Analyse der genomischen Instabilität von normalen Zellen und

Analyse der genomischen Instabilität von
normalen Zellen und Krebszellen ex vivo
Zusammenarbeit zwischen der EPFL und dem Universitätsspital Genf
Dieser aus einer Schenkung der „Fondation de Bienfaisance Pictet“
stammende „zweckgebundene Fonds“ wurde im September 2014 für eine
Dauer von drei Jahren vergeben.
Forschungslabore des Prof. Joerg Huelsken, (EPFL/SV/ISREC)
Das Ziel des von der Pictet-Stiftung geförderten Projektes war es festzustellen ob
unterschiedliche Mutationsraten zwischen normalen und Krebszellen existieren.
Unsere bisherigen Erkenntnisse hierzu wurden am 13. Juni 2017 in einem ersten
Manuskript in der Zeitschrift "Cell Reports" veröffentlicht. Unsere Studie umfasste die
Sequenzierung von Normal- und Krebszellgenomen auf der Ebene von einzelnen
Zellen. Wir haben dies mit einem Mausmodell für Darmkrebs durchgeführt. Normale
Zellen und Tumorzellen aus denselben Mäusen wurden in vitro expandiert und ihre
DNA wurde sequenziert. Um dies zu tun, isolierten wir einzelne Zellen aus
Darmkrypten, die aus normalem Gewebe oder aus Adenomen von Apc MIN/+ Mäusen
gewonnen wurden. Diese Zellen wurden in vitro als Organoide minimal expandiert und
eine Exom-Sequenzierung durchgeführt um Punktmutationen zu identifizieren, die in
vivo in einzelnen Zellen entstanden waren. Im Gegensatz zum aktuellen Dogma, dass
die meisten Punktmutationen in Tumoren das Ergebnis eines normalen
Alterungsprozesses sind und auch in normalen Zellen vorhanden sind, haben wir
festgestellt, dass Krebszellen Punktmutationen mit einer mindestens zehnfach
höheren Rate als normale Zellen erwerben. Dies bedeutet, dass sobald eine normale
Zelle zur Krebszelle wird, ihr Genom instabiler wird. Diese genomische Instabilität kann
das Fortschreiten von gutartigen Tumoren zu metastasierenden, bösartigen
Krebserkrankungen sowie die Entwicklung von Resistenz gegen Krebstherapien
erklären.
Die am häufigsten vorkommende Einzelnukleotidsubstitution (ENS), die in
Krebserkrankungen gefunden wird, ist eine C-to-T-Substitution im CpG-Motiv.
Cytosine in CpG-Motiven sind oft methyliert, und ihre Deaminierung wandelt sie in
Thymine und damit ENS um. Es wurde vorgeschlagen, dass viele dieser ENS während
der normalen Alterung auftreten, vor der Transformation einer normalen Zelle in eine
Krebszelle. Ähnlich wie die Gesamtzahl der Mutationen in Krebszellen waren ENSs
des CpG-to-TpG-Typs mindestens zehnmal häufiger im Adenom als in normalen
Zellen. Dies deutet darauf hin, dass Attribute die mit dem Altern verbunden sind bei
der Krebsbildung beschleunigt werden. Die wahrscheinlichste Ursache für diese
beschleunigte
Mutationsrate
scheint
transformations-induzierter
DNAReplikationsstress zu sein. Die zelluläre Transformation aufgrund des Verlustes von
Tumorsuppressorgenen wie APC oder die Aktivierung von Onkogenen führt zu DNAReplikationsstress und kollabierten DNA-Replikationsgabeln, die zu einzelsträngiger
DNA und schließlich zu DNA-Doppelstrangbrüchen führen. In normalen Zellen wird die
Cytosin-Deaminierung im Rahmen von doppelsträngiger DNA schnell repariert.
Jedoch können in Gegenwart von einzelsträngiger DNA deaminierte Methylcytosine
nicht als beschädigte Basen erkannt werden, was zu erhöhten Mutationsraten führt.
Um das Vorhandensein von DNA-Schäden in Organoiden zu untersuchen, wurde eine
Immunfluoreszenzfärbung für den Marker phosphoryliertes Histon H2AX (γH2AX)
durchgeführt. Die aus dem makroskopisch normalen Epithel abgeleiteten Organoide
waren für diesen Marker nicht positiv, während die Tumor-Sphäroide für γH2AX positiv
waren, was auf eine erhöhte DNA-Schädigung hindeutet. Es wird nun interessant sein
zu bestimmen, ob unsere Erkenntnisse auf andere Gewebetypen und auf menschliche
präkanzeröse Läsionen und Krebsarten ausgedehnt werden können.
Figurenlegende:
Kultur von Organoiden aus gesundem intestinalem Epithel (links) oder
Intestinaltumoren (rechts). Diese Kulturen wurden verwendet um einzelne Zellen zu
expandieren für die nachfolgende Genomsequenzierung und die Analyse von DNAMutationen.