Versuch 14 Fluoreszenzspektroskopische Bestimmung des

Versuch 14
Fluoreszenzspektroskopische Bestimmung des
Gehaltes an Chinin in Softdrinks
Ziel
Mit dem Praktikum sollen Kenntnisse in der Anwendung fluoreszenzspektroskopischer
Arbeitstechniken in der Lebensmittelanalytik vermittelt werden. Zunächst erfolgt die Einarbeitung
in die Fluoreszenzmesstechnik am Spektralfluorimeter PERKIN ELMER LS50B an Hand eines
Grundexperimentes.
Danach ist ein Analysenverfahren zur Gehaltsbestimmung von Chinin in einem Tonic-Getränk
auszuarbeiten. Die dazu notwendigen Kalibrierungsarbeiten sind auzuführen.
Grundlagen
Die Fluoreszenzspektroskopie ist eine der empfindlichsten Analytischen Methoden, die dem
Analytiker zur Verfügung stehen. Mit ihr ist es dank der im Vergleich zur
Atomabsorptionsspektroskopie1000 mal niedrigeren Nachweisgrenzen möglich, Substanzen selbst
in geringsten Spuren nachzuweisen und deren Gehalt zu bestimmen. Trotzdem ist die
Fluoreszenzspektrospie aufgrund der geringen Mess- und Wiederholgenauigkeit, der geringen
Anzahl an bestimmbaren Substanzen und der Notwendigkeit, das Gerät täglich neu zu kalibrieren
nicht immer das Mittel der Wahl.
Im allgememeinen besteht ein Fluoreszenzspektrometer aus einer Lichtquelle
(Deuteriumlampen(160-380nm), Ar-Lampen (unter 180nm) oder schwarze Strahler(VIS-NIR),
einem Monochromator, mit dem die Wellenlänge zur Anregung des Analyten gewählt werden kann,
der Probe selbst, je nach Bauart einem weiteren Monochromator oder Filter im rechten Winkel zum
Strahlengang, mit dem die emmitierte Strahlung selektiv gewählt werden kann und dem
Photomultiplier, der das Fluoreszenzsignal verstärkt und zu einer Auswerteeinheit, wie dem PC,
weiterleitet.
Trifft das von der Strahlungsquelle emmitierte Licht auf die Probe, kommt es im Analyten zur
Anregung von Elektronen aus dem Grundzstand (Singulett S0) in den energiereicheren angeregten
Singulettzustand S1. Aus diesem kann es nun durch interne Umwandlungen und
Schwingungsrelaxation zur Umwandlung in den energieärmeren Singulettzustand S2 kommen, von
dem aus eine Relaxation in den Grundzustand erfolgen kann. Da schon durch die strahlungsfreie
Umwandlung Energie verbraucht wurde, kann bei der stattfindenen Fluoreszenz nur energieärmere
Strahlung emmitiert werden. Die Wellenlänge des Fluoreszenzsignals ist somit größer als die der
absorbierten Strahlung. Ist der geringste Schwingugszustand des angeragten Singulettzustandes S1
sehr stabil, kann es im Molekül nach einiger Zeit auch zu einem Intersystem Crossing kommen, bei
dem sich der Elektronenspin des angeregten Elektrons ändert, wodurch wiederum energieärmere
Strahlung als Phosphoreszenz abgegeben werden kann.
Auch bei der Fluoreszenzspektroskopie haben Parameter wie Temperatur oder die
Zusammensetzung der Matrix entscheidenden Einfluß auf die Qualität der Messung. Da in unserem
Praktikum diese Zusammenhänge bestimmt wurden, sei an dieser Stelle auf die Spektren asdad und
die zugehörige Fehlerdiskussion verwiesen
Aufgaben
1. Aufzeichnen eines Übersichtsfluoreszenzspektrums von Chinin
2. Aufzeichnen der Fluoreszenzspektren von Chinin bei verschiedenen Anregungswellenlängen
3. Aufzeichnen der Fluoreszenzspektren von Chinin in verschiedenen Konzentrationen
-Quantitative Bestimmung
4. Aufzeichnen des Fluoreszenzspektrums von Chinin bei leicht erhöhter Temperatur
5. Aufzeichnen des Fluoreszenzspektrums von Chinin nach Zusatz eines Fluoreszenzlöschers
Chemikalien:
Name
Molare
Masse/(g/
mol)
Gefahrensymbol
R-Sätze
S-Sätze
konz.
H2SO4:
C
Ätzend
R 35
S 26-30-36/37/39-45
Chinin
Xn
Gesundheitsschä
dlich
R 42/43
S 22-24-37-45
324.43
R 35
R 42/43
S 22
S 24
S 26
S 30
S 37
S 36/37/39
S 45
Besonderheiten
Verursacht schwere Verätzungen.
Sensibilisierung durch Einatmen und Hautkontakt möglich.
Staub nicht einatmen.
Berührung mit der Haut vermeiden.
Bei Berührung mit den Augen sofort gründlich mit Wasser
abspülen und Arztkonsultieren.
Niemals Wasser hinzugießen.
Geeignete Schutzhandschuhe tragen.
Bei der Arbeit geeignete Schutzkleidung, Schutzhandschuhe und
Schutzbrille/Gesichtsschutz tragen.
Bei Unfall oder Unwohlsein sofort Arzt hinzuziehen (wenn möglich,
dieses Etikett vorzeigen).
Struktur von Chinin:
Versuchsdurchführung
Zu Anfang werden mit Hilfe der Stammlösung die erforderlichen Standards, um eine
Kalibriegerade aufzunehmen, hergestellt. Dazu wurde die 2. Verdünnung wie nachfolgend
beschrieben hergestellt und auf 0,05 mg/l bis 0,3 mg/l verdünnt. Die zu untersuchende Probe
Margon Tonic Water wurde im Verhältnis 1:200 verdünnt.
Herstellen der Lösungen
Um die nachfolgende Kalibriergerade aufnehmen zu können, wurden 6 Kalibrierlösungen und eine
Verdünnung des Analyten laut nachfolgender Vorschrift hergestellt.
0,5 M H2SO4
2ml konz. Schwefelsäure auf 2 Liter verdünnen
Margon Tonic Water: 0,5 ml mit 0,5 M H2SO4 auf 100 ml auffüllen (1:200)
Stammlösung Chinin (vom Assistenten ausgestellt)
100 mg Chinin in 100 ml 0,5 M Schwefelsäure (1mg / ml)
1. Verdünnung: 10 ml Stammlösung auf 100 ml mit 0,5M H2SO4 auffüllen (0,1 mg/ml)
2. Verdünnung: 10 ml 1. Verdünnung auf 100 ml mit 0,5M H2SO4 auffüllen (0,01 mg/ml)
Verdünnungsreihe:
Nr.
Volumen/ml der 2.
Verdünnung pro 100 ml
Konzentration / (μg/ml)
1
0,5
0,05
2
1,0
0,10
3
1,5
0,15
4
2,0
0,20
5
2,5
0,25
6
3,0
0,30
In der Herstellung der Lösung liegt gerade in der Spurenanalytik die größte Fehlerquelle, da
Volumenfehler der Messpipetten durch unsachgerechtes Benutzen der Messpietten (opt.
Temperatur, richtige Probennahme), ungleichmäßiges Verdünnen der Lösungen oder Verluste
durch anhaftende Lösung an Glaswänden der Stammlösung entscheidend ins Gewicht fallen.
Zudem wird sich auch eine unzureichende Durchmischung der Probe ungünstig auf das
Analysenergebnis auswirken. Somit muss gerade hier mit größter Sorgfalt gearbeitet werden.
1) Aufzeichnung eines Übersichtsspektrums
Um einen ersten Eindruck zu bekommen, in welchen Wellenlängen die nachfolgenden Messungen
erfolgen müssen, wurde mit Lösung Nr. 3 ein erstes Übersichtsspektrum aufgenommen. Dazu scannten
wir die emmitierte Strahlung in einem Wellenlängenbereich von 200 nm bis 800 nm. Wir strahlten Licht
UV-Licht der Wellenlänge 300 nm ein und verwendeten (hier und in den folgenden Versuchen) eine
spezielle Küvette, die selbst kein Licht im UV/Vis-Bereich absorbiert. Im Spektrum Nr. 1
(Übersichtsspektrum) ist das erhaltene Spektrum dargestellt. Auf den ersten Blick ragen zwei Peaks bei
300 nm und 600 nm aufgrund ihrer vergleichsweise hohen Intensität von 765,9 und 430 heraus. Beide
stellen Streulicht des eingestrahlten Lichts dar, das an den Gefäßwänden der Küvette gebrochen wurde.
Die Peaks bei 335 nm und 370 nm, vergleichsweise klein mit 40 und 5, sind Raman-Schwingungen, die
in diesen Wellenlängen sichtbar werden. Die gesuchte Fluoreszenzschwingung erstreckt sich in einem
Bereich von 380 bis 550 nm mit einer maximalen Intensität von ca. 175. Sie ist relativ breit, da die die
Relaxation aus dem energieärmsten S1 zustand in jeden Grundzustand erfolgen kann. Es wird Licht
verschiedener Wellenlänge emmititiert, ein breiter Peak entsteht.
2)
Aufzeichnen der Fluoreszenzspektren von Chinin bei verschiedenen
Anregungswellenlängen
Um ein optimales Signal während der Messung zu erhalten, wurde nun ein Anregungsspektrum
aufgenommen. Dazu wurde die maximale Intensität des Fluoreszenzsignals in einem Bereich von 440
nm bis 460 nm bei Anregungswellenlängen von 275 nm bis 375 nm in Schritten von 25 nm
aufgenommen. Das erhaltene Spektrum ist in Spektrum 2 (Anregungspekrum) dargestellt. Man erkennt
deutlich, dass die Intensität des Fluoreszenzsignals bei einer Anregungswellenlänge von 350 nm ein
Maximum hat. In diesem Maximum erscheint das Fluoreszenzsignal am schäfsten. Da die Intensität des
Fluoreszenzsignals direkt von der Konzentration des Analyten in der Lösung abhängt, ist das
Messergebnis umso genauer, je schärfer das erhaltene Signal ist. Somit wurde die
Anregungswellenlänge für die folgenden Versuche auf 350 nm festgelegt.
3)
Aufzeichnen der Fluoreszenzspektren von Chinin in verschiedenen
Konzentrationen -Quantitative Bestimmung
Von den Anfangs hergestellten Lösungen 1 bis 6 und der verdünnten Probelösung wurden nun die
Fluoreszenzspektren aufgenommen. Dabei wurde mit Lösung 1 bis 6 eine Kalibrierkurve aufgenommen.
Die Fluoreszenzspektren aller Proben wurden jeweils dreimal aufgenommen, um zufällige Fehler, wie
ungünstige Brechungsverhältnisse in der Lösung, zu vermeiden. Um Fehler durch Verunreinigungen des
Lösungsmittels (0,5 M Schwefelsäure) zu vermeiden wurde zu Anfang ein Spektrum des
Lösungsmittels aufgenommen. Der so erhaltene Blindwert wurde anschließend von jedem später
aufgenommen Spektrum subtrahiert.
An den erhalten Spektren (Spektrum 3 - Quantitative Analyse) fällt auf, dass die Intensitäten der
Spektren in geringen Bereichen etwas schwanken. Dies ist auf die Mechanik des Monochromators
zurückzuführen, da die Spiegel bzw. Linsen mechanisch bewegt werden, wodurch es zu den Zacken im
Spektrum kommt. In der unten dargestellten Tabelle sind die gemessenen Intensitäen der
Kalibrierlösungen und der Probe erfasst.
Nr.
Konzentration / (μg/ml)
Maximale Intensität des
erhaltenen Fluoreszenzsignals
1
0,05
131,58
2
0,10
261,67
3
0,15
393,27
4
0,20
527,56
5
0,25
657,43
6
0,30
789,61
Analyt
(Margon Tonic Water 1:200)
-->0,1557
409,36
Die sich für die erhaltene Kalibriergerade ergebenden Standardabweichungen und
Vertrauensintervalle sind in Tabelle 1 (Chininbestimmung in Tonic) aufgelistet. An dieser Stelle sei
bemerkt, dass die Standardabweichung des Anstieges sehr klein ist. Dies bedeutet, dass unsere
Messwerte, da sie wenig streuen, fast exakt linear von der Konzentration des Analyten in Lösung
abhängen. Der resultierende Fehlerschlauch der Kalibriegerade muss somit winzig sein. In der
ebenfalls angehängten Graphik 1 (Kalibriergerade) ist die aus den tabellierten Werten errechnete
Kalibriergerade graphisch dargestellt. Da unsere Messwerte fast gar nicht streuten, ist der
resultierende Fehlerschlauch auf der Gerade nicht zu erkennen. Die Intensität des Analyten ist linear
abhängig von der Konzentration des Chinins in Lösung.
Für den Chinngehalt bei 200 facher Verdünnung wurde bei einer Intensität von 409,36 eine
Konzentration von 0,1557 μg/ml berechnet. Ohne Verdünnung ergibt sich ein Gehalt von 0,1557
μg/ml * 200 = 31,1425 μg/ml. Mit einer statistischen Wahrscheinlichkeit von 95 % und f=4 ergibt
sich t(p,f)=2,7764. Aus diesen Werten ergibt sich wiederum folgendes Messergebnis:
wb= x ± (t*s)/√n = 31,14258 mg/l ± 0,25179 mg/l
4) und 5) Aufzeichnen des Fluoreszenzspektrums von Chinin bei leicht erhöhter
Temperatur und anschließendem Zusatz eines Quenchers
Um den Temperatureinfluß auf die Intensität des Fluoreszenzsignals zu messen, wurde die Probe zuerst
bei Raumtempemperatur analysiert. Anschließend wurde die Küvette um einige Grade unter dem
warmen Wasserstrahl erwärmt und die Intensität gemessen. In Spektrum 4 (Temperatur und Quencher)
ist das Spektrum bei Raumtemperatu braun, bei erhöhter Temperatur blau gezeichnet. Die Intensität bei
höherer Temperatur ist deutlich kleiner. Das Signal wird demnach bei erhöhter Temperatur
abgeschwächt, da bei Temperaturzunahme die Beweglichkeit der Teilchen steigt. Somit nimmt auch die
Wahrscheinlichkeit zu, dass ein angeregtes Elektron durch externe Umwandlug seine Energie
strahlungslos an das Lösungsmittel abgeben kann.
Anschließend wurde dem Analyten eine Spatelspitze eines Quenchers zugegeben. Quencher sind
Substanzen, die das Fluoreszenzsignals des Analyten schwächen oder gänzlich löschen, da sie die mit
den Singulettzuständen der angeregten Elektronen in Wechselwirkung treten und eine strahlungsfreie
Relaxation möglich machen. Zu ihnen zählen paramagnetischer Sauerstoff oder schwere Atome, wie
z.B. Iod oder Bromid. Im Versuch wurde dem Lösungmittel NaCl zugegeben. Wie deutlich zu sehen,
nahm die Intensität des Signals (dunkelrotes Spektrum) nach Zugabe um das sechsfache ab. Somit wird
ebenfalls ersichtlich, dass Matrixeffekte bei Fluoreszenzmessungen einen entscheidenden Einfluss
haben können.
Fehlerdiskussion:
Wie schon im Abschnitt „ Herstellen der Lösungen“ besprochen, können sich besonders Fehler, die
in der Probennahme und der Herstellung der Lösungen geschehen, am gravierendsten auf das
Ergebnis der Analyse auswirken. Somit sind Fehler, z.B. beim abpipettieren der Stammlösung oder
der Analysenlösung unbedingt zu vermeiden. Weiterhin sollte unbedingt auf die Temperatur bei der
die Analyse durchgeführt wird, geachtet werden, da alle Messgeräte auf eine bestimmte Temperatur
geeicht wurden und somit eine Temperaturänderung Volumenfehler zur Folge haben kann. Auch
bei sorgfältigster Arbeitsweise ist jedoch das Ergebnis der Analyse fehlerbehaftet, da die
verwendeten Messgeräte wie z.B. Waagen, Pipetten oder Maßkolben selbst nur mit einer
bestimmten Genauigkeit arbeiten.