Doktorarbeit Choangiokarzinom

Aus der Medizinischen Universitätsklinik
Abteilung Innere Medizin II
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg i. Br.
Häufigkeit der EGFR- und HER2-Ausprägung sowie
HER2-Genamplifikation beim Gallengangskarzinom
INAUGURAL-DISSERTATION
zur
Erlangung des Medizinischen Doktorgrades
der Medizinischen Fakultät
der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg i. Br.
vorgelegt 2011
von Oliver Waiz
geboren in Lörrach
Dekan:
Prof. Dr. Dr. h.c. mult. Hubert Erich Blum
1. Gutachter:
PD Dr. Jan Harder
2. Gutachter:
Prof. Dr. Annette Schmitt-Gräff
Jahr der Promotion: 2012
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
1
1.1 Das Gallengangskarzinom
1
1.2 Tumorklassifikation
6
1.2.1. Bismuth-Klassifikation
7
1.2.2. Einteilung der intrahepatischen Karzinome
8
1.2.3. Einteilung der extrahepatischen Karzinome
9
1.2.4. Einteilung des Gallenblasenkarzinoms
11
1.3 Wachstumsfaktoren beim Gallengangskarzinom
12
1.4 Fragestellung
15
2 Materialien und Methoden
16
2.1 Vorbereitungen
16
2.2. Immunhistochemie
20
2.2.1 Grundlagen der Methode
20
2.2.2 HER2
21
2.2.3. EGFR
25
2.3. Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung (FISH)
27
2.3.1 Grundlagen der Methode
27
2.3.2 Vorbereitungen
28
2.3.3 Vorbehandlung
28
2.3.4 Denaturierung und Hybridisierung
28
2.3.5 Waschen, Färben, Eindeckeln
29
2.3.6 Auswertung
30
2.4 Datenauswertung und statistische Analyse
31
3 Ergebnisse
32
4 Diskussion
36
5 Zusammenfassung
41
Danksagung
I
Lebenslauf
III
Literaturverzeichnis
IV
Abbildungsverzeichnis
Tabellenverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
XV
XVI
XVII
1 Einleitung
1.1 Das Gallengangskarzinom
Das Gallengangskarzinom (BTC) ist eine in den USA und Europa selten vorkommende
Erkrankung mit schlechter Prognose. Der Begriff Gallengangskarzinom umfasst die
Bezeichnungen
Gallenblasenkarzinom
sowie
extrahepatisches
und
intrahepatisches
Cholangiokarzinom (CCC). Gallengangskarzinome gehen vom Gallengangsepithel aus und
sind zu mehr als 90% Adenokarzinome [15, 33, 53]. Die WHO-Klassifikation nennt darüber
hinaus einige andere histologische Typen, darunter u.a. Siegelringkarzinome, kleinzellige
Karzinome und squamöse Karzinome [32].
Die um die Hepatikusgabel herum liegenden Tumore werden auch als Klatskin-Tumore
bezeichnet. Diese machen einen Anteil von 50-60% des CCC aus.
Am zweithäufigsten kommen die extrahepatischen Karzinome mit ca. 20-30% vor, gefolgt
von den intrahepatischen Tumoren in 10-25% der Fälle [32, 40].
Klinische Symptome der Erkrankung sind Allgemeinsymptome wie Gewichtsabnahme und
Inappetenz. Oberbauchschmerzen finden sich vor allem bei intrahepatisch gelegenen
Tumoren. Extrahepatische Tumore präsentieren sich häufig mit den typischen Zeichen der
Cholestase, wozu Hellfärbung des Stuhls, dunkler Urin, Ikterus und Pruritus zählen [40, 45].
Im Frühstadium ist das CCC klinisch jedoch häufig stumm [4, 45].
Abbildung 1: CT-Bild einer 71-jährigen Patientin mit einem zentral sitzenden KlatskinTumor (beidseits weit eingewachsen, Bismuth-Klassifikation IV). a–c
Kontrastmittelverstärktes CT in der venösen Phase: Weiße Pfeilspitzen markieren den
zentralen Klatskin-Tumor, schwarze Pfeilspitzen die dilatierten Gallengänge. Mit freundlicher
Genehmigung des Verlages [55]
1
Zur Diagnose des Cholangiokarzinoms wird vor allem bei Zeichen einer Cholestase häufig
zunächst
eine
Ultraschalldiagnostik
(Magnetresonanztomografie)
durchgeführt.
zusammen
mit
Zusätzlich
einer
MRCP
kann
eine
MRT
(Magnetresonanz-
cholangiopankreatikografie) durchgeführt werden.
Die Differenzierung benigner und maligner Stenosen extrahepatischer Gallengänge gelingt
mit der MRCP mit einer Sensitivität und Spezifität von 85–100% bzw. von bis zu 98% [55].
Das CCC erscheint bei der MRT-Untersuchung als hypointense bzw. hyperintense Läsion bei
T1- bzw. T2-gewichteten Bildern.
Weitere Verfahren können von Nutzen sein. So wird die ERCP (Endoskopisch retrograde
Cholangio-Pankreatikografie) mittlerweile häufig durch die MRCP ersetzt, im Falle einer
Cholestase dient diese gleichzeitig der Therapie.
Ist es durch bildgebende Verfahren nicht möglich, die Tumorentität eindeutig zu klären, kann
mit Hilfe der ERCP Probenmaterial mittels Bürstenzytologie, Feinnadelaspiration oder einer
transpapillären Biopsie gewonnen werden. Diese Methoden weisen eine 100%ige Spezifität
auf, haben jedoch nur eine Sensitivität von 46-73% [37].
Als Tumormarker sind CEA (carcinoembryonic antigen), CA-125 und CA 19-9 zu nennen.
CA 19-9 ist dabei der beim CCC am häufigsten verwendete Tumormarker. Dieser kann
jedoch ebenfalls beim Pankreas- und Magenkarzinom sowie bei der primären biliären
Zirrhose sowie bei Rauchern erhöht sein. Bei der Cholangitis und der Cholestase kann CA 199 ebenfalls, zumindest zeitweise erhöht sein. Bei Patienten mit primär sklerosierender
Cholangitis (PSC) weist CA 19-9 eine Sensitivität und Spezifität von 79% bzw. 98% zur
Diagnose eines CCC auf. Bei Patienten ohne PSC beträgt die Sensitivität und Spezifität 53%
bzw. 76-92% [19, 40].
Das Cholangiokarzinom ist weltweit gesehen für 3% aller gastrointestinalen Tumore
verantwortlich.
Die Inzidenz liegt zwischen 1 und 2 Erkrankungen auf 100.000 Einwohner. In den USA
wurde 2002 die Inzidenz des BTC auf 3000 Fälle geschätzt, zum Vergleich gab es im gleichen
Zeitraum 16.600 Fälle an primären Lebertumoren [33].
In Israel, Japan, Südostasien sowie bei indigenen Amerikanern ist die Inzidenz des CCC mit
87 Erkrankungen auf 100.000 Einwohner am höchsten [40]. Die höchste Inzidenz des
2
Gallenblasenkarzinoms ist in Indien mit 21,5 auf 100.000 Einwohner, in Pakistan mit 13,8 auf
100.000 sowie in Ecuador mit 12,9 auf 100.000 zu finden [57]. Die Ätiologie ist dabei
meistens auf dem Boden infektiöser Vorerkrankungen der Leber zu finden [61].
Die Erkrankungsspitze liegt im 7. Lebensjahrzehnt, wobei Männer häufiger als Frauen
betroffen sind [33].
Einige Studien haben gezeigt, dass in den letzten Jahren ein Ansteigen der Inzidenz des
intrahepatischen Cholangiokarzinoms zu verzeichnen ist [81], während das Neuauftreten des
extrahepatischen sinkt. Eine eindeutige Erklärung dafür konnte noch nicht gefunden werden
[49, 61].
Eindeutige Ursachen für das Auftreten des CCC können in den meisten Fällen nicht
ausgemacht werden. Zusammenhänge zwischen chronischen Erkrankungen der Gallengänge
und der Leber sowie dem Auftreten der Erkrankung werden jedoch beobachtet, wobei hier in
erster Linie die primär sklerosierende Cholangitis (PSC) zu nennen ist [21].
Khan et al fanden ein ,,lifetime risk“ von 5-15% bei Patienten mit PSC, ein
Cholangiokarzinom zu entwickeln [32]. Die Rate von Patienten mit PSC ein CCC zu
entwickeln, liegt dabei bei 0,6% pro Jahr. Das relative Risiko ist - verglichen mit der
Normalbevölkerung - somit signifikant erhöht [8, 19].
Der Befall mit Leberparasiten wie Opisthorchis viverrini, Clonorchis sinensis und
Schistosomiasis japonica ist ebenfalls mit einem erhöhten Risiko für die Entwicklung eines
CCC verbunden.
Infektiöse Lebererkrankungen wie Hepatistis B und C erhöhen ebenso das Risiko am CCC zu
erkranken. So ist die Prävalenz der HCV Infektion laut einer US-Studie bei am CCC
erkrankten Patienten viermal höher im Vergleich zur Normalbevölkerung (0,8 versus 0,2%).
Studien aus Taiwan, Italien und Japan bestätigen dies [19].
Die Hepatolithiasis als Resultat chronischer biliärer Infektionen kommt vor allem in Asien vor
und führt in wahrscheinlich 10 % der Fälle zur Entwicklung eines CCC.
Patienten mit angeborenen Fehlbildungen der Gallenwege wie z.B. der Caroli Krankheit
sowie Gallengangszysten haben ebenfalls ein erhöhtes Risiko. Prophylaktische Operationen
der Gallenwege werden diesen Patienten empfohlen [19].
Weitere Risikofaktoren wären einigen Studien zufolge Dioxinexposition, Thorotrast - ein
Kontrastmittel welches bis Ende der 50 er Jahre verwendet wurde - sowie Nitrosamine[4].
3
Im Gesamten weist das CCC eine sehr ungünstige Prognose auf. Im Schnitt beträgt die 5Jahres-Überlebensrate einschließlich der resezierten Patienten weniger als 5%. Die Patienten
sterben im Großteil der Fälle binnen 12 Monate nach der Diagnose. Als Todesursachen sind
hier Tumorkachexie, Leberversagen sowie sekundäre Sepsis aufgrund biliärer Obstruktion zu
nennen [33].
Den einzig kurativen Therapieansatz stellt die chirurgische Resektion des Tumors dar [14,
84], wobei diese nur in lokal beschränkten Stadien zur Verlängerung der Überlebenszeit führt
und nur dann sinnvoll ist. Bei Fehlen von Lokal- und Fernmetastasen wird die Möglichkeit
der Resektion vor allem durch die Ausdehnung des Tumors in der Leber, sowie die
Ausdehnung auf die Gallengänge und der hepatischen Gefäße bestimmt [40].
Bei Patienten mit erweiterter Leberteilresektion kann eine präoperativ eingeleitete
Portalvenenembolisation nützlich sein, um somit das Lebervolumen zu erhöhen und das
Auftreten eines postoperativen Leberversagens zu reduzieren [19]. Dabei wird der
Portalvenenast des zu resezierenden Leberlappens präoperativ okkludiert. Dieser Eingriff
kann das Volumen der verbleibenden Leber um 12-20% erhöhen und ist sinnvoll, wenn bei
Patienten mit normaler Leberfunktion nach der Resektion voraussichtlich weniger als 20-25%
Restleber verbleiben [3].
In jüngster Zeit konnten durch eine Lebertransplantation zusammen mit einer Chemotherapie
erfolgreiche Resultate erzielt werden. An einem streng ausgewählten Patientenkollektiv
konnten Rosen et al. an der Mayo Clinic 5-Jahres-Überlebensraten von 82% erzielen [19].
Für einen Teil der Patienten mit Klatskin-Tumoren, für die weder eine komplette Resektion
noch eine Transplantation in Frage kommt, wird nach neueren Veröffentlichungen u.a. die
Photodynamische Therapie (PDT) empfohlen [20].
In der Vergangenheit gab es zudem Versuche, verschiedene Chemotherapeutika alleine oder in
Kombination
beim
fortgeschrittenen
Cholangiokarzinom
anzuwenden.
Eine
Standardchemotherapie konnte bisher jedoch noch nicht entwickelt werden. Den vielen
Einzelstudien, fehlt aufgrund der meist geringen Patientenzahlen oft die Signifikanz [70, 74].
Einige Chemotherapeutika wie 5-Fluorouracil, Methansulfon, Cisplatin, Rifampicin,
Mitomycin C, Paclitaxel und Gemcitabine wurden in Phase-II-Studien getestet. Dabei zeigten
die Patienten partial response-Raten von 0-9% und eine durchschnittliche Überlebenszeit
zwischen 2-12 Monaten [19].
4
Eine britische Studie testete eine Chemotherapie mit Gemcitabine alleine gegen Gemcitabine
+ Cisplatin. Dabei betrug die durchschnittliche Überlebensrate in der Gemcitabine-Gruppe 5
Monate, in der Gemcitabine + Cisplatin-Gruppe 8 Monate. Darüber hinaus konnte ein
signifikanter Unterschied bezüglich der
Tumorkontrolle erreicht werden - in der ersten
Gruppe zu 71,8% , in der zweiten Gruppe zu 81,4% [71].
Eine kanadische Phase-II-Studie untersuchte an 45 Patienten Gemcitabine in einer
Kombination mit Capecitabine. Dabei ergab sich eine Tumorkontrolle in 73% der Fälle. Die
mittlere Überlebenszeit betrug 14 Monate [36].
Eine weitere Phase-II-Studie evaluierte die Effektivität einer Gemcitabine-OxaliplatinKombination bei 40 Patienten. Dabei wurde eine Tumorkontrolle in 65% der Fälle erreicht,
die mittlere Überlebenszeit betrug 12 Monate [22].
Harder et al untersuchte 2006 an 31 Patienten ebenfalls die Wirksamkeit von GemcitabineOxaliplatin. Dabei konnte in 71% der Fälle eine Tumorkontrolle sowie eine mittlere
Überlebenszeit von 11 Monaten erreicht werden [23].
Eine deutsche Arbeitsgruppe prüfte eine Dreifachkombination mit Gemcitabine, Oxaliplatin
und
5-Fluorouracil
getrennt
an
insgesamt
75
Fällen
von
Gallengangs-
und
Gallenblasenkarzinomen. Hier wurde eine Tumorkontrolle zwischen 69 bis 79 % erreicht, die
mittlere Überlebenszeit betrug 9,9 bzw. 10 Monate [73].
Des Weiteren wurden in letzter Zeit Daten über die Anwendung von Wachstumsinhibitoren
beim CCC veröffentlicht.
Eine australische Phase-II-Studie untersuchte Bevacizumab in einer Kombination mit
Erlotinib an 49 Patienten. Nach erneutem Staging wiesen 12% der Patienten PR (partial
response) auf, bei 51% konnte SD (stable disease) erzielt werden. Die mittlere Überlebenszeit
betrug 9,9 Monate [39].
Philip et al. untersuchten Erlotinib an 42 Patienten ebenfalls im Zuge einer Phase-II-Studie.
Eine Tumorkontrolle konnte hier in 50% der Fälle erreicht werden. Die Patienten wiesen eine
mittlere Überlebenszeit von 7,5 Monaten auf [52].
5
Malka et al. verglichen in einer randomisierten Phase-II-Studie Gemcitabine plus Oxaliplatin
alleine, mit derselben Kombination zusammen mit Cetuximab. Dabei konnte eine höhere
viermonats-PFS (progression-free-survival) gezeigt werden (44% versus 61%) [41].
In einer weiteren Phase-II-Studie über Lapatinib beim BTC an 57 Fällen konnte bei keinem
der Patienten eine Tumorkontrolle erreicht werden [56].
1.2 Tumorklassifikation
Die Tumorausbreitung des CCC wird unterschiedlich klassifiziert und richtet sich nach der
anatomischen Lage der Tumore.
Dabei werden intra- und extrahepatische Gallengangskarzinome, Gallenblasenkarzinome
sowie Klatskin-Tumore unterschieden.
Die Klatskin-Tumore werden dabei nach Bismuth klassifiziert, die intra- und extrahepatischen
Karzinome dagegen nach den Regeln der ,,Union International Contre le Cancer“ (TNMKlassifikation).
6
1.2.1. Bismuth-Klassifikation
Nachfolgende Tabelle und anschließendes Schema zeigen die Bismuth-Klassifikation [77].
Typ
I
II
IIIa
IIIb
IV
Beschreibung
Karzinom betrifft Ductus hepaticus communis
Karzinom betrifft auch die Hepatikusgabel,
jedoch ohne Einbeziehung des rechten oder
linken Gallenganges
rechter Gallengang ist zusätzlich miteinbezogen
linker Gallengang ist zusätzlich miteinbezogen
beide Gallengänge sind zusätzlich
miteinbezogen
Tabelle 1: Bismuthklassifikation der Klatskin-Tumore
Abbildung 2:Bismuth-Klassifikation der hilären Cholangiokarzinome.
1: Tumor beschränkt sich auf den Ductus hepaticus communis.
2: Tumor betrifft auch Hepatikus-Gabel, jedoch nicht die sekundären Aufzweigungen links
und rechts.
3a und 3b: Einseitiges Heraufreichen bis an die Segmentabgänge (links/rechts).
4a: Beidseitiges Heraufreichen bis an die Segmentabgänge.
4b: Multifokaler Tumor der Gallengänge. modifizierte Darstellung nach [5], mit freundlicher
Genehmigung des Verlages
7
1.2.2. Einteilung der intrahepatischen Karzinome
Die TNM-Klassifikation [77] bezieht sich hier auf:
•
T
- die Anzahl, die Größe, die Gefäßinvasion und die Ausdehnung des
Tumors auf die Leberlappen
•
N
- die Ausdehnung der Lymphknoten
•
M
- das Bestehen von Fernmetastasen
•
T1
- solitärer Tumor ≤ 2 cm ohne Gefäßinvasion
•
T2
- solitärer Tumor ≤ 2 cm mit Gefäßinvasion oder multiple Tumore ≤ 2 cm ohne
Gefäßinvasion
•
T3
- solitärer Tumor > 2 cm mit Gefäßinvasion oder multiple Tumore auf einen
Lappen begrenzt, jeder Tumor < 2 cm mit Gefäßinvasion oder multiple
Tumore auf einen Lappen begrenzt, jeder Tumor > 2 cm mit oder ohne
Gefäßinvasion
•
T4
- multiple Tumore in mehr als einem Lappen oder Tumor infiltriert die
Hepatikus-/Portalvenengabelung oder angrenzende Organe
•
N1
- regionale Lymphknotenmetastasen
•
M1
- Vorhandensein von Fernmetastasen
Stadium I
Stadium II
T1
T2
N0
N0
M0
M0
T1
N1
M0
T2
N1
M0
T3
N1, N0
M0
Stadium IV - A
T4
jedes N
M0
Stadium IV - B
jedes T
jedes N
M1
Stadium III
Tabelle 2: Aus der TNM-Klassifikation ergibt sich das Tumorstadium
8
1.2.3. Einteilung der extrahepatischen Karzinome
Die TNM-Klassifikation [75] bezieht sich hier auf:
•
T
- die Ausdehnung des Primärtumors
•
N
- die Beteiligung von Lymphknoten
•
M
- das Vorliegen von Fernmetastasen
•
TX
- Primärtumor kann nicht beurteilt werden
•
T0
- kein Hinweis für Primärtumor
•
Tis
- Carcinoma in Situ
•
T1
- Tumor auf das subepitheliale Bindegewebe oder die fibromuskuläre Schicht
beschränkt
•
T2
- Tumor infiltriert das perifibromuskuläre Bindegewebe
•
T3
- Tumor infiltriert die Leber, Gallenblase, Pankreas und/oder unilaterale Äste
der V. portae (rechts oder links) oder der A. hepatica propria
(rechts oder links)
•
T4
- Tumor infiltriert eine oder mehrere Nachbarstrukturen: Hauptstamm der
V. portae oder ihrer Äste bilateral, A. hepatica communis oder
Nachbarorgane /-strukturen wie Kolon, Magen, Duodenum, Abdominalwand
•
NX
- regionäre Lymphknoten können nicht beurteilt werden
•
N0
- keine regionären Lymphknotenmetastasen
•
N1
- regionäre Lymphknotenmetastasen
•
MX
- Fernmetastasen nicht beurteilbar
•
M0
- Fernmetastasen nicht vorhanden
•
M1
- Vorhandensein von Fernmetastasen
•
pTN - pathologische Klassifikation
9
pN0 heißt, dass eine regionäre Lymphadenektomie und histologische Untersuchung,
üblicherweise von drei oder mehr Lymphknoten, erfolgte. Wenn die untersuchten
Lymphknoten tumorfrei sind, aber die Zahl der üblicherweise untersuchten Lymphknoten
nicht erreicht wird, soll pN0 klassifiziert werden.
Stadium 0
Tis
N0
M0
Stadium I
T1
N0
M0
Stadium II
T2
NO
M0
Stadium III
T1-T2
N1-N2
M0
Stadium IV-A
T3
jedes N
M0
Stadium IV-B
jedes T
jedes N
M1
Tabelle 3: Aus der TNM Klassifikation ergibt sich das Tumorstadium
10
1.2.4. Einteilung des Gallenblasenkarzinoms
•
T1
- Tumor infiltriert lamina propria oder Muskulatur
•
T1a
- Tumor infiltriert Schleimhaut
•
T1b
- Tumor infiltriert Gallenwegsmuskulatur
•
T2
- Tumor infiltriert perimuskuläres Bindegewebe, keine Ausbreitung über
Serosa oder Leber
•
T3
- Infiltration über die Serosa oder Infiltration von Leber und/oder ein anderes
Organ wie Magen, Kolon, Pankreas, extrahepatische Gallenwege
oder andere Organe
•
T4
- Infiltration von V. portae oder A. hepatica oder mehreren Nachbarorganen
•
N0
- keine regionären Lymphknoten befallen
•
N1
- Metastasen am Ductus cysticus, um den Ductus choledochus und/oder am
Leberhilus
•
N2
- Metastasen in Lymphknoten um den Pankreaskopf, in periduodenalen,
periportalen, coeliacalen und/oder oberen mesenterialen Lymphknoten
•
M0
- keine Fernmetastasen
•
M1
- Fernmetastasen
Stadium Ia
T1
N0
M0
Stadium Ib
T2
N0
M0
Stadium IIa
T3
NO
M0
Stadium IIb
T1-T3
N1
M0
Stadium III
T4
jedes N
M0
Stadium IV
jedes T
jedes N
M1
Tabelle 4: Stadieneinteilung des Gallenblasenkarzinoms (UICC 2002)
11
1.3 Wachstumsfaktoren beim Gallengangskarzinom
Aufgrund der schlechten Prognose von Patienten mit Cholangiokarzinom, die mit einer
Chemotherapie behandelt werden, sind vor allem für Patienten im fortgeschrittenen Stadium
neue Therapieansätze notwendig.
Neben der chirurgischen Resektion, Strahlentherapie und der Chemotherapie, kommt
grundsätzlich eine Antikörpertherapie in Frage, wie sie derzeit schon routinemäßig z.B. beim
Kolonkarzinom und Mammakarzinom angewendet wird.
Eine wichtige Rolle spielen beim Cholangiokarzinom dabei die Rezeptoren der ErbB-Familie.
Dazu zählen EGFR (ErbB1), HER2 (ErbB2), ErbB3 und ErbB4, wobei im Folgenden nur auf
die ersten beiden eingegangen werden soll [62].
Diese Rezeptoren weisen dabei an der Zelloberfläche eine extrazelluläre Domäne auf und
besitzen des Weiteren eine transmembranäre Region, sowie eine intrazelluläre Domäne,
welche eine Tyrosin-Kinase-Funktion erfüllt. Mit der Ausnahme von HER2-Rezeptoren
binden alle genannten Rezeptoren rezeptorspezifische Liganden, die wiederum zu den
Wachstumsfaktoren der EGF-Familie gehören. Dazu gehören EGF, TGF-α und Amphiregulin,
welche spezifisch an EGFR binden, sowie einige andere Wachstumsfaktoren [62].
Bindet nun ein Ligand an der extrazellulären Domäne des EGFR, führt dies zur Homo- oder
Heterodimerization der Rezeptorproteine. Dies führt zur Aktivierung der intrinsischen
Tyrosin-Kinase-Domäne, welches wiederum zur Autophosphorilierung der cytoplasmatischen
Domäne führt. Dies hat wiederum zur Folge, dass weitere Kaskaden aktiviert werden, welche
z.B. den Zellzyklus, Apoptosevorgänge und das Gefäßwachstum steuern. Dies ist
verständlicherweise für das Tumorwachstum von großer Bedeutung [40, 62, 76].
In einer Arbeit von J.H. Yoon und N.W. Werneburg wurde bereits in den Jahren 2002 und
2003 gezeigt, dass humane CCC-Zellen EGFR exprimieren und darüber hinaus durch
Gallensäure aktiviert werden [34, 80].
Zahlreiche weitere Arbeiten, die an Nagetiermodellen entwickelt wurden, zeigen außerdem
einen
Zusammenhang
einer
ErbB2-Überexpression
Cholangiokarzinom [38, 54, 63, 64, 79].
12
und
der
Entwicklung
des
Der durch Weinberg 1984 zum ersten mal beschriebene HER2-Rezeptor ist ein 185kDa
Protein und wird durch das HER2-Gen auf Chromosom 17q21 kodiert [58]. Seine
extrinsische Domäne unterscheidet sich von der molekularen Struktur gegenüber EGFR und
ErbB3 derart, dass es für EGFR-Liganden nicht möglich ist daran zu binden. Dies liegt daran,
dass die Konformation der extrinsischen Domäne der einer aktivierten Domäne ähnelt, was es
unmöglich macht, Liganden zu binden.
Dagegen kann gerade diese Struktur als Dimerisationspartner für andere Rezeptoren der
EGFR-Familie fungieren. So besitzt ErbB3 alleine nur eine abgeschwächte Kinaseaktivität,
kann aber sein volles Potenzial nach Dimerisation mit dem HER2-Rezeptor entfalten.
Diese Struktur erklärt auch die Tatsache, warum HER2 eine hohe basale Kinaseaktivität
aufweist und somit in der Onkogenese eine wichtige Rolle spielt [25, 62, 76].
Eine HER2-Überexpression ist beim Mammakarzinom in 15-30 % der Fälle dokumentiert und
mit einer schlechten Prognose vergesellschaftet. Beim Mammakarzinom dient der HER2Rezeptor mittlerweile zum einen als prädiktiver, zum anderen als prognostischer Marker [42,
60].
Prädiktiver Marker meint dabei, dass durch HER2 das Ansprechen des Tumors auf eine
endokrine Therapie, eine adjuvante Chemotherapie oder eine Antikörpertherapie vorausgesagt
werden kann. Prognostischer Marker meint in diesem Fall, dass mit Hilfe von HER2
Aussagen auf den Krankheitsverlauf und das Outcome der Erkrankung gemacht werden
können.
Bei HER2-positiven Patienten wird der monoklonale HER2-Antikörper Trastuzumab als
Therapie angewendet. Dies führt zu einer nachhaltigen Verkleinerung des Tumors, verbessert
das Ansprechen auf Chemotherapie und führt zu einer verlängerten Überlebenszeit sowohl
beim primären als auch beim metastasierten Mammakarzinom [35].
Auch bei anderen Tumoren wie beim Ovarial-, Lungen-, Magen-, Blasen-, hepatozellulären
und Kolonkarzinom wird eine HER2-Überexpression beschrieben [24, 28, 42, 65, 67, 68].
Beim CCC wird ebenfalls eine HER2-Überexpression beschrieben, die Ergebnisse sind
jedoch inhomogen. Während in Arbeiten über Patienten thailändischen, englischen,
taiwanesischen, amerikanischen und japanischen Ursprungs 27% - 82% der Tumore HER2
exprimierten, fanden Collier et al. bei zehn Tumoren europäischen Ursprungs keine
Überexpression [35].
13
Ebenso inhomogen sind die Ergebnisse bei der Expression von EGFR beim CCC. Diese
wurden von vielen Arbeitsgruppen untersucht, wobei diese in 8,1% bis 100% der Fälle
überexprimiert waren [17, 29, 43, 50, 59].
Abbildung 3: Funktionsweise eines Tyrosinkinaserezeptors am Beispiel von EGFR; Aus
DAKO EGFR pharmDX™ Interpretation Manual, mit freundlicher Genehmigung der Dako
Deutschland GmbH [16].
14
1.4 Fragestellung
Aufgrund der erwähnten, zwar reichlichen, jedoch an kleinen Patientengruppen gewonnenen
und inhomogenen Datenlage bezüglich der HER2- und EGF-Rezeptorausprägung beim CCC
stellte sich die Frage nach der HER2- und EGFR-Expression an einem großen unselektierten
Patientengut.
Dabei stellten wir uns folgende Fragen:
1) Wie stark sind HER2 und EGFR beim CCC exprimiert bzw. wie häufig
überexprimiert?
2) Wie häufig ist eine HER2-Genamplifikation bei überexprimierten HER2-Proben zu
finden?
3) Wie reihen sich unsere Ergebnisse in die Daten anderer Arbeitsgruppen ein?
4) Wo könnten die Gründe für Unterschiede liegen?
5) Sind HER2 bzw. EGFR zwei Therapieziele die in klinischen Studien ausprobiert
werden sollten?
15
2 Materialien und Methoden
2.1 Vorbereitungen
Gegenstand der Untersuchung waren 124 Patienten die am cholangiozellulären Karzinom
erkrankt waren und deshalb zwischen 1996 und 2005 an der Universitätsklinik Freiburg
behandelt wurden. Das Durchschnittsalter betrug 63,4 Jahre, wobei der jüngste Patient 32,8
Jahre und der älteste Patient 84,8 Jahre alt war. 51% der Patienten waren Frauen.
Von sämtlichen Patienten wurden Gewebeproben im Zuge eines Schnellschnittes oder einer
Biopsie gewonnen. Teilweise wurde dieses Material an auswärtigen Kliniken gewonnen (n=8)
und musste deshalb von uns angefordert werden.
Alle Proben der 124 Patienten wurden auf eine HER2-Rezeptorausprägung untersucht. Im
Falle einer Überexpression, die als 2+ sowie 3+ definiert wurde, erfolgte die zusätzliche
Untersuchung auf eine HER2-Genamplifikation mit Hilfe der FISH-Methode.
56 Patienten wurden auf eine EGF-Rezeptorausprägung untersucht. Da Daten anderer
Arbeitsgruppen eine Erhöhung der EGFR-Genkopien aufgrund einer Genamplifikation nur
selten zeigten, verzichteten wir auf eine Untersuchung der Genamplifikation [43, 51, 59].
Darüber hinaus wurden zahlreiche andere Patientendaten erhoben.
Dies erfolgte hauptsächlich durch Aktenstudium. Die Sterbedaten wurden durch das zentrale
Sterberegister der Universitätsklinik Freiburg oder durch Telefonate mit Hausärzten (n=12)
erhoben.
Im Verlauf mussten Patienten aus der Studie wieder ausgeschlossen werden (n=48), da
manche der gesuchten Daten nicht mehr eruiert werden konnten.
16
Die folgende Tabelle gibt eine Übersicht über die erhobenen Parameter:
•
•
•
•
Geschlecht
Erkrankungsjahr des Patienten
Alter bei Erstdiagnose
Ansprechen auf Chemotherapie
◦ partial response (PR)
◦ progressive disease (PD)
◦ stable disease (SD)
•
Tumorlokalisation
◦ Gallenblase
◦ intrahepatisch
◦ extrahepatisch-hilär
•
•
•
Stadium
Überlebenszeit in Tagen bis zum 30.03.2007
Ausprägung EGFR
◦
◦
◦
◦
•
Ausprägung HER2
◦
◦
◦
◦
•
•
•
0
1+
2+
3+
0
1+
2+
3+
Genamplifikation
Operation (ja/nein)
histologisches Grading
◦ gut differenziert
◦ mäßig differenziert
◦ undifferenziert
•
Sterbedatum und Gesamtüberleben
Tabelle 5: Übersicht über die erhobenen Patientenparameter
17
Die Ansprechrate des Tumors auf Chemotherapie (Tumorresponse) wurde dabei nach
folgenden Kriterien definiert:
•
complete-response (CR)
vollständiges Verschwinden der Tumormasse (Reevaluation nach vier Wochen)
•
partial response (PR)
Rückgang der Tumormasse um mehr als 30% (Reevaluation nach vier Wochen)
•
progressive disease (PD)
Tumorzuwachs um mehr als 20%
•
stable disease (SD)
weder CR noch PR noch PD
Unabhängig von den klinischen Daten wurde in Zusammenarbeit mit dem pathologischen
Institut der Universität Freiburg der EGFR- und HER2-Rezeptorstatus sowie die HER2Genamplifikation untersucht.
Zur
Evaluierung
der
Rezeptorausprägung
von
HER2
und
EGFR
wurde
die
Immunhistochemie angewandt. In Fällen überexprimierter HER2-Rezeptoren wurden diese
Präparate zusätzlich einer Fluoreszenz–In–Situ–Hybridisierung (FISH) unterzogen.
Vor dem Anwenden genannter Methoden wurde alle Präparate zunächst 5µm dick geschnitten.
Daraufhin
wurden
die
Schnittpräparate
einer
Entparaffinierung
sowie
einer
Epitopdemaskierung unterzogen.
Die Entparaffinierung erfolgte in folgenden Schritten:
•
Objektträger in Xylol I für 10 min
•
Objektträger in Xylol II für 10 min
•
Objektträger in Isopropanol für 2 min
•
Objektträger in Ethanol 100% für 2min
•
Objektträger in Ethanol 96% für 2 min
•
Objektträger in Ethanol 70% für 2 min
•
Objektträger in Ethanol 50% für 2 min
Zur Epitopdemaskierung wurden die Präparate für die HER2 und EGFR unterschiedlich
weiterbehandelt.
18
Epitopdemaskierung
Die Epitopdemaskierung ist eine Methode, die häufig vor immunhistochemischen Methoden
und FISH angewendet wird, um das Anfärben der Zielproteine zu erleichtern. Der Grund
dafür ist, dass sich während des Fixationsvorgangs Methylenbrücken ausbilden können, die
mit Proteinen Verbindungen eingehen und dadurch die Bindung von Antikörpern stören
können.
Grundsätzlich kann diese Epitopdemaskierung mit Hilfe von Hitze oder Enzymen erfolgen.
Die HER2-Schnitte wurden dabei dem HIER-Verfahren (Heat Induced Epitope Retrieval)
unterzogen.
Dies erfolgte in einem Dampfgarer, wobei die HER2-Schnitte bei einem pH-Wert von 6,1 in
Zitratpuffer („Target Retrieval Solution pH 6,1“, Fa. DAKO) 45 min bei einer Temperatur von
98° C gekocht wurden. Anschließend erfolgte zehnminütiges Abkühlen.
Bei den EGFR-Schnitten erfolgte die Epitopdemaskierung mit Hilfe der „Proteinkinase K“
(Fa. Sigma), verdünnt mit einem Tris-HCl-Puffer mit Natriumazid für fünf Minuten bei 37°C.
19
2.2. Immunhistochemie
2.2.1 Grundlagen der Methode
Die Immunhistochemie ist eine in der Pathologie häufig angewendete Methode. Dabei wird
die Spezifität von Antikörpern genutzt, um die Verteilung von bestimmten Antigenen in
Geweben sichtbar zu machen.
Dabei werden zwei Antikörper nacheinander dem zu untersuchenden Gewebe zugegeben. Der
erste Antikörper bindet dabei an das zu suchende Antigen und entstammt z.B. der Maus.
Danach wird ein zweiter Antikörper zugegeben, der von einem anderen Tier, z.B. Kaninchen
abstammt und gegen den ersten Antikörper gerichtet ist. An den zweiten Antikörper kann
grundsätzlich bereits ein Fluoreszenzfarbstoff gebunden sein. Um aber eine möglichst
empfindliche Reaktion zu erreichen, kann an diesen sekundären Antikörper eine ganze Reihe
an anderen Stoffen gebunden werden. Im Fall des HER2-Nachweises ein Komplex aus
Streptavidin, Avidin und Biotin. Dabei ist an den zweiten Antikörper Biotin gebunden. Daran
bindet anschließend Avidin und an diesen Komplex schlussendlich Streptavidin. Anschließend
wird der Komplex mit Chromogen sichtbar gemacht.
Die immunhistochemische Färbung wurde mit dem „Autostainer©“ der Fa. Dako nach
automatisiertem Färbeprotokoll durchgeführt.
Zunächst wurde in beiden Fällen das Gewebe mit einem optimal verdünnten primären
Kaninchen- oder Mausantikörper inkubiert:
• HER2-Gewebe mit ,,Polyclonal Rabbit Anti Human c-erbB-2 Oncoprotein“ mit einer
Titrierung von 1/350; Fa. Dako
• EGFR-Gewebe mit „EGFR pharm DX Monoclonal Mouse IgG Antibody“ mit einer
Titrierung 1/500: Fa. Dako
Im Verlauf wurde dann mit verschieden Testkits weiter verfahren.
20
2.2.2 HER2
Zur Anfertigung der HER2-Färbungen wurde das „Dako REAL™ Detection System Alkaline
Phosphatase/RED, Rabbit/Mouse“ der Fa. Dako verwendet.
Dabei handelt es sich um ein Nachweissystem zur Verwendung in der Immunzytochemie. Das
Kit basiert auf der LSAB-Methode (markiertes Streptavidin-Avidin-Biotin) und wird in einem
dreistufigen Verfahren eingesetzt.
Dreistufiges Verfahren bedeutet dabei, dass insgesamt drei Inkubationen erfolgen. Erstens mit
dem o.g. verdünnten primären Antikörper, gefolgt von ,,Dako REAL™ Biotinylated
Secondary Antibodies“ und schlussendlich mit „Dako REAL™ Streptavidin Alkaline
Phosphatase (AP)“.
Bei „Dako REAL™ Biotinylated Secondary Antibodies“ handelt es sich um biotinylierte
Ziege-Anti-Maus- und Ziege-Anti-Kaninchen-Immunglobuline in gepufferter Lösung mit
stabilisierendem Protein und Natriumazid.
Bei „Dako REAL™ Streptavidin Alkaline Phosphatase (AP)“ handelt es sich um alkalische
Phosphatase konjugiertes Streptavidin in gepufferter Lösung mit Zusatz von stabilisierendem
Protein und Konservierungsmittel.
Anschließend erfolgte die Blockade der alkalischen Phosphatase mit „Dako REAL™
Levamisole“ der „Dako REAL™ AP Substrat Puffer“ zugesetzt wurde.
Die Reaktion wurde schließlich mit Hilfe von „Dako REAL™ Chromogen Red“ visualisiert.
Zur Gegenfärbung wurden die Objektträger in Hematoxylin getaucht, was zu einer
eindeutigen Blaufärbung der Zellkerne führte. Anschließend wurde mit Wasser gespült und in
einer aufsteigenden Alkoholreihe entwässert.
Zur Qualitätskontrolle wurden hierbei stets Negativ- und Positivkontrollen mitgefärbt.
21
Abbildung 4: immunhistochemische Färbemethode – dreistufiges Verfahren, mit
freundlicher Genehmigung der Dako Deutschland GmbH [6].
22
Auswertung
Die Auswertung erfolgte am Lichtmikroskop nach den Kriterien des „DAKO™ Scoring
System“, welches in nachfolgender Tabelle aufgeführt ist.
Status der HER2Überexpression
Score
negativ
0
negativ
1+
positiv
2+
positiv
3+
Färbeverhalten
keine Anfärbung oder Membranfärbung in weniger als 10%
der Tumorzellen
schwach, kaum wahrnehmbare Membranfärbung in mehr
als 10% der Tumorzellen,
die Zellmembran nur partiell gefärbt.
schwache bis mäßig starke Anfärbung der gesamten
Zellmembran in mehr als 10 % der Tumorzellen.
starke Anfärbung der gesamten Zellmembran in mehr als
10 % der Tumorzellen
Tabelle 6: Kriterien des „DAKO™ Scoring System“, [13]
Unter Überexpression versteht man eine 2+- oder 3+-Ausprägung.
Die folgenden Abbildungen zeigen Beispiele für eine negative, ein- , zwei- und dreifache
HER2-Rezeptorausprägung:
23
Abbildung 5: HER2-negativ; 20-fache
Vergrößerung, Quelle: eigene Fotografie
Abbildung 6: HER2 1+; 20-fache
Vergrößerung, Quelle: eigene Fotografie
Abbildung 7: HER2 2+; 20-fache
Vergrößerung, Quelle: eigene Fotografie
Abbildung 8: HER2 3+; 20-fache
Vergrößerung, Quelle: eigene Fotografie
24
2.2.3. EGFR
Zur Anfärbung der EGFR-Proteine wurde das „EGFR pharmDX™ Kit“ - ebenfalls der Firma
Dako Cytomation (Fa. Dako. Glostrup DK) - verwendet. Dabei handelt es sich um ein
Visualisierungsreagenz auf Basis der Dextrantechnologie.
Das Reagenz enthält sowohl sekundäre Ziegen-Anti-Maus-Antikörpermoleküle wie auch
Meerettichperoxidasemoleküle
zusammen
mit
Tris-Puffer,
Stabilisatorprotein
und
Natriumazid.
Nach der Epitopdemaskierung erfolgte die Anfertigung eines Peroxidase-Blocks mit 3 %
Wasserstoffperoxid.
Daraufhin wurden die Schnitte mit dem primären Mausantikörper „EGFR pharmDX™
Monoclonal Mouse IgG Antibody“ inkubiert.
Anschließend erfolgte die Inkubation mit
Meerretichperoxidase und Ziegen-Anti-Maus-
immunglobulin-konjugiertem Dextranpolymer „Labelled Polymer, HRP©“.
Zuletzt wurde die Reaktion mit Hilfe von „Liquid DAB + Chromogen“ visualisiert und mit
Haematoxylin gegengefärbt.
Zur Qualitätskontrolle wurden auch hier Negativ- und Positivkontrollen mitgefärbt.
Auswertung
Die Auswertung erfolgte an einem Lichtmikrospkop („Axioplan“, Fa. Zeiss)
Dabei wurde zwischen negativen sowie ein-, zwei- und dreifach positiven Gewebeproben
unterschieden. Im Fall 2+- und 3+-positiver Ausprägung spricht man von einer EGFRÜberexpression.
Die Zuordnung zu den Ausprägungen erfolgte auf der Grundlage des Interpretationshandbuches von „EGFR pharmDX™“ [16].
Die folgenden Abbildungen zeigen Beispiele für eine negative,- ein-, zwei-, und dreifache
Rezeptorausprägung.
25
Abbildung 9: EGFR negativ, 20-fache
Vergrößerung
Abbildung 10: EGFR 1+, 20-fache
Vergrößerung
Abbildung 11: EGFR 2+, 20-fache
Vergrößerung
Abbildung 12: EGFR 3+, 20-fache
Vergrößerung
26
2.3. Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung (FISH)
2.3.1 Grundlagen der Methode
Die Fluoreszenz-In-Situ-Hybridisierung stellt ein wichtiges Markierungsverfahren dar, das für
viele Untersuchungen benutzt wird.
Hybridisierung meint dabei die spezifische Rekombination von DNS-Einzelsträngen
verschiedener Herkunft zum DNS-Doppelstrang - in diesem Fall nach Denaturierung.
Dabei hybridisiert man bei dieser Methode eine fluoreszenz-markierte Sonde bekannter DNS
mit denaturierter DNS aus Metaphase- und Interphase-Chromosomen in in Paraffin
eingebetteten und formalinfixierten Gewebeschnitten auf Objektträgern.
Die gesuchte Hybridisierungsstelle kann dadurch nachgewiesen werden, dass man an ein
bestimmtes DNS-Molekül einen Fluoreszenzfarbstoff anbindet, diesen nach erfolgreicher
Hybridisierung durch eine geeignete Lichtquelle zur Fluoreszenz anregt und daraufhin
lichtmikroskopisch auswertet.
Somit kann eine ganz bestimmte DNS-Sequenz, hier die Amplifikation für eine HER2
-Überexpression, sichtbar gemacht werden.
Abbildung 13: Prinzip der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH). Mit
freundlicher Genehmigung des Instituts [2].
27
2.3.2 Vorbereitungen
Von den archivierten, paraffinierten Gewebeproben wurden 5µm dicke Schnittpräparate
hergestellt und auf „Superfrost Plus®“ aufgezogen. Dabei handelt es sich um einen speziell
beschichteten Objektträger, welcher die Schnitte besser haften lässt. Anschließend wurden die
Objektträger bei 80°C für 30 Minuten im Brutschrank getrocknet.
Danach wurden die Schnitte nach oben aufgeführtem Schema entparaffiniert.
2.3.3 Vorbehandlung
•
Objektträger kurz mit PBS spülen
•
Objektträger in den Citratpuffer stellen, kurz bei 360 Watt in der Mikrowelle
aufkochen und dann bei 180 Watt für 17 Minuten weiterkochen, danach kurz mit PBS
spülen
•
„Pronase E“ in 100 ml PBS auflösen, welche im Wasserbad auf 37°C erwärmt wurde
•
Objektträger in „Pronase E“ für 2 Minuten bei 37 °C inkubieren
•
Objektträger 3x2 Minuten mit PBS waschen
•
Objektträger trocknen lassen
•
Sonden im Dunkeln auftauen lassen
2.3.4 Denaturierung und Hybridisierung
Nach dem Auftauen der Sonden wurden diese unverdünnt auf den Objektträger pipettiert.
Danach wurde jeweils ein Deckglas 18x18 mm luftblasenfrei auf den Objektträger gelegt und
mit Fixogum versiegelt.
Danach wurden die Präparate in den Hybrite der Marke „Vysis/Abott®“ gelegt, zunächst 10
Minuten bei 73°C denaturiert und anschließend für 20 Stunden bei 37°C hybridisiert.
28
2.3.5 Waschen, Färben, Eindeckeln
Die aus dem Hybrite entnommenen Objektträger wurden zweimalig mit SSC (saline-sodium
citrate-buffer) gespült.
Danach wurden selbige zwei Minuten erneut in auf 73°C erwärmten SSC gewaschen.
Anschließend wurden die Objektträger in PBS gestellt.
Daraufhin erfolgte im Dunkeln die Inkubation über zwei Minuten in vorbereiteter DAPILösung (4-5µl/50ml PBS), danach erneutes Waschen in PBS.
Zum Schluß wurden die Objektträger mit „Vectashield®“, einem Medium für Schnitte aus
wässrigen Medien, eingedeckelt und bei -20°C aufbewahrt.
29
2.3.6 Auswertung
Die Auswertung erfolgte an einem Epifluoreszenz-Mikroskop („Axioplan 2®“, Fa. Zeiss)
zusammen mit einem Zusatzmodul („Apotom®“, Fa. Zeiss), wobei die Färbungen bei 1000facher Vergrößerung betrachtet wurden. Dabei wurden je Schnitt drei verschiedene
Tumorareale identifiziert, in denen jeweils 20 Zellkerne beurteilt wurden.
Nun wurden die HER2-Genkopien sowie die Chromosom-17-Kopien je Zelle gezählt und
davon die ,,Her2:17-Ratio“, also der Quotient (Anzahl HER2-Genkopien:Chromosom-17Kopien) gebildet. Eine normale Her2:17-Ratio wurde bei einem Quotienten < 2 definiert, eine
Ratio > 2 wurde als Genamplifikation definiert. Zur Auswertung der Bilder am Computer
wurde ein spezielles Zusatzprogramm verwendet („Axio Version 4®“).
Nachfolgende Abbildungen zeigen Beispiele für eine vorliegende und eine fehlende
Genamplifikation:
Abbildung 13: Genamplifikation positiv;
1000-fache Vergrößerung,
Abbildung 14: Genamplifikation negativ;
1000-fache Vergrößerung,
Quelle: eigene Fotografie
Quelle: eigene Fotografie
30
2.4 Datenauswertung und statistische Analyse
Die statistische Auswertung der Daten erfolgte durch Herrn Dipl.-Statistiker M. Olschewski
vom Institut für Medizinische Biometrie und Informatik der Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg.
Für die grafische Aufarbeitung und Darstellung der Kaplan-Meier-Kurven kam das
Statistikprogramm „WinSTAT© für Windows“ (Version 2003.1) zur Anwendung.
Bei der Analyse der Überlebenszeiten wurde der Zeitraum zwischen dem Zeitpunkt der
Erstdiagnose des Tumors und dem Endpunkt der Beobachtung (30.03.2007) untersucht.
Zum finalen Erfassungszeitpunkt bestanden hinsichtlich des Verbleibs der Patienten
grundsätzlich zwei Möglichkeiten:
• der Patient lebt
• der Patient ist verstorben
Das Aktenstudium, das Heraussuchen der Gewebeblöcke und das Abfotografieren der
HER2/EGFR-Schnitte erfolgte dabei durch mich selbst. Die Interpretation der verschiedenen
HER2/EGFR-Proben erfolgte in Zusammenarbeit mit Frau Prof. Dr. Schmitt-Graeff. Die
Präparation und Anfärbung der Gewebeblöcke wurden durch die MTAs des Pathologischen
Institutes der Universität Freiburg durchgeführt.
31
3 Ergebnisse
Von den 124 untersuchten Patienten wiesen 33 (26,6%) ein Gallenblasenkarzinom, 47
(37,9%) ein intrahepatisches Karzinom sowie 44 (35,5%) ein extrahepatisches bzw.
perihiläres CCC auf.
80 Proben (64,5%) wiesen dabei eine mäßige Differenzierung auf, in 8 Fällen (6,5%) lag eine
gute Differenzierung vor, während die restlichen 36 Proben (29%) undifferenziert waren.
Beim Tumorstadium wiesen neun (7,3%) Patienten ein Stadium I auf. 20 Proben (16,1%)
zeigten das Stadium II sowie 31 (25%) Stadium III. Am häufigsten, in 64 Fällen (51,6%), war
ein Stadium IV zu finden.
Des Weiteren wurde das Ansprechen auf Chemotherapie untersucht. Dabei erhielten 62 der
124 Patienten (50%) eine Chemotherapie.
Nach erneuten Tumorstaging nach zwei Zyklen Chemotherapie zeigten neun der Patienten
(14,5%) „partial response“, sowie 27 ,,stable disease“ (43,5%). Bei beinahe gleich vielen
Patienten, nämlich 26 (42%), konnte keine Remission erzielt werden, sie zeigten ,,progressive
disease“.
Bei 58% der Patienten konnte somit eine Tumorkontrolle erreicht werden (PR 14,5% und SD
43,5%).
Die mittlere Gesamtüberlebenszeit der Patienten nach Diagnosestellung betrug 13 Monate.
Dabei zeigten Patienten, die eine Chemotherapie erhielten, eine mittlere Überlebenszeit von
14 Monaten, verglichen mit neun Monaten bei Patienten, die keine Chemotherapie erhielten.
Ein statistischer Zusammenhang zwischen Proteinexpressionen und Differenzierungsgrad,
Stadium, Gesamtüberlebensrate und dem Ansprechen auf Therapie bei EGFR- und HER2Expression ergab sich nicht.
32
Folgende Tabelle zeigt einen Überblick über die Patientencharakteristika:
Alter in Jahren:
- Durchschnitt
- Standartabweichung
- Spannbreite
63,4 Jahre
11,0 Jahre
32,8-84,8 Jahre
Geschlecht:
- weiblich
- männlich
63 (50.8%)
61 (49,2%)
Karzinomtyp:
- Gallenblasenkarzinom
- intrahepatischer Typ
- extrahepatischer Typ
33 (26.6%)
47 (37.9%)
44 (35.5%)
Histologischer Typ:
- gut differenziert
- mäßig differenziert
- undifferenziert
8 (6.5%)
80 (64.5%)
36 (29%)
Stadium
( AJCC/UICC Klassifikation 2002)
-I
- II
- III
- IV
9 (7.3%)
20 (16.1%)
31 (25%)
64 (51.6%)
Chemotherapie:
- partial response
- stable disease
- progressive disease
62 (50%)
9 (14.5%)
27 (43.5%)
26 (42%)
Tabelle 7: Patientencharakteristika
33
Die Expression von EGFR wurde anhand von 56 Proben untersucht. Dabei wiesen 22 von 56
Fällen (39,3%) keine EGFR-Expression auf. Zwölf Schnitte (21,5%) boten eine einfach
positive Ausprägung. Grad 2 war bei 13 (23,2%) und Grad 3 bei neun (16%) Patienten zu
finden. Somit zeigte sich bei 22 Patienten (39,2%) eine EGFR-Überexpression.
Die EGFR-Überexpression war dabei in Fällen von extrahepatischen Cholangiokarzinomen
(57,9%) signifikant häufiger (p=0,0284) anzutreffen als bei intrahepatisch gelegenen
Cholangiokarzinomen (25%).
Die HER2-Expression wurde bei allen 124 Patienten untersucht.
Dabei waren 72 (58%) der Proben negativ. 26 (21%) zeigten Grad 1+, 21 (17%) Grad 2+ und
vier (3%) Proben Grad 3+.
Überexprimierte, also Proben die Grad 2+ und Grad 3+ aufwiesen, wurden zusätzlich auf
eine HER2-Genamplifikation untersucht.
Alle Schnitte, die eine dreifach positive Immunhistochemie aufwiesen, zeigten eine HER2Genamplifikation (4/4), während diese nur bei 2/21 (10%) der zweifach positiven Proben
gefunden wurde. Insofern konnte in 6/124 (5%) Fällen eine Genamplifikation gefunden
werden. Tumore mit keiner oder nur 1+-Ausprägung wurden, beruhend auf bereits
publizierten Daten sowie den Anwenderrichtlinien, nicht auf die HER2-Genamplifikation
untersucht [35, 43, 53] .
Gallenblasenkarzinom
n=13
intrahepatisches CCC
n=24
extrahepatisch/
perihiläres CCC
Negativ / 1+
2+ / 3+
8
5
18
6
8
11
n=19
Tabelle 8: EGFR-Expression in Assoziation zur
Tumorlokalisation
34
Gallenblasenkarzinom
n=34
intrahepatisches CCC
n=47
extrahepatisch/
perihiläres CCC
Negativ /1+
2+ / 3+
26
8
40
7
33
10
n=43
Tabelle 9: HER2-Expression in Assoziation zur
Tumorlokalisation
Folgende Tabelle zeigt eine Übersicht über den Zusammenhang zwischen den
Proteinexpressionen und klinisch-pathologischen Faktoren.
Parameter
EGFR 2+/3+
Tumore
Gallenblasenkarzinom
intrahepatisches CCC
extrahepatisch/perihilär
5/13
6/24
11/19
histologischer Typ
gut differenziert
mäßig differenziert
schlecht differenziert
2/3
16/39
4/14
p-Wert
HER2 2+/3+
Tumore
p-Wert
0.088
8/34
7/47
10/43
0.517
0.511
1/8
20/80
4/36
0.202
Stadium
(AJCC/UICC Klassifikation 2002)
I
II
III
IV
Chemotherapie
partial response
stable disease
progressive disease
3/4
2/6
8/17
9/29
0.317
2/3
3/13
5/13
0.296
4/9
4/20
9/31
8/64
4/9
4/27
5/26
Tabelle 10: EGFR- und HER2-Expression in Assoziation zu klinisch-pathologischen
Faktoren (Cox-Modell)
35
0.059
0.156
4 Diskussion
Karzinome der Gallenwege weisen eine schlechte Prognose auf. Um das Überleben dieser
Patienten zu verbessern, ist es neben einer frühen Diagnose und effektiven Therapie
notwendig, diese Tumore auf molekularer Ebene besser zu verstehen [43].
Die Expression von HER2 und EGFR - beide zur Familie der ErbB Wachstumsfaktoren
gehörend - wurden in der Vergangenheit bei unterschiedlichsten Tumorentitäten intensiv
untersucht, wodurch eine zielgerichtete Therapie mit spezifischen Inhibitoren und
Antikörpern entwickelt werden konnte [9, 24, 37, 46, 78]. Diese werden zum Beispiel bei
Kolon-, Mamma- und Lungenkarzinomen, sowie bei Hirntumoren und HNO-Tumoren
angewendet [27].
Gängige Antikörper in der Krebstherapie sind derzeit zum Beispiel Tyrosin-KinaseInhibitoren wie Cetuximab, Trastuzumab, Erlotinib, Gefitinib und Lapatinib.
Die Bedeutung von EGFR und HER2, sowie diese als therapeutisches Ziel zu nutzen, ist bei
verschiedenen Tumoren beschrieben [27, 46, 48, 66].
Über die Expression genannter Rezeptoren beim CCC sind seit Anfang der 90er Jahre viele
Arbeiten publiziert [1, 12, 29, 30, 34, 43, 80, 83], jedoch meist an kleinen Fallzahlen
gewonnen [1, 12, 17, 30, 69] worden.
In dieser Arbeit untersuchten wir die EGFR- und HER2-Expression an einer großen
unselektionierten Fallzahl von Patienten im fortgeschrittenen Stadium des CCC. Lag eine
HER2-Überexpression vor, wurden diese zusätzlich auf eine HER2-Genamplifikation mittels
FISH untersucht.
Im Gegensatz dazu wurde bei einer EGFR-Überexpression auf die Untersuchung einer
Genamplifikation, aufgrund der Ergebnisse anderer Arbeitsgruppen, die nur einen geringen
Zusammenhang zwischen einer EGFR-Überexpression und einer Genamplifikation fanden,
verzichtet [43, 51, 59].
Die Überexpression von EGFR beim CCC bewegt sich in bisherigen Veröffentlichungen
zwischen 8,1% und 81%. In vorliegender Studie fanden wir eine EGFR-Überexpression beim
extrahepatischen CCC in 57,9% und beim intrahepatischen CCC in 25 %.
36
Yoshikawa et al untersuchten 2008 an 236 operierten Patienten, den Zusammenhang zwischen
EGFR, HER2 und deren Assoziation zu klinisch-pathologischen Faktoren, sowie dem
Überleben der Patienten. Diese berichten über eine EGFR-Überexpression beim
extrahepatischen CCC in 26,4% der Fälle und 17,7% beim intrahepatischen [82]. Somit ist in
beiden Studien eine EGFR-Überexpression beim extrahepatischen CCC häufiger als beim
intrahepatischen anzutreffen.
In einer Arbeit von Yoshikawa et al. [82] war die Überexpression von EGFR mit einer
höheren Aggressivität des Tumors assoziiert. Dies konnte in vorliegender Arbeit nicht
bestätigt werden. Jedoch gibt es Hinweise, dass extrahepatische und intrahepatische CCC
unterschiedlich auf Chemotherapie ansprechen, weshalb man auf unterschiedliche biologische
Eigenschaften der beiden Subtypen schließen könnte [23, 44].
Nakazawa et al. beschreiben 2005 eine EGFR-Überexpression in nur 8,1%. Beim
intrahepatischen CCC in 10,7%, beim extrahepatischen CCC nur in 5,1% [43]. Diese Zahlen
zeigen im Vergleich zu dieser Arbeit sowie den meisten bisher veröffentlichten Daten einen
deutlichen Unterschied. Ebenso berichten Ooi et al. 2009 von einer EGFR-Überexpression in
11,3% der Fälle [47]. Der Grund dafür könnte in den unterschiedlichen Färbe- und
Präpariermethoden gefunden werden. So verwendeten beide Arbeitsgruppen den selben
monoklonalen Antikörper (Novocastra Lab. Newcastle, Verdünnung 1:20). Darüber hinaus
wurde in beiden Fällen eine hitzegestützte Epitopdemaskierung durchgeführt, wohingegen
diese in vorliegender Arbeit enzymgestützt durchgeführt wurde.
Jan et al. fanden 2004 in 47% eine EGFR-Expression [29]. Dabei wurden wie in vorliegender
Arbeit sowie bei Yoshikawa et al. im Gegensatz zu Nakazawa et al. und Ooi et al. Methoden
zur Signalverstärkung angewendet (Avidin-Biotin-Peroxidase-Methode, Dextrantechnologie,
polymerbasierte Methode).
Shafizadeh et al. fanden 2009 in 80% der Fälle eine EGFR-Expression. Eine EGFRÜberexpression war beim intrahepatischen CCC in 58% und beim extrahepatischen CCC in
68% der Fälle zu finden [59]. Dies könnte auf die unterschiedliche Definition der
Rezeptorpositivität zurückzuführen sein. Tatsächlich findet man unterschiedliche Definitionen
bezüglich positiver Ausprägung von EGFR. In Arbeiten, welche die Grenze für eine positive
Rezeptorausprägung bei 1% der Tumorzellen legen und dann gestaffelt nach steigenden
Prozentanteilen der Färbung an der Gesamtzellzahl 2+/3+ definieren, weisen entsprechend in
37
80% bis 100% der Fälle EGFR-Positivität nach [52, 59]. In anderen Arbeiten, welche eine
schwache sowie moderate bis starke Färbung der Zellen als positiv definieren, sind
entsprechend nur 8% bis 47% der Proben EGFR-positiv [29, 43, 82].
Daten aus der Vergangenheit belegen beim CCC eine Überexpression von HER2 in 4% bis
82% der Fälle [1, 31, 35, 47, 59, 72, 82, 83].
Eine HER2-Gen-Amplifikation ist in 6,8% bis 17,9% der Fälle zu finden [31, 35, 43].
Bei unserem Patientenkollektiv wurde eine HER2-Überexpression in 20%, sowie eine
therapierelevante HER2-Genamplifikation in 5% gefunden.
Aishima et al. berichteten 2002 in 55% der Fälle von einer positiven HER2Rezeptorausprägung. Im Gegensatz zu vorliegender Arbeit, wo der positive Rezeptorstatus
über die Färbungsintensität der Zellen definiert wird, definierten Aishima et al. den positiven
Rezeptorstatus anhand des prozentualen Anteils der angefärbten Zellen an der Gesamtzellzahl
[1].
Jun Zheng fand 2007 eine HER2-Expression in 80% der Fälle beim Cholangiokarzinom. Hier
wurde zwischen negativ und positiv unterschieden, ansonsten jedoch keine weitere Abstufung
mehr vorgenommen [83].
Yoshikawa dagegen fand 2008 mit standardisierten Testmethoden nur in 0,9 % des
intrahepatischen CCC und 8,5% des extrahepatischen CCC eine HER2-Überexpression [82].
Ukita et al. fanden 2002 eine HER2-Überexpression in 82% der Fälle. Der positive
Rezeptorstatus wurde hier wiederum über den prozentualen Anteil an gefärbten Zellen von
300 Zellen definiert. Zwischen einer HER2-Überexpression und einer Genamplifikation
konnte Ukita keinen Zusammenhang finden [69].
Unsere Daten zeigen beim fortgeschrittenen CCC und hoher HER2-Rezeptorausprägung
jedoch eine gute Korrelation zwischen Überexpression und Genamplifikation. So zeigen alle
3+-HER2- Proben eine Genamplifikation, aber nur 10% der 2+-Proben. An der Gesamtzahl
der Proben gemessen, zeigen nur 5% eine HER2-Genamplifikation.
Weitere Daten aus den letzten Jahren sind uneinheitlich.
So konnten Nakazawa et al. 2005 in 6,8% von 221 BTC Fällen eine Genamplifikation finden,
welche per FISH detektiert wurde [43]. Auffallend ist hier, dass auch 67% der 2+-positiven
Proben (8 von 12) eine HER2-Gen-Amplifikation aufweisen. Der Grund dafür könnte in der
38
zu vorliegender Arbeit unterschiedlichen Färbemethode liegen. So erwähnen Nakazawa et al
in ihrer Arbeit keine signalverstärkenden Methoden zur immunhistochemischen Anfärbung.
Dadurch könnte auch die niedrigere HER2-Überexpressionsrate von nur 9,5% der Fälle
resultieren. Da diese Arbeitsgruppe jedoch die selben Kriterien zur Auswertung der gefärbten
Schnitte wie wir anwendeten, könnte sich dadurch das Verhältnis zwischen negativen,
positiven und überexprimierten Proben derart verschoben haben, dass sich dadurch derartige
Unterschiede im Ergebnis ergeben. Gemeinsam ist jedoch, dass sämtliche 3+-Proben eine
Genamplifikation aufweisen.
Kim et al. fanden 2007 bei 10 von 55 Patienten (18,1%) mit extrahepatischem CCC per CISH
eine Genamplifikation. Hier weisen 57,1% der 2+-Proben ebenfalls eine Genamplifikation auf
[35]. Der Grund dafür könnte ebenfalls in den nicht standardisierten, unterschiedlichen Testund Auswertungsmethoden liegen.
Kawamoto et al. fanden 2007 dagegen mit standardisierten Testmethoden und gleichem
Testkit zur Immunhistochemie wie in vorliegender Arbeit, bei 95 Fällen von intra- und
extrahepatischen CCC sowie Gallenblasenkarzinomen in 17,9% eine Genamplifikation. 3+Fälle wiesen dabei zu 78,6% und 2+-Fälle zu 26,7% eine Genamplifikation auf [31].
Daten beim Mammakarzinom sind ebenfalls uneinheitlich. Studien von Ende der 1980er Jahre
berichten über eine HER2-Überexpression in über 30% der Fälle [78].
Kobayashi fand 2002 in 100% der 3+-HER2 Proben des Mammakarzinoms eine
Genamplifikation, sowie in 18,5% der 2+-Proben [37].
Yau et al. konnten 2008 bei 37 Fällen an Mammakarzinomen in nur 1% der 2+- und in 71%
der 3+-Proben eine Genamplifikation finden [78].
Zusammengefasst zeigen Daten sowohl beim BTC als auch beim Mammakarzinom, welche
durch unterschiedliche nicht standardisierte Test- und Auswertungsmethoden gewonnen
wurden, eine hohe HER2-Expression und teilweise deutlich höhere Genamplifikation. Daten,
welche mit standardisierten modernen Methoden gewonnen wurden, scheinen eine Tendenz
zur deutlich niedrigeren HER2-Expression und Genamplifikation zu haben.
Trotz der Tatsache, dass HER2-transgene Mäuse häufig ein CCC entwickeln, muss somit
angezweifelt werden, dass HER2 bei humanen CCC eine große Rolle spielt.
39
Angesichts der Tatsachen, dass beim Mammakarzinom eine Antikörpertherapie mit
Trastuzumab nur dann effektiv ist [7, 11, 26], wenn der HER2-Überexpression eine
Genamplifikation zugrunde liegt, sowie in vorliegender Arbeit in nur 5% der Fälle eine
HER2-Amplifikation gefunden wurde, scheint eine Antikörpertherapie gegen HER2 beim
CCC wenig vielversprechend zu sein.
Zusammengefasst zeigen unsere Daten, dass die EGFR-Überexpression, speziell beim
extrahepatischen CCC häufig vorkommt. Im Gegensatz dazu ist die Überexpression von
HER2 selten. Eine HER2-Genamplifikation ist ebenfalls selten zu finden, und wenn, dann
hauptsächlich mit einer 3+-Überexpression assoziiert.
Somit sollte, da bei der Entwicklung zukünftiger Behandlungsstrategien HER2-Rezeptoren
als therapeutisches Ziel wenig sinnvoll erscheinen, weitere klinische Prüfungen mit AntiEGFR-Therapien bei Patienten mit fortgeschrittenem CCC in den Mittelpunkt rücken.
40
5 Zusammenfassung
Die Bedeutung der ErbB-Wachstumsfaktoren EGFR und HER2 beim BTC wurde bereits seit
Anfang der 90er Jahre erkannt, weshalb zu diesem Thema zahlreiche Veröffentlichungen
erschienen sind. Die Ergebnisse dieser Arbeiten sind häufig different, was auf die teilweise
kleinen
Patientenkollektive
sowie
die
unterschiedlichen,
nicht-standardisierten
Auswertungsmethoden zurückzuführen sein kann.
In dieser Arbeit untersuchten wir deshalb eine große Gruppe von 124 Patienten mit
fortgeschrittenem Cholangiokarzinom bezüglich der HER2-Ausprägung, sowie 56 Patienten
bezüglich der EGFR-Ausprägung. Überexprimierte HER2-Proben wurden auf eine
Genamplifikation untersucht.
Dabei zeigten 20% der Patienten eine HER2-Überexpression und nur 5% eine
Genamplifikation.
Da beim Mammakarzinom eine gegen HER2 gerichtete Antikörpertherapie nur dann wirksam
ist, wenn einer HER2-Überexpression zugleich eine Genamplifikation zugrunde liegt,
schließen wir, dass beim CCC aufgrund der geringen Ausprägung eine Antikörpertherapie
nicht sinnvoll erscheint.
Dagegen ist die Überexpression von EGFR, speziell beim extrahepatischen CCC häufig, in
unserer Arbeit in mehr als 50 % der Fälle anzutreffen, weshalb es vielversprechend erscheint,
diesem Rezeptor als Angriffsziel einer Antikörpertherapie mehr Aufmerksamkeit zu schenken.
Andere
Arbeitsgruppen
haben
sich
in
jüngerer
Vergangenheit
damit
bereits
auseinandergesetzt. Die Ergebnisse dieser meist kleineren Studien sind zwar hoffnungsvoll,
geben leider aber noch keinen Hinweis auf einen Durchbruch in den Therapieoptionen [10,
39, 52, 56]. Ob eine antikörpergestützte Therapie die Überlebenszeit der betroffenen Patienten
wesentlich verlängern kann, und somit in der Behandlung des CCC einen Meilenstein setzen
wird, werden erst größere Studien zeigen können.
41
Danksagung
Als ich im Sommer 2006 meine Dissertation begann, rechnete ich wohl nicht damit, dass sich
das Ganze über fünf Jahre hinziehen wird. Doch das ,,Praktische Jahr“, das unmittelbar danach
stattfindende Staatsexamen und mein anschließender rascher Berufseinstieg mit Umzug nach
Berlin, bremsten das Projekt Doktorarbeit immer wieder für Monate aus.
An einem grauen Wintertag im Januar 2011 zwang ich mich selbst, eine Entscheidung zu
treffen, ob ich das Projekt endgültig begrabe oder nun endlich zu Ende bringe. Meine
Hoffnung, mich jemals Dr. med. nennen zu dürfen schwand, als ich feststellte, dass PD Dr. Jan
Harder, der bis dahin als mein Betreuer fungierte, mittlerweile die Uniklinik Freiburg
verlassen hatte. Rasch konnte ich ihn jedoch ausfindig machen.
Trotz seiner neuen Herausforderung Chef zu sein, klärte er sich nach einem kurzen e-mailKontakt bereit, meine Dissertation weiter zu betreuen und nun nach Habilitation sogar den
Posten als Doktorvater zu übernehmen.
Deshalb möchte ich PD Dr. Jan Harder als erstes danken. In vielen Treffen unterstützte er mich
und stand mir während des Aktenstudiums, dem Auswerten der histologischen Schritte,
meinen ersten Schreibversuchen sowie während der Vorbereitung anlässlich meiner
Postervorstellung bei der Tagung der DGVS in Berlin 2008 mit Rat und Tat zur Seite. Darüber
hinaus bedanke ich mich natürlich für den fachlichen Rat im Endstadium meiner Arbeit und
schlussendlich für das Übernehmen der Erstkorrektur.
Zudem bedanke ich mich bei Frau Prof. Dr. Schmitt-Gräff für die tatvolle Unterstützung bei
der immunhistochemischen Auswertung der EGFR- und HER2-Proben. Ohne ihre
Unterstützung wäre diese Doktorarbeit nicht möglich gewesen. Des Weiteren bedanke ich
mich bei ihr für die Übernahme der Zweitbegutachtung.
In diesem Zuge ist auch MTA Frau Bärbel Weinhold des Pathologischen Institutes der Uni
Freiburg zu nennen. Bei fast unzähligen Besuchen unterstützte sie mich, vor allem während
dem Heraussuchen und der Vorbereitung der histologischen Präparate, sowie dem Erklären der
einzelnen Arbeitsschritte.
Dank gilt auch den zahlreichen anderen Mitarbeitern des Pathologischen Institutes die beim
Schneiden, der Präparation und dem Anfärben der Präparate beteiligt waren.
I
Aus meinem privaten Umfeld bedanke ich mich als erstes bei meinen Eltern für die
Ermöglichung meines Studiums und vor allem auch für die mentale Unterstützung während
meiner zahlreichen Prüfungsphasen.
Bei Patrick bedanke ich mich für die Unterstützung am Computer und fürs abschließende
Korrektur lesen.
Bei Marco bedanke ich mich für den Rat das Projekt Doktorarbeit unbedingt weiterzuführen
und seine Durchhalteparolen. Ebenfalls bedanke ich mich bei ihm und Michel fürs Korrektur
lesen und die konstruktiven Verbesserungsvorschläge.
II
Die Seite III (Lebenslauf) enthält persönliche Daten. Sie sind deshalb nicht
Bestandteil der Online-Veröffentlichung."
III
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XIV
Abbildungsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1:CT-Bild einer 71-jährigen Patientin mit einem zentral
sitzenden Klatskin-Tumor ................................................................................... 1
Abbildung 2:Bismuth-Klassifikation der hilären Cholangiokarzinome. ..................................7
Abbildung 3: Funktionsweise eines Tyrosinkinaserezeptors am Beispiel von EGFR.............14
Abbildung 4: immunhistochemische Färbemethode – dreistufiges Verfahren........................22
Abbildung 5: HER2-negativ; 20-fache Vergrößerung............................................................. 24
Abbildung 6: HER2 1+; 20-fache Vergrößerung..................................................................... 24
Abbildung 7: HER2 2+; 20-fache Vergrößerung..................................................................... 24
Abbildung 8: HER2 3+; 20-fache Vergrößerung..................................................................... 24
Abbildung 9: EGFR negativ, 20-fache Vergrößerung..............................................................26
Abbildung 10: EGFR 1+, 20-fache Vergrößerung..................................................................... 26
Abbildung 11: EGFR 2+, 20-fache Vergrößerung..................................................................... 26
Abbildung 12: EGFR 3+, 20-fache Vergrößerung..................................................................... 26
Abbildung 13: Prinzip der Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH)..................................... 27
Abbildung 14: Genamplifikation positiv; 1000-fache Vergrößerung........................................30
Abbildung 15: Genamplifikation negativ; 1000-fache Vergrößerung.......................................30
XV
Tabellenverzeichnis
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Bismuthklassifikation der Klatskin-Tumore............................................................. 7
Tabelle 2: Aus der TNM-Klassifikation ergibt sich das Tumorstadium.....................................8
Tabelle 3: Aus der TNM Klassifikation ergibt sich das Tumorstadium...................................10
Tabelle 4: Stadieneinteilung des Gallenblasenkarzinoms (UICC 2002)..................................11
Tabelle 5: Übersicht über die erhobenen Patientenparameter..................................................17
Tabelle 6: Kriterien des „DAKO™ Scoring System“..............................................................23
Tabelle 7: Patientencharakteristika.......................................................................................... 33
Tabelle 8: EGFR-Expression in Assoziation zur Tumorlokalisation.......................................34
Tabelle 9: HER2-Expression in Assoziation zur Tumorlokalisation.......................................35
Tabelle 10: EGFR- und HER2-Expression in Assoziation zu
klinisch-pathologischen Faktoren (Cox-Modell).................................................... 35
XVI
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
BTC
- Gallengangskarzinom von Englisch ,,Biliary Tract Cancer“
CCC
- Cholangiokarzinom
CEA
- carcinoembryonic antigen
CR
- complete response
ERCP
- Endoskopisch retrograde Cholangiopankreatikografie
MRCP
- Magnetresonanz-Cholangiopankreatikografie
MRT
- Magnetresonanztomografie
PBS
- phosphate buffered saline
PD
- progressive disease
PDT
- Photodynamische Therapie
PFS
- progression-free-survival
PR
- partial response
PSC
- primär sklerosierende Cholangitis
SD
- stable disease
SSC
- saline-sodium-citrate-buffer
XVII