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Fluoreszenzspektroskopie
Aufgaben
1. Aufzeichnen eines Übersichtsfluoreszenzspektrums von Chinin
2. Aufzeichnen der Fluoreszenzspektren von Chinin bei verschiedenen
Anregungswellenlängen
3. Aufzeichnen der Fluoreszenzspektren von Chinin in verschiedenen
Konzentrationen – Quantitative Bestimmung
4. Einfluss des pH-Wertes auf die Intensität
Theoretische Grundlagen
Fluoreszenz
Bei der Fluoreszenz findet ein Übergang eines elektronisch angeregten Systems
zu einem energetisch niedriger liegenden Zustand statt, wobei Energie in Form
von Licht emittiert wird. Die Übergänge erfolgen dabei nur zwischen Zuständen
gleichen Spins. (zwischen sich energetisch unterscheidenden Singulettzuständen)
Es werden dabei die bindenden  bzw. σ - Bindungselektronen in nichtbindende
* bzw. σ * Zustände überführt, woraufhin die Elektronen wieder in den
Grundzustand zurückfallen.
Im Gegensatz zur Fluoreszenz tritt bei der Phosphoreszenz eine spin- Umkehr
auf. Diesen Vorgang bezeichnet man als Intersystem- crossing.
Die Phosphoreszenzstrahlung dauert wesentlich länger als die der Fluoreszenz,
und kann bis zu Stunden andauern.
Interne und externe Umwandlung, Schwingungsrelaxation
Als Schwingungsrelaxation wird das energetische Absinken eines Elektrons vom
angeregten in den energetisch tiefer liegenden Schwingungszustand bezeichnet.
Diese Energie wird normalerweise als Wärme, überschüssige Energie dann als
Lichtquant, abgegeben.
Interne Umwandlung ist ein strahlungsloser Übergang bei der Änderung des
Elektronenzustandes.
Bei einer externen Umwandlung findet ebenfalls ein strahlungsloser Übergang bei
der Änderung des Elektronenzustandes statt, wobei hier jedoch ein Übergang
nach außen erfolgt, wie z.B. in Verbindung zu Lösungsmittelmolekülen.
Eigenabsorption
Man spricht von Eigenabsorption, wenn die Emission der Fluoreszenzstrahlung
bei einer Absorptionswellenlänge dieses Moleküls liegt.
Quenching
Auslöschung der Fluoreszenz tritt z.B. durch Kollision mit anderen Molekülen auf,
oder durch Anwesenheit von gelöstem paramagnetischem Sauerstoff.
Bei einer Selbstauslöschung wird die Anregungsenergie nicht emittiert, sondern
auf ein anderes Molekül übertragen, im Fall einer Selbstlöschung auf eins der
gleichen Art.
Das Akzeptormolekül ist dabei der „Löscher“.
Quenching spielt bei der Fluoreszenz und ihrer Messung eine wesentliche Rolle.
Im Folgenden werden diese Einflussfaktoren aufgeführt:
-
-
-
-
-
Aromatische Moleküle mit einer hohen Dichte an - Elektronen zeigt eine
wesentlich stärkere Fluoreszenz als nichtaromatische Verbindungen.
Hierbei spielen auch Substituenten am Aromaten eine wichtige Rolle:
handelt es sich um einen Elektronen schiebenden Substituenten, so wird
die Fluoreszenz ebenfalls erhöht, bzw. im Elektronen ziehenden
Substituenten- Fall erniedrigt.
Starre Systeme zeigen eine ausgesprochen hohe Fluoreszenz im
Gegensatz zu „beweglichen“ (schwingenden) Systemen.
Der pH-Wert hat ebenfalls einen Einfluss auf die Fluoreszenz, in dem
protonierte bzw. deprotonierte Substituenten am Aromaten die
Elektronendichte in diesem erniedrigen bzw. erhöhen. Im Fall der
Erniedrigung der Elektronendichte kann der pH-Wert einen QuenchingEffekt haben.
Das Lösungsmittel ist in der Fluoreszenzspektroskopie auch von
Bedeutung, da dieses die emittierte Fluoreszenzstrahlung/ -energie
ebenfalls absorbieren, und damit löschen kann. Besonders Lösungsmittel
mit schweren Atomen löschen stark.
Ähnliche, nur wesentlich stärkere Einflüsse haben Salzzusätze zur
messenden Lösung. Gibt man beispielsweise etwas NaCl zur zu
untersuchenden Lösung, stellt man eine erhebliche Fluoreszenzlöschung
fest. (siehe Aufgabe 4)
Eine weitere Fluoreszenzstrahlungslöschung stellt man bei Vorhandensein
von gelöstem Sauerstoff im Lösungsmittel fest, da dieser die freiwerdende
Energie absorbiert.
Eine erhöhte Temperatur der Messlösung übt einen Intensität
verringernden Einfluss auf die Strahlungsmessung aus.
Eine falsche Anregungsstrahlung kann die Strahlungsintensität auch sehr
stark Erniedrigen, wie aus den Messkurven der 2. Aufgabe hervorgeht.
Das Signalrauschen des Messgerätes liefert auch eine verringert scharfes
Signalbild der Messung.
Durchführung/ Auswertung
Zu Beginn des Versuches wurden zunächst die benötigten Lösungen hergestellt:
- 0,5M H2SO4:
durch Verdünnen von 54ml konz. H2SO4 auf 2l H2O
- Stammlösung:
aus 100mg Chinin in 100ml 0,5 M H2SO4 (1ml/ml)
- 1. Verdünnung:
10 ml der Stammlösung auf 100ml aufgefüllt
(0,1mg/ml)
- 2. Verdünnung:
25ml der 1. Verdünnung wurden auf 250ml aufgefüllt
(0,01mg/ml)
- Lichtenauer Tonic 0,5ml wurden mit 0,5M H2SO4 auf 100 ml verdünnt.
Dies entspricht einem Verhältnis von 1:200
Es wurde nun mithilfe der 2. Verdünnung eine Konzentrationsreihe von 0,050,30mg/l, bestehend aus 6 Versuchslösungen, hergestellt.
Die Lösungen wurden dabei intensiv geschüttelt, um eine möglichst homogene
Konzentrationsverteilung in der Lösung zu erhalten.
Für die Bearbeitung der 1. Aufgabe diente die 4. Probenlösung mit einer
Konzentration von 0,20mg/l. (Übersichtsspektrum siehe S.1 im Anhang)
Im Übersichtsspektrum für Chinin (auf S.1) lassen sich 4 Peaks erkennen. Dabei
entspricht der 1., größte Peak dem Signal der Anregungswellenlänge (300nm).
Der 2., kleinste Peak wird durch die Raman- Streuung verursacht und der 3.,
breiteste Peak ist das Messsignal.
Chinin fluoresziert somit bei einer Wellenlänge von ca. 450nm.
Die hinteren Peaks entsprechen den Oberschwingungen der ersten beiden Peaks
(von Anregungswellenlänge und Raman- Effekt), und treten exakt bei der jeweils
doppelten Wellenlänge auf.
In der 2. Aufgabe wurde die Abhängigkeit der Fluoreszenzintensität von der
Anregungswellenlänge untersucht. (Diagramm siehe S.2 im Anhang)
Man kann erkennen, dass zunächst bei zunehmender Anregungswellenlänge auch
die Intensität der Fluoreszenz wesentlich gesteigert werden kann. (von 275 –
350nm) Bei 350nm gibt es ein Intensitätsmaximum, bei höheren
Anregungswellenlängen(ab 375nm) ist dieses überschritten und die erzielte
Intensität ist deutlich geringer.
Umso intensiver das Messsignal ist, desto präziser lässt sich jeweils das
Maximum an Intensität aus den Fluoreszenz- Messkurven ablesen. Bei flachen
Kurven ist dabei der auftretende Fehler zu groß.
Es wurde somit eine optimale Anregungswellenlänge von 350nm festgestellt.
Bei der 3. Aufgabe wurde eine Kalibriermessreihe der 6 verschiedenen
Probelösungen mit unterschiedlicher Chinin- Konzentration aufgenommen.
Dazu wurde die Küvette jeweils gut mit der zu untersuchenden Probenlösung
gespült, anschließend mit dieser gefüllt und in das Messgerät gestellt.
Man erhielt nun nach je einer 3fach- Messung eine Fluoreszenzintensität
proportional zur vorgelegten Konzentration.
Messwerte:
Nr.
1
2
3
4
5
6
Probe
c in mg/l
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
x
Messwert
137,34
275,25
426,13
553,04
694,66
838,20
644,97
Die einzelnen Messkurven kann man im Diagramm auf S.3 sehen.
Aus den einzelnen Messpunkten ergibt sich ein linearer Zusammenhang beim
Auftragen der Intensität gegen die Konzentration, und man erhält:
Intensität… I
Konzentration… c
I = 2829,3 c +3,6347
Diese Abhängigkeit ist auf S.4 im Anhang dargestellt, und zeigt weiterhin die
Fehlerschläuche.
Auf Seite 5 befindet sich die Auswertung, mit angegebener Chinin- Konzentration
von ca. 46,3mg/l in der Probenlösung.
In der 4. Aufgabe wurde die Änderung der Intensität nach Zusetzung eines
Fluoreszenzlöschers untersucht.
Dabei wurde zunächst eine „normale“ Messung durchgeführt (intensivste
Messkurve) und anschließend die Lösung leicht erwärmt. (rote Kurve)
Die niedrigste, grüne Kurve wurde nach Zusatz von NaCl zur Probelösung
erhalten.
Man kann erkennen, dass die minimale Temperaturerhöhung nur eine leichte
Signalschwächung erbrachte, wogegen die Zugabe des Salzes die Intensität
enorm beeinträchtigt hat.
Kochsalz übt also einen enormen quenching- Effekt auf die Fluoreszenzstrahlung
aus.
Berechnungen
c(Probe) =
644
,97

3
,6347
= 46,3  1,1mg/l
2829
,3
Die Konzentration von Chinin in Lichtenauer Tonic beträgt 46,3  1,1mg/l.
Fehlerdiskussion
Die Hauptfehlerquellen bei diesem Versuch liegen in der Probenherstellung und
bei den zahlreichen Quencher- Effekten, die das Messsignal beeinträchtigen.
Bei der Probenherstellung wurde sehr oft verdünnt und mit sehr kleinen
Konzentrationen gearbeitet. Deshalb haben die Geräte- und Ablesefehler bei
Volumenabmessungen einen relativ großen Einfluss auf die Messsignale. Es
können Ablesefehler wegen des breiten Eichstriches auf den Maßkoben
aufgetreten sein, sowie leichte Volumenschwankungen der Geräte/ Gefäße.
Weiterhin wurde keine ausreichende Konzentrationshomogenität innerhalb der
Probelösung erzielt, da auch ein Teil der Chinin- Moleküle an der Glaswand der
verwendeten Gefäße adsorbiert wird. Dies ergaben die 3 in der
Dreifachbestimmung erhaltenen, voneinander leicht abweichenden Messsignale.
Die Intensität der Fluoreszenzstrahlung hing stark von den einwirkenden
Quencher- Effekten ab.
So trat z.B. eine Lösungsmittelabsorption der Fluoreszenzstrahlung auf, sowie
auch Strahlungsabsorption durch in der Lösung gelösten Luftsauerstoff und durch
die im nicht zu 100% entionisierten Wasser vorhandenen Ionen gelöster Salze.
Einen sich ändernden Quenching- Effekt hat die Temperatur ausgeübt.
Bei erhöhten Temperaturen stellt man eine Erniedrigung der Signalintensität fest.
Da die Temperatur im Versuchslabor annähernd konstant geblieben ist, kann
man nur eine sich evtl. leicht erhöhte Innentemperatur des Messgerätes als
Fehlerquelle betrachten.
Ein weiterer Fehler, der sich ebenfalls auf jede Messung unterschiedlich auswirkt,
ist die Beschaffenheit der verwendeten Glasküvette.
Bei nicht absoluter Reinheit können Chinin- Moleküle aus vorangegangen
Messungen noch immer am Glas anhaften und das Signal erhöhen.
Ist die Glasaußenwand leicht verschmutzt (Fingerabdrücke, Staub) bzw. die
Küvette innen nicht absolut fusselfrei, so können zusätzliche Lichtabsorptionen
verzeichnet werden.
Auswertung
Da die meisten Quenching- Effekte auf jede Messprobe in etwa die gleichen
Einflüsse hatten, hat dieser Fehler nahezu keinen Einfluss auf die Kalibriergerade,
und damit keinen Einfluss mehr auf die Genauigkeit des Messergebnisses.
Die nicht vollkommene Linearität der Kalibriergerade ist auf Fehler
zurückzuführen, die die Messung in unterschiedlicher Weise beeinflusst haben.
Das sind z.B. die sich ändernde Temperatur, persönliche Einflüsse beim Spülen
und Befüllen der Küvette sowie die Küvettenreinheit.
Es wurde allerdings trotz der vielen Fehlereinflüsse eine annähernd lineare
Kalibrierung erhalten. Man hätte die Dreifachbestimmung der Messung jedoch
außerdem mit immer neuen Proben der gleichen Konzentration durchführen
müssen, um minimale Konzentrationsunterschiede innerhalb der Probenlösung
auszugleichen.
Aus dieser recht linearen Kalibrierung ließ sich ein Messergebnis für die
Chiningehalt- Messung mit einem Fehlerbereich von 2,38% bestimmen. Dies
entspricht einer Fehlerschwankung von  1,1mg/l.
Das erhaltene Ergebnis kann somit als recht präzise angenommen werden.