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Research Collection
Doctoral Thesis
Chaperone activity and oligomerization of bacterial small heat
shock proteins
Author(s):
Studer, Sonja
Publication Date:
2002
Permanent Link:
https://doi.org/10.3929/ethz-a-004355045
Rights / License:
In Copyright - Non-Commercial Use Permitted
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ETH Library
Diss. ETH Nr. 14550
Chaperone Activity and Oligomerizationof Bacterial
Small Heat Shock Proteins
A dissertationsubmitted to the
SWISS FEDERAL INSTITUTEOF TECHNOLOGYZÜRICH
For the degree of
DOCTOR OF NATURAL SCIENCES
presentedby
Sonja Studer
Dipl. Natw. ETH
born on December28, 1972
from Zürich
accepted on the recommendationof
Hennecke,examiner
PD Dr. Franz Narberhaus, co-examiner
Prof. Dr. Pierre Goloubinoff,co-examiner
Prof. Dr. Hauke
Zürich 2002
Abstract / Kurzfassung
Abstract
The heat shock response is
a
universal mechanism
allowing organisms to cope with the
elevated temperatures. Small heat shock proteins
unfolding of cellular proteins at
(sHsps) are among the least studied components of the intricate network of chaperones
and proteases known as heat shock proteins (Hsps). Numerousin vitro studies indicate
that sHsps may act as ATP-independentchaperones, but their actual functions and implications in vivo are still poorly understood. Small heat shock protein genes have been
identified in most genomes from bacteria to men. Many eukaryotes induce multiple
sHsps, a phenomenon that is rather unusual for bacteria. So far, rhizobia are the only
bacteria known to induce multiple sHsps. The record is presently held by Bradyrhizobium japonicum, which possesses at least ten sHsps belonging to two distinct classes, A
and B. B. japonicum serves thus as a suitable model organism for studying functions
and interactions of bacterial sHsps. Two class A (HspB and HspH) and two class B
proteins (HspC and HspF) were chosen as representative examples and thoroughly
analyzed in vivo and in vitro. The results of these studies are reported in this thesis.
Expression and complementation studies in an Escherichia coli System provided
neither direct nor indirect evidence for chaperone function of the selected sHsps in vivo.
No enhancementof heat and cold tolerance was observed in E. coli cultures overex-
pressing B. japonicum sHsps, and inactivation of the model Substrate luciferase could
not be prevented. Growth of an E. coli dnaK ibpAB triple mutant at elevated tempe¬
ratures was partially restored by controlled expression of the E. coli sHsps IbpA and
IbpB, but not by B. japonicum proteins. Apparently, E. coli cells do not benefit from
individually expressed B. japonicum sHsps, neither at physiological temperatures nor
under heat stress. Rather on the contrary, it seems that overproduction of individual
sHsps exerts a detrimental effect on cell growth. It could be envisaged that the small
heat shock proteins ofB. japonicum fulfil functions differentfrom their E. coli counterparts, or that their activitydepends on interaction with other sHsps.
For further biochemical characterization, the four selected proteins were provided
with a carboxyterminal hexahistidine-tag, overproduced and purified by affinity chromatography. A hallmark of sHsps is their assemblyinto large oligomericcomplexes. In
electron micrographs, the purified B. japonicum proteins appeared as large, roughly
spherical particles. Size exclusion chromatographyconfirmed the formation of com-
Abstract / Kurzfassung
plexes with a molecular mass of 400-500 kDa, comprising approximately 24 subunits.
These complexesefficiently protected the model Substrate citrate synthase against thermally induced aggregation in vitro, indicating that HspB, HspC, HspF and HspH are
true ATP-independentchaperones despite their apparent lack of function in vivo.
Co-purification assays with hexahistidine-tagged and untagged sHsps demonstrated
that B. japonicumsHsps are able to interact in vitro. Heterooligomers, whose chaperone
activity was indistinguishable from homooligomeric complexes, were formed of diffe¬
rent sHsps belonging to the same class. Interestingly, B. japonicum proteins also interacted with sHsps of the same class derived from other organisms, but not with B. japo¬
nicum sHsps from the other class. Thus, heterooligomerformation of sHsps is clearly a
class-specific process.
sHsps from different classes share no more than approximately 25% sequence identity. Sequence divergence between class A and B is particularly pronouncedin the Nand C-terminal parts of the proteins regions that might play a crucial role in classspecific subunit interactions. Stepwise truncation of the N-terminal region and C-termi¬
nal extension allowed mapping protein regions that are critical for both oligomerization
and chaperone activity. Truncations in the N-terminal region as well as the C-terminal
extension were associated with incomplete sHsp oligomerizationand a lack of chape¬
rone activity. Formation of distinct dimeric to octameric complexes suggested that
oligomerizationtakes place in a stepwise manner. A dimer formed by the central acrystallin domain and parts of the N-terminal region was identified as basic building
-
block.
Site-directed mutagenesis of conserved residues further narrowed down the inter-
acting sites in the C-terminalextension. A conserved isoleucine x isoleucine motif
proved to be of particular interest, since individual isoleucine exchanges affecting this
motif sufficed to impair oligomerizationof B. japonicumHspH. The mutated proteins
formed small, presumably dimeric complexes devoid of chaperone activity. Further
structural and functional characterization should help to expand our knowledge of the
dynamic behaviour of small heat shockproteins in the future.
-
-
Abstract/ Kurzfassung
Kurzfassung
Die Hitzeschockantwort ist ein universeller
Mechanismus, mit
dem sich
Organismen
der
Entfaltung von Proteinen bei erhöhten Temperaturen schützen. Die kleinen
Hitzeschockproteine(sHsps) zählen zu den am wenigsten erforschten Bestandteilen
dieses komplexen Netzwerks aus Chaperonen und Proteasen, die zusammengefasstals
Hitzeschockproteine bekannt sind. Zahlreiche in vtYro-Studien haben gezeigt, dass
sHsps als ATP-unabhängige Chaperone wirken können, doch über ihre tatsächliche
Funktion in vivo ist wenig bekannt. Gene, die für kleine Hitzeschockproteinecodieren,
vor
sind in den meisten Genomen
Eukaryoten
Bakterien bis hin
von
zum
Menschen
zu
finden. Viele
sHsps, ein für Bakterien eher ungewöhnliches Phäno¬
men. Die Induktion mehrerer sHsps ist bisher nur bei Rhizobien bekannt. Den Rekord
hält derzeit Bradyrhizobium japonicum mit mindestens zehn sHsps, die sich in zwei
induzierenmehrere
verschiedene Klassen
(A
und
geeigneten Modellorganismus
B)
einteilen lassen. Dies macht B.
für
Untersuchungenzur Funktion
japonicum zu
einem
und Interaktion
von
bakteriellen kleinen Hitzeschockproteinen.Stellvertretend für die Vielfalt der
sHsps in
B. japonicum wurden je zwei Proteine der Klassen A (HspB und HspH) und B (HspC
und HspF) in vivo und in vitro analysiert. Die vorliegende Dissertation stellt die Ergeb¬
nisse dieser Untersuchungen vor.
Expressions- und Komplementationsstudien in Escherichia coli konnten weder
direkte noch indirekte Hinweise auf eine Chaperonfunktion dieser ausgewählten sHsps
in vivo liefern. Überproduktion von B. japonicum sHsps machteE. coli Kulturen nicht
toleranter gegenüber Hitze- und Kältestress und konnte die Inaktivierung des Modell¬
substrates Luciferase nicht verhindern. Ein E. coli Stamm mit Mutationen in den dnaKund
ibpAB-Genen zeigt
bei erhöhten
Temperaturen ein verlangsamtes
Dieser Wachstumsdefektkonnte durch kontrollierte Expression der E. coli
Wachstum.
sHsps IbpA
und IbpB teilweise behoben werden, nicht aber durch B. japonicum sHsps. Offenbar
profitieren E. co/i-Zellen weder bei physiologischen Temperaturen noch unter Hitzestress von der Gegenwart einzeln exprimierter B. japonicumsHsps. Die Überproduktion
einzelner sHsps wirkt sich sogar schädlich aufs Zellwachstum aus. Möglicherweise
erfüllen die kleinen Hitzeschockproteinevon B. japonicum andere Aufgaben als IbpA
und IbpB in E. coli, oder aber sie können ihre Aktivität nur durch Interaktionmit andern
sHsps entfalten.
Abstract/ Kurzfassung
weitergehende biochemische Charakterisierungwurden die vier ausgewähl¬
ten Proteine am Carboxylterminus mit einer Hexahistidin-Markierung versehen, über¬
produziert und affinitätschromatografisch gereinigt. Kennzeichnendfür kleine Hitze¬
schockproteineist die Bildung grosser oligomerer Komplexe. Im Elektronenmikroskop
erschienendie gereinigten B. japonicum Proteine als grosse, annähernd kugelförmige
Partikel. Komplexe mit einer Molekularmassevon 400-500 kDa, bestehend aus unge¬
fähr 24 Untereinheiten, wurden auch mittels Gelfiltration nachgewiesen. Diese Kom¬
plexe schützten das Modellsubstrat Citratsynthase wirksam gegen hitzeinduzierte
Aggregation in vitro. HspB, HspC, HspF und HspH sind also echte ATP-unabhängige
Chaperone, auch wenn ihnen in vivo bislang keine Funktion zugewiesen werden kann.
Durch Co-Reinigungenmit Hexahistidin-markiertenund unmarkierten sHsps wurden
die Prinzipien der Oligomerisierung von B. japonicum sHsps aufgeklärt. Verschiedene
sHsps derselben Klasse bildeten Heterooligomere, deren Chaperonaktivitätsich nicht
von Homooligomeren unterschied. Interessanterweise interagierten die B. japonicum
Proteine auch mit kleinen HitzeschockproteinenderselbenKlasse aus anderen Organis¬
men, nicht aber mit B. japonicum sHsps der anderen Klasse. Die Bildung von Heterooligomeren erfolgt also klar klassenspezifisch.
sHsps aus verschiedenen Klassen weisen eine geringeSequenzübereinstimmungvon
Für eine
etwa 25%
auf. Am markantesten sind die Unterschiede zwischen Klasse A und B in den
Regionen kommt bei klassen¬
spezifischen Interaktionen möglicherweise eine zentrale Bedeutung zu. Beide Regionen
wurden schrittweise verkürzt, um jene Regioneneinzugrenzen,die entscheidend für die
Oligomerisierung und Chaperonaktivitätsind. Verkürzungen in der N-terminalen Re¬
gion und in der C-terminalen Verlängerung verhinderten eine vollständige Oligomeri¬
sierung und führten zum Verlust der Chaperonaktivität. Die Bildung definierter Kom¬
plexe aus zwei bis acht Untereinheitenlässt auf einen schrittweisen OligomerisierungsN- und C-terminalen Teilen der Proteine. Diesen
prozess schliessen. Den Grundbaustein bildet ein Dimer, das durch Interaktionen in der
zentralen
cc-Crystallin-Domäne und angrenzenden
Teilen der N-terminalen
Region
entsteht.
Durch
gezielten
Austausch konservierter Aminosäuren konnten die Interaktions¬
stellen in der C-terminalen Region weiter
eingeengt werden. Als besonders interessant
erwies sich dabei ein konserviertes Isoleucin
-
x
-
Isoleucin-Motiv. Der Austausch
eines einzelnen Isoleucins in diesem Motiv genügte, um die Bildung von grossen HspH-
Abstract/
Kurzfassung
Oligomeren zu verunmöglichen. Die so mutierten Proteine bildeten kleine, vermutlich
dimere Komplexe ohne Chaperonaktivität. Weitergehende Studien zur Struktur und
Funktion
von
sHsps sollten in Zukunft helfen, unser Wissen über das dynamische Ver¬
halten dieser Proteine zu vertiefen.
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