Experimente zur Erzeugung tumorspezifischer

Experimente zur Erzeugung tumorspezifischer, zirkulierender Antikörper
V o n
ARNO
GEISSLER,
WOLFGANG
MÜLLER-RUCHHOLTZ
u n d
ELSE
KNAKE
Aus der Abteilung für Gewebezüchtung am Max-Planck-Institut für vergleichende Erbbiologie
und Erbpathologie, Berlin-Dahlem
( Z . Naturforsdig. 15 b , 3 7 5 — 3 7 8 [ 1 9 6 0 ] ; eingegangen am 1. Februar 1 9 6 0 )
\
The immunization of highly inbred Wistar rats with a Benzpyrene-Sarcoma produced in this strain
did not stimulate the formation of circulating tumor-specific antibodies. In these studies the complement fixation test, the colloid-complement fixation test, the ring precipitin test, the agar-gel-diffusion
technic o f O u c h t e r l o n y and tissue cultures for the study of cytotoxic antibodies were used.
Über den gelungenen Nachweis zirkulierender,
tumorspezifischer Antikörper ist in vielen Arbeit e n 1 - 1 6 und andere berichtet worden. Eine grundsätzliche Lösung scheint jedoch noch nicht erzielt worden
zu sein. Das von H A U S C H K A
1 9 5 2 gezogene Resume
hat seine Gültigkeit bis heute behalten. In der Mehrzahl der oben zitierten Arbeiten wurden TumorAntiseren von heterologen Tierarten erzeugt. Dies
bedingte, daß gleichzeitig artspezifische Antikörper
gebildet wurden und infolgedessen die Untersucher
nur mehr oder weniger stark ausgeprägte „tumorspezifische Antikörperquoten" in den Seren nachweisen konnten.
1 7
Die Erwartung tumorspezifischer, zirkulierender
Antikörper geht von der Annahme aus, daß in Tumoren eine Antigensubstanz von artfremder Konstitution vorhanden ist. Vorherrschend wären jedoch auch
in diesem Gewebe die Art- und Gewebsantigene, die
es mit den normalen Organgeweben desselben Tieres
und anderer Tiere derselben Art gemeinsam hat.
Gegen diese Antigene sind in einem heterolog hergestellten Antitumor-Serum ebenfalls Antikörper
enthalten, die im erforderlichen Falle nur durch Absorption mit Normalgeweben eventuell wieder daraus eliminiert werden können. Sicherer ist es, solche
Antigene von vornherein nicht zur Wirkung kommen
1
P . A B R A M O F F , H . CHINCHINIAN U . J . W .
2
cer Inst. 22, 919 [1959],
B. B J Ö R K L U N D U . V . B J Ö R K L U N D , Ber. allg. spez. Pathol.
37 [1958],
3
4
5
6
7
8
9
E. D. DAY,
G. W .
BARNES,
SAUNDERS, J . n a t .
J . A . PLANINSEK
U.
Can-
zu lassen, indem man das Antitumor-Serum homolog
erzeugt. Auch dann könnten sich noch Individualunterschiede als Isoantikörper auswirken. Dies ist
aber dadurch zu umgehen, daß man innerhalb eines
hochgezüchteten Inzuchtstammes arbeitet.
Material und Methodik
Diesen Leitgedanken unserer Experimente verwirklichten wir, indem wir auf Ratten unseres Inzuchtstammes einen Tumor erzeugten und deren sehr weitgehend
erbähnliche, d. h. antigenähnliche Geschwister gegen den
Tumor immunisierten. Wir verwendeten Wistarratten in
etwa der 70. ununterbrochenen Bruder/Schwester-Generation. Für jeden Versuch wurde auf einer Ratte ein
Benzpyren-Sa erzeugt und die Wurfgeschwister dieser
Ratte oder Geschwister aus früheren oder späteren Würfen desselben Weibchens mit dem gleichen Bock (Bruder) gegen den Tumor immunisiert.
Die hier mitgeteilten Untersuchungen bestehen aus 2
voneinander unabhängigen Versuchsabschnitten. In dem
ersten ( G E I S S L E R ) prüften wir die Seren der immunisierten Ratten im Reagenzglas in der KomplementbindungsReaktion (KBR), der Kolloid-KomplementbindungsReaktion (KKBR), der.Ringpräzipitation und im AgarGel-Diffusionstest nach O u c h t e r l o n y . Im 2. Versuchsabschnitt ( M Ü L L E R - R U C H H O L T Z ) untersuchten wir
die Immunseren in der Gewebekultur auf zytotoxische
Antikörper.
10
T . F . M A C R A E U. E. S K I P P E R , zitiert nach E.
Z. Krebsforsch. 52, 269 [1942].
S T . C. M O H O S U . J . G . K I D D , J . exp. Medicine 105, 233
[1957].
W . O S W A L D , Z. Immunitätsforsch, exp. Therap. 97, 219
[1940].
W. O S T W A L D , Z. Immunitätsforsch, exp. Therap. 98, 427
[1940].
T H . LUMSDEN,
KNAKE,
38,
11
D . PRESSMANN,
12
J. nat. Cancer Inst. 20, 123 [1958].
P. P. F I L A T O V , Bull. exp. Biol. Med. (Russ.) 46, 128 [1958].
D . G . G R I G O R ' Y A N , Bull. exp. Biol. Med. (Russ.) 47, 231
[1959],
L. H I R S Z F E L D , W. H A L B E R U . J . L A S K O W S K I , Z. Immunitätsforsch. exp. Therap. 64, 81 [1929].
J . G . K I D D , J . exp. Medicine 6 7 , 581 [1958].
P. N . K O S Y A K O V U . V . S . K R O S T E L E V A , Bull. exp. Biol. Med.
(Russ.) 47, 226 [1959].
T H . L U M S D E N , Amer. J . Cancer 1 5 , 563 [1931].
13
14
M . RAPPORT, L . G R A F ,
N . ALONZO,
E . ABEHOUSE U. M .
MEJAC,
Cancer 8, 546 [1955].
15
R. W .
18
17
WISSLER,
P . A .
BARKER,
M . H . FLAX,
M . F . LAVIA
U.
Cancer Res. 16, 761 [1956].
E. W I T E B S K Y u. P . P Ö P L A U , Z. Immunitätsforsch, exp. Therap. 76, 82 [1932].
T H . S . H A U S C H K A , Cancer Res. 12, 615 [1952].
D. W .
TALMAGE,
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>
I.
Versuchsabschnitt
a) Bereitung des Tumor-Gesamthomogenisates
Ein an einer Inzuchtratte durch subcutane Injektion
von 0,2 cm3 einer 0,5-proz. Lösung von Benzpyren in
Sesamöl (5 Injektionen in wöchentlichem Abstand) erzeugter Tumor wurde steril entnommen. 20 g davon wurden mit einer Schere grob zerkleinert, nachdem Blutreste
und Bindegewebskapsel entfernt worden waren. Das
Material wurde in einer abgemessenen Menge steriler,
physiologischer Kochsalzlösung suspendiert und in einem
Homogenisator der Firma E. Bühler
(Tübingen)
20 Min. bei 54 000 U/Min. homogenisiert. Im gefärbten
Objektträgerausstrich waren nach dieser Behandlung
keine ganzen Zellen mehr und nur vereinzelt noch Bruchstücke von Zellkernen zu sehen. Zu diesem Gewebsbrei
wurde noch so viel physiologische Kochsalzlösung hinzugegeben, daß eine Mischung von 20 g•% entstand. Die
Konservierung erfolgte mit Cialit 1 : 1000 und die Aufbewahrung bei + 4 °C im Kühlschrank.
b) Bereitung des Kochsalzextraktes
Das nach a zubereitete Tumormaterial wurde 24 Stdn.
bei + 4 °C aufbewahrt und danach 1 Stde. bei 3000 U/
Min. zentrifugiert. Der möglichst klare Überstand stellte
den Kochsalzextrakt dar, der außer zur Immunisierung
nach entsprechender Verdünnung auch als Testantigen
für die serologischen Untersuchungen diente.
Entblutung der Tiere am 10. —12. Tage nach der letzten
Immunisierungsinjektion gewonnen. Das Blutserum
jedes einzelnen Tieres wurde mittels der verschiedenen,
nachfolgend geschilderten serologischen Methoden
untersucht. In jedem Falle wurde sowohl das durch
Kochsalzauszug (b) als auch das durch Alkoholauszug
(c) gewonnene Testantigen angewandt.
Zur Sicherung der antigenen Wirksamkeit der zur
Immunisierung der Ratten verwendeten Extrakte wurden
außerdem mit jedem dieser beiden Antigene zwei Kaninchen immunisiert. Die Kaninchen erhielten in den gleichen Zeitabständen intravenös die gleiche Zahl und Art
an Injektionen wie die Ratten. Die Dosis war jedoch
jeweils um ein Drittel höher. Die Entblutung erfolgte
10 —12 Tage nach der letzten Injektion. Mit TumorGesamthomogenisat waren keine Kaninchen immunisiert
worden.
Serologische
e) Komplementbindungs-Reaktion (KBR)
Die Komplementbindungs-Reaktion wurde mit folgendem Hauptversuchsansatz durchgeführt:
[cm3]
0,1
0,4
0,5
0,5
c) Bereitung des Alkoholauszuges
Der Bodensatz, der bei der unter b geschilderten Behandlung nach dem Zentrifugieren zurückgeblieben war,
wurde in 100,0 cm3 Methylalkohol aufgenommen und
24 Stdn. unter mehrmaligem Aufschütteln bei Zimmertemperatur stehengelassen. Danach wurde 15 Min. bei
3000 U/Min. zentrifugiert und der klare Überstand in
eine Porzellanschale abgegossen. Der Alkohol wurde
über einem Wasserbad von 100 °C abgedampft. Der
dabei anfallende Rückstand wurde in einem Gemisch
von Äthylalkohol und physiologischer Kochsalzlösung
im Verhältnis 1 : 5 wieder gelöst. Dieser Extrakt wurde
außer zur Immunisierung ebenfalls bei den serologischen
Untersuchungen der Rattenseren als Testantigen verwendet.
d) Immunisierungsmodus und Serumgewinnung
Insgesamt wurden 23 Inzuchtratten immunisiert, und
zwar 4 Tiere mit Homogenisat nach a, 11 Tiere mit
Kochsalzextrakt nach b und 8 Tiere mit Alkoholauszug
nach c. Die Immunisierung der Ratten erfolgte mit relativ sehr großen Dosen an verschiedenen Körperstellen
subcutan. Die Dosierung und die Injektionsfolge war
mit den 3 verschiedenen Antigen-Zubereitungen (a — c)
gleich. Die Tiere erhielten im Abstand von 2 — 3 Tagen
jeweils 1,0; 1,5; 2,0; 3,0; 4,0 und 5,0cm 3 Antigen
injiziert. Um etwa vorhandene Haptene zu komplettieren, wurden die Antigene mit Ausnahme des Homogenisats zur Immunisierung mit Kalbserum im Verhältnis
2 : 1 bis 4 : 1 gemischt und mehrere Stdn. vor der Injektion bei 37 °C inkubiert. Das Serum wurde durch
Technik
1,0
Serum
physiol. Kochsalzlösung
Antigen
Komplement
30 Min. WB 37 °C
hämolyt. System
30 Min. WB 37 °C
Als Kontrollen wurden stets die Serumkontrolle, die
Antigenkontrolle sowie der gleiche Versuchsansatz mit
negativem Serum durchgeführt.
f) Kolloid-Komplementbindungs-Reaktion (KKBR)
Die Kolloid-Komplementbindungs-Reaktion wurde
nach der von uns entwickelten Methode durchgeführt.
Die Technik und Möglichkeiten dieser neuen Reaktion
sind in früheren Arbeiten geschildert worden 18,19 . Das
als Kolloidsubstanz verwendete Kollidon wurde bei den
hier geschilderten Versuchen stets 7-proz. angewandt
und die Antigene wie bei der KBR zubereitet. Mit der
Kolloid-Komplementbindungs-Reaktion wird ein univalenter Antikörper nachgewiesen, der bei Infektionskrankheiten vor allem am Beginn eines akuten Infektionsgeschehens in Erscheinung tritt. Er ist dann häufig
die Ursache des bei der Komplementbindungs-Reaktion
vielfach als störend empfundenen Prozonenphänomens19.
g) Ring-Präzipitation
Es wurden 0,1 cm3 unverdünntes und 1 : 5 verdünntes
Serum mit 0,2 cm3 fortlaufend verdünntem Antigen
(1 : 5; 1 : 10; 1 : 50; 1 : 100 und 1 : 1000) über- bzw.
unterschichtet. Die Reaktion wurde sofort und nach
45 Min. Aufenthalt im Brutschrank bei 37 °C abgelesen.
18
19
A.
A.
GEISSLER,
GEISSLER,
Mh. Veterinärmed. 13, 586 [1958],
Mh. Veterinärmed. 14. 46 [1959].
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h) Agar-Gel-Diffusionstest nach O u cht e r l o ny
Die Präzipitation im Agar-Gel-Diffusionstest wurde
nach den von B J Ö R K L U N D 20 gegebenen Richtlinien ausgeführt. Wir verwendeten hierzu „Anumbra"-Petrischalen mit einwandfrei planem Boden und einem Durchmesser von 9 cm. In jede Schale wurden genau 20 cm3
eines 2-proz. Agars gegossen. Mit einer Matritze stanzten wir vor dem Gebrauch der Platten 3 gleichseitige,
mit einer ihrer Spitzen zueinander liegende Dreiecke
aus. Die Seitenlänge der Dreiecke betrug 15 mm. In die
nach Entfernung des ausgestanzten Agars entstehenden
Becken konnte ein Flüssigkeitsvolumen von 0,25 cm3
eingefüllt werden. Wir beschickten die Platten 3-mal
nacheinander. Die Ablesung erfolgte 2 — 5 Tage nach
der letzten Einfüllung.
Ergebnisse des I. Versuchsabschnittes
In keinem Serum der immunisierten Ratten konnten wir mit den von uns verwendeten serologischen
Methoden gegen den Tumor oder gegen Bestandteile
des Tumors gerichtete Antikörper nachweisen. Tumorspezifische, zirkulierende Antikörper waren also
nicht gebildet worden. Erwartungsgemäß fehlten
audi Iso-Antikörper, d. h. alle Untersuchungsergebnisse an Rattenseren fielen negativ aus. Wohl aber
hatten die parallelen Immunisierungsversuche mit
denselben Antigenzubereitungen an Kaninchen zur
Antikörperbildung geführt.
II. V e r s u c h s a b s c h n i t t
Die Seren von 13 immunisierten Ratten wurden an
Gewebekulturen auf cytotoxische Antikörper untersucht
und mit Seren von 14 unbehandelten Ratten verglichen.
Wie in Versuchsabschnitt I wurde jeder Versuch in einer
einzigen Linie unseres Wistarstammes durchgeführt, um
die nicht-tumorspezifischen Antiart- und Iso-Antikörper
auszuschalten. Die zum Test gebrauchten Tumor-Gewebekulturen wurden von Tumoren hergestellt, die durch
Transplantation des bei der vorausgegangenen Immunisierung verwendeten Tumormaterials auf Geschwisterratten erhalten worden waren. Die einzelnen Experimente innerhalb des II. Versuchsabschnittes unterscheiden sich erstens durch verschiedene Intensität der Immunisierung und zweitens dadurch, daß das Immunserum den Testkulturen auf 2 verschiedenen Wegen zugeführt wurde (mit Verfahren a und b bezeichnet).
a) Bereitung des Immunisierungs-Antigens
Von einem Ratten-Benzpyrensarkom (Erzeugung s.
S. 376) wurden 7 g grob zerkleinert und homogenisiert.
Hierzu wurden 20 cm3 Paraffinöl, 25 mg hitzeabgetötete
Tuberkelbakterien, 10 cm3 angewärmtes Euzerin, 10 cm3
physiologische Salzlösung und 1% Phenol gegeben. Diese
Emulsion wurde 45 Min. bei 60 °C und dann bei
+ 4 °C gehalten.
20
B . BJÖRKLUND,
Proc. Soc. exp. Biol. Med.
79, 319
[1952].
b) Immunisierung und Serumgewinnung
In der 1. Versuchsgruppe wurden 3, in der 2. Gruppe
8, in der 3. Gruppe 11 und in der 4. Gruppe 12 Injektionen von je 0,5 ml Antigenzubereitung in wöchentlichen Abständen teils intramuskulär, teils intraperitoneal verabreicht. Die Seren wurden 8 Tage nach der letzten Antigeninjektion gewonnen und am gleichen Tage
verwendet.
V e r s u c h s t e c h n i k zum N a c h w e i s
c y t o t o x i s c h e r A n t i k ö r p e r an
Gewebekulturen
Zur späteren Verwendung als Testobjekte für die
Immunseren wurden Kulturen des transplantierten BPSarkoms (s. oben) und normaler Gewebe (Lunge, Milz
und Niere, die teils vom Tumorträger, teils von tumorfreien Geschwistern stammten) in Rollröhrchen vorgezüchtet (feste Phase Hühnerplasma und Hühnerembryonal-Extrakt; flüssige Phase entweder menschlicher Ascites oder Laktalbumin-Hefehydrolysat mit
H a n k s - Lösung und Kälberserum). Davon wurden
für den Testversuch gut wachsende Stücke auf Deckgläser über hohlgeschliffene Objektträger in Gerinnsel aus
Hühnerplasma und Embryonalextrakt gesetzt. Das Immunserum (bzw. normale Kontrollserum) wurde den
wieder ausgewachsenen Kulturen in den Hohlschliff
oder, um Serum zu sparen, in einen kleinen aufgesetzten Kunststoffring zugegeben. Der Zusatz des Serums
erfolgte meistens unverdünnt, aber auch in Verdünnung
1 + 1 und 1 + 2 in Tyrodelösung (Verfahren a). In dem
Verfahren b wurden die zu untersuchenden Seren den
Testkulturen sofort beim Umsetzen aus Rollröhrchen
auf Deckgläser zugefügt (1 HP 1 + 1 HEE + 1 Rattenserum). Nach dem Verfahren a wurden 110 Tumor- und
212 Normalgewebskulturen, nach dem Verfahren b
24 Tumor- und 42 Normalkulturen untersucht.
Kontrollen
Zur Beurteilung der Spezifität etwaiger Veränderungen wurden Immunseren und Normalseren zu Kulturen
sowohl von Tumorgewebe wie von normalen Organen
(s. oben) zugefügt und außerdem mit solchen Kulturen
ohne Serumzusatz verglichen.
Kriterien
für die A u s w e r t u n g
des
Testes
1, 2 und evtl. 3 Tage nach der Serumzugabe wurden
folgende Merkmale protokolliert: 1. Breite der Wachstumszone im Vergleich zum Mutterstück, 2. Granulierung der Zellen in der Wachstumszone, 3. Lysis einzelner Zellen, 4. Lysis von Zellverbänden.
Ergebnis des Versuchsabschnittes II
Auf die beschriebene Weise konnten keine cytotoxischen Antikörper festgestellt werden, Kulturen
mit Zugabe von Immunserum unterschieden sich
nicht von solchen mit Normalserum. In dem Verfah-
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ren a waren die Kulturen beider Serum-Gruppen in
schlechterem Gesundheitszustand als die Vergleichsgruppe ohne Serumzusatz.
Diskussion
Aus den Ergebnissen der Versuchsabschnitte I und
II ist zu folgern, daß in Benzpyren-Sarkomen bei
Ratten keine Antigenpotenzen vorhanden sind, die
sich von den antigenen Art- oder Gewebseigenschaften des tumorfreien Organismus so sehr unterscheiden, daß zirkulierende Antikörper gegen sie gebildet
werden. Diese Aussage kann jedoch nur im Zusammenhang mit der Reichweite der angewandten serologischen Methoden und deren Empfindlichkeit verstanden werden, Das heißt, daß sich unsere Befunde
nur auf das Vorkommen von Ambozeptoren, Präzipitinen* Zytotoxinen und die mit der Kolloid-Komplementbindungs-Reaktion nachweisbaren, univalen21
22
23
24
25
A . D . DUNLAY, V . GOLDSMITH, K . ARNESEN u . L . BUXTON,
Can-
cer Res. 9,217 [1949].
E . EDLINGER U. L. H A R E L , Bull. Cancer 41, 363 [1954].
E. EDLINGER U. F. LACOUR, Bull. Cancer 42, 382 [1955].
H. N. GREEN, Ber. all^. spez. Pathol. 41, 38 [1959].
R. A. MALMGREN, J. nat. Cancer Inst. 20, 417 [1958].
ten Antikörper beziehen. Es gibt z. B. reaktive Vorgänge im Organismus gegenüber antigenen Substanzen, bei denen im allgemeinen keine Antikörper im
Blut auftreten. Von unseren Versuchsergebnissen
kann deshalb nichts Grundsätzliches über die Rolle
von Immunreaktionen in der Tumorpathogenese abgeleitet werden.
Unsere Ergebnisse können in die unter anderem
von D U N L A Y und Mitarbb. 2 1 , E D L I N G E R und H A R E L ,
2 2
EDLINGER
und
LACOUR
2 3
,
GREEN
2 4
,
MALMGREN
2 5
,
und M i t a r b b . 2 8 ' 2 7 , S C H M I D T und Mitarbb. 28 und W E I L E R 29 mitgeteilten Befunde eingereiht werden, in denen von den Autoren gegen
neoplastisches Gewebe keine tumorspezifischen, zirkulierenden Antikörper nachgewiesen werden konnten, bzw. von ihnen sogar ein Antigenverlust des
Tumors gegenüber dem Normalgewebe festgestellt
wurde 2 4 , 2 9 .
MALMGREN
26
R . A . MALMGREN U. B . E . BENNISON, J .
301
27
nat. Cancer Inst.
11,
[1950],
R . A . MALMGREN,
B . E . BENNISON,
B . F . ANDERSON
U.
C. C.
nat. Cancer Inst. 1 1 , 1 2 7 7 [ 1 9 5 1 ] .
F. SCHMIDT, E. L I S S U. R. COUTELLE, Z. Krebsforsch. 62, 658
[1959].
E. W E I L E R , Strahlentherapie 9 3 , 213 [1954].
RISLEY, J.
28
29
Umwandlung des embryonalen Stoffwechsels in Krebsstoffwechsel
V o n
OTTO WARBURG,
KARLFRIED
GAWEHN
u n d
AUGUST-WILHELM
GEISSLER
Aus dem Max-Planck-Institut für Zellphysiologie, Berlin-Dahlem
( Z . N a t u r f o r s c h g . 15 b , 3 7 8 — 3 7 9 [ 1 9 6 0 ] ; e i n g e g a n g e n am 28. März 1960)
Der Stoffwechsel der embryonalen Hühnerzellen ist ein reiner Oxydations-Stoffwechsel. Bei der
Kultur in vitro unter Zusatz von Serum schlägt der embryonale Stoffwechsel in 48 Stdn. in den
Gärungsstoffwechsel der Krebszellen um.
10-tägige Hühnerembryonen wurden nach DULwie früher für Nierenzellen beschrieben 2 , trypsinisiert, gewaschen und mit Nährmedium
+ Serum auf das 400-fache des Zellvolumens verdünnt. Der Bicarbonatgehalt betrug dann etwa
400 mm 3 NaHC0 3 pro cm 3 . Diese Zellsupension
wurde in Petrischalen von 10 cm Durchmesser gegossen und in einer Atmosphäre von 5 Vol-% C0 2 -Luft
bei 3 8 ° gezüchtet, wobei etwa 1/3 der Zellen am Boden
der Schalen anwächst und sich hier in Form von
Spindelzellen teilt, während die übrigen Zellen absterben und sich z. T. auflösen. Die gewachsenen
Zellen wurden nach 24 oder 48 Stdn. mit wenig Versen und Trypsin vom Boden der Schalen abgelöst,
in Phosphat-Salzlösung gewaschen und zur Stoff-
BECCO-VOGT
wechselmessung wieder in Kulturlösung + Serum
aufgenommen, der noch Bicarbonat und Glucose bis
zur physiologischen Konzentration zugesetzt war.
Bei der Manometrie fanden wir:
Aus dem embryonalen Stoffwechsel (Zeit Null der
Züchtung)
iOt
«o2
'M
?
Argon
M
Meyerhof
Quotient
+ 15
-12
1,25
entstand (bei der Züchtung in vitro (unter Zusatz von
Serum) in 48 Stdn. der folgende Stoffwechsel:
1
2
R.
M. VOGT, J. exp. Medicine 99, 167 [1954].
K. GAWEHN U. A. W . GEISSLER, Z. Naturforschg.
13 b, 588 [1958].
DULBECCO
U.
O . WARBURG,
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