produziert und affinitätschromatografisch gereinigt. Kennzeichnendfür kleine Hitze¬ schockproteineist die Bildung grosser oligomerer Komplexe. Im Elektronenmikroskop erschienendie gereinigten B. japonicum Proteine als grosse, annähernd kugelförmige Partikel. Komplexe mit einer Molekularmassevon 400-500 kDa, bestehend aus unge¬ fähr 24 Untereinheiten, wurden auch mittels Gelfiltration nachgewiesen. Diese Kom¬ plexe schützten das Modellsubstrat Citratsynthase wirksam gegen hitzeinduzierte Aggregation in vitro. HspB, HspC, HspF und HspH sind also echte ATP-unabhängige Chaperone, auch wenn ihnen in vivo bislang keine Funktion zugewiesen werden kann. Durch Co-Reinigungenmit Hexahistidin-markiertenund unmarkierten sHsps wurden die Prinzipien der Oligomerisierung von B. japonicum sHsps aufgeklärt. Verschiedene sHsps derselben Klasse bildeten Heterooligomere, deren Chaperonaktivitätsich nicht von Homooligomeren unterschied. Interessanterweise interagierten die B. japonicum Proteine auch mit kleinen HitzeschockproteinenderselbenKlasse aus anderen Organis¬ men, nicht aber mit B. japonicum sHsps der anderen Klasse. Die Bildung von Heterooligomeren erfolgt also klar klassenspezifisch. sHsps aus verschiedenen Klassen weisen eine geringeSequenzübereinstimmungvon Für eine etwa 25% auf. Am markantesten sind die Unterschiede zwischen Klasse A und B in den Regionen kommt bei klassen¬ spezifischen Interaktionen möglicherweise eine zentrale Bedeutung zu. Beide Regionen wurden schrittweise verkürzt, um jene Regioneneinzugrenzen,die entscheidend für die Oligomerisierung und Chaperonaktivitätsind. Verkürzungen in der N-terminalen Re¬ gion und in der C-terminalen Verlängerung verhinderten eine vollständige Oligomeri¬ sierung und führten zum Verlust der Chaperonaktivität. Die Bildung definierter Kom¬ plexe aus zwei bis acht Untereinheitenlässt auf einen schrittweisen OligomerisierungsN- und C-terminalen Teilen der Proteine. Diesen prozess schliessen. Den Grundbaustein bildet ein Dimer, das durch Interaktionen in der zentralen cc-Crystallin-Domäne und angrenzenden Teilen der N-terminalen Region entsteht. Durch gezielten Austausch konservierter Aminosäuren konnten die Interaktions¬ stellen in der C-terminalen Region weiter eingeengt werden. Als besonders interessant erwies sich dabei ein konserviertes Isoleucin - x - Isoleucin-Motiv. Der Austausch eines einzelnen Isoleucins in diesem Motiv genügte, um die Bildung von grossen HspH- Abstract/ Kurzfassung Oligomeren zu verunmöglichen. Die so mutierten Proteine bildeten kleine, vermutlich dimere Komplexe ohne Chaperonaktivität. Weitergehende Studien zur Struktur und Funktion von sHsps sollten in Zukunft helfen, unser Wissen über das dynamische Ver¬ halten dieser Proteine zu vertiefen.
