2007-09 Dissertation Sagrauske

Aus der Abteilung Pädiatrische Onkologie und Hämatologie
(Leiter: Univ.-Prof. Dr. med. James F. Beck)
der Klinik und Poliklinik für Kinder- und Jugendmedizin
(geschäftsführender Direktor: Univ.-Prof. Dr. med. Christoph Fusch)
der Medizinischen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
Angefertigt am Institut für Pharmakologie
Research Center of Pharmacology and Experimental Therapeutics
(Direktor: Univ.-Prof. Dr. rer. nat. Heyo K. Kroemer)
der Ernst-Moritz-Arndt-Universität Greifswald
Die Suppression von PKCη oder Bcl-xL, nicht aber Bcl-2,
verstärkt die zytotoxische Wirkung von TRAIL
in PC3-Prostatakarzinomzellen
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des akademischen
Grades
Doktor der Medizin
(Dr. med.)
der
Medizinischen Fakultät
der
Ernst-Moritz-Arndt-Universität
Greifswald
2006
vorgelegt von:
geboren am:
in:
-1-
Antje Sagrauske
17.03.1980
Ilmenau
Dekan:
Prof. Dr. rer. nat. Heyo K. Kroemer
1. Gutachter:
Prof. Dr. med. James F. Beck
2. Gutachter:
Prof. Dr. med. Meinolf Suttorp
Ort:
Universitätsklinik für Kinder- und Jugendmedizin, Greifswald
Tag der Disputation: 03. September 2007
-2-
Diese Arbeit wurde in Teilen veröffentlicht:
Apoptotic responsiveness of PC-3 prostate cancer cells to tumor necrosis factor-related
apoptosis-inducing ligand: Evidence for differential effects of Bcl-xL and Bcl-2 downregulation.
Sonnemann, J., Gekeler, V., Sagrauske, A., Muller, C., Hofmann, H.P. and Beck, J.F. (2004).
Int. J. Oncol. 25, 1171-1181.
Down-regulation of protein kinase C{eta} potentiates the cytotoxic effects of exogenous
tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand in PC-3 prostate cancer cells.
Sonnemann, J., Gekeler, V., Sagrauske, A., Muller, C., Hofmann, H.P. and Beck, J.F. (2004).
Mol. Cancer Ther. 3, 773-781.
-3-
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Das Prostatakarzinom ist in den westlichen Ländern der häufigste Krebs des Mannes und
verantwortlich für einen beträchtlichen Teil der von Krebs verursachten Todesfälle. Es ist in
fortgeschrittenen
Stadien
einer
Zytostatikatherapie
nur
schwer
zugänglich,
neue
Therapieansätze sind deshalb notwendig. In dieser Hinsicht ist „tumor necrosis factor-related
apoptosis-inducing ligand“ (TRAIL) ein aussichtsreicher Kandidat, da er selektiv toxisch auf
Tumorzellen wirkt. Allerdings entfaltet TRAIL allein in vielen Tumorzellen keine
ausreichende
Wirkung.
Die
Beeinflussung
intrazellulärer
Resistenzfaktoren
zur
Sensibilisierung der Tumorzellen ist hier ein vielversprechender Ansatzpunkt.
In der vorliegenden Arbeit wird gezeigt, dass die spezifische Herabregulation der
Proteinkinase Cη in PC3-Prostatakarzinomzellen durch chimäre Zweitgenerations-AntisenseOligonukleotide die zytotoxischen Effekte von TRAIL signifikant verstärkt. Nach „Knockdown“ der PKCη zeigt sich ein deutlicher Anstieg der TRAIL-induzierten Apoptosetypischen
Veränderungen,
wie
Caspase
3-Aktivierung
und
nukleosomale
DNA-
Fragmentierung. Außerdem kommt es zur Verstärkung der TRAIL-induzierten Störung des
mitochondrialen Membranpotentials und einer erhöhten Cytochrom c-Freisetzung, was dafür
spricht, dass die PKCη innerhalb des Apoptosesignalweges oberhalb der Mitochondrien
wirksam ist. Die PKCη kann in Bezug auf TRAIL somit als ein bedeutender Resistenzfaktor
in Prostatakarzinomzellen angesehen werden und ist damit ein vielversprechender
Angriffspunkt zur Verstärkung der antineoplastischen Effekte von TRAIL.
Im weiteren werden in dieser Arbeit mit Bcl-2 und Bcl-xL zwei bekannte antiapoptotische
Proteine mit der Fragestellung untersucht, ob sie als Resistenzfaktoren in der TRAILinduzierten Apoptose von PC3-Prostatakarzinomzellen eine wichtige Funktion besitzen.
Gegen die Erwartungen hat der „Knock-down“ von Bcl-2 jedoch keinerlei Auswirkungen auf
den TRAIL-induzierten Zelltod. Anders Bcl-xL: dessen Herabregulation führt zu einer
signifikanten Verstärkung der Störung der Mitochondrienfunktion, der Caspase 9- und 3Aktivitäten und des apoptotischen Zelltodes nach TRAIL-Behandlung. Die beiden Proteine
scheinen in Prostatakarzinomzellen also unterschiedliche Funktionen in Bezug auf den
TRAIL-aktivierten Apoptoseweg zu haben, wobei Bcl-xL als vielversprechendes Zielmolekül
zur Potenzierung der zytotoxischen Effekte von TRAIL genannt werden kann.
Zusammengenommen legen diese Befunde nahe, dass PKCη und Bcl-xL erfolgversprechende
Zielmoleküle zur Verbesserung der Therapie des Prostatakarzinoms, vor allem im Hinblick
auf eine mögliche therapeutische Anwendung von TRAIL, darstellen.
-4-
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1.
Einleitung
1.1.
Mechanismen der Tumorentstehung
1.2.
Apoptose und Caspasen
1.3.
Therapie maligner Tumoren und Chemoresistenz
1.4.
Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL)
1.4.1.
Physiologische Rolle von TRAIL
1.4.2.
TRAIL-Rezeptoren
1.4.3.
Signaltransduktion der TRAIL-Rezeptoren
1.4.4.
TRAIL-Resistenz
1.4.5.
TRAIL in der Therapie maligner Tumoren
1.5.
Die Proteinkinase C-Familie
1.5.1.
Einteilung der Proteinkinasen C
1.5.2.
Struktur der Proteinkinasen C
1.5.3.
Aktivierungsprinzip der Proteinkinasen C (für cPKCs zutreffend)
1.5.4.
Die PKCη
1.6.
Die Bcl-2-Familie
1.6.1.
Struktur und Funktion der Bcl-2-Proteine
1.6.2.
Interaktion der Bcl-2-Proteine
1.6.3.
Die Rolle der Bcl-2-Proteine in der Tumorentstehung
1.7.
Die Antisense-Technik
1.7.1.
Struktur und Funktion von Antisense-Oligonukleotiden
1.7.2.
Aufnahme der Oligonukleotide in lebende Zellen
1.8.
Das Prostatakarzinom
1.9.
Zielstellung der Arbeit
2.
Material und Methoden
2.1.
Material
2.1.1.
Allgemein verwendetes Material und Geräte
2.1.2.
Reagenzien und Zellen für die Zellkultur
2.1.3.
Reagenzien für die Transfektion der Zellen
-5-
Inhaltsverzeichnis
2.1.4.
Reagenzien für die mRNA-Expressionsanalyse
2.1.4.1.
Reagenzien für die RNA-Isolation
2.1.4.2.
Reagenzien für die „Real Time“ RT-PCR (TaqMan)
2.1.5.
Reagenzien für die Proteinexpressionsanalyse
2.1.5.1.
Reagenzien für die Protein-Isolation
2.1.5.2.
Reagenzien für den Western Blot
2.1.6.
Reagenzien für funktionelle Tests
2.1.6.1.
Reagenzien für den Alamar Blue™-Assay
2.1.6.2.
Reagenzien für die Zellzyklusanalyse
2.1.6.3.
Reagenzien für die Caspase-Aktivitätstests
2.1.6.4.
Reagenzien für die Bestimmung des mitochondrialen Membranpotentials
2.1.6.5.
Reagenzien für die Bestimmung der Cytochrom c-Freisetzung
2.1.6.6.
Zytokine
2.1.6.7.
Caspaseinhibitoren
2.2.
Methoden
2.2.1.
Zellkultur
2.2.2.
Transfektion der Zellen mit Gapmer Antisense-Oligodesoxynukleotiden
2.2.3.
mRNA-Expressionsanalyse von PKCη, Bcl-xL und Bcl-2
2.2.3.1.
Präparation der RNA und RNA-Konzentrationsbestimmung
2.2.3.2.
Quantitative „Real time“ RT-PCR (TaqMan)
2.2.4.
Proteinexpressionsanalysen von PKCη, Bcl-xL und Bcl-2
2.2.4.1.
Präparation des zellulären Gesamtproteins und Bestimmung
der Proteinkonzentration
2.2.4.2.
Western Blot
2.2.5.
Funktionelle Tests
2.2.5.1.
Alamar Blue™-Assay
2.2.5.2.
Zellzyklusanalyse
2.2.5.3.
Caspase-Aktivitätstests
2.2.5.4.
Messung des mitochondrialen Membranpotentials
2.2.5.5.
Nachweis des zytosolischen Cytochrom c
-6-
Inhaltsverzeichnis
3.
Ergebnisse
3.1.
Charakterisierung der Gapmer-Transfektion von PC3-Zellen
3.1.1.
Aufnahme FITC-markierter Gapmere in PC3-Zellen
3.1.2.
Expressionsanalysen mittels „Real Time“ RT-PCR (TaqMan®)
3.1.2.1.
PKCη-mRNA-Expression
3.1.2.2.
Bcl-xL-mRNA-Expression
3.1.2.3.
Bcl-2-mRNA-Expression
3.1.3.
Expressionsanalysen mittels Western Blot
3.1.3.1.
PKCη-Protein-Expression
3.1.3.2.
Bcl-xL-Protein-Expression
3.1.3.3.
Bcl-2-Protein-Expression
3. 2.
Funktionelle Analysen nach Transfektion von PC3-Zellen mit Gapmer-AODNs
3.2.1.
Auswirkungen der Suppression der PKCη
3.2.1.1.
Zytotoxizitätstest (Alamar Blue™-Assay) nach Suppression der PKCη
3.2.1.2.
Zellzyklusanalyse nach Suppression der PKCη
3.2.1.3.
TRAIL-induzierte Caspase 3-Aktivierung nach Suppression der PKCη
3.2.1.4.
TRAIL-induzierte Depolarisation der Mitochondrienmembranen
nach Suppression der PKCη
3.2.1.5.
TRAIL-induzierte Cytochrom c-Freisetzung nach Suppression der PKCη
3.2.2.
Auswirkungen der Suppression von Bcl-xL oder Bcl-2
3.2.2.1.
Zytotoxizitätstest (Alamar Blue™-Assay) nach Suppression
von Bcl-xL oder Bcl-2
3.2.2.2.
Zellzyklusanalyse nach Suppression von Bcl-xL oder Bcl-2
3.2.2.3.
TRAIL-induzierte Caspase 3-Aktivierung nach Suppression
von Bcl-xL oder Bcl-2
3.2.2.4.
TRAIL-induzierte Depolarisation der Mitochondrienmembranen
nach Suppression von Bcl-xL oder Bcl-2
3.2.2.5.
TRAIL-induzierte Cytochrom c-Freisetzung nach Suppression
von Bcl-xL oder Bcl-2
3.2.2.6.
TRAIL-induzierte Caspase 9-Aktivierung nach Suppression
von Bcl-xL oder Bcl-2
-7-
Inhaltsverzeichnis
4.
Diskussion
4.1.
Einsatz von Antisense-Oligonukleotiden
zur Herabregulation intrazellulärer Resistenzfaktoren
4.2.
Die Proteinkinase C-Familie und Auswirkungen der Suppression der PKCη
4.3.
Die Bcl-2-Familie und Auswirkungen der Suppression von Bcl-xL oder Bcl-2
4.4.
Fazit
Abkürzungsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Literaturverzeichnis
Eidesstattliche Erklärung
Lebenslauf
Danksagung
-8-
1. Einleitung
1.
Einleitung
1.1.
Mechanismen der Tumorentstehung
Das richtige Zusammenspiel aus Zellteilung, Differenzierung und Zelltod ist essentiell für die
störungsfreie Entwicklung und das Fortbestehen des menschlichen Körpers. Bei Störungen
dieser Vorgänge in der Embryonalentwicklung kommt es zum Beispiel zu Fehlbildungen von
Organen oder Extremitäten. Bei Fehlern in der späteren Entwicklung des menschlichen
Organismus
kann
es
unter
anderem
zu
neurodegenerativen
Erkrankungen,
Autoimmunerkrankungen oder zu unkontrolliertem Wachstum maligne transformierter Zellen
kommen. Bei der Tumorentstehung überwiegt die Zellteilung gegenüber dem Zelltod in
einem Gewebeverband. Dazu müssen die Regulationsmechanismen, die normalerweise eine
übermäßige Vermehrung von Zellen verhindern, durch Mutationen außer Kraft gesetzt sein,
so dass die Zellproliferation dereguliert ist und der programmierte Zelltod unterdrückt wird
(Evan and Vousden, 2001). Mutationen können zur verstärkten Expression von Oncogenen
führen. Die meisten dieser Oncogene, darunter zum Beispiel c-myc, begünstigen die
Zellteilung, einige andere, beispielsweise Bcl-2, verhindern die Apoptose. Zusätzlich ist oft
eine verminderte Expression sogenannter Tumorsuppressorgene, wie „activin response factor“
(ARF),
Retinoblastomgen
(Rb)
oder
p53,
zu
beobachten.
Diese
kontrollieren
Zellzyklusregulation, Proliferation und die Apoptose. Andere Mutationen können zur
übermäßigen Produktion von Mitogenen führen, die in der Lage sind, die transformierten
Zellen autokrin zu stimulieren (Evan and Vousden, 2001; Hanahan and Weinberg, 2000).
Zu einer onkogenen Transformation einer Zelle sind sehr wahrscheinlich vier bis sieben
zentrale, sich ergänzende Mutationen notwendig. Bei der in Tumorzellen sehr häufigen p53Mutation kommt es trotz DNA-Schäden zur Zellteilung, was zur Vererbung dieser Mutation
und schließlich zur Mutationsakkumulation und zur Transformation der Zelle führt (Harvey
and Levine, 1991; Prokocimer and Rotter, 1994; Yin et al., 1992). Normalerweise sorgt p53
dafür, dass bei DNA-Schäden die Zelle in den G1-Arrest versetzt wird und entweder eine
DNA-Reparatur erfolgt oder, wenn dies nicht möglich ist, die Apoptose induziert wird (Lowe
et al., 1993; Kuerbitz et al., 1992; Kastan et al., 1991). Auch eine Bcl-2-Überexpression führt
zu einer Hemmung der Apoptoseinduktion und so zur weiteren Vermehrung der mutierten
Zellen. Transformierte Zellklone sind im Prinzip in der Lage, unbegrenzt zu einem malignen
Tumor heranzuwachsen. Ab einer bestimmten Tumorgröße kommt es im Zentrum des
Tumors durch Hypoxie und Wachstumsfaktormangel häufig zur Apoptose- oder
-9-
1. Einleitung
Nekroseinduktion. Viele maligne Tumoren sind jedoch wiederum selbst in der Lage,
Angiogenesefaktoren zu bilden, und können sich so ein eigenes Gefäßnetz aufbauen und ihre
Versorgung sicherstellen (Hanahan and Weinberg, 2000; Dang and Semenza, 1999).
Für eine systemische Ausbreitung eines Tumors im menschlichen Körper ist seine Fähigkeit
zur Invasion und Metastasierung von Bedeutung. Durch Mutation von Cadherinen und
Integrinen wird sowohl die Zell-Zell- als auch die Zell-Matrix-Interaktion gestört, so dass sich
Zellen aus ihrem Gewebeverband lösen können (Christofori and Semb, 1999). Aber auch
durch Überexpression extrazellulärer Proteasen oder Suppression ihrer Inhibitoren kann es zur
Lösung der Zellen aus ihrem Gewebeverband kommen (Hanahan and Weinberg, 2000). Die
malignen Zellen sind dann in der Lage, vom Blut- oder Lymphstrom transportiert zu werden
und sich an anderer Stelle erneut anzusiedeln und zu vermehren, also neue maligne Zellklone,
sprich Metastasen, zu bilden.
1.2.
Apoptose und Caspasen
Das genetisch determinierte Programm des natürlichen Zelltodes wird in Anlehnung an die
griechische Bezeichnung des herbstlichen Blätterfalls „Apoptose“ genannt. Die Apoptose ist
ein aktiver, Energie verbrauchender Prozess. Die Entscheidung, ob eine Zelle durch Apoptose
oder Nekrose zugrunde geht, hängt nicht zuletzt vom intrazellulären ATP-Gehalt ab (Leist et
al., 1997). Während man die Apoptose als physiologische Zellmauser betrachtet, wird die
Nekrose mit einem pathologischen Zelltod in Verbindung gebracht.
Morphologische Kriterien der Apoptose sind Ausstülpung der Kernmembran und
Veränderung ihrer Symmetrie ohne Verlust ihrer Integrität, Aggregation der DNA an der
Kernmembran und Kondensation von Zellkern und Zytoplasma, Schrumpfung der Zelle und
Abschnürung apoptotischer Körperchen. Aufgrund der internucleosomalen Spaltung der DNA
durch Endonukleasen entstehen Fragmente mit definierter Länge. Nach physiologischen
Kriterien ist die Apoptose ein streng kontrollierter, aktiver, ATP-abhängiger Prozess. Es
kommt meist zum Tod von Einzelzellen ohne umgebende Entzündungsreaktion und zur
Phagozytose des apoptotischen Materials durch Makrophagen und benachbarte Zellen. Invitro kann in der Endphase der Apoptose eine „sekundäre Nekrose“ durch Schwellen und
Platzen der apoptotischen Körperchen beobachtet werden.
Morphologisch kommt es bei der Nekrose dagegen zum Verlust der Membranintegrität, zur
Ausflockung des Chromatins und schließlich zum Anschwellen von Zelle und Zellorganellen
mit nachfolgender Lyse der Zelle. Die entstehenden DNA-Fragmente besitzen keine
- 10 -
1. Einleitung
bestimmte Länge. Aus physiologischer Sicht spricht man von einem unkontrollierten, meist
durch chemische oder physikalische Schädigung induzierten, passiven, nicht Energie
verbrauchenden Prozess. Es kommt zum Tod von Zellgruppen mit begleitender
Entzündungsreaktion und zur Phagozytose des nekrotischen Materials durch Makrophagen
und Neutrophile.
Die für den ungestörten Ablauf der Apoptose notwendigen Proteine werden in jeder
Körperzelle konstitutiv exprimiert. Damit es nicht zum unregulierten Ablauf der Apoptose
kommt, liegen diese Proteine entweder als proteolytisch aktivierbare inaktive Vorstufen vor
oder sie befinden sich in Zellkompartimenten, in denen sie ihre Wirkung nicht entfalten
können. Für die Apoptose verantwortliche Enzyme sind vor allem die Caspasen. Dies sind
Proteasen, die die Aminosäure Cystein in ihrem aktiven Zentrum enthalten und ihre Substrate
nach der Aminosäure Aspartat spalten (Shi, 2002). Bisher sind 14 Vertreter bekannt. Die
Caspasen 1, 4 und 5 gehören nur rein nomenklatorisch dieser Familie an, sie fördern die
Reifung von Zellen des Immunsystems, spielen bei der Apoptose aber keine Rolle. Die
anderen Enzyme können in Initiatorcaspasen (z.B. Caspase 8 und 9) und Effektorcaspasen
(z.B. Caspase 3, 6 und 7) eingeteilt werden. Analog zu diesen Bezeichnungen kann die
Apoptose prinzipiell in zwei Schritte eingeteilt werden: Induktion und Termination. Für die
Induktion der Apoptose sind wiederum prinzipiell zwei Signalwege bekannt: der
Todesrezeptor-vermittelte Weg und der mitochondriale Weg. Der Todesrezeptor-vermittelte
Weg wird durch Zytokine wie „Fas-Ligand“ (FasL), „Tumor Nekrose Faktor“ (TNF) oder
„TNF-related apoptosis-inducing ligand“ (TRAIL) initiiert. Sie alle gehören zur TNF-Familie
und vermitteln ihre Wirkung über die Bindung an bestimmte Todesrezeptoren. Bei der
Ligandenbindung kommt es zur Trimerisierung der Rezeptoren und zur Aneinanderlagerung
ihrer intrazellulären Todesdomänen (death domain = DD). An die Todesdomänen der
Rezeptoren wird nun ein intrazelluläres Adaptermolekül, die „Fas-assoziierte Todesdomäne“
(Fas-associated death domain = FADD) rekrutiert und es entsteht die sogenannte
Todeseffektordomäne
(death
effector
domain
=
DED)
(Dranoff,
2004).
Nach
autokatalytischer Aktivierung der Caspase 8 (= „Fas-associated death domain-like IL-1βconverting enzyme“ = FLICE) an der DED kommt es einerseits auf direktem Weg zur
Aktivierung der Caspase 3 als Effektorcaspase und andererseits zur Spaltung von Bid, einem
proapoptotischen Protein der Bcl-2-Familie, welches den mitochondrialen Weg aktiviert.
Dieser mitochondriale Weg wird aber auch durch Chemotherapeutika, Bestrahlung oder
anderen
zellulären
Membranpotentials
Stress
kommt
ausgelöst.
es
zur
Durch
Erhöhung
- 11 -
die
der
Störung
des
Permeabilität
mitochondrialen
der
äußeren
1. Einleitung
Mitochondrienmembran und zur Freisetzung von Proteinen aus dem Intermembranspalt der
Mitochondrien. Ein wichtiges, dabei freigesetztes Molekül ist Cytochrom c, das im
Mitochondrium eine Rolle im Elektronentransfer bei der oxidativen Energiegewinnung spielt
(Shimizu et al., 1999). Nach der Freisetzung ins Zytosol bildet es mit dem „apoptotic
protease-activating factor-1“ (Apaf-1) und der Procaspase 9 das sogenannte Apoptosom. Hier
kommt es zur autokatalytischen Aktivierung der Caspase 9, die nun in der Lage ist, die
Caspase 3 zu aktivieren (Li et al., 1997). Ein weiterer, aus den Mitochondrien freigesetzter
Faktor ist der „second mitochondria-derived activator of caspases“ (Smac) oder „direct IAP
binding protein with low isoelectric point” (DIABLO) genannt, der an Inhibitoren der
Apoptose (inhibitor of apoptosis proteins = IAP) bindet und diese so daran hindert, die
Aktivierung der Caspasen zu inhibieren (Du et al., 2000). Für die Termination der Apoptose
sind hauptsächlich die Effektorcaspasen 3, 6 und 7 verantwortlich. Es sind bisher etwa 60
verschiedene Substrate identifiziert worden, die vor allem durch die Caspase 3 gespalten
werden.
Dies
sind
zum
Beispiel
der
Inhibitor
der
„caspase
activated
desoxyribonuclease“/DNA-Fragmentierungsfaktor 45 (ICAD/DFF45) (Enari et al., 1998) oder
die „Poly-(ADP)-Ribose-Polymerase“ (PARP), ein DNA-Reparaturenzym (Sakahira et al.,
1998). Am Ende der Apoptose stehen oben beschriebene morphologische Veränderungen der
Zelle, wie Kondensation des Chromatins, definierte DNA-Fragmentierung und Entstehung
membranöser Vesikel, die von Nachbarzellen aufgenommen werden.
Damit
die
Apoptose
nicht
unkontrolliert
ablaufen
kann,
gibt
es
verschiedene
Regulationsmechanismen. Bei dem Rezeptor-vermittelten Weg ist dies zum Beispiel das
„cellular FLICE-like inhibiting protein“ (cFLIP), das Ähnlichkeit mit der Caspase 8 (=
FLICE) aufweist, aber keine proteolytische Aktivität besitzt. Bei hohen intrazellulären cFLIPKonzentrationen kann die Rezeptor-vermittelte Caspase 8-Aktivierung durch Rekrutierung
von cFLIP statt FLICE an die Todeseffektordomäne blockiert werden (Leverkus et al., 2000).
Beim mitochondrialen Signalweg ist vor allem die Familie der Bcl-2-Proteine für die
Regulation verantwortlich. Das Verhältnis aus pro- und antiapoptotischen Mitgliedern dieser
Familie scheint entscheidend für die Membranstabilität der Mitochondrien zu sein. Weiter
unten in der Signalkette der Apoptose können IAPs die aktiven Caspasen 3 oder 7 hemmen
(Du et al., 2000). Aufgrund defekter Apoptoseregulation kann es einerseits zum
unkontrollierten Ablauf des programmierten Zelltodes kommen, was wohl für die Entstehung
von degenerativen Erkrankungen verantwortlich ist, andererseits kann eine Blockade des
programmierten Zelltodes zum Überleben transformierter Zellen und so zur Tumorentstehung
führen.
- 12 -
1. Einleitung
Die unten stehende Abbildung zeigt schematisch die Signalwege der Apoptose und deren
intrazelluläre Regulationsmechanismen.
Abb. 1:
Schematische Darstellung der beiden Hauptsignalwege der Apoptose.
1.3.
Therapie maligner Tumoren und Chemoresistenz
Zur Behandlung von soliden Tumoren stehen heute im Wesentlichen drei Therapieoptionen
zur Verfügung. Wenn möglich wird versucht, den Tumor durch eine Operation in toto zu
entfernen. Oft ist es allerdings nötig, nach der Operation eine adjuvante Strahlen- oder
Chemotherapie anzuschließen, um eventuell noch verbliebene Tumorzellen zu zerstören. In
anderen Fällen kann zur Verbesserung der Operabilität eine Tumorverkleinerung durch
neoadjuvante Bestrahlung oder Zytostatikatherapie erreicht werden. Bei bereits systemisch
ausgebreiteter Tumorerkrankung bleibt bei den meisten Tumoren neben einer suffizienten
Schmerztherapie und symptomorientierter supportiver Therapie als weitere Therapieoption
häufig nur eine palliative Chemotherapie oder Bestrahlung, um die Lebensqualität des
Patienten zu verbessern.
- 13 -
1. Einleitung
Die meisten Chemotherapeutika und auch die Bestrahlung führen über die Induktion der
Apoptose zur Verkleinerung des Tumors. Ein großes Problem in der Krebstherapie ist die
primäre Resistenz oder die Resistenzentwicklung der Tumoren gegenüber Zytostatika. Dies
kann einerseits durch sogenannte „upstream events“ geschehen. Dazu gehört die
Überexpression von „ATP-binding cassette“ (ABC)-Transportern, welche aufgenommene
Zytostatika schnell wieder aus der Zelle heraus transportieren und damit die intrazelluläre
Wirkkonzentration minimieren (Forth et al., 2001). Das p-Glykoprotein, welches zu diesen
Transportern gehört, ist zum Beispiel in verschiedenen Leukämieformen, Karzinomen und
Sarkomen überexprimiert und an deren Chemoresistenz beteiligt. Andererseits kann durch
sogenannte „downstream events“ der geregelte Ablauf der Apoptose der Zellen gestört
werden. So können Apoptose-induzierende Faktoren supprimiert und Apoptose-inhibierende
Faktoren überexprimiert werden. Bcl-2 und Bcl-xL sind solche Resistenzfaktoren, die bei
verschiedenen Tumoren überexprimiert sind und zur Chemoresistenz führen. Die
Proteinkinase C-Familie (PKC) stellt weitere wichtige Modulatoren in Zellzyklus und
Zelldifferenzierung. Durch PKC-vermittelte Phosphorylierungen wird die Expression sowohl
von „upstream“- als auch von „downstream“- Faktoren reguliert. Abhängige Proteine sind
z.B. die Glutathion-S-Transferase, die Topoisomerase I und II, die d-TMP-Synthase oder das
p-Glykoprotein.
Chemoresistente Tumorzellen reagieren oft weiterhin sensibel auf die Rezeptor-vermittelte
Apoptose. So könnte die systemische Therapie mit Zytokinen der TNF-Familie zu neuen
Therapierfolgen führen. Während TNFα relativ unspezifisch toxisch auf normale und maligne
transformierte Zellen des Organismus wirkt, konnte bei TRAIL, einem anderen Zytokin der
TNF-Familie, diese unspezifische Toxizität bisher nicht beobachtet werden. TRAIL scheint
selektiv Tumorzellen zu zerstören, während normale Zellen weitgehend unbeeinträchtigt
bleiben (Ashkenazi et al., 1999; Kelley et al., 2001; Walczak et al., 1999).
1.4.
Tumor
necrosis
factor-related
apoptosis-inducing
ligand (TRAIL)
Apo2L/TRAIL, ein Mitglied der TNF-Familie der Zytokine, wurde 1995 von Wiley und
Mitarbeitern aufgrund seiner Sequenzhomologie zu FasL und TNFα kloniert und
charakterisiert. Es besteht beim Menschen aus 281 Aminosäuren und wird als Typ-IITransmembranprotein in vielen Geweben, prädominant in Milz, Lunge und Prostata
exprimiert. Das TRAIL-Gen konnte auf Chromosom 3 (3q26) lokalisiert werden und liegt
- 14 -
1. Einleitung
damit nicht in der Nähe der Gene anderer Mitglieder der TNF-Familie (Wiley et al., 1995).
Die Expression von TRAIL und seinen Rezeptoren wird durch Interferone (IFN) reguliert
(Gong and Almasan, 2000).
Zum Beispiel kommt es in Monozyten und peripheren
Blutlymphozyten nach Interferonbehandlung zur verstärkten TRAIL-Expression und damit
erhöhter Zytotoxizität (Griffith et al., 1999b; Kayagaki et al., 1999). Durch eine verminderte
Todesrezeptor (death receptor = DR) -Expression erlangen die Monozyten selbst eine TRAILResistenz (Griffith et al., 1999b). Cytomegalievirus (CMV) -infizierte Fibroblasten, die mit
Interferonen behandelt werden, reagieren mit der Hochregulation von TRAIL und seinen
Todesrezeptoren. Die TRAIL-Wirkung, speziell auf infizierte Zellen, wird dabei durch die
Hochregulation der TRAIL-Expression bei gleichzeitiger Herabregulation der DR-Expression
in benachbarten, nicht infizierten Zellen verstärkt (Sedger et al., 1999).
TRAIL kann als an Zelloberflächen gebundenes Protein, als proteolytisch abgespaltenes
lösliches Zytokin oder als Transmembranprotein auf sezernierten Vesikeln seine zytotoxische
Wirkung entfalten (Monleon et al., 2001). Wie andere Mitglieder der TNF-Familie bildet es
Homotrimere,
die
an
Todesrezeptoren
binden,
was
zur
Oligomerisation
der
intrazytoplasmatischen Todesdomänen führt (Hymowitz et al., 1999; Mongkolsapaya et al.,
1999). Für die Stabilität der Homotrimere und damit für die biologische Aktivität von TRAIL
ist
die
Bindung
eines
Zinkatoms
an
einen
ungepaarten
Cysteinrest
in
der
Rezeptorbindungsdomäne von TRAIL nötig (Bodmer et al., 2000; Hymowitz et al., 2000).
1.4.1.
Physiologische Rolle von TRAIL
Untersuchungen zur physiologischen Rolle von TRAIL wurden zum Teil an Mäusen
durchgeführt, auch wenn deren Rezeptorsystem für TRAIL weit weniger komplex ist als das
des Menschen (Wu et al., 1999). TRAIL-„Knock-out“-Mäuse sind lebensfähig, fertil und
weisen keine hämatologischen Defekte auf. Es konnte aber gezeigt werden, dass Wachstum
und Metastasierung von TRAIL-sensitiven subkutan inoculierten Tumoren sowie die Inzidenz
von Methylcholanthren-induzierten Sarkomen deutlich höher sind, wenn physiologisch kein
TRAIL exprimiert wird. Dabei scheint der protektive Effekt von TRAIL gegen
Tumorwachstum und Metastasierung „natural killer cell“ (NKC)-vermittelt zu sein. Die
beschriebenen Effekte können nämlich analog auch in NKC-defizienten Mäusen beobachtet
werden (Cretney et al., 2002; Takeda et al., 2001b; Takeda et al., 2001a; Takeda et al., 2002).
Tumore, die in Anwesenheit von TRAIL-blockierenden Antikörpern entstehen und wachsen,
reagieren darüber hinaus meist sensitiver auf eine TRAIL-Behandlung. In Mäusen kann
TRAIL also als ein wichtiger Inhibitor von Tumorinitiation, -wachstum und -metastasierung
- 15 -
1. Einleitung
angesehen werden (Takeda et al., 2002). TRAIL scheint außerdem eine wichtige Rolle in der
Unterdrückung von Autoimmunreaktionen zu spielen. Es hemmt die Entzündungsreaktion bei
experimentell
induzierter
Rheumatoidarthritis
und
Multipler
Sklerose.
In
den
Entzündungszellen ist hierbei wohl eher eine hemmende Wirkung auf den Zellzyklus als eine
direkte Apoptoseinduktion von Bedeutung (Hilliard et al., 2001; Song et al., 2000).
1.4.2.
TRAIL-Rezeptoren
Das menschliche System der TRAIL-Rezeptoren ist ungewöhnlich komplex. Bisher sind fünf
Rezeptoren bekannt. Die beiden Todesrezeptoren TRAIL-R1/„death-receptor“ 4 (DR4) (Pan
et al., 1997b) und TRAIL-R2/DR5 (Chaudhary et al., 1997; Pan et al., 1997a; Schneider et al.,
1997; Screaton et al., 1997; Sheridan et al., 1997; Walczak et al., 1997) besitzen eine
intrazytoplasmatische Todesdomäne und sind in der Lage ein Signal zur Einleitung der
Apoptose zu übertragen und „nuclear factor κ B“ (NFκB) zu aktivieren; sie werden von vielen
Geweben exprimiert. Zusätzlich gibt es drei weitere Rezeptoren, die TRAIL binden können,
aber als sogenannte „Decoy“-Rezeptoren die zytotoxische Wirkung des Zytokins zu
vermindern scheinen. Ihre TRAIL-Bindungsstellen haben eine hohe Homologie zu denen von
DR4 und DR5. TRAIL-R3/„decoy receptor“ 1 (DcR1) (Degli-Esposti et al., 1997b;
Mongkolsapaya et al., 1998; Pan et al., 1997a; Schneider et al., 1997; Sheridan et al., 1997) ist
mittels eines Glykophospholipid-Ankers auf der Zelloberfläche befestigt, hat aber keine
transmembranäre Domäne und auch keine intrazelluläre Todesdomäne. Er kann kein Signal
zur Apoptoseinduktion und auch keine NFκB-Aktivierung vermitteln. TRAIL-R3 wird
hauptsächlich von peripheren Blutlymphozyten und Skelettmuskelzellen, aber nicht von
Tumorzellen exprimiert. TRAIL-R4/DcR2 (Degli-Esposti et al., 1997a; Pan et al., 1998)
besitzt intrazellulär eine um etwa zwei Drittel verkürzte Todesdomäne, durch die zwar kein
Todessignal, wohl aber eine NFκB-Aktivierung vermittelt werden kann. Er wird ebenso wie
DR4 und DR5 in vielen Geweben exprimiert. Der fünfte TRAIL-Rezeptor, Osteoprotegerin
(OPG), wird sezerniert und inhibiert die Osteoklastogenese. In vivo wird durch seine
Aktivierung die Knochendichte erhöht. Er bindet TRAIL bei physiologischen Temperaturen
aber nur mit geringer Affinität (Emery et al., 1998; Truneh et al., 2000).
1.4.3.
Signaltransduktion der TRAIL-Rezeptoren
Nach der TRAIL-Bindung an DR4 oder DR5 kommt es zur Homo- oder Heterotrimerisation
der Rezeptoren. An der zytoplasmatischen Todesdomäne wird durch Rekrutierung von „Fas- 16 -
1. Einleitung
associated death domain“ (FADD) und Caspase 8 ein „death-inducing signaling complex“
(DISC) gebildet. Im Gegensatz zum TNF-Rezeptor-DISC scheinen die „TNF-related
associated death domain“ (TRADD) oder das „receptor interacting protein“ (RIP) keine Rolle
im TRAIL-DISC zu spielen (Bodmer et al., 2000; Kischkel et al., 2000; Sprick et al., 2000).
Auch die Beteiligung der Caspase 10 (= FLICE 2) als weitere Initiatorcaspase wird
kontrovers diskutiert (Kischkel et al., 2001; Sprick et al., 2000; Wang et al., 1999). Nachdem
die Caspase 8 im DISC gebunden ist, wird sie autokatalytisch durch Proteolyse aktiviert und
kann abhängig vom Zelltyp die Apoptose direkt oder indirekt einleiten (Scaffidi et al., 1998).
In Typ-I-Zellen wird durch eine starke Caspase 8-Aktivität direkt die Caspase 3 aktiviert. Die
Apoptose kann ohne eine mitochondriale Beteiligung ablaufen. In Typ-II-Zellen reicht die
Aktivierung der Caspase 3 allein durch die Caspase 8 für einen vollständig ablaufenden
programmierten Zelltod nicht aus. Eine zusätzliche mitochondriale Triggerung der Apoptose
wird erreicht, indem zunächst Bid, ein proapoptotisches BH3-only Protein der Bcl-2-Familie,
durch die Caspase 8 gespalten wird. Das sogenannte „truncated Bid“ (tBid) transloziert zum
Mitochondrium
und
führt
zusammen
mit
Bax/Bak
zur
Permeabilisierung
der
Mitochondrienmembran, was unter anderem zur Freisetzung von Cytochrom c und
Smac/DIABLO aus den Mitochondrien ins Zytosol führt (Bouillet and Strasser, 2002; Li et
al., 1998; Luo et al., 1998). Nach der Freisetzung von Cytochrom c kommt es bei
Anwesenheit von dATP zur Bindung von Apaf-1 und Procaspase 9 und damit zur Bildung des
sogenannten Apoptosoms. Hier wird die Caspase 9 autoaktiviert und spaltet dann ihrerseits
die Caspase 3, was zu deren Aktivierung führt (Li et al., 1997). Die Freisetzung von
Smac/DIABLO führt zur Bindung von „X-linked inhibitor of apoptosis proteins“ (XIAP) und
anderen Apoptose-Inhibitoren (IAPs), was diese daran hindert, aktivierte Caspasen zu
blockieren. Dieser Mechanismus scheint für die TRAIL-induzierte Apoptose wichtiger als die
Cytochrom c-getriggerte Caspase 9-Aktivierung zu sein (Deng et al., 2002; Deveraux et al.,
1999; Du et al., 2000; Verhagen et al., 2000; Zhang et al., 2001).
1.4.4.
TRAIL-Resistenz
Viele, auch chemoresistente Tumorzellen sind empfänglich für die zytotoxische Wirkung von
TRAIL, andere wiederum sind aus verschiedenen Gründen resistent. Seit der Aufklärung des
Rezeptorsystems für TRAIL nimmt man an, dass die Expression der verschiedenen
Rezeptortypen über Sensibilität oder Resistenz gegenüber TRAIL entscheidet. Die Sensibilität
von Tumorzellen gegenüber TRAIL kann durch Vorbehandlung mit herkömmlichen
Chemotherapeutika erheblich gesteigert werden. Dieser Effekt beruht nicht nur auf den
- 17 -
1. Einleitung
zytotoxischen Effekten der Zytostatika selbst, sondern auf der signifikanten Hochregulation
der Todesrezeptoren für TRAIL. Insbesondere DR5 wird p53-unabhängig nach DNASchädigung heraufreguliert (Nimmanapalli et al., 2001; Wen et al., 2000). Die sogenannten
„Decoy“-Rezeptoren sollen durch konkurrierende Bindung für die TRAIL-Resistenz
verantwortlich sein. Es wurde gezeigt, dass die Überexpression dieser Rezeptoren TRAILsensitive Zellen vor TRAIL-induzierter Apoptose schützen kann (Degli-Esposti et al., 1997b;
Degli-Esposti et al., 1997a; Pan et al., 1997a; Pan et al., 1998; Zhang et al., 2000). Im
Gegensatz zu diesen Ergebnissen wurde in verschiedenen anderen Studien gezeigt, dass die
Resistenz gegen TRAIL keine Korrelation zur Rezeptorexpression hat (Kim and Gupta, 2000;
Kim et al., 2000; Lincz et al., 2001; Nimmanapalli et al., 2001). Eine Erklärung dafür könnte
die unterschiedliche Affinität der Rezeptoren für TRAIL sein (Truneh et al., 2000).
Dies impliziert, dass intrazelluläre Mechanismen unabhängig von der Expression der
unterschiedlichen Rezeptortypen eine entscheidende Rolle in der Entstehung der TRAILResistenz spielen könnten: wenn, wie bereits beschrieben cFLIP statt FLICE im TRAILDISC gebunden wird, kommt es zum Abbruch der Signalkaskade am TRAIL-Rezeptor.
Allerdings wird auch cFLIP im Hinblick auf die TRAIL-Resistenz von Tumorzellen
kontrovers diskutiert. In einigen Studien wird eine Korrelation zwischen cFLIP-Level und
TRAIL-Resistenz festgestellt (Burns and el Deiry, 2001; Griffith et al., 1998; Irmler et al.,
1997; Mitsiades et al., 2002; Tschopp et al., 1998; Wang et al., 2000) in anderen zeigt sich
diese nicht (Nimmanapalli et al., 2001; Wen et al., 2000). Ein weiterer Mechanismus für die
Regulation der Sensibilität von Tumorzellen gegenüber zytotoxischen Liganden ist das
Verhältnis aus pro- und antiapoptotischen Mitgliedern der Bcl-2-Familie. Nach der
Aktivierung der Caspase 8 im TRAIL-DISC kommt es neben der direkten Caspase 3Aktivierung auch zur Freisetzung von Cytochrom c und Smac/DIABLO aus den
Mitochondrien, was ebenfalls zur Caspase-Aktivierung führt. Zur Permeabilisierung der
Mitochondrienmembran als Vorraussetzung für die Freisetzung der Faktoren ist die
Anwesenheit der proapototischen Mitgliedern der Bcl-2-Familie, Bax und/oder Bak
notwendig. In Zellen, die weder Bax noch Bak exprimieren, findet keine tBid-induzierte
Cytochrom c-Freisetzung statt (Wei et al., 2001). Auch verschiedene andere Studien zeigen,
dass in Bax-defizienten Kolonkarzinom-Zelllinien keine mitochondrialen Apoptoseereignisse
durch TRAIL ausgelöst werden können (Ravi and Bedi, 2002; LeBlanc et al., 2002). Durch
eine zytosolische Expression von Smac/DIABLO kann die Bax-Defizienz in solchen Zellen
überbrückt werden und trotzdem Apoptose induziert werden (Deng et al., 2002). Eine
Überexpression von Bcl-2 oder Bcl-xL, antiapoptotischen Mitgliedern der Bcl-2-Familie,
- 18 -
1. Einleitung
stört die Interaktion von tBid mit Bax/Bak, so dass eine Freisetzung von Cytochrom c und
Smac/DIABLO nicht stattfindet. Einige Tumorzellen, mutmaßlich Typ-II-Zellen, sind auf
diese Weise vor der TRAIL-induzierten Apoptose geschützt (Wen et al., 2000; Luo et al.,
1998). In anderen Tumorzellen, mutmaßlich Typ-I-Zellen, hat die Überexpression von Bcl-2
oder Bcl-xL keine schützende Wirkung. Auch Bcl-2- oder Bcl-xL-überexprimierende,
chemoresistente Tumorzellen können laut Walczak und Mitarbeitern TRAIL-sensitiv sein
(Walczak et al., 2000). Keogh und Mitarbeiter zeigten 2000, dass in CEM-Zellen die
Überexpression von Bcl-2 zwar eine UV-induzierte Apoptose verhindert, jedoch die Apoptose
nach TRAIL-Behandlung unbeeinflusst bleibt (Keogh et al., 2000). Die Aktivierung von
NFkB könnte ein weiterer Weg für die Entstehung der TRAIL-Resistenz in Tumorzellen sein,
da es für eine Hochregulation von cFLIP, Bcl-xL und XIAP verantwortlich ist. Eine
reduzierte NFkB-Aktivität in Colonkarzinomzellen führt über die reduzierte Bcl-xLExpression zu einer verstärkten TRAIL-Wirkung (Ravi and Bedi, 2002). Im Vergleich zur
TNF-R1-induzierten NFkB-Aktivierung ist sie über die TRAIL-Rezeptoren aber nur schwach
ausgeprägt, was impliziert, dass dieser Mechanismus nur eine untergeordnete Rolle spielt
(Sheridan et al., 1997). Auch weitere intrazelluläre Faktoren mit Einfluss auf die TRAILWirkung wurden beschrieben. Durch Aktivierung von Proteinkinasen C kann die TRAILinduzierte Apoptose in Jurkat T-Zellen reduziert werden (Sarker et al., 2001), durch
Hemmung derselben in TRAIL-resistenten PancTuI-Zellen können diese gegen TRAIL
sensibilisiert werden (Sarker et al., 2001; Trauzold et al., 2001). Die Caspase-unabhängige
TRAIL-vermittelte „mitogen activated protease“ (MAP) -Kinaseaktivierung sensibilisiert
Zellen gegen TRAIL (Tran et al., 2001). Zellen, die konstitutiv aktive Akt/Proteinkinase B
(PKB) exprimieren, sind TRAIL-resistenter als Zellen mit niedrigen Akt-Levels (Thakkar et
al., 2001). Akt-vermittelter Schutz vor TRAIL-induzierter Apoptose scheint auf der Ebene der
Bid-Spaltung einzugreifen (Nesterov et al., 2001). Für Prostatakarzinomzellen und
nichtkleinzellige Lungenkarzinomzellen wird eine positive Korrelation zwischen konstitutiv
aktivierter Akt und TRAIL-Resistenz beschrieben (Chen et al., 2001; Kandasamy and
Srivastava, 2002). Eine konstitutiv aktivierte Caseinkinase II (CK2) hemmt die Caspase 8vermittelte Spaltung von Bid und fördert die Bcl-xL-Expression, was zusammen zur
Resistenz gegen TRAIL führt (Ravi and Bedi, 2002).
Der komplexe Regulationsmechanismus und die Wertigkeit dieser Faktoren sind aber bisher
weitgehend ungeklärt.
- 19 -
1. Einleitung
1.4.5.
TRAIL in der Therapie maligner Tumoren
TRAIL induziert in einer Vielzahl von Tumorzellen unterschiedlichen Ursprungs in vitro und
in vivo schnell und effektiv Apoptose, während die meisten normalen Zellen weitgehend von
seiner zytotoxischen Wirkung verschont bleiben (Ashkenazi et al., 1999). Bei Nagetieren und
Affen kann das Tumorwachstum durch TRAIL-Behandlung um das zwei- bis zehnfache
verlangsamt werden. Dabei wurden bisher keine toxischen Effekte an gesunden Geweben
oder Organen beobachtet (Ashkenazi et al., 1999; Kelley et al., 2001; Walczak et al., 1999).
TRAIL erscheint vor allem in der Kombination mit Zytostatika oder zusammen mit der
Beeinflussung intrazellulärer Resistenzfaktoren als ein vielversprechender Kandidat zur
Verbesserung der Krebstherapie. Für die klinische Anwendung von TRAIL am besten
geeignet sind Zubereitungen, die effektiv Apoptose induzieren, gut löslich sind, stabile
Homotrimere bilden und dabei möglichst wenig immunogen sind. Eine rekombinante Version
des Liganden mit den Aminosäuren 114 bis 281 des menschlichen TRAIL-Moleküls und ohne
exogene Sequenzen, optimiert durch den Zusatz von Zink und formuliert als gereinigtes
Protein bei neutralem pH scheint dafür in Frage zu kommen (Ashkenazi et al., 1999; Kelley et
al., 2001; Lawrence et al., 2001; LeBlanc and Ashkenazi, 2003). Vor einem breiten klinischen
Einsatz von TRAIL muss aber sowohl die Wirkungsweise als auch die Sicherheit bei
systemischer Applikation noch näher beleuchtet werden.
1.5.
Die Proteinkinase C-Familie
Die Familie der Proteinkinasen C (PKC) besteht aus Serin/Threonin-Proteinkinasen, die in
diversen zellulären Prozessen eine Rolle spielen. Sie sind beteiligt an der synaptischen
Signaltransduktion, der Aktivierung von Ionenflüssen, der Sekretion, der Zellzykluskontrolle,
der Proliferation und Differenzierung, sowie der Tumorentstehung, Metastasierung und
Apoptose (Hofmann, 2004).
1.5.1.
Einteilung der Proteinkinasen C
Die 12 Isoenzyme werden aufgrund ihrer Struktur und biochemischen Eigenschaften in drei
Gruppen unterteilt. Jedes PKC-Isoenzym ist das Produkt eines eigenen Gens, einzig die
Isoformen β1 und β2 entstehen durch alternatives Spleißen (Cartee et al., 2003; Mellor and
Parker, 1998; Nishizuka, 1988a; Nishizuka, 1988b; Nishizuka, 1992).
- 20 -
1. Einleitung
1) „Konventionelle“ Proteinkinasen C (cPKC) α, β1, β2 und γ sind Phorbolesterinduzierbar und Calcium-abhängig. Eine maximale Aktivierung kann durch negativ
geladene
Phospholipide
(z.B.
Phosphatidylserin
(PtdSer)),
Calcium
und
Diacylglycerol (DAG) oder Phorbolester erreicht werden.
2) „Neue“ Proteinkinasen C (nPKC) δ, ε, θ und η sind ebenfalls Phorbolesterinduzierbar, aber Calcium-unabhängig.
3) „Atypische“ Proteinkinasen C (aPKC) ζ, λ und ι sind sowohl Phorbolester- als auch
Calcium-unabhängig. Durch Phosphatidylserin (PtdSer) sind sie aber stimulierbar.
1.5.2.
Struktur der Proteinkinasen C
Jede der Proteinkinasen C besteht aus einer einzelnen Polypeptidkette mit vier konservierten
(C-) und fünf variablen (V-) Regionen. In der folgenden Abbildung sind Struktur und
Funktion der einzelnen Regionen der Proteinkinasen C schematisch dargestellt.
„klassische“ PKCs
+
+
„neue“ PKCs
+
+
„atypische“ PKCs
+
Abb. 2:
+
+
+
+
+
+
+
Prinzipielle Struktur der Proteinkinasen C, (modifiziert nach Cartee and Kucera 2000).
Am aminoterminalen Ende befindet sich die Regulatordomäne, bestehend aus den Regionen
C1, C2, V1 und V2. Die C1-Region enthält eine Cystein-reiche Sequenz, an der die Bindung
von DAG und Phorbolestern erfolgt. In den cPKCs ist die C1-Region doppelt vorhanden,
während sie in den Phorbolester-unabhängigen aPKCs nur einmal vorliegt. Am
carboxyterminalen Ende ist, bestehend aus C3, C4, V4 und V5, die katalytische Domäne
lokalisiert. Während die C3-Region eine ATP-bindende Sequenz enthält, ist die C4-Region
- 21 -
1. Einleitung
für die Substratbindung und Phosphatrestübertragung zuständig (Parker et al., 1986). Beide
Domänen werden durch die Hinge-Region V3 getrennt, an der die Kinase durch Trypsin oder
Calpaine gespalten werden kann. Durch die Trennung beider Domänen kommt es zur
konstitutiven Aktivierung des katalytischen Restes (Kishimoto et al., 1983).
1.5.3.
Aktivierungsprinzip der Proteinkinasen C (für cPKCs zutreffend)
Nach der Bindung von bestimmten Hormonen, Wachstumsfaktoren, Lektinen oder
Neurotransmittern
an
Transmembranrezeptoren
entstehen
die
„second
messenger“
Diacylglycerol (DAG) und Inositoltriphosphat (IP3) durch Spaltung mittels Phospholipase C
(PLC) aus dem Membranphospholipid Phosphatidylinositoltriphosphat (PIP3). IP3 öffnet
Calciumkanäle, wodurch sich die intrazelluläre Calciumkonzentration erhöht. Das Calcium
bindet an die C2-Region der PKC und erhöht die Affinität zu Phosphatidylserin (PtdSer), was
zur Senkung der Schwelle zur vollständigen Aktivierung führt (Hofmann, 1997). DAG und
PtdSer binden an die Regulatordomäne der Kinase und aktivieren diese schließlich. Zur
Regulation der Cofaktorbindung sind außerdem drei Phophorylierungen (teils autokatalytisch)
notwendig (Keranen et al., 1995). Durch die Aktivierung des Enzyms kommt es zur
Konformationsänderung mit Verlust der Pseudosubstratbindung aus dem katalytischen
Zentrum, welches nun für die Substratbindung frei ist (Dekker et al., 1995). Die aktivierte
Kinase ist jetzt anfälliger für eine proteolytische Spaltung und Inaktivierung (Parker et al.,
1995) sowie für die Ubiquitin-abhängige Degradation (Lee et al., 1996; Lu et al., 1998).
1.5.4.
Die PKCη
Die PKCη ist eine „neue“ Proteinkinase C, also Phorbolester-induzierbar, aber Calciumunabhängig. Sie ist durch Cholesterolsulfat, Sulfatide, sulfatierte Metabolite von Cholesterol
und Cerebroside aktivierbar (Kashiwagi et al., 2002). Eine hohe PKCη-mRNA-Expression
kann in Lunge und Haut nachgewiesen werden; im Gegensatz zu anderen PKCs wird im
Gehirn nur eine geringe Expression beschrieben (Osada et al., 1990). Das Gen der PKCη
wurde 1990 von einer cDNA-Bank der Maushaut isoliert (Osada et al., 1990) und im
menschlichen Chromosom 14 (14q22-23) lokalisiert (Quan and Fisher, 1999).
Die
PKCη
scheint
in
unterschiedlichen
Zellen
unterschiedliche
Funktionen
im
Zusammenspiel zwischen Differenzierung, Tumorprogression und Apoptoseinduktion zu
besitzen. In Keratinozyten und anderen epithelialen Zellen führt sie über den Cyclin
E/„Cyclin-dependent kinase“ 2 (CdK2)/ p21-Komplex zum G1-Arrest und greift somit in die
- 22 -
1. Einleitung
Zellzykluskontrolle ein (Kashiwagi et al., 2002; Shtutman et al., 2003). Auch über eine FynAktivierung ist sie an der Wachstumskontrolle und Differenzierung von normalen
Keratinozyten beteiligt (Cabodi et al., 2000). Ebenfalls ist die PKCη bei der Maus an der
Proliferation und dem Remodeling sowie der Suppression der Tumorpromotion von
epidermalen Zellen beteiligt (Chida et al., 2003). In anderen Zellen scheint die PKCη im
Gegensatz dazu an Tumorentstehung und -progress beteiligt zu sein: in Proben von
Prostatakarzinomen ist unter anderem die PKCη signifikant höher exprimiert als in Proben
von benignen Prostatahyperplasien (Koren et al., 2004). Auch fand sich eine klare Korrelation
zwischen
PKCη-Expression
und
Tumorprogression
in
Proben
von
klarzelligen
Nierenzellkarzinomen mit einem dreifachen Anstieg der PKCη in Tumoren Grad 3 und 4
gegenüber Tumoren Grad 1 und 2 (Brenner et al., 2003). Es wird andererseits aber auch
beschrieben, dass die PKCη-mRNA-Expression in wenig differenzierten Kolonkarzinomen
geringer ist als in Adenomen und normaler Kolonmucosa (Doi et al., 1994). Auch ist sie in
invasiven Mammakarzinomen niedriger als im angrenzenden normalen Brustgewebe. In den
invasiven Mammakarzinomläsionen ist die Expression der PKCη sehr heterogen verteilt und
nur in Zellen mit aberrierender Kernmorphologie findet sich eine erhöhte Expression (MassoWelch et al., 2001). Die Funktion der PKCη kann demnach nicht gemeingültig für viele
Zelltypen beschrieben werden, sondern muss im Gegenteil für jeden Zell- und Tumortyp
gesondert untersucht und beleuchtet werden.
Dennoch weisen einige Studien darauf hin, dass die PKCη in bestimmten Zellen eine spezielle
Rolle in der Resistenzentstehung von Tumorzellen gegenüber Medikamenten-induzierter
Apoptose spielt: die Genexpressionshöhen der PKCη korrelieren signifikant positiv mit der
Expression von „multidrug resistance 1“ (MDR1)- und „multidrug resistance associated
protein“ (MRP)- Genen in Tumorzellen aus Proben von Patientinnen mit einem
Mammakarzinom (Beck et al., 1998a), aus malignem Aszites von Patientinnen mit einem
Ovarialkarzinom (Beck et al., 1998b) und aus Blasten von Patienten mit einer akuten
myeloischen Leukämie (Beck et al., 1996). Die differentielle Phosphorylierung des pGlykoproteins (= Genprodukt des MDR1) durch PKC-Isoenzyme einschließlich der PKCη
könnte eine entscheidende Rolle für dessen Aktivität spielen (Sachs et al., 1999). Die PKCη
wird weiterhin als ein potenter Aktivator von Raf1 (Schonwasser et al., 1998) beschrieben,
einer Proteinkinase, die in der Entwicklung der Chemoresistenz von Zellen ebenfalls beteiligt
ist (Weinstein-Oppenheimer et al., 2000).
Auch wenn zur Aufklärung ihrer genauen Funktionen in den verschiedenen Zelltypen noch
eine Reihe von Untersuchungen notwendig sein wird, zeigen einige Studien bereits, dass die
- 23 -
1. Einleitung
PKCη ein effektiver Apoptoseinhibitor in Tumorzellen sein könnte. Die Herabregulation der
PKCη in A549-Lungenkarzinomzellen führt zum Beispiel zur Sensibilisierung der Zellen
gegenüber Vincristin- oder Paclitaxel-induzierter Apoptose (Sonnemann et al., 2004). Eine
Überexpression der PKCη in Mammakarzinomzelllinien vermindert den TNFα-induzierten
Zelltod durch Unterdrückung der Aktivierung der Caspasen 7 und 8 (Akkaraju and Basu,
2000; Basu, 1998). In Glioblastomzellen fördert die PKCη die Proliferation und die Resistenz
gegen Bestrahlung (Martin and Hussaini, 2005; Martin et al., 2006). Die Blockade der UVoder γ-Strahlen-induzierten Apoptose in diesen Zellen kann auf die Verhinderung der Caspase
9-Aktivierung durch die PKCη zurückgeführt werden (Hussaini et al., 2000; Hussaini et al.,
2002). Auch die proliferative Antwort der Glioblastomzellen auf „phorbol myristate acetate“
(PMA)- Exposition scheint durch die PKCη vermittelt zu sein (Hussaini et al., 2000; Martin et
al., 2006). Des Weiteren kann die UV-Strahlen-induzierte Caspase 3-Aktivierung in normalen
menschlichen Keratinozyten durch Überexpression der PKCη reduziert und durch dominant
negative Mutation der PKCη erhöht werden (Matsumura et al., 2003).
All diese Beobachtungen legen eine eingehendere Betrachtung der PKCη und der
Auswirkungen ihrer Suppression nahe. Chemische Inhibitoren beeinflussen allerdings zumeist
sehr unselektiv viele Proteinkinasen C und andere Enzyme, so dass ein spezifischer Ansatz,
zum Beispiel über die Verwendung von Antisense-Oligonukleotiden, verfolgt werden sollte.
1.6.
Die Bcl-2-Familie
Die Familie der Bcl-2-Proteine besteht aus 20 homologen Mitgliedern, die pro- oder
antiapoptotische Funktionen haben (Cory and Adams, 2002). Das Bcl-2-Protein selbst wurde
initial als Überlebensfaktor in B-Zell-Lymphomen (= B-cell lymphoma (Bcl)) gefunden.
Durch eine Translokation (t14;18) wird das Bcl-2-Gen in solchen Lymphomzellen in eine
Region mit starkem Promotoreinfluß verlagert, nachfolgend kommt es zur Überexpression
des Gens, was zum verstärkten Wachstum der Zellpopulation führt (Tsujimoto et al., 1985;
Tsujimoto and Croce, 1986; Vaux et al., 1988; Yang et al., 1996).
1.6.1.
Struktur und Funktion der Bcl-2-Proteine
Alle Mitglieder der Bcl-2-Familie verfügen über mindestens eine konservierte Bcl-2homologe (BH) Domäne.
Die antiapoptotischen Mitglieder Bcl-2 und Bcl-xL sowie Bcl-w, A1 und Mcl-1 verfügen
über insgesamt vier BH-Domänen und eine carboxyterminale Transmembran-Domäne. Bcl-2,
- 24 -
1. Einleitung
Bcl-xL und Bcl-w inhibieren die apoptotische Antwort vieler Zellen auf zytotoxische Stimuli.
Während Bcl-2 auch in gesunden Zellen ein integrales Membranprotein an der äußeren
Mitochondrienmembran, dem endoplasmatischen Retikulum und der Kernhülle ist,
assoziieren Bcl-xL und Bcl-w erst nach der Einwirkung eines zytotoxischen Stimulus an diese
Membranen (Cory and Adams, 2002; Janiak et al., 1994). Die dreidimensionale Struktur von
Bcl-2 ist hoch konserviert und ähnelt dem viralen Homologen (Huang et al., 2002; Petros et
al., 2001). Das Protein besteht aus einem globulären Bündel von fünf amphiphatischen αHelices, die zwei zentrale hydrophobe α-Helices umgeben. Diese zentrale hydrophobe Rinne
wird aus Teilen der Domänen BH1, -2 und -3 formiert und kann die BH3-Domäne eines
anderen Verwandten binden (Sattler et al., 1997).
Die proapoptotischen Mitglieder Bax und Bak verfügen über 3 BH-Domänen sowie eine
Transmembran-Domäne. Bax liegt in gesunden Zellen zytosolisch als Monomer vor.
Während der Apoptose integriert es mit seiner carboxyterminalen Domäne in die äußere
Mitochondrienmembran und oligomerisiert (Antonsson, 2001; Antonsson et al., 2001;
Mikhailov et al., 2001). Bak ist bereits in gesunden Zellen ein oligomeres integrales Protein
der
Mitochondrienmembran,
erfährt
während
der
Apoptose
aber
ebenfalls
eine
Konformationsänderung und bildet größere Aggregate. In diesen kann es wahrscheinlich
einerseits als BH3-Donator und andererseits als BH3-Akzeptor fungieren (Antonsson, 2001;
Antonsson et al., 2001; Griffith et al., 1998; Griffith and Lynch, 1998; Griffith et al., 1999a).
Die Oligomere von Bax oder Bak bewirken eine Permeabilisierung der äußeren
Mitochondrienmembran, so dass es zur Freisetzung von Cytochrom c und Smac/DIABLO aus
dem Intermembranspalt kommt. Die Mechanismen dafür sind allerdings umstritten. Einerseits
könnten die Oligomere mit den vorhandenen „Permeability Pores“ interagieren und einen
größeren Kanal bilden, andererseits könnten sie allein einen neuen Kanal in der Membran
formieren (Pavlov et al., 2001). Eines der beiden Proteine muss aber vorhanden sein, damit
typische mitochondriale Veränderungen während der Apoptose beobachtet werden können
(Gross et al., 1999). Neben der Porenbildung in der Mitochondrienmembran sind Bax/BakOligomere aber auch in der Lage, in Membranen von endoplasmatischem Retikulum (ER)
oder Zellkern Kanäle zu bilden, was zum Beispiel zur Freisetzung von Calcium-Ionen aus
dem ER führt. Diese Calcium-Ionen können wiederum durch Calcium-abhängige Proteasen
die Caspase-Aktivierung bewirken (Nakagawa and Yuan, 2000).
Die dritte Gruppe der Bcl-2-Familie stellen die sogenannten „BH3-only“-Proteine dar, die
ebenfalls proapoptotische Wirkung haben. Dabei verfügen Bim, Bik, Bad, Bmf, Puma und
Noxa über eine BH3-Domäne und eine Transmembran-Domäne, während Bid keine
- 25 -
1. Einleitung
Transmembran-Domäne aufweist. Sie scheinen Sensoren für intrazelluläre Zerstörung zu sein
und beeinflussen wahrscheinlich durch die Bindung an andere Proteine der Familie deren
Aktivität, Funktion und Interaktion (Cory and Adams, 2002). „BH3-only“-Proteine können in
Abwesenheit von Bax und Bak keine Apoptose auslösen. Das bedeutet, dass sie im
apoptotischen Signalweg oberhalb von diesen liegen müssen (Zong et al., 2001).
Es sind weitere Mitglieder der Bcl-2-Familie beschrieben, wie z.B. Boo/Diva, Bcl-G oder
Bcl-B, deren Vorkommen und Funktion aber noch unklar sind (Cory and Adams, 2002).
1.6.2.
Interaktion der Bcl-2-Proteine
Für die Gewebehomöostase scheint das Verhältnis von proapoptotischen „BH3-only“Proteinen und antiapoptotischen Bcl-2-ähnlichen Proteinen entscheidend zu sein. Außerdem
ist wenigstens eines der beiden proapoptotischen Mitglieder Bax oder Bak für den Ablauf
einer ungestörten Apoptose essentiell. Bei der Interaktion der verschiedenen Bcl-2-Proteine
haben die verschiedenen „BH3-only“-Proteine wahrscheinlich individuelle Funktionen. Bid
zum Beispiel wird von Caspasen oder Granzym B gespalten, wandert als tBid zum
Mitochondrium und triggert innerhalb kurzer Zeit die Freisetzung von Cytochrom c und
Smac/DIABLO, wenn Bax oder Bak in der Zelle vorhanden sind (Li et al., 1998; Luo et al.,
1998; Madesh et al., 2002; Wei et al., 2001; Wei et al., 2000; Zha et al., 2000). Hohe
Konzentrationen der antiapoptotischen Proteine antagonisieren die Oligomerisation von Bax
und Bak. Dabei sind allerdings keine direkten Komplexe aus Bax und Bcl-2 zu finden
(Antonsson, 2001; Antonsson et al., 2001; Mikhailov et al., 2001). Eine Hypothese zum
Zusammenspiel von Bcl-2/Bcl-xL mit „BH3-only“-Proteinen und Bax/Bak könnte lauten: bei
hohen Leveln der „BH3-only“-Proteine besetzen diese die Bindungsstellen von Bcl-2/Bcl-xL.
Damit wird die Bindung von Bax/Bak an Bcl-2/Bcl-xL unterbrochen und die Bildung von
Bax/Bak-Homotrimeren
wird
unterstützt.
Es
kommt
zum
Zusammenbruch
des
mitochondrialen Membranpotentials, zur Freisetzung von Cytochrom c und Smac/DIABLO
und schließlich zur Einleitung oder Beschleunigung der Apoptose. Überwiegt jedoch Bcl2/Bcl-xL gegenüber den „BH3-only“-Proteinen, so bleiben Bax/Bak für die Bildung ihrer
Homotrimere blockiert. Die Mitochondrien bleiben intakt und es wird keine Apoptose
ausgelöst. Diese Hypothese erscheint zunächst einfach und verständlich, wahrscheinlicher ist
jedoch eine wesentlich komplexere Interaktion auch mit anderen zellulären Molekülen.
Es werden weiterhin verschiedene Einflussfaktoren auf die Expression der Bcl-2-Proteine
beschrieben. Durch Inaktivierung des Retinoblastomgens (Rb) oder durch Aktivierung von
Myc kommt es zur p53-Aktivierung. Diese wiederum führt unter anderem zur verstärkten
- 26 -
1. Einleitung
Expression von Noxa, Puma und Bax, die zum Teil für dessen proapoptotisches Signal
verantwortlich sein könnten. Durch Ras-vermittelte NFκB-Aktivierung wird die Expression
von antiapoptotischem Bcl-2 und Bcl-xL erhöht (Grumont et al., 1998; Mayo et al., 2003).
1.6.3.
Die Rolle der Bcl-2-Proteine in der Tumorentstehung
Eine Beteiligung der Mitglieder der Bcl-2-Familie an der Tumorentstehung und an der
Entwicklung von Resistenzen gegenüber Zytostatika ist wahrscheinlich.
1) In verschiedenen Studien wurde bereits gezeigt, dass bei erhöhter Bcl-2 Expression Blymphoide Tumoren häufiger vorkommen. Bei Koexpression von Bcl-2 und Myc kann
ein starker Anstieg von Lymphomen, Brustkrebs oder β-Zell-Tumoren des Pankreas
verzeichnet werden (Jager et al., 1997; McDonnell et al., 1989; McDonnell and
Korsmeyer, 1991; Naik et al., 1996; Strasser et al., 1990; Strasser et al., 1993).
2) In hochmalignen Non-Hodgkin-Lymphomen ist eine hohe Bcl-2-Expression mit nur
kurzem krankheitsfreiem Überleben assoziiert (Hermine et al., 1996).
3) Für Bcl-xL wird eine Beteiligung an der Entstehung von myeloischer und T-ZellLeukämie bei der Maus beschrieben (Packham et al., 1998).
4) Bei Überexpression von Bcl-2 oder Bcl-xL kommt es zur Chemoresistenz bestimmter
Tumoren (Raffo et al., 1995; Tu et al., 1998). Die Herabregulation von Bcl-2 oder BclxL führt zur Sensibilisierung der Zellen (Gleave et al., 1999; Jansen et al., 2000;
Zangemeister-Wittke et al., 2000).
5) Eine Überexpression von Bcl-2 oder Bcl-xL speziell in Prostatakarzinomzellen kann
diese gegen Chemotherapeutika und TRAIL desensibilisieren (Lebedeva et al., 2000b;
Munshi et al., 2001). Durch die Überexpression von Bcl-2 in Prostatakarzinomzellen,
die mit TRAIL behandelt werden, wird die Freisetzung von Cytochrom c und die
Aktivität der Caspasen 2, 7 und 9 verringert. Es werden dabei keine Effekte auf die
Caspase 8 beobachtet (Rokhlin et al., 2001). Eine Herabregulation der beiden Proteine
oder
von
Bcl-xL allein
bewirkt
eine
Sensibilisierung
der
Zellen
gegen
Chemotherapeutika (Lebedeva et al., 2000b).
In klinischen Studien werden bereits Bcl-2-Antisense-Oligonukleotide auf ihre Wirksamkeit
bei verschiedenen Tumoren untersucht. In Kombination mit konventioneller Chemotherapie
ergaben sich bisher vielversprechende Ergebnisse für verschiedene Tumoren (Buchele, 2003;
Jansen et al., 2000; Chi et al., 2001).
- 27 -
1. Einleitung
1.7.
Die Antisense-Technik
Antisense-Oligonukleotide (AODN oder ASO) sind vielversprechende Kandidaten zur
spezifischeren Therapie von Krebs oder Viruserkrankungen. Sie sind in der Lage, die
Expression individueller Gene auszuschalten oder zumindest zu reduzieren. Auf diese Weise
könnten in Tumorzellen ganz bestimmte überexprimierte Oncogene spezifisch herabreguliert
werden und die Zellen dadurch gegen Chemotherapeutika und Zytokine sensibilisiert werden.
Ein bereits klinisch angewendetes Antisense-Oligonukleotid-Medikament ist Vitravene®
(Wirkstoff: Formivirsen). Es wird in der lokalen Behandlung der CMV-Retinitis verwendet
(Marwick, 1998; Stix, 1998). In einer klinischen Studie an Patienten mit fortgeschrittenem
malignem Melanom ist außerdem die Wirksamkeit eines Bcl-2-ASO (Augmerosen,
Genasense, G3139) gezeigt: nach s.c.- oder i.v.-Applikation in verschiedenen Dosierungen
kann in Tumorgewebeproben eine Reduktion des Bcl-2-Proteins um bis zu 40 % beobachtet
werden. Damit einher geht ein besseres Ansprechen der Tumorzellen auf Dacarbazin. Bisher
konnten keine schweren Nebenwirkungen beobachtet werden (Jansen et al., 2000). Auch für
die chronisch lymphatische Leukämie und das Multiple Myelom können synergistische
Effekte mit konventioneller Chemotherapie für ein Bcl-2-ASO (Oblimersen, Genasense)
gezeigt werden (Buchele, 2003). Zur Anwendung dieses Bcl-2-ASO beim hormonrefraktären
Prostatakarzinom in Kombination mit anderen zytotoxischen Substanzen gibt es bereits
vielversprechende Untersuchungen, die jedoch vor dem breiten klinischen Einsatz noch
erweitert werden müssen (Chi et al., 2001; Chi, 2005)
Probleme, die bei der Antisense-Anwendung überwunden werden müssen, sind einerseits die
schnelle Degradation von Phosphodiestern im Nuklease-haltigen Milieu und die damit
verbundene Toxizität und andererseits ihre nur geringe Aufnahme in lebende Zellen.
1.7.1.
Struktur und Funktion von Antisense-Oligonukleotiden
Antisense-Oligonukleotide
sind
synthetische
einzelsträngige
DNA-Moleküle,
deren
Nukleotidsequenz komplementär zur Basenfolge der definierten Ziel-mRNA angeordnet ist.
Die AODNs hybridisieren nach Watson-Crick-Basenpaarung mit ihrer Ziel-mRNA. Die so
entstehenden Heteroduplices werden von der RNAse H, einem ubiquitär vorkommenden
Enzym, als Substrat erkannt. Durch sie wird der RNA-Strang degradiert, während der DNAStrang der Heteroduplex intakt bleibt. Nach der Degradation einer mRNA kann das AODN
erneut hybridisieren und so zum Abbau vieler mRNA-Moleküle führen. Diese RNAse-H- 28 -
1. Einleitung
vermittelte Degradation wird als Hauptmechanismus der Antisense-Wirkung solcher
Oligonukleotide angesehen. Bei starker Aktivierung der RNAse H kommt es aber auch zum
unspezifischen Abbau von Heteroduplices, die gar nicht Ziel des AODNs sind. Schon kurze
Stücke von circa sechs Basenpaaren können erkannt und degradiert werden. Da diese bei
längeren AODNs häufiger vorkommen, kommt es hier zum paradoxen Abfall der Spezifität.
Es ist also notwendig, eine optimale Länge der AODNs zu wählen, die nach heutigem
Erkenntnisstand bei 16 bis 20 Basen liegt (Stein, 2001). Aufgrund statistischer Berechungen
kommt eine Nukleotidsequenz von 15 bis 17 Basen im Genom durchschnittlich nur einmal
vor, somit kann hier von Spezifität für die gewünschte Ziel-mRNA grundsätzlich
ausgegangen werden. Die Spezifität der jeweiligen AODNs wird mit geeigneten NegativKontrollen (aus identischer Basenzusammensetzung in anderer Sequenz) empirisch ermittelt.
Für den experimentellen Einsatz von AODNs sind Moleküle notwendig, die Stabilität
gegenüber Nuklease-vermittelter hydrolytischer Spaltung aufweisen. Bei zu schnellem Abbau
wird keine wirksame Konzentration der Antisense-Oligonukleotide in den Zellen erreicht,
außerdem entstehen potentiell toxische Nukleotid-Monophosphate. Die erste Entwicklung in
der Lösung dieses Problems sind die sogenannten Methylphosphonate, bei denen ein
Sauerstoffatom am Zuckerrest durch eine Methylgruppe ersetzt wird. Sie weisen eine höhere
Stabilität auf, sind aber schlechter löslich als Phosphodiester. In der weiteren Entwicklung
werden durch den Austausch eines Sauerstoffatoms gegen ein Schwefelatom am Phosphatrest
der Nukleotide sogenannte Phosphorothioate synthetisiert, die stabil gegen Nukleasevermittelten Abbau sind und sich bezüglich Löslichkeit und mRNA-Bindung ähnlich wie
unveränderte
Moleküle
verhalten.
Da
sie
Polyanionen
sind,
besteht
eine
hohe
längenabhängige Affinität zu Proteinen, die zum Teil für ihre unspezifischen toxischen
Effekte verantworlich ist (Stein, 2001). Dadurch wird allerdings die Wirkung von
Chemotherapeutika oder Zytokinen bei Versuchen an Tumorzellen stark verfälscht, so dass
diese Versuche nur noch bedingt auswertbar sind. Neuere chemische Modifikationen führen
zu sogenannten Zweitgenerations-AODNs, die Nuklease-resistent sind, höhere Affinität zur
Ziel-mRNA haben und dabei weniger unspezifische Nebenwirkungen aufweisen. Durch die
Einführung einer Methoxyethylgruppe an 2’-Position der Ribose erreicht man eine höhere
Affinität zur Ziel-mRNA (Monia et al., 1993). 2’-Methoxyethyl-modifizierte ODNs (MOEODN) sind aber nicht in der Lage, die RNAse H ausreichend zu aktivieren, was zum Teil
auch die Ursache der verminderten Nebenwirkungen ist (Stein, 2001). Durch stabile
Hybridisierung mit der mRNA ist in diesem Fall ein hemmender Effekt nur 1:1 durch
Hemmung der Initiation der Translation zu erwarten. Damit dies überhaupt möglich ist,
- 29 -
1. Einleitung
müssen die AODNs jedoch gegen die 5’-untranslatierte Region der mRNA gerichtet sein, was
deren Design deutlich erschwert. Die Entwicklung in dieser Richtung ist hier aber noch nicht
zu Ende, so gibt es zum Beispiel auch sogenannte „peptide nucleic acids“ (PNAs), die ein
Polyamidrückgrat besitzen (Dias and Stein, 2002).
Die in dieser Arbeit verwendeten Antisense-Oligonukleotide sind chimäre Moleküle,
sogenannte Gapmere. Durch eine Kombination aus Phosphorothioat-ODN und MOE-ODN
kann sowohl eine gute Affinität zur mRNA als auch eine gute, aber nicht zu starke RNAse HAktivierung erreicht werden. Die Gapmere bestehen aus einem Phosphorothioat-Rückgrad
über die gesamte Sequenz und 2’-Methoxyethyl-Modifikationen an den jeweils endständigen
fünf oder sechs Basen. Es entsteht ein „gap“ aus acht bis zehn zentralen, nicht alkylierten
Nukleotiden, die die RNAse H-Kompetenz vermitteln. Der Antisense-Effekt korreliert in
diesem Fall mit der Affinität der AODNs zur mRNA (Monia et al., 1993). Derart gestaltete
Gapmere haben also eine hohe Affinität zur Ziel-mRNA und weniger unspezifische RNAse
H-Aktivierung. Dadurch wird der Einfluss auf den Abbau anderer mRNAs minimiert.
Die nachstehende Abbildung zeigt die verschiedenen Modifikationen der Phosphodiester der
Oligonukleotide.
Abb. 3:
Chemische Modifikationen von Oligonukleotiden, (aus Dias and Stein, 2002).
- 30 -
1. Einleitung
1.7.2.
Aufnahme der Oligonukleotide in lebende Zellen
Damit der Antisense-Effekt der ODNs erreicht werden kann, müssen diese in die Zellen
gelangen. Aufgrund ihres anionischen Charakters ist eine passive Diffusion durch die
Lipidmembranen in ausreichendem Ausmaß nicht zu erwarten (Akhtar et al., 1991). Es wären
Konzentrationen von über 20 µM notwendig, um eine zufriedenstellende Wirkkonzentration
in der Zelle zu erreichen. In diesem Bereich kann allerdings mit Sicherheit von unspezifischen
Wirkungen durch die Proteinbindung ausgegangen werden. In verschiedenen Studien wurde
ein ODN-Rezeptor auf der Oberfläche von Hepatozyten und Membranvesikeln nachgewiesen,
der die Endozytose von Oligonukleotiden Sequenz-unabhängig zu vermitteln scheint (de
Diesbach et al., 2002; Loke et al., 1989). Da dieser jedoch nicht auf allen Zellen vorhanden
ist, müssen für den experimentellen Einsatz „Carrier“ entwickelt werden, die die Aufnahme
von AODNs in alle Zellen erleichtern. Mit kationischen Porphyrinen als „Carrier“ können
bereits Erfolge erzielt werden (Benimetskaya et al., 2001). Experimentell werden derzeit
hauptsächlich verschiedene kationische Trägerlipide verwendet, die mit den ODNs Komplexe
bilden und sie auf diese Weise in die Zellen einschleusen. Solche Lipide sind zum Beispiel
Lipofectin®, FuGENE® oder Superfect®. Wichtig ist hier das richtige Verhältnis aus „Carrier“
und ODN, das experimentell ermittelt werden muss. Für die Transfektion sollte die niedrigste
wirksame „Carrier“-Konzentration verwendet werden, denn auch von den Lipiden können
bisher unbekannte zytotoxische Effekte ausgehen (Lebedeva et al., 2000a; Stein, 2001).
In der vorliegenden Arbeit wird zur Einschleusung der Gapmere in die Zellen ein spezielles
Lipid (Argfectin-50) verwendet, das eine besonders effiziente Transfektion von PC3-Zellen
erlaubt.
1.8.
Das Prostatakarzinom
Das Prostatakarzinom ist mit 33 % das häufigste Karzinom des Mannes, es ist für 9 % aller
männlichen Krebstoten verantwortlich. Seine Inzidenz stieg in den letzten Jahren deutlich an
und liegt in Deutschland aktuell bei circa 150/100.000/Jahr. Trotzdem fiel die
Prostatakarzinom-bedingte Todesrate in diesem Zeitraum stetig ab (Jemal et al., 2006;
www.destatis.de, 2006). Die Ursachen dafür sind verbesserte Behandlungsstrategien und vor
allem die häufigere und damit frühzeitige Diagnose durch das eingeführte Screening auf einen
erhöhten Wert für das Prostata-spezifische Antigen (PSA). Dennoch bleiben viele Karzinome
der Prostata unentdeckt. Das „Life-time-risk“ an einem klinisch manifesten, invasiven
- 31 -
1. Einleitung
Prostatakarzinom zu erkranken beträgt für jeden Mann knapp 18 %, das heißt einer von sechs
Männern wird im Laufe seines Lebens daran erkranken (Jemal et al., 2006).
Die Ätiologie des Prostatakarzinoms ist multifaktoriell. Ernährung, Umweltgifte und
familiäre Belastung spielen eine Rolle. Familiär gehäufte Prostatakarzinome treten in jungem
Lebensalter auf. Etwa 9 % aller Prostatakarzinome sind hereditär (Carter et al., 1992).
Histologisch sind zwei Drittel der Fälle Adenokarzinome, sie werden nach Gleason anhand
ihrer Gewebearchitektur und ihrem Wachstumsmuster in fünf Grade eingeteilt (Gleason and
Mellinger, 1974). Makroskopisch imponieren Adenokarzinome der Prostata als derbe,
unscharf begrenzte, grau-weißliche oder -gelbe Herde.
Durch seine Entstehung in der peripheren Zone der Prostata bleibt das Karzinom klinisch
meist lange unbemerkt, häufig ergibt sich beim PSA-Screening ein erhöhter Wert auf den die
weitere Diagnostik folgt. Das Prostatakarzinom ist ein meist langsam wachsender Tumor,
über 90 % der Fälle werden in einem lokal oder regional begrenzten Stadium diagnostiziert,
die 5-Jahres-Überlebensrate beträgt in diesen Fällen 100 %. Trotzdem ist es eine der
häufigsten Ursachen für den Tod an einer Krebserkrankung beim Mann. Die Metastasierung
erfolgt lymphogen in iliakale und später paraaortale und parakavale Lymphknoten und
hämatogen frühzeitig über venöse Gefäßplexus in die Wirbelkörper. Rückenschmerzen sind
nicht selten erstes Symptom eines okkulten Prostatakarzinoms.
Die Diagnosestellung eines Prostatakarzinoms erfolgt mittels digital rektaler Untersuchung,
transrektaler Sonographie und Bestimmung des prostataspezifischen Antigens (PSA). Zum
weiteren Staging werden außerdem eine Prostatastanzbiopsie, eine Skelettszintigraphie und
gegebenenfalls erweiterte Bildgebung wie CT oder MRT benötigt. Anhand der Befunde
können nun die Einteilung nach TNM-Klassifikation und das histologisches Grading nach
Gleason erfolgen. Zusammen mit der Einschätzung der sonstigen Lebenserwartung des
Patienten erfolgt die Entscheidung über die therapeutische Strategie.
Für Patienten mit einem gut differenzierten Karzinom und einer Lebenserwartung von
weniger als zehn Jahren aufgrund Alter oder anderer Erkrankungen steht ein „watchful
waiting“ im Vordergrund (Adolfsson et al., 1992; Adolfsson et al., 1999; Chodak et al., 1994;
Stenzl and Studer, 1993). Sobald in regelmäßigen Kontrolluntersuchungen eine Progression
der Erkrankung mit Wachstum von Metastasen festgestellt wird, sollte möglichst früh eine
Androgen-suppressive Therapie zur Vermeidung von Komplikationen durch Tumor oder
Metastasen eingeleitet werden (1997). Therapie-bedingte Komplikationen, wie Osteoporose,
dürfen allerdings nicht unberücksichtigt bleiben (Daniell, 1997). Bei noch lokalisierter
Erkrankung ohne Fernmetastasen und einer sonstigen Lebenserwartung von mehr als zehn
- 32 -
1. Einleitung
Jahren ist eine radikale Prostatektomie abhängig vom Differenzierungsgrad mit oder ohne
adjuvante Therapie oder alternativ eine primäre Strahlentherapie mit kurativer Intention die
Therapie der Wahl (Ohori et al., 1994; Walsh et al., 1994; Fallon and Williams, 1990; van den
Ouden et al., 1998). Die Ergebnisse beider Verfahren sind vergleichbar (Fallon and Williams,
1990; Kupelian et al., 2002), es gibt keine harten medizinischen Differentialindikationen für
eines der beiden. Zur Therapieentscheidung sollten die zu erwartenden Nebenwirkungen des
jeweiligen Verfahrens (bei der Operation Inkontinenz und erektile Dysfunktion, bei der
Bestrahlung Enddarmprobleme) berücksichtigt werden (Madalinska et al., 2001; McCullough,
2001). Nicht zuletzt sollte der Wunsch des Patienten hierbei im Vordergrund stehen. Eine
primäre Bestrahlung erfolgt abhängig vom histologischen Grading und dem Staging als
alleinige Brachytherapie mit interstitieller Bestrahlung der Prostata, als alleinige perkutane
Bestrahlung von Prostata und pelvinen Lymphknoten oder als eine Kombination aus
perkutaner Bestrahlung und Brachytherapie zur lokalen Dosisaufsättigung. Postoperativ sollte
eine Bestrahlung bei unvollständiger Resektion, als adjuvante Therapie nach radikaler
Prostatektomie in histopathologisch fortgeschrittenen Stadien oder bei hohen PSA-Leveln
erfolgen (van den Ouden et al., 1998; van Poppel et al., 2000). Bei lokal fortgeschrittenen
Karzinomen oder disseminiertem Wachstum ist eine Hormonbehandlung angezeigt. Sie hat
durch ihre Testosteron-suppressive Wirkung einen antiproliferativen Effekt auf die Zellen des
Prostatakarzinoms. Damit kann zwar keine Heilung, wohl aber eine Größenreduktion von
Tumor und Metastasen erreicht werden. Der Testosteronentzug kann chirurgisch durch
beidseitige
Orchiektomie
oder
medikamentös
durch
die
Gabe
von
Östrogenen,
Luteinisierendes Hormon-releasing Hormon (LHRH)-Analoga oder Antiandrogenen erfolgen.
Als Nebenwirkungen ist neben Libido- und Potenzverlust sowie Gynäkomastie vor allem die
Osteoporosegefahr zu beachten. Eine beiderseitige Orchiektomie führt zu einer sofortigen
Reduktion des Testosteronspiegels, ist aber mit erheblichen Nebenwirkungen verbunden.
Auch der Eingriff in die körperliche Integrität der Patienten stellt häufig ein Problem dar. Sie
sollte nur noch durchgeführt werden, wenn eine medikamentöse Therapie nicht möglich ist
oder der Patient diese nicht wünscht (Iversen, 1998). Östrogene hemmen die Bildung von
Testosteron durch den „Feedback“-Mechanismus auf Hypothalamus und Hypophyse. Sie
erhöhen allerdings das kardiovaskuläre Risiko der aufgrund des hohen Lebensalters meist
vorerkrankten Patienten. Gegenüber anderen Verfahren ist eine Senkung der Osteoporoserate
von Vorteil (Garnick, 1986; Pavone-Macaluso et al., 1986; Iversen, 1998). LHRH-Analoga,
wie Goserelin, Buserelin oder Leuprolide führen durch hypophysäre Dauerstimulation
zunächst zu einem Anstieg von Luteinisierendem Hormon (LH), Follikel-stimulierendem
- 33 -
1. Einleitung
Hormon (FSH) und Testosteron, initial muss hier zusätzlich antiandrogen behandelt werden.
Im Verlauf kommt es aber durch die Herabregulation der hypophysären Rezeptoren für
LHRH zum Abfall des Serumtestosteronspiegels (Garnick, 1986; Kuhn et al., 1989). Nicht
steroidale Antiandrogene wie Nilutamid, Flutamid oder Bicalutamid verdrängen peripher
Testosteron von seinen Rezeptoren, der Serumtestosteronspiegel bleibt also hoch, so dass es
seltener zu den genannten Nebenwirkungen kommt (Iversen et al., 2000; Kaisary, 1997;
Soloway and Matzkin, 1993). Zur Monotherapie sind sie aber nur für auf das Becken
begrenzte Tumorerkrankung und PSA-Spiegel unter 100 ng/ml geeignet. Steroidale
Antiandrogene wie Cyproteronacetat verdrängen ebenfalls peripher Testosteron von seinen
Rezeptoren, haben aber außerdem eine zentrale Progesteron-artige Wirkung, was über einen
„Feedback“-Mechanismus zur Senkung des Serumtestosteronspiegels führt. Cyproteronacetat
ist in seiner Wirkung mit der Östrogentherapie vergleichbar, hat aber weniger kardiovaskuläre
Nebenwirkungen (Pavone-Macaluso et al., 1986). Eine weitere Möglichkeit der Therapie ist
die Gabe von Estramustin, es hat kombiniert eine Östrogen-artige und eine zytotoxische
Wirkung. Allerdings ist hier ebenfalls das erhöhte kardiovaskuläre Risiko zu beachten,
weshalb es auch weitgehend wieder verlassen wurde (Pienta and Smith, 2005). Nach
durchschnittlich 18 Monaten Hormonbehandlung wird ein Prostatakarzinom Androgenresistent und es kommt erneut zum Wachstum. Die Mechanismen hierfür sind vielfältig. Eine
Hochregulation der Androgenrezeptorexpression führt dazu, dass schon sehr niedrige
Serumspiegel von Testosteron für eine proliferative Wirkung ausreichen. Nach einer
Rezeptormutation kann eine Wachstumsstimulation durch nonandrogene Steroide erfolgen.
Durch
Wachstumsfaktoren
und
Zytokine
(Nichtsteroide)
kann
es
zur
direkten
Phosphorylierung und damit Aktivierung des Rezeptors (sogenannter „outlaw pathway“)
kommen. Durch neuroendokrine Zellen der Umgebung können wachstumsstimulierende
Neuropeptide gebildet werden. Eine echte Androgen-unabhängigkeit erreichen die Zellen zum
Beispiel durch Hochregulation der Bcl-2-Expression oder anderer antiapoptotischer Proteine
(sogenannter
„bypass
pathway“).
Für
die
Behandlung
des
hormonrefraktären
Prostatakarzinoms kommt eine Chemotherapie in Frage. Es hat sich aber gezeigt, dass diese
Karzinome häufig unempfindlich gegen zytotoxische Agentien wie Anthrazykline,
Alkylantien, Antimetaboliten, Platinderivate oder Topoisomeraseinhibitoren sind. Eine
Wirksamkeit zeigte sich jedoch für Taxane und dabei besonders für Docetaxel, hier konnte
mit einer Monotherapie ein Ansprechen von 38-48 %, gemessen am Rückgang des PSASpiegels, erreicht werden. Für Docetaxel ist eine Interaktion mit Bcl-2, Bcl-xL und eine
Induktion von p53 beschrieben. Daneben besitzt es antiandrogene Eigenschaften. Ob eine
- 34 -
1. Einleitung
Kombination von Docetaxel mit Estramustin oder Prednisolon Vorteile erbringt, wird
kontrovers diskutiert, in jedem Fall wird eine Steigerung der Nebenwirkungsrate beschrieben.
Als palliative Chemotherapie kommt außerdem eine Kombination aus Mitoxantron und
Prednisolon zum Einsatz, für die eine gute Schmerzreduktion beschrieben ist. Auch in der
Palliativsituation kann eine Bestrahlung erfolgen. Hier kommt zur Schmerzkontrolle vor
allem die Behandlung mit Strontium 89 oder Samarium 153 in Frage. Auch die kombinierte
Behandlung aus Bestrahlung und Chemotherapie wird derzeit noch untersucht. Des Weiteren
wird
mit
Bisphosphonaten
(z.B.
Zoledronat)
behandelt,
was
die
Inzidenz
von
Knochenveränderungen bei androgenresistenten Karzinomen senkt (Pienta and Smith, 2005).
Auch experimentell konnte an PC3-Zellen für Minodronat eine Proliferations-hemmende
Wirkung gezeigt werden (Asahi et al., 2006).
Neben einer frühen Diagnosestellung und damit der Möglichkeit zur Therapie mit kurativer
Intention wären neue Therapieansätze für das fortgeschrittenere Prostatakarzinom sehr
wünschenswert. Neben der Beeinflussung intrazellulärer Resistenzfaktoren scheint hier auch
TRAIL ein vielversprechender Kandidat zu sein.
1.9.
Zielstellung der Arbeit
Ziel der Arbeit ist die spezifische Validierung von möglichen Resistenzfaktoren gegen das
zytotoxische Zytokin TRAIL, um neue Ansätze zur Verbesserung der Behandlung von
Krebserkrankungen aufzuzeigen.
Hierzu wird die hormonrefraktäre Prostatakarzinomzelllinie PC3 mit TRAIL behandelt und
ihre apoptotische Reaktion vor und nach Suppression der Kandidaten mittels AntisenseTechnik eingehend untersucht.
Die PKCη stellt einen der möglichen Resistenzfaktoren dar. Sie verhindert in verschiedenen
Zelltypen die Aktivierung von Caspasen nach UV-Bestrahlung und Zytostatika- oder TNFαBehandlung. Die durchgeführten Untersuchungen sollen Aufschluss über die Auswirkungen
eines selektiven „Knock-down“ der PKCη mittels Antisense-Technik und nachfolgender
TRAIL-Behandlung der Zellen geben. Außerdem sollen nähere Einblicke bezüglich des
zellulären Wirkortes und möglicherweise auch der Wirkungsweise der PKCη im
apoptotischen Signalweg gewonnen werden.
Im Vergleich werden die Expressionen von zwei bekannten antiapoptotischen Mitgliedern der
Bcl-2-Familie (Bcl-2 und Bcl-xL) durch Antisense-Technik blockiert, die PC3-Zellen mit
TRAIL behandelt und die apoptotischen Veränderungen in der Zellkultur analysiert.
- 35 -
2. Material und Methoden
2.
Material und Methoden
2.1.
Material
Die verwendeten Chemikalien werden über die Universitätsapotheke Greifswald oder direkt
von den Herstellern bezogen. Die jeweiligen Hersteller sind in Klammern aufgeführt.
2.1.1.
Allgemein verwendetes Material und Geräte
Abi Prism 7700
(Applied Biosystems, Darmstadt)
Accu-Jet
(Brand, Wertheim)
Durchflusszytometer FACSCalibur
(Becton Dickinson Company, Heidelberg)
Gene Quant II
(Pharmacia, Karlsruhe)
Hyperfilm-ECL
(Amersham Biosciences, Freiburg)
Inkubator BBD6220
(Heraeus, Hanau)
Kulturflasche 75 ml
(Greiner Bio One, Frickenhausen)
Kulturplatten 6 Well / 96 Well
(Greiner Bio One, Frickenhausen)Multipipette®
Mikroskop
(Carl Zeiss, Jena)
Multipipette® plus / CombiTips Plus
(Eppendorf, Hamburg)
Optical 96-Well Reaction Plate
(Applied Biosystems, Darmstadt)
Pasteur Pipetten (Glas)
(VWR International, Darmstadt)
Pipette PipetMan / Pipettenspitzen
(Gilson, Bad Camberg)
Proteintransferkammer
(Biorad, München)
PS Tube (FACS-Röhrchen)
(Greiner Bio One, Frickenhausen)
Pumpe Laboport
(Neuberger, Freiburg)
Röhrchen 15 / 50 ml
(Greiner Bio One, Frickenhausen)
Safe Lock Tube 1,5 / 2,0 ml
(Eppendorf, Hamburg)
Schüttler Titramax 100
(Heidolph Instruments, Schwabach)
Serological Pipette 1 / 2 / 5 / 10 / 25 ml
(Sarstedt, Nümbrecht)
Sterilbank Herasafe
(Heraeus, Hanau)
Ultra-Mikro-Quarzküvette
(Bender + Hobein, Neu-Ulm)
Ultraschallgerät Bronson Sonifier B-12
(Bronson Sonic Power Company, Danbury, USA)
Vortex
(Neolab, Heidelberg)
Wallac Victor Fluoreszenzphotometer
(Perkin Elmer, Rodgau-Jügesheim)
- 36 -
2. Material und Methoden
Zentrifuge Rotixa 120R
(Hettich, Bäch, Schweiz)
Zentrifuge Biofuge fresco
(Heraeus, Hanau)
2.1.2.
Reagenzien und Zellen für die Zellkultur
PC3-Prostatakarzinom-Zelllinie
(ATCC, Rockville, USA)
Dulbecco’s MEM
(Biochrom AG, Berlin)
fetales Kälberserum (FKS)
(Biochrom AG, Berlin)
Glutamin
(Biochrom AG, Berlin)
Penicillin G
(Biochrom AG, Berlin)
Streptomycinsulfat
(Biochrom AG, Berlin)
PBS (phosphate buffered saline)
(Biochrom AG, Berlin)
Trypsin/EDTA-Lösung
(Biochrom AG, Berlin)
Dimetylsulfoxid (DMSO)
(Wak Chemie Medical GmbH, Steinbach)
Trypanblau-Lösung 4 % (w/v) in PBS
(Biochrom AG, Berlin)
Mycoplasmen PCR ELISA
(Boehringer-Mannheim, Mannheim)
2.1.3.
Reagenzien für die Transfektion der Zellen
Argfectin-50
(Atugen, Berlin)
Gapmer-Antisense-Oligodesoxynukleotide (Altana Pharma, Konstanz)
PKCη-Antisense-Oligodesoxynukleotid
(folgend ETA-ASO genannt)
Bcl-xL-Antisense-Oligodesoxynukleotid
(folgend Bcl-xL-ASO genannt)
Bcl-2-Antisense-Oligodesoxynukleotid
(folgend Bcl-2-ASO genannt)
Kontroll-Oligodesoxynukleotid
(Altana Pharma, Konstanz)
Bcl-xL-Inverse-Oligodesoxynukleotid
(folgend CONO genannt)
2.1.4.
Reagenzien für die mRNA-Expressionsanalyse
2.1.4.1.
Reagenzien für die RNA-Isolation
RNeasy Mini Kit
Puffer RW1 (Wasch-Puffer)
(Qiagen, Hilden)
Puffer RLT (Lyse-Puffer)
Puffer RPE (Wasch-Puffer - auf 55 ml Puffer 44 ml Ethanol)
RNAse-freies Wasser
- 37 -
2. Material und Methoden
2.1.4.2.
Reagenzien für die „Real Time“ RT-PCR (TaqMan)
TaqMan One-Step RT-PCR Master Mix Reagents
(Applied Biosystems, Darmstadt)
AmpliTaqDNA Polymerase
dNTP
dUTP
Puffer
Multi Srible Reverse Transkriptase
RNAse Inhibitor
Primer und Sonden für PKCη, Bcl-xL und Bcl-2
(Metabion, Martinsried)
2.1.5.
Reagenzien für die Proteinexpressionsanalyse
2.1.5.1.
Reagenzien für die Protein-Isolation
Für Wasch- und Lyseschritte:
PBS
RIBA-Puffer: Tris-HCl (pH 7,4)
40 mM
NaCl
150 mM
Triton X 100
1%
Na-Desoxycholat
0,5 %
SDS mit Protease-Inhibitor
0,1 %
Protease-Mix
(Roche, Mannheim)
Für die Proteinbestimmung: Fertigreagenz
Lösung A:
(Pierce, Rockford, USA)
NaOH-Lösung
0,2 M
mit Natriumcarbonat, Natriumbicarbonat, Natriumtartrat,
Bicinchoninsäure
Lösung B:
2.1.5.2.
wässrige Kupfersulfatlösung
Reagenzien für den Western Blot
Für die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese:
Sammelgel:
Polyacrylamid
5%
Tris-HCl (pH 6,8)
0,125 mM
SDS
10 %
- 38 -
2. Material und Methoden
Trenngel:
Ladepuffer:
Polyacrylamid
8,5 %
Tris-HCl (pH 6,8)
0,38 mM
Tris-HCl (pH 6,8)
0,625 M
Glycerin
2 ml
5 ml
SDS
10 %
2 ml
l0 ml
β-Mercaptoethanol
Bromphenolblau-Lösung
1 % (w/v)
0,1 ml
in Ethanol
und zweifach destilliertem Wasser
2,4 ml
Molekulargewichtsmarker: Rainbow RPN 800 (Amersham, Freiburg)
Für den Elektrotransfer der Proteine auf die Membranen:
PVDF-Membran
(Millipore, Eschborn)
Elektrotransfer-Puffer:
Tris-HCl (pH 8,3)
5 mM
Glycin
38 mM
SDS
0,2 %
Methanol
20 % (w/v)
Tris-HCl (pH 6,7)
62,5 mM
β-Mercaptoethanol
100 mM
Tris-HCl (pH 7,5)
4 mM
NaCl
100 mM
Tween 20
0,05 %
Waschpuffer:
TBS/T-Puffer:
TBS-Puffer mit Magermilchpulver (Sigma, Deisenhofen)
5 % (w/v)
Für die Detektion der Zielproteine:
Inkubations-Puffer:
PBS
Rinderserumalbumin
0,5 %
TBS/T-Puffer
0,005 %
Detektions-Lösungen
ECL-System (Amersham, Freiburg)
„Luminol“-Lösung
„Enhancer“-Lösung
Antikörper gegen Zielproteine
(Santa Cruz Biotechnologie, Heidelberg)
monoklonaler Kaninchen-Anti-PKCη-AK (Verdünnung 1:5000)
monklonaler Maus-Anti-Bcl-xL-AK
(Verdünnung 1:1000)
monoklonaler Maus-Anti-Bcl-2-AK
(Verdünnung 1:500)
- 39 -
2. Material und Methoden
Peroxidase-konjugierte Antikörper
(Diavona, Hamburg)
monoklonaler Anti-Kaninchen-AK (IgG)
(Verdünnung 1:25000)
monoklonaler Anti-Maus-AK (IgG)
(Verdünnung 1:25000)
2.1.6.
Reagenzien für funktionelle Tests
2.1.6.1.
Reagenzien für den Alamar Blue™-Assay
Alamar Blue™-Assay Reagenz
2.1.6.2.
(Biosource, Solingen)
Reagenzien für die Zellzyklusanalyse
Glucose-Propidiumjodid Lösung:
Glucose in PBS
1%
Propidiumjodid
(Sigma, Deisenhofen) 50 µg/ml
RNAse A
(Roche, Mannheim) 50 µg/ml
Ethanol
70 %
2.1.6.3.
Reagenzien für die Caspase-Aktivitätstests
Lysepuffer:
Tris-HCl
10 mM
NaH2PO4/NaHPO4
10 mM
NaCl
130 mM
Triton X 100
1%
Na4P2O7
10 mM
HEPES (pH 7,5)
20 mM
Glycerol
10 %
NaCl
100 mM
EDTA
1 mM
CHAPS
0,1 %
Saccharose
10 %
DTT
2 mM
Caspase 3-Substrat
25 µg/ml
Caspase 3-Substrat:
Ac-DEVD-AFC
(Bachem, Heidelberg)
Caspase 9-Substrat:
Ac-LEHD-AFC
(Bachem, Heidelberg)
Caspase-AFC-Puffer:
(pH 7,2)
(0,5 mg/ml in PBS lichtgeschützt bei -20 ° C gelagert)
- 40 -
2. Material und Methoden
2.1.6.4.
Reagenzien für die Bestimmung des mitochondrialen Membranpotentials
Dihexaoxacarbocyaninjodid DiOC6(3)
(Alexis Biochemicals, Grünberg)
(bei -20 ° C lichtgeschützt gelagert)
2.1.6.5.
Reagenzien für die Bestimmung der Cytochrom c-Freisetzung
Paraformaldehyd in PBS
1%
Inkubationspuffer:
PBS
500 µl
Triton X 100
0,05 %
Rinderserumalbumin
2%
Cytochrome c-FITC-AK
10 µl
Anti-Cytochrome c (6H2)-FITC
(Santa Cruz Biotechnology Inc., Heidelberg)
(monoklonaler Maus IgG1-Antikörper gegen menschliches Cytochrom c)
(200 µg/ml in PBS bei 4° C lichtgeschützt gelagert)
2.1.6.6.
Zytokine
Recombinant Human TRAIL/Apo2L
(Tebu-Bio, Offenbach)
(10 µg/ml in sterilem Aqua bidest. bei -20° C gelagert)
2.1.6.7.
Caspaseinhibitoren
pan-Caspase-Inhibitor z-VAD-fmk
(Alexis Biochemicals, Grünberg)
Caspase 3-Inhibitor z-DEVD-fmk
(Alexis Biochemicals, Grünberg)
Caspase 9-Inhibitor z-LEHD-fmk
(Alexis Biochemicals, Grünberg)
2.2.
Methoden
2.2.1.
Zellkultur
Alle Arbeiten an der Zellkultur werden unter der sterilen Werkbank Herasafe (Heraeus)
durchgeführt.
Zur Herstellung eines gebrauchsfertigen Zellkulturmediums (Komplettmedium) für die
Stammkultur erfolgt die Supplementierung von Dulbecco’s MEM mit 10 % FKS, 2 mM L- 41 -
2. Material und Methoden
Glutamin, 100 Units/ml Penicillin G und 100 µg/ml Streptomycinsulfat. Für die
Transfektionsversuche wird Dulbecco’s MEM mit 10 % FKS und 2 mM L-Glutamin aber
ohne Penicillin und Streptomycin verwendet (Medium ohne Antibiotika (AB)).
Die bei -80 ° C gelagerten PC3-Zellen werden im 37 ° C warmen Wasserbad aufgetaut und in
10 ml warmem Komplettmedium in ein Röhrchen (15 ml) aufgenommen. Anschließend
werden sie bei 4 ° C bei 2200 U/min (Rotixa 120R, Hettich) für zehn Minuten zentrifugiert.
Das Zellpellet wird in 10 ml warmem Komplettmedium resuspendiert und in eine
Zellkulturflasche (75 ml) in ein Gesamtvolumen von 20 ml Medium überführt. Die
Kulturflasche kommt anschließend in den Inkubator mit einer Temperatur von 37 ° C, einer
relativen Luftfeuchtigkeit von 95 % und einer 5-prozentigen CO2-Atmosphäre.
Sobald die Zellen in den Stammkulturflaschen eine Dichte von 90-95 % erreicht haben, wird
das alte Medium (mit einer Pasteur Pipette (Glas) mithilfe der Pumpe Laboport (Neuberger))
abgesaugt; dies geschieht alle drei bis vier Tage. Die Zellen werden einmal mit warmem PBS
gewaschen und danach mit 2 ml Trypsin-EDTA-Lösung überschichtet, wovon 1,6 ml sofort
wieder abgenommen werden. Nach drei bis vier Minuten im Inkubator sind die Zellen vom
Boden der Kulturflasche abgelöst und werden mit 9 ml warmem Medium ohne AB geerntet. 3
ml davon werden wieder in eine Stammkulturflasche (75 ml) gegeben, mit 17 ml warmen
Komplettmedium zu einem Gesamtvolumen von 20 ml aufgefüllt und weiter im Brutschrank
inkubiert (Teilung 1:3). Die restlichen 6 ml der geernteten Mediumsuspension werden den
Transfektionsversuchen zugeführt.
Um bei allen Transfektionsversuchen eine konstante Zelldichte zu gewährleisten muss die
Anzahl der Zellen in der Mediumsuspension vor dem Aussäen ermittelt werden. Dazu werden
10 µl der sorgfältig aufgeschwemmten Suspension entnommen, in eine NeubauerZählkammer gegeben und unter dem Mikroskop ausgezählt. Es kann anschließend die
entsprechend gewünschte Verdünnung hergestellt werden.
Mithilfe von Trypanblau kann die Vitalität der Zellkultur vor der Zuführung zu den jeweiligen
Versuchen überprüft werden. Es werden 0,5 ml Zellsuspension mit 0,5 ml Trypanblau-Lösung
(4 % (w/v) in PBS) gemischt, fünf bis 15 Minuten unter Kulturbedingungen gehalten und
anschließend in die Neubauer-Zählkammer gegeben. Lebende Zellen werden dabei nicht
angefärbt, tote Zellen stellen sich blau dar. Der Anteil der lebenden Zellen in Prozent der
Gesamtzellzahl ist Ausdruck für die Vitalität der Zellkultur.
Nach Bestimmung der Zellzahl und Vitalität werden die geernteten Zellen den
Transfektionsversuchen zugeführt. Dazu wird eine Verdünnung von 100.000 Zellen pro ml in
warmem Medium ohne AB angesetzt. In die 6-Well-Kulturplatten werden je 2 ml,
- 42 -
2. Material und Methoden
entsprechend 200.000 Zellen pro Well, in die 96-Well-Kulturplatten je 100 µl, entsprechend
10.000 Zellen pro Well, ausgesät. Nach 24 Stunden im Inkubator werden die Zellen vor der
weiteren Behandlung optisch auf Dichte und Adhärenz beurteilt.
Zum Einfrieren und Lagern werden die Zellen aus den Kulturflaschen geerntet und
zentrifugiert. Das Zellpellet wird in einer Mischung aus 930 µl fetalem Kälberserum (FKS)
und 70 µl Dimethylsulfoxid (DMSO) resuspendiert und in ein Kryoröhrchen (1,5 ml,
Eppendorf) überführt. Die Zellen werden zunächst für sechs Stunden bei -20 ° C eingefroren
und danach in flüssigem Stickstoff gehalten.
Ein Problem bei dauerhaft geführten Zellkulturen ist die Kontamination durch Mykoplasmen.
Als Ursprung kommen unter anderem das Kulturmediensupplement fetales Kälberserum
(FKS), das Laborpersonal sowie die Zellen der Zellkultur selbst in Betracht. Im Gegensatz zu
anderen Bakterien oder Pilzen ist ihre Anwesenheit nicht immer mikroskopisch erkennbar.
Sie können vor allem in kontinuierlich geführten Zellkulturen, langsam wachsend, zu
Störungen von Metabolismus und Physiologie der Zellen führen, ohne diese jedoch gänzlich
zu zerstören. Die Folgen sind Veränderungen von Vitalität, Morphologie, DNA-, RNA- und
Proteinsynthese der Zellen, was sich in nicht reproduzierbaren Versuchsergebnissen äußert.
Um die oben genannten Komplikationen zu verhindern, werden die für diese Arbeit
verwendeten Zellen im Abstand von vier bis sechs Wochen auf Kontamination durch
Mykoplasmen untersucht. Hierzu wird der Mycoplasmen PCR-ELISA Kit der Firma
Boehringer-Mannheim
verwendet.
Dieser
Test
basiert
auf
der
Amplifikation
mykoplasmenspezifischer DNA-Sequenzen in der PCR und anschließender Detektion der
amplifizierten DNA im ELISA. Die detaillierte Vorgehensweise zur Durchführung des
Mykoplasmentests ist der Anleitung des Herstellers zu entnehmen. Die Durchführung des
Testes erfolgt im hämatologisch-onkologischen Labor der Kinderklinik der EMAU durch
Frau C. Stötzer.
2.2.2.
Transfektion der Zellen mit
Gapmer-Antisense-Oligodesoxynukleotiden
Um die Expression von PKCη, Bcl-xL und Bcl-2 in den PC3-Prostatakarzinomzellen zu
unterdrücken, werden gezielte Oligonukleotide mit „Antisense“-Strategie eingesetzt (AODN).
Hier werden Antisense-Oligodesoxynukleotide mit einer Länge von 20 Nukleotiden,
bestehend aus einem Phosphorothioat-Skelett mit je fünf bis sechs 2’-alkoxy-modifizierten
- 43 -
2. Material und Methoden
Riboseresten am 3’- und 5’-Ende verwendet. Sie werden in einer Stammlösung bei -20 ° C in
Kryoröhrchen (1,5 ml) gelagert.
Die Sequenzen der Phosphorothioat-AODNs und ihrer 2’-alkoxy-Modifikationen sind
nachstehend aufgezählt. Die Stelle, an der sie mit ihrer Ziel-mRNA hybridisieren ist in
Klammern angegeben.
PKCη-Antisense-Oligodesoxynukleotid, folgend ETA-ASO genannt:
5’-AGGCCCGTACAGCATTTCCT-3’
2’-alkoxy-Modifikation an den Riboseresten 1-5 und 16-20
(Position 1762 der PKCη-mRNA)
Bcl-xL-Antisense-Oligodesoxynukleotid, folgend Bcl-xL-ASO genannt:
5’-CTGCGATCCGACTCACCAAT-3’)
2’-alkoxy-Modifikation an den Riboseresten 1-5 und 16-20
(Position 483 der Bcl-xL-mRNA)
Selektives Ziel ist die Bcl-xL-mRNA, nicht aber die Bcl-xS-mRNA.
Bcl-2-Antisense-Oligodesoxynukleotid, folgend Bcl-2-ASO genannt:
5’-AATCCTCCCCCAGTTCACCC-3’
2’-alkoxy-Modifikation an den Riboseresten 1-6 und 15-20
(Position 422 der Bcl-2-mRNA)
Als Kontrolle wurde ein Phosphorothioat-ODN mit inverser Sequenz zum Bcl-xL-ASO
eingesetzt. Es hat die gleichen chemischen Eigenschaften wie die anderen ODNs, hybridisiert
aber nicht mit einer m-RNA, besitzt also keine spezifische Wirkung.
Kontroll-Oligodesoxynukleotid, folgend CONO genannt:
5’-TAACCACTCAGCCTAGCGTC-3’
2’-alkoxy-Modifikation an den Riboseresten 1-5 und 16-20
Als Trägerlipid dient Argfectin-50, das eine besonders effiziente ODN-Transfektion von PC3Zellen erlaubt.
Die Transfektion der Zellen wird 24 Stunden nach dem Aussäen durchgeführt. Dazu wird das
verbrauchte Medium abgesaugt und durch frisches Medium ohne AB ersetzt. Es werden 800
µl/Well in 6-Well-Kulturplatten bzw. 80 µl/Well in 96-Well-Kulturplatten verwendet. Für die
Transfektion ist eine Komplexbildung aus dem Lipid Argfectin-50 und dem ODN notwendig.
Dazu wird das Lipid in Medium ohne AB mit 20 mM HEPES in einer Verdünnung von 12
µg/ml angesetzt. Die ODNs werden zunächst in sterilem destillierten Wasser in eine 2 µM
Arbeitslösung versetzt und dann mit Medium ohne AB auf 500 nM weiter verdünnt. Die
Lipid- und ODN- Lösungen werden jeweils zu gleichen Teilen gemischt und für 20 Minuten
- 44 -
2. Material und Methoden
zur Komplexbildung in den Inkubator gestellt. Anschließend werden je 200 bzw. 20 µl/Well
zu den Zellen gegeben, so dass die Endkonzentration im Medium der Kulturplatte für das
Lipid 1,2 µg/ml und das ODN 50 nM beträgt. Die Kulturplatten werden nun für weitere 48
Stunden im Brutschrank inkubiert.
2.2.3.
mRNA-Expressionsanalyse von PKCη
η, Bcl-xL und Bcl-2
Zur Durchführung der Genexpressionsanalysen wird die Gesamt-RNA isoliert. Anschließend
wird eine „Real Time“ RT-PCR (TaqMan®PCR) durchgeführt und mittels des „Abi Prism
7700 sequence-detection system“ (TaqMan®) (Applied Biosystems) quantifiziert. In dem
verwendeten Ein-Schritt-Protokoll der TaqMan®PCR erfolgt die Umschreibung in
komplementäre DNA (cDNA) mit Hilfe der Reversen Transkriptase (MuLV-RT) und die
quantitative Amplifikation mit der AmpliTaq Gold®Polymerase in einem Schritt. Zur
Vermeidung von Kontaminationen mit RNAsen wird generell mit Handschuhen und RNAsefreiem Wasser gearbeitet. Es werden sterile wattierte Pipettenspitzen und sterile
Reaktionsgefäße verwendet. Für die RNA-Isolation und die TaqMan®PCR werden räumlich
getrennte Arbeitsplätze und Pipettensätze verwendet.
2.2.3.1.
Präparation der RNA und RNA-Konzentrationsbestimmung
Die Zellen werden in 6-Well-Kulturplatten in einer Dichte von 200.000 Zellen pro Well
ausgesät und 24 Stunden später transfiziert. Um eine günstige Inkubationszeit der ODNs mit
einer möglichst starken mRNA-Suppression zu ermitteln, wird mit einer Endkonzentration
von 50 nM jeweils 48 bis drei Stunden vor der RNA-Präparation transfiziert. Für die
Bestimmung
der
Dosisabhängigkeit
der
mRNA-Suppression
werden
ODNs
in
Endkonzentrationen von 6.25 bis 50 nM eingesetzt und vor der RNA-Präparation für 48
Stunden mit den Zellen inkubiert. Dabei werden jeweils drei Wells identisch behandelt. Zum
Ernten der Zellen wird das Medium abgenommen und pro Well in ein RNAse-freies
Röhrchen (15 ml) gegeben. Die Kulturplatten werden mit 200 µl/Well warmer TrypsinEDTA-Lösung fünf Minuten in den Brutschrank gestellt. Danach werden die Zellen mit dem
vorher abgenommenen Medium abgelöst und in das Röhrchen gegeben. Jedes Well wird
einmal mit 1 ml frischem Medium nachgespült. Die Röhrchen mit der Zell-MediumSuspension werden für zehn Minuten bei 2200 U/min zentrifugiert. Der Überstand wird
komplett abpipettiert und aus dem Zellpellet wird mit dem RNeasy MiniKit® (Qiagen) die
RNA nach Anleitung des Herstellers isoliert. Hierbei werden die Zellen mit einem
- 45 -
2. Material und Methoden
Guanidinisothiocyanat- und β-Mercaptoethanol-haltigen Puffer lysiert, wobei die Proteine
denaturiert und RNAsen inaktiviert werden. Durch Zugabe von 70-prozentigem Ethanol zum
homogenisierten Lysat werden die Nukleinsäuren gefällt. Nach Bindung der RNA auf einer
Quarzmembran werden Kontaminationen mittels Waschpuffer entfernt und die RNA in
RNAse-freiem Wasser eluiert.
Zur Isolierung der Gesamt-RNA wird folgendes Protokoll verwendet:
•
Zellen mit 350 µl RLT-Puffer lysieren und mit einer
Kanüle (0,9 mm, 20 G)
homogenisieren
•
350 µl 70-prozentigen Ethanol hinzufügen, durch Auf- und Abpipettieren mischen, die
Gesamtmischung (700 µl) auf eine RNeasy® mini spin Säule in einem 2 mlSammelgefäß überführen und 15 Sekunden bei 10000 U/min zentrifugieren, das Filtrat
verwerfen
•
700 µl RW1-Puffer auf die Säule geben, erneut 15 Sekunden bei 10000 U/min
zentrifugieren und das Filtrat mit dem Sammelgefäß erneut verwerfen
•
Säule in ein neues 2 ml-Sammelgefäß geben, 500 µl RPE-Puffer auf die Säule
pipettieren, 15 Sekunden bei 10000 U/min zentrifugieren, das Filtrat verwerfen
•
500 µl RPE-Puffer auf die Säule geben, zwei Minuten bei 10000 U/min zentrifugieren
und das Filtrat mit Sammelgefäß verwerfen
•
die Säule in ein 1,5 ml-Sammelgefäß geben, 40 µl RNAse-freies Wasser direkt auf die
RNeasy® Membran pipettieren, eine Minute bei 10000 U/min zentrifugieren
Das erhaltende Eluat wird bei -80 ° C eingefroren und gelagert. Die Konzentration der
enthaltenen RNA wird photometrisch ermittelt. Es folgt eine Expressionsanalyse der ZielmRNAs mittels TaqMan®PCR.
Die Konzentration der gewonnenen RNA-Proben wird photometrisch mittels Gene Quant II
(Pharmacia) ermittelt. Bei einer Wellenlänge von 260 nm und einer Schichtdicke von 1 cm
entspricht ein gemessener Absorptionswert von 1 einer RNA-Konzentration von 37 µg/ml.
Zur Messung wird eine UV-Licht-durchlässige Quarzküvette mit einem Messvolumen von
100 µl eingesetzt. Als Leerwert und Verdünnungsmittel für die RNA-Proben (2,5:97,5) dient
RNAse-freies Wasser. Die Reinheit der RNA-Isolierung wird anhand des Quotienten aus
Absorptionsmessung bei 260 nm (RNA) und 280 nm (Protein) überprüft. Dieser Quotient
liegt bei sehr reinen Nukleinsäure-Lösungen zwischen 1,9 und 2,0. Niedrigere Werte deuten
auf Verunreinigungen durch Proteine oder EDTA hin.
- 46 -
2. Material und Methoden
2.2.3.2.
Quantitative „Real time“ RT-PCR (TaqMan)
Die Polymerase Kettenreaktion (PCR) ist eine schnelle und sehr sensitive Methode in der
DNA-Analytik. Es ist eine, durch spezifische Primer definierte, enzymatische in-vitroReplikation, bei der eine annähernd exponentielle Amplifikation der Zielsequenz erreicht
wird. Trotz der wesentlichen Erleichterungen durch diese Methode bedeutet der sensitive,
reproduzierbare und spezifische Nachweis der PCR-Produkte noch immer einen hohen Zeitund Arbeitsaufwand. Außerdem bestehen zum Teil sehr hohe Reagenzienkosten sowie die
Gefahr der „Carry-Over“-Kontamination. Ziel der Bemühungen ist es deshalb, einen
sogenannten homogenen Assay zu entwickeln, bei dem Amplifikation und Nachweis des
PCR-Produkts simultan in einem Reaktionsgefäß möglich sind. Dies gelingt erstmals 1991
mit dem von Holland und Mitarbeitern beschriebenen 5’-Nuclease-PCR-Assay (Holland et
al., 1991). Allerdings erforderte seine Technik ein aufwendiges Post-PCR-Processing. Erst
mit den von Lee und Mitarbeitern 1993 bei Applied Biosystems entwickelten fluorogenen
Sonden wird es möglich, den Abbau der Sonde ohne aufwendiges Processing zu detektieren
(Lee et al., 1993). Bei der hier genutzten „Real Time“ PCR handelt es sich um eine PCRMethode zur Detektion genomischer DNA und cDNA, bei der im Unterschied zu der oben
beschriebenen herkömmlichen PCR durch die Verwendung einer fluorogenen Sonde eine
simultane Amplifikation und Detektion des Amplikons und damit eine Beobachtung des
Verlaufs der PCR im Reaktionsgefäß möglich ist (Schild, 1998).
Der beschriebene TaqMan®PCR Assay nutzt die 5’-3’-Exonuklease-Aktivität der AmpliTaq
DNA-Polymerase. Hierbei wird eine spezielle fluorogene Sonde eingesetzt, die aus einem
Oligonukleotid besteht, dessen 5’-Ende mit einem fluoreszierenden Reporter-Farbstoff
(Fluoreszein-Derivat) markiert ist, während das 3’-Ende einen Quencher-Farbstoff
(Rhodamin-Derivat) trägt und außerdem mit einem Phosphatrest blockiert ist. Wird die
intakte Sonde bei einer spezifischen Wellenlänge (488 nm) zur Fluoreszenz angeregt, so wird
die Fluoreszenz des Reporter-Farbstoffs aufgrund der räumlichen Nähe zum Quencher durch
einen Fluoreszenz-Energietransfer (FET) unterdrückt. Im ersten Schritt der PCR lagern sich
Sonde und Primer sequenzspezifisch an den Matrizen-Strang der cDNA an. In der
Extensionsphase trifft die AmpliTaq Gold®Polymerase auf diese Sonde und beginnt sie zu
verdrängen. Es entsteht eine Y-förmige Sekundärstruktur, wodurch die 5’-3’-ExonukleaseAktivität der Polymerase aktiviert und die Sonde Base für Base hydrolysiert wird, während
das PCR-Produkt vollständig synthetisiert wird. Bei der Sondenhydrolyse werden die
räumliche Nähe und damit auch der FET zwischen Reporter und Quencher unterbrochen.
- 47 -
2. Material und Methoden
Entsprechend der Akkumulation von PCR-Produkt steigt die Fluoreszenz des Reportersignals
mit jedem PCR-Zyklus an. Die Veränderung der Fluoreszenzen der verschiedenen Farbstoffe
wird mit Hilfe des Abi Prism 7700 Sequence Detectors im geschlossenen Reaktionsgefäß
Zyklus für Zyklus erfasst. Das dabei gebildete Signal ist strikt sequenzspezifisch, denn
sowohl freie, nicht hybridisierte, als auch nicht vollständig bindende Sondenmoleküle werden
nicht hydrolysiert und die räumliche Nähe zwischen Reporter und Quencher bleibt erhalten.
Der Reaktionsablauf ist in der unten stehenden Abbildung schematisch dargestellt.
Abb. 4:
1)
Sequenzspezifische Anlagerung
Sonde und der PCR-Primer an
cDNA. Die räumliche Nähe
Reporter und Quencher verhindert
Fluoreszenz-signal (FET).
2)
Die 5’→3’ exonukleaseaktive Taq DNA
Polymerase trifft auf die Sonde und
beginnt diese zu hydrolysieren.
3)
Das PCR-Produkt
synthetisiert
und
abgetrennt.
4)
In Abhängigkeit von der Zahl
freigesetzter
Reportermoleküle
und
damit von der Zahl gebildeter PCRProdukte wächst das Reporter-Signal.
wird
die
der
die
von
das
vollständig
Farbstoffe
Schematische Darstellung der Sondendegradierung während eines TaqMan® Laufes,
(aus Schild, 1998).
Für die Messungen werden die Bestandteile des TaqMan® One-Step RT-PCR Master Mixes
(Applied Biosystems) verwendet. Es wird das Ein-Schritt-Protokoll der Gold® RTTaqMan®PCR durchgeführt, bei welchem die reverse Transkription und die Amplifikation in
einem Reaktionsgefäß zeitlich direkt hintereinander ablaufen. Die Synthese der cDNA aus
- 48 -
2. Material und Methoden
RNA erfolgt mit Hilfe des Enzyms Reverse Transkriptase MuLV-RT. Diese DNAPolymerase besitzt sowohl RNA- als auch DNA- abhängige DNA-Polymeraseaktivität und
synthetisiert an einzelsträngigen RNA-Templates cDNA. Zur Einleitung der reversen
Transkription werden die gleichen Primer wie für die Amplifikation verwendet. Als endogene
Kontrolle wird die 18S-rRNA herangezogen, um bei unterschiedlichem Gehalt an GesamtRNA einzelner Proben, eine vergleichende Auswertung zu ermöglichen. Die zur
Amplifizierung verwendete AmpliTaq Gold®Polymerase ist eine chemisch modifizierte Form
der rekombinanten AmpliTaq (Thermus aquaticus) DNA-Polymerase. Sie ist bei
Raumtemperatur inaktiv und wird erst in einer der PCR vorgeschalteten Phase (10 min bei 95
° C) in den aktiven Zustand überführt.
Nachfolgend sind die Programmparameter des Ein-Schritt-Protokolls aufgeführt.
Hold
48 ° C 30 min
reverse Transkription
Hold
95 ° C 10 min
Aktivierung der AmpliTaq Gold®Polymerase
Denaturierung
95 ° C 15 sec
Annealing
60 ° C 1 min
40 Zyklen
Der Reaktionsansatz für eine Probe enthält die aufgeführten Bestandteile in der jeweils
angegebenen Menge. Alle Messungen werden als Dreifachansatz durchgeführt.
TaqMan® Master Mix ohne UNG
10 µl
MultiScrible and RNAse Inhibitor Mix
0,5 µl
Primer FW (300 nM)
1,2 µl
Primer RV (300 nM)
1,2 µl
Sonde (100 nM)
0,4 µl
RNA-Probe
2,0 µl
20 x 18s rRNA Mix
1,0 µl
________________________________________________________________________________
RNAse-freies Wasser ad
20 µl
Folgend sind Primer- und Sondendesign für die untersuchten Zielmoleküle aufgelistet.
Primerdesign: Primer PKCη
Primer Bcl-2
Primer Bcl-xL
FW
5’-ATGCTGTACGGGCCTGCA-3’
RV
5’-CGTGACCACAGAGCATCTCATAGA-3’
FW
5’-TCCGCATCAGGAAGGCTAGA-3’
RV
5’-GCTGGGACACAGGCAGGTT-3’
FW
5’-TGGAACTCTATGGGAACAATGCA-3’
RV
5’-TCAGGAACCAGCGGTTGAAG3’
- 49 -
2. Material und Methoden
Sondendesign: Sonde PKCη 5’-FAM-AACACGCCCATTGCCCACCAGTCTA-TAMRA-3’
Sonde Bcl-2 5’-FAM-CCCAGAGCATCAGGCCGCCA-TAMRA-3’
Sonde Bcl-xL 5’-FAM-CCTGGCCCTTTCGGCTCTCGG-TAMRA-3’
Die klassischen Sonden sind wie folgt aufgebaut: die Reporterfarbstoffe FAM (6Carboxyfluorescein) oder VIC sind kovalent an das 5´-Ende der Sonde gebunden. Der
Quencher TAMRA (6-Carboxytetramethylrhodamin) wird über ein „Linker-Arm“-Nukleotid
(LAN) an das 3´-Ende der Sonde gebunden. Essentieller Bestandteil einer TaqMan-Sonde ist
neben dem Referenz- und Quencherfarbstoff ein 3´-OH-blockierendes Phosphat, das die
Extension der Sonde am 3´-Ende während der PCR unterdrückt. In der folgenden Abbildung
ist die chemische Struktur einer TaqMan®PCR-Sonde dargestellt.
Abb. 5:
Darstellung der chemischen Struktur einer TaqMan®PCR-Sonde, (aus Schild, 1998).
Werden die nach jedem Zyklus gemessenen Reportersignale (∆Rn-Werte) gegen die
Zykluszahl
aufgetragen,
ergibt
sich
eine
Darstellung
des
Reaktionsverlaufes
(Amplifikationsdiagramm) der einzelnen Ansätze. Die Hintergrundaktivität der Sonde
- 50 -
2. Material und Methoden
(„Baseline“) wird bestimmt. Ab Übersteigen etwa der zehnfachen Intensität der „Baseline“
wird ein linearer Anstieg der Fluoreszenzintensität der Proben registriert. Dieser
Intensitätswert wird als Schwelle („Threshold“), der Zyklus, in dem dieser erreicht wird, als
Schwellenzyklus („Threshold Cycle“ = CT) bezeichnet. Im linearen Bereich der Graphen
oberhalb der Schwelle kann eine Auswertung erfolgen, denn hier ist der Anstieg des Signals
proportional
zur
Anzahl
der
hydrolysierten
Sondenmoleküle.
Ein
typisches
Amplifikationsdiagramm ist in der folgenden Abbildung dargestellt.
Hintergrundaktivität
(„Baseline“)
Abb. 6:
“Threshold cycle” (CT)
„Threshold
Amplifikationsdiagramm, (aus Schild, 1998).
Um die Effizienz der Suppressionsversuche zu ermitteln, wird die d∆CT-Auswertungsmethode
gewählt. Hierbei wird die 18s-rRNA als Referenzgen in jeder Probe mit amplifiziert, um trotz
unterschiedlicher
Gesamt-RNA-Mengen
der
einzelnen
Proben
eine
vergleichende
Quantifizierung zu ermöglichen.
Berechnung der d∆CT-Werte:
Zielsequenz-CT
– 18s-rRNA-CT
= Zielsequenz-∆CT
Kontroll-CT
– 18s-rRNA-CT
= Kontroll-∆CT
Zielsequenz-∆CT – Kontroll-∆CT
= d∆CT
Die d∆CT-Werte werden als negativer Exponent der Basis 2 gesetzt, somit ist Kontrolle 1
bzw. 100 %.
- 51 -
2. Material und Methoden
2.2.4.
Proteinexpressionsanalysen von PKCη
η, Bcl-xL und Bcl-2
Bei der Proteinexpressionsanalyse (Western Blot) werden nach Auftrennung aller zellulären
Proteine aufgrund ihres Molekulargewichtes mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
und Elektrotransfer auf Membranen die Zielproteine durch spezifische Antikörper markiert.
Ein zweiter, Peroxidase-konjugierter Antikörper, der gegen Teile der spezifischen Antikörper
gerichtet ist, macht die Zielproteine detektierbar: die Peroxidase erzeugt durch Oxidation von
Substraten aus einer zugeführten Detektionslösung eine Lumineszenz, die zur Schwärzung
des aufgelegten Röntgenfilmes führt. Durch Entwicklung der Filme und Digitalisierung der
Signale mit einer Videokamera kann eine densitometrische Auswertung mit entsprechender
Software erfolgen.
2.2.4.1.
Präparation des zellulären Gesamtproteins und Bestimmung
der Proteinkonzentration
Die Zellen werden auch für diese Versuche in Kulturplatten mit sechs Well in einer Dichte
von 200.000 Zellen/Well ausgesät und nach 24 Stunden mit je 50 nM ODN transfiziert. Um
eine ausreichende Proteinmenge zu erhalten werden je drei Wells mit dem gleichen AODN
behandelt. Als Kontrolle dient wiederum das inverse CONO. Ebenso werden drei Wells, die
nicht transfiziert werden als unbehandelte Kontrolle in die Untersuchung einbezogen. 48
Stunden nach der Transfektion werden die Zellen aus den jeweils drei gleich behandelten
Wells zusammen in ein Röhrchen (15 ml) geerntet und zentrifugiert. Das Zellpellet wird in 2
ml PBS resuspendiert und erneut zentrifugiert. Das gewaschene Zellpellet kann bei
-20 ° C eingefroren und gelagert werden.
Zur Bestimmung der Proteinkonzentration wird das Zellpellet in jeweils 100 µl gekühltem
Lyse-Puffer für 15 Minuten auf Eis lysiert und 45 Sekunden mit Ultraschallwellen (Bronson
Sonifier B-12 auf Stufe II) behandelt. Anschließend wird die Probe fünf Minuten in
kochendem Wasser erhitzt, wieder auf Eis gestellt, abzentrifugiert und der Überstand zur
weiteren Verwendung auf Eis gehalten. Die Proteinbestimmung selbst erfolgt mit
Fertigreagenzien (Pierce). Dazu werden je 25 µl des Lysates in ein Loch einer Mikrotiterplatte
(96 Well) pipettiert und mit 200 µl eines Gemisches der Reagenzien A und B im Verhältnis
50:1 versetzt. Aus einer fünfprozentigen Albumin-Lösung wird eine Standard-Reihe mit acht
Konzentrationsstufen von 25 µg/ml bis 2000 µg/ml mitgeführt. Die Proben werden 30
Minuten bei 37 ° C inkubiert und dann in einem Wallac Victor Fluorometer (mit dem
Programm „Bicinchoninic acid assay“ (BCA) zur Proteinbestimmung) bei einer Wellenlänge
- 52 -
2. Material und Methoden
von 390/510 nm gemessen. Die Proteinkonzentrationen der Proben werden an Hand einer
Eichgeraden der mitgeführten Standard-Reihe bestimmt.
2.2.4.2.
Western Blot
Anhand der bestimmten Proteinkonzentration der jeweiligen Proben kann das Volumen der
Zelllysate so gewählt werden, dass für den Nachweis der PKCη insgesamt je 60 µg Protein
und für den Nachweis von Bcl-xL bzw. Bcl-2 insgesamt je 30 µg Protein eingesetzt werden.
Mit dem gleichem Volumen Lade-Puffer werden die Proben aufgefüllt, fünf Minuten bei 100
° C im Wasserbad erhitzt und dann auf Eis gestellt. Nach Abkühlung werden die Aliquots der
Zelllysate sowohl der Antisense-ODN- als auch der Kontroll-ODN-behandelten Zellen und
der unbehandelten Zellen je Zielprotein auf ein SDS-Polyacrylamid-Gel aufgetragen. An eine
3 cm lange Sammelstrecke des Gels schließt sich ein Trenngel von 10 cm Länge an. Der
Elektrophorese-Puffer wird aus einer zehnfach konzentrierten Stammlösung frisch angesetzt
und auf das Gel gegeben. Die Elektrophorese wird nun initial mit einer Spannung von 120 V
und bei Erreichen des Trenngels weiter mit konstant 240 V durchgeführt. Als
Molekulargewichtsmarker wird Rainbow RPN 800 (Amersham) in jedem Gel mitgeführt.
Im Anschluss an die Elektrophorese wird das Gel von der Glasplatte vorsichtig abgelöst und
zehn Minuten in Elektrotransfer-Puffer gelegt. Währenddessen wird eine PVDF-Membran
(Millipore) mit Methanol benetzt und ebenfalls für zehn Minuten in Elektrotransfer-Puffer
gelegt. Die so vorbereitete Membran wird nun auf das Gel gelegt und beides zusammen in
eine Transferkammer (Biorad) eingespannt. Der Elektrotransfer erfolgt über zwei Stunden bei
einer konstanten Stromstärke von 300 mA. Nach beendetem Elektrotransfer wird die
Membran zunächst zehn Minuten bei Raumtemperatur belassen und anschließend zweimal
mit TBS/T-Puffer gewaschen. Um unspezifische Bindungsstellen abzudecken wird sie vor der
Proteindetektion durch eine einstündige Inkubation mit TBS/T-Puffer mit 5 % (w/v)
Magermilchpulver bei Raumtemperatur abgesättigt.
Jetzt erfolgt der spezifische Nachweis der Zielproteine mithilfe von Antikörpern. Die
Membran wird in Inkubationspuffer unter Zugabe des entsprechenden Antikörpers in der
angegebenen Verdünnung bei +4 ° C über Nacht inkubiert. Es folgen ein Waschschritt über
eine Minute und drei Waschschritte über 15 Minuten in 50 ml TBS/T-Puffer. Die Inkubation
mit dem entsprechenden Peroxidase-konjugierten monoklonalen Antikörper erfolgt in einer
Verdünnung von 1:25000 in 20 ml 0,05-prozentigem TBS/T-Puffer über zwei Stunden bei
Raumtemperatur. Anschließend wird die Membran wiederum dreimal in 50 ml 0,05prozentigem TBS/T-Puffer bei Raumtemperatur gewaschen. Die Detektion der Zielproteine
- 53 -
2. Material und Methoden
erfolgt mit dem ECL-System (Amersham). Hierzu werden die Lösungen „Luminol“ und
„Enhancer“ 1:1 gemischt und die Membran damit benetzt. Unter Lichtschutz wird sie in einer
Röntgenfilmkassette mit einer Klarsichtfolie und dem Hyperfilm-ECL abgedeckt. Die
Entwicklung erfolgt nach Inkubationszeiten zwischen 30 Sekunden und zehn Minuten unter
Standardbedingungen. Nach Digitalisierung der Signale kann nun die densitometrische
Auswertung erfolgen. Die Durchführung der Western Blots erfolgt im Labor von Frau Dr. C.
Müller durch Frau U. Glawe.
2.2.5.
Funktionelle Tests
In den funktionellen Versuchen werden intrazelluläre Veränderungen und die Vitalität der
Zellen unter TRAIL-Behandlung nach der Gapmer-AODN-Transfektion untersucht.
2.2.5.1.
Alamar Blue™-Assay
Der Alamar Blue™-Assay wurde entwickelt, um die Proliferation von Zellen quantitativ zu
messen. Er kann auch zur Ermittlung der relativen Zytotoxizität von verschiedenen Agenzien
eingesetzt werden. In der Alamar Blue™-Lösung ist ein selbst nicht toxischer Abkömmling
des MTT (Tetrazoliumsalz) als REDOX-Indikator enthalten, der durch Änderung seiner Farbe
im Wachstumsmedium das Ausmaß seiner metabolischen Reduktion durch eine Zellkultur
anzeigt. Enthält die Zellkultur viele lebende, metabolisch aktive Zellen, so schlägt die
Indikatorfarbe durch Reduktion von blau nach rot um. Bei Überwiegen der toten Zellen ist die
Reduktion des Indikators so gering, dass der Farbumschlag ausbleibt. Die Lichtabsorption des
Indikatorfarbstoffs wird drei Stunden nach Zugabe von 1/10 des Gesamtvolumens Alamar
Blue™-Lösung zur Versuchszellkultur bei 570 und 600 nm am Wallac Viktor Fluorometer
gemessen.
Für den Versuch werden die Zellen in einer Dichte von 10.000 Zellen pro Well in einer
Kulturplatte (96 Well) ausgesät. 24 Stunden später werden sie auf Dichte und Adhärenz
optisch beurteilt und anschließend mit den jeweils gewünschten AODNs (50 nM) für 48
Stunden transfiziert. Danach erfolgt je nach geplantem Versuch eine unterschiedliche
Behandlung der Zellen mit TRAIL. Alle Versuche werden als Dreifachbestimmungen
durchgeführt. Es werden außerdem drei Wells mit völlig unbehandelten Zellen als positive
Wachstumskontrolle mitgeführt. Um einerseits die Zeitabhängigkeit der TRAIL-Wirkung zu
erfassen, werden 300 ng/ml TRAIL für jeweils drei bis 24 Stunden auf die Zellen gegeben.
Um andererseits die Dosis-Wirkungsbeziehung der TRAIL-Behandlung zu bestimmen, wird
- 54 -
2. Material und Methoden
TRAIL in Konzentrationen von 0-300 ng/ml für jeweils 24 Stunden auf die Zellen gegeben.
Der Nachweis, dass Caspasen an der TRAIL-vermittelten Reduktion der Zellviabilität
beteiligt sind, kann mit Hilfe des pan-Caspase-Inhibitors z-VAD-fmk erfolgen. Er wird eine
Stunde vor TRAIL-Behandlung in verschiedenen Konzentrationen auf die Zellen gegeben.
Nach Ablauf der jeweiligen Inkubationszeit wird die Alamar Blue™-Lösung (1/10 des
Gesamtvolumens) zur Zellkultur gegeben, nach drei Stunden bei 37 ° C kann die Absorption
am Wallac Viktor Fluorometer gemessen werden.
Für die Auswertung muss zunächst ein Korrekturfaktor RO ermittelt werden, um den Einfluss
der Eigenfarbe des Medium auszuschalten. Es werden je drei Wells nur mit Medium und je
drei Wells mit Medium + 10 % Alamar Blue™ versehen. Die Absorption von Medium allein
wird von der Absorption von Medium + 10 % Alamar Blue™ subtrahiert. Der Quotient aus
der Differenz der Absorption bei 570 nm (A570) und der Differenz der Absorption bei 600 nm
(A600) ergibt den Korrekturfaktor für alle weiteren Berechnungen.
A570 (Medium)-A570 (Medium + Alamar Blue™)
RO = ---------------------------------------------------------A600 (Medium)-A600 (Medium + Alamar Blue™)
Um das Ausmaß der Reduktion des Indikators im jeweiligen Testwell zu ermitteln, wird die
Absorption bei 600 nm (A600) mit dem Korrekturfaktor multipliziert, von der Absorption bei
570 nm (A570) subtrahiert und das Ergebnis mit 100 multipliziert.
Prozent reduzierter Alamar Blue™ = [A570-(A600 * RO)] * 100
Die Viabilität der Zellen wird als Verhältnis aus reduziertem Alamar Blue™ im Testwell zu
reduziertem Alamar Blue™ in der positiven Wachstumskontrolle angegeben.
Prozent lebende Zellen im Testwell =
[A570-(A600 * RO)] * 100 im Testwell
---------------------------------------------------------------[A570-(A600 * RO)] * 100 in der Wachstumskontrolle
Angegeben wird der Mittelwert aus der Dreifachbestimmung für jeden Versuchsansatz.
2.2.5.2.
Zellzyklusanalyse
Das für die Zellzyklusanalyse verwendete Durchflusszytometer FACSCalibur von der
Becton Dickinson Company ermöglicht eine gleichzeitige Messung von Fluoreszenz- und
- 55 -
2. Material und Methoden
Streulichtsignalen an einzelnen Zellen mittels eines von einer Seite auf die Zelle gerichteten
Laserstrahls. Die Veränderungen des Laserstrahls hinter der Zelle lassen Rückschlüsse auf die
Morphologie oder Fluoreszenzeigenschaften der Zelle zu. Der Anteil des im rechten Winkel
zum einfallenden Lichtstrahl gestreuten Lichtes hängt hauptsächlich von der Granularität der
Zelle ab (SSC, „Side Scatter“). Gerade an der Zelle vorbeischeinendes, nicht abgelenktes
Licht ist in erster Linie ein Maß für die Zellgröße (FSC, „Forward Scatter“).
Fluoreszenzeigenschaften werden in den Kanälen der unterschiedlichen Wellenlängen
gemessen. Detektorplatten nehmen das Spektrum des Laserlichtes hinter der Zelle für
unterschiedliche Wellenlängen getrennt auf und übertragen es in elektrische Signale. Dies
ermöglicht die Auswertung der gemessenen Signale mit einer speziellen Software in der z.B.
in einem zweidimensionalen Koordinatensystem der oben genannten Parameter jeder Punkt
einer analysierten Zelle entspricht. Die Punktewolke entspricht dann der gemessenen
Zellpopulation. In wenigen Sekunden können einige 1000 Zellen auf diese Weise analysiert
werden.
Ein wichtiges Merkmal apoptotischer Zellen ist das Auftreten einer spezifischen DNAFragmentierung. Durch diesen Prozess nimmt der DNA-Gehalt von apoptotischen Zellen im
Vergleich zu nicht apoptotischen Zellen ab. Durch Anfärbung mittels Propidiumjodid kann
die Fluoreszenz und damit die DNA-Menge im Kern der einzelnen Zellen genau bestimmt
werden. Da der DNA-Gehalt einer Zelle abhängig ist von der Zellzyklusphase, in der sie sich
befindet, entspricht jede Phase des Zellzyklus auch einer bestimmten Fluoreszenzintensität.
Die Zellen werden für die Zellzyklusanalysen in Kulturplatten (6-Well) mit einer Dichte von
200.000 Zellen/Well ausgesät. 24 Stunden später werden sie auf Dichte und Adhärenz optisch
beurteilt und anschließend mit den jeweils gewünschten AODNs (50 nM) für 48 Stunden
transfiziert. Danach erfolgt je nach geplantem Versuch eine unterschiedliche Behandlung der
Zellen mit TRAIL. Um die Zeitabhängigkeit der TRAIL-Wirkung zu erfassen werden 100
ng/ml TRAIL für jeweils drei bis 24 Stunden auf die Zellen gegeben. Um die DosisWirkungsbeziehung der TRAIL-Behandlung zu bestimmen wird TRAIL in Konzentrationen
von 0-100 ng/ml für jeweils 24 Stunden auf die Zellen gegeben. Zum Nachweis der
Beteiligung der Caspase 3 am TRAIL-vermittelten Zelltod wird der Caspase 3-Inhibitor zDEVD-fmk eine Stunde vor TRAIL-Behandlung in einer Dosierung von 10 µM appliziert.
Anschließend werden die Zellen mit Trypsin/EDTA geerntet, zweimal mit PBS gewaschen
und mit 2 ml 70-prozentigem Ethanol bei -20 ° C für mindestens 30 Minuten fixiert. Danach
wird erneut zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Zellsediment in 500 µl einer
Glucose/Propidiumjodid-Lösung resuspendiert. Nach Überführung die Zellsuspension in
- 56 -
2. Material und Methoden
FACS-Röhrchen, erfolgt eine 30-minütige Inkubation bei Raumtemperatur unter Lichtschutz.
Die Zellzyklusanalyse wird im Anschluss am FACSCalibur durchgeführt. Als Maß für die
apoptotischen Zellen wird der hypodiploide „Peak“ der AODN-behandelten Zellen mit dem
der unbehandelten bzw. Kontroll-ODN-behandelten Zellen verglichen. Die unten stehende
Abbildung zeigt das Diagramm der Zellzyklusanalyse einer normalen Zellkultur.
Hypodiploide
Zellen
G1 Phase
Diploide
Zellen
Synthesephase
Abb. 7:
Darstellung einer Zellzyklusanalyse.
2.2.5.3.
Caspase-Aktivitätstests
G2 Phase
Tetraploide
Zellen
Die Messung der Aktivität von Caspasen beruht auf einer spezifischen enzymatischen
Abspaltung eines Flureszenzfarbstoffes (Trifluoromethylcoumarin, AFC) von einem CaspaseSubstrat. Die Anregung/Emission wird bei 390/510 nm am Wallac Viktor Fluorometer
gemessen. Die jeweilige Caspase-Aktivität wird als relatives Verhältnis der Emission von
behandelten zu unbehandelten Zellen angegeben.
Die Zellen werden in Kulturplatten (6-Well) in einer Dichte von 200.000 Zellen/Well
ausgesät und nach 24 Stunden nach optischer Beurteilung auf Dichte und Adhärenz mit 50
nM ODNs transfiziert. 48 Stunden später wird mit der TRAIL-Behandlung der Zellen
begonnen. Um die Kinetik der Wirkung zu ermitteln, wird TRAIL 24 bis zwei Stunden vor
dem Ernten der Zellen in einer Dosis von 100 ng/ml appliziert. Zur Bestimmung der
Dosisabhängigkeit der TRAIL-Wirkung werden dreieinhalb Stunden vor dem Ernten der
Zellen 30 bzw. 100 ng/ml TRAIL zu den Zellen gegeben. Nun werden die Zellen mithilfe von
Trypsin/EDTA geerntet und zentrifugiert. Der Überstand wird komplett abpipettiert und das
- 57 -
2. Material und Methoden
Zellpellet für mindestens zehn Minuten mit 100 µl des Lysepuffers auf Eis lysiert. Das
Zelllysat wird anschließend mit 110 µl des frisch angesetzten Caspase-AFC-Puffers gemischt
und in eine optische Mikrotiterplatte (96-Well) gegeben. Innerhalb von zwei Stunden bei 37 °
C wird das im Caspasepuffer enthaltene spezifische Substrat von der zuständigen Caspase
gespalten und der Fluoreszenzfarbstoff freigesetzt. Zur Messung der Aktivität der Caspase 3
wird
das
spezifische
Substrat
Ac-DEVD-AFC
verwendet,
für
die
Caspase
9-
Aktivitätsbestimmung wird Ac-LEHD-AFC verwendet. Nun kann die Anregung/Emission am
Wallac Viktor Fluorometer gemessen werden. Um den Spontanzerfall des Substrates zu
ermitteln, wird ein Well nur mit 100 µl Lysepuffer und 110 µl Caspase-AFC-Puffer versehen.
Der hier gemessene Emissionswert wird von dem der jeweiligen Proben abgezogen. Die
Caspase-Aktivität wird schließlich als relatives Verhältnis der Emissionen von behandelten zu
unbehandelten (d.h. nicht transfizierten und nicht mit TRAIL behandelten) Zellen angegeben.
2.2.5.4.
Messung des mitochondrialen Membranpotentials
Dihexaoxacarbocyaninjodid DiOC6(3) ist ein lipophiles, planares, positiv geladenes Molekül,
das eine grüne Fluoreszenz (Absorption/Emission bei 484/501 nm) aufweist. Es durchdringt
die Plasmamembran von Zellen und akkumuliert in niedrigen Konzentrationen aufgrund der
stark
negativ
geladenen
Membran
in
Mitochondrien.
Bei
depolarisierter
Mitochondrienmembran wird DiOC6(3) nicht akkumuliert und kann wieder aus den Zellen
ausgewaschen werden. Intakte lebende Zellen, die sich nicht in Apoptose befinden, werden
also mittels DiOC6(3) angefärbt und können im Durchflusszytometer detektiert werden.
Wiederum werden die PC3-Zellen in Kulturplatten (6-Well) in einer Dichte von 200.000
Zellen/Well ausgesät und nach 24 Stunden nach optischer Beurteilung mit 50 nM ODNs
transfiziert. Beginnend nach Ablauf von 48 Stunden wird TRAIL appliziert. Zur Ermittlung
der Kinetik der TRAIL-Wirkung wird 24 bis drei Stunden vor dem Ernten der Zellen mit
einer Dosis von 100 ng/ml behandelt. Zur Bestimmung der Dosisabhängigkeit der TRAILWirkung werden drei Stunden vor dem Ernten der Zellen 30 bzw. 100 ng/ml TRAIL zu den
Zellen gegeben. Der Einfluss der Caspasen auf die TRAIL-vermittelte Störung des
mitochondrialen Membranpotentials wird durch Vorbehandlung mit dem BreitspektrumCaspase-Inhibitor z-VAD-fmk nachgewiesen.
Die Zellen werden nach Ablauf der Inkubationszeiten mithilfe von Trypsin/EDTA geerntet,
abzentrifugiert, mit PBS gewaschen und anschließend in 500 µl PBS resuspendiert. Nun wird
DiOC6(3) in einer Endkonzentration von 50 nM unter Lichtschutz für 30 Minuten zugegeben.
Im Anschluss daran kann die Zellsuspension im FACSCalibur® analysiert werden.
- 58 -
2. Material und Methoden
Die Anzahl der Zellen ohne intaktes mitochondriales Membranpotential, also die Anzahl der
apoptotischen Zellen, wird in Prozent der Gesamtzellzahl angegeben.
2.2.5.5.
Nachweis des zytosolischen Cytochrom c
Bei der Depolarisation der Mitochondrienmembran während der Apoptose wird neben
anderen Faktoren auch Cytochrom c aus dem Intermembranspalt des Mitochondriums
freigesetzt. Dieses nun zytosolisch vorliegende Cytochrom c kann mithilfe eines FITCmarkierten monoklonalen Antikörpers angefärbt werden. Die so angefärbten Zellen können
im Durchflusszytometer detektiert werden.
Analog zu den Versuchen zur Zellzyklusanalyse werden die PC3-Zellen in Kulturplatten (6Well) in einer Dichte von 200.000 Zellen/Well ausgesät und nach 24 Stunden optisch auf
Dichte und Adhärenz beurteilt. Anschließend erfolgt die Transfektion mit jeweils 50 nM
ODNs. Nach weiteren 48 Stunden wird mit der TRAIL-Behandlung der Zellen begonnen.
Eine Kinetik der TRAIL-Wirkung lässt sich hier ermitteln, indem TRAIL 24 bis drei Stunden
vor dem Ernten der Zellen in einer Dosis von 100 ng/ml appliziert wird. Der Einfluss der
Caspasen auf die TRAIL-vermittelte Cytochrom c-Freisetzung lässt sich hier ebenfalls durch
eine Vorbehandlung mit dem pan-Caspase-Inhibitor z-VAD-fmk nachweisen.
Nach Ablauf der entsprechenden Zeit werden die Zellen mithilfe von Trypsin/EDTA in
Röhrchen (15 ml) geerntet und zentrifugiert. Sie werden nun einmal mit PBS gewaschen und
danach in PBS mit 1 % Paraformaldehyd bei Raumtemperatur für 30 Minuten fixiert. Nach
der Fixierung werden die Zellen in 500 µl PBS mit 0,05 % Triton X 100, 2 %
Rinderserumalbumin und 10 µl Anti-Cytochrome c (6H2)-FITC (Stammlösung 200 µg/ml)
für 20 Minuten auf Eis permeabilisiert und dabei das zytosolische Cytochrom c mit dem
FITC-markierten Antikörper angefärbt. Nun wird noch zweimal mit PBS gewaschen und die
Zellsuspension letztendlich in 500 µl PBS auf Eis gehalten. Es kann anschließend die Analyse
der Zellen am FACSCalibur® erfolgen.
Die Anzahl der Zellen mit erhöht freigesetztem, also zytosolisch nachweisbarem Cytochrom c
wird hier ebenfalls in Prozent der Gesamtzellzahl angegeben.
- 59 -
3. Ergebnisse
3.
Ergebnisse
3.1.
Charakterisierung der Gapmer-Transfektion
von PC3-Zellen
3.1.1.
Aufnahme FITC-markierter Gapmere in PC3-Zellen
Zunächst wurde mit Hilfe Fluoreszeinisothiocyanat (FITC)-gekoppelter Gapmere am
Durchflusszytometer (FACSCalibur®) die Transfektionseffizienz bei PC3-Zellen bestimmt.
Als Transfektionsreagenz diente Argfectin-50, das eine besonders effiziente ODNTransfektion
von
PC3-Prostatakarzinomzellen
erlaubt.
Abbildung
8
zeigt
eine
konzentrationsabhängige Verschiebung der Fluoreszenz der gesamten Zellpopulation: bereits
bei einer ODN-Konzentration von nur 25 nM wurde eine nahezu restlose Transfektion der
Zellen erzielt.
Abb. 8:
Aufnahme FITC-markierter Gapmer-ODNs in PC3-Zellen.
Die Zellen wurden mit 25-50 nM FITC-ODNs transfiziert. 24 Stunden nach Transfektion
wurde die Fluoreszenz der Zellen mit dem Durchflusszytometer bestimmt. Dargestellt ist die
Fluoreszenz der Zellen im FL1-Kanal.
Linke Kurve: nicht transfizierte Zellen
Mittlere Kurve: mit 25 nM FITC-ODN transfizierte Zellen
Rechte Kurve: mit 50 nM FITC-ODN transfizierte Zellen
- 60 -
3. Ergebnisse
3.1.2.
Expressionsanalysen mittels „Real Time“ RT-PCR (TaqMan®)
Anschließend wurde mittels „Real Time“ RT-PCR (TaqMan®) untersucht, wie sich die
Transfektion von PC3-Prostatakarzinomzellen mit chimären Antisense-ODNs gegen PKCη,
Bcl-xL oder Bcl-2 auf deren mRNA-Expression auswirkt.
3.1.2.1.
PKCη-mRNA-Expression
Abbildung 9 A zeigt die Kinetik der Expression der PKCη-mRNA nach Behandlung mit dem
ETA-ASO. Die Verminderung der mRNA-Expression war zeitabhängig. Schon sechs
Stunden nach Transfektion zeigte sich eine knapp 60-prozentige Expressionsreduktion, die
nach 48 Stunden auf über 80 % gesteigert werden konnte. Das heißt, die Expression des
Zielproteins konnte auf unter 20 % des Ausgangsniveaus gesenkt werden.
Abb. 9 A:
Quantifizierung der PKCη-mRNA mittels „Real Time“ RT-PCR (TaqMan®), Kinetik.
Die PC3-Zellen wurden mit 50 nM ETA-ASO transfiziert, die RNA nach der angegebenen
Zeit präpariert. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte ± SD zweier unabhängiger
Bestimmungen, dargestellt als
Prozentsatz der Expression unbehandelter Zellen nach
Normalisierung auf 18s-rRNA.
- 61 -
3. Ergebnisse
Auch die Dosisabhängigkeit der Reduktion der PKCη-mRNA-Expression konnte sehr gut
gezeigt werden, wie in Abbildung 9 B dargestellt. Bei Transfektion der PC3-Zellen mit nur
12,5 nM des ETA-ASO konnte ein deutlicher Abfall in der mRNA-Expression beobachtet
werden. Das PKCη-mRNA-Niveau ließ sich mit 50 nM des AODN auf unter 20 % des
Ausgangswertes senken. Durch das Kontroll-ODN wurde die Expression der Ziel-mRNA
kaum beeinflusst.
Relative PKCη-mRNA-Expression (% der unbehandelten Zellen)
1 4 0
1 2 0
1 0 0
8 0
6 0
4 0
2 0
Abb. 9 B:
CONO
1 2 .5
50 nM
unbehandelt
0
E T A -A S O
2 5
5 0
(n M )
®
Quantifizierung der PKCη-mRNA mittels „Real Time“ RT-PCR (TaqMan ),
Dosisabhängigkeit.
Die PC3-Zellen wurden mit 12,5 bis 50 nM ETA-ASO transfiziert, die RNA nach 48 Stunden
präpariert. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte ± SD zweier unabhängiger Bestimmungen,
dargestellt als Prozentsatz der Expression unbehandelter Zellen nach Normalisierung auf 18srRNA.
3.1.2.2.
Bcl-xL-mRNA-Expression
Auch die Verminderung der Bcl-xL-mRNA-Expression war zeitabhängig. Dargestellt in
Abbildung 9 C zeigte sich, dass die Expression von Bcl-xL bereits sechs Stunden nach
Transfektion auf unter 50 % gesenkt wurde. Nach 48 Stunden konnte sie auch hier auf unter
20 % des Ausgangsniveaus gesenkt werden
- 62 -
Relative Bcl-xL-mRNA-Expression (% der unbehandelten Zellen)
3. Ergebnisse
Abb. 9 C:
120
100
80
60
40
20
0
0
3
6
12
24
48
Z e it n a c h T r a n s fe k tio n ( h )
Quantifizierung der Bcl-xL-mRNA mittels „Real Time“ RT-PCR (TaqMan®), Kinetik.
Die PC3-Zellen wurden mit 50 nM Bcl-xL-ASO transfiziert, die RNA nach der angegebenen
Zeit präpariert. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte ± SD zweier unabhängiger
Bestimmungen,
dargestellt
in
Prozent
der
Expression
unbehandelter
Zellen
nach
Normalisierung auf 18s-rRNA.
Um die Dosisabhängigkeit der mRNA-Expression zu zeigen, wurden die PC3-Zellen jeweils
für 48 Stunden mit unterschiedlichen Konzentrationen des Bcl-xL-ASO behandelt, wie in
Abbildung 9 D dargestellt. Auch hier zeigte sich schon bei der sehr niedrigen ODNKonzentration von 12,5 nM eine deutliche Reduktion der Bcl-xL-mRNA-Expression. Bei
Transfektion der Zellen mit 50 nM Bcl-xL-ASO konnte die mRNA-Expression auf weniger
als 20 % im Vergleich zu unbehandelten Zellen gesenkt werden. Es sollte beachtet werden,
dass der PCR-Primer nicht nur die Bcl-xL-, sondern auch die Bcl-xS-mRNA nachweist, die
aber durch das Bcl-xL-ASO unbeeinflusst bleibt. Die Bcl-xS-Expression in PC3-Zellen liegt
um 10 % der Bcl-xL-Expression (unveröffentlichte Daten). Durch Transfektion mit dem
Kontroll-ODN wurde die Expression der Ziel-mRNA auch hier nur minimal beeinflusst.
- 63 -
Abb. 9 D:
120
100
80
60
40
20
0
1 2 .5
B c l- x L - A S O
CONO
50 nM
6 .2 5
unbehandelt
Relative Bcl-xL-mRNA-Expression (% der unbehandelten Zellen)
3. Ergebnisse
25
50
(n M )
Quantifizierung der Bcl-xL-mRNA mittels „Real Time“ RT-PCR (TaqMan®),
Dosisabhängigkeit.
Die PC3-Zellen wurden mit 6,25 bis 50 nM Bcl-xL-ASO transfiziert, die RNA nach 48
Stunden präpariert. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte ± SD dreier unabhängiger
Bestimmungen, dargestellt als
Prozentsatz der Expression unbehandelter Zellen nach
Normalisierung auf 18s-rRNA.
3.1.2.3.
Bcl-2-mRNA-Expression
Auch für die Transfektion der Zellen mit dem Bcl-2-ASO zeigte sich eine dosisabhängige
Reduktion der mRNA-Expression. Während die Expression von Bcl-2 durch die Transfektion
mit 12,5 nM Bcl-2-ASO schon unter 40 % gesenkt wurde, konnte sie nach Transfektion mit
50 nM auf unter 20 %, verglichen mit den unbehandelten Zellen, gesenkt werden. Auch die
Bcl-2-mRNA-Expression wurde durch Transfektion mit dem Kontroll-ODN nur wenig
beeinflusst. Dies ist in Abbildung 9 E gezeigt.
- 64 -
Abb. 9 E:
1 6 0
1 4 0
1 2 0
1 0 0
8 0
6 0
4 0
2 0
0
CONO
50 nM
6 .2 5
unbehandelt
Relative Bcl-2-mRNA-Expression (% der unbehandelten Zellen)
3. Ergebnisse
1 2 .5
2 5
B c l- 2 - A S O
5 0
(n M )
Quantifizierung der Bcl-2-mRNA mittels „Real Time“ RT-PCR (TaqMan®),
Dosisabhängigkeit.
Die PC3-Zellen wurden mit 6,25 bis 50 nM Bcl-2-ASO transfiziert, die RNA nach 48 Stunden
präpariert. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte ± SD dreier unabhängiger Bestimmungen,
dargestellt als Prozentsatz der Expression unbehandelter Zellen nach Normalisierung auf 18srRNA.
3.1.3.
Expressionsanalysen mittels Western Blot
Korrespondierend zur Reduktion der mRNA-Expression konnte im Western Blot auch für die
Protein-Expression in AODN-behandelten Zellen eine deutliche Reduktion im Vergleich zu
unbehandelten oder Kontroll-ODN-transfizierten PC3-Zellen festgestellt werden. Kein oder
nur ein sehr minimaler Unterschied wurde durch die Transfektion mit dem Kontroll-ODN im
Vergleich zu unbehandelten Zellen hervorgerufen.
3.1.3.1.
PKCη-Protein-Expression
Die PKCη-Protein-Expression ist in Abbildung 10 A gezeigt. Es stellte sich eine signifikante
Reduktion der Expression bei ETA-ASO-transfizierten Zellen dar, während keine
Beeinflussung durch das Kontroll-ODN nachgewiesen werden konnte.
- 65 -
3. Ergebnisse
1
Abb. 10 A:
2
3
Western Blot-Analyse der PKCη-Protein-Expression.
Die PC3-Zellen wurden jeweils mit 50 nM ODN transfiziert, das zelluläre Gesamtprotein 48
Stunden nach Transfektion präpariert und jeweils 60 µg Protein auf einem 10 %Polyacrylamidgel aufgetrennt. Spur 1: unbehandelte Zellen, Spur 2: ETA-ASO-transfizierte
Zellen, Spur 3: CONO-transfizierte Zellen.
3.1.3.2.
Bcl-xL-Protein-Expression
In Abbildung 10 B ist die Western Blot-Analyse von Bcl-xL in PC3-Zellen nach Behandlung
mit Antisense-Oligonukleotiden dargestellt. Man sieht einen signifikanten Abfall der
Proteinexpression nach Transfektion mit dem Bcl-xL-ASO im Vergleich zu unbehandelten
Zellen bzw. zu Kontroll-ODN-transfizierten Zellen.
11
Abb. 10 B:
22
33
Western Blot-Analyse der Bcl-xL-Protein-Expression.
Die PC3-Zellen wurden jeweils mit 50 nM ODN transfiziert, das zelluläre Gesamtprotein 48
Stunden
nach Transfektion präpariert und jeweils 30 µg Protein auf einem 10 %-
Polyacrylamidgel aufgetrennt. Spur 1: unbehandelte Zellen, Spur 2: CONO-transfizierte
Zellen, Spur 3: Bcl-xL-ASO-transfizierte Zellen.
3.1.3.3.
Bcl-2-Protein-Expression
Für die Suppression der Bcl-2-Protein-Expression zeigte sich ein ähnliches Bild, dargestellt in
Abbildung 10 C. Die Transfektion mit dem Bcl-2-ASO bewirkte eine deutliche Reduktion der
Expression gegenüber unbehandelten oder Kontroll-ODN-transfizierten Zellen.
- 66 -
3. Ergebnisse
1
Abb. 10 C:
2
3
Western Blot-Analyse der Bcl-2-Protein-Expression.
Die PC3-Zellen wurden jeweils mit 50 nM ODN transfiziert, das zelluläre Gesamtprotein 48
Stunden nach Transfektion präpariert und jeweils 30 µg Protein auf einem 10 %Polyacrylamidgel aufgetrennt. Spur 1: unbehandelte Zellen, Spur 2: CONO-transfizierte
Zellen, Spur 3: Bcl-2-ASO-transfizierte Zellen.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass mit dem Gapmer-AODN/Argfectin-50Transfektionsverfahren ein hocheffizientes System zur Suppression der Expression von
möglichen Resistenzfaktoren in PC3-Zellen zur Verfügung steht. In den in der einschlägigen
Literatur zu Antisense-ODNs beschriebenen Methoden werden in der Regel mindestens 200
nM bis über 1 µM AODNs eingesetzt, während hier mit lediglich 50 nM AODNs schon sehr
wirkungsvolle Suppressionen erzielt werden. Somit sind an PC3-Zellen hochspezifische
Proteinsuppressionen sowie die Analyse ihrer Folgen bei gleichzeitiger Reduzierung der
unspezifischen Nebenwirkungen möglich.
3. 2.
Funktionelle Analysen nach Transfektion
von PC3-Zellen mit Gapmer-AODNs
3.2.1.
Auswirkungen der Suppression der PKCη
3.2.1.1.
Zytotoxizitätstest (Alamar Blue™-Assay) nach Suppression der PKCη
In den ersten Experimenten zur Auswirkung des „Knock-downs“ der PKCη wurde die
Zellviabilität der PC3-Zellen mittels Alamar Blue™ gemessen. Wie im Kapitel „Material und
Methoden“ beschrieben, wird im Alamar Blue™-Assay die metabolische Aktivität der
Zellkultur, die proportional zur Viabilität ist, bestimmt. Die PC3-Zelle, die als prinzipiell
TRAIL-sensibel beschrieben ist, wurde vor und nach Suppression der Expression der PKCη
mit TRAIL behandelt.
Die Abbildung 11 A zeigt die Kinetik der Wirkung von 100 ng/ml TRAIL. Nach der
Applikation von TRAIL konnte eine zeitabhängige zytotoxische Wirkung beobachtet werden,
die durch Transfektion der PC3-Zellen mit ETA-ASO deutlich verstärkt werden konnte.
- 67 -
3. Ergebnisse
110
unbehandelt
CONO
ETA-ASO
Zellviabiltät (% der unbehandelten Zellen)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
3
6
9
12
15
18
21
24
Zeit nach Applikation von 100 ng/ml TRAIL (h)
Abb. 11 A:
Zytotoxische Wirkung von TRAIL auf PC3-Zellen nach Suppression der PKCη (Alamar
Blue™-Assay), Kinetik.
Die PC3-Zellen wurden nach der Transfektion mit jeweils 50 nM der ODNs mit 100 ng/ml
TRAIL für unterschiedliche Zeiten behandelt. Die Zellviabilität wurde mit dem Alamar
Blue™-Assay bestimmt. Sie ist angegeben als Verhältnis der Absorption von behandelten zu
unbehandelten Zellen. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte von 2 unabhängigen 3-fachBestimmungen.
Zur Untersuchung der Dosisabhängigkeit des TRAIL-Effekts wurden die Zellen 48 Stunden
nach Transfektion für weitere 24 Stunden mit verschiedenen TRAIL-Konzentrationen
behandelt, wie in Abbildung 11 B dargestellt ist. Nicht transfizierte Zellen zeigten nur eine
geringe Einschränkung der Viabilität durch hohe Dosen von TRAIL. Im Gegensatz dazu
evozierte TRAIL in Zellen, die mit dem ETA-ASO behandelt worden waren, einen deutlichen
dosisabhängigen zytotoxischen Effekt mit 50 % toten Zellen bei 300 ng/ml TRAIL. Man
beachte, dass schon in den Zellen, die nur mit dem ETA-ASO transfiziert wurden, die
- 68 -
3. Ergebnisse
Zellviabilität signifikant reduziert war, was auf einen protektiven Effekt der PKCη gegen den
spontanen Zelltod in PC3-Zellen hindeutet.
Zellviabilität (% der unbehandelten Zellen)
**
**
100
**
**
80
60
unbehandelt
CONO
ETA-ASO
40
20
Abb. 11 B:
AI
L
/m
lT
R
AI
L
ng
/m
lT
R
0
30
10
30
0
ng
ng
/m
lT
Ko
R
nt
ro
AI
L
lle
0
Zytotoxische Wirkung von TRAIL auf PC3-Zellen nach Suppression der PKCη (Alamar
Blue™-Assay), Dosisabhängigkeit.
Die PC3-Zellen wurden 48 Stunden nach Transfektion mit jeweils 50 nM des ODNs für 24
Stunden mit verschiedenen Konzentrationen von TRAIL behandelt. Die Zellviabilität wurde
mit dem Alamar Blue™-Assay bestimmt. Sie ist angegeben als Verhältnis der Absorption von
behandelten zu unbehandelten Zellen. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte ± SD von 4
unabhängigen 3-fach-Bestimmungen. (**p < 0.01)
Um die molekularen Folgen der Suppression der PKCη und die TRAIL-Antwort der PC3Zellen besser charakterisieren zu können, wurde anschließend untersucht, inwieweit die
beobachteten Effekte Caspase-abhängig waren, also der Apoptose zuzuordnen sind. Dies
geschah mit Hilfe des Breitsprektrum-Caspase-Inhibitors z-VAD-fmk, der eine Reihe
verschiedener Caspasen, darunter auch Caspase 8 und 3, irreversibel inhibiert. Die Abbildung
11
C
zeigt,
dass
sich
die
TRAIL-Wirkung
in
ETA-ASO-behandelten
Zellen
konzentrationsabhängig durch z-VAD-fmk blockieren ließ. Die Verstärkung der TRAILWirkung in transfizierten Zellen ist also ein Caspase-abhängiger Effekt.
- 69 -
3. Ergebnisse
Zellviabilität (% der unbehandelten Zellen)
100
ETA-ASO
ETA-ASO + 300 ng/ml TRAIL
80
60
40
20
k
-fm
D
-f m
z-
VA
VA
D
10
µM
3
µM
z-
zµM
1
0.
Abb. 11 C:
k
k
VA
D
AD
µM
zV
Ko
3
-f m
-f m
k
nt
ro
lle
0
Dosisabhängige Reduktion des TRAIL-induzierten Zelltodes in PKCη-supprimierten
Zellen durch z-VAD-fmk (Alamar Blue™-Assay).
Die PC3-Zellen wurden 47 h nach Transfektion mit 0-10 µM z-VAD-fmk, 1 h später mit 300
ng/ml TRAIL behandelt. Die Zellviabilität wurde nach einer Inkubation von weiteren 24 h mit
dem Alamar Blue™-Assay bestimmt. Sie ist angegeben als Verhältnis der Absorption von
behandelten zu unbehandelten Zellen. Es sind die Mittelwerte ± SD von 2 unabhängigen 3fach-Bestimmungen gezeigt.
In Abbildung 11 D zeigt sich, dass unbehandelte und ausschließlich mit TRAIL behandelte
Zellen von z-VAD-fmk profitierten, während die Viabilität der ausschließlich transfizierten
Zellen durch z-VAD-fmk nicht beeinflusst wurde und niedriger blieb als in untransfizierten
Zellen.
- 70 -
3. Ergebnisse
Zellviabilität (% der unbehandelten Zellen)
140
**
120
100
80
60
40
20
0
300 ng/ml TRAIL
ETA-ASO
10 µM z-VAD-fmk
Abb. 11 D:
-
+
+
-
+
+
+
-
+
+
+
+
-
+
+
+
Reduktion des TRAIL-induzierten Zelltodes in PKCη-supprimierten Zellen durch zVAD-fmk (Alamar Blue™-Assay).
Die PC3-Zellen wurden 47 h nach Transfektion zum Teil mit 10 µM z-VAD-fmk, 1 h später
zum Teil mit 300 ng/ml TRAIL behandelt. Die Zellviabilität wurde nach einer Inkubation von
weiteren 24 h mit dem Alamar Blue™-Assay bestimmt. Sie ist angegeben als Verhältnis der
Absorption von behandelten zu unbehandelten Zellen. Es sind die Mittelwerte ± SD von 2
unabhängigen 3-fach-Bestimmungen gezeigt. (**p < 0.01)
3.2.1.2.
Zellzyklusanalyse nach Suppression der PKCη
Eine andere Möglichkeit, den Zelltod zu quantifizieren, ist die Zellzyklusanalyse mittels
Durchflusszytometrie. Apoptotische Zellen haben durch die DNA-Fragmentierung einen
niedrigeren DNA-Gehalt als nicht apoptotische Zellen. Nach Anfärbung der DNA in
ethanolfixierten Zellen mittels Propidiumjodid kann mittels Durchflusszytometrie die
Intensität der Fluoreszenz der Zellen bestimmt werden und damit die Menge der DNA im
Kern der einzelnen Zellen im Vergleich zueinander quantifiziert werden. Normale, lebende
Zellen in der G1-Phase des Zellzyklus bilden den größten Anteil der gesunden Zellpopulation
und sind als diploider Peak zu identifizieren. Eine höhere Fluoreszenz haben Zellen in der
Synthesephase und tetraploide Zellen in der G2-Phase des Zellzyklus. Hypodiploide Zellen,
also auch apoptotische Zellen zeigen, bedingt durch den niedrigeren DNA-Gehalt, eine
geringere Fluoreszenzintensität.
- 71 -
3. Ergebnisse
Zur Quantifizierung des Zelltodes nach „Knock-down“ der PKCη wurde eine solche
Zellzyklusanalyse durchgeführt. Es konnte gezeigt werden, dass Zellen, in denen die PKCη
mittels Antisense-Transfektion supprimiert ist, sehr viel sensibler auf die TRAIL-vermittelte
Zytotoxizität reagieren. In Abbildung 12 A ist der synergistische Effekt von PKCηSuppression und TRAIL-Behandlung in PC3-Zellen in Abhängigkeit von der TRAILInkubationszeit dargestellt.
30
untbehandelt
CONO
ETA-ASO
Apoptotische Zellen (%)
25
20
15
10
5
0
0
6
12
18
24
Zeit nach Applikation von 100 ng/ml TRAIL (h)
Abb. 12 A:
Zytotoxische Wirkung von TRAIL auf PC3-Zellen nach Suppression der PKCη (Zellzyklusanalyse), Kinetik.
Die PC3-Zellen wurden nach der Transfektion mit jeweils 50 nM der ODNs mit 100 ng/ml
TRAIL für unterschiedliche Zeiten behandelt. Der Anteil apoptotischer Zellen wurde als
hypodiploider Peak in der Zellzyklusanalyse am Durchflusszytometer detektiert und in Prozent
der Gesamtpopulation dargestellt. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte von 2 unabhängigen
Bestimmungen.
Ebenso konnte eine Dosisabhängigkeit der Wirkung von TRAIL festgestellt werden.
Abbildung 12 B zeigt, dass in untransfizierten und Kontroll-ODN-transfizierten Zellen nach
- 72 -
3. Ergebnisse
24 Stunden mit 100 ng/ml TRAIL nur 12 % der Zellen apoptotisch waren. Hingegen konnte
in ETA-ASO-transfizierten Zellen fast eine Verdopplung auf 23 % apoptotische Zellen
erreicht werden. Auch hieraus kann, aufgrund des leichten Anstiegs der hypodiploiden
Zellpopulation nach ausschließlicher Transfektion mit ETA-ASO, ein protektiver Effekt der
PKCη gegen einen spontanen Zelltod angenommen werden.
30
**
Apoptotische Zellen (%)
25
20
*
15
unbehandelt
CONO
ETA-ASO
10
5
AI
L
AI
L
R
10
0
30
ng
ng
/m
/m
lT
lT
lT
10
ng
/m
Ko
Abb. 12 B:
R
R
nt
ro
AI
L
lle
0
Zytotoxische Wirkung von TRAIL auf PC3-Zellen nach Suppression der PKCη (Zellzyklusanalyse), Dosisabhängigkeit.
Die PC3-Zellen wurden nach der Transfektion mit jeweils 50 nM der ODNs mit 10-100 ng/ml
TRAIL für 24 Stunden behandelt. Der Anteil apoptotischer Zellen wurde als hypodiploider
Peak in der Zellzyklusanalyse am Durchflusszytometer detektiert und in Prozent der
Gesamtpopulation dargestellt. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte ± SD von 3 unabhängigen
Bestimmungen. (*p < 0.05, ** < 0.01)
Es wurde anschließend mittels Caspase 3-Inhibitor z-DEVD-fmk überprüft, ob der in der
Zellzyklusanalyse beobachtete TRAIL-vermittelte Zelltod Caspase 3-abhängig ist. 47 Stunden
nach Transfektion der Zellen und genau eine Stunde vor TRAIL-Applikation wurde z-DEVDfmk auf die Zellen gegeben. In Abbildung 12 C ist dargestellt, dass ETA-ASO-transfizierte
Zellen von der Hemmung der Caspase 3 stark profitieren. Der Anteil apoptotischer Zellen
konnte nahezu auf den Ausgangswert, der in der ausschließlich transfizierten Zellkultur
- 73 -
3. Ergebnisse
gemessen wurde, reduziert werden. Der verbliebene Effekt von TRAIL könnte durch eine
Restaktivität der Caspase 3 oder alternativ durch Aktivierung der Caspasen 6 oder 7 erklärt
werden.
*
30
Apoptotische Zellen (%)
25
20
15
10
5
0
100 ng/ml TRAIL
ETA-ASO
20 µM z-DEVD-fmk
Abb. 12 C:
+
-
+
+
-
+
+
+
Reduktion des TRAIL-induzierten Zelltodes in PC3-Zellen durch z-DEVD-fmk nach
Suppression der PKCη (Zellzyklusanalyse).
Die PC3-Zellen wurden 47 Stunden nach Transfektion mit 50 nM des ODNs mit 20 µM zDEVD-fmk behandelt, eine Stunde später wurden 100 ng/ml TRAIL appliziert. Der Anteil
apoptotischer Zellen wurde als hypodiploider Peak in der Zellzyklusanalyse am
Durchflusszytometer 24 Stunden nach TRAIL-Applikation detektiert und in Prozent der
Gesamtpopulation dargestellt. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte ± SD von 2 unabhängigen
Bestimmungen. (*p < 0.05)
3.2.1.3.
TRAIL-induzierte Caspase 3-Aktivierung nach Suppression der PKCη
Die Aktivierung von Caspasen wird als zentraler Punkt in der Apoptose vieler Zellen
beschrieben (Shi, 2002). Nach dem Nachweis der Beteiligung der Caspase 3 am TRAILinduzierten Zelltod erschien es sinnvoll, die Aktivierung derselben während der TRAILinduzierten Apoptose der PC3-Zellen zu untersuchen. Es zeigte sich, dass durch „Knock- 74 -
3. Ergebnisse
down“ der PKCη die TRAIL-induzierte Caspase 3-Aktivität in PC3-Zellen vervielfacht
werden konnte. In Abbildung 13 A ist die Kinetik der Caspase 3-Aktivierung nach TRAILApplikation gezeigt. Nach Zugabe von 100 ng/ml TRAIL erreichte die Caspase 3-Aktivität in
den ETA-ASO-transfizierten Zellen schon nach zwei Stunden ein Maximum und war nach 24
Stunden wieder nahezu auf den Ausgangswert abgefallen. Bemerkenswert ist, dass in
untransfizierten Zellen das Maximum der Caspase 3-Aktivierung erst nach circa vier Stunden
erreicht wurde.
25
unbehandelt
CONO
ETA-ASO
Relative Caspase-3-Aktivität
20
15
10
5
0
0
4
8
12
16
20
24
Zeit nach Applikation von 100 ng/ml TRAIL (h)
Abb. 13 A:
TRAIL-induzierte Caspase 3-Aktivierung in PC3-Zellen nach Suppression der PKCη,
Kinetik.
Die PC3-Zellen wurden nach der Transfektion mit jeweils 50 nM des ODNs mit 100 ng/ml
TRAIL für unterschiedliche Zeiten behandelt. Anschließend wurden die Caspase 3-Aktivitäten
gemessen. Sie sind angegeben als Verhältnis der Aktivitäten von behandelten zu unbehandelten
Zellen. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte von 2 unabhängigen Bestimmungen.
Zur Bestimmung der Dosisabhängigkeit der TRAIL-induzierten Caspase 3-Aktivierung
wurden die Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen von TRAIL behandelt und die
- 75 -
3. Ergebnisse
Caspase 3-Aktivität nach einer mittleren Zeit von dreieinhalb Stunden bestimmt, wie in
Abbildung 13 B dargestellt ist. Nach Transfektion mit dem AODN gegen PKCη wurde durch
100 ng/ml TRAIL ein mehr als 20-facher Anstieg der Caspase 3-Aktivität gegenüber
unbehandelten Zellen erreicht. In den Zellen, die untransfiziert waren bzw. mit dem KontrollODN transfiziert wurden, konnte hingegen nur ein Anstieg auf maximal das 12-fache des
Ausgangswertes in unbehandelten Zellen erreicht werden. Bereits in ausschließlich ETAASO-transfizierten Zellen konnte ein Anstieg der Caspase 3-Aktivität beobachtet werden, was
als Anstieg der spontanen Apoptoserate bei Fehlen von PKCη gewertet werden kann.
25
*
unbehandelt
CONO
ETA-ASO
Relative Caspase-3-Aktivität
20
15
10
5
m
ng
/
10
0
30
ng
/m
lT
lT
R
R
AI
L
le
ro
l
Ko
nt
Abb. 13 B:
AI
L
0
TRAIL-induzierte Caspase 3-Aktivierung in PC3-Zellen nach Suppression der PKCη,
Dosisabhängigkeit.
Die PC3-Zellen wurden 48 h nach Transfektion mit jeweils 50 nM des ODNs für 3,5 h mit 0100 ng/ml TRAIL behandelt. Die Caspase 3-Aktivitäten sind angegeben als Verhältnis der
Aktivitäten von behandelten zu unbehandelten Zellen. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte ±
SD von 4 unabhängigen Bestimmungen. (*p < 0.05)
- 76 -
3. Ergebnisse
3.2.1.4.
TRAIL-induzierte Depolarisation der Mitochondrienmembranen
nach Suppression der PKCη
TRAIL triggert
durch
frühe Permeabilisierung der Mitochondrienmembranen
mit
anschließender Freisetzung von Cytochrom c ins Zytosol und damit einhergehender Caspase
9-Aktivierung die Apoptose auch über den mitochondrialen Weg (Walczak and Krammer,
2000; Yamada et al., 1999; Walczak et al., 2000). Durch Anfärbung der Zellen mit DiOC6(3),
das in intakten Mitochondrien akkumuliert, kann die Depolarisation der mitochondrialen
Membranen am Durchflusszytometer nachgewiesen werden. Abbildung 14 A zeigt die
Kinetik der TRAIL-Wirkung auf das mitochondriale Membranpotential ∆ψm.
60
unbehandelt
CONO
ETA-ASO
∆ψm Verlust (% der Zellen)
50
40
30
20
10
0
0
6
12
18
24
Zeit nach Applikation von 100 ng/ml TRAIL (h)
Abb. 14 A:
TRAIL-induzierte Depolarisation der Mitochondrienmembranen nach Suppression der
PKCη, Kinetik.
Die PC3-Zellen wurden nach der Transfektion mit jeweils 50 nM der ODNs mit 100 ng/ml
TRAIL für die angegebene Zeit behandelt. Der Anteil der Zellen, deren mitochondriale
Membranen depolarisiert sind, ist in Prozent der Gesamtpopulation angegeben. Das Diagramm
zeigt die Mittelwerte von 2 unabhängigen Bestimmungen.
- 77 -
3. Ergebnisse
In den Kontrollzellen konnte nach 12 Stunden Inkubation mit 100 ng/ml TRAIL eine
schwache Abnahme des mitochondrialen Membranpotentials ∆ψm beobachtet werden. Im
Gegensatz dazu provozierte TRAIL in PKCη-supprimierten Zellen einen sehr starken ∆ψmAbfall bereits nach drei Stunden Inkubationszeit.
Die Dosisabhängigkeit der TRAIL-Wirkung auf die Mitochondrienmembranen ist in
Abbildung 14 B dargestellt. 24 Stunden nach der Applikation von 300 ng/ml TRAIL kam es
in weniger als 20 % der untransfizierten bzw. Kontroll-ODN-transfizierten Zellen, hingegen
in über 50 % der PKCη-supprimierten Zellen, zur Depolarisation der mitochondrialen
Membranen.
*
80
unbehandelt
CONO
ETA-ASO
*
∆ψm Verlust (% der Zellen)
60
40
20
Abb. 14 B:
L
R
/m
0
30
10
0
ng
ng
/m
Ko
lT
lT
R
nt
ro
AI
AI
L
lle
0
TRAIL-induzierte Depolarisation der Mitochondrienmembranen nach Suppression der
PKCη, Dosisabhängigkeit.
Die PC3-Zellen wurden nach der Transfektion mit jeweils 50 nM der ODNs mit 0-300 ng/ml
TRAIL für 24 Stunden behandelt. Der Anteil der Zellen, deren mitochondriale Membranen
depolarisiert sind, ist in Prozent der Gesamtpopulation angegeben. Das Diagramm zeigt die
Mittelwerte ± SD von 4 unabhängigen Bestimmungen. (*p < 0.05)
- 78 -
3. Ergebnisse
Wie in Abbildung 14 C gezeigt, verhinderte der pan-Caspase-Inhibitor z-VAD-fmk in einer
Konzentration von 10 µM die TRAIL-induzierte Mitochondriendepolarisation. Dies zeigt
also, dass die Apoptosefunktion der Mitochondrien nach Suppression der PKCη in PC3Zellen prinzipiell Caspase-abhängig ist.
*
60
∆ψm Verlust (% der Zellen)
50
40
30
20
10
0
100 ng/ml TRAIL
ETA-ASO
10 µM z-VAD-fmk
Abb. 14 C:
-
+
-
+
+
+
-
+
+
+
+
-
+
+
+
Reduktion der TRAIL-induzierten Mitochondriendepolarisation durch z-VAD-fmk nach
Suppression der PKCη.
Die PC3-Zellen wurden 47 Stunden nach Transfektion mit 50 nM der ODNs mit 10 µM zVAD-fmk behandelt, eine Stunde später wurden 100 ng/ml TRAIL appliziert und für 24
Stunden inkubiert. Der Anteil der Zellen, deren mitochondriale Membranen depolarisiert sind,
ist in Prozent der Gesamtpopulation angegeben. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte ± SD von
3 unabhängigen Bestimmungen. (*p < 0.05)
3.2.1.5.
TRAIL-induzierte Cytochrom c-Freisetzung nach Suppression der PKCη
Um festzustellen, ob der Verlust des mitochondrialen Membranpotentials ∆ψm mit der
Freisetzung proapoptotischer Faktoren aus den Mitochondrien assoziiert ist, wurde das
zytosolische Cytochrom c mittels FITC-markierter Antikörper in ethanolfixierten Zellen am
Durchflusszytometer quantifiziert. In Abbildung 15 A ist dargestellt, dass die Behandlung mit
100 ng/ml TRAIL zeitabhängig zur Freisetzung von Cytochrom c ins Zytosol führte. In den
Kontrollproben führte die 24-stündige TRAIL-Behandlung zu einem Anstieg des zytosolisch
- 79 -
3. Ergebnisse
nachgewiesenen Cytochrom c von fünf auf circa 20 %. Dieser Anteil konnte in ETA-ASOtransfizierten Zellen auf über 60 % gesteigert werden.
70
unbehandelt
CONO
ETA-ASO
Cytochrom c-Freisetzung (% der Zellen)
60
50
40
30
20
10
0
0
6
12
18
24
Zeit nach Applikation von 100 ng/ml TRAIL (h)
Abb. 15 A:
TRAIL-induzierte Cytochrom c-Freisetzung nach Suppression der PKCη, Kinetik.
Die PC3-Zellen wurden nach der Transfektion mit jeweils 50 nM der ODNs mit 100 ng/ml
TRAIL für die angegebene Zeit behandelt. Der Anteil der Zellen, die durch FITC-antiCytochrom c-Antikörper markiert wurden, ist in Prozent der Gesamtpopulation angegeben.
Das Diagramm zeigt die Mittelwerte von 2 unabhängigen Bestimmungen.
Die TRAIL-vermittelte Cytochrom c-Freisetzung konnte, wie in Abbildung 15 B gezeigt ist,
mit 10 µM z-VAD-fmk fast vollständig blockiert werden. Auch dies ist ein Indikator dafür,
dass die Mitochondrienbeteiligung an der Apoptose in PC3-Zellen nach PKCη-Suppression
streng Caspase-abhängig ist.
- 80 -
3. Ergebnisse
Cytochrom c-Freisetzung (% der Zellen)
100
80
60
40
20
0
100 ng/ml TRAIL
ETA-ASO
10 µM z-VAD-fmk
Abb. 15 B:
-
+
-
+
+
+
-
+
+
-
+
+
+
Reduktion der TRAIL-induzierten Cytochrom c-Freisetzung durch z-VAD-fmk nach
Suppression der PKCη.
Die PC3-Zellen wurden 47 Stunden nach der Transfektion mit jeweils 50 nM der ODNs mit 10
µM z-VAD-fmk behandelt, eine Stunde später wurden 100 ng/ml TRAIL appliziert und für
weitere 24 Stunden inkubiert. Der Anteil der Zellen, die durch FITC-anti-Cytochrom cAntikörper markiert wurden, ist in Prozent der Gesamtpopulation angegeben. Das Diagramm
zeigt die Mittelwerte ± SD von 2 unabhängigen Bestimmungen.
3.2.2.
Auswirkungen der Suppression von Bcl-xL oder Bcl-2
3.2.2.1.
Zytotoxizitätstest (Alamar Blue™-Assay) nach Suppression
von Bcl-xL oder Bcl-2
Auch nach dem „Knock-down“ von Bcl-xL oder Bcl-2 wurde die Zellviabilität der PC3Zellen mittels Alamar Blue™ gemessen. Die Abbildung 16 A zeigt die Kinetik der Wirkung
von 100 ng/ml TRAIL auf die Zellviabilität von PC3-Zellen. Nach der Applikation von
TRAIL konnte eine zeitabhängige zytotoxische Wirkung beobachtet werden, die durch
Transfektion der Zellen mit Bcl-xL-ASO deutlich verstärkt werden konnte. Unerwartet hatte
die Transfektion mit dem Bcl-2-ASO keinerlei Auswirkungen auf die Sensibilität der PC3Zellen gegenüber dem zytotoxischen Effekt von TRAIL.
- 81 -
3. Ergebnisse
110
unbehandelt
CONO
Bcl-xL-ASO
Bcl-2-ASO
Zellviabiltät (% der unbehandelten Zellen)
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
0
3
6
9
12
15
18
21
24
Zeit nach Applikation von 100 ng/ml TRAIL (h)
Abb. 16 A:
Zytotoxische Wirkung von TRAIL auf PC3-Zellen nach Suppression von Bcl-xL oder
Bcl-2 (Alamar Blue™-Assay), Kinetik.
Die PC3-Zellen wurden nach der Transfektion mit jeweils 50 nM der ODNs mit 100 ng/ml
TRAIL für unterschiedliche Zeiten behandelt. Die Zellviabilität wurde mit dem Alamar
Blue™-Assay bestimmt. Sie ist angegeben als Verhältnis der Absorption von behandelten zu
unbehandelten Zellen. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte von 2 unabhängigen 3-fachBestimmungen.
Zur Untersuchung der Dosisabhängigkeit des TRAIL-Effekts wurden die Zellen 48 Stunden
nach Transfektion für weitere 24 Stunden mit verschiedenen TRAIL-Konzentrationen
behandelt, wie in Abbildung 16 B dargestellt ist. Es wird deutlich, dass die Zellviabilität in
untransfizierten Zellen nur bei Behandlung mit hohen Dosen von TRAIL beeinträchtigt
wurde. Im Gegensatz dazu vermittelte TRAIL in Bcl-xL-ASO-transfizierten Zellen einen
deutlichen konzentrationsabhängigen zytotoxischen Effekt. Bei 300 ng/ml TRAIL konnte eine
über 50-prozentige Reduktion der Viabilität beobachtet werden. Man beachte dabei, dass auch
schon in den Zellen, die nur mit dem Bcl-xL-ASO behandelt worden sind, die Zellviabilität
- 82 -
3. Ergebnisse
deutlich reduziert war. Dies spricht dafür, dass Bcl-xL ein Schutzfaktor gegen einen
spontanen Zelltod sein könnte. Auch hier zeigte sich, dass die Transfektion der Zellen mit
dem Bcl-2-ASO fast keine Auswirkungen auf den TRAIL-Effekt hatte.
*
Zellviabilität (% der unbehandelten Zellen)
100
**
**
80
60
unbehandelt
CONO
Bcl-xL-ASO
Bcl-2-ASO
40
20
Abb. 16 B:
AI
L
AI
L
30
0
ng
/m
lT
ng
/m
lT
10
0
R
R
AI
L
R
ng
/m
lT
30
Ko
nt
ro
lle
0
Zytotoxische Wirkung von TRAIL auf PC3-Zellen nach Suppression von Bcl-xL oder
Bcl-2 (Alamar Blue™-Assay), Dosisabhängigkeit.
Die PC3-Zellen wurden 48 Stunden nach Transfektion mit jeweils 50 nM des ODNs für 24
Stunden mit verschiedenen Konzentrationen von TRAIL behandelt. Die Zellviabilität wurde
mit dem Alamar Blue™-Assay bestimmt. Sie ist angegeben als Verhältnis der Absorption von
behandelten zu unbehandelten Zellen. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte ± SD von 4
unabhängigen 3-fach-Bestimmungen. (*p < 0.05, **p < 0.01)
Um einen genaueren Einblick in die molekularen Folgen der Suppression von Bcl-xL auf die
TRAIL-Antwort von PC3-Zellen zu erhalten, wurde auch hier überprüft, inwieweit die
beobachteten Effekte Caspase-abhängig waren, also als Apoptose zu charakterisieren sind.
Dies geschah wiederum mit Hilfe des pan-Caspase-Inhibitors z-VAD-fmk.
Die synergistische Wirkung von Bcl-xL-Suppression und TRAIL-Behandlung lässt sich in
einen Caspase-abhängigen und einen Caspase-unabhängigen Anteil differenzieren. Die
Abbildung 16 C zeigt, dass sich die TRAIL-Wirkung in Bcl-xL-ASO-behandelten Zellen
konzentrationsabhängig durch z-VAD-fmk komplett aufheben ließ. Die Verstärkung der
TRAIL-Wirkung in transfizierten Zellen ist also ein Caspase-abhängiger Effekt.
- 83 -
3. Ergebnisse
Zellviabilität (% der unbehandelten Zellen)
120
Bcl-xL-ASO
Bcl-xL-ASO + 300 ng/ml TRAIL
100
80
60
40
20
Abb. 16 C:
µM
10
µM
3
z-
z-
VA
VA
D
-fm
D
- fm
k
k
k
D
- fm
z-
µM
1
0.
3
µM
zVA
VA
D
Ko
nt
- fm
ro
k
lle
0
Dosisabhängige Reduktion des TRAIL-induzierten Zelltodes in Bcl-xL-supprimierten
Zellen durch z-VAD-fmk (Alamar Blue™-Assay).
Die PC3-Zellen wurden 47 h nach Transfektion mit 0-10 µM z-VAD-fmk, 1 h später mit 300
ng/ml TRAIL behandelt. Die Zellviabilität wurde nach einer Inkubation von weiteren 24 h mit
dem Alamar Blue™-Assay bestimmt. Sie ist angegeben als Verhältnis der Absorption von
behandelten zu unbehandelten Zellen. Es sind die Mittelwerte ± SD von 2 unabhängigen 3fach-Bestimmungen gezeigt.
Caspase-unabhängig scheint dagegen die Reduktion der Zellviabilität durch Bcl-xLKnockdown selbst zu sein. Abbildung 16 D zeigt, dass unbehandelte und nur mit TRAIL
behandelte Zellen von z-VAD-fmk profitierten, während die Viabilität der ausschließlich
transfizierten Zellen durch z-VAD-fmk nicht beeinflusst wurde und niedriger blieb als in
untransfizierten Zellen.
- 84 -
3. Ergebnisse
140
Zellviabilität (% der unbehandelten Zellen)
**
120
100
80
60
40
20
0
300 ng/ml TRAIL
Bcl-xL-ASO
10 µM z-VAD-fmk
Abb. 16 D:
-
+
+
-
+
+
+
-
+
+
+
+
-
+
+
+
Reduktion des TRAIL-induzierten Zelltodes in Bcl-xL-supprimierten Zellen durch zVAD-fmk (Alamar Blue™-Assay).
Die PC3-Zellen wurden 47 h nach Transfektion zum Teil mit 10 µM z-VAD-fmk, 1 h später
zum Teil mit 300 ng/ml TRAIL behandelt. Die Zellviabilität wurde nach einer Inkubation von
weiteren 24 h mit dem Alamar Blue™-Assay bestimmt. Sie ist angegeben als Verhältnis der
Absorption von behandelten zu unbehandelten Zellen. Es sind die Mittelwerte ± SD von 2
unabhängigen 3-fach-Bestimmungen gezeigt. (**p < 0.01)
3.2.2.2.
Zellzyklusanalyse nach Suppression von Bcl-xL oder Bcl-2
In der Zellzyklusanalyse konnte gezeigt werden, dass Zellen, in denen Bcl-xL mittels
Antisense-Transfektion supprimiert ist, sehr viel sensibler auf die TRAIL-vermittelte
Zytotoxizität reagieren. In Abbildung 17 A ist der synergistische Effekt von Bcl-xL-„Knockdown“ und TRAIL-Wirkung in PC3-Zellen in Abhängigkeit von der Inkubationszeit von
TRAIL dargestellt.
- 85 -
3. Ergebnisse
50
unbehandelt
CONO
Bcl-xL-ASO
Bcl-2-ASO
Apoptotische Zellen (%)
40
30
20
10
0
0
6
12
18
24
Zeit nach Applikation von 100 ng/ml TRAIL (h)
Abb. 17 A:
Zytotoxische Wirkung von TRAIL auf PC3-Zellen nach Suppression von Bcl-xL oder
Bcl-2 (Zellzyklusanalyse), Kinetik.
Die PC3-Zellen wurden nach der Transfektion mit jeweils 50 nM der ODNs mit 100 ng/ml
TRAIL für unterschiedliche Zeiten behandelt. Der Anteil apoptotischer Zellen wurde als
hypodiploider Peak in der Zellzyklusanalyse am Durchflusszytometer detektiert und in Prozent
der Gesamtpopulation dargestellt. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte von 2 unabhängigen
Bestimmungen.
Auch hier war die Wirkung von TRAIL abhängig von der Dosis, in der es auf die PC3-Zellen
einwirkte. Abbildung 17 B zeigt einen signifikanten Anstieg des Anteils an apoptotischen
Zellen nach Suppression von Bcl-xL und anschließender TRAIL-Behandlung von weniger als
15 % in den Kontrollzellen auf über 40 % in Bcl-xL-supprimierten Zellen. Analog zum
Alamar Blue™-Assay blieb auch hier die Suppression von Bcl-2 fast ohne Folgen für die
Sensibilität der PC3-Zellen gegenüber TRAIL. Mit dem Kontroll-Oligonukleotid ergab sich
nur ein geringer Unterschied zu untransfizierten Zellen. Man beachte bei diesem Versuch
auch, dass es zu einem leichten Anstieg der Apoptose in ausschließlich Bcl-xL-ASO- 86 -
3. Ergebnisse
transfizierten Zellen kam, was für einen protektiven Effekt von Bcl-xL gegen einen spontanen
Zelltod sprechen könnte.
50
Apoptotische Zellen (%)
40
*
unbehandelt
CONO
Bcl-xL-ASO
Bcl-2-ASO
30
*
*
20
10
Abb. 17 B:
AI
L
R
AI
L
10
0
ng
/m
lT
30
ng
/m
lT
R
AI
L
R
ng
/m
lT
10
Ko
nt
ro
lle
0
Zytotoxische Wirkung von TRAIL auf PC3-Zellen nach Suppression von Bcl-xL oder
Bcl-2 (Zellzyklusanalyse), Dosisabhängigkeit.
Die PC3-Zellen wurden nach der Transfektion mit jeweils 50 nM der ODNs mit 10-100 ng/ml
TRAIL für 24 Stunden behandelt. Der Anteil apoptotischer Zellen wurde als hypodiploider
Peak in der Zellzyklusanalyse am Durchflusszytometer detektiert und in Prozent der
Gesamtpopulation dargestellt. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte ± SD von 3 unabhängigen
Bestimmungen. (*p < 0.05)
Es wurde auch hier untersucht, ob der Caspase 3-Inhibitor z-DEVD-fmk die Zellen vor dem
TRAIL-induzierten Zelltod bewahrt. Nach Transfektion der Zellen, genau eine Stunde vor
TRAIL-Applikation wurde z-DEVD-fmk auf die Zellen gegeben. In Abbildung 17 C ist
dargestellt, dass sowohl untransfizierte als auch Bcl-xL-ASO-transfizierte Zellen von der
Hemmung der Aktivität der Caspase 3 profitierten. Der Anteil apoptotischer Zellen konnte
nahezu auf den Ausgangswert in unbehandelten Zellen reduziert werden. Der verbliebene
- 87 -
3. Ergebnisse
Effekt von TRAIL könnte durch eine Restaktivität der Caspase 3 oder alternativ durch eine
Aktivierung der Caspasen 6 oder 7 erklärt werden.
50
**
Apoptotische Zellen (%)
40
30
20
10
0
100 ng/ml TRAIL
Bcl-xL-ASO
20 µM z-DEVD-fmk
Abb. 17 C:
-
+
-
+
+
+
-
+
+
-
+
+
+
Reduktion des TRAIL-induzierten Zelltodes in PC3-Zellen durch z-DEVD-fmk nach
Suppression von Bcl-xL (Zellzyklusanalyse).
Die PC3-Zellen wurden 47 Stunden nach Transfektion mit 50 nM der ODNs mit 20 µM zDEVD-fmk behandelt, eine Stunde später wurden 100 ng/ml TRAIL appliziert. Der Anteil
apoptotischer Zellen wurde als hypodiploider Peak in der Zellzyklusanalyse am
Durchflusszytometer 24 Stunden nach TRAIL-Applikation detektiert und in Prozent der
Gesamtpopulation dargestellt. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte ± SD von 2 unabhängigen
Bestimmungen. (**p < 0.01)
3.2.2.3.
TRAIL-induzierte Caspase 3-Aktivierung nach Suppression
von Bcl-xL oder Bcl-2
Nachdem die Beteiligung der Caspase 3 am TRAIL-induzierten Zelltod mittels Inhibition
derselben durch z-DEVD-fmk auch hier nachgewiesen werden konnte, wurde wiederum ihre
Aktivität nach TRAIL-Applikation bestimmt. Es stellte sich heraus, dass durch „Knockdown“ von Bcl-xL die TRAIL-induzierte Caspase 3-Aktivität in PC3-Zellen vervielfacht
werden konnte. In Abbildung 18 A wird zunächst die Kinetik der Caspase 3-Aktivierung
- 88 -
3. Ergebnisse
durch TRAIL gezeigt. Nach Zugabe von 100 ng/ml TRAIL erreichte die Caspase 3-Aktivität
in den Bcl-xL-ASO-transfizierten Zellen nach sechs Stunden ein Maximum und blieb bis 24
Stunden nach TRAIL-Applikation erhöht, während sie in den untransfizierten bzw. KontrollODN-transfizierten Zellen schon wieder auf ihr Ausgangsniveau zurückgegangen war. Zu
beachten ist dabei, dass das jeweilige Maximum der Caspase 3-Aktivität sowohl in Bcl-xLals auch in Bcl-2-„Knock-down“-Zellen deutlich später als in den Kontrollzellen erreicht
wurde. Auch in diesen Untersuchungen zeigte sich jedoch, dass bei Transfektion mit dem Bcl2-ASO gegen die Erwartungen keine Änderung der Sensibilität gegenüber TRAIL erreicht
wurde.
30
unbehandelt
CONO
Bcl-xL-ASO
Bcl-2-ASO
Relative Caspase 3-Aktivität
25
20
15
10
5
0
0
4
8
12
16
20
24
Zeit nach Applikation von 100 ng/ml TRAIL (h)
Abb. 18 A:
TRAIL-induzierte Caspase 3-Aktivierung in PC3-Zellen nach Suppression von Bcl-xL
oder Bcl-2, Kinetik.
Die PC3-Zellen wurden nach der Transfektion mit jeweils 50 nM des ODNs mit 100 ng/ml
TRAIL für unterschiedliche Zeiten behandelt. Anschließend wurden die Caspase 3-Aktivitäten
gemessen. Sie sind angegeben als Verhältnis der Aktivitäten von behandelten zu unbehandelten
Zellen. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte von 2 unabhängigen Bestimmungen.
- 89 -
3. Ergebnisse
Um die Dosisabhängigkeit der TRAIL-induzierten Caspase 3-Aktivierung zu zeigen, wurden
die mit den verschiedenen ODNs transfizierten Zellen mit unterschiedlichen Konzentrationen
von TRAIL für dreieinhalb Stunden behandelt, wie in Abbildung 18 B dargestellt ist.
*
60
unbehandelt
CONO
Bcl-xL-ASO
Bcl-2-ASO
Relative Caspase 3-Aktivität
50
*
40
30
20
10
Abb. 18 B:
AI
L
R
AI
10
0
ng
/m
lT
lT
R
ng
/m
30
Ko
nt
ro
lle
L
0
TRAIL-induzierte Caspase 3-Aktivierung in PC3-Zellen nach Suppression von Bcl-xL
oder Bcl-2, Dosisabhängigkeit.
Die PC3-Zellen wurden 48 h nach Transfektion mit jeweils 50 nM des ODNs für 3,5 h mit 0100 ng/ml TRAIL behandelt. Die Caspase 3-Aktivitäten sind angegeben als Verhältnis der
Aktivitäten von behandelten zu unbehandelten Zellen. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte ±
SD von 4 unabhängigen Bestimmungen. (*p < 0.05)
Nach Transfektion mit dem AODN gegen Bcl-xL wurde durch 100 ng/ml TRAIL ein fast 40facher Anstieg der Caspase 3-Aktivität verglichen mit unbehandelten Zellen erreicht. In den
Zellen, die untransfiziert waren bzw. mit dem Kontroll-ODN oder mit Bcl-2-ASO transfiziert
wurden, konnte durch die TRAIL-Behandlung hingegen nur ein Anstieg auf maximal das 13fache des Ausgangswertes in unbehandelten Zellen erreicht werden. Auch hier konnte bereits
in ausschließlich Bcl-xL-ASO-transfizierten Zellen ein Anstieg der Caspase 3-Aktivität
- 90 -
3. Ergebnisse
beobachtet werden, was als Anstieg der spontanen Apoptoserate bei Fehlen von Bcl-xL
gewertet werden kann.
3.2.2.4.
TRAIL-induzierte Depolarisation der Mitochondrienmembranen
nach Suppression von Bcl-xL oder Bcl-2
Durch Anfärbung der Zellen mit DiOC6(3) wurde auch hier die Depolarisation der
mitochondrialen Membranen am Durchflusszytometer nachgewiesen. Abbildung 19 A zeigt
die Kinetik der TRAIL-Wirkung auf das mitochondriale Membran-potential ∆ψm in PC3Zellen.
60
unbehandelt
CONO
Bcl-xL-ASO
Bcl-2-ASO
∆ψm Verlust (% der Zellen)
50
40
30
20
10
0
0
6
12
18
24
Zeit nach Applikation von 100 ng/ml TRAIL (h)
Abb. 19 A:
TRAIL-induzierte Depolarisation der Mitochondrienmembranen nach Suppression von
Bcl-xL oder Bcl-2, Kinetik.
Die PC3-Zellen wurden nach der Transfektion mit jeweils 50 nM der ODNs mit 100 ng/ml
TRAIL für die angegebene Zeit behandelt. Der Anteil der Zellen, deren mitochondriale
Membranen depolarisiert sind, ist in Prozent der Gesamtpopulation angegeben. Das Diagramm
zeigt die Mittelwerte von 2 unabhängigen Bestimmungen.
- 91 -
3. Ergebnisse
In den Kontrollzellen konnte nach 12 Stunden Inkubation mit 100 ng/ml TRAIL eine
schwache Abnahme des ∆ψm beobachtet werden. Im Gegensatz dazu provozierte TRAIL in
Bcl-xL-„Knock-down“-Zellen einen ∆ψm-Zerfall schon nach einer Inkubationszeit von nur
drei bis sechs Stunden mit einem Maximum nach 18 bis 24 Stunden.
Die Dosisabhängigkeit der TRAIL-Wirkung auf die Depolarisation der Mitochondrienmembranen ist in Abbildung 19 B dargestellt. 24 Stunden nach der Applikation von 300
ng/ml TRAIL kam es in weniger als 20 % der untransfizierten bzw. Kontroll-ODNtransfizierten Zellen, hingegen in über 60 % der Bcl-xL-supprimierten Zellen zur
Depolarisation der Mitochondrienmembranen. Wieder evozierte die Bcl-xL-Suppression
selbst eine proapoptotische Reaktion, was bekräftigt, dass Bcl-xL dem Schutz der
mitochondrialen Integrität dient.
100
unbehandelt
CONO
Bcl-xL-ASO
Bcl-2-ASO
**
*
∆ψm Verlust (% der Zellen)
80
60
40
20
Abb. 19 B:
AI
L
AI
L
R
R
30
0
ng
/m
lT
lT
ng
/m
10
0
Ko
nt
ro
lle
0
TRAIL-induzierte Depolarisation der Mitochondrienmembranen nach Suppression von
Bcl-xL oder Bcl-2, Dosisabhängigkeit.
Die PC3-Zellen wurden nach der Transfektion mit jeweils 50 nM der ODNs mit 0-300 ng/ml
TRAIL für 24 Stunden behandelt. Der Anteil der Zellen, deren mitochondriale Membranen
depolarisiert sind, ist in Prozent der Gesamtpopulation angegeben. Das Diagramm zeigt die
Mittelwerte ± SD von 4 unabhängigen Bestimmungen. (*p < 0.05, **p < 0.01)
- 92 -
3. Ergebnisse
Der pan-Caspase-Inhibitor z-VAD-fmk verhinderte, wie in Abbildung 19 C dargestellt, in
einer Konzentration von 10 µM den TRAIL-getriggerten Zerfall von ∆ψm. Dies zeigt, dass die
Apoptosefunktion der Mitochondrien prinzipiell Caspase-abhängig ist.
*
60
∆ψm Verlust (% der Zellen)
50
40
30
*
20
10
0
100 ng/ml TRAIL
Bcl-xL-ASO
10 µM z-VAD-fmk
Abb. 19 C:
-
+
-
+
+
+
-
+
+
+
+
-
+
+
+
Reduktion der TRAIL-induzierten Mitochondriendepolarisation durch z-VAD-fmk nach
Suppression von Bcl-xL.
Die PC3-Zellen wurden 47 Stunden nach Transfektion mit 50 nM der ODNs mit 10 µM zVAD-fmk behandelt, eine Stunde später wurden 100 ng/ml TRAIL appliziert und für 24
Stunden inkubiert. Der Anteil der Zellen, deren mitochondriale Membranen depolarisiert sind,
ist in Prozent der Gesamtpopulation angegeben. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte ± SD von
3 unabhängigen Bestimmungen. (*p < 0.05)
3.2.2.5.
TRAIL-induzierte Cytochrom c-Freisetzung
nach Suppression von Bcl-xL oder Bcl-2
In den folgend gezeigten Versuchen wurde das zytosolische Cytochrom c mittels FITCmarkierter Antikörper in ethanolfixierten Zellen angefärbt, die Zellen anschließend im
Durchflusszytometer untersucht und ihre Fluoreszenz vergleichend quantifiziert. In
Abbildung 20 A ist gezeigt, dass die Behandlung mit 100 ng/ml TRAIL in zeitabhängiger
Weise zur Freisetzung von Cytochrom c ins Zytosol führte. In den Kontrollproben führte die
- 93 -
3. Ergebnisse
TRAIL-Behandlung zu einem Anstieg des zytosolisch nachgewiesenen Cytochrom c von fünf
auf circa 20 %. Dieser Anteil konnte in Bcl-xL-ASO-transfizierten Zellen auf knapp 80 %
nach 24 Stunden TRAIL-Einwirkung gesteigert werden.
Cytochrom c-Freisetzung (% der Zellen)
80
unbehandelt
CONO
Bcl-xL-ASO
Bcl-2-ASO
60
40
20
0
0
6
12
18
24
Zeit nach Applikation von 100 ng/ml TRAIL (h)
Abb. 20 A:
TRAIL-induzierte Cytochrom c-Freisetzung nach Suppression von Bcl-xL oder Bcl-2,
Kinetik.
Die PC3-Zellen wurden nach der Transfektion mit jeweils 50 nM der ODNs mit 100 ng/ml
TRAIL für die angegebene Zeit behandelt. Der Anteil der Zellen, die durch FITC-antiCytochrom c-Antikörper markiert wurden, ist in Prozent der Gesamtpopulation angegeben.
Das Diagramm zeigt die Mittelwerte von 2 unabhängigen Bestimmungen.
Diese TRAIL-vermittelte Cytochrom c-Freisetzung konnte mit nur 10 µM z-VAD-fmk fast
komplett blockiert werden, wie in Abbildung 20 B gezeigt ist. Dies ist erneut ein Indikator
dafür, dass die Mitochondrienbeteiligung an der Apoptose streng Caspase-abhängig ist.
Es sei noch einmal darauf hingewiesen, dass schon die Suppression von Bcl-xL allein ohne
TRAIL-Applikation eine Steigerung der Cytochrom c-Freisetzung bewirkte. Es genügt also
- 94 -
3. Ergebnisse
die Herabregulation von Bcl-xL, um den mitochondrialen Weg der Apoptose zu erleichtern
beziehungsweise einzuleiten.
Cytochrom c-Freisetzung (% der Zellen)
80
60
40
20
0
100 ng/ml TRAIL
Bcl-xL-ASO
10 µM z-VAD-fmk
Abb. 20 B:
-
+
-
+
+
+
-
+
+
-
+
+
+
Reduktion der TRAIL-induzierten Cytochrom c-Freisetzung durch z-VAD-fmk nach
Suppression von Bcl-xL.
Die PC3-Zellen wurden 47 Stunden nach der Transfektion mit jeweils 50 nM der ODNs mit 10
µM z-VAD-fmk behandelt, eine Stunde später wurden 100 ng/ml TRAIL appliziert und für
weitere 24 Stunden inkubiert. Der Anteil der Zellen, die durch FITC-anti-Cytochrom cAntikörper markiert wurden, ist in Prozent der Gesamtpopulation angegeben. Das Diagramm
zeigt die Mittelwerte ± SD von 2 unabhängigen Bestimmungen.
3.2.2.6.
TRAIL-induzierte Caspase 9-Aktivierung
nach Suppression von Bcl-xL oder Bcl-2
Die Freisetzung von Cytochrom c führt normalerweise zur Bildung des sogenannten
Apoptosoms und damit zur Aktivierung der Caspase 9. Abschließend wurde also die TRAILinduzierte Caspase 9-Aktivierung untersucht. In Abbildung 21 ist dargestellt, dass 100 ng/ml
TRAIL die Caspase 9 in untransfizierten bzw. CONO-transfizierten Zellen auf nur circa das
1,5-fache des Ausgangswertes erhöhen konnten, wohingegen in Bcl-xL-supprimierten Zellen
eine signifikante Steigerung der Caspase 9-Aktivität auf das 2,8-fache erreicht wurde.
- 95 -
3. Ergebnisse
3,5
*
unbehandelt
CONO
Bcl-xL-ASO
Bcl-2-ASO
3,0
Relative Caspase 9-Aktivität
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
10
0
ng
/m
lT
R
AI
L
Ko
nt
ro
lle
0,0
Abb. 21:
TRAIL-induzierte Caspase 9-Aktivierung in PC3-Zellen nach Suppression von Bcl-xL
oder Bcl-2, Dosisabhängigkeit.
Die PC3-Zellen wurden 48 h nach Transfektion mit jeweils 50 nM des ODNs für 3,5 h mit 0100 ng/ml TRAIL behandelt. Die Caspase 9-Aktivitäten sind angegeben als Verhältnis der
Aktivitäten von behandelten zu unbehandelten Zellen. Das Diagramm zeigt die Mittelwerte ±
SD von 3 unabhängigen Bestimmungen. (*p < 0.05)
Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass die TRAIL-induzierte Apoptose zu einem
nicht unerheblichen Teil über den mitochondrialen Signalweg getriggert wird. Durch
Suppression von Bcl-xL konnten die intrazellulär messbaren Veränderungen, die während der
Apoptose stattfinden, verstärkt werden. Der Zelltod als primärer Endpunkt selbst konnte in
einem erheblich höheren Anteil der Zellpopulation ausgelöst werden. Bcl-xL kann demnach
als
intrazellulärer
Schutzfaktor
gegen
spontane
Apoptose
angesehen
werden.
Überraschenderweise traf dies auf Bcl-2 in den hier durchgeführten Untersuchungen an der
PC3-Zelle nicht zu.
- 96 -
4. Diskussion
4.
Der
Diskussion
Bedarf
an
neuen,
wirksamen
und
dabei
möglichst
nebenwirkungsarmen
Therapiestrategien für das Prostatakarzinom ist gerade im Hinblick auf die Häufigkeit der
Erkrankung sehr groß. Während für Karzinome in frühen Stadien der Erkrankung wirksame
Therapien zur Verfügung stehen, sind die kurativen Möglichkeiten bei hormonrefraktären
Karzinomen nur sehr begrenzt. Bei der Untersuchung der Wirksamkeit verschiedener
Standard-Chemotherapeutika konnte hier lediglich für Docetaxel eine gute Wirksamkeit
nachgewiesen werden (Pienta and Smith, 2005). Vor diesem Hintergrund scheint die
therapeutische Anwendung von TRAIL sinnvoll. Physiologischerweise spielt TRAIL unter
anderem eine Rolle in der Verhinderung der Entwicklung von Tumoren (Cretney et al., 2002;
Takeda et al., 2001a; Takeda et al., 2001b; Takeda et al., 2002). Im Gegensatz zu TNFα
wurden bisher keine schweren Nebenwirkungen beobachtet (Ashkenazi et al., 1999; Kelley et
al., 2001; Walczak et al., 1999). Gegen viele Tumoren scheint TRAIL allein jedoch keine
oder zumindest keine ausreichende Wirkung zu besitzen oder bei Defekten an den
Todesrezeptoren sogar eine proliferative Wirkung zu entfalten (Baader et al., 2005). Eine
alleinige Gabe von TRAIL zur Behandlung der Tumorerkrankung ist also in vielen Fällen
nicht angezeigt. Durch die vorherige Applikation von Zytostatika kann die Expression der
Todesrezeptoren für TRAIL heraufreguliert oder die Expression von cFLIP reduziert werden,
was eine bessere TRAIL-Wirkung nach sich zieht (Nimmanapalli et al., 2001; van Valen et
al., 2003; Wen et al., 2000). Dann besteht aber die Gefahr der unselektiv toxischen Wirkung
von TRAIL auch auf normale Körperzellen (van Valen et al., 2003). Eine spezifischere
Sensibilisierung
von
ausschließlich
Tumorzellen
gegen
TRAIL
wäre
demnach
wünschenswert. Dies könnte zum Beispiel durch Herabregulation von in Tumorzellen
überexprimierten intrazellulären Resistenzfaktoren erfolgen. Sowohl für die Familie der Bcl2-Proteine als auch für die Familie der Proteinkinasen C ist bereits eine Beeinflussung der
Zytostatika-induzierten Apoptose beschrieben. Ein ähnlicher Einfluss auf die TRAILvermittelte Apoptose kann vermutet werden. Die PC3-Zelle, die hier verwendet wurde, ist
eine hormonrefraktäre, prinzipiell TRAIL-sensible Prostatakarzinomzelle. Sie soll als Modell
für die Untersuchung von Resistenzfaktoren in Prostatakarzinomen dienen.
In dieser Arbeit wurde untersucht, inwiefern die Herabregulation der Expression von PKCη,
Bcl-xL oder Bcl-2 durch Antisense-Oligonukleotide den Ablauf der TRAIL-induzierten
Apoptose in PC3-Prostatakarzinomzellen verändert. Die Ergebnisse sind im Anschluss
diskutiert.
- 97 -
4. Diskussion
4.1.
Einsatz von Antisense-Oligonukleotiden
zur Herabregulation intrazellulärer Resistenzfaktoren
Die Funktionsweise der Faktoren, die für die Resistenz von Tumorzellen gegen zytotoxische
Substanzen oder Zytokine verantwortlich zu sein scheinen, muss spezifisch für die einzelnen
Tumorzellen untersucht werden können. Dazu ist einerseits die Untersuchung der durch ihre
Überexpression entstehenden Effekte geeignet. Andererseits braucht man ein effizientes und
vor allem spezifisches Verfahren um jeden einzelnen Faktor in der betreffenden Tumorzelle
ausschalten zu können. Erst dadurch kann die physiologische Funktion dieses Faktors erfasst
werden. Eine zu diesem Zweck zum Einsatz kommende Methode ist die Transfektion einer
Zelllinie mit Antisense-Oligonukleotiden. Dies sind kurze, chemisch modifizierte,
einzelsträngige DNA-Moleküle mit einer Nukleotidsequenz komplementär zur Sequenz der
definierten Ziel-mRNA, die in diesem Fall für solch einen vermuteten Resistenzfaktor der
Zelle kodiert. Die Ziel-mRNA wird nach der Bildung von Heteroduplices nach Watson-CrickBasenpaarung durch die RNAse H abgebaut. Die Möglichkeit, die Expression ganz
bestimmter Gene mit einem hohen Grad an Spezifität zu unterdrücken, zeichnet die
Antisense-Technologie gegenüber anderen Methoden aus. Dennoch gibt es eine rege
Diskussion
über
die
Spezifität
von
Antisense-Oligonukleotiden.
Besonders
für
Erstgenerations-AODNs wurde gezeigt, dass sie eine Reihe an unspezifischen Wirkungen
entfalten (Dias and Stein, 2002). Erst durch verschiedene Modifikationen konnte eine höhere
Spezifität und Effektivität erreicht werden.
Bei den hier vorliegenden Untersuchungen wurden sogenannte Zweitgenerations-GapmerAODNs verwendet. Dies sind circa 20 Nukleotide lange Phosphorothioate mit einer 2’Methoxyethyl-Modifikation an den jeweils endständigen fünf oder sechs Basen. Während die
modifizierten endständigen Nukleotide eine hohe Affinität zur Ziel-mRNA, also eine
spezifische Bindung vermitteln, sorgt das „gap“ aus unmodifizierten PhosphorothioatNukleotiden in der Mitte des Moleküls für eine gute, aber nicht zu starke RNAse HAktivierung (Monia et al., 1993). Die beschriebenen molekularen Veränderungen führen also
zu einer Steigerung von sowohl Spezifität als auch Effizienz gegenüber ErstgenerationsAODNs.
Sowohl in den Untersuchungen zur PKCη, als auch in den Untersuchungen zu Bcl-xL und
Bcl-2 gelang eine effiziente Herabregulation der Expression der Zielproteine in PC3-Zellen
auf unter 20 % des Ausgangsniveaus durch eine Transfektion der Zellen mit nur 50 nM des
jeweiligen Antisense-Oligonukleotids. Dies ist sowohl auf RNA- als auch auf Proteinebene
- 98 -
4. Diskussion
durch TaqMan® bzw. Western Blot belegt. Die strenge Zeit- und Dosisabhängigkeit der
Expressionsreduktion der betrachteten Zielproteine lässt stark auf einen spezifischen Effekt
schließen. Auch die Tatsache, dass die Transfektion mit dem Kontroll-ODN nur einen äußerst
geringen Einfluss auf die Expression der Zielproteine hat, stützt diese Beobachtung.
Als Hilfsmittel für das Einschleusen der AODNs in die lebenden Tumorzellen wurde
Argfectin-50 verwendet. Da es eine besonders effiziente Transfektion von PC3-Zellen erlaubt,
konnte die verwendete AODN-Konzentration in den nanomolaren Bereich gesenkt werden.
Dies trägt zur Reduktion eventuell verbliebener unspezifisch toxischer Wirkungen bei. Auch
das Lipid selbst wurde in einer möglichst niedrigen Konzentration eingesetzt, um noch
unbekannte, eventuell toxische Wirkungen zu minimieren.
Für den klinischen Einsatz von Antisense-Oligonukleotiden bedarf es noch einiger
Weiterentwicklungen, um sowohl eine effiziente Transfektion im lebenden Körper als auch
eine sichere Behandlung mit minimierten Nebenwirkungen zu ermöglichen. Im Rahmen
klinischer Studien wird bereits ein Bcl-2-ASO von Genasense bei verschiedenen Tumoren in
Kombination mit Chemotherapeutika mit Erfolg angewendet (Jansen et al., 2000; Marwick,
1998; Buchele, 2003). Die beobachteten Nebenwirkungen hierbei sind vergleichbar mit denen
der
Chemotherapie
allein.
Allerdings
wurde
für
dieses
AODN
an
DU145-
Prostatakarzinomzellen experimentell gezeigt, dass es zytostatische Effekte aufweist, die
unabhängig von der Bcl-2-Expression zu sein scheinen (Raffo et al., 2004).
4.2.
Die Proteinkinase C-Familie und Auswirkungen
der Suppression der PKCη
Die Familie der Proteinkinasen C besteht aus 12 Isoenzymen, die aufgrund ihrer Struktur und
biochemischen Eigenschaften in drei Gruppen unterteilt werden (Cartee and Kucera, 2000).
Sie spielen in der Regulation von diversen zellulären Prozessen wie Proliferation,
Differenzierung, Sekretion und Tumorentstehung eine Rolle (Hofmann, 2004). Die PKCη ist
eine „neue“ Proteinkinase C, die durch Cholesterolsulfat, Sulfatide, sulfatierte Metabolite von
Cholesterol und Cerebroside aktivierbar (Kashiwagi et al., 2002), aber unabhängig von der
intrazellulären Calciumkonzentration ist. Ihre genaue Funktionsweise in verschiedenen
Zelltypen ist bisher weitgehend ungeklärt. In bestimmten Zellen scheint sie zu
Differenzierung und Hemmung des Tumorwachstums zu führen (Kashiwagi et al., 2002;
Chida et al., 2003). In anderen Zellen scheint sie an der Hemmung der Apoptose und der
Entwicklung einer Chemoresistenz beteiligt zu sein (Brenner et al., 2003; Koren et al., 2004;
- 99 -
4. Diskussion
Beck et al., 1996; Beck et al., 1998a; Beck et al., 1998b). Zu Beginn dieser Arbeit wurde die
Hypothese aufgestellt, dass die PKCη ein Resistenzfaktor beim Ablauf der TRAILinduzierten
Apoptose
in
PC3-Prostatakarzinomzellen
ist.
In
den
durchgeführten
Untersuchungen konnte dies bestätigt werden.
Nach der effizienten Herabregulation der PKCη durch Transfektion der PC3-Zellen mit dem
ETA-ASO zeigte sich in verschiedenen Untersuchungen eine signifikante Steigerung der
TRAIL-induzierten Apoptose. Im Alamar Blue™-Assay wurde zunächst die metabolische
Aktivität der Zellkultur, die proportional zu deren Viabilität ist, bestimmt. Die Zellen, in
denen die PKCη-Expression herabreguliert war, zeigten nach der Behandlung mit TRAIL
einen signifikanten Abfall ihrer Viabilität verglichen mit der Kontroll-Zellkultur. Dieser
Abfall war sowohl von der Einwirkzeit als auch von der applizierten Dosis von TRAIL
abhängig. Bemerkenswert ist dabei, dass auch in den ausschließlich ETA-ASO-transfizierten
Zellen die Zellviabilität signifikant reduziert war, was auf einen protektiven Effekt der PKCη
gegen den spontanen Zelltod in PC3-Zellen hindeutet. Durch die Zugabe des pan-CaspaseInhibitors z-VAD-fmk, der unter anderem Caspase 8 und 3 irreversibel blockiert, konnte die
TRAIL-Wirkung sowohl in untransfizierten als auch in ETA-ASO-behandelten Zellen
konzentrationsabhängig fast vollständig aufgehoben werden. Dies bedeutet, dass die
Verstärkung der TRAIL-Wirkung in PKCη-„Knock-down“-Zellen ein Caspase-abhängiger
Effekt ist. Da die Aktivierung von Caspasen als zentraler Punkt in der Apoptose von Zellen
beschrieben ist (Shi, 2002), kann dies als Amplifikation der Apoptose verstanden werden. Der
Viabilitätsabfall in ausschließlich transfizierten Zellen hingegen konnte durch z-VAD-fmk
nicht verhindert werden. Ein möglicherweise protektiver Effekt der PKCη gegen den
spontanen Zelltod ist also unabhängig von der Apoptose zu betrachten. In einer
Zellzyklusanalyse mittels Durchflusszytometrie wurde nun der Anteil apoptotischer Zellen in
der behandelten Zellkultur, gemessen als Anteil der Zellen mit hypodiploidem DNA-Gehalt,
bestimmt. Durch Suppression der PKCη konnte die
TRAIL-vermittelte Zelltodrate
signifikant gesteigert werden. Auch diesmal ergab sich ein leichter Anstieg der hypodiploiden
Zellpopulation durch ausschließliche Transfektion der Zellen mit dem ETA-ASO, was erneut
für einen protektiven Effekt der PKCη gegen den spontanen Zelltod spricht. Durch den
Caspase 3-Inhibitor z-DEVD-fmk konnte die TRAIL-Wirkung in PKCη-„Knock-down“Zellen nahezu völlig aufgehoben werden. Der geringe verbliebene TRAIL-Effekt könnte
durch eine Restaktivität der Caspase 3 oder alternativ durch die Aktivierung der Caspasen 6
oder 7 erklärt werden. Insgesamt lässt sich jedoch feststellen, dass es sich bei dem TRAILinduzierten Zelltod um Apoptose handelt und diese durch die Suppression der PKCη
- 100 -
4. Diskussion
signifikant verstärkt wird. Wie nach diesen Ergebnissen zu erwarten, konnte die TRAILvermittelte Caspase 3-Aktivität durch Suppression der PKCη-Expression vervielfacht werden.
Dabei ist zu beachten, dass die Aktivität der Caspase 3 in den PKCη-„Knock-down“-Zellen
bereits nach zwei Stunden ihr Maximum erreichte und anschließend rasch wieder abfiel,
wohingegen ein Maximum in untransfizierten und Kontroll-ODN-transfizierten Zellen erst
nach vier Stunden erreicht wurde. Trotzdem konnte in den Experimenten zur
Dosisabhängigkeit der TRAIL-Wirkung, die nach durchschnittlich dreieinhalb Stunden
beendet wurden, mit der identischen TRAIL-Dosis eine fast doppelt so hohe Caspase 3Aktivität in PKCη-„Knock-down“-Zellen verglichen mit den Kontroll-ODN-transfizierten
Zellen gemessen werden. Der frühe Caspase 3-Anstieg nach Herabregulation der PKCη lässt
eine Beeinflussung der apoptotischen Signalkaskade sehr früh, also oberhalb der
Mitochondrien, vermuten. Auch diesmal konnte bereits in ausschließlich ETA-ASOtransfizierten Zellen ein leichter Anstieg der Caspase 3-Aktivität beobachtet werden, was als
Anstieg der spontanen Apoptoserate bei Fehlen von PKCη gewertet werden kann. Unklar
bleibt dann jedoch, warum diese Zellen zumindest bezüglich der Messung ihrer Viabilität im
Alamar Blue™-Assay nicht von z-VAD-fmk profitieren. Es ist bekannt, dass durch TRAIL
auch
der
intrinsische
Signalweg
der
Apoptose
mit
Permeabilisierung
der
Mitochondrienmembran, Freisetzung von Cytochrom c ins Zytosol und Aktivierung der
Caspase 9 im Apoptosom beschritten wird (Walczak et al., 2000; Walczak and Krammer,
2000; Yamada et al., 1999). Bei der Untersuchung der mit DiOC6(3)-gefärbten Zellen im
Durchflusszytometer konnte nach Applikation von TRAIL bei der ETA-ASO-transfizierten
Zellkultur ein deutlich stärkerer Anstieg der Zellen mit gestörtem mitochondrialen
Membranpotential, verglichen mit der Kontrollzellkultur, verzeichnet werden. Wiederum
zeigte sich also, dass der Angriffspunkt der PKCη deutlich oberhalb der Mitochondrien zu
suchen ist. Auch die Depolarisation der mitochondrialen Membranen konnte sowohl in den
Kontroll- als auch in den PKCη-„Knock-down“-Zellen durch den Breitspektrum-CaspaseInhibitor z-VAD-fmk nahezu komplett aufgehoben werden. Dies bedeutet, dass auch der
Verlust des mitochondrialen Membranpotentials nach TRAIL-Gabe streng Caspase-abhängig
ist. Dieser Effekt kann am ehesten der Rezeptor-Caspase 8 zugeschrieben werden. Ein
direkter Einfluss der PKCη auf die Aktivität der Caspase 8 oder eine andere, durch z-VADfmk hemmbare, oberhalb der Mitochondrien aktive Caspase muss aufgrund der fehlenden
protektiven Wirkung von z-VAD-fmk nach alleiniger PKCη-Suppression jedoch verneint
werden. Der Angriffspunkt der PKCη im apoptotischen Signalweg nach TRAIL-Gabe liegt
also an einer anderen Stelle oberhalb der Mitochondrien. Abschließend wurde die
- 101 -
4. Diskussion
Auswirkung der Mitochondrien-Depolarisation auf den zytosolischen Gehalt an Cytochrom c
mittels FITC-markierter Antikörper am Durchflusszytometer untersucht. Wie zu erwarten,
kam es zu einer deutlichen Amplifikation der TRAIL-bedingten Cytochrom c-Freisetzung
nach Suppression der PKCη. Auch diese konnte durch Zugabe von z-VAD-fmk fast
vollständig blockiert
werden,
was wiederum ein
Indikator dafür ist, dass die
Mitochondrienbeteiligung an der Apoptose in PC3-Zellen nach TRAIL-Gabe streng Caspaseabhängig ist.
Im Ergebnis konnte bewiesen werden, dass der TRAIL-induzierte Zelltod von PC3-Zellen
tatsächlich Caspase-abhängig ist und damit als Apoptose bezeichnet werden kann. Die PKCη
stellt in PC3-Zellen offensichtlich einen Schutzfaktor vor der TRAIL-induzierten Apoptose
dar, denn nach Suppression ihrer Expression kommt es zu einem signifikanten Anstieg von
allen untersuchten Apoptose-typischen Veränderungen in der Zellkultur. Eine sehr frühe
Aktivierung der Caspase 3 bei supprimierter PKCη legt eine Wirkung weit oben im
apoptotischen
Signalweg
nahe.
Auch
die
Tatsache,
dass
die
Stabilität
der
Mitochondrienmembran bei supprimierter PKCη deutlich stärker beeinträchtigt ist, spricht für
einen Wirkort oberhalb der Mitochondrien. Ein Angriffspunkt direkt am TRAIL-Rezeptor
oder an der Caspase 8 muss jedoch verneint werden. Die beobachteten Apoptose-typischen
Veränderungen nach Suppression der PKCη allein ohne Behandlung der Zellen mit einem
zytotoxischen Agens bleiben unklar. Diese sind durch z-VAD-fmk beziehungsweise zDEVD-fmk nicht beeinflussbar und daher offensichtlich Caspase-unabhängig, also außerhalb
der Apoptose zu betrachten.
Im Einklang mit den hier vorliegenden Ergebnissen wurde auch in anderen Studien gezeigt,
dass die PKCη ein Resistenzfaktor im Ablauf der durch unterschiedliche Stimuli
herbeigeführten Apoptose in verschiedenen Karzinomen und in normalen Zellen ist. So führte
die Herabregulation der PKCη in A549-Lungenkarzinomzellen zur Sensibilisierung der
Zellen gegen Vincristin und Paclitaxel (Sonnemann et al., 2004). In verschiedenen
Glioblastomzelllinien förderte die PKCη die Proliferation und vermittelte einen Schutz gegen
die UV- oder γ-Strahlen-induzierte Apoptose (Hussaini et al., 2000; Hussaini et al., 2002;
Martin and Hussaini, 2005; Martin et al., 2006). In Keratinozyten, in denen sie normalerweise
für Wachstumskontrolle und Differenzierung sorgt (Kashiwagi et al., 2002), wurde die UVBinduzierte Caspase 3-Aktivität durch die Überexpression der PKCη gehemmt und durch ihre
dominant negative Mutation gesteigert (Matsumura et al., 2003). Auch im Hinblick auf die
Zytokin-induzierte Apoptose wurde bereits gezeigt, dass die PKCη involviert ist. So wurde
durch Basu bereits 1998 gezeigt, dass nach ihrer Aktivierung MCF-7-Mammakarzinomzellen
- 102 -
4. Diskussion
gegen TNFα desensibilisiert werden (Basu, 1998). Auch konnte durch Überexpression der
PKCη in MCF-7-Zellen eine verminderte Aktivierung von Caspase 8 und 7 nach TNFαApplikation beobachtet werden (Akkaraju and Basu, 2000). In all diesen Zelltypen wirkt die
PKCη also als Resistenzfaktor gegen verschiedene Apoptose-auslösende Stimuli. Die
Vermutung, dass sie in den meisten Karzinomen als Resistenzfaktor wirkt, liegt nahe. So ist
sie in bestimmten Karzinomen auch um so höher exprimiert je weniger differenziert der
Tumor ist (Brenner et al., 2003; Koren et al., 2004). Aber es liegen auch gegenteilige
Beobachtungen vor. In bestimmten anderen Karzinomen ist sie nämlich im invasiven
Karzinom niedriger exprimiert, als im entsprechenden gesunden Gewebe (Doi et al., 1994;
Masso-Welch et al., 2001). Eine spezifische Untersuchung der Wirkungsweise der PKCη
gesondert für jeden Tumortyp ist vor einer möglichen therapeutischen Nutzung also
unabdingbar. Auch zur Bestimmung ihres genauen Wirkortes und ihrer Zielproteine sind noch
eine Reihe von Untersuchungen notwendig. Dennoch scheint sie ein vielversprechender
Kandidat zur Sensibilisierung von Tumorzellen gegen Chemotherapeutika, Bestrahlung und
zytotoxische Zytokine zu sein. In der Zukunft könnte dies ein Ansatzpunkt für die
erfolgreiche Behandlung chemoresistenter Tumoren sein. Vorher muss allerdings auch das
Werkzeug der intrazellulären Suppression der PKCη für den klinischen Einsatz optimiert
werden und dessen Sicherheit belegt sein.
4.3.
Die Bcl-2-Familie und Auswirkungen der Suppression
von Bcl-xL oder Bcl-2
Das Verhältnis aus pro- und antiapoptotischen Proteinen der Bcl-2-Familie ist maßgeblich
entscheidend für die Stabilität des mitochondrialen Membranpotentials während der
Auslösung der Apoptose über den intrinsischen Signalweg. Für eine erfolgreiche Störung der
Mitochondrienfunktion sind vor allem die proapoptotischen Mitglieder Bax und Bak von
Bedeutung, die zu einer Permeabilisierung der Mitochondrienmembranen führen können.
Bekannte wichtige antiapoptotische Mitglieder der Bcl-2-Familie sind vor allem Bcl-2 und
Bcl-xL. Sind diese im Übermaß vorhanden, kann die Apoptose nicht ungestört ablaufen.
Sowohl in Lymphomen als auch in epithelialen Tumoren sind sie bei Überexpression ein
Überlebensvorteil und mit verantwortlich für die Entstehung der Erkrankung (Jager et al.,
1997; McDonnell et al., 1989; McDonnell and Korsmeyer, 1991; Naik et al., 1996). Auch
konnte für verschiedene Tumorzellen gezeigt werden, dass eine Überexpression von Bcl-2
oder Bcl-xL mit einer Chemoresistenz der Zellen assoziiert ist (Raffo et al., 1995; Tu et al.,
- 103 -
4. Diskussion
1998), während eine Herabregulation der Proteine zur Sensibilisierung der Zellen gegen
verschiedene Substanzen führt (Gleave et al., 1999; Jansen et al., 2000; Zangemeister-Wittke
et al., 2000). Insbesondere für Prostatakarzinomzellen wurde beschrieben, dass sie bei
Überexpression von Bcl-2 oder Bcl-xL resistenter gegen Chemotherapeutika oder TRAIL
sind (Lebedeva et al., 2000b; Munshi et al., 2001; Raffo et al., 1995) und dass sie bei
Herabregulation der beiden Proteine oder von Bcl-xL allein sensibler auf Chemotherapeutika
reagieren (Lebedeva et al., 2000b; Gleave et al., 1999). In den Untersuchungen zu dieser
Arbeit konnte gezeigt werden, dass PC3-Prostatakarzinomzellen durch die Herabregulation
von Bcl-xL gegen die TRAIL-vermittelte Apoptose sensibilisiert werden können. Die
Herabregulation von Bcl-2 hatte dagegen keinen Einfluss auf die Sensibilität der Zellkultur
gegenüber der TRAIL-vermittelten Apoptose.
Es gelang sowohl für Bcl-xL als auch für Bcl-2 eine effiziente und spezifische
Herabregulation durch Transfektion mit dem entsprechenden AODN. Zunächst wurde auch
diesmal im Alamar Blue™-Assay die metabolische Aktivität der Zellkultur, die proportional
zu deren Viabilität ist, bestimmt. In Bcl-xL-„Knock-down“-Zellen zeigte sich zeit- und
dosisabhängig eine sehr viel stärkere Senkung ihrer Viabilität nach TRAIL-Behandlung als in
Kontroll-ODN-behandelten Zellen. Die Zellviabilität war aber auch in den ausschließlich BclxL-ASO-transfizierten Zellen reduziert, was dafür spricht, dass Bcl-xL ein Schutzfaktor
gegen den spontanen Zelltod sein könnte. Unerwartet blieb die Viabilität der Bcl-2-„Knockdown“-Zellen mit und ohne TRAIL-Applikation nahezu auf dem gleichen Niveau wie in
untransfizierten Zellen. Mit Hilfe des Breitspektrum-Caspase-Inhibitors z-VAD-fmk, der
unter anderem Caspase 8 und 3 irreversibel blockiert, ließ sich die synergistische Wirkung der
Herabregulation von Bcl-xL und der TRAIL-Behandlung in einen Caspase-abhängigen und
einen
Caspase-unabhängigen
Anteil
differenzieren.
Während
die
TRAIL-bedingte
Viabilitätssenkung durch z-VAD-fmk konzentrationsabhängig fast vollständig reversibel war,
hatte der pan-Caspase-Inhibitor auf den Viabilitätsabfall nach alleiniger Bcl-xL-Suppression
keinerlei Auswirkungen. Der allein durch das Fehlen von Bcl-xL zu beobachtende
Viabilitätsabfall der Zellkultur hat also neben der induzierten Apoptose eine andere Ursache.
In der anschließenden Zellzyklusanalyse mittels Durchflusszytometrie wurde auch hier der
Anteil apoptotischer Zellen in der behandelten Zellkultur, gemessen als Anteil der Zellen mit
hypodiploidem DNA-Gehalt, bestimmt. Nach der Gabe von 100 ng/ml TRAIL zeigte sich ein
Anteil apoptotischer Zellen von weniger als 15 % in den Kontrollzellen, hingegen über 40 %
in Bcl-xL-„Knock-down“-Zellen. Das heißt also, dass die TRAIL-vermittelte Zelltodrate
durch die Herabregulation von Bcl-xL auf über das Doppelte gesteigert werden konnte. Auch
- 104 -
4. Diskussion
hier kam es nach ausschließlicher Suppression von Bcl-xL ohne TRAIL-Behandlung zu
einem leichten Anstieg der Zelltodrate, was erneut für einen protektiven Effekt von Bcl-xL
gegen den spontanen Zelltod spricht. Wiederum hatte die Herabregulation von Bcl-2
unerwartet keinerlei Einfluss auf die Sensibilität der Zellen gegenüber TRAIL. Durch den
Caspase 3-Inhibitor z-DEVD-fmk konnte die durch Bcl-xL-„Knock-down“ hervorgerufene
Sensibilisierung der PC3-Zellen gegenüber TRAIL nahezu völlig aufgehoben werden. Der
geringe verbliebene TRAIL-Effekt könnte auch hier durch eine Restaktivität der Caspase 3
oder die Caspasen 6 oder 7 erklärt werden. Im Ergebnis stellt sich heraus, dass es sich beim
TRAIL-induzierten Zelltod von PC3-Zellen um Apoptose handelt und diese durch die
Herabregulation von Bcl-xL, nicht aber von Bcl-2, signifikant verstärkt werden kann.
Nachdem die Abhängigkeit der TRAIL-vermittelten Apoptose von der Caspase 3 bewiesen
war, wurde deren Aktivität in den unterschiedlich behandelten Zellkulturen bestimmt. Bereits
in ausschließlich Bcl-xL-ASO transfizierten Zellen war die Caspase 3 deutlich stärker
aktiviert als in Kontroll-ODN-transfizierten Zellen, was hier als ein Anstieg der spontanen
Apoptoserate beim Fehlen von Bcl-xL gewertet werden kann. Wie zu erwarten, wurde auch
die TRAIL-induzierte Caspase 3-Aktivierung durch Suppression von Bcl-xL signifikant
verstärkt. Es ergab sich ein doppelt so hoher Anstieg wie in den Kontrollzellen. Durch Bcl-2Suppression konnte auch bezüglich der Caspase 3-Aktivität keine Sensibilisierung der PC3Zellen gegenüber TRAIL erreicht werden. Bemerkenswert ist jedoch, dass sowohl in den Bcl2- wie auch in den Bcl-xL-„Knock-down“-Zellen das jeweilige Maximum der Caspase 3Aktivität erst sechs Stunden nach TRAIL-Gabe erreicht wurde, während es in unbehandelten
und Kontroll-ODN-transfizierten Zellen schon nach gut vier Stunden wieder zu einem Abfall
der Aktivität der Caspase 3 kam. Darüber hinaus blieb die Caspase 3-Aktivität in den Bcl-xLsupprimierten Zellen auch 24 Stunden nach TRAIL-Applikation noch deutlich über dem
Ausgangsniveau erhöht. Zu erklären ist dies durch den Wirkungsort der Bcl-2-Proteine. In der
Signalkaskade nach Aktivierung des TRAIL-Rezeptors sind die Mitochondrien erst in zweiter
Linie für die Induktion der Apoptose verantwortlich. Dadurch ist das verspätete Maximum der
Caspase 3-Aktivität nach Bcl-xL-Suppression plausibel. Unklar bleibt dabei aber, warum die
Suppression von Bcl-2 zwar einen deutlichen Effekt auf den zeitlichen Ablauf der Caspase 3Aktivierung, nicht aber auf ihre Höhe hat. Ebenfalls unklar bleibt, warum die Bcl-xL-„Knockdown“-Zellen zwar einen spontanen Anstieg der Caspase 3 zeigen, aber zumindest bezüglich
der Messung ihrer Viabilität im Alamar Blue™-Assay nicht von z-VAD-fmk profitieren.
Weil der Angriffspunkt der Proteine der Bcl-2-Familie die Mitochondrienmembran ist und
TRAIL neben der direkten Rezeptor-vermittelten Caspase 3-Aktivierung auch den
- 105 -
4. Diskussion
intrinsischen Signalweg der Apoptose aktiviert, wurde auch hier das mitochondriale
Membranpotential untersucht. Nach Färbung der Zellen mit DiOC6(3) wurde mittels
Untersuchung im Durchflusszytometer festgestellt, dass der Anteil der Zellen mit gestörtem
mitochondrialen Membranpotential nach TRAIL-Behandlung in den Bcl-xL-„Knock-down“Zellen um ein Vielfaches höher lag als in den Kontroll-Zellen. Durch den BreitspektrumCaspase-Inhibitor z-VAD-fmk konnte auch hier gezeigt werden, dass die TRAIL-vermittelte
Störung des mitochondrialen Membranpotentials streng Caspase-abhängig ist. Der z-VADfmk-bedingte Wirkungsverlust von TRAIL könnte also durch die Hemmung der Caspase 8
direkt am TRAIL-Rezeptor bedingt sein. Wieder evozierte bereits die Bcl-xL-Suppression
allein eine proapoptotische Reaktion, die durch z-VAD-fmk nicht gehemmt werden konnte.
Dies bekräftigt die Notwendigkeit von Bcl-xL für die Integrität der Mitochondrien auch ohne
das Einwirken apoptotischer Stimuli. Die Suppression von Bcl-2 hatte keinen Einfluss auf die
Integrität der Mitochondrien in PC3-Zellen. Sie konnte weder eine Sensibilisierung gegenüber
TRAIL bewirken noch eine spontane Störung des mitochondrialen Membranpotentials, wie
im Falle von Bcl-xL, hervorrufen. Bcl-2 scheint also in PC3-Zellen beim Schutz der
Mitochondrien keine oder nur eine untergeordnete Rolle zu spielen. Die Auswirkungen der
Mitochondriendepolarisation nach TRAIL-Behandlung wurden wiederum durch Bestimmung
des Anteils der Zellen mit zytosolisch vorliegendem Cytochrom c mit Hilfe FITC-markierter
Antikörper am Durchflusszytometer untersucht. Es kam zu einer deutlichen Cytochrom cFreisetzung bereits nach alleiniger Suppression von Bcl-xL und zu einer signifikanten
Verstärkung des TRAIL-Effektes in diesen Zellen. Während 24 Stunden nach TRAILApplikation in nur circa 20 % der Kontroll-Zellen zytosolisch vorhandenes Cytochrom c
nachgewiesen werden konnte, war dies in knapp 80 % der Bcl-xL-„Knock-down“-Zellen der
Fall. Als Zeichen für die Caspase-Abhängigkeit der TRAIL-vermittelten Cytochrom cFreisetzung konnte diese durch z-VAD-fmk nahezu auf das Augangsniveau gesenkt werden.
Auch diesmal zeigte sich durch die Herabregulation von Bcl-2 kein signifikanter Effekt.
Abschließend konnte bestätigt werden, dass die beobachteten Effekte nach Suppression von
Bcl-xL und anschließender TRAIL-Behandlung auch zu einer signifikant höheren Caspase 9Aktivierung führten.
Zusammenfassend konnte eine strenge Caspase-Abhängigkeit der TRAIL-induzierten Effekte
in allen Versuchen festgestellt werden. Der TRAIL-induzierte Zelltod kann also als Apoptose
bezeichnet werden. Die durch die alleinige Bcl-xL-Suppression hervorgerufenen Effekte
waren in allen durchgeführten Versuchen Caspase-unabhängig. Der Mechanismus dieser
Effekte bleibt unklar, in jedem Fall ist er außerhalb der ablaufenden Apoptose zu suchen. Die
- 106 -
4. Diskussion
Vermutung es könnte sich um unspezifische Transfektions-bedingte Effekte handeln scheidet
jedoch mit großer Sicherheit aus, da das Kontroll-ODN mit identischer NukleotidZusammensetzung aber inverser Sequenz keinen vergleichbaren Einfluss auf die Zellkultur
hatte. Es wird weiterhin deutlich, dass die TRAIL-induzierte Apoptose zu einem nicht
unerheblichen Teil über den mitochondrialen Signalweg getriggert wird. In PC3-Zellen
scheint hier nur Bcl-xL, nicht aber Bcl-2, ein wichtiger Resistenzfaktor gegen die TRAILvermittelte Apoptose zu sein. Im Allgemeinen wird Bcl-2 als sehr wichtiger Faktor in der
Resistenzentwicklung
von
Tumorzellen
gegen
die
Apoptoseinduktion
durch
Chemotherapeutika oder Zytokine beschrieben. Hinsichtlich der Reaktion von PC3-Zellen
wurde gezeigt, dass eine Überexpression von Bcl-2 die TRAIL-vermittelte Apoptose
blockieren kann (Munshi et al., 2001; Rokhlin et al., 2001). Physiologischerweise scheint Bcl2 im Gegensatz zu Bcl-xL in diesen Zellen aber keine Apoptose-hemmende Rolle zu spielen.
Bei der Herabregulation von Bcl-2 zeigte sich im Gegensatz zu Bcl-xL in keinem der hier
durchgeführten Versuche eine Verstärkung der TRAIL-Wirkung. Analog wurde bereits von
Lebedeva und Mitarbeitern beschrieben, dass Bcl-2 im Vergleich zu Bcl-xL wohl eine
untergeordnete Rolle in der Sensibilität von PC3-Zellen gegenüber Chemotherapeutika spielt
(Lebedeva et al., 2000b). Eine Erklärung für die Diskrepanz der beobachteten Effekte des
„Knock-downs“ von Bcl-2 und Bcl-xL könnte ein unterschiedliches Expressionslevel der
beiden Proteine in PC3-Zellen sein. Eine andere Möglichkeit für diese Differenz wäre
eventuell ein Unterschied in der spezifischen Funktion von Bcl-2 und Bcl-xL. Trotz ihrer für
die meisten Fälle beschriebenen funktionellen Äquivalenz (Cory and Adams, 2002) gibt es
einige Anhaltspunkte für eine unterschiedliche Funktionsweise. Im „National Cancer
Institute's in vitro anticancer drug screen“ (NCI-ACDS) wurde in einer Auswahl von 60
Zelllinien nur für Bcl-xL eine starke Korrelation zwischen Expressionslevel und Resistenz
gegen 122 Standard-Chemotherapeutika gefunden (Amundson et al., 2000). Für eine Reihe
von Zelllinien ist lediglich für Bcl-xL, nicht aber für Bcl-2, eine Wirksamkeit im Schutz
gegen bestimmte apoptotische Stimuli beschrieben. So wurde für FL5.12-lymphoide Zellen
bei vergleichbarem Expressionslevel für Bcl-2 und Bcl-xL gezeigt, dass zwar beide Proteine
den gleichen Schutz gegen Vincristin- und γ-Strahlen-induzierte Apoptose vermitteln, aber
Bcl-xL einen besseren Schutz gegen die Apoptose durch Etoposid, Methotrexat und Cisplatin
verleiht (Simonian et al., 1997). Auch in CEM-Zellen bot Bcl-2 zwar einen wirksamen Schutz
vor UV-induzierter Apoptose, konnte aber den TRAIL-induzierten Zelltod nicht verhindern
(Keogh et al., 2000). Erst kürzlich wurde von Fiebig und Mitarbeitern gezeigt, dass Bcl-xL
zehnfach aktiver als Bcl-2 bei der Verhinderung der Doxorubicin-induzierten Apoptose in
- 107 -
4. Diskussion
MCF-7-Mammakarzinomzellen ist (Fiebig et al., 2006). Auch in Bezug auf die TRAILinduzierte Apoptose von Mammakarzinomzellen wurde bereits ein inhibitorischer Effekt für
Bcl-xL, nicht aber für Bcl-2, beschrieben (Kim et al., 2003). Zusammenfassend scheint BclxL die prädominante Rolle in der Regulation der Suszeptibilität von Karzinomzellen gegen
apoptotische Stimuli zu spielen. Übereinstimmend mit diesen Ergebnissen wurde beschrieben,
dass in kolorektalen Karzinomen die Überexpression von Bcl-xL mit
Prognose
assoziiert
ist
(Biroccio
et
al.,
2001).
Für
die
einer schlechten
Bcl-2-Expression
in
Prostatakarzinomen fand sich im Gegensatz dazu keine Korrelation zum Fortschreiten der
Tumorerkrankung oder der Überlebenswahrscheinlichkeit der Patienten (Khor et al., 2006),
was ebenfalls auf eine untergeordenete Rolle von Bcl-2 im Prostatakarzinom hindeutet. In
Lymphomen hingegen, in denen Bcl-2 ja auch primär als Überlebensvorteil der malignen
Zellklone entdeckt wurde, scheint es selbst die prädominante Rolle zu spielen. So wurde bei
hochmalignen Non-Hodgkin-Lymphomen die hohe Expression von Bcl-2 als prädiktiv für nur
kurzes krankheitsfreies Überleben beschrieben (Hermine et al., 1996).
Durch eine Beeinflussung der Bcl-xL-Expression im lebenden menschlichen Körper könnte
durch die damit erreichte Überwindung der Chemoresistenz von Karzinomen in Zukunft eine
erfolgreiche Behandlung auch fortgeschrittener Tumorerkrankungen möglich werden. Bei
einem klinischen Einsatz zytotoxischer Zytokine wie TRAIL könnte die Herabregulation von
Bcl-xL zu einer besseren Wirksamkeit selektiv in den malignen Zellen führen. Zuvor muss für
die Suppression von Bcl-xL im lebenden menschlichen Körper zunächst ein sicheres und
effizientes Verfahren entwickelt werden.
4.4.
Fazit
Diese Arbeit zeigt, dass es sich bei der PKCη um einen potenten Resistenzfaktor im Ablauf
der TRAIL-induzierten Apoptose in PC3-Prostatakarzinomzellen handelt. Des Weiteren
bestätigen diese Untersuchungen die Bedeutung von Bcl-xL als wichtiges antiapoptotisches
Protein in PC3-Zellen. Bcl-2 dagegen spielt, anders als erwartet, keine Rolle beim TRAILvermittelten Zelltod dieser Zellen. PKCη und Bcl-xL, nicht aber Bcl-2, sind mithin potentielle
Angriffspunkte
zur
Verstärkung
der
zytotoxischen
Prostatakrebszellen.
- 108 -
Wirksamkeit
von
TRAIL
in
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
AB
Antibiotika
ABC
ATP-„binding cassette“
ADP
Adenosindiphosphat
AFC
Aminotrifluoromethylcoumarin
AK
Antikörper
AODN
Antisense-Desoxyoligonukleotid (Synonym: ASO)
Apaf-1
„apoptotic protease-activating factor“ 1
aPKC
atypische (atypical) Proteinkinasen C
APO1
(Synonyme: CD95, Fas)
APO2L
(Synonym: TRAIL)
ARF
„activin responsive factor“
ASO
Antisense-Desoxyoligonukleotid (Synonym: AODN)
ATP
Adenosintriphosphat
Bak
Bcl-2-„homologous antagonist/killer“ (Protein der Bcl-2-Familie)
Bax
Bcl-2-„associated x protein“ (Protein der Bcl-2-Familie)
BCA
„Bicinchoninic acid assay“
Bcl-2
„B-cell lymphoma“ (Protein der Bcl-2-Familie)
Bcl-xL
„long splicing variant of a Bcl-2 related gene“ (Protein der Bcl-2-Familie)
Bcl-xS
„short splicing variant of a Bcl-2 related gene“ (Protein der Bcl-2-Familie)
BH
Bcl-2-homologe Domäne
Bid
BH-3-„interacting death agonist“ (Protein der Bcl-2-Familie)
CAD
„caspase-activated desoxyribonuklease“
CD
„cluster of differentiation“
CD95
(Synonyme: APO-1, Fas)
CD95L
CD95-Ligand (Synonym: Fas-Ligand)
CdK2
„Cyclin-dependent kinase“ 2
cDNA
„complementary“ DNA
cFLIP
„cellular FLICE like inhibiting protein“
CHAPS
3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propansulfonat
CK2
Caseinkinase 2
CMV
Cytomegalievirus
c-myc
Protoonkogen
- 109 -
Abkürzungsverzeichnis
(als v-myc = Retrovirus, Induktion der Myelocytomatose bei Vögeln)
c-Myc
Transkriptionsfaktor (Genprodukt von c-myc)
CONO
Kontrolloligonukleotid
cPKC
klassische (classical) Proteinkinasen C
CT
„threshold cycle“ (Schwellenzyklus)
d
delta
DAG
Diacylglycerol
dATP
Desoxyadenosintriphosphat
DD
„death domain“ (Todesdomäne)
DED
„death effector domain“ (Todeseffektordomäne)
DFF45
DNA-Fragmentierungsfaktor 45
DEVD
Aspartat-Glutamat-Valin-Aspartat
(Aminosäurefolge des Caspasesubstrates bzw. -inhibitors für die Caspase 3)
DIABLO
„direct IAP binding protein with low isoelectric point” (Synonym: Smac)
DiOC6(3)
Dihexaoxacarbocyaninjodid
DISC
„death-inducing signaling complex“
DMEM
„Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium“
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
Desoxyribonukleinsäure (-acid)
dNTP
Desoxynukleosidtriphosphat
∆ψm
Mitochondriales Membranpotential
DR
„death receptor“ (Todesrezeptor)
dTMP
Desoxythymidinmonophosphat
DTT
Dithiothreitol
dUTP
Desoxyuridintriphosphat
EDTA
Ethylendiamintetraacetat
ELISA
„enzyme linked immuno-sorbent assay“
FACS
„Fluorescence activated cell sorter“
FADD
„Fas-associated death domain“ (Fas-assoziierte Todesdomäne)
FAM
6-Carboxyfluorescein (Reporterfarbstoff)
FasL
Fas-Ligand (Synonym: CD95-Ligand)
FET
Fluoreszenz-Energie-Transfer
FITC
Fluoresceinisothiocyanat
FKS
Fetales Kälberserum
- 110 -
Abkürzungsverzeichnis
FLICE
„Fas-associated death domain-like IL-1βconverting enzyme“
FRET
Fluoreszenz-Resonanz-Energietransfer
FSC
„forward scatter“
FSH
Follikel-stimulierendes Hormon
FW
„forward“
g
Gramm
G
Gauge
GnRH
„Gonadotropin releasing hormon“
HEPES
4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazin-ethansulfonsäure
IAP
„Inhibitor of apoptosis proteins“
CAD
I
Inhibitor der „caspase-activated desoxyribonuklease“
IFN
Interferon
Ig
Immunglobulin
IgG
Immunglobulin der Klasse G
IL
Interleukin
IP3
Inositoltriphosphat
i.v.
intra venös
LAN
„Linker-Arm“-Nukleotid
l
liter
LEHD
Leucin-Glutamat-Histidin-Aspartat
(Aminosäurefolge des Caspasesubstrates bzw. -inhibitors für die Caspase 9 )
LH
Luteinisierendes Hormon
LHRH
LH-releasing Hormon
MAP
„mitogen activated protease“
MAPK
MAP-Kinase
Mcl-1
„Myeloid cell leucemia sequence 1 (Protein der Bcl-2-Familie)
MDR
„multidrug resistance“
m
Meter
M
molar
min
Minute
MOE
Methoxyethyl
MTT
Tetrazoliumsalz
mRNA
„messenger“ RNA
MRP
„multidrup resistance associated protein“
- 111 -
Abkürzungsverzeichnis
NFκB
„nuclear factor kappa B“ (Transkriptionsfaktor)
NKC
„natural killer cell“ (Natürliche Killerzellen)
nPKC
novel/neue Proteinkinasen C
ODN
Desoxyoligonukleotid
OPG
Osteoprotegerin (TRAIL-Rezeptor)
p21
„cyclin-dependent kinase inhibitor“ (Zellzyklusregulator)
p53
(Transkriptionsfaktor)
PAGE
Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PARP
Poly-ADP-Ribose Polymerase
PBS
„phosphate buffered saline“ (Phosphat-gepufferte Salzlösung)
PCR
„polymerase chain reaction“ (Polymerasekettenreaktion)
PIP3
Phosphatidylinositoltriphosphat
PKB
Proteinkinase B
PKC
Proteinkinase C (c: classical; n: novel; a: atypical)
PLC
Phospholipase C
PMA
„phorbol myristate acetate“
PNA
„peptide nucleic acid“
PSA
Prostata-spezifisches Antigen
PtdSer
Phosphatidylserin
PVDF
Polyvinylidenfluorid
Rb
Retinoblastomgen
Redox
Reduktions-Oxidations-(Reaktion)
RIBA
„recombinant immunoblot assay“
RIP
„receptor interacting protein“
RNA
Ribonukleinsäure (-acid)
RNAse H
Ribonuklease H
rRNA
ribosomale RNA
Rn
Reportersignal
RT-PCR
Reverse Transkriptase PCR
RV
„reverse“
s.c.
sub cutan
SD
„standard deviation“ (Standardabweichung)
SDS
Natriumdodecylsulfat (sodium dodecyl sulfate)
sec
Sekunde
- 112 -
Abkürzungsverzeichnis
Smac
„second mitochondria-derived activator of caspases“ (Synonym: DIABLO)
SSC
„side scatter“
Taq
Thermus aquaticus (hitzeresistenter Bakterienstamm)
TAMRA
6-Carboxytetramethylrhodamin (Quencher)
tBid
„truncated“ Bid (Protein der Bcl-2-Familie)
TBS/T
„Tris-buffered saline“/Tween® (Polyoxyethylen)
TMB
Tetramethylbenzidin
TNF
Tumor Nekrose Faktor
TNF-R
TNF-Rezeptor
TRADD
„TNF-related associated death domain“
TRAIL
„TNF-related apoptosis-inducing ligand“
TRAIL-R1
TRAIL Receptor 1 (Synonyme: DR4, APO-2 A)
TRAIL-R2
TRAIL Receptor 2 (Synonyme: DR5, TRICK, Killer)
TRAIL-R3
TRAIL Receptor 3 (Synonyme: DcR1, TRID, LIT)
TRAIL-R4
TRAIL Receptor 4 (Synonyme: DcR2, TRUNDD)
Tris
2-Amino-2-hydroxymethyl-1,3-propandiol
U
Umdrehungen
UNG
Uracil-N-Glykosylase
UV
ultraviolette
VAD
Valin-Alanin-Aspartat
(Aminosäurefolge des Caspasesubstrates bzw. -inhibitors)
VIC
(Reporterfarbstoff)
(v/v)
„volume per volume“
(w/v)
„weight per volume“
XIAP
„x-linked inhibitor of apoptosis proteins“
- 113 -
Abbildungsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Abb. 1:
Schematische Darstellung der beiden Hauptsignalwege der Apoptose.
Abb. 2:
Prinzipielle Struktur der Proteinkinasen C, (modifiziert nach Cartee and
Kucera, 2000).
Abb. 3:
Chemische Modifikationen von Oligonukleotiden, (aus Dias and Stein, 2002).
Abb. 4:
Schematische Darstellung der Sondendegradierung während eines TaqMan®
Laufes, (aus Schild, 1998).
Abb. 5:
Darstellung der chemischen Struktur einer TaqMan® PCR-Sonde, (aus Schild,
1998).
Abb. 6:
Amplifikationsdiagramm, (aus Schild, 1998).
Abb. 7:
Darstellung einer Zellzyklusanalyse.
Abb. 8:
Aufnahme FITC-markierter Gapmer-ODNs in PC3-Zellen.
Abb. 9 A:
Quantifizierung der PKCη-mRNA mittels „Real Time“ RT-PCR (TaqMan®),
Kinetik.
Abb. 9 B:
Quantifizierung der PKCη-mRNA mittels „Real Time“ RT-PCR (TaqMan®),
Dosisabhängigkeit.
Abb. 9 C:
Quantifizierung der Bcl-xL-mRNA mittels „Real Time“ RT-PCR (TaqMan®),
Kinetik.
Abb. 9 D:
Quantifizierung der Bcl-xL-mRNA mittels „Real Time“ RT-PCR (TaqMan®),
Dosisabhängigkeit.
Abb. 9 E:
Quantifizierung der Bcl-2-mRNA mittels „Real Time“ RT-PCR (TaqMan®),
Dosisabhängigkeit.
Abb. 10 A:
Western Blot-Analyse der PKCη-Protein-Expression.
Abb. 10 B:
Western Blot-Analyse der Bcl-xL-Protein-Expression.
Abb. 10 C:
Western Blot-Analyse der Bcl-2-Protein-Expression.
Abb. 11 A:
Zytotoxische Wirkung von TRAIL auf PC3-Zellen nach Suppression der PKCη
(Alamar Blue™-Assay), Kinetik.
Abb. 11 B:
Zytotoxische Wirkung von TRAIL auf PC3-Zellen nach Suppression der PKCη
(Alamar Blue™-Assay), Dosisabhängigkeit.
Abb. 11 C:
Dosisabhängige Reduktion des TRAIL-induzierten Zelltodes in PKCηsupprimierten Zellen durch z-VAD-fmk (Alamar Blue™-Assay).
Abb. 11 D:
Reduktion des TRAIL-induzierten Zelltodes in PKCη-supprimierten Zellen
durch z-VAD-fmk (Alamar Blue™-Assay).
- 114 -
Abbildungsverzeichnis
Abb. 12 A:
Zytotoxische Wirkung von TRAIL auf PC3-Zellen nach Suppression der PKCη
(Zellzyklusanalyse), Kinetik.
Abb. 12 B:
Zytotoxische Wirkung von TRAIL auf PC3-Zellen nach Suppression der PKCη
(Zellzyklusanalyse), Dosisabhängigkeit.
Abb. 12 C:
Reduktion des TRAIL-induzierten Zelltodes in PC3-Zellen durch z-DEVDfmk nach Suppression der PKCη (Zellzyklusanalyse).
Abb. 13 A:
TRAIL-induzierte Caspase 3-Aktivierung in PC3-Zellen nach Suppression der
PKCη, Kinetik.
Abb. 13 B:
TRAIL-induzierte Caspase 3-Aktivierung in PC3-Zellen nach Suppression der
PKCη, Dosisabhängigkeit.
Abb. 14 A:
TRAIL-induzierte
Depolarisation
der
Mitochondrienmembranen
nach
der
Mitochondrienmembranen
nach
Suppression der PKCη, Kinetik.
Abb. 14 B:
TRAIL-induzierte
Depolarisation
Suppression der PKCη, Dosisabhängigkeit.
Abb. 14 C:
Reduktion der TRAIL-induzierten Mitochondriendepolarisation durch z-VADfmk nach Suppression der PKCη.
Abb. 15 A:
TRAIL-induzierte Cytochrom c-Freisetzung nach Suppression der PKCη,
Kinetik.
Abb. 15 B:
Reduktion der TRAIL-induzierten Cytochrom c-Freisetzung durch z-VAD-fmk
nach Suppression der PKCη.
Abb. 16 A:
Zytotoxische Wirkung von TRAIL auf PC3-Zellen nach Suppression von BclxL oder Bcl-2 (Alamar Blue™-Assay), Kinetik.
Abb. 16 B:
Zytotoxische Wirkung von TRAIL auf PC3-Zellen nach Suppression von BclxL oder Bcl-2 (Alamar Blue™-Assay), Dosisabhängigkeit.
Abb. 16 C:
Dosisabhängige Reduktion des TRAIL-induzierten Zelltodes in Bcl-xLsupprimierten Zellen durch z-VAD-fmk (Alamar Blue™-Assay).
Abb. 16 D:
Reduktion des TRAIL-induzierten Zelltodes in Bcl-xL-supprimierten Zellen
durch z-VAD-fmk (Alamar Blue™-Assay).
Abb. 17 A:
Zytotoxische Wirkung von TRAIL auf PC3-Zellen nach Suppression von BclxL oder Bcl-2 (Zellzyklusanalyse), Kinetik.
Abb. 17 B:
Zytotoxische Wirkung von TRAIL auf PC3-Zellen nach Suppression von BclxL oder Bcl-2 (Zellzyklusanalyse), Dosisabhängigkeit.
Abb. 17 C:
Reduktion des TRAIL-induzierten Zelltodes in PC3-Zellen durch z-DEVDfmk nach Suppression von Bcl-xL (Zellzyklusanalyse).
- 115 -
Abbildungsverzeichnis
Abb. 18 A:
TRAIL-induzierte Caspase 3-Aktivierung in PC3-Zellen nach Suppression von
Bcl-xL oder Bcl-2, Kinetik.
Abb. 18 B:
TRAIL-induzierte Caspase 3-Aktivierung in PC3-Zellen nach Suppression von
Bcl-xL oder Bcl-2, Dosisabhängigkeit.
Abb. 19 A:
TRAIL-induzierte
Depolarisation
der
Mitochondrienmembranen
nach
Mitochondrienmembranen
nach
Suppression von Bcl-xL oder Bcl-2, Kinetik.
Abb. 19 B:
TRAIL-induzierte
Depolarisation
der
Suppression von Bcl-xL oder Bcl-2, Dosisabhängigkeit.
Abb. 19 C:
Reduktion der TRAIL-induzierten Mitochondriendepolarisation durch z-VADfmk nach Suppression von Bcl-xL.
Abb. 20 A:
TRAIL-induzierte Cytochrom c-Freisetzung nach Suppression von Bcl-xL oder
Bcl-2, Kinetik.
Abb. 20 B:
Reduktion der TRAIL-induzierten Cytochrom c-Freisetzung durch z-VAD-fmk
nach Suppression von Bcl-xL.
Abb. 21:
TRAIL-induzierte Caspase 9-Aktivierung in PC3-Zellen nach Suppression von
Bcl-xL oder Bcl-2, Dosisabhängigkeit.
- 116 -
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- 131 -
Eidesstattliche Erklärung
Hiermit erkläre ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbständig verfasst und keine
anderen als die angegebenen Hilfsmittel benutzt habe.
Die Dissertation ist bisher keiner anderen Fakultät vorgelegt worden.
Ich erkläre, dass ich bisher kein Promotionsverfahren erfolglos beendet habe und dass eine
Aberkennung eines bereits erworbenen Doktorgrades nicht vorliegt.
Greifswald, 03.09.2007
……………………………………………
- 132 -
Lebenslauf
Name:
Antje Sagrauske
Geburtsdatum:
17.03.1980
Geburtsort:
Ilmenau/Thür.
Schulausbildung:
1986-1991
Rudi-Arnstadt-Oberschule Frauenwald (POS)
1991-1998
Goethe-Schule Ilmenau (Gymnasium)
1998
Abitur
Krankenpflegepraktikum:
09-11/1998
Intensivstation/Kreiskrankenhaus Ilmenau
Bundeswehr:
01/1999
Einstellung als Soldat auf Zeit
01-09/1999
Grundausbildung und Offizierlehrgang
10/1999
Beurlaubung zum Studium
Studium:
10/1999
Immatrikulation an der Ernst-Moritz-Arndt-Universität
Greifswald im Studiengang Humanmedizin
09/2001
Physikum
02-03/2002
Famulatur Innere Medizin am Bundeswehrkrankenhaus Ulm
08/2002
Erstes Staatsexamen
02-03/2003
Famulatur Chirurgie am Bundeswehrkrankenhaus Leipzig
03/2003
Famulatur Neurologie an der EMAU Greifswald
09-10/2003
Famulatur Allgemeinmedizin am MStOSanZ Parow
09/2004
Zweites Staatsexamen
10/2004-09/2005
Praktisches Jahr an der EMAU Greifswald
10/2004-02/2005
Chirurgische Universitätsklinik (1. Trimester)
02-05/2005
KIM C - Hämatologie und Onkologie (2. Trimester)
05-09/2005
Klinik für Neurologie (3. Trimester)
11/2005
Drittes Staatsexamen
- 133 -
Promotion:
10/2002-01/2007
in der Abteilung Pädiatrische Onkologie und Hämatologie
(Leiter: Univ.-Prof. Dr. med. James F. Beck) der Klinik und
Poliklinik für Kinder- und Jugendmedizin (geschäftsführender
Direktor:
Univ.-Prof.
Dr.
med.
Christoph
Fusch)
der
Medizinischen Fakultät der Ernst-Moritz-Arndt-Universität
Greifswald
angefertigt am Institut für Pharmakologie, Research Center of
Pharmacology and Experimental Therapeutics, (Direktor: Univ.Prof. Dr. rer. nat. Heyo K. Kroemer) der Ernst-Moritz-ArndtUniversität Greifswald
Thema:
Die Suppression von PKCη oder Bcl-xL, nicht aber Bcl-2,
verstärkt die zytotoxische Wirkung von TRAIL in PC3Prostatakarzinomzellen.
Veröffentlichungen:
-
Apoptotic responsiveness of PC-3 prostate cancer cells to tumor necrosis
factor-related apoptosis-inducing ligand: Evidence for differential effects of
Bcl-xL and Bcl-2 down-regulation.
Sonnemann, J., Gekeler, V., Sagrauske, A., Muller, C., Hofmann, H.P. and
Beck, J.F. (2004).
Int. J. Oncol. 25, 1171-1181.
-
Down-regulation of protein kinase C{eta} potentiates the cytotoxic effects of
exogenous tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand in PC-3
prostate cancer cells.
Sonnemann, J., Gekeler, V., Sagrauske, A., Muller, C., Hofmann, H.P. and
Beck, J.F. (2004).
Mol. Cancer Ther. 3, 773-781.
Beruflicher Werdegang:
11/2005-03/2006
Tätigkeit als Assistenzärztin am Bundeswehrkrankenhaus Berlin
Abteilung Innere Medizin
03/2006-01/2007
Mutterschutz und Elternzeit
Seit 02/2007
Wiederaufnahme der beruflichen Tätigkeit als Assitenzärztin
Greifswald, 03.09.2007
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Danksagung
An dieser Stelle bedanke ich mich bei meinem Betreuer Herrn Prof. Dr. James F. Beck für die
freundliche Überlassung des Themas, die hilfreichen Hinweise und Anregungen und die
kritische Diskussion der Versuchsergebnisse in den allwöchentlichen Besprechungen.
Besonders gilt mein Dank Herrn Dr. Jürgen Sonnemann für die intensive Betreuung, die
Wegweiser im Verlauf der praktischen Arbeit, die vielen Diskussionen und hilfreichen
Gespräche und nicht zuletzt für das rasche Korrekturlesen der zugeschickten Kapitel.
Bei Frau Jennifer Gänge bedanke ich mich ganz herzlich für die Hilfe bei der Durchführung
der Versuche und bei den „alltäglichen“ kleinen Problemen im Labor, für das gute
Arbeitsklima und für die vielen persönlichen Gespräche.
Für die Hilfe bei der Durchführung von Proteinexpressionsanalysen im Labor von Frau Dr.
Cornelia Müller an der Kinderklinik der Ernst-Moritz-Arndt-Universität bedanke ich mich bei
Frau Ulrike Glawe.
Bei Frau Christine Stötzer bedanke ich mich für die Durchführung der regelmäßigen
Mykoplamentests im Hämatologisch-/Onkologischen Labor der Kinderklinik der ErnstMoritz-Arndt-Universität.
Auch bei meiner Familie und meinem Freund bedanke ich mich für die aufmunternden aber
auch mahnenden Worte, ohne die diese Arbeit wohl niemals fertig geworden wäre. Bei
meiner kleinen Tochter bedanke ich mich für die regelmäßigen Ruhezeiten, in denen ich
ungestört am Schreibtisch habe sitzen können.
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