Jansen_2012 - Universität Freiburg

Modellierung von RNA-RNA Interaktionen
Kollaboration 1: Jansen S1; Georg, J2; Hess, WR3; und Timmer J2/4/5/6
Institute: 1Physikalisches Institut, Universität Freiburg; 2Max-Planck-Institut für Immunbiologie Freiburg;
3Biologisches Institut III, Universität Freiburg; 4Centre for Biological Signalling Studies Freiburg, 5Freiburg
Center of Advanced Studies (FRIAS), Universität Freiburg; 6Freiburg Center for Systems Biology (ZBSA),
University of Freiburg;
Ziel des Projektes:
Das Projekt beschäftigt sich mit der quantitativen Beschreibung der Regulierung von Boten-RNA (mRNA)
durch kurze RNA (sRNA). Als Grundlage für dieses Projekt diente das Kodegradationsmodell wie es von
Levine et al. (2007) vorgeschlagen wurde.
dM /dt=X M − d M M − kMR
dR /dt=X R − d R R− kMR
Dieses Modell beschreibt die negative Regulation einer mRNA (M) durch eine sRNA (R). Die Parameter XM
und XR sind Produktionsterme (Transkription), dM und dR sind Degradationskonstanten und k ist der
Kodegradationsparameter.
Das Projekt beschäftig sich mit der Untersuchung von Zellen in denen die durchschnittliche Anzahl der RNAMoleküle sehr gering ist, man also zu einer stochastischen Beschreibung übergehen muss.
Vorgehen und Ergebnisse:
Das obige System hat fünf Parameter S = (XM, XR, dM, dR, k). Bei Messungen eines deterministischen
Systems im steady-state, hat man jedoch nur zwei Observablen: die 'konstanten' Konzentrationen von R und
M. Diese Beschreibung ist im allgemeinen nicht zufriedenstellend, da selbst genetisch identische Zellen
sich untereinander sehr unterschiedlich verhalten. Daher ist es von Interesse sich die Verteilung der
Konzentrationen innerhalb einer Population anzusehen, und nicht nur deren Mittelwerte.
Es wurde nun untersucht welche Parametersätze S in den obigen Gleichungen zu gleichen mRNA und
sRNA Erwartungswerten, führen. Im deterministischen Fall wäre die Messungen diese Parametersätze S
nicht unterscheidbar. Im stochastischen Fall, der mit Hilfe des Gillespie-Algoritmus simuliert wurde,
beobachtet man neben den Mittelwerten auch noch höhere Momente der Verteilungen. Insbesondere ist die
Varianz und die Schiefe der Verteilungen interessant. Es stellt sich heraus, dass diese Verteilungen von der
Wahl der Parameter abhängen. Wir konnten zeigen, dass neben dem Erwartungswert zwei Faktoren eine
wichtige Rolle spielen.
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Eine starke Interaktion zwischen mRNA und sRNA, d. h. ein hoher k-Wert, führt zu einer
inhomogeneren Verteilung der mRNA und sRNA und damit zu einem hohen Coefficient of Variation
Ein Quotient der Produktionsterme XM, XR, nahe bei 1 führt auch zu einem hohen Coefficient of
Variation.
Diese beiden Effekte sind nicht unabhängig voneinander, was damit zu tun hat, dass die 5 Parameter nnicht
komplett frei gewählt werden können um zu einem festen Erwartungswert zu gelangen.
Abbildung 1: Die Abbildung zeigt wie die Verteilungen der mRNA
Moleküle in zwei verschiedenen Zellpopulationen. Bei der schwarzen
Kurve wurde ein niedriger k-Wert angenommen, bei der roten ein
hoher.
Der Erwartungswert von etwa 10 mRNA-Molekülen / Zelle wird bei
beiden gemessen, allerdings ist die Varianz (und damit auch der
Coeffient of Variation) und die Schiefe bei der roten Kurve deutlich
größer als bei der schwarzen Kurve.
Abbildung 2: Die Abbildung zeigt dreimal die gleichen Datenpunkte, dabei repräsentiert jeder Datenpunkt
Eigenschaften der Verteilung der mRNA Konzentration einer komplette Population, und jede dieser
Population hat anderen Eigenschaften (Parameter).
Links: Auf der Ordinaten ist der Coefficient of Variation aufgetragen, auf der Abszisse der Quotient der
Produktionsraten. Man kann erkennen, dass für alle hohen k-Werte der Quotient der Produktionsterme nahe
bei 1 sein muss. Die verschiedenen Plateaus der hellgrauen Punkte sind kommen daher, dass die
Erwartungswerte der mRNA unterschiedlich sind: je höher ein Plateau liegt umso geringer ist der
Erwartungswert. Dabei ist zu beachten, dass ein Anstieg des Coeffient of Variations erst auftritt, wenn der
der Quotient der Produktionsterme nahe bei 1 ist.
Mitte: Wieder ist auf Abszisse der Quotient der Produktionsterme abgetragen, auf der Ordinate allerdings die
Schiefe der jeweiligen Verteilung. Vergleicht man dies mit der linken Abbildung so sieht man, dass Schiefe
und Coefficient of Variation sehr start korreliert sind.
Rechts: Die Schiefe ist gegen die (auch farblich gekennzeichneten) k-Werte abgetragen.
Kollaboration 2: Jansen, S¹; Rödel, P³; Reski, R³; Frank, W³⁵; und Timmer J¹²⁵⁶
Institute: 1Physikalisches Institut, Universität Freiburg; 2Max-Planck-Institut für Immunbiologie Freiburg;
3Biologisches Institut II , Universität Freiburg; 4Centre for Biological Signalling Studies Freiburg, 5Freiburg
Center of Advanced Studies (FRIAS), Universität Freiburg; 6Freiburg Center for Systems Biology (ZBSA),
University of Freiburg;
Ziel des Projektes:
Ziel des Projektes war es einen mikroRNA-regulierten und auxininduzierten Kreislauf zu verstehen und
mittels mathematischer Betrachtungen Modellselektion zwischen konkurrierenden Modellen zu betreiben.
Der miR160/ARF-Regelkreis ist ein Regulator der Differenzierung von Chloronema zu Caulonema in der
Protonementwicklung des Mooses Physcomitrella patens.
Die wichtigste zu beantwortende Frage war, wie der ARF3-1- und ARF3-2-Abbau (ARF: Auxin Response
Factors) durch die mikroRNA miR160 vonstatten geht. Die zwei gängigen Modelle sind zum einen die
Kodegradation (Levine et al, 2007) und zum anderen ein katalytischer Abbau (siehe Osella, Bosia et al,
2011). Bei der Kodegradation bindet die miRNA an die ARFs und der komplette Duplex wird abgebaut
(ARF3-X_frag). Beim katalytischen Modell ist die miRNA nur unterstützend am Abbau der ARFs beteiligt,
und somit in der Lage mehrere ARFs hintereinander abzubauen.
Vorgehen und Ergebnisse: Die Halbwertszeiten (gewöhnliche Degradation) der ARFs sowie der ARFFragmente wurden in unabhängigen Experimenten bestimmt (standartisierte Northern Blots).
Dabei wurde die Transkription der ARFs mit Hilfe von Phenanthroline inhibiert und über einem Zeitraum von
4 Stunden beobachtet. Für die miR160-ARFs wurde sowohl der Wildtyp als auch diverse Mutanten
verwendet. Insbesondere die ΔDCL1a Mutante war bei der Halbwertszeitbestimmung von großem Nutzen,
da in dieser die ARFs nicht zu einem 3'-Fragment gespaltet werden, und man somit die reine, mikroRNA
unabhängige Degradation beobachtet.
Die so berechneten Halbwertszeiten von 17±2 Minuten für ARF3-1 ist in guter Übereinstimmung mit den
ARF3-Halbwertszeiten in Arabidopsis Thaliana (Narsai, Howell et al., 2007). Die Halbwertszeiten der 3'ARF3-Fragmentente wurden ebenso bestimmt, für das ARF3-1-Fragment beträgt diese 33±2 Minuten und
für das ARF3-2-Fragment 37±4 Minuten.
Mit Hilfe des Modells konnten nun weitere interessante Größen bestimmt werden. Eine so berechnete
Größe ist die Halbwertszeit der MikroRNA von etwa 43 ± 2 Stunden. Diese Größe ist insofern von Interesse,
da bisher nur klar war, dass die Halbwertszeit recht lang sein müsse. Ausserdem konnte die sogenannte
Spaltungsaktivität der miR160 bezüglich der ARFs berechnet werden.
Abbildung
1:
Der
miR160/AR
F
Regelkreis.
Auxin
induziert
sowohl die
Produktion
der
mikroRNA
miR160, als
auch
die
Transkriptio
n
von
ARF3-1 und ARF3-2. Die mikroRNA ist für den Abbau der ARFs zu ARF-3'-Fragmenten verantwortlich.
Mittels mathematischer Modellierung sollte die Art des Abbaus bestimmt werden. Es stellt sich heraus, dass
die experimentellen Daten für einen katalytischen Abbau sprechen.
Abbildung 2: Datenpunkte (Triplikate, blau) und BestFit (rot). Der Stimulus ist die Zugabe des Auxins zum
Zeitpunkt t = 0. Sowohl für das Codegradationsmodell als auch für das katalytische Modell wurde die
Analyse durchgeführt. Es zeigt sich, dass die Daten durch das katalytische Modell besser repräsentiert
werden können als durch ein Codegradationsmodell. Die Graphik zeigt die verschiedenen Messreihen, die
simultan gefittet wurden.