Dokument_28

Identifizierung und funktionelle Charakterisierung
von SGK1 als neues Zielgen der Wnt-Signaltransduktion
Den Naturwissenschaftlichen Fakultäten
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
zur
Erlangung des Doktorgrades
vorgelegt von
Manuel Dehner
aus Rothenburg o. d. Tauber
Als Dissertation genehmigt von den Naturwissenschaftlichen Fakultäten
der Universität Erlangen-Nürnberg
Tag der mündlichen Prüfung:
11. April 2008
Vorsitzender
der Prüfungskommission:
Prof. Dr. Eberhard Bänsch
Erstberichterstatter:
Prof. Dr. Jürgen Behrens
Zweitberichterstatter:
PD. Dr. Robert Slany
INHALTSVERZEICHNIS
1
Inhaltsverzeichnis
1
INHALTSVERZEICHNIS
3
2
SUMMARY
6
3
ZUSAMMENFASSUNG
7
4
EINLEITUNG
8
4.1
Der Wnt-Signaltransduktionsweg
8
4.1.1
Klassischer Wnt-Signalweg
4.1.2
Rolle des klassischen Wnt-Signalweges in der kolorektalen Karzinogenese
11
4.1.3
Nicht kanonische Wnt-Signalkaskaden
12
4.1.4
Der Wnt-Signalweg in anderen Spezies
12
4.2
SGK1 - Serum und Glucocorticoid induzierbare Kinase 1
8
13
4.2.1
Proteinkinasen und ihre Regulation
13
4.2.2
Funktion und Regulation von SGK
14
4.3
Die Transkriptionsfaktoren Forkhead Box O (FoxO)
16
4.3.1
Die Fox-Familie
16
4.3.2
Die Gruppe der FoxO-Proteine
17
4.3.3
Regulation von FoxO-Transkriptionsfaktoren
18
4.3.4
Aktivierung von Zielgenen durch FoxO3a
21
5
ZIELSETZUNG
22
6
ERGEBNISSE
23
6.1
Identifikation von SGK1 als neues Zielgen des Wnt-Signalweges
23
6.1.1
Regulation der Expression von SGK1 durch den Wnt-Signalweg
23
6.1.2
Regulation des SGK1-Promotors durch den Wnt-Signalweg
28
6.2
Regulation von Transkriptionsfaktoren der FoxO-Familie durch den Wnt-Signalweg
32
6.2.1
Einfluss des Wnt-Signalweges auf die Lokalisation von FoxO3a
32
6.2.2
Einfluss des Wnt-Signalweges auf die transkriptionelle Aktivität von FoxO3a
36
6.2.3
Regulation der transkriptionellen Aktivität von FoxO3a durch den Wnt-Signalweg in
HEK293T und LS174T
40
3
INHALTSVERZEICHNIS
6.3
Regulation der FoxO3a Aktivität durch den Wnt-Signalweg über SGK1
6.4
Analyse der Spezifität von Regulatoren des Wnt-Signalweges in Bezug auf die Regulation der
6.5
transkriptionellen Aktivität von FoxO3a
47
Veränderung der Apoptoserate durch den Wnt-Signalweg
49
6.5.1
Einfluss des Wnt-Signalweges auf die Transkription der FoxO3a-Zielgene Bcl2-interacting
6.5.2
7
42
mediator (BIM) und p27KIP1
49
Inhibierung der FoxO3a-induzierten Apoptose durch den Wnt-Signalweg
51
DISKUSSION
53
7.1
Neues Zielgen des Wnt-Signalweges: SGK1
53
7.2
Direkte oder indirekte Regulation von SGK1 durch den Wnt-Signalweg
54
7.3
Regulation von FoxO3a durch den Wnt-Signalweg über SGK1
55
7.4
Einfluss des Wnt-Signalweges auf die FoxO3a-induzierte Apoptose
58
7.5
SGK1 und Tumorigenese
59
7.5.1
Möglicher Einfluss auf die Tumorigenese von SGK1 durch die Regulation von epithelialen
7.5.2
Natriumkanälen (ENaC)
59
Veränderungen des Expressionsprofils von SGK1 im Verlauf der Tumorigenese
60
7.6
Fox-Proteine und Tumorigenese
61
7.7
Der Wnt-Signalweg und Tumorigenese
63
8
MATERIAL UND METHODEN
8.1
Material
65
65
8.1.1
Puffer und Lösungen
65
8.1.2
Weitere Reagenzien und Enzyme
68
8.1.3
Verbrauchsmaterialien
70
8.1.4
Geräte
70
8.1.5
Oligonukleotide
71
8.1.5.1
Oligonukleotide zur Analyse der Expression von Genen
71
8.1.5.2
Oligonukleotide für Klonierungen
71
8.1.5.3
Oligonukleotide für Sequenzierungen
73
8.1.5.4
Small interfering RNA Oligonukleotide
73
8.1.6
Organismen
74
8.1.7
Antikörper
74
4
INHALTSVERZEICHNIS
8.1.8
8.2
Vektoren
Methoden
75
80
8.2.1
Anzucht von Bakterien
80
8.2.2
Herstellung kompetenter Bakterien
80
8.2.3
Transformation von Bakterien
81
8.2.4
Plasmidisolierung aus Bakterien
81
8.2.5
Extraktion von DNA aus TAE-Agarosegelen
81
8.2.6
DNA-Reinigung und Fällung
82
8.2.7
Bestimmung der DNA- bzw. RNA-Konzentration
82
8.2.8
Sequenzierung von DNA-Fragmenten
82
8.2.9
Kultur und Transfektion von Säugerzellen
83
8.2.10
Zählen von Zellen und Anlegen von Dauerkulturen
83
8.2.11
Transiente Transfektion
83
8.2.12
Reporterassays
84
8.2.13
SDS-PAGE und Western Blot Analyse
84
8.2.14
RNA-Isolierung
85
8.2.15
Reverse Transkriptase-PCR (RT-PCR)
85
8.2.16
Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) für Klonierungen
86
8.2.17
Kolonie-PCR
87
8.2.18
DNA-Microarrays und Analyse der Expression von Genen
87
8.2.19
Quantitative Echtzeit-PCR (real time RT-PCR)
88
8.2.20
Immunfluoreszenzfärbung von Zellen
89
8.2.21
Apoptose Messung, TUNEL
89
9
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
91
9.1
Abkürzungen
91
9.2
Aminosäuren
93
9.3
Dimensionen
93
9.4
Einheiten
94
10
ANHANG
95
10.1
Ergebnisse der DNA-Microarray Analyse im HCT116 (RNAi)-System
95
10.2
Ergebnisse der DNA-Microarray Analyse im DLD1-dnTCF4 (-/+dox)-System
96
11
LITERATURVERZEICHNIS
102
5
SUMMARY
2
Summary
β-catenin is the major effector of the canonical Wnt signaling pathway. Mutations in
components of the pathway that stabilize β-catenin result in augmented gene transcription and
play a major role in human cancer. To clarify the role of stabilized β-catenin in colorectal
carcinogenesis, the aim of this study was to search for genes involved in the β-catenin/Tcf
signaling and analyze their role in tumorigenesis.
Serum- and glucocorticoid-inducible kinase 1 (SGK1) was identified as a new target gene
of the Wnt signaling pathway. When the pathway was superactivated by ablation of APC in
HCT116 cells, which have a stabilized mutated form of β-catenin, SGK1 was one of the most
upregulated genes as determined by DNA microarray analysis. Concomitant Knock-Down of
β-catenin showed the specific regulation of SGK1 by β-catenin. The regulation of SGK1 by
Wnt signaling was confirmed by quantitative real-time RT-PCR and Western blot analysis in
several cellular systems in which the β-catenin signaling was activated or inhibited at
different levels of the pathway. In addition promoter reporter experiments confirmed the βcatenin dependent regulation of SGK1.
A known function of SGK1 is to negatively regulate the pro-apoptotic transcription factor
FoxO3a via phosphorylation. In immunofluorescence experiments it was observed that Wnt
signaling leads to the exclusion of FoxO3a out of the nucleus. Reportergen experiments
showed that this Wnt mediated effect on FoxO3a localization has also an influence on the
transcriptional activity of FoxO3a. Wnt signaling inhibits the transcriptional activity of
FoxO3a, and also of the promoter reporter constructs of two FoxO target genes, BIM and
p27KIP1. A FoxO3a mutant which cannot be regulated by SGK1 anymore was employed and
compared with wild type FoxO3a in immunofluorescence and reporter analyses. The results
indicate that the observed effects are mediated via the upregulation of SGK1 and subsequent
phosphorylation of FoxO3a. Furthermore, to assess apoptosis TUNEL experiments were
performed and could reveal the inhibition of FoxO3a-induced apoptosis by Wnt signaling.
These results indicate that via the upregulation of SGK1 the Wnt signaling pathway
contributes to colorectal cancer not only via activation of proliferation but also by inhibition
ofapoptosis.
6
ZUSAMMENFASSUNG
3
Zusammenfassung
β-Catenin ist das zentrale Signalmolekül innerhalb der kanonischen Wnt-Signaltransduktion.
Mutationen von Komponenten dieses Signalweges, die eine Stabilisierung von β-Catenin und
somit eine gesteigerte Transkription der Zielgene zur Folge haben, spielen eine entscheidende
Rolle im humanen Krebs. Um die Rolle von stabilisiertem β-Catenin in der kolorektalen
Karzinogenese weiter aufzuklären, war das Ziel dieser Arbeit nach neuen Zielgenen von βCatenin zu suchen und deren Funktion in der Tumorigenese zu erforschen.
Serum- und Glucocorticoid induzierbare Kinase 1 (SGK1) wurde als neues Zielgen des
Wnt-Signaltransduktionsweges identifiziert. In DNA Microarray Analysen war SGK1 eines
der am stärksten regulierten Gene bei einer siAPC-vermittelten Superaktivierung des WntSignalweges in HCT116 Zellen, die bereits stabilisiertes β-Catenin haben. Die spezifische
Regulation von SGK1 durch β-Catenin wurde durch einen simultanen Knock-Down von APC
und β-Catenin nachgewiesen. Die Regulation von SGK1 durch die Wnt-Signaltransduktion
wurde mittels quantitativer Echtzeit-PCR und Westernblot Analyse bestätigt. Diese
Untersuchungen wurden in verschiedenen zellulären Systemen, in denen der Signalweg auf
unterschiedlichen Ebenen aktiviert oder blockiert werden konnte, durchgeführt. Zusätzlich
bekräftigen Promotorreportergen-Experimente eine β-Catenin/TCF abhängige Regulation von
SGK1.
Eine bekannte Funktion von SGK1 ist, den pro-apoptotischen Transkriptionsfaktor
FoxO3a durch Phosphorylierung negativ zu regulieren. Nach Aktivierung der β-CateninSignaltransduktion konnte in Immunfluoreszenz- (IF-) Experimenten eine Translokation von
FoxO3a aus dem Zellkern beobachtet werden. Reportergen-Experimente zeigten, dass ein
aktivierter Wnt-Signaltransduktionsweg sowohl die FoxO3a-abhängige Transkription als auch
die Aktivität von Promotorreporter-Konstrukten zweier FoxO3a-Zielgene, BIM und p27KIP1,
inhibiert. Ein Vergleich in IF- und Reportergen-Experimenten von Wildtyp mit mutiertem
FoxO3a, welches nicht mehr von SGK1 kontrolliert wird, deutet darauf hin, dass die
beobachteten Effekte durch die Aktivierung von SGK1 vermittelt werden. Zusätzlich zeigen
Apoptose/TUNEL-Messungen eine Inhibierung der FoxO3a-induzierten Apoptose durch den
Wnt-Signaltransduktionsweg.
Diese Ergebnisse deuten auf einen weiteren, die Tumorigenese fördernden,
Mechanismus des Wnt/β-Catenin-Signaltransduktionweges hin: Zusätzlich zur Aktivierung
der Proliferation wird aufgrund der Hochregulation von SGK1 die Apoptose supprimiert.
7
EINLEITUNG
4
4.1
Einleitung
Der Wnt-Signaltransduktionsweg
In der westlichen Welt ist Dickdarmkrebs eine häufig auftretende Erkrankung, die eine hohe
Todesrate hat. Sie fordert innerhalb der Krebserkrankungen die meisten Todesopfer, nach den
durch Rauchen verursachten Krebsformen. Der Krankheitsverlauf beginnt mit anormalen
Auswüchsen von Adenompolypen aus dem Darmepithel, welche sich letztendlich zu
aggressiven Karzinomen entwickeln (Kinzler and Vogelstein, 1996; Nathke, 2004a; Radtke
and Clevers, 2005). In den meisten Fällen ist das Wachstum der Polypen mit einer
Veränderung/Mutation zweier Gene des sogenannten kanonischen Wnt-Signalweges, den
Genen von Adenomatous Polyposis Coli (APC) (Fearnhead et al., 2001; Sparks et al., 1998)
und β-Catenin (Polakis, 2000; Sparks et al., 1998), assoziiert. Solche Mutationen können
spontan auftreten oder auch erblich bedingt sein (familiäres adenomatöses Polyposis
Syndrome, FAP). Neben dem „klassischen“ (kanonischen) Signalweg gibt es zwei weitere
Wnt-Signalkaskaden, die am Ende dieses Kapitels noch kurz vorgestellt werden.
4.1.1
Klassischer Wnt-Signalweg
Die physiologische Aufgabe dieses Signalweges ist es, durch Veränderung des
transkriptionellen Programms Wachstum, Fortbestand und Differenzierung der Zelle zu
regulieren (Seidensticker and Behrens, 2000). In Abbildung 1 ist die Signalweiterleitung des
klassischen Wnt-Signalweges vereinfacht dargestellt. Eine Hauptrolle spielt β-Catenin,
welches das Wnt-Signal übermittelt indem es im Zellkern an Transkriptionsfaktoren der
Lef/TCF (T-cell Factor)-Familie bindet (Behrens et al., 1996). Solche Komplexe binden an
definierte Sequenzen der DNA (TCF-Bindestellen) und aktivieren so die Transkription von
Zielgenen. Der β-Catenin-Level wird mittels proteasomaler Degradation kontrolliert und
durch einen Multiproteinkomplex (Abbaukomplex) gesteuert, der die Proteine APC,
Glykogen Synthase Kinase 3β (GSK3β), Casein Kinase 1ε (CK1) und die Gerüstfaktoren
Axin1 und Axin2/Conductin beinhaltet (Behrens et al., 1998; Lustig and Behrens, 2003;
8
EINLEITUNG
Seidensticker and Behrens, 2000). In diesem Abbaukomplex wird β-Catenin durch
GSK3β und CK1 an spezifischen, N-terimalen Serin- und Threoninresten phosphoryliert (Liu
et al., 2002; Rubinfeld et al., 1996; Zeng et al., 1997), dadurch von der E3 Ubiquitin Ligase
β-TrCP ubiquitiniert und anschließend im Proteasom degradiert. Eine andere Funktion von βCatenin in der Zelle ist die Beteiligung an der Vermittlung von Zell-Zell-Kontakten. Über αCatenin stellt es eine Verbindung vom Aktinzytoskelett zu dem Adhesionsmolekül ECadherin her (Ozawa et al., 1989).
Eine
Aktivierung
des
klassischen
Wnt-Signalweges,
zum
Beispiel
während
der
Embryonalentwicklung, geschieht durch Bindung von Wnt-Glykoproteinen an Frizzled
Rezeptoren und LRP (Low-Density Lipoprotein-Receptor-Related)-Korezeptoren (Pinson et
al., 2000; Tamai et al., 2000; Willert et al., 2002). Dadurch wird Dishevelled an die
Plasmamembran rekrutiert, aktiviert und vermittelt eine Blockade des Abbaukomplexes, was
zur Stabilisierung von β-Catenin führt (Behrens, 2005; Bhanot et al., 1996). Angereichertes βCatenin transloziert in den Zellkern und aktiviert die Transkription von Zielgenen. Zu diesen
zählen auch Gene, die Tumorinvasion und Metastasenbildung fördern. Dazu gehören die
Zellzyklus-regulierenden Faktoren Cyclin D1 (Tetsu and McCormick, 1999) und c-myc (He
et al., 1998), das gegen den programmierten Zelltod (Apoptose) fungierende Survivin (Zhang
et al., 2001b) sowie VEGF (Vascular Endothelial Growth Factor), das die Angiogenese
vorantreibt (Zhang et al., 2001b) und die Matrix-abbauenden Proteasen MMP7 (Brabletz et
al., 1999) und MMP26 (Marchenko et al., 2002). In ungefähr 80 % sporadischer, kolorektaler
Tumore finden sich Mutationen im APC-Gen, wie auch in geringer Anzahl im Gen für βCatenin oder anderen Komponenten des Abbaukomplexes. Solche Mutation resultieren in
einem stetig aktiven Signalweg, was die Krebsentstehung, insbesondere die kolorektale
Karzinogenese, aber auch die anderer Krebsarten begünstigt (Morin et al., 1997). Dies wurde
bereits durch viele Untersuchungen gezeigt (Fox and Lyon, 2006; Oliva et al., 2006; Roberts
et al., 2006). Dennoch ist der genaue Mechanismus noch nicht aufgeklärt und so besteht
weiterhin großes Interesse, beteiligte Faktoren zu identifizieren, um das Verständnis der
Karzinogenese zu erweitern und zu vervollständigen. Der Fokus dieser Arbeit lag auf der
Identifizierung neuer Zielgene des Wnt-Signalweges und der Untersuchung ihrer Funktion bei
der Entstehung und Progression von Krebs.
9
EINLEITUNG
Abbildung 1: Vereinfachte Darstellung des kanonischen Wnt-Signaltransduktionsweges (nach
Behrens, 2005)
β-Catenin wird in Abwesenheit von Wnt-Faktoren (-Wnt) in dem Abbaukomplex bestehend aus Axin und
Axin2/Conductin und APC (adenomatous polyposis coli) durch GSK3β phosphoryliert (+P). Phosphoryliertes βCatenin wird ubiquitiniert (Ub) und im Proteasom abgebaut. Bindung von Wnt-Faktoren an Frizzled-Rezeptoren
und LRP-Correzeptoren aktiviert Dishevelled, welches den Abbaukomplex blockiert. β-Catenin reichert sich an,
transloziert in den Zellkern, komplexiert mit Transkriptionsfaktoren der TCF-Familie und aktiviert die Transkription
von Zielgenen durch Bindung an spezifischen Promotorelementen - weitere Erläuterungen im Text.
10
EINLEITUNG
4.1.2
Rolle des klassischen Wnt-Signalweges in der kolorektalen Karzinogenese
Wie bereits erwähnt, sind Mutationen im APC-Gen verantwortlich für die familiäre
adenomatöse Polyposis coli (FAP) und in den meisten sporadischen Kolonkarzinomen
nachweisbar. APC-Mutationen treten bereits früh während der kolorektalen Tumorigenese auf
und scheinen eine entscheidende Rolle bei der Entstehung von Kolonkarzinomen zu spielen
(Powell, 2002). Mausmodelle haben gezeigt, dass Mäuse, die heterozygot für Mutationen im
APC-Gen sind, welche in einem verkürzten APC-Protein resultieren, unausweichlich Tumore
entwickeln (Nathke, 2004b). Ein konditionaler Knock-Out beider APC-Allele im Kolorektum
hat eine rasche Entwicklung von Adenomen zur Folge (Shibata et al., 1997). Die
Hauptaufgabe des Tumorsuppressors APC scheint die Rolle als Antagonist des
Wnt-Signalweges im Darmepithel zu sein (Fodde et al., 2001). Die Zellen des Darmepithels
haben aufgrund der sehr feindlichen Umweltbedingungen im Darm durch chemischen und
mechanischen Stress eine begrenzte Lebensdauer von etwa drei bis fünf Tagen. Es findet ein
ständiger Austausch dieser Zellen statt. Am Grund der Krypten des Epithels befinden sich
Stammzellen, die für die Nachbildung der Zellen sorgen. Durch assymetrische Zellteilung
entstehen zunächst Vorläuferzellen, die nach weiteren Mitosen schließlich zu den vier
Zelltypen
(Becherzellen,
enteroendokrinen
Zellen,
absorptiven
Epithelzellen
und
Panethzellen) des Darmepithels ausdifferenzieren. Die Zellen wandern während dieses
Prozesses an das obere Ende der Villi des Dünndarms bzw. des Oberflächenepithels der
Krypten im Kolon. Dort durchlaufen sie schließlich den apoptotischen Zelltod und werden
abgeschilfert. Eine Störung der Regulationsprozesse, die die Homöostase des Darmepithels
steuern, kann zur Entstehung von Tumoren führen (Nathke, 2004b).
Eine Schlüsselrolle bei der Aufrechterhaltung des Stammzellkompartiments in den Krypten
spielt die Regulation von β-Catenin. Zu den Zielgenen der β-Catenin/TCF-vermittelten
Transkription zählen unter anderen c-myc und CyclinD1, die eine wichtige Rolle bei der
Zellproliferation, Apoptose und Zellzyklusregulation spielen und denen daher eine
maßgebliche Bedeutung bei der Tumorentstehung zugesprochen wird. Im gesunden
Darmepithel ist die Kernexpression von β-Catenin in den Stammzellen am Grund der Krypten
erhöht und erhält die Proliferationskapazität des Stammzellenkompartiments aufrecht. Der
Antagonist APC hingegen ist besonders im Bereich der differenzierenden Zellen im oberen
Bereich der Krypten, aber kaum im Stammzellkompartiment nachzuweisen. Durch diese
APC-vermittelten Gradienten von β-Catenin wird die Differenzierung der Vorläuferzellen
ermöglicht. Wie schon angesprochen, können sowohl Mutationen im APC-Gen oder auch im
11
EINLEITUNG
β-Catenin-Gen zur konstitutiven Aktivierung von β-Catenin führen. Dadurch wird das
Stammzellkompartiment durch unangemessene Proliferation erweitert, was eine verminderte
Differenzierung zur Folge hat und schließlich die Bildung von adenomatösen Polypen
induziert (Fodde, 2003; Fodde and Smits, 2002; Radtke and Clevers, 2005).
4.1.3
Nicht kanonische Wnt-Signalkaskaden
Die beiden anderen Kaskaden des Wnt-Signalweges sind der Wnt/PCP (Planar Cell Polarity)Signalweg und der Wnt-Calcium-Signalweg. Durch eine Aktivierung des Wnt-CalciumSignalweges wird intrazelluläres Calcium (Ca2+) erhöht und dadurch Ca2+-sensitive
Signalkomponenten aktiviert, wie zum Beispiel die Protein Kinase C (PKC) und die
Calmodulin Kinase II (CamKII) (Kuhl et al., 2000). Die Signalkaskade, die durch PKC
aktiviert wird, kann auf Zell-Motilität, Morphogenese, Apoptose und auch Differenzierung
Einfluss nehmen. Dieser nicht-kanonische Signalweg kann auch mit dem kanonischen
interagieren, allerdings ist nicht klar, ob der Wnt-Calcium-Signalweg in Säugern konserviert
ist und ob er in der Tumorigenese eine Rolle spielt.
Der Wnt/PCP-Signalweg ist an der Etablierung der Zellpolarität beteiligt. Dieser Signalweg
aktiviert die Kinasen RhoA und Jun und ist dadurch an der Gestaltung des Zytoskeletts, sowie
der Morphologie und Polarität von Geweben beteiligt (Montcouquiol et al., 2006). Polarität
ist während der Entwicklung ein wichtiges Merkmal, um manchen Zellen eine bestimmte
Orientierung zu verschaffen. Beispiele für die Wichtigkeit einer solchen Orientierung finden
sich bei den Haaren und auch bei den Federn von Vögeln. Hier ist eine richtige Orientierung
für eine korrekte Funktion sehr entscheidend. Dies ist auch bei sensorischen Häarchen im Ohr
von Vertebraten der Fall (Strutt, 2003). In kürzlich veröffentlichen Studien wurde auch eine
wichtige Rolle dieses Signalweges bei der Regulation der konvergenten Extension während
der Gastrulation der Embryonen von Vertebraten gezeigt (Moriguchi et al., 1999; Yamanaka
et al., 2002).
4.1.4
Der Wnt-Signalweg in anderen Spezies
Auch in anderen Organismen ist β-Catenin ein wichtiger Transkriptionsfaktor. In Zebrafisch
und Xenopus bestimmen die β-Catenin-Signale die Ausbildung der Körperachse (Larabell et
12
EINLEITUNG
al., 1997; Moon and Kimelman, 1998). Heasman und Kollegen (Heasman et al., 1994) zeigen
als Folge der Überexpression von β-Catenin die Formierung einer zweiten Körperachse
(Heasman et al., 1994). Auch in der Maus führt ein konstitutiv aktiver Wnt-Signalweg zu
Fehlentwicklungen: Durch Überexpression von Wnt8 z. B. wird auch in der Maus eine zweite
Körperachse ausgebildet (Popperl et al., 1997). Weiter sind in der Maus β-Catenin-Signale
entscheidend für die Entwicklung der anterior-posterior Achse und der sich anschließenden
Bildung des Mesoderms. Anteriore Markergene wie Cerberus-like und Lim1 sind in βCatenin Knock-Out Embryonen fehlerhaft lokalisiert. Dies hat zur Folge, dass kein Mesoderm
und keine Kopfstrukturen gebildet werden. (Huelsken et al., 2000).
4.2
SGK1 - Serum und Glucocorticoid induzierbare Kinase 1
4.2.1
Proteinkinasen und ihre Regulation
Proteinkinasen sind eine wichtige Klasse von regulatorischen Molekülen, die als
Kommunikationskanäle fungieren, um Signale von der Zelloberfläche ins Innere und in den
Zellkern zu übermitteln. Durch schnelle und reversible Phosphorylierung spezifischer
Substrate kontrollieren sie eine große Bandbreite an komplexen, biologischen Prozessen
(Hunter, 2000; Karin and Hunter, 1995). Die Mehrheit der Proteinkinasen wird durch
posttranslationale Phosphorylierung und Dephosphorylierung reguliert, dadurch wird ihre
Enzymaktivität gesteuert (Hunter, 2000; Karin and Hunter, 1995). Manche Kinasen können
auch durch spezifische, blockierende oder stimulierende Moleküle, durch Kontrolle der
Expression oder Veränderung der Lokalisation in der Zelle reguliert werden (Donohue et al.,
1995; Hollister et al., 1997; Holtrich et al., 1994; Hunter, 2000; Simmons et al., 1992). SGK
(Serum und Glucocorticoid induzierbare Kinase) ist in viele Signalwege von Oberflächenund Kernrezeptoren, sowie auch bei der Regulation von Zellen auf Stress-Stimuli
eingebunden.
13
EINLEITUNG
4.2.2
Funktion und Regulation von SGK
Die Verfügbarkeit und Funktion von SGK wird durch unterschiedliche, Stimulus-aktivierte
Kaskaden auf drei verschiedenen Ebenen der zellulären Kontrolle reguliert. Erstens wird die
Expression von SGK durch eine Vielzahl an extrazellulären, hormonellen und nichthormonellen Reizen stimuliert. Zweitens wird SGK als eine stromabwärts liegende
Komponente der Phosphoinositol-3 Kinase-Kaskade phosphoryliert und enzymatisch
aktiviert. Drittens wird die subzelluläre Lokalisierung von SGK durch den Zellzyklus, durch
spezifische Hormone und durch Stress-Stimuli aus dem umgebenden Milieu kontrolliert.
Auf der Suche nach Hormon-regulierten Genen, die bei der Kontrolle des Wachstums von
Tumorzellen beteiligt sind, wurde SGK bei einer subtraktiven Hybridisierung aus
Brusttumorzellen der Ratte isoliert (Webster et al., 1993a; Webster et al., 1993b). SGK wurde
als Kinase beschrieben, die sowohl durch Serum als auch Glucocorticoide transkriptionell
reguliert wird (Webster et al., 1993a; Webster et al., 1993b). Das SGK1-Gen kodiert ein
50 kDa Protein, das zur Familie der „AGC“-Serin/Threonin Proteinkinasen gehört. SGK
besitzt eine katalytische Domäne, die ~ 45-55 % homolog zu katalytischen Domänen von
mehreren gut charakterisierten, konstitutiv exprimierten Serine/Threonin Proteinkinasen ist,
wie z. B. von PKB/Akt, Proteinkinase A oder Proteinkinase C-Zeta (Webster et al., 1993b).
Eine Vielzahl von Veröffentlichungen weisen SGK eine Rolle bei der Weiterleitung von
Signalen zu, die für das Überleben der Zelle wichtig sind. Auch bei der Signalübertragung für
die Regulation der Proliferation wird SGK eine wichtige Funktion zugeordnet (Brunet et al.,
2001; Buse et al., 1999; Mikosz et al., 2001; Webster et al., 1993b; Xu et al., 2001). Des
Weiteren ist SGK in die Aktivitätskontrolle von epithelialen Natrium Kanälen (ENaC) und
der Natrium-Homeostase involviert (Alvarez de la Rosa et al., 1999; Chen et al., 1999;
Kamynina and Staub, 2002; Naray-Fejes-Toth et al., 1999; Shigaev et al., 2000).
Die Transkription von SGK wird durch eine Vielzahl von externen Stimuli, zu denen
Wachstumsfaktoren wie Insulin und HGF (hepatocyte growth factor) oder Steroidhormone
zählen, aktiviert. Dies geschieht Zelltyp-spezifisch und Stimulus-abhängig durch hormonelle,
Mitogen-vermittelte und zelluläre Stresssignale. (Bell et al., 2000; Brennan and Fuller, 2000;
Chen et al., 1999; Cowling and Birnboim, 2000; Imaizumi et al., 1994; Maiyar et al., 1997;
Mizuno and Nishida, 2001; Naray-Fejes-Toth et al., 1999; Shigaev et al., 2000; Waldegger et
al., 1997; Webster et al., 1993a; Webster et al., 1993b).
14
EINLEITUNG
Die enzymatische Aktivität und Phosphorylierung von SGK wird ebenfalls durch
Wachstumsfaktoren (Buse et al., 1999), Insulin (Park et al., 1999) oder auch hyperosmotische
Bedingungen (Bell et al., 2000) reguliert. Wie schon erwähnt ist SGK ein stromabwärtsliegender Faktor der Phosphoinositol-3 Kinase-Kaskade und wird durch die Phosphatidylabhängige Proteinkinase-1 (PDK1) und PDK2, am Aminosäurerest Serin422 phosphoryliert.
Darauf folgt eine weitere Phosphorylierung der Aminosäure Threonin256, wodurch SGK
enzymatisch aktiviert ist (Park et al., 1999). SGK und PKB/Akt weisen große Ähnlichkeiten
in Bezug auf ihre katalytische Domäne auf. So konnten in einem Screen mit einer PeptidSammlung einige Proteine identifiziert werden, die für beide Kinasen Substrate darstellen
(Park et al., 1999). Es konnte bisher für die folgenden PKB/Akt Substrate gezeigt werden,
dass sie auch von SGK phosphoryliert werden: Glykogen Synthase Kinase-3 (GSK3), Raf
Kinase und die Mitglieder der FoxO-Gruppe der Transkriptionsfaktoren der ForkheadProteinfamilie (Brunet et al., 2001; Zhang et al., 2001a).
Ein anderer, wichtiger Mechanismus der Regulation von SGK ist die kontrollierte Verteilung
und Lokalisierung von SGK in der Zelle, was in epithelialen Zellen stringent Stimulusabhängig geregelt ist (Alliston et al., 2000; Bell et al., 2000; Buse et al., 1999; GonzalezRobayna et al., 1999). In Serum-kultivierten, epithelialen Brustzellen pendelt SGK zwischen
dem Nukleus und dem Zytoplasma synchron mit dem Zellzyklus. Während der G1-Phase ist
SGK überwiegend im Zytoplasma und im Verlauf von S- und G2/M-Phasen vorwiegend im
Kern lokalisiert (Buse et al., 1999).
In vielen Veröffentlichungen wird SGK1 als SGK bezeichnet, obwohl es zwei weitere
Isoformen (SGK2 und SGK3) gibt, die allerdings bisher sehr wenig untersucht worden sind.
In dieser Arbeit wurde ausschließlich mit SGK1 gearbeitet, und somit ist im Folgenden die
Bezeichnung SGK mit SGK1 gleichzusetzen. Für SGK3 gibt es Hinweise auf eine spezifische
Funktion dieser SGK-Isoform: Sie ist offensichtlich beim Interleukin-3 vermittelten
Überleben von hämatopoetischen Zellen involviert (Liu et al., 2000). Der Phänotyp einer
SGK1 Knock-Out Maus ist nicht sehr ausgeprägter. Es ist nur eine Beeinträchtigung der
Natriumkanäle in der Niere festzustellen.
Zusätzlich zu den SGK-Formen in Mensch, Ratte und Maus wurden auch Homologe in den
Genomen von diversen Spezies wie Frosch, Caenorhabditis elegans und auch Saccharomyces
cerevisiae identifiziert (Casamayor et al., 1999; Chen et al., 1999; Sun et al., 2000). Ein
wichtiger Grund für eine Konservierung von SGK ist wohl die Fähigkeit, dass sich ein
Organismus dadurch besser auf umgebungsbedingten Stress, wie extreme Änderung des
Nährstofflevels, Temperatur oder Osmolarität einstellen und so möglicherweise ein Überleben
15
EINLEITUNG
sichern kann. Diese durch SGK vermittelte Fähigkeit kann sowohl für einzellige, wie auch
vielzellige Organismen von großem Nutzen sein (Bell et al., 2000; Pearce, 2001).
SGK ist eine Proteinkinase, die als Signalmolekül bei der Regulation vieler biologischer
Prozesse beteiligt ist. Im Vergleich zu den meisten anderen Proteinkinasen unterscheidet sich
SGK durch die stringente Stimulus-abhängige Regulation ihrer Transkription, subzellulärer
Lokalisierung und enzymatischer Aktivität. Dadurch kann SGK als entscheidender Stimulusabhängiger Schalter fungieren, der zelluläre Reaktionen auf verschiedenste extrazelluläre
Signale steuert. Für einige Untersuchungen dieser Arbeit stand die Fähigkeit von SGK1 im
Vordergrund, die Mitglieder der Gruppe „O“ der Transkriptionsfaktoren der Forkhead Box
Familie zu regulieren.
4.3
Die Transkriptionsfaktoren Forkhead Box O (FoxO)
4.3.1
Die Fox-Familie
Forkhead Box (Fox)-Proteine sind eine Superfamilie von konservierten transkriptionellen
Regulatoren, die durch eine DNA-Bindedomäne - die Forkhead Box - charakterisiert sind. Im
Menschen umfasst die gesamte Proteinfamilie mehr als 100 Mitglieder, die von FoxA bis
FoxS aufgrund ihrer Sequenzähnlichkeit klassifiziert sind. Fox-Proteine steigern oder
unterdrücken die Transkription von Genen, indem sie Co-Faktoren oder Repressoren
rekrutieren. Der Name „Forkhead“ entstand, weil Mutationen des begründenden Mitgliedes
der gesamten Familie (jetzt FoxA), welches ursprünglich in Drosophila identifiziert wurde, zu
untypischen - gabelförmigen Verformungen des Kopfes führen (Carter and Brunet, 2007).
Manchmal werden Forkhead-Proteine auch als „winged helix“ Proteine bezeichnet, weil die
DNA-Bindedomäne aus drei α-Helices von zwei charakteristischen Schleifen flankiert wird,
welche wiederum einem Schmetterling ähneln (Carter and Brunet, 2007). Die Fox-Proteine
sind an den unterschiedlichsten biologischen Prozessen, wie Metabolismus, Entwicklung,
Differenzierung, Proliferation, Apoptose, Migration und Invasion beteiligt (Myatt and Lam,
2007). FoxE3 ist z. B. für eine korrekte Entwicklung des Auges nötig, wohingegen FoxP2
eine wichtige Rolle beim Erlernen von Sprachen spielt (Carter and Brunet, 2007). FoxM1 ist
ein wichtiger Faktor für die Steuerung von Zellzyklus und mitotischem Spindelaufbau (Myatt
and Lam, 2007). Bei der Beteiligung der Fox-Proteine an so vielen und unterschiedlichen
16
EINLEITUNG
Prozessen ist es nicht überraschend, dass ein Verlust oder eine Steigerung der Aktivität von
Fox-Proteinen den Zustand einer Zelle stark stören und dadurch zur Entstehung und
Progression von Krebs beitragen kann. Für einige Unterfamilien, wie FoxO, FoxM, FoxP,
FoxC und FoxA wurden bereits Nachweise erbracht, die eine direkte Verbindung zur
Tumorigenese aufzeigen. Aufgrund dessen werden einige dieser Fox-Faktoren auch als
Tumorsuppressor bzw. Onkogene bezeichnet (Myatt and Lam, 2007).
4.3.2
Die Gruppe der FoxO-Proteine
Die Faktoren der FoxO-Gruppe sind an der Regulation von Zell-Zyklus, Apoptose, DNAReparatur und Entgiftung beteiligt (Carter and Brunet, 2007). In die Gruppe „O“ sind die
Mitglieder eingeteilt, die durch den Insulin/PI3K-Signalweg reguliert werden. Die ersten
Hinweise dafür wurden durch genetische Studien in C. elegans erbracht. Sie zeigten, dass
PI3K die Funktion von DAF-16, einem homologen Transkriptionsfaktor der Forkhead „O“Gruppe in C. elegans, unterdrückt und dies zu erschwerter Kontrolle des Metabolismus und
der Lebensdauer führt (Lin et al., 1997; Ogg et al., 1997). Durch Analyse der
Aminosäuresequenz wurden drei Stellen in DAF-16 gefunden, die homolog zu AktPhosphorylierungsstellen sind. Das gab Anlass zur Vermutung, dass DAF-16 und andere
FoxO-Proteine direkte Substrate von Akt sind, was auch bestätigt werden konnte (Greer and
Brunet, 2005; Kops et al., 1999; Tran et al., 2003).
Im Menschen wurden drei Homologe zu DAF-16 identifiziert, FKHR (Forkhead in
rhabdomyosarcoma; FoxO1), FKHR-L1 (FKHR-like 1; FoxO3a) und AFX (acutelymphocytic-leukaemia-1; FoxO4). Diese Faktoren wurden schnell mit der Entstehung und
Progression von Krebs in Verbindung gebracht, da sie interessanterweise zuerst an
chromosomalen Bruchstellen (Translokationen) in menschlichen Tumoren identifiziert
wurden (Anderson et al., 1998; Borkhardt et al., 1997; Davis et al., 1994; Galili et al., 1993;
Hillion et al., 1997; Parry et al., 1994). In einigen Rhabdomyosarkomen sind die DNABindedomänen der Transkriptionsfaktoren PAX3 und PAX7, die für die neuromuskuläre
Differenzierung wichtig sind, mit der Transaktivierungs-Domäne von FoxO1 fusioniert
(Galili et al., 1993). Ganz ähnlich ist auch die DNA-Bindedomäne von MLL (mixed-linage
leukemia) - ein positiver Regulator der Hox-Gene während der Embryonalentwicklung - in
einigen Formen von Leukämie mit der Transaktivierungs-Domäne von FoxO3a oder FoxO4
verschmolzen (Anderson et al., 1998; Borkhardt et al., 1997). Solche Fusionen ändern das
17
EINLEITUNG
eigentliche Transaktivierungsschema der ursprünglichen Proteine und fördern dadurch die
Tumorigenese. Eine simultane Deletion von FoxO1, FoxO3a und FoxO4 verstärkt die
Voraussetzungen für Krebs deutlich, was durch Lymphome des Thymus charakterisiert ist.
Deswegen werden diese Faktoren auch als sogenannte „bona fide“ Tumorsuppressoren
bezeichnet (Myatt and Lam, 2007). FoxO-Proteine können durch mehrere Kinasen, wie
PKB/Akt, SGK1, JNK, DYRK1A, oder CDK2 phosphoryliert werden (Hu et al., 2004; Huang
et al., 2006; Woods et al., 2001). Diese posttranslationale Modifikation führt zum Export aus
dem Zellkern und dadurch zur transkriptionellen Inaktivierung von FoxO-Faktoren. In vielen
humanen Krebsformen sind Fehlregulationen von diesen genannten Kinasen zu beobachten,
die maßgeblich an der Tumorigenese beteiligt sind, da sie auch den nukleären Export und die
Degradation von FoxOs fördern (Bader et al., 2005; Heasley and Han, 2006). In vielen
Krebsarten ist auch der Wnt-Signaltransduktionsweg dahingehend beeinträchtigt, dass er
konstitutiv aktiviert ist. Dadurch wird, wie in der vorliegenden Arbeit gezeigt, die
Transkription von SGK1 erhöht, was wiederum eine Inhibierung von FoxO-Proteinen nach
sich ziehen und die Tumorigenese begünstigen kann.
Als letzter und daher noch am wenigsten untersuchte Faktor der FoxO Gruppe wurde FoxO6
identifiziert. Dieser enthält nur zwei der drei Akt/SGK-regulatorischen Stellen (Jacobs et al.,
2003). Abweichend von den anderen Faktoren dieser Gruppe ist FoxO6 hauptsächlich im
Kern lokalisiert. Einiges deutet darauf hin, dass sich FoxO6 in Regulation und Funktion von
den anderen Mitgliedern dieser Untergruppe unterscheidet (van der Heide et al., 2005).
4.3.3
Regulation von FoxO-Transkriptionsfaktoren
Die Regulation von FoxO-Proteinen geschieht durch Aktivierung der Transkription,
Degradation des Proteins, Veränderung der subzellulären Lokalisation, vor allem aber durch
Signal-vermittelte, posttranslationale Modifikationen, wie zum Beispiel Phosphorylierung,
Acetylierung oder Ubiquitinierung (Van Der Heide et al., 2004). Durch die PI3K-Kaskade
wird die direkte Phosphorylierung von FoxO-Proteinen vermittelt. Diese Regulation war in
vorliegenden Arbeit von Interesse und soll deswegen genauer erklärt werden. Durch die
PI3K-Kaskade wird die Lokalisierung von FoxO-Proteinen in der Zelle reguliert. Ohne
Zellstimulation befinden sich FoxOs im Nukleus. Durch Stimuli, wie zum Beispiel
Wachstumsfaktoren, wird die PI3K-Kaskade aktiviert. Deren Kinase PKB/Akt phosphoryliert
die FoxO-Proteine, wodurch der Export dieser Faktoren aus dem Zellkern induziert und somit
18
EINLEITUNG
ihre transkriptionelle Aktivität, das heißt die Expression von Zielgenen, inhibiert wird.
PKB/Akt kann FoxOs an drei Serin- und Threonin-Resten phosphorylieren, die in dieser
Untergruppe konserviert sind (Brunet et al., 1999; Kops et al., 1999). Wie bereits geschildert,
wird auch SGK1 durch den PI3K-Signalweg aktiviert und kann FoxO3a phosphorylieren und
inhibieren (Brunet et al., 2001). PKB/Akt und SGK1 phosphorylieren die gleichen
Aminosäurereste, allerdings mit unterschiedlicher Effizienz. Thr32 wird von beiden Kinasen
phosphoryliert, Ser253 vorwiegend durch PKB/Akt und Ser315 durch SGK1. Eine
Phosphorylierung jeder der regulatorischen Stellen von FoxO3a scheint aber entscheidend für
einen effizienten Ausschluss von FoxO aus dem Kern (Brunet et al., 2001). Wahrscheinlich
arbeiten PKB/Akt und SGK1 bei der Regulation von FoxO-Transkriptionsfaktoren
zusammen, um das Zellüberleben zu sichern. In Abbildung 2 ist die Regulation von FoxO
durch PKB/Akt und SGK1 kurz skizziert. In den FoxO-Proteinen findet sich sowohl ein NES(nuclear export signal) als auch ein NLS- (nuclear localisation signal) Motiv (Biggs et al.,
1999; Brunet et al., 2002). Es wurde gezeigt, dass phosphoryliertes FoxO mit 14-3-3
Proteinen interagiert, welche FoxO aus dem Nukleus eskortieren (Brunet et al., 1999). Eine
Interaktion von 14-3-3 Proteinen mit FoxO fördert wohl aktiv den Export, möglicherweise
durch eine Änderung der Konformation von FoxO, wodurch das NES-Motive freigelegt und
eine Interaktion mit Exportin/Crm ermöglicht wird (Brunet et al., 2002). Die Komplexe aus
FoxO und 14-3-3 bleiben im Zytoplasma, weil durch die Bindung mit 14-3-3 Proteinen
wahrscheinlich das NLS-Motiv überdeckt und so ein Re-Import von FoxO in den Kern
verhindert wird (Brownawell et al., 2001; Rena et al., 2001). Durch Mutationsanalysen der
drei Phosphorylierungsstellen konnte gezeigt werden, dass eine Phosphorylierung jeder dieser
Stellen zum Ausschluss von FoxO aus dem Kern beiträgt (Brunet et al., 2001).
Möglicherweise spielt das eine Rolle bei der Regulation in verschiedenen Zelltypen und bei
der Reaktion auf unterschiedliche Kombinationen von Signalen.
Proteinphosphatasen, die FoxO-Transkriptionsfaktoren an den Zielstellen von Akt/SGK
dephosphorylieren, sind noch nicht bekannt. Diese Phosphatasen hätten das Potential der
Funktion von PKB/Akt und SGK1 entgegenzuwirken und könnten FoxO-Proteine schnell
aktivieren, indem sie deren Wiedereintritt in den Kern induzieren. Andere Faktoren, die
FoxO-Proteinen den Wiedereintritt in den Nukleus ermöglichen, sind Stress-Stimuli, wie zum
Beispiel oxidativer Stress oder Hitzeschock. Durch sie werden die 14-3-3/FoxO-Komplexe
gespalten und FoxO transloziert in den Kern (Brunet et al., 2004; Kobayashi et al., 2005).
Beim Aufbrechen dieser Komplexe ist wahrscheinlich c-Jun NH2-terminale Kinase (JNK)
involviert. JNK ist ein Mitglied der Gruppe von Mitogen-aktivierten Kinasen und wird durch
Stress aktiviert, beispielsweise durch oxidativen Stress (Davis, 2000). Es ist möglich, dass 1419
EINLEITUNG
3-3 Proteine durch aktivierte JNK phosphoryliert werden, dadurch von FoxO dissoziieren und
so den Wiedereintritt von FoxO in den Kern erlauben.
Abbildung 2: Vereinfachte Darstellung der FoxO-Regulation durch PI3K/Akt/SGK1
Bei aktivem PI3K- (Phosphoinositol-3 Kinase) Signalweg werden Transkriptionsfaktoren der FoxO-Familie durch
Akt/SGK1 phosphoryliert und dadurch über die Exportmaschinerie CRM1-abhängig aus dem Zellkern exportiert.
In Komplexen mit 14-3-3 Proteinen verbleibt FoxO im Zytoplasma. Durch Lösen der Komplexe, z. B. durch
Stress-Stimuli, transloziert FoxO wieder in den Kern und aktiviert durch Bindung an spezifische
Promotorelemente (DBE) die Transkription von Zielgenen.
20
EINLEITUNG
Wie bereits erwähnt, können FoxO-Proteine auch durch andere posttranslationale
Modifikationen reguliert werden (Greer and Brunet, 2005; van der Horst et al., 2004). Durch
Acetylierung und Deacetylierung wird die transkriptionelle Aktivität von nukleärem FoxO
vor allem bei der zellulären Stress-Antwort gesteuert. Dies wird unter anderem durch CBP
(CREB-binding protein) und p300 bzw. von Deacetylasen der Sir2 Familie vermittelt (Brunet
et al., 2004; Daitoku et al., 2004; Fukuoka et al., 2003; Motta et al., 2004; Nasrin et al., 2000;
van der Horst et al., 2004). Ein weiterer Regulationsmechanismus von FoxO-Proteinen erfolgt
durch Ubiquitinierung. Hierbei ist eine Mono-Ubiquitinierung von Poly-Ubiquitinierung zu
unterscheiden: Letztere führt zu Degradation von FoxOs, wohingegen eine MonoUbiquitinierung den Wiedereintritt in den Nukleus und damit die transkriptionelle Aktivität
fördert (van der Horst et al., 2006).
4.3.4
Aktivierung von Zielgenen durch FoxO3a
Im Nukleus binden FoxO-Transkriptionsfaktoren als Monomere über die „Forkhead-Box“ an
eine Konsensus-Sequenz der DNA. Als optimale Sequenz für diese Interaktion wurde die
Abfolge TTGTTTAC ermittelt (Biggs et al., 1999; Furuyama et al., 2000). Wie schon
erwähnt, sind FoxO-Proteine unter anderem an der Regulation von Zellzyklus und Apoptose
beteiligt. Zwei für diese Arbeit relevante Zielgene von FoxO sind p27KIP1 und BIM (Bcl-2
interacting mediator). Die Aktivierung von BIM induziert die Apoptose (O'Connor et al.,
1998), p27KIP1 ist ein Inhibitor von CDKs (Cyclin-dependent kinases) und spielt eine wichtige
Rolle bei der Steuerung des Zellzyklus (Toyoshima and Hunter, 1994). In den Promotoren
dieser Gene befinden sich FoxO-Bindemotive und es wurde gezeigt, dass diese Gene durch
FoxO aktiviert werden (Dijkers et al., 2002; Dijkers et al., 2000a; Dijkers et al., 2000b;
Medema et al., 2000; Stahl et al., 2002). Es wurden noch viele weitere Zielgene von FoxOTranskriptionsfaktoren beschrieben, die je nach Kontext, also Zelltyp- und Stimulusabhängig, aktiviert werden (Arden, 2006; Furukawa-Hibi et al., 2005; Greer and Brunet,
2005).
21
ZIELSETZUNG
5
Zielsetzung
Eine anormale Aktivität des Wnt/β-catenin-Signaltransduktionsweges ist direkt mit der
Entstehung und Progression von Krebs assoziiert. Durch zahlreiche Untersuchungen konnte
schon ein gutes Verständnis der Karzinogenese erreicht werden. Allerdings ist der genaue
Mechanismus immer noch ungeklärt. Deshalb besteht weiterhin großes Interesse, involvierte
Faktoren zu identifizieren und deren Funktion bei der Tumorigenese zu erforschen. Ziel
dieser Arbeit war es neue Gene zu identifizieren, die durch β-Catenin reguliert werden und zu
untersuchen, welche Rolle diese Faktoren bei der Karzinogenese spielen.
22
ERGEBNISSE
6
Ergebnisse
6.1
Identifikation von SGK1 als neues Zielgen des Wnt-Signalweges
6.1.1
Regulation der Expression von SGK1 durch den Wnt-Signalweg
Zur Identifizierung von Wnt-regulierten Kandidatengenen wurden die beiden KolonkarzinomZelllinien HCT116 und DLD1 herangezogen, die beide einen stetig aktiven Wnt-Signalweg
aufweisen. Bei HCT116 liegt dies an einer Mutation von β-Catenin, welches dadurch nicht
mehr phosphoryliert und abgebaut werden kann. In DLD1 ist APC mutiert und es wird ein
verkürztes APC-Protein synthetisiert, das β-Catenin nicht mehr bzw. nur noch schlecht binden
kann. Dies führt zur Stabilisierung von β-Catenin, einem stetig aktiven Wnt-Signalweg und
daraus resultierend zu der Aktivierung von Zielgenen. Diese beiden Zelllinien wurden so
modifiziert, dass die Aktivität des Wnt-Signalweges verändert werden konnte. Im ersten
System wurde der Wnt-Signalweg in HCT116 Zellen durch den Knock-Down von APC
(Transfektion von siRNA gegen APC) überaktiviert (System und Funktionalität der siRNAs
in Hadjihannas et al. 2006). Als Kontrolle wurden Zellen mit siRNA gegen GFP transfiziert,
um die Grundaktivität bestimmen zu können (Ausgangswert). Zusätzlich wurden Zellen mit
siRNA gegen APC und β-Catenin zugleich transfiziert, um Gene zu ermitteln, die spezifisch
durch β-Catenin reguliert sind. Es sollten folglich solche Gene isoliert werden, die durch
Transfektion von siAPC noch stärker aktiviert und durch zusätzliche Transfektion von siβCatenin wieder inaktiviert werden.
Das zweite System wurde im Labor von Hans Clevers etabliert. In DLD1 Zellen wurde ein
dominant-negativ wirkendes TCF4 (dnTCF4) Konstrukt, welches durch Doxycyclin induziert
werden kann, stabil transfiziert und die neue Linie DLD1-dnTCF4 genannt (van de Wetering
et al., 2002). Dominant-negatives TCF4 ist N-terminal verkürzt und kann deswegen β-Catenin
nicht mehr binden. Es verhindert eine Aktivierung der Zielgene, da die DNA-Bindestellen für
TCF4/β-Catenin Komplexe durch dnTCF4 besetzt werden und durch Überexpression ein
dominanter Effekt erreicht wird. In den induzierten Zellen ist eine niedrige und in den nicht
23
ERGEBNISSE
induzierten Zellen eine starke Expression von Zielgenen des Wnt-Signalweges zu erwarten.
Im Folgenden werden die beiden Systeme als HCT116 (RNAi) und DLD1-dnTCF4 (-/+dox)
bezeichnet. Von den Zellen mit inhibierten, aktivierten und superaktivierten Wnt-Signalweg
wurde RNA isoliert, aufgereinigt, in cDNA umgeschrieben und die Genaktivität mittels
DNA-Microarray Analysen untersucht.
Die Funktionalität der Systeme wurde an dem bekannten Zielgen Axin2/Conductin durch RTPCR (Abb. 3A) und Westernblot-Analyse (Abb. 3B) überprüft. Axin2/Conductin steuert als
eine zentrale Komponente des β-Catenin-Abbaukomplexes die Stabilität von β-Catenin
(Behrens et al., 1998). Zusätzlich ist Axin2/Conductin ein gut charakterisiertes Wnt-Zielgen,
dessen Expression durch Wnt-Signale erhöht wird. Damit bildet Axin2/Conductin eine
Rückkopplungs-Schleife, die den Wnt-Signalweg negativ reguliert (Lustig et al., 2002). Die
RNA- und Proteinlevel von Axin2/Conductin zeigen in beiden Systemen eine Regulation die
der Aktivität des Wnt-Signalweges folgt. Die Level sind bei superaktiviertem bzw.
aktiviertem im Vergleich zum nicht aktivierten bzw. geblockten Signalweg deutlich erhöht
(vgl. HCT116: siAPC mit siGFP, DLD1-dnTCF4: –dox mit +dox). Im HCT116-System
werden diese Steigerungen durch Kotransfektion von siβ-Catenin wieder gesenkt und damit
die Spezifität auf den Wnt-Signalweg gezeigt. Damit ist bestätigt, dass die Systeme für die
Identifikation neuer Zielgene des Wnt-Signalweges geeignet sind.
24
ERGEBNISSE
Abbildung 3: Expressionsanalyse des β-Catenin Zielgenes Axin2/Conductin in Zellen mit
unterschiedlichem Aktivitätsstatus des Wnt-Signalweges
Stimulation des Wnt-Signalweges in den beiden zellulären Systemen HCT116 (RNAi) und DLD1-dnTCF4 (-/+dox)
auf unterschiedliche Weise als Funktionalitätstest der Systeme zur Identifikation von Zielgenen; in HCT116 mittels
transienter Transfektion von siAPC, siAPC/siβ-Catenin und siGFP als Kontrolle (je 100 nM) und in DLD1-dnTCF4
durch Zugabe von dox (1 µg/ml) A) semiquantitative RT-PCR Analyse, B) Westernblot-Analyse; β-Aktin diente
jeweils als Kontrolle.
Aus den Zellen beider beschriebener Systeme wurde RNA isoliert, aufgereinigt und in cDNA
umgeschrieben, um DNA-Microarrays (Affymetrix) anzufertigen. Bei der Auswertung der
Arrays wurden einige bereits bekannte Zielgene des Wnt-Signalweges bestätigt (wie z. B.
Axin2, c-myc, BMP4, Cox-2; siehe Kap.10 Anhang.), was ein weiterer Beleg für die
Zuverlässigkeit der gewählten Systeme ist. Axin2/Conductin diente hier, wie auch in
folgenden Experimenten als Positivkontrolle. In den Arrays wurde neben einigen schwach
regulierten Genen ein Gen beobachtet, das in beiden Systemen sehr stark und Wnt-spezifisch
reguliert ist: Serum- und Glucocorticoid induzierbare Kinase 1 (SGK1). Im HCT116 (RNAi)
System zeigen die Arraydaten eine Steigerung der Expression von SGK1 bei Überaktivierung
des Signalweges (siAPC) um das 3,3-fache (Tab.1). Durch zusätzlich Wegnahme von βCatenin (Inhibierung des Signalweges) wird das Expressionslevel wieder von 3,3- auf 2,4fach in Bezug auf das Ausgangniveau gesenkt. Axin2/Conductin wird bei Überaktivierung
des Wnt-Signalweges 8,1-fach hochreguliert und bei anschließender Inhibierung wieder auf
3,4-fach relativ zum Ausgangslevel gesenkt. Im zweiten System (DLD1-dnTCF4) zeigt SGK1
eine Steigerung von 5,9-fach beim Vergleich von aktivem (nicht induziertem) zu inaktivem
(induziertem) Wnt-Signalweg (Tab.1). Hier konnte Axin2/Conductin nicht als Kontrolle
herangezogen werden, da bei dieser Microarray Analyse der Chip HU-133 verwendet wurde,
25
ERGEBNISSE
auf welchem sich keine Sonde für Axin2/Conductin befindet. Allerdings wurden andere
bereits bestätigte Zielgene durch dnTCF4 herunterreguliert, wie z. B. c-myc (3,4-fach).
Die deutliche Regulation von SGK1 in beiden Testsystemen war ein erster Hinweis, dass
SGK1 ein neues Zielgen des Wnt-Signalweges darstellt. Um dies zu bestätigen, wurden
weitere Untersuchungen durchgeführt.
Tabelle 1: Regulation der Gene SGK1 und Axin2 durch den Wnt-Signalweg in der DNA
Microarray Analyse
Angeben sind die Quotienten der Signalwerte der Microarrays bei den angegebenen experimentellen
Bedingungen.
Zur Verifizierung der Ergebnisse der Microarrays wurde die Wnt-abhängige Regulation der
mRNA Expression von SGK1 durch quantitative Echtzeit RT-PCR in den beiden bereits
vorgestellten Zellsystemen analysiert. In Abb. 4 sind repräsentative Ergebnisse von
mindestens zwei unabhängigen Experimenten dargestellt. Sie zeigen eine mRNA-Expression
von SGK1, die in beiden Systemen durch einen aktiven bzw. superaktiven Wnt-Signalweg um
mehr als das 14-fache im DLD1-dnTCF4 (Abb. 4B) bzw. um mehr als das 3-fache im
HCT116-System (Abb. 4A) erhöht ist. In HCT116 wird dieses gesteigerte Level durch die
zusätzliche Wegnahme von β-Catenin wieder auf ein Niveau von 2-fach im Vergleich zum
Ausgangslevel gesenkt (Abb. 4A). Die mitgeführte Positivkontrolle Axin2/Conductin zeigt in
diesen Experimenten sehr ähnliche Ergebnisse und stützt die Annahme, dass SGK1 ein
Zielgen des Wnt-Signalweges ist.
26
ERGEBNISSE
Abbildung 4: Regulation der Expression von SGK1 durch den Wnt-Signalweg
Quantitative Echtzeit RT-PCR zur Analyse der Expression von SGK1 und Axin2 in den beiden Systemen A)
HCT116 (RNAi) und B) DLD1-dnTCF4 (-/+dox); gezeigt sind, nach Normalisierung auf β-Aktin die relativen mRNA
Expressionen im Verhältnis zu den auf eins gesetzten Ausgangswert (siGFP bzw. Kontrolle). In B) sind jeweils die
Faktoren der Genexpression angegeben, d. h. nach Normalisierung auf β-Aktin wurde der Expressionswert von
SGK1 von induzierten Zellen durch den Wert von nicht induzierten Zellen geteilt (-/+dox).
Nach der Validierung der Arraydaten auf mRNA Ebene wurde die Regulation des
Proteinlevels von SGK1 durch den Wnt-Signalweg untersucht. In der Westernblot-Analyse
(Abb. 5A+B) ist in den beiden Systemen eine Wnt-abhängige Proteinregulation von SGK1 zu
sehen. Bei aktivem bzw. superaktivem Signalweg sind die Proteinmengen im Vergleich zu
dem nicht aktivierten Signalweg deutlich gesteigert. Die Regulation der Proteinlevel von
Axin2/Conductin zeigt dasselbe Muster, allerdings in stärkerem Maße, denn bei nicht aktivem
Wnt-Signalweg wird es im Gegensatz zu SGK1 kaum exprimiert. Daraus kann geschlossen
werden, dass Axin2/Conductin sehr spezifisch für den Wnt-Signaltransduktionsweg ist,
wogegen für SGK1 auch andere Funktionen in unterschiedlichen Zusammenhängen
beschrieben sind (siehe Einleitung), und somit eine Regulation nicht exklusiv dem
Wnt-Signalweg vorbehalten ist.
Für die Analyse der Proteinregulation von SGK1 und Axin2/Conductin stand noch ein
weiteres Zellsystem zur Verfügung: Rat2 Zellen, die stabil mit einem Wnt-1 Konstrukt
transfiziert wurden und dadurch ein stetig aktiver Wnt-Signalweg erzeugt wurde (Giarre et al.,
1998; Lustig et al., 2002). Als Kontrolle wurden Rat2 Zellen mit dem Leervektor MV7 stabil
27
ERGEBNISSE
transfiziert. Auch hier sind die Proteinlevel von SGK1 und Axin2/Conductin beim Vergleich
von Rat2-Wnt1 Zellen mit Rat2-MV7 Zellen stark erhöht (Abb. 5C) und zeigen damit eine
Wnt-abhängige Regulation.
Abbildung 5: Regulation von SGK1 durch den Wnt-Signalweg
Westernblot-Analyse der Proteinregulation von SGK1 durch den Wnt-Signalweg in den Systemen A) HCT116
(RNAi), B) DLD1-dnTCF4 (+/-dox) und C) Rat2 (MV7/Wnt-1); Axin2 diente als Positiv- und β-Aktin als
Ladekontrolle.
Neben den DNA-Microarraydaten wurde in den verwendeten Zellsystemen eine
Wnt-Signalweg-abhängige Regulation von SGK1 auch auf mRNA- und Proteinebene gezeigt.
Diese ist der von Axin2/Conductin sehr ähnlich und untermauert die Annahme, dass SGK1
ein Zielgen des Wnt-Signalweges ist.
6.1.2
Regulation des SGK1-Promotors durch den Wnt-Signalweg
Die Aktivierung der Transkription von Zielgenen des Wnt-Signalweges wird durch Bindung
von
β-Catenin/TCF4-Komplexen
an
definierte
Sequenzen,
TCF-Bindestellen,
im
Promotorbereich der Gene vermittelt. Eine genauere Betrachtung der Sequenz des putativen
Promotorbereichs
(~3000 bp
stromaufwärts
des
Startcodons
ATG,
nach
Sanger;
www.sanger.ac.uk) von SGK1 und Untersuchungen dieses Bereichs durch Reporterassays
sollten die Regulation durch den Wnt-Signalweg weiter bestätigen, und Aufschluss darüber
28
ERGEBNISSE
geben, ob SGK1 ein direktes Zielgen von β-Catenin ist. In Abb. 6 ist der endogene
Sequenzbereich des potentiellen humanen SGK1-Promotors skizziert. Dieser Bereich weist
drei TCF-Bindemotive mit der definierten Sequenz CTTTGA/TA/T (Roose and Clevers,
1999; van de Wetering et al., 1997) an den Stellen -2806, -2513 und -1968 auf. Es wurden
drei Promotorreporter-Konstrukte kloniert (Abb. 6; SGK1 I-III). Das längste Konstrukt
enthält alle drei, das mittlere nur eine und das kürzeste keine der definierten TCFBindemotive. Diese drei Fragmente des SGK1-Promotors wurden mittels transienter
Transfektion in mehreren zellulären Systemen auf eine β-Catenin-abhängige Regulation
untersucht.
Abbildung 6: Schematische Darstellung des putativen Promotorbereichs von humanem SGK1
und der klonierten Reporterkonstrukte (nach Sanger: www.sanger.ac.uk)
schwarze Boxen (-2806, -2513 und -1968): TCF-Bindestellen (mit Positionsangabe des ersten Nukleotides der
potentiellen Bindestelle relativ zum Transkriptionsstart), Pfeil (+1): Transkriptionsstart, ATG (+58):
Translationsstart, luc: Luziferase-Reportergen, SGK1 I-III: Bezeichnung der Konstrukte mit Größenangabe der
Fragmente in Klammern.
Die Vermessung der Promotorreporter-Konstrukte von SGK1 wurde in den bereits
verwendeten Zellsystemen HCT116 (RNAi) und DLD1-dnTCF4 (-/+dox) zusammen mit dem
TOP/FOP-Reportersystem durchgeführt. Der TOP-Vektor trägt ein Luziferase-Gen unter
Kontrolle eines Minimalpromotors mit TCF-Bindestellen und dient als Postitivkontrolle für
eine TCF/β-Catenin-abhängige Transkription. In der Negativkontrolle FOP sind die TCFBindestellen
mutiert
und
dadurch
die
TCF/β-Catenin-abhängige
Aktivierung
der
29
ERGEBNISSE
Transkription verhindert. Als weitere Positivkontrolle (Ax2-luc) wurde ein Reporterkonstrukt
eingesetzt, bei dem das Luziferase-Gen unter der Kontrolle des endogenen Promotors von
Axin2/Conductin
steht
(Jho
et
al.,
2002).
Reporterexperimente
mit
den
SGK1-Promotorkonstrukten, TOP und Ax2-luc zeigen in HCT116 Zellen eine Regulation
durch den Wnt-Signalweg (Abb. 7). Die Luziferaseaktivitäten dieser Reporterkonstrukte
steigen durch einen Knock-Down des Tumorsuppressors APC mittels RNAi deutlich und
werden durch Transfektion von siRNA gegen β-Catenin unter das Ausgangsniveau (siRNA
gegen GFP) gesenkt (Abb. 7A). Die Negativkontrolle FOP bleibt unverändert. Auch in
DLD1-dnTCF Zellen kann eine Regulation der Promotorkonstrukte von SGK1 durch den
Wnt-Signalweg beobachtet werden (Abb. 7B). Beim Vergleich der Aktivitäten von doxinduziertem (inaktivem) mit nicht induziertem (aktivem) Wnt-Signalweg sind die
Luziferasewerte von den SGK1-Promotorkonstrukten und auch von den Kontrollen TOP und
Ax2-luc deutlich erniedrigt, wohingegen die Negativkontrolle FOP nicht beeinflusst wird
(Abb. 7B).
Die SGK1-Promotorkonstrukte wurden auch in SW480 Zellen getestet. Dies ist ebenfalls eine
Kolonkarzinom-Zelllinie, die durch eine Mutation im Gen für APC ein verkürztes Protein
synthetisiert und dadurch einen stetig aktiven Wnt-Signalweg aufweist. In den
Reporterexperimenten wurde durch Kotransfektion von Wildtyp APC (wtAPC) der
Signalweg wieder inaktiviert. Die Aktivität der SGK1-Konstrukte und auch die der
Kontrollen TOP und Ax2-luc wird durch die Kotransfektion von wtAPC in SW480 Zellen
stark reduziert (Abb. 7C). FOP dagegen bleibt unverändert aktiv. Das bedeutet, dass auch in
diesem System die Reporterkonstrukte von SGK1 eine β-Catenin-abhängige Regulation
zeigen.
Die Ergebnisse der Promotoranalyse von SGK1 durch Reporterexperimente korrelieren mit
den bisherigen Untersuchungen und liefern weitere Hinweise zur Bestätigung von SGK1 als
ein Zielgen des Wnt-Signalweges.
30
ERGEBNISSE
Abbildung 7: Regulation von SGK1-Promotorfragmenten durch den Wnt-Signalweg
Repräsentative Reportergen-Experimente mit je 20 ng der angegebenen Reporterkonstrukte A) in HCT116 bei
Kotransfektion von je 100 nM siGFP (Kontrolle, hellgraue Balken), siAPC (graue) oder siβ-Catenin (schwarze); B)
in DLD1-dnTCF4 (bei –dox: grau oder +dox: schwarz) und C) in SW480 bei Kotransfektion von je 50 ng
Kontrollplasmid (grau) oder wtAPC (schwarz).
Die Promotorkonstrukte SGK1 I und II beinhalten drei beziehungsweise eine der TCFBindemotive und werden auch β-Catenin-abhängig reguliert. Das Konstrukt SGK1 III hat
keine dieser definierten Bindestellen, zeigt allerdings ebenfalls eine Wnt-abhängige
Regulation. Eine Erklärung hierfür könnte eine indirekte Regulation, also eine Beteiligung
31
ERGEBNISSE
weiterer Faktoren sein. Möglich ist aber auch, dass in der verbliebenen Sequenz von SGK1 III
noch weitere, den definierten TCF-Motiven sehr ähnliche Sequenzen sind, die
möglicherweise eine Bindung von TCF/β-Catenin-Komplexen erlauben. Innerhalb dieser
Sequenz von SGK1 III befinden sich an den Positionen -1905, -1278 und +7 (ATG bei +58)
noch weitere Motive mit der definierten Kernsequenz (CTTTG), bei denen nur eine der
angrenzenden Basen von der definierten Sequenz abweicht. Es könnte möglich sein, dass
auch an diesen Stellen eine - eventuell verminderte - Bindung von TCF/β-Catenin-Komplexen
stattfindet. Wenn das der Fall ist, kann auch weiterhin eine Regulation vermittelt werden. Um
genaueren Aufschluss über die direkte oder indirekte Regulation von SGK1 durch den
Wnt-Signalweg zu bekommen, könnten Mutagenese-Experimente hilfreich sein, in denen die
verschiedenen Bindestellen genauer untersucht werden.
Mit den bisher durchgeführten Experimenten konnte auf mRNA- und Proteinebene die Wntabhängige Regulation von SGK1 gezeigt und anhand von Promotorreporter-Analysen weiter
bestärkt werden. Daraufhin stellte sich die Frage, welche Rolle die Regulation von SGK1
durch den Wnt-Signalweg bei der Tumorigenese spielen kann.
6.2
Regulation von Transkriptionsfaktoren der FoxO-Familie durch
den Wnt-Signalweg
6.2.1
Einfluss des Wnt-Signalweges auf die Lokalisation von FoxO3a
Eine der in der Literatur beschriebenen Funktionen von SGK1 ist die Regulation des
Transkriptionsfaktors FoxO3a, welcher unter anderem die Transkription von zellzyklusregulierenden und pro-apoptotischen Genen aktiviert (Carter and Brunet, 2007). Eine
Unterbindung dieser Aktivierung geschieht durch Phosphorylierung der Aminosäuren Thr32,
Ser253 und Ser315 von FoxO3a. Dies kann durch SGK1 oder auch Akt vermittelt werden
(Brunet et al., 2001) und führt zur Inhibierung von FoxO3a durch aktiven Transport aus dem
Zellkern ins Zytoplasma. Anhand von Immunfluoreszenz- (IF) Experimenten wurde die
Lokalisierung von FoxO3a bei aktiven und inaktiven Wnt-Signalweg untersucht. Es sollte
geprüft werden, ob die Wnt-vermittelte Aktivierung von SGK1 eine Auswirkung auf FoxO3a
32
ERGEBNISSE
hat. Hierzu wurden HEK293T Zellen transient transfiziert. In Abbildung 8 sind die
Lokalisierung von FoxO3a (YFP-gekoppelt), sowie der kotransfizierten Faktoren (entweder
RFP-gekoppelt oder durch Antikörperfärbung mit Cy3-gekoppelten sekundärem Antikörper
detektiert) und eine Kernfärbung (Hoechst) dargestellt. Unter normalen Bedingungen
(Abb. 8A) ist transfiziertes FoxO3a ubiquitär in der Zelle verteilt, es findet sich sowohl im
Zytoplasma als auch im Zellkern. Wie in Veröffentlichungen berichtet transloziert FoxO3a in
den Zellkern, wenn die Zellen unter Stress stehen (Abb. 8B; Brunet et al., 2004). Hier wurde
oxidativer Stress durch Zugabe von H2O2 (0,5 mM für eine Stunde ins Kulturmedium)
simuliert. Wie ebenfalls in der Literatur beschrieben, ist FoxO3a fast ausschließlich im
Zytoplasma zu finden, wenn SGK1 überexprimiert ist (Abb. 8C; Brunet et al., 2001; van der
Horst et al., 2006). Die Pfeilspitzen in Abbildung 8C (Cy3) zeigen Zellen, die SGK1-Flag
exprimieren und bei denen FoxO3a (YFP) aus dem Kern dieser Zellen ausgeschlossen ist.
Dagegen ist in den dazwischenliegenden Zellen, in welchen kein SGK1 detektiert werden
kann, FoxO3a überall in der Zelle verteilt, also auch im Kern lokalisiert. Bei einer
Aktivierung des Wnt-Signalweges durch die Überexpression von Wnt3A-RFP (Abb. 8D),
LRP6da-RFP (Abb. 8E) oder stabilisiertem β-Catenin (S33A; Abb. 8F) bzw. durch die
Depletion von APC (siAPC; Abb. 8H) ist FoxO3a fast ausschließlich im Zytoplasma
lokalisiert. Das bedeutet, eine Aktivierung des Wnt-Signalweges bewirkt ebenfalls wie SGK1
einen Ausschluss von FoxO3a aus dem Zellkern. Die Transfektion von siRNA gegen βCatenin (Abb. 8I) bzw. Überexpression von wtAPC (Abb. 8K) verändert nichts an der
Lokalisation von FoxO3a. Es kann überall in der Zelle nachgewiesen werden. Mit Asef2-Flag
(Abb. 8L) wurde eine Wnt-Signalweg unspezifische Kontrolle gewählt, die keinen Einfluss
auf den Aktivitätsstatus des Wnt-Signalweges hat. In der IF ist zu sehen, dass Asef2-Flag die
Lokalisierung von FoxO3a nicht verändert, was damit die Spezifität der vorher eingesetzten
Faktoren zeigt. Die Transfektion von siGFP (Abb. 8G) wurde als Kontrolle der RNAiTransfektionen durchgeführt und zeigt wie die anderen Negativkontrollen keinen Einfluss auf
die Verteilung von FoxO3a in der Zelle (vgl. Abb. 8G mit Abb. 8A).
Vergleichbare Ergebnisse wurden auch mit FoxO4, einem weiteren Mitglied der FoxOGruppe, beobachtet (ohne Abb.).
Die IF-Experimente zeigen einen Einfluss des Wnt-Signalweges auf die Lokalisation von
FoxO3a. Die Aktivierung des Signalweges bewirkt den Ausschluss von FoxO3a aus dem
33
ERGEBNISSE
Zellkern. Dagegen ist bei einer Inhibierung des Wnt-Signalweges kein offensichtlicher
Einfluss auf die FoxO3a-Lokalisierung zu beobachten. Allerdings ist der Wnt-Signalweg in
den verwendeten HEK293T Zellen nicht oder nur schwach konstitutiv aktiv und kann daher
nicht wirklich inhibiert werden.
34
ERGEBNISSE
Abbildung 8: Immunfluoreszenzfärbung in HEK293T Zellen zur Analyse des Einflusses von
kotransfizierten Regulatoren des Wnt-Signalweges auf die Lokalisation von FoxO3a
YFP: YFP-gekoppeltes FoxO3a, Cy3: Kotransfizierte Faktoren: nach Färbung der Proteine mit entsprechendem
Erstantikörper wurde zur Visualisierung entsprechender Cy3-gekoppelter sekundärer Antikörper verwendet oder
RFP-gekoppelte Proteine eingesetzt. Hoechst: Kernfärbung.
35
ERGEBNISSE
6.2.2
Einfluss des Wnt-Signalweges auf die transkriptionelle Aktivität von
FoxO3a
In den IF-Experimenten konnte beobachtet werden, dass bei aktiviertem Wnt-Signalweg
FoxO3a aus dem Zellkern ins Zytoplasma transloziert. Es stellte sich die Frage, ob dieser
Ausschluss von FoxO3a aus dem Zellkern auch eine Veränderung der transkriptionellen
Aktivität von FoxO3a zur Folge hat. Zur Untersuchung dieses Sachverhaltes wurde ein
Reportersystem verwendet, bei dem acht spezifische Bindemotive (DBEs = DNA binding
elements) der FoxO-Transkriptionsfaktoren mit der Kernsequenz TTGTTTA - wie in
Furuyama et al. beschrieben - vor das Reporter-Luziferasegen gesetzt wurden (Furuyama et
al., 2000). Dadurch kann die FoxO-abhängige Transkription anhand der Luziferaseaktivität
bestimmen werden. Die ersten Experimente mit diesem Reportersystem wurden in HCT116
durchgeführt. Sie dienten dazu, die aus der Literatur bekannten Ergebnisse (Brunet et al.,
2001; Furuyama et al., 2000) zu reproduzieren, um die Funktionalität des Systems zu
überprüfen. Abb. 9A zeigt eine sehr niedrige Grundaktivität des Reporterkonstruktes 8xDBE,
die der des Ausgangsvektors pTA-luc entspricht. Durch Kotransfektion von FoxO3a wird die
Aktivität des 8xDBE-Reporters stark und dosisabhängig gesteigert, wohingegen der
Leervektor pTA-luc nicht reagiert. Die Menge an endogenem FoxO3a in HCT116 Zellen
scheint niedrig zu sein, denn ohne exogen transfiziertes FoxO3a ist die Luziferaseaktivität des
8xDBE Konstruktes sehr niedrig. Die durch Kotransfektion von FoxO3a gesteigerte Aktivität
des Reporters wird wiederum dosisabhängig durch SGK1 erniedrigt (Abb. 9B). Dieser
Sachverhalt ist bereits bekannt (Brunet et al 2001 MCB) und bestätigt die Funktionalität des
Systems zur Untersuchung der FoxO-abhängigen Transkription. In den anschließenden
Untersuchungen zur transkriptionellen Aktivität von FoxO3a wurden jeweils, falls nicht
anders angegeben, die Systemkomponenten 8xDBE-Reporterkonstrukt und FoxO3aExpressionsvektor mit den jeweils angegebenen Faktoren von Interesse kotransfiziert.
36
ERGEBNISSE
Abbildung 9: Reportersystem zur Bestimmung der transkriptionellen Aktivität von FoxO3a
Repräsentative Ergebnisse transienter Transfektionen in HCT116 mit je 20 ng der angegebenen
Reporterkonstrukte zusammen mit in A) steigenden Mengen an FoxO3a (50-200 ng) bzw. in B) zu konstanter
Menge (50 ng) FoxO3a steigende Mengen an SGK1 (50-200 ng).
In den folgenden Reporterexperimenten wurde der Wnt-Signalweg durch einige bereits in den
Immunfluoreszenzen verwendeten Faktoren aktiviert bzw. inhibiert, um deren Einfluss auf die
transkriptionelle Aktivität von FoxO3a zu untersuchen. Wie bereits bekannt und geschildert,
kann FoxO3a auch durch SGK1 reguliert werden (Brunet et al., 2001). Als interne Kontrolle
zur Überprüfung des Systems bei Experimenten dieser Art (wie Abb. 10) wurde SGK1
verwendet. Wie zu erwarten, reduziert die Überexpression von SGK1 die transkriptionelle
Aktivität von FoxO3a enorm (Abb. 10B). Ein Knock-Down von SGK1 mittels RNAi erhöht
dagegen die Luziferaseaktivität deutlich (Abb. 10A; Funktionalitätstest von siSGK1 in
Experiment Abb. 13B+C dargestellt). Durch Transfektion der Wnt-Signalweg aktivierenden
Komponenten
siAPC,
β-Catenin
bzw.
S45A
(stabilisiertes
β-Catenin)
wird
die
Luziferaseaktivität des 8xDBE-Reporterkonstrukts - verglichen mit der Grundaktivität der
jeweiligen Kontrolle pcDNA3.1 bzw. siGFP (Abb. 10A+B) - deutlich erniedrigt. Im Falle von
β-Catenin bzw. dominant aktiven S45A-β-Catenin erfolgt die Verringerung der Aktivität
annähernd so stark wie durch die Postitivkontrolle SGK1. Im Gegensatz dazu erhöht eine
Inhibierung des Wnt-Signalweges durch Transfektion von siβ-Catenin oder APC die FoxO3a-
37
ERGEBNISSE
abhängige Transkription (Abb. 10A+B). siβ-Catenin erzielt einen fast so starken Effekt wie
die Kontrolle siSGK1. Eine Blockierung des Wnt-Signalweges zeigt somit annähernd die
gleiche Wirkung auf die FoxO3a-abhängige Transkription wie ein Knock-Down von SGK1.
Bei einer simultanen Transfektion der siRNAs gegen APC und β-Catenin werden die
gegensätzlichen Effekte weitgehend neutralisiert. Die Reporteraktivität von 8xDBE ist mit der
der Kontrolle vergleichbar (Abb. 10A, siGFP+FoxO3a).
Diese Ergebnisse korrelieren mit den Beobachtungen aus den IF-Experimenten. Folglich kann
die Vermutung aufgestellt werden, dass durch die Aktivierung des Wnt-Signalweges die
Translokation von FoxO3a aus dem Zellkern induziert wird. Dadurch wird die
transkriptionelle Aktivität von FoxO3a gehemmt.
Andererseits besteht die Möglichkeit, dass eine Kotransfektion der Wnt-Aktivatoren keinen
spezifischen Einfluss auf die Regulation von FoxO3 hat. In diesem Fall könnte es sein, dass
weniger FoxO3a in der Zelle ist oder vermehrt abgebaut wird und deswegen die
Luziferaseaktivität sinkt. Diese Möglichkeit wurde mittels Westernblot-Analyse untersucht.
Die FoxO3a-Proteinmengen wurden analysiert und das Resultat ist in Abb. 10B unter der
dazugehörigen Transfektion dargestellt. Es sind vergleichbare Proteinlevel von FoxO3a in
den verschiedenen Ansätzen zu beobachten. Das zeigt eine Regulation der transkriptionellen
Aktivität, die nicht auf unterschiedliche FoxO3a Mengen beruht.
Äquivalente Untersuchungen mit FoxO4, einem weiterem Mitglied der FoxO-Gruppe,
lieferten vergleichbare Ergebnisse (Abb. 10C). Eine Aktivierung des Wnt-Signalweges
erniedrigte FoxO4-abhängige Luziferaseaktivität des 8xDBE-Reporterkonstruktes. Die
Aktivität wurde ebenso durch eine Inhibierung des Wnt-Signalweges über das
Ausgangsniveau erhöht, wie dies auch bei einer Kotransfektion von FoxO3a zu beobachten
war.
Die Ergebnisse aus den IF- und den Reporterexperimenten zeigen eine Beteiligung des
Wnt-Signaltransduktionsweges an der Regulation von FoxO3a. Dieser Einfluss schlägt sich
sowohl auf die Lokalisation als auch auf die transkriptionelle Aktivität von FoxO3a nieder.
Im weiteren Verlauf der vorliegenden Arbeit wurden dieser Einfluss und die Auswirkungen
noch weiter untersucht.
38
ERGEBNISSE
Abbildung 10: Einfluss des Wnt-Signalweges auf die Regulation der FoxO3a bzw. FoxO4abhängigen Transkription
Repräsentative Ergebnisse transienter Transfektionen in HCT116: Transfektion des 8xDBE-Reporterkonstrukt (je
20 ng) zusammen mit -/+ je 10 ng FoxO3a in A) + B) bzw. FoxO4 in C) und den angegebenen Regulatoren (je
100 nM siRNA bzw. 50 ng Plasmid-DNA). B) unten: Westernblot zur Analyse der Proteinlevel in den jeweiligen
Transfektionsansätzen wie angegeben, β-Aktin diente als Ladekontrolle.
39
ERGEBNISSE
6.2.3
Regulation der transkriptionellen Aktivität von FoxO3a durch den
Wnt-Signalweg in HEK293T und LS174T
Die β-Catenin-abhängige Regulation der FoxO Aktivität wurde auch in anderen Zelllinien
getestet, um zu klären, ob dieser Effekt spezifisch für HCT116 Zellen ist. In
Abbildung 11A+B sind Reporterassays gezeigt, die in den Zelllinien HEK293T (humane,
embryonale Nierenzellen, keine Tumorlinie) und LS174T (kolorektale Tumorzelllinie)
durchgeführt wurden. Die Experimente wurden genauso wie in HCT116 angelegt und zeigen
ein
vergleichbares
Regulationsmuster
des
8xDBE-Reporterkonstruktes.
Ein
durch
Transfektion von siAPC, β-Catenin bzw. S45A aktivierter Wnt-Signalweg senkt die
Luziferasewerte deutlich unter das Ausgangsniveau (pcDNA bzw. siGFP; Abb. 11A+B).
Durch eine Inhibierung des Wnt-Signalweges (siβ-Catenin oder APC) wird die FoxO3aabhängige Transkription, genauso wie in HCT116, noch weiter erhöht.
Das bedeutet, die Regulation der FoxO-abhängigen Transkription durch den Wnt-Signalweg
ist nicht beschränkt auf HCT116 Zellen, sondern ist auch in den Zelllinien HEK293T und
LS174T zu beobachten.
40
ERGEBNISSE
Abbildung 11: Einfluss des Wnt-Signalweges auf die Regulation der FoxO3a-abhängigen
Transkription in den Zelllinien HEK293T und LS174T
Repräsentative Ergebnisse transienter Transfektionen; analog wie in Abb. 10.
41
ERGEBNISSE
6.3
Regulation der FoxO3a Aktivität durch den Wnt-Signalweg über
SGK1
Die Ergebnisse der FoxO-Experimente aus Immunfluoreszenz und Reporterassays zeigen klar
einen Effekt des Wnt-Signalweges auf die Regulation von FoxO3a, sowohl auf die
Lokalisation als auch auf die transkriptionelle Aktivität von FoxO3a. Es stellte sich die Frage,
ob der Einfluss durch die Faktoren des Wnt-Signalweges auf die Regulation von FoxO durch
SGK1 vermittelt wird. Da SGK1 durch Aktivierung (Superaktivierung) des Wnt-Signalweges
hochreguliert wird (Tab. 1 und Abb. 4-7) könnte die Folge daraus sein, dass FoxO3a mehr
bzw. effektiver phosphoryliert wird. Dadurch könnte wiederum mehr FoxO3a aus dem
Zellkern exportiert werden, wodurch die transkriptionelle Aktivität von FoxO3a gehemmt
werden würde. Für den Test dieser Hypothese wurden einige Untersuchungen durchgeführt,
die im Folgenden beschrieben sind. In IF- und Reporterexperimenten wurde eine Mutante von
FoxO3a, FoxO3a-TM (Brunet et al., 2004), eingesetzt, die an drei Stellen mutiert ist. Es
wurden die Aminosäuren Thr32, Ser253 und Ser315 zu Alaninen mutiert, was eine für den
Export nötige Phosphorylierung durch SGK1/Akt an diesen Stellen nicht mehr erlaubt.
Äquivalente Experimente, wie mit wtFoxO3a sollten beim Vergleich mit der Mutante
Aufschluss darüber geben, ob der Wnt-Effekt auf FoxO durch SGK1 vermittelt wird.
Abbildung 12 zeigt die IF-Färbung der Dreifach-Mutante FoxO3a-TM in HEK293T Zellen
zusammen mit den schon bekannten, kotransfizierten Faktoren des Wnt-Signalweges.
Transfiziertes FoxO3a-TM befindet sich vornehmlich im Kern der Zellen (Abb. 12A) und
wird weder durch SGK1 (Abb. 12C) noch durch einen der verwendeten Aktivatoren des
Wnt-Signalweges (Wnt3A, LRP6da, S45A und siAPC) aus dem Kern exportiert (Abb. 12D-F
und H). Ebenso nehmen weder oxidativer Stress durch die Behandlung mit H2O2 (Abb. 12B)
noch die Transfektion von siβ-Catenin (Abb. 12I) oder siGFP (als Kontrolle, Abb. 12G) einen
Einfluss auf die Lokalisation von FoxO3a-TM. In den durchgeführten IF-Experimenten mit
der FoxO3a-Mutante konnte durch keinen kotransfizierten Faktor ein FoxO-Export aus dem
Kern beobachtet werden.
FoxO3a-TM unterscheidet sich von wtFoxO3a nur durch den Austausch von drei
Aminosäuren, die eine Phosphorylierung durch SGK1/Akt verhindern. Diese Mutante zeigt
im Gegensatz zum Wildtyp keine Veränderung der Lokalisierung durch Kotransfektion der
Aktivatoren des Wnt-Signalweges. Das bedeutet, dass die Regulation der FoxO3a
42
ERGEBNISSE
Lokalisation durch den Wnt-Signalweg über die Phosphorylierung, welche auch durch SGK1
vermittelt werden kann, von FoxO3a abläuft.
Abbildung 12: Immunfluoreszenzfärbung in HEK293T Zellen zur Analyse des Einflusses von
kotransfizierten Regulatoren des Wnt-Signalweges auf die Lokalisation von FoxO3a-TM
α-Flag: Flag-gekoppeltes FoxO3a-TM (sekundärer AB: Cy3 gekoppelt), YFP/RFP: kotransfizierte Faktoren mit
YFP/RFP-Tag, Hoechst: Kernfärbung.
43
ERGEBNISSE
Zur weiteren Bestätigung, dass SGK1 das Bindeglied der Wnt-vermittelten Regulation von
FoxO3a darstellt, wurde die FoxO3a-Mutante auch in Reporterexperimenten, wie unter Punkt
6.2.2. (Experiment Abb. 10) beschrieben, anstelle von wtFoxO3a eingesetzt und der Einfluss
des Wnt-Signalweges auf die transkriptionelle Aktivität von FoxO3a-TM analysiert.
In den Reporterexperimenten mit der Dreifachmutante von FoxO3a (FoxO3a-TM, Abb. 13A)
ist keine signifikante Regulation des 8xDBE-Reporterkonstrukts durch die kotransfizierten
Regulatoren des Wnt-Signalweges zu beobachten. Im Gegensatz zu den Experimenten mit
nicht mutiertem FoxO3a vermag weder SGK1 noch β-Catenin die transkriptionelle Aktivität
von FoxO3a-TM zu verändern (Abb. 13A). Auch eine Kotransfektion von APC hat keinen
Einfluss auf die Aktivität von FoxO3a-TM. Dieses Ergebnis korreliert genau mit den
Beobachtungen aus den IF-Experimenten mit FoxO3a-TM (Abb. 12) und festigt die Theorie,
dass der Wnt-Signalweg über SGK1 auf die FoxO3a-abhängige Transkription Einfluss
nimmt.
Für weitere Untersuchungen wurde siRNA gegen SGK1 gemeinsam mit Aktivatoren des
Wnt-Signalweges in FoxO-Reporterassays eingesetzt. Zuvor wurde die Funktionalität der
RNAi mittels Westernblot-Analyse und Reporterexperiment geprüft (Abb. 13B+C). Das
verwendete siOligo gegen SGK1 ist sehr effizient im Abbau der SGK1-mRNA (Abb. 13B).
Es wird exogenes, wie auch endogenes SGK1 abgebaut, da in Spur 2 und 3 SGK1
kotransfiziert wurde, und im Vergleich zu Spur 1 (endogenes SGK1) in Spur 3 die
Proteinmenge von SGK1 deutlich geringer ist. Dagegen ist in Spur 2 eine deutliche
Steigerung zu beobachtet, welche die Überexpression von SGK1 bestätigt. Die Funktionalität
der siRNA gegen SGK1 kann auch in dem Reporterexperiment von Abbildung 13C
beobachtet werden. Wie bereits in Abbildung 10 gezeigt, wird die FoxO3a-abhängige
Reporteraktivität auch in dem vorliegenden Experiment durch Überexpression von SGK1
(Abb. 13C) gesenkt und durch Wegnahme (RNAi) von SGK1 gesteigert. Der hemmende
Effekt von SGK1 auf die Aktivität von FoxO3a wird durch den RNAi vermittelten KnockDown von SGK1 wieder aufgehoben. Die transkriptionelle Aktivität steigt noch über das
Ausgangsniveau (siGFP), was darauf hindeutet, dass auch endogenes SGK1 abgebaut wird.
Diese beiden Experimente (Abb. 13B+C) zeigen, dass die verwendete siRNA gegen SGK1
sehr effektiv arbeitet und die mRNA von SGK1 (einschließlich exogenem SGK1) fast
vollständig abgebaut wird. Gleiche Resultate wurden auch durch den Einsatz eines zweiten
RNAi-Oligos gegen SGK1 erhalten (Daten nicht gezeigt).
44
ERGEBNISSE
Im folgenden Experiment sollte untersucht werden, ob die Hemmung der FoxO3a Aktivität
durch einen aktivierten Wnt-Signalweg (Transfektion von siAPC oder β-Catenin;
Abb. 10A+B) bei einer Kotransfektion von siSGK wieder aufgehoben wird. Genau dies ist
der Fall: Ein zusätzlicher Knock-Down von SGK1 hebt die durch siAPC oder β-Catenin
vermittelte Erniedrigung der transkriptionellen Aktivität von FoxO3a wieder auf. Das Niveau
wird deutlich über das Ausgangsniveau (siGFP) hinaus, annähernd bis zu dem Level des
siSGK1/siGFP Kontroll-Ansatzes (Abb. 13D), gesteigert.
Diese Ergebnisse spiegeln die Beobachtungen aus dem vorhergehenden Experiment
(Abb. 10A+B und 13C) wider und zeigen, dass die Regulation von FoxO3a (und FoxO4, ohne
Abb.) durch den Wnt-Signalweg weitgehend über SGK1 vermittelt wird.
45
ERGEBNISSE
Abbildung 13: Regulation
Wnt-Signalweg über SGK1
der
transkriptionellen
Aktivität
von
FoxO3a
durch
den
A) Repräsentatives Ergebnis transienter Transfektionen in HCT116: Kotransfektion des 8xDBE-Reporterkonstrukt
(je 20 ng) zusammen mit -/+ FoxO3a-TM (je 10 ng) und den angegebenen Regulatoren (je 50 ng). B) Test der
RNAi gegen SGK1 in Westernblot Analyse, β-Aktin diente als Ladekontrolle, C) Test der RNAi gegen SGK1 im
Reporterassay: Kotransfektion der siRNAs (je 100 nmol) bzw. Plasimd-DNA (je 50 ng) zu 8xDBE-Reporter (je
20 ng) und FoxO3a (je 10 ng), D) Repräsentatives Ergebnis transienter Transfektionen in HCT116 analog C).
46
ERGEBNISSE
6.4
Analyse der Spezifität von Regulatoren des Wnt-Signalweges in
Bezug auf die Regulation der transkriptionellen Aktivität von
FoxO3a
Es wurden mehrere Kontrollexperimente durchgeführt, welche die Spezifität der eingesetzten
Regulatoren des Wnt-Signalweges in Bezug auf die Regulation der FoxO-abhängigen
Transkription prüfen sollten. Es könnte sein, dass diese Faktoren generell einen Einfluss auf
Reportersysteme haben und somit in den Experimenten eine unspezifische Regulation
dokumentiert wurde. Dazu wurden die Wnt-Regulatoren zusammen mit anderen
Reportersystemen kotransfiziert. In diesen Systemen sollten die Wnt-Regulatoren keinen
Einfluss auf die Aktivität der Reporter nehmen. Vorab ist in Abbildung 14A das spezifische
Potential der verwendeten Faktoren bezüglich der Regulation des Wnt-Signalweges
dargestellt. In transienten Transfektionen des TOP/FOP-Systems in HCT116 Zellen zeigen
die Faktoren siAPC, β-Catenin und S45A (stabilisiertes β-Catenin) eine deutliche Aktivierung
von TOP über FOP. Ein Knock-Down von β-Catenin vermindert die Aktivität unter das
Ausgangsniveau der siGFP-Kontrolle. Eine Kotransfektion von wtAPC zeigt in diesem
System eine geringe Verminderung von TOP/FOP. Diese Faktoren zeigen die bekannten und
erwarteten Effekte auf den Wnt-Signalweg. Wie schon erwähnt wurden diese Faktoren nun
auch noch in anderen Reportersystemen getestet, um eine eventuelle, unspezifische
Regulation zu prüfen.
Zum einen wurden die Reporter pTA-luc, pGL2-control und ein ca. 500 bp langes Fragment
des putativen Promotors von c-fos (Dr. B. Mayr) mit den Faktoren kotransfiziert. Das
Ergebnis der Experimente ist zusammengefasst in Abbildung 14B dargestellt: Die
Luziferasewerte der drei Test-Reporter werden durch keinen der verwendeten Regulatoren
signifikant verändert.
Zum anderen wurden die Faktoren des Wnt-Signalweges in einem Reporter-System von
STRATAGENE gestestet, mit dem die transkriptionelle Aktivität von c-Jun gemessen werden
kann. Das Reporterkonstrukt pFR-luc dieses Systems wird durch c-Jun (pFA2Jun) aktiviert,
ähnlich wie FoxO3a die Aktivität des 8xDBE-Reporters induziert. Keiner der kotransfizierten
Wnt-Regulatoren nimmt Einfluss auf die Aktivität des c-Jun-Systems (Abb. 14C). Dagegen
ist bei einer Kotransfektion der Positivkontrolle MEKK, wie zu erwarten, eine weitere und
deutliche Steigerung der Luziferaseaktivität von pFR-luc zu beobachtet.
47
ERGEBNISSE
Durch die Ergebnisse der Test-Experimente kann eine unspezifische Regulation der FoxO3aabhängigen
Transkription
durch
die
verwendeten
Faktoren
des
Wnt-Signalweges
ausgeschlossen werden, da diese in anderen, unabhängigen Systemen keinen regulatorischen
Einfluss zeigen.
Abbildung 14: Kontrollexperimente zur Überprüfung der Spezifität von Wnt-Regulatoren
bezüglich der FoxO-abhängige Transkription
Repräsentative Ergebnisse transienter Transfektionen in HCT116: A) Regulation von TOP/FOP durch die
angegebenen Regulatoren des Wnt-Signalweges. Kotransfektionen der Regulatoren mit den angegebenen
Reportern B) oder im cJun-System C) zeigen keine signifikanten Veränderungen der Reporteraktivitäten. MEKK
ist ein bekannter Aktivator des c-Jun-Signalweges und diente als Positivkontrolle.
48
ERGEBNISSE
6.5
Veränderung der Apoptoserate durch den Wnt-Signalweg
6.5.1
Einfluss des Wnt-Signalweges auf die Transkription der FoxO3a-Zielgene
Bcl2-interacting mediator (BIM) und p27KIP1
Bislang wurde ein Einfluss des Wnt-Signalweges auf die Lokalisation und die
transkriptionelle Aktivität von FoxO3a gezeigt. Des Weiteren wurde nachgewiesen, dass
dieser Einfluss über die Regulation von SGK1 vermittelt wird. Nun stellte sich die Frage, ob
ein Nachweis einer Relevanz in vivo für diese Regulation von FoxO3a durch den
Wnt-Signalweg erbracht werden kann. Dazu wurden im Folgenden in Reporterexperimenten
zwei Zielgene von FoxO3a untersucht, sowie Apoptosemessungen durchgeführt.
In der Literatur ist bekannt, dass eine Aktivierung von FoxO3a zu Zellzyklusarrest und
Apoptose führen kann (Dijkers et al., 2002; Dijkers et al., 2000a; Dijkers et al., 2000b;
Nakamura et al., 2000; Stahl et al., 2002; Takaishi et al., 1999). Dies wird durch die Induktion
der Transkription von FoxO3a-Zielgenen erreicht, zu denen unter anderen auch die Gene
p27KIP1 und BIM (Bcl2 interacting mediator) gehören. Die endogenen, putativen Promotoren
von p27KIP1 und BIM wurden vor das Reportergen Luziferase kloniert (Motta et al., 2004) und
freundlicherweise von Dr. R. H. Medema zur Verfügung gestellt. In transienten
Transfektionen mit den bereits verwendeten Komponenten des Wnt-Signalweges konnte ein
Regulationsmuster dieser Promotoren beobachtet werden, welches mit dem des artifiziellen
8xDBE Reporterkonstruktes vergleichbar ist. Beide Konstrukte zeigen eine Steigerung der
Reporteraktivität durch FoxO3a. Bei einer zusätzlichen Kotransfektion der Aktivatoren des
Wnt-Signalweges wird die Promotoraktivität von BIM (Abb. 15A) und p27KIP1 (Abb. 15B)
verglichen mit der Kontrolle (FoxO3a + pcDNA3.1) erniedrigt. Wohingegen in Kombination
mit dem Inhibitor APC des Wnt-Signalweges die Luziferaseaktivität der Reporter erhöht ist.
Im Vergleich zu dem artifiziellen 8xDBE-Reporterkonstrukt sind die Grundaktivitäten der
Promotoren deutlich höher (auch ohne kotransfiziertes FoxO3a). Das ist nicht ungewöhnlich,
da Promotorfragmente oft eine gewisse Grundaktivität aufweisen. Durch die erhöhte
Grundaktivität sind die regulatorischen Effekte nicht so stark wie mit dem 8xDBE-Reporter,
aber dennoch signifikant. Vergleicht man die Werte der Kotransfektionen von β-Catenin und
S45A mit denen von kotransfizierter SGK1, fällt auf, dass diese Regulatoren die Aktivität
genauso stark und annähernd auf das Ausgangsniveau (Grundaktivität; pcDNA ohne FoxO3a)
49
ERGEBNISSE
senken. Das heißt, die durch transfiziertes FoxO3a induzierte Aktivität wird wieder annähernd
vollständig geblockt. Eine Kotransfektion von APC, also eine Inaktivierung des
Wnt-Signalweges, erhöht die FoxO3a-induzierte Aktivität der Promotoren noch weiter. Das
Regulationsmuster dieser Promotoren von FoxO3a-Zielgenen zeigt ein dem artifiziellen
8xDBE-Konstrukt vergleichbares Profil.
Diese Experimenten dokumentieren, dass die Regulation von FoxO3a durch den
Wnt-Signalweg Promotoren von FoxO3a-Zielgenen anspricht und geben damit einen ersten
Hinweis auf eine in vivo Funktion.
Abbildung 15: Einfluss des Wnt-Signalweges auf die Promotorenaktivität der FoxO3a-Zielgene
BIM (Bcl2-interacting mediator) und p27KIP1
Repräsentative Ergebnisse transienter Transfektionen in HCT116 der Promotorreporter-Konstrukte der Gene A)
BIM und B) p27KIP1 (je 20 ng); Kotransfektionen mit den angegebenen Regulatoren (je 50 ng) und -/+ FoxO3a (je
10 ng).
50
ERGEBNISSE
6.5.2
Inhibierung der FoxO3a-induzierten Apoptose durch den Wnt-Signalweg
Es ist bekannt, dass eine Induktion der BIM-Expression den programmierten Zelltod einleiten
kann (O'Connor et al., 1998). In den Reporterexperimenten wurde eine Inhibierung der
Aktivität des BIM-Promotors beobachtet, als der Wnt-Signalweg aktiviert wurde. Eine
Hemmung der Transkription von BIM durch aktivierten Wnt-Signalweg könnte eine
Verminderung der Apoptoserate bewirken und würde so das Tumorwachstum begünstigen. Es
sollte getestet werden, ob eine Aktivierung des Wnt-Signalweges durch die Regulation von
BIM auch die Apoptose hemmen kann.
Mittels
TUNEL
(TdT-mediated
dUTP-biotin
nick
end
labeling;
TdT:
terminal
deoxynucleotidyl transferase) Experimente (Abb. 16) wurde getestet, ob ein Einfluss auf die
Apoptoserate durch den Wnt-Signalweg besteht und gemessen werden kann. Während der
Apoptose wird der DNA-Strang durch die Aktivität von Endonukleasen fragmentiert. Die an
den Bruch-Enden frei werdenden 3'-OH-Gruppen werden durch das Enzym TdT mit
markierten Nukleotiden versehen und können im Durchflusszytometer vermessen werden.
Die vom Hersteller (Invitrogen) mitgelieferten Kontrollzellen mit induzierter Apoptose zeigen
in der FACS-Messung 40 % apoptotische Zellen (pos. Kontrolle in Abb. 16A; neg. Kontrolle
1 %). Durch Transfektion von FoxO3a in HCT116 Zellen konnten 25 % bzw. durch die
doppelte Menge FoxO3a 38 % apoptotische Zellen gemessen werden. Die pcDNA3.1
Kontrolltransfektion zeigte einen Wert von 9 % an apoptotischen Zellen, was einem normalen
Wert in solchen Transfektionsexperimenten entspricht. Im folgenden Experiment (Abb. 16B)
wurden Faktoren des Wnt-Signalweges kotransfiziert und die Rate von apoptotischen Zellen
vermessen. In Abbildung 16B sind die durch FoxO3a induzierten, apoptotischen Zellen auf
100 % gesetzt. Die Ergebnisse der Kotransfektionen sind in Relation zu den FoxO3ainduzierten, apoptotischen Zellen dargestellt. Bei Kotransfektion von SGK1 wurde die
FoxO3a-induzierte Apoptoserate um 70 % gesenkt (von den auf 100 % gesetzten, FoxO3a
induzierten auf ca. 30 %). Bei Aktivierung des Wnt-Signalweges durch β-Catenin oder S33A
wird die Zahl der durch FoxO3a-induzierten apoptotische Zellen deutlich erniedrigt. Die
FoxO3a-induzierte Apoptoserate wird noch weiter gesteigert, wenn der Wnt-Signalweg durch
Kotransfektion von APC inhibiert wird (Abb. 16B). Damit zeigen auch die Ergebnisse der
TUNEL-Assays einen Einfluss des Wnt-Signalweges auf die FoxO3a induzierte Apoptose.
51
ERGEBNISSE
Abbildung 16: Einfluss des Wnt-Signalweges auf den programmierten Zelltod
Repräsentative Ergebnisse von TUNEL-Assays in HCT116: A) Test des Assays und Überprüfung des Potentials
von FoxO3a Apoptose zu induzieren, B) Kotransfektion von FoxO3a und Regulatoren des Wnt-Signalweges, um
dessen Einfluss auf die Apoptoserate zu untersuchen.
Die Messungen der Apoptoserate korrelieren mit den vorherigen Ergebnissen und dadurch
kann zusammenfassend folgendes Model aufstellt werden: SGK1 ist als Zielgen des
Wnt-Signalweges das Bindeglied zur Regulation der Lokalisation und transkriptionellen
Aktivität von FoxO3a. Das heißt, durch den Aktivitätsstatus des Wnt-Signalweges entsteht
ein Einfluss auf die Transkription von FoxO3a-Zielgenen und dadurch auch auf den
programmierten Zelltod. Das deutet daraufhin, dass ein aktivierter Signalweg die
Apoptoserate senken kann und dadurch die Entstehung und das Wachstum von Tumoren
begünstigen könnte.
52
DISKUSSION
7
Diskussion
Im Rahmen dieser Arbeit wurde SGK1 als Zielgen des Wnt-Signalweges identifiziert. Dieses
Gen
zeigt
wie
andere
schon
bestätigte
Zielgene,
z.
B.
Axin2/Conductin,
ein
Regulationsmuster, das dem Aktivitätstatus des Wnt-Signaltransduktionsweges folgt. Weiter
konnte gezeigt werden, dass diese Regulation von SGK1 durch den Wnt-Signalweg einen
Einfluss sowohl auf die Lokalisation als auch auf die Aktivität des Transkriptionsfaktors
FoxO3a hat. In anschließenden Experimenten wurde nachgewiesen, dass der Wnt-Signalweg
an der Regulation der FoxO3a-induzierten Apoptose - vermutlich über SGK1 - beteiligt ist.
Dadurch könnte die tumorigene Funktion des Wnt-Signalweges nicht nur über die Steigerung
der Zellproliferation erfolgen, sondern auch über die Aktivierung von SGK1, welches durch
FoxO3a anti-apoptotisch wirkt.
7.1
Neues Zielgen des Wnt-Signalweges: SGK1
Die ersten Hinweise auf eine Regulation von SGK1 durch den Wnt-Signalweg wurden durch
DNA-Microarrays gewonnen und konnten durch weitere Untersuchungen - quantitative RTPCR, Westernblot-Analyse und Promotorreporter-Assays - bestätigt werden. Auch in der
Literatur finden sich vereinzelte Publikationen, in denen eine Regulation von SGK1 durch
den Wnt-Signalweg beobachtet, aber nicht weiter untersucht wurde. So zeigen Naishiro und
Kollegen (Naishiro et al., 2005) erhöhte SGK1 Proteinmengen in Gewebeschnitten aus
Dickdarmadenomen von FAP-Patienten, die wie schon erwähnt, mutiertes APC haben. Des
Weiteren wird auch in der Veröffentlichung von Labbé (Labbe et al., 2007) eine Aktivierung
von SGK durch Wnt3a-Stimulation in einem zellulären System erwähnt. Die Ergebnisse der
vorliegenden Arbeit bestätigen eindeutig die β-Catenin/TCF-abhängige Regulation von
SGK1. Die Superaktivierung des Wnt-Signalweges in HCT116 mittels RNAi-vermittelten
Knock-Down von APC zeigte eine Aktivierung von SGK1. Da APC nicht nur ein Faktor in
der Wnt-Signaltransduktion darstellt, sondern auch noch andere Funktionen hat, wurde durch
eine zusätzliche, gleichzeitige Wegnahme von β-Catenin (siβ-Catenin) ausgeschlossen, dass
die Regulation von SGK1 ein APC-spezifischer Effekt ist, der nicht durch den kanonischen
Wnt-Signalweg vermittelt wird. Es stellte sich die Frage, ob die Regulation von SGK1 durch
53
DISKUSSION
den Wnt-Signalweg spezifisch für einen superaktivierten Signalweg ist. Die Untersuchungen
im DLD1-dnTCF (-/+dox) System erbrachten, dass SGK1 nicht nur bei superaktivierten
Wnt-Signalweg β-Catenin/TCF-abhängig reguliert ist. Zusätzlich konnte beim Vergleich von
Wnt1 exprimierenden Rat2 Zellen mit Rat2 MV7 Kontrollzellen auch die Wnt-abhängige
Regulation von SGK1 nachgewiesen werden. Das bedeutet zum einen, dass die Regulation
von SGK1 durch den Wnt-Signalweg nicht exklusive für Tumorzellen ist. Zum anderen
entspricht die Stimulation mit Wnts einer generellen Regulation durch den Wnt-Signalweg
und widerspricht zudem einer spezifischen Regulation von SGK1 nur bei superaktiviertem
Wnt-Signalweg. Außerdem konnte durch Promotorreporter-Experimente in verschiedenen
Systemen mit unterschiedlichen Stimuli, die den Wnt-Signalweg aktivierten oder inhibierten,
die β-Catenin-abhängige Regulation von SGK1 untermauert werden. Ein weiterer Sachverhalt
aus der Literatur der eine Regulation von SGK1 durch den Wnt-Signalweg in Beziehung
setzt, ist: SGK1 stellt ein Ziel dar, welches durch Wachstumsfaktoren aktiviert wird, und der
Wnt-Signaltransduktionsweg ist ein Signalweg, der Zellwachstum reguliert.
7.2
Direkte
oder
indirekte
Regulation
von
SGK1
durch
den
Wnt-Signalweg
Bei der Untersuchung der Regulation von SGK1 durch den Wnt-Signalweg sollte auch geklärt
werden, ob dies eine direkte oder eine indirekte Regulation ist. Bei der Analyse des Promotors
von SGK1 wurden Deletionskonstrukte angefertigt und in Reporterassays getestet. Alle
Konstrukte zeigten eine starke Wnt-abhängige Regulation. Allerdings konnte kein Motiv
identifiziert werden, das für die Regulation verantwortlich ist. Auch das kürzeste
Promotorkonstrukt (SGK1 III) ohne eine der definierten Bindestellen ist noch durch βCatenin reguliert. Eine mögliche Erklärung hierfür ist, dass sich innerhalb dieser verbliebenen
Sequenz des Promotorkonstruktes noch drei weitere Bereiche befinden, die den TCF-Motiven
sehr ähnlich sind. Sie unterscheiden sich von diesen nur durch den Austausch von einer Base.
Möglicherweise können auch diese Sequenzbereiche eine Regulation durch β-Catenin
vermitteln. Eine genaue Untersuchung dieser potentiellen Bindemotive im SGK1-Promotor
könnte zeigen, ob sich darunter eine für die Regulation durch β-Catenin relevante Bindestelle
befindet. Eine Identifizierung von regulatorischen TCF-Bindestellen durch PromotorreporterAnalysen stellt sich häufig als schwierig dar, denn Deletions- und Mutationsanalysen liefern
54
DISKUSSION
nicht immer eindeutige Erkenntnisse. Dies ist auch in der Publikation von Jho und Kollegen
bei der Untersuchung des Promotors von Axin2/Conductin (Jho et al., 2002) zu beobachten.
Die Autoren führten eine Deletions- und Mutationsanalyse des Promotors von Axin2 durch
und erhielten kontroverse Ergebnisse. Die Wnt/β-Catenin-abhängige Luziferaseaktivität des
Promotors wurde durch Deletion eines großen DNA-Bereichs, in dem sich sechs TCFBindestellen befinden, sehr stark gesenkt (>70 %). Allerdings wurde die Aktivität durch
Einführung von Mutationen in alle TCF-Bindemotive um nicht einmal 30 % gesenkt. Das
deutet darauf hin, dass die umliegende Sequenz für die Wnt-abhängige Regulation des Axin2
Promotors ebenfalls wichtige Elemente enthält und die Regulation nicht allein über die TCFBindestellen vermittelt wird. Dies kann auch für den SGK1 Promotor der Fall sein.
Ein anderer Mechanismus der Regulation von SGK1 durch den Wnt-Signalweg könnte durch
die Involvierung eines weiteren Faktors vonstatten gehen, also eine indirekte Regulation sein.
Ein bekanntes Beispiel dafür ist die indirekte, negative Regulation des ZellzyklusKinaseinhibitors p21WAF1 durch den Wnt-Signalweg (van de Wetering et al., 2002; Ziegler et
al., 2005). In Untersuchungen wurde gezeigt, dass die Expression von p21WAF1 durch den
Faktor MIZ-1 (MYC interacting zink finger protein 1) und dem direkten Wnt-Zielgen MYC
geregelt wird. In epithelialen Darmzellen dient diese MYC/MIZ-1/p21WAF1-Kaskade als
Schalter zwischen Differenzierung und Proliferation. Als ein direktes Zielgen des
Wnt-Signalweges nimmt MYC eine Sonderstellung ein, da MYC seinerseits die Transkription
von sehr vielen Genen sowohl durch Aktivierung als auch durch Reprimierung steuert. Eine
Regulation von SGK1 durch MYC oder einem anderen Zielgen des Wnt-Signalweges ist
bisher nicht bekannt.
Mit den in der vorliegenden Arbeit aufgeführten Ergebnissen konnte eindeutig nachgewiesen
werden, dass SGK1 durch den Wnt-Signalweg reguliert wird. Ob dies eine direkte oder
indirekte Regulation ist, bleibt noch zu klären und ist für die funktionelle Relevanz der SGK1
Induktion durch Wnt Signale nicht von Belang.
7.3
Regulation von FoxO3a durch den Wnt-Signalweg über SGK1
Ein in der Literatur beschriebenes Substrat von SGK1 ist der Transkriptionsfaktor FoxO3a.
FoxO3a reguliert unter anderem die Transkription des Zellzyklus-regulierenden Genes
p27KIP1 und des Apoptose-induzierenden Genes BIM. Eine Inhibierung der FoxO3a
55
DISKUSSION
Aktivität geschieht weitgehend durch Phosphorylierung, die auch von SGK1 vermittelt
werden kann (Brunet et al., 2001; Park et al., 1999). Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit
zeigen einen repressiven Effekt des Wnt-Signalwegs auf FoxO3a, der über SGK1 vermittelt
wird. In Immunfluoreszenz- (IF) Experimenten wurde ein Export von FoxO3a aus dem
Zellkern beobachtet, der durch aktiven Wnt-Signalweg induziert wurde. Es wurde durch den
Vergleich von Wildtyp FoxO3a mit einer FoxO3a-Mutante (FoxO3a-TM), die nicht mehr
durch SGK1 phosphoryliert und reguliert werden kann, herausgearbeitet, dass für die
Wnt-Signalweg-vermittelte
Translokation
von
FoxO3a
aus
dem
Zellkern
diese
Phosphorylierungen notwendig sind. Das Verwenden von siRNA gegen SGK1 in den IFExperimenten zeigte keinen homogenen Phänotyp. Es war nicht eindeutig zu detektieren, ob
die Wnt-vermittelten Effekte auf die Lokalisation von FoxO3a durch einen Knock-Down von
SGK1 wieder aufgehoben werden. Das Problem besteht einerseits darin, dass die
Transfektionseffizienz nur bei etwa 50 % liegt und andererseits auch nicht nachgewiesen
werden kann, welche Zellen die siRNA überhaupt aufgenommen haben. Transfizierte sowie
endogene Proteine konnten gefärbt und genau analysiert werden, ob sie exprimiert wurden
und wo sie in der Zelle lokalisiert waren. FoxO3a ist durch eine Aktivierung des Signalweges
vorwiegend im Zytoplasma der Zellen zu finden, dagegen ist bei der Mutante keine
Veränderung der nukleären Lokalisation festzustellen. Reportergen-Experimente bestätigten
ebenfalls einen Einfluss des Wnt-Signalweges auf die transkriptionelle Aktivität von FoxO3a.
In den Reportergen-Experimenten wurde sowohl durch das Verwenden der FoxO3a-Mutante
als auch durch siRNA gegen SGK1 nachgewiesen, dass die Regulation von FoxO3a durch
den Wnt-Signalweg über SGK1 abläuft. Dabei stellt sich die Frage, wie die Phosphorylierung
von SGK1 vermittelt wird bzw. wie dies bei einer erhöhten Expression von SGK1 vonstatten
geht. Dieser Sachverhalt wird auch in der Veröffentlichung von Mikosz und Kollegen
(Mikosz et al., 2001) diskutiert. Die Autoren berichten von einer Steigerung der Expression
von SGK1 - in ihrem Fall durch die Aktivierung von Glucocorticoid-Rezeptoren - und einem
daraus resultierenden, SGK1-vermittelten anti-apoptotischen Effekt. Sie zeigen durch
spezifische Inhibition der PI3-Kinase, dass die endogene PI3-Kinase Aktivität in den
verwendeten Zellen (MEC = mammary epithelial cells) ausreichend für die Phosphorylierung
des erhöhten SGK1 Levels ist (Mikosz et al., 2001). Diese Argumente können auch auf die in
der vorliegenden Arbeit durchgeführten Experimente übertragen werden. Für den Großteil der
Experimente wurden epitheliale Tumorzellen (HCT116) verwendet, für die außerdem eine
erhöhte PI3-Kinaseaktivität aufgrund einer Mutation des PIK3CA-Gens gezeigt wurde
56
DISKUSSION
(Samuels et al., 2005). Die endogene Kinaseaktivität von PI3-Kinase ist in dem verwendeten
System offensichtlich ausreichend, um die erhöhten SGK1 Mengen zu phosphorylieren.
Allerdings ist bisher der Einfluss von PKB/Akt in Bezug auf die Regulation von FoxOs durch
den Wnt-Signalweg noch nicht geklärt. Wie bereits beschrieben, ist PKB/Akt ebenfalls ein
negativer Regulator von FoxO3a (Brunet et al., 1999; Kops et al., 1999) und es gibt Hinweise,
dass PKB/Akt ebenfalls durch den Wnt-Signalweg reguliert wird (Dihlmann et al., 2005). Die
hier gezeigten Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Wnt-Signalweg durch die Regulation
von SGK1 und evtl. zusätzlich von PKB/Akt der FoxO3a-Aktivität entgegenwirkt. Eine
Regulation von PKB/Akt durch den Wnt-Signalweg konnte in den für die vorliegende Arbeit
durchgeführten DNA Microarrays nicht beobachtet werden. Die darauf folgenden
Experimente wurden in denselben Systemen durchgeführt und es kann vermutet werden, dass
PKB/Akt zumindest in diesen Systemen nicht oder nur schwach durch den Wnt-Signalweg
reguliert ist. Ein Ausschluss von FoxO3a aus dem Zellkern und die daraus resultierende
Hemmung der FoxO-Aktivität ist am effektivsten, wenn alle drei regulatorischen
Aminosäurereste phosphoryliert sind (Thr32 durch beide Kinasen, Ser253 durch Akt und Ser315
durch SGK1). Brunet und Kollegen konnten ein vergleichbares Potential für PKB/Akt und
SGK1 in Bezug auf die Phosphorylierung der jeweiligen Aminosäuren von FoxO3a messen
(Brunet et al., 2001). Für eine effektive Regulation von FoxO3a vermuten sie ein
Zusammenspiel der beiden Kinasen. Deswegen könnte man spekulieren, dass eine Regulation
von SGK1 und PKB/Akt1 durch den Wnt-Signalweg sinnvoll wäre, um eine effektive
Regulation von FoxO3a zu gewährleisten. Aber auch die Phosphorylierungen, die von einer
der beiden Kinasen vermittelt werden, sind ausreichend für einen - etwas verminderten Einfluss auf die Regulation von FoxO3a (Brunet et al., 2001). Eine Regulation von FoxO3a
durch jeweils nur eine der beiden Kinasen könnte aber auch durch unterschiedliche externe
Reize induziert werden. Ob PKB/Akt durch den Wnt-Signalweg an der Regulation von FoxOs
beteiligt ist, bleibt noch zu klären. Für SGK1 wurde in der vorliegenden Arbeit der Nachweis
erbracht, dass es ein durch β-Catenin/TCF-reguliertes Gen ist und bei der Wnt-vermittelten
Regulation der FoxO3a Aktivität involviert ist.
Für den Einfluss von β-Catenin auf die FoxO3a-abhängige Transkription zeigen Essers und
Kollegen in ihrer Veröffentlichung (Essers et al., 2005) Daten, die im Gegensatz zu den in der
vorliegenden Arbeit erzielten Resultaten stehen. Die Autoren zeigen eine Regulation der
FoxO3a-abhängigen Transkription, die durch β-Catenin nicht, wie in der vorliegenden Arbeit
gezeigt, erniedrigt, sondern erhöht wird. Bisher konnte noch keine Begründung für diese
57
DISKUSSION
Diskrepanz gefunden werden. Durch Titration von β-Catenin in Reporterexperimenten konnte
nicht nachgewiesen werden, ob es eventuell einen Schwellenwert für β-Catenin gibt, an dem
eine Repression von FoxO3a in eine Aktivierung umschlägt. Es wurde eine dosisabhängige
Repression der Aktivität von FoxO3a durch β-Catenin beobachtet. Der Widerspruch zu den
Beobachtungen von Essers und Kollegen könnte durch einen direkten Vergleich der
experimentellen Durchführung (DNA-Mengen und Inkubationszeiten) oder auch durch
Austausch und Kombination der jeweils verwendeten Materialien (Zelllinien und Plasmide)
geklärt werden.
7.4
Einfluss des Wnt-Signalweges auf die FoxO3a-induzierte Apoptose
Bekannte Zielgene von FoxO3a sind unter anderen auch die Gene BIM (Bcl-2 interacting
mediator) und p27KIP1. In Reporterassays wurde der Einfluss des Wnt-Signalweges auf die
Regulation der Transkription dieser Gene gezeigt. Eine Aktivierung von BIM induziert den
programmierten Zelltod. Deshalb wurde ein möglicher Einfluss des Wnt-Signalweges auf die
Regulation der FoxO3a-induzierten Apoptose untersucht. Mittels TUNEL-Messungen konnte
eine Wnt-abhängige Regulation der FoxO3a-induzierten Apoptose nachgewiesen werden.
Aufgrund der vorhergehenden Untersuchungen liegt die Vermutung nahe, dass dies über
SGK1 vermittelt wird. Mit anderen Methoden zur Messung von Apoptose, wie AnnexinVoder Propidiumiodid (PI)- Färbung, konnte keine signifikante Regulation der FoxO3ainduzierten Apoptose nachgewiesen werden. Zwar konnte eine Induktion der Apoptose durch
FoxO3a gemessen werden, allerdings war keine signifikante Änderung der Apoptoserate
durch Koexpression der Regulatoren des Wnt-Signalweges zu beobachten. Auch eine
Überexpression von SGK1, der „Positivkontrolle“ führte nicht zu einer Abnahme der
FoxO3a-induzierte Apoptose. Offensichtlich sind diese Techniken nicht geeignet, um in den
hier angewandten Systemen die Regulation der FoxO3a-induzierten Apoptose aufzuzeigen.
Der TUNEL-Assay scheint für die vorliegende Fragestellung und das System die beste
Messmethode zu sein, da sie sehr sensitiv ist. Mit dieser Methode konnte die FoxO3ainduzierte Apoptose gut bestimmt und auch der repressive Effekt von SGK1 nachgewiesen
werden.
58
DISKUSSION
7.5
SGK1 und Tumorigenese
7.5.1
Möglicher Einfluss auf die Tumorigenese von SGK1 durch die Regulation
von epithelialen Natriumkanälen (ENaC)
In der vorliegenden Arbeit wurde eine mögliche Relevanz für die Aktivierung des SGK1Genes durch den Wnt-Signalweg auf die Tumorigenese untersucht: die Regulation des
Transkriptionsfaktors FoxO3a durch SGK1. Eine weitere, auch in der Einleitung bereits
angesprochene Funktion von SGK1 ist die Regulation der Aktivität von epithelialen
Natriumkanälen (ENaC = epithelial Na+ channel). SGK1 kontrolliert über die Ubiquitin
Ligase Nedd4-2 (neuronal expressed developmentally downregulated 4-2) die Aktivität von
ENaC (Canessa et al., 1993; Naray-Fejes-Toth et al., 2004; Pearce, 2003). Dies ist eine
wichtige Funktion von SGK1, denn in SGK1 Knock-Out Mäusen ist kein ausgeprägter
Phänotyp festzustellen, außer einer Beeinträchtigung der Natriumkanäle in der Niere. Welche
Folgen eine konstitutive Expression von SGK1 und damit eine erhöhte Aktivität der
Natriumkanäle auf die Tumorigenese haben könnte, ist bisher nicht beschrieben. Allerdings
finden sich in der Literatur etliche Berichte, in denen ein Einfluss von Ionenkanälen auf die
Entstehung von Krebs diskutieren wird (Anderson et al., 2003; Fiske et al., 2006;
Kunzelmann, 2005; Laniado et al., 2001; Monteith et al., 2007; Preussat et al., 2003;
Prevarskaya et al., 2007a; Prevarskaya et al., 2007b). Die Ionenkanäle der Plasmamembran
sind nahezu an allen grundlegenden zellulären Prozessen beteiligt, auch an solch kritischen
wie
Proliferation,
Differenzierung
und
Apoptose.
Erhöhte
Proliferation,
anomale
Differenzierung und eine beeinträchtigte Regulation des programmierten Zelltodes sind die
ersten Anzeichen von verändertem Gewebewachstum. Solche Eigenschaften können später in
unkontrollierte Expansion und Invasion – Charakteristika von Krebs – resultieren
(Prevarskaya et al., 2007a). Eine veränderte Aktivität von Ionenkanälen kann so
möglicherweise das Tumorwachstum fördern (Kunzelmann, 2005). Beim Vergleich von
gesunden Zellen mit Zellen aus Tumorgeweben wurde eine Korrelation mit einer
Veränderung der Aktivität von Ionenkanälen beobachtet (Abdul and Hoosein, 2006;
Kunzelmann, 2005). In Prostatakrebszellen wurde eine erhöhte Aktivität von Natriumkanälen
beobachtet, welche mit einer erhöhten Resistenz gegenüber Apoptose einhergeht (Prevarskaya
et al., 2007a). Somit gibt es Hinweise, die einen Einfluss der Ionenkanäle auf die
59
DISKUSSION
Tumorentwicklung
vermuten
lassen.
SGK1
ist
ein
Regulator
von
epithelialen
Natriumkanälen. Eine Aktivierung von SGK1 durch den Wnt-Signalweg könnte über diesen
Weg zusätzlich an der Tumorigenese beteiligt sein. Mit Hilfe von APCmin-Mäusen könnte
diese Theorie untersucht werden. Durch das Kreuzen von APCmin-Mäusen mit SGK1 KnockOut Mäusen könnte man verfolgen, ob die Regulation von SGK1 durch den Wnt-Signalweg
eine messbare Funktion in vivo hat. Ein Vergleich dieser gekreuzten Mäuse könnte zeigen, ob
durch den Verlust von SGK1 ein Tumorwachstum schneller entstehen und fortschreiten kann.
Sollte ein solcher Effekt zu beobachten sein, könnte im Anschluss durch weitere
Untersuchungen geklärt werden, ob dies durch die Regulation der Natriumkanäle, der FoxOProteine oder durch beide Funktionen von SGK1 vermittelt wird.
7.5.2
Veränderungen des Expressionsprofils von SGK1 im Verlauf der
Tumorigenese
Im Verlauf dieser Arbeit konnten DNA-Microarraydaten (von Dr. F. Rödel, Strahlenklinik,
Universität Erlangen) eingesehen werden, die aus Tumorgewebeproben von Patienten mit
Darmkrebs generiert wurden. Es wurden die Expressionsprofile von normalem, gesundem
Gewebe mit dem von Tumorgewebe jeweils aus dem Kolon von mehreren Patienten
miteinander verglichen. Die genauen Entwicklungsstadien bzw. die Größe der Tumoren
waren nicht angegeben, es scheint sich um weiterentwickelte Karzinome gehandelt zu haben,
da diese operativ entfernt werden mussten. Es standen nur wenige Proben zur Verfügung
(n=8), was keiner statistischen Aussagekraft entspricht. Für eine genauere und
aussagekräftigere Untersuchung müssten wesentlich mehr Proben analysiert werden. Beim
Vergleich von Tumor- mit Normalgewebe war für SGK1 in zwei dieser Proben eine erhöhte,
in drei eine verminderte und in den restlichen drei keine veränderte Expression zu messen.
Möglicherweise ändert sich das Expressionsprofil von SGK1 im Verlauf der Tumorigenese
und SGK1 ist nicht fortwährend aktiviert. Eventuell wird SGK1 vor allem zu Beginn der
Tumorigenese und weniger in späteren Stadien aktiviert und deswegen konnte in den meisten
Patientenproben mit weiterentwickelten Karzinomen keine erhöhte Expression von SGK1
detektiert werden. Im Gegensatz dazu konnten aber, wie bereits erwähnt, erhöhte SGK1-Level
in Dickdarmadenomen von FAP-Patienten detektiert werden (Naishiro et al., 2005). In
einigen Veröffentlichungen wurden Expressionsanalysen von unterschiedlichen Stadien der
60
DISKUSSION
kolorektalen Karzinogenese angefertigt. Die Expressionsprofile wurden miteinander und mit
solchen aus gesundem, kolorektalem Gewebe verglichen. (Frederiksen et al., 2003;
Friederichs et al., 2005; Habermann et al., 2007; Kleivi et al., 2007). Bei den Auswertungen
wurden nicht nur Gene gefunden, die ständig aktiviert waren, sondern auch solche mit
ansteigender oder abnehmender Expression im Verlauf der Karzinogenese. Möglicherweise
ist auch die Expression von SGK1 in den verschiedenen Tumorstadien unterschiedlich.
Dadurch wäre die Regulation von SGK1 (und FoxO3a) durch β-Catenin im Verlauf der
Karzinogenese ebenfalls unterschiedlich intensiv. Eine Änderung des Expressionsmuster
könnte dadurch erklärt werden, dass eine Aktivierung von manchen Faktoren nur in
bestimmten Phasen der Tumorigenese besonders wichtig ist. Möglicherweise zählt SGK1 zu
diesen Faktoren.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigen, dass der Wnt-Signalweg SGK1 aktiviert und
dadurch einen Einfluss sowohl auf die Lokalisation von FoxO3a als auch auf die FoxO3aabhängige Transkription sowie die FoxO3a-induzierte Apoptose nimmt. Ein solcher Effekt
des Wnt-Signalweges ist möglicherweise nur in bestimmten Phasen der Tumorigenese von
besonderer Wichtigkeit.
7.6
Fox-Proteine und Tumorigenese
Fox-Proteine sind bei sehr vielen unterschiedlichen zellulären Prozessen beteiligt. Vielen von
ihnen wird eine wichtige Rolle bei der Entstehung und Progression von Krebs zugeschrieben,
einige von ihnen werden auch als Tumorsuppressoren oder Oncogene bezeichnet (Myatt and
Lam, 2007). Eine fehlerhafte Regulation von Fox-Proteinen kann in zahlreichen
verschiedenen
Tumoren
beobachtet
werden.
In
vielen
Krebsarten
ist
auch
der
Wnt-Signaltransduktionsweg dahingehend beeinträchtigt, dass er konstitutiv aktiviert ist.
Dadurch wird unter anderem, wie in der vorliegenden Arbeit gezeigt, die Transkription von
SGK1 erhöht. Das zieht wiederum eine Inhibierung von FoxO-Proteinen nach sich und
könnte durch Inhibierung der Apoptose die Tumorigenese begünstigen.
Kürzlich wurde eine mögliche Funktion von FoxO-Faktoren bei der Entwicklung von KrebsStammzellen beschrieben (Coffer and Burgering, 2007). Die Beobachtung, dass FoxOs
wichtige Regulatoren sind, um das „Stammzell-Potential“ von normalen Stammzellen
aufrecht zu erhalten, warf die Frage auf, ob FoxOs auch eine Rolle in Krebs-Stammzellen
61
DISKUSSION
spielen. Wie bereits erwähnt werden FoxO-Proteine als sog. „bona fide“ Tumorsuppressoren
bezeichnet und es stellt sich die Frage, welche Aufgabe sie in Krebs-Stammzellen haben
könnten. Der Verlust von FoxOs führt zur Abnutzung (Depletion) von normalen
Stammzellen. Deswegen könnte man annehmen, dass ein Verlust von FoxO-Faktoren auch
für Krebs-Stammzellen schädlich ist, was allerdings im Gegensatz zu einer TumorsuppressorFunktion von FoxO stünde (Coffer and Burgering, 2007). Tatsächlich scheint es aber für eine
Krebs-Stammzelle nötig zu sein, neben PTEN auch FoxO „ruhig“ zu stellen.
Interessanterweise wurde dies auch in C. elegans beobachtet, wo ein Keimzelltumor, der als
aus Stammzellen entstanden betrachtet werden kann, sich durch die Aktivierung von Daf-16
(FoxO Homolog in C. elegans) wieder zurückentwickelte (Pinkston et al., 2006). Die Daten
der vorliegenden Arbeit zeigen einen generellen repressiven Effekt des Wnt-Signalweges auf
die Aktivität von FoxO. Da, wie bereits erwähnt, Krebs-Stammzellen offenbar eine
„Ruhigstellung“ von FoxO benötigen, könnte der Wnt-Signalweg durch die Inhibierung von
FoxO auch bei der Entstehung von Krebs-Stammzellen beteiligt sein. Zusätzlich ist für den
Wnt-Signalweg eine wichtige Funktion bei der Aufrechterhaltung und Selbsterneuerung von
normalen Stammzellen beschrieben (Pardal et al., 2003; Reya et al., 2003; van de Wetering et
al., 2002; Willert et al., 2003). Signalwege, die bei der Aufrechterhaltung und Erneuerung von
Stammzellen beteiligt sind, sind sehr wichtig bei der Regulation von Proliferation und
Überleben der Zellen. Deswegen sind es diese Signalwege, die durch eine Fehlsteuerung,
z. B. begründet durch Mutationen, direkt assoziiert sind mit der Entstehung und Progression
von Krebs. Eventuell sind sie dadurch auch an der Entwicklung von Krebs-Stammzellen
beteiligt. Eine Funktion des Wnt-Signalweges bei der Entstehung von Krebs-Stammzellen
könnte so durch die Fehlregulation des Wnt-Signalweges selbst begründet sein. Aber auch der
repressive Effekt des Wnt-Signalweges auf die FoxO-Proteine könnte einen Einfluss des
Wnt-Signalweges auf die Entwicklung von Krebs-Stammzellen darstellen. Der genaue
Mechanismus, auf welche Weise der Wnt-Signalweg bei der Entstehung von KrebsStammzellen beteiligt sein könnte, muss noch geklärt werden. Ebenso muss auch noch die
Bedeutung der Phosphorylierung und Inaktivierung von FoxOs während der Tumorigenese in
Bezug auf die Entwicklung von Krebs-Stammzellen genauer erforscht werden.
62
DISKUSSION
7.7
Der Wnt-Signalweg und Tumorigenese
Eine Steigerung der Proliferation und die Hemmung der Apoptoserate sind Mechanismen, die
die Entstehung und Progression von Krebs stark vorantreiben. Ein stetig aktiver
Wnt-Signalweg fördert die Tumorigenese durch die Aktivierung von Genen, welche die
Proliferation der Zellen steigern, wie z. B. MYC und CyclinD1. Weniger erforscht ist bisher
das Potential des Wnt-Signalweges, die Apoptose zu hemmen. In der Literatur sind Berichte
zu finden, aus denen sowohl eine anti- als auch eine pro-apoptotische Funktion des
Wnt-Signalweges abgeleitet werden kann. Anti-apoptotisch wirkt der Wnt-Signalweg durch
die Aktivierung von Survivin (Chen et al., 1999; Kim et al., 2003; Tapia et al., 2006; Torres et
al., 2006). Es wurde auch eine β-Catenin-abhängige Resistenz gegenüber einer Krebstherapievermittelten Apoptose in Wnt-1 exprimierenden Zellen beobachtet (Chen et al., 2001). Eine
pro-apoptotische Funktion durch den Wnt-Signalweg ist bisher noch nicht beschrieben,
könnte aber durch die β-Catenin/TFC-abhängige Aktivierung von MYC ablaufen. Es wurde
gezeigt, dass MYC unter bestimmten Voraussetzungen (z. B. Entzug von Serum, wt-p53
background) den programmierten Zelltod einleiten kann (Evan et al., 1992; Hermeking and
Eick, 1994; Wagner et al., 1994). Allerdings wurde bisher in Zusammenhang mit βCatenin/TCF nichts von einer MYC-abhängigen Induktion der Apoptose berichtet, d. h. es
gibt wenig Evidenz für einen pro-apoptotischen Effekt des Wnt-Signalweges. Ein weiterer
Mechanismus durch den der Wnt-Signalweg in die Regulation der Apoptose eingreifen
könnte, ist die Regulation von FoxO-Transkriptionsfaktoren. Eine direkte Interaktion von βCatenin und FoxO3a/4 kann die FoxO-Aktivität steigern (Essers et al., 2005), was eine
Induktion der Apoptose zur Folge haben könnte. Durch die β-Catenin/TCF-abhängige
Aktivierung von SGK1 wurde in der vorliegenden Arbeit gezeigt, dass ein aktiver
Wnt-Signalweg die FoxO-Aktivität auch hemmen kann. Weiter wurde auch eine Inhibierung
der
FoxO3a-induzierten
Apoptose
durch
eine
Aktivierung
des
Wnt-Signalweges
nachgewiesen. Diese Beobachtungen würden auf eine antagonistische Regulation von FoxOs
durch den Wnt-Signalweg hindeuten. Dies könnte einen Mechanismus zur Feinabstimmung
oder zur Kontrolle bei der Regulation von FoxO-Faktoren darstellen. Es könnte allerdings
auch sein, dass eine Regulation von FoxO durch β-Catenin durch bestimmte zusätzliche
Faktoren in einer Aktivierung oder Inhibierung der FoxO-Aktivität resultiert, um auf
unterschiedliche Stimuli zu reagieren. Welche Faktoren einen solchen Einfluss auf die βCatenin-vermittelte Regulation von FoxO haben könnten, muss noch untersucht werden.
63
DISKUSSION
Zusammenfassend zeigen die Daten der vorliegenden Arbeit, dass durch die β-Catenin/TCFabhängige Aktivierung von SGK1 der Wnt-Signalweg eine repressiven Effekt auf die FoxOAktivität ausübt und dadurch vermutlich zusätzlich die Entstehung und Progression von
Krebs gefördert wird.
64
MATERIAL & METHODEN
8
Material und Methoden
8.1
Material
8.1.1
Puffer und Lösungen
Acrylamid-Stammlösung I
30 % Acrylamid
0,8 % Bisacrylamid
Alkalische Lyse Puffer I
50 mM Tris/ HCL, pH 7,5
10 mM EDTA, pH 8,0
100 µg/ml RNaseA
Alkalische Lyse Puffer II
200 mM NaOH
1 % SDS
Alkalische Lyse Puffer III
3,0 M Kalium-Acetat, pH 5,5
Ampicilin (1000x)
50 mg/ml
Blockierlösung
1x PBS
5 % Magermilchpulver
0,1 % Tween-20
Bradford-Färbelösung (5x)
23,5 % Ethanol
42,5 % Phosphorsäure
0,05 % Coomassie Brilliant Blue R-250
Ethidiumbromid-Stammlösung
10 mg/ml gelöst in H2O
Fixierlösung (IF)
3 % Paraformaldehyd in PBS
Kanamycin (1000x)
15 mg/ml
KH2PO4/ K2HPO4 Puffer, pH 7,8
84 ml 100 mM K2HPO4
16 ml 100 mM KH2PO4
LacZ-Puffer (5x)
100 mM KH2PO4/ K2HPO4, pH 7,5
10 mM KCl
1 mM MgSO4
65
MATERIAL & METHODEN
50 mM β-Mercaptoethanol
L1-Puffer
20 mM Tris/ HCL pH, 7,4
(Lysepuffer für Säugerzellen)
150 mM NaCl
5 mM EDTA
1,0 % Triton-X-100
1 mM DTT
1 mM PMSF
Ladepuffer (10x)
100 mM EDTA, pH 8,0
60 % Glyzerin
0,25 % Bromphenolblau
0,25 % Xylencyanol
LB-Medium
0,5 % Bacto® Hefeextract
1 % Bacto® Pepton
1 % NaCl
Luziferin Stammlösung (10x)
5 mM D-Luziferin
100 mM KH2PO4/ K2HPO4, pH 7,8
Glycylglycine, Free Base (Gly-Gly)
0,5 M
Gly-Gly Lysepuffer
25 mM Gly-Gly
(Luziferase-Experimente)
15 mM MgSO4
4 mM EGTA
1 % Triton X-100
1 mM DTT (frisch dazugegeben)
Luziferinlösung (1x)
25 mM Gly-Gly
15 mM MgSO4
4 mM EGTA
2 mM DTT
1/10 Luziferin Stammlösung
Mess-Puffer
25 mM Gly-Gly
(Luziferase-Experimente)
15 mM MgSO4
15 mM KH2PO4/ K2HPO4, pH 7,8
4 mM EGTA
5 mM ATP
1 mM DTT
66
MATERIAL & METHODEN
Moviol (Einbettungsmedium IF)
4,9 ml 87 % Glyzerin
2,4 g Moviol
6 ml H2O
12 ml 0,2 M Tris/HCl, pH 8,5
ONPG-Lösung
4 mg/ml ONPG in 1x LacZ-Puffer
PBS (1x)
137 mM NaCL
3 mM KCl
6,5 mM Na2HPO4
1,5 mM KH2PO4
PBS-T (1x)
1x PBS
0,5 % Tween-20
Permeabilisierungslösung (IF)
0,5 % Triton-X-100 in PBS
Ponceau-Färbelösung
2 % (w/v) Ponceau S
in 1 % Essigsäure
Sammelgel (Western-Blot)
4 % Bisacrylamid
4x Sammelgelpuffer
0,06 % APS
0,125 % Temed
Sammelgelpuffer (4x)
500 mM Tris/ HCL, pH 6,8
0,4 % SDS
SDS-Laufpuffer
25 mM Tris Base
(Lämmli-Puffer)
192 mM Glycin
0,1 % SDS
SDS-Probenpuffer (4x)
250 mM Tris/ HCL, pH 6,8
20 % Glyzerin
20 % β-Mercaptoethanol
8 % SDS
0,4 % Bromphenolblau
TAE
40 mM Tris Base
20 mM Essigsäure
1 mM EDTA
TE-Puffer (10x)
10 mM Tris/ HCl, pH 8,0
0,1 mM EDTA
67
MATERIAL & METHODEN
Trenngel (Western-Blot)
6 – 8 % Acrylamid
4x Trenngelpuffer
0,06 % APS
0,16 % Temed
Trenngelpuffer (4x)
1,5 mM Tris/ HCL, pH 8,8
0,4 % SDS
Transferpuffer (Western Blot)
20 mM Tris/ HCl, pH 7,0
150 mM Glycin
10 % (v/v) Methanol
0,02 % SDS
Zellkulturmedium
DMEM mit 1g/l Glukose
10 % Fötales Kälberserum
1 % Penicillin/Streptomycin
8.1.2
Weitere Reagenzien und Enzyme
β-Mercaptoethanol
Roth, Karlsruhe
Absolute SYBR Green Fluorescein
Abgene Hamburg
Agarose NEEO ultra ROTI®GAROSE
Roth, Karlsruhe
Ampicilllin
Roche, Mannheim
Bio-Magermilchpulver
Töpfer GmbH, Dietmannsried
BSA (Albumin Fraktion V)
Roth, Karlsruhe
Desoxynukleotide
Fermentas, St. Leon-Roth
Deferoxamine Mesylate Salz
Sigma-Aldrich, Deisenhofen
D-Luziferin
P.J.K. GmbH, Kleinblittersdorf
Dithiothreitol (DTT)
Serva, Heidelberg
Fötales Kälberserum (FKS)
Biochrom AG, Berlin
Perbio Science Deutschland GmbH, Bonn
PAA Laboratories GmbH, Cölbe
GeneRuler DNA Größenstandard
Fermentas, St. Leon-Roth
68
MATERIAL & METHODEN
Glycylglycine, Free Base (Gly-Gly)
Calbiochem, San Diego, CA
Hi-Di™ Formamidpuffer
Applied Biosystems, Foster City, CA
Kanamycin
Roche, Mannheim
Klenow Enzym
BioLabs, Schwalbach
Mowiol 4-88
Calbiochem, San Diego, CA
NEB-Puffersystem für Restriktionsverdaus
BioLabs, Schwalbach
4-Nitrophenyl
phosphate
dinatrium
salz Sigma Aldrich, Deisenhofen
hexahydrate
Phosphatase, alkalische
BioLabs, Schwalbach
Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase
Finnzymes, Espoo, Finnland
PMSF Proteinase Inhibitor
Sigma Aldrich, Deisenhofen
Ponceau S
Roth, Karlsruhe
Protein Standard SDS-6H
Sigma Aldrich, Deisenhofen
Random Hexamer Primer
Invitrogen GmbH, Karlsruhe
Restriktionsenzyme
BioLabs, Schwalbach
Reverse Transkiptase SuperScript™ II
Invitrogen GmbH, Karlsruhe
RNase A
Qiagen, Hilden
RNase Inhibitor, RNase Out
Invitrogen GmbH, Karlsruhe
RNeasy
Qiagen, Hilden
Roti-Phenol
Roth, Karlsruhe
Sequenzier-Mix Big Dye® Terminator v1.1 Applied Biosystems, Foster City, CA
Sequencing Standard Kit
T4 DNA Ligase
BioLabs, Schwalbach
Taq-DNA-Polymerase
Invitrogen GmbH, Karlsruhe
TransIT T-KO Transfektions Reagenz
MoBiTec GmbH, Göttingen
Triton X-100
Sigma Aldrich, Deisenhofen
Trizol peqGOLD Trifast™
Peqlab, Erlangen
Tween®-20
Sigma Aldrich, Deisenhofen
Western Lightning® Western Blot
Chemiluminescence Reagent Plus
Perkin Elmer, Wellesley, MA
Nicht aufgeführte Chemikalien stammten von der Firma Roth, Karlsruhe.
69
MATERIAL & METHODEN
8.1.3
Verbrauchsmaterialien
APO-BrdU™ TUNEL Assay Kit (A23210)
Invitrogen GmbH, Karlsruhe
CryoTube™ vials
Nunc GmbH & Co. KG, Wiesbaden
Nitrocellulose-Membran Hybond-C extra
Amersham Pharmacia biotech, Freiburg
NucleoSpin® Extract II
Macherey – Nagel, Düren
PCR-Reaktionsgefäße ultradünn
Biolabs, Schwalbach
PureLink™ HiPure Plasmid Maxiprep Kit
Invitrogen GmbH, Karlsruhe
QIAquick Gel Extraction Kit
Qiagen, Hilden
QIAquick PCR Purification
Qiagen, Hilden
Whatmanfilter
Whatman International Ltd., Maidstone,
England
96 Well Immuno Platten MaxiSorp
Nunc GmbH & Co. KG, Wiesbaden
Zellkulturschalen und 6-, 12-, 24- und 96- TPP AG, Trasadingen, Schweiz
Well Platten
8.1.4
Geräte
Neben in molekularbiologischen Laboratorien üblichen Geräten wurden folgende eingesetzt:
Durchflusscytometer FACScan
BD Biosciences, Heidelberg
Elisa-Reader SpectraMAX190
Molecular Devices GmbH, Ismaning
Fluoreszenzmikroskop Axioplan 2
Zeiss, Göttingen
Fotoaufsatz für Mikroskop und Stereo-
Visitron Systems, Puchheim
Mikroskop RT monochrome Spot
iCycler iQ
Bio-Rad, München
Luminometer DLReady CentroLB 960
Berthold Technologies,GmbH & Co. KG,
Bad Wildbad
Luminoimager LAS-3000 FujiFilm
raytest
Isotopenmessgeräte
GmbH,
70
MATERIAL & METHODEN
Straubenhardt
Nuaire Biological Safety Cabinets
Integra Bioscience GmbH, Fernwald
PCR-Maschine Thermocycler T3
Biometra, Göttingen
SDS-PAGE Apparatur Mini-Protean II
Bio-Rad, München
Sequencer ABI Prism™ 377
Perkin Elmer, Überlingen
SmartSpec™ 3000 Photometer
Bio-Rad, München
Steri-Cult 200 Incubator
Memmert GmbH & Co. KG, Schwabach
Western Blotting Apparaturen
Bio-Rad, München
8.1.5
Oligonukleotide
8.1.5.1
Oligonukleotide zur Analyse der Expression von Genen
Gen
Name
Sequenz
TA
Zyklen
SGK1
SGK Hu tqm for2
GATCTCCCAACCTCAGGAGCC
57°C
50
57°C
50
57°C
50
SGK Hu tqm rev2 CTGGAAAGAGAAGTGAAGGCCC
Axin2
GAPDH
8.1.5.2
Ax2 Hu tqm for
GCAAACTTTCGCCAACCGTG
Ax2 Hu tqm rev
CTCTGGAGCTGTTTCTTACTGCCC
GAPDH for
CCTGCTTCACCACCTTCTTG
GAPDH rev
CTTCACCACCATGGAGAAGG
Oligonukleotide für Klonierungen
Gen/Vektor Name
SGK1/
mYF-N2
Sgk1_F_Xma
Sequenz
TA
Zyklen
TCCCCCCGGGACGGTGAAAACTGAG
58°C
35
58°C
35
GCTGC
Sgk1_R_Bam
CGCGGATCCGAGGAAAGAGTCCGTG
GGAGG
71
MATERIAL & METHODEN
SGK1/
pcDNA3.1Flag
FoxO3a/
mYF-N2
FoxO4/
pcDNA3.1Flag
n x DBE-
Sgk1_F_Not
ATAAGAATTGCGGCCGCTGACGGTG
57°C
35
57°C
35
57°C
35
AAAACTGAGGCTGC
Sgk1_R_Not
TTAGTTTAGCGGCCGCAATCAGAGG
AAAGAGTCCGTGGGAGG
FoxO3a_F_BspE1 TCCCTCCGGAGCAGAGGCACCGGCTT
CC
FoxO3a_R_Bam
CGCGGATCCGCCTGGCACCCAGCTCTG
57°C
35
FoxO4_F_Not
ATAAGAATTGCGGCCGCTGGATCCGG
57°C
35
57°C
35
GGAATGAGAATTC
FoxO4_R_Not
TTAGTTTAGCGGCCGCAATCAGGGAT
CTGGCTCAAAGTTGAAGTC
2xDBE_for
GATCAAGTAAACAACTATGTAAACAA
-
-
2xDBE_rev
GATCTTGTTTACATAGTTGTTTACTT
-
-
56°C
35
56°
35
56°C
35
56°
35
56°C
35
56°
35
Reporterkonstrukte
SGK1 I/
pGL3basic
SGK1 II/
pGL3basic
SGK_Hu_for1
SGK_Hu_rev1
SGK_Hu_for2
AAAAAGATCTGGGGAGACAGAAAGA
CGTTAGCG
AAAAAGATCTGGGGAGACAGAAAGAC
GTTAGCG
TTTTGCTAGCGCAAGAGGAAGCAGAC
ATGGGC
SGK_Hu_rev1
AAAAAGATCTGGGGAGACAGAAAGAC
GTTAGCG
SGK1 III/
pGL3basic
SGK_Hu_for3
TTTTGCTAGCGCAAGTGGGGGTGGTTT
TGC
SGK_Hu_rev1
AAAAAGATCTGGGGAGACAGAAAGAC
GTTAGCG
72
MATERIAL & METHODEN
8.1.5.3
Oligonukleotide für Sequenzierungen
Name
Sequenz
TA
CMV-Seq-F
GCAGAGCTGGTTTAGTGAACCG
55°C
EGFP-N Seq
CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG
59°C
T7
AATACGACTCACTATAG
pcDNA3.1Flag/BGH_rev
TAGAAGGCACAGTCGAGG
RVprimer3
CTAGCAAAATAGGCTGTCC
54°C
GLprimer2
CTTCCATGGTGGCTTTACC
54°C
8.1.5.4
Small interfering RNA Oligonukleotide
Name
Zielsequenz
siGFP
GCUACCUGUUCCAUGGCCA
siAPC-C
GACGTTGCGAGAAGTTGGA
siβ-Catenin-B
ACTGCTAAATGACGAGGAC
siSGK1#1
CCCGUCGUCCAAUCCUCAUGCUAAA
siSGK1#2
CCUGAGCUUAUGAAUGCCAACCCUU
Alle Oligonukleotide sind in 5´-3´Orientierung angegeben. Die Synthese der Oligonukleotide
erfolgte bei MWG oder bei Operon. Die siRNA-Oligonukleotide wurden von Eurogentec
(siGFP, siAPC-C und siβ-Catenin-B) und von Invitrogen (siSGK1; SGK Validated Stealth™
RNAi DuoPak) erworben.
73
MATERIAL & METHODEN
8.1.6
Organismen
Zelllinie
Ursprung
HEK293T
Embryonale Nierenzellen (Homo sapiens)
HCT116
Kolorektales Karzinom mit stablisierten β-Catenin (Homo sapiens)
SW480
Kolorektales Karzinom mit trunkiertem APC (Homo sapiens)
DLD-1dnTCF4
Kolorektales Karzinom mit trunkiertem APC (Homo sapiens) mit
Doxycyclin-induzierbarer Expression von N-terminal trunkiertem
(dominant negativ)TCF4 (van de Wetering et al., 2002)
DLD1-TR7
Kolorektales Karzinom mit trunkiertem APC (Homo sapiens)
Parentale Kontrollzelllinie von DLD1-dnTCF4
Rat2
(Giarre et al., 1998; Lustig et al., 2002)
Bakterienstämme Genotyp
Escherichia
coli recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1 lac
XL1-blue
8.1.7
Antikörper
Name
Beschreibung
Hersteller
Anti-β-Aktin
monoklonaler Anti-β-Aktin Antikörper aus Maus
Sigma
Anti-β-Catenin
monoklonaler Anti-β-Catenin Antikörper aus
Santa Cruz
(H102)
Kaninchen
C/G7
monoklonaler Anti-Conductin Antikörper aus Maus
Dr. Behrens
Anti-SGK1
polyklonaler Anti-SGK1 Antikörper aus Kaninchen
Biomol
Anti-Flag
monoklonaler Antikörper gegen den Flag-Tag aus
Sigma
Kaninchen
Anti-GFP
monoklonaler Antikörper gegen GFP aus Maus
Roche
Cy2, Cy3 und HRP markierte Sekundärantikörper wurden von Jackson Immuno Research
erworben.
74
MATERIAL & METHODEN
8.1.8
Vektoren
Vektor
Beschreibung
Referenz
8xDBE
acht Bindestellen (DBEs) für FoxO
diese Arbeit
eingeführt in BglII–Schnittstelle
von pTA-luc Reporterkonstrukt zur
Messung der FoxO-abhängigen
Transkription
Asef2-FLAG
Exoressionsplasmid für Asef2 mit
A. Grohmann
Flag-Tag
myc-wt-β-Catenin
myc-gekoppeltes
(Krieghoff et al., 2006)
Expressionplasmid für β-Catenin,
BIM-luc
Luziferasegen unter der Kontrolle
(Motta et al., 2004)
des BIM Pormotors,
freundlicherweise von Dr. R. H.
Medema erhalten
c-fos Promoter
c-fos Promoterfragment
Dr. B. Mayr
(ca. 500 bp) in pGL3basic kloniert
mit den Oligos: Xho_fos+116R
CCGCTCGAGGGAGACAGGTG
GGCGCTGTG und Kpn_fos-385F
GGGGTACCACTGCACCCTCGG
TGTTGGC
Dsh2-CFP
cDNA für humanes, dominat
(Krieghoff et al., 2006)
actives Dsh2, KanR/NeoR
FLAG-Asef2
FLAG-FoxO3a-TM
A.Grohmann
3-fach mutiertes FoxO3a (T32A,
(Brunet et al., 2004)
S253A, S315A) in pECE Vektor,
erworben von addgene (Krieghoff
et al., 2006)Plasmid #8361)
FoxO3a-YFP
Expressionsplasmid von FoxO3a
diese Arbeit
mit YFP-Tag
75
MATERIAL & METHODEN
pGL2-27KIP1
Luziferasegen unter der Kontrolle
(Motta et al., 2004)
des p27KIP1 Pormotors,
freundlicherweise von Rene H.
Medema erhalten
pcDNA3.1(+)
AmpR, G418
Invitrogen
pcDNAflag
Derivat von pcDNA3.1 mit
Dr. Behrens
eingefügtem Flag-Tag
pcDNAflag-SGK1
cDNA für humanes SGK1 in
diese Arbeit
pcDNAflag
pcDNAflag-FoxO4
cDNA für humanes FoxO4 in
diese Arbeit
pcDNAflag
pcDNA-HA-Dvl2
Dishevelled2 in pcDNA-HA
Dr. Behrens
pCG-LEFΔBB
humanes LEF ohne β-Catenin
Dr. Behrens
Bindedomäne, AmpR
pCMV-APC
Expressionsplasmid für APC
(Kinzler et al., 1987)
pCMV-Sport6-SGK1
cDNA von SGK1 im
RZPD; Deutsches
Expressionsvektor pCMV-Sport6
Ressourcenzentrum für
AmpR
Genomforschung; full length
clone IRATp970E014D
pEGFP-N1
KanR, G418
Clontech
pFA2-cJun
Aktivatorplasmid von c-Jun Trans-
Stratagene #219000
Reporting system (Stratagene)
pFC-MEKK
Regulatorplasmid (Positiv-
Stratagene #219000
Kontrolle von c-Jun TransReporting system (Stratagene)
pFR-Luc
Luziferasereporter für c-Jun Trans-
Stratagene #219000
Reporting system (Stratagene)
pGL2-Control
AmpR
Promega
pGL3-Basic
AmpR
Promega
pGL3Ax2luc
Luziferasereporter unter Kontrolle
(Jho et al., 2002)
des Axin2-Promotor
pTA-luc
AmpR
Clontech
pTOPflash
β-Catenin/TCF-abhängiger
(van de Wetering et al.,
76
MATERIAL & METHODEN
pFOPflash
pOTB7-FoxO3a
Luziferasereporter, AmpR
1997)
Kontrollplasmid für pTOPflash,
(van de Wetering et al.,
AmpR
1997)
Komplette cDNA von FoxO3a in
dem Vektor pOTB7, Cap
pRSV-βGal
R
β−Galaktosidase Vektor, AmpR
RZPD full length clone
IRAUp969FO851D
(Stratford-Perricaudet et al.,
1992)
RFP-APC
cDNA für APC, KanR/NeoR
(Krieghoff et al., 2006)
RFP-LRP6da
cDNA für humanes, dominat
(Krieghoff et al., 2006)
actives LRP6, KanR/NeoR
RFP-Wnt3A
murine Wnt3a-cDNA, KanR/NeoR
(Krieghoff et al., 2006)
S45A-YFP (β-
Expressionplasmid für stabilisiertes
(Krieghoff et al., 2006)
Catenin)
β-Catenin durch mutiertes Serin45
mit YFP-Tag
S33A (β-Catenin)
Expressionplasmid für stabilisiertes
(Kuphal and Behrens, 2006)
β-Catenin durch mutiertes Serin33
SGK1fmY
cDNA von SGK1 in mYF-N2
diese Arbeit
SGK1 I (-2886/+48)
Promotorfragment von SGK1,
diese Arbeit
Amp
SGK1 II (-2484/+48)
R
Promotorfragment von SGK1,
diese Arbeit
AmpR
SGK1 III (-1926/+48)
Promotorfragment von SGK1,
diese Arbeit
AmpR
77
MATERIAL & METHODEN
Plasmidkonstruktionen dieser Arbeit
SGK1 I, II, III
Die Klonierung der Promotorfragmente in pGL3basic erfolgte nach dem gleichen Schema
und mit demselben reversen Oligo (SGK_Hu_rev1), das zusammen mit dem jeweiligen
forward Oligo und genomischer DNA von 293T Zellen als Matrize in die PCR-Reaktion
eingesetzt wurde. Die Oligos brachten Schnittstellen für die Restriktionsendonukleasen NheI
und BglII in die PCR-Fragmente ein und nach einem Verdau mit diesen Enzymen, konnten
die Fragmente in den Reportervektor pGL3basic einligiert werden.
SGK1fmY
Für die Klonierung eines Expressionsvektors für SGK1 wurde bei RZPD in Berlin ein Klon
(ID: IRATp970E014D) bestellt, der die komplette cDNA von SGK1 in dem Vektor pCMVSport6 trägt. Nach der DNA-Präparation wurde die erhaltene DNA als Matrize eingesetzt um
den entsprechenden offenen Leserahmen von SGK1 mit den Oligonukleotiden Sgk1_F_Xma
und Sgk1_R_Bam zu amplifizieren. Die Oligos waren so gestaltet, dass die Schnittstellen
XmaI und BamHI an die Enden des Amplikons eingeführt wurden. Das PCR-Produkt, wie
auch der Vektor mYF-N2 wurden mit den Restriktionsendonukleasen XmaI und BamHI
geschnitten und anschließend miteinander ligiert.
pcDNAflag-SGK1
Der Vektor pCMV-Sport6-SGK1 wurde als Matrize gemeinsam mit den Oligonukleotiden
Sgk1_F_Not und Sgk1_R_Not in die PCR für die ungerichtete Klonierung des Vektors
pcDNAflag-SGK1 eingesetzt. Das Reaktionsprodukt sowie der Ausgangsvektor pcDNAflag
wurden mit NotI verdaut, ligiert und anschließend anhand eines Kontrollverdaus der
Minipräparation ein Klon mit richtiger Orientierung des Inserts isoliert.
FoxO3afmY
Die Erstellung des Vektors FoxO3afmY wurde identisch der Klonierung von SGK1fmY
durchgeführt. Der PCR diente als Matrize DNA aus einem weitern Klon (ID:
IRAUp969FO851D), der von RZPD in Berlin gekauft wurde und die cDNA von FoxO3a in
dem Vektor pOTB7 trug. Durch eine PCR mit den Oligonukleotide FoxO3a_F_BspE1
FoxO3a_R_Bam wurde die DNA amplifiziert, die für FoxO3a kodiert. Mit Hilfe der
78
MATERIAL & METHODEN
Restriktionsschnittstellen BspEI und BamHI die durch die Oligos eingeführt wurden, konnte
das Fragment in den mit XmaI und BamHI verdauten Vektor mYF-N2 einligiert werden. Da
das
Insert
(FoxO3a)
zwei
interne
XmaI
Schnittstellen
trägt
wurde
BspEI
als
Restriktionsenzym verwendet, welches eine andere Zielsequenz erfordert aber identische
Schnittstellen wie XmaI erzeugt.
pcDNAflag-FoxO4
Die Matrize für die cDNA von FoxO4 wurde wiederum aus einem Klon von RZPD
(IRAMp995HO213Q) durch DNA Präparation gewonnen und anschließend in die PCR
gemeinsam mit den Oligonukleotiden FoxO4_F_Not und FoxO4_R_Not eingesetzt. Das
PCR-Produkt und der Vektor pcDNAFlag wurden mit NotI verdaut und anschließend
miteinander ligiert. Durch einen anschließenden PCR-Screen (Kolonie-PCR) konnte ein Klon
identifiziert werden der das Insert mit der richtigen Orientierung trägt.
DBE-Reporter Konstrukte
Um Multimere des Bindemotivs (DBE) von FoxO3a und FoxO4 Transkriptionsfaktoren zu
generieren wurden die Oligonukleotide 2xDBE_for und 2xDBE_rev wie in (Furuyama et al.,
2000) beschrieben mit Hilfe der T4-Polynukleotidkinase (PNK) jeweils am 5’-Ende
phosphoryliert und anschließend miteinander hybridisiert. Die Oligonukleotide wurden so
gewählt, dass sie zwei der Bindemotive in sich tragen und nach dem Hybridisieren
überlappende Enden („sticky ends“) bilden, die mit den durch einen BglII Verdau
entstehenden Enden kompatibel sind. Die erhaltenen Fragmente wurden in den mit BglII
verdauten Vektor pTA-luc ligiert. Hier konnte nicht vorhergesehen werden, wie viele
Fragmente sich einlagern würden. Dies lies sich durch eine Kolonie-PCR überprüfen,
wodurch Kandidaten gefunden wurden bei denen das Fragment ein, zwei und vier mal
inseriert war, was zwei, vier, beziehungsweise acht spezifischen Bindestellen (DBEs)
bedeutet. Dementsprechend wurden die Reporterkonstrukte nach der Anzahl der Bindestellen
2xDBE, 4xDBE und 8xDBE genannt.
FLAG-FoxO3a-TM
Die dreufach Mutante von FoxO3a wurde bei addgene (plasmid #8361) gekauft und nach
einer DNA-Präparation verwendet.
79
MATERIAL & METHODEN
8.2
Methoden
Molekularbiologische
Standardmethoden
wie
z. B.
Plasmid-DNA-Präparation,
Spektrometrische Bestimmung der Menge und Reinheit von DNA und RNA, Fällung von
Nucleinsäuren, DNA-Sequenzierung, DNA-Gelelektrophorese, enzymatische Spaltung mit
spezifischen Restriktionsendonukleasen, Phospholyrierung, Dephosphorylierung und Ligation
von DNA, RNA-Isolierung, cDNA-Synthese, Polymerase Kettenreaktion (PCR) und
Transformation von E. coli wurden gemäß dem Handbuch „Molecular Cloning, A Laboratory
Manual“ (Sambrook et al., 2001) durchgeführt. Im Folgenden sind nur Methoden
beschrieben, die im Handbuch anderes oder gar nicht aufgeführt sind. Bei Methoden, für die
Kits verwendet wurden, wurde den Angaben der Hersteller Folge geleistet.
8.2.1
Anzucht von Bakterien
Die Kultivierung von E. coli erfolgte bei 37°C. Ein ständiges Schütteln gewährleistete bei der
Anzucht von Flüssigkulturen eine optimale Belüftung und Durchmischung. Bei Selektion auf
verschiedene Plamide wurde den Medien die entsprechenden Antibiotika (1 µl/ml
Kulturmedium der Stocklösung Ampicilin oder Kanamycin) zugegeben.
8.2.2
Herstellung kompetenter Bakterien
Zur Herstellung kompetenter Bakterien wurde eine Übernachtkultur von E. coli XL-blue in
500 ml LB-Medium angeimpft und bei 37°C bis zu einer optischen Dichte (OD) von 0,4 – 0,5
geschüttelt. Alle folgenden Arbeitsschritte wurden auf Eis oder im Kühlraum unter
Verwendung einer 4°C Zentrifunge durchgeführt. Nach 10 min Abkühlung wurden die
Bakterien bei 5000 rpm für 5 min pelletiert und in 45 ml kaltem CM-Puffer resuspendiert.
Anschließend wurde erneut für 10 min inkubiert, 5 min bei 5000 rpm zentrifugiert und das
Pellet in 17,5 ml CM-Puffer aufgenommen. Es folgte eine Inkubation von 10 min, die Zugabe
von 625 µl DMSO, eine weiter Inkubation von 5 min und erneute Zugabe von 625 µl DMSO.
80
MATERIAL & METHODEN
Nach einer abschließenden Inkubation von 5 min wurden die kompetenten Bakterien
aliquotiert und bis zur Verwendung bei -80°C gelagert.
8.2.3
Transformation von Bakterien
Es wurden 100 – 200 ng Plasmidllösung zu 100 µl kometenter Bakterien pipettiert und für
60 min auf Eis inkubiert. Nach dem anschließenden Hitzschock (90 sek. 42°C) wurde zu dem
Ansatz 900 µl LB-Medium gegeben und dieser für 45 min bei 37°C geschüttelt. Daraufhin
wurde der Ansatz abzentrifugiert, der Überstand abgekippt, die Zellen in dem
zurückgelaufenen Restmedium resuspendiert, auf Selektivmedium ausplattiert und über Nacht
bei 37°C inkubiert.
8.2.4
Plasmidisolierung aus Bakterien
Die Isolierung von Plasmiden erfolgte aus E. coli unter Verwendung der alkalischen Lyse.
1,5 ml einer Übernachtkultur wurden bei 4500 rpm für 2 min bei RT pelletiert und in 100 µl
Puffer I resuspendiert. Anschließend wurden 100 µl von Puffer II zugegeben, mehrmals
invertiert und innerhalb von 5 min 100 µl Puffer III dazu pipettiert. Nach 10 min Inkubation
auf Eis wurden bakterielle Proteine, Zellreste und chromosomale DNA abzentrifugiert
(13.000 rpm, 10 min und RT). Die Plasmid-DNA im Überstand wurde durch Zugabe von 0,8
Volumenprozent Isopropanol gefällt und das erhaltene Pellet danach mit 70 % EtOH
gewaschen, getrocknet und in H2O aufgenommen.
8.2.5
Extraktion von DNA aus TAE-Agarosegelen
Nach elektrophoretischer Auftrennung wurde das betreffende DNA-Fragment unter UV-Licht
aus dem Agarosegel ausgeschnitten, in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß überführt und die DNA mit
Hilfe des NucleoSpin® Extract II Kits (Machery-Nagel) nach Angabe des Herstellers
81
MATERIAL & METHODEN
extrahiert. Zur Überprüfung der Qualität und Quantität der isolierten DNA, wurde ein Aliquot
dieser DNA auf einem Agarosegel aufgetrennt.
8.2.6
DNA-Reinigung und Fällung
Zur Aufreinigung der DNA wurde der „NucleoSpin® Extract II Kit“ verwendet. Die Fällung
der DNA erfolgte mit 1/10 Vol 3 M NaOAc pH 4,8-5,2 und 2,5 Vol 100 % EtOH und wurde
für 20 min bei 13.000 rpm zentrifugiert. Anschließend wurde das erhaltene Pellet mit 70 %
EtOH gewaschen, bei 56°C für10 min getrocknet und in 20-30 µl Wasser aufgenommen.
8.2.7
Bestimmung der DNA- bzw. RNA-Konzentration
Die DNA- bzw. RNA-Lösung wurde 1:100 bzw. 1:50 verdünnt und ihre Absorption zwischen
220 und 320 nm im Photometer bestimmt. Die Konzentration wurde mittels folgender
Beziehung berechnet:
DNA: 1 OD260 entspricht 50 µg DNA/ml
RNA: 1 OD260 entspricht 40 µg RNA/ml
8.2.8
Sequenzierung von DNA-Fragmenten
Die PCR für die Sequenzierung wurde mit ca. 500 ng gereinigte Plasmid-DNA, 5 pmol
Primer, 3 µl Sequenziermix und ad 10 µl H2O durchgeführt. Für die Überprüfung der
Sequenzen
von
DNA-Fragmenten
wurde
die
Kettenabbruch-Methode
in
dem
Kapillarsequenzer „Sequencer ABI Prism™ 377“ mit dem ABI PRISM BigDye® v1.1 Cycle
Sequencing Kit (Applied Biosystems) nach Angaben des Herstellers angewandt. Zur
Auswertung wurde die mitgelieferte Software ABI PRISM 377 Collection and Sequencing
Analysis 3.0 verwendet.
82
MATERIAL & METHODEN
8.2.9
Kultur und Transfektion von Säugerzellen
Alle verwendeten Zelllinien wurden in DMEM Medium (mit L-Glutamin und 4,5 g/l
Glukose) mit 10 % fötalem Kälberserum (FKS) und 1 % Penicillin/ Streptomycin kultiviert.
Die Zellen wuchsen bei 37°C, 90 % Luftfeuchtigkeit und 10 % CO2 und wurden alle 2-3 Tage
unter Verwendung von Trypsin/ EDTA im Verhältnis 1:3 bis 1:20 passagiert.
8.2.10 Zählen von Zellen und Anlegen von Dauerkulturen
Die Zellzahl wurde anhand einer Neubauer Zählkammer bestimmt. Für Dauerkulturen wurden
106 Zellen in 1 ml Kryoröhrchen (Nagene) mit 80 % DMEM, 20 % FKS und 10 %
Dimethylsulfoxid versetzt und über Nacht auf -80°C gekühlt. Die dauerhafte Lagerung
erfolgte anschließend in flüssigem Stickstoff.
8.2.11 Transiente Transfektion
Transfektion von Plasmid-DNA erfolgte gemäß der Anleitung des Herstellers unter der
Verwendung von 5 µl (1 mg/ml) Polyethylenimin (PEI) pro µg DNA über Nacht in
Vollmedium. Für die jeweilige Transfektion wurde ein Mastermix erstellt, der sich pro Well
einer 24 Well-Platte aus 50 µl Serum- und Antibiotika-freiem Medium und der
korrespondierenden Menge PEI zusammensetzt und für 5-10 min inkubiert wurde bevor die
DNA dazu gegeben wurde. Bei Verwendung von Platten mit 6 oder 12 Wells wurden die
Mengen proportional erhöht. Der Transfektionsansatz wurde nochmals für 10 min bei RT
inkubiert und anschließend auf die Zellen in Vollmedium gegeben. Darauf wurden diese für
4 min bei 1000 rpm und RT zentrifugiert. Die Transfektion von siRNA-Oligonukleotiden mit
oder ohne zusätzlicher Plasmid-DNA wurde unter Verwendung von TransIt TKO (Mirus) und
den Angaben des Herstellers durchgeführt. 24 bis 48 Stunden nach der Transfektion wurden
die Zellen geerntet.
83
MATERIAL & METHODEN
8.2.12 Reporterassays
Transfektionen für Reporterassays wurden normalerweise in 24 Well Platten durchgeführt,
dabei wurden folgende DNA-Mengen pro Well eingesetzt: je 20 ng Reporter, 50 ng
Regulator, bei FoxO-Experimenten zusätzlich 10-20 ng FoxO, sowie 50 ng RSVβ-Gal. Durch
Auffüllen mit unspezifischer Plasmid-DNA (pcDNA3.1) wurde die Gesamt-DNA-Menge
konstant gehalten. Bei der Verwendung von siRNA in transienten Transfektionen wurden pro
24 Well 1.5 µl siRNA (20 µM) zu der Plasmid DNA kotransfiziert und die Gesamt siRNA
Menge durch siGFP angeglichen.
Für Luziferase Assays (Luc-Assays) wurden die Zellen transient mit einem Luziferase
Reporter Vektor, mit Effektorplasmiden und zur Normalisierung der Transfektionseffizienz
einem konstitutiv exprimierenden β-Galaktosidase Vektor (RSVβ-Gal) transient transfiziert.
Bei Transfektionen zur Untersuchung von FoxO-Effekten wurde zusätzlich ein FoxOExpressionsvektor kotransfiziert. 24 -48 Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen in
50–75 µl Lysispuffer lysiert und 5 min bei 4°C zentrifugiert. Die Luziferaseaktivität wurde in
einem Luminometer durch automatische Injektion von 50 µl Luziferinpuffer zu den
vorgelegten 15 µl Zelllysat in 50 µl Luziferaseassaypuffer gemessen (Parametereinstellungen
wurden wie folgt gewählt: Injektion mit mittlerer Geschwindigkeit Verzögerung: 3 s,
Messung: 10 s). Die Luziferaseaktivität wurde auf die Transfektionseffizienz korrigiert indem
die erhaltenen Werte durch die β-Galaktosidaseaktivität geteilt wurden. Zur Bestimmung der
β-Galaktosidaseaktivität wurden 5-15 µl des Zelllysates mit 150 µl 1 x ONPG-Assaypuffer
vermischt und die Reaktion solange ablaufen lassen bis die Proben gelb wurden. Die Reaktion
wurde durch Zugabe von 100 µl Na2CO3 gestoppt und die optische Dichte in einem
Mikrotiterplattenleser bei 420 nm gemessen.
8.2.13 SDS-PAGE und Western Blot Analyse
Für das Erstellen von Proteinrohlysaten wurden die Zellen nach der Transfektion für 24h
weiterkultiviert und dann mit 80-100 µl L1 Protein-Lysis-Puffer durch Inkubation für 10 min
auf Eis lysiert. Anschließend wurden die Proben geklärt in dem sie für 10 min und 13000 rpm
bei 4 °C zentrifugiert wurden. Die Proteinmengen wurden durch einen Bradford Test mit BioRad Reagenz grob bestimmt und gleiche Mengen an Protein aufgetragen, mittels SDS-PAGE
84
MATERIAL & METHODEN
(7-10 %ige Polyacrylamidgele) aufgetrennt und auf HybondN Nitrozellulose Membranen bei
330 mA für 60 min transferiert (Burnette, 1981). Nach kurzer Färbung in Ponceau S und
Übertragen des Standards wurde die Membran zuerst für 60 min in Blockierlösung und darauf
über Nacht in Primärantikörperlösung langsam geschwenkt. Primäre sowie Peroxidasegekoppelte, sekundäre Antikörper wurden nach den Vorgaben der Hersteller verwendet. Die
Signale wurden mit Western Lightning Reagenz (Perkin Elmer) visualisiert und mit dem
Luminoimager LAS-3000 (Raytest) und dem Programm Image Reader Las-3000 Version 2.0
detektiert.
8.2.14 RNA-Isolierung
Für die RNA Extraktion wurden Zellen in 6-Well-Schalen kultiviert und nach der für den
experimentellem Ansatz durchgeführten Behandlung mit 750 µl peqGold® (Peqlab) für 5 min
bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Überführung in ein 1,5 ml Reaktionsgefäß und der
Zugabe von 200 µl Chloroform wurden die Ansätze durch Schütteln gemischt und
anschließend für 10 min bei 13000 rpm und 4°C zentrifugiert. Die obere, RNA-haltige Phase
wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt mit 500 µl Isopropanol vermengt, mehrmals
invertiert für 10 min bei Rauftemperatur (RT) inkubiert und danach für 10 min bei 13000 rpm
und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen, das Pellet in 1 ml 75 % Ethanol
gewaschen und für 5 min bei 13000 rpm und 4°C zentrifugiert. Nachdem das Pellet bei RT
getrocknet war wurde es in 20 µl DNase- und RNase-freiem H2O (Gibco) aufgenommen und
die Reinheit und Konzentration der RNA photometrisch bestimmt. RNA-Präparationen
wurden bei -80°C gelagert.
8.2.15 Reverse Transkriptase-PCR (RT-PCR)
Für die Herstellung von cDNA aus mRNA wurde die reverse Transkriptase Reaktion
angewandt, bei der ein cDNA/RNA-Hybrid (first-strand-cDNA) entsteht, welches als
Template in einer klassischen PCR eingesetzt werden kann. Dazu wurden 1,5 µg RNA in 9 µl
H2O (DNase- und RNase-frei) aufgenommen und nach Zugabe von 2 µl Random Hexamer
Primern (1 µg/µl) für 10 min bei 70°C inkubiert und auf Eis abgeschreckt (2 min). Nach der
85
MATERIAL & METHODEN
Zugabe von 4 µl Reaktionspuffer (5x), 2 µl DTT (1 M), 1 µl dNTPs (je 10 mM), 1 µl RNaseOUT und 1 µl SuperScript™ II Reverse Transcriptase (reverse Transkriptase) folgte eine
Inkubation von 60 min bei 42°C. Die Reaktion wurde anschließend für 15 min bei 75°C
(Inaktivierung des Enzyms) gestoppt. Der Ansatz wurde mit 25 µl H2O (DNase- und RNasefrei) aufgefüllt.
Für eine anschließende Kontroll-PCR wurde je 1 µl der synthetisierten cDNA als Matrize
eingesetzt. Durch den Einsatz von spezifischen Primer für ein sog. Haushaltsgen (GAPDH
oder β-Aktin), welche in der Regel in allen Zelltypen exprimiert wird, wurde ein erfolgreicher
Verlauf der Reversen-Transkriptase-Reaktion kontrolliert. Bei dem Design von solchen
Primern wurde darauf geachtet, dass diese, wenn möglich Exon-springend gewählt wurden.
Dadurch konnte eine eventuelle Kontamination durch genomische DNA überprüft werden.
Die PCR-Reaktion wurde stets in Ansätzen mit 20 µl Volumen durchgeführt, die sich wie
folgt zusammensetzte:
1,0 µl
cDNA aus RT-Reaktionsansatz
2,0 µl
Taq-Polymerase-Inkubationspuffer (10x)
0,3 µl
MgCl2 (50 mM)
0,3 µl
dNTPs (10 mM)
0,4 µl
5’-Primer (10 pmol)
0,4 µl
3’-Primer (10 pmol)
1U
Taq-DNA-Polymerase
ad 20 µl H2O
Die Amplifikate wurden auf einem Agarosegel ausgewertet.
8.2.16 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) für Klonierungen
Bei PCRs für Klonierungen wurden Proof-Reading-Polymerasen (Pfx oder Phusion)
verwendet. Die Amplifikation mit den jeweiligen Oligonukleotiden und Plasmid-DNA oder
cDNA als Matrize erfolgte nach Anleitung der Hersteller.
86
MATERIAL & METHODEN
8.2.17 Kolonie-PCR
Bei Klonierungen wurden zum Teil auch erhaltene Liganten mittels Kolonie-PCR auf
Einlagerung und Orientierung des Inserts überprüft. Dazu wurde der im Anschluss
beschriebene Mastermix in ein Reaktionsgefäß vorgelegt und anschließend mit einer sterilen
Spitze eine Kolonie von der Ligationsplatte gepickt und zuerst in dem Mix mehrmals hin- und
hergedreht und anschließend mit derselben Spitze eine Übernachtkultur angeimpft. Für die
PCR-Reaktion wurden spezifische Oligonukleotide eingesetzt, durch die anhand der
resultierenden Amplifikate ausgewertet werden konnte, ob das Insert eingelagert ist, und
gegebenenfalls in welcher Orientierung dies geschehen ist. Dafür wurden zusätzlich
entsprechende Kontrollen mitgeführt, so dass durch unterschiedliches Laufverhalten der
Amplifikate im Agarosegel die positiven Kandidaten identifiziert werden konnten. Am
nächsten Tag wurden die entsprechenden Übernachtkulturen präpariert und durch
Sequenzanalyse nochmals überprüft. Für die Amplifikation wurde Taq-Polymerase
(Invitrogen GmbH, Karlsruhe) eingesetzt und den Angaben des Herstellers folge geleistet.
Die PCR-Reaktion wurde stets in Ansätzen mit 20 µl Volumen durchgeführt, die sich wie
folgt zusammensetzte:
2,0 µl
Taq-Polymerase-Inkubationspuffer (10x)
0,6 µl
MgCl2 (50 mM)
0,4 µl
dNTPs (10 mM)
0,2 µl
5’-Primer (10 pmol)
0,2 µl
3’-Primer (10 pmol)
0,2 U
Taq-DNA-Polymerase
ad 20 µl H2O
8.2.18 DNA-Microarrays und Analyse der Expression von Genen
Die gesamte RNA von Zellen wurde durch den Einsatz von TRIzol Reagenz präpariert, mit
DNaseI verdaut und mittels RNeasy aufgereinigt, hierbei wurde den Angaben der Hersteller
Folge geleistet. Microarrayanalyse der Zelllinien DLD1-TR7 und DLD1-dnTCF4 wurden mit
87
MATERIAL & METHODEN
dem GeneChip HG-U133, die Analyse von HCT116 Zellen mit dem GeneChip HG-U133
Plus 2.0 von Affymetrix durchgeführt. Die erhaltenen Daten wurden mit den
Softwareprogrammen Microarray Suite 5.0 (Affymetrix; statistischer Algorithmus), Data
Mining Tool 3.0 (Affymetrix) und MS Excel und Access bearbeitet. Als unterschiedlich
regulierte Gene wurden solche gewertet wenn die folgenden Kriterien erfüllt waren: (i) unter
wenigstens einer Bedingung hatte das Transkript einen `present call`, was der Affymetrix
Analyse folgend bedeutet das Gen ist mindestens in einer der Proben exprimiert; (ii) das Gen
war mindestens um das 2-fache erhöht (I, increased) oder erniedrigt (D; decreased) gemessen
an dem `difference call` der Affymetrix Software; (iii) der `change p-value` war ≤ 0,05
(difference call reliability); (iv) die Affymetrix-Signalintensität (`signal intensity`) war in
mindestens einer Probe höher als 100.
8.2.19 Quantitative Echtzeit-PCR (real time RT-PCR)
Von der umgeschriebene cDNA wurde je 1-3 µl bei der quantitativen Echtzeit-PCR als
Matrize eingesetzt. Diese wurde zu dem vorgelegten Gemisch aus 12,5 µl „Absolute SYBRGreen Fluorescin“ und den entsprechenden Oligonukleotiden (0,25 µM) gegeben und das
Gesamtvolumen auf 25 µl eingestellt. Der PCR-Lauf wurde im iCycler™ iQ (Bio-Rad) über
50 Zyklen und folgendem PCR-Programm durchgeführt:
Hot-Start (Aktivierung der Taq-Polymerase):
12 min, 95°C
Denaturierung:
15 sec, 95°C
Hybridisierung:
20°sec, 57°C
Elongation:
45 sec, 72°C
Denaturierung:
1 min, 95°C
Schmelzkurve:
30 sec, 55°C
50x
8 sek, 55°Χ
8 sek ΔT + 0,5°C (80 Cyklen)
End:
∞, 4°C
88
MATERIAL & METHODEN
Die generierten Daten wurden mit Hilfe der iCycler™ iQ Optical System Software Version
3.0 a von Bio-Rad ausgewertet.
8.2.20 Immunfluoreszenzfärbung von Zellen
Ca. 1 x 105 293T Zellen wurden auf Deckgläschen in 6-Well Platen ausgesät und am
folgenden Tag transfiziert. 24h nach der Transfektion wurden die Zellen mit PBS gewaschen,
für 15 min mit 3 %igem PFA fixiert und durch Inkubation für 5 min in 0,5 %igem Triton
X-100 permeabilisiert. Vor dem nächsten Schritt und allen folgenden wurden die Zellen mit
1 x PBS gewaschen. Zum Blockieren unspezifischer Bindungen wurden die Ansätze dann für
mindestens 30 min mit 10 % FKS-haltigem DMEM inkubiert und anschließend 50 µl
primärer Antikörper vorsichtig auf die Zellen pipettiert. Nach einstündiger Inkubation be RT
wurde 45 min mit 50 µl Cy2- bzw. Cy3 gekoppelten sekundären Antikörper (1:200 verdünnt
mit DMEM/ 10 % FKS) inkubiert. Anschließend wurden 4 µl Hoechst zum Färben der DNA
auf die Deckgläschen gegeben. Nachdem 15 µl Moviol auf einen Objektträger pipettiert
worden waren, wurden die Deckgläschen mit den Zelllen nach unten darauf gelegt. Die
Mikroskopische Betrachtung erfolgte mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskops unter
entsprechendem Anregungslicht.
Bei Transfektionen in denen mit GFP- (green flourescence protein) oder RFP- (red
flourescence protein) gekoppelten Proteinen gearbeitet wurde, ist keine Antikörperfärbung
durchgeführt worden.
8.2.21 Apoptose Messung, TUNEL
Für den Nachweis von apoptotischen Zellen wurde die TUNEL-Technik (TdT-mediated
dUTP-biotin nick end labeling; TdT: terminal deoxynucleotidyl transferase) angewandt.
Während der Apoptose, einer Form des „programmierten Zelltodes“, wird der DNA-Strang
durch die Aktivität von Endonukleasen fragmentiert. Die an den Bruchenden freiwerdenden
3'-OH-Gruppen werden durch das Enzym TdT mit markierten Nukleotiden versehen, welche
z. B aufgrund von Fluoreszenz mit entsprechenden Mikroskopen sichtbar gemacht werden
können, oder im Durchflusszytometer vermessen werden können. HCT116 Zellen wurden in
89
MATERIAL & METHODEN
6-Well Platten transfiziert und nach 24 h wurde der TUNEL Assay mit Hilfe des APOBrdU™ TUNEL Assay Kit (A23210) nach den Vorgaben des Herstellers (Invitrogen)
durchgeführt. Die Detektion der gefärbten Zellen erfolgte am Durchflusscytometer FACScan
(BD Bioscience).
90
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
9
9.1
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungen
A
Abb.
Ampr
Amp
APS
AS
ATP
3-AT
bp
BSA
Cam
C. elegans
C.
cDNA
CMV
COOH-Terminus
Da
DMEM
DMSO
DNA
dNTPs
DTT
E. coli
ECL
EDTA
EGTA
ELISA
EGFP
EtBr
FKS
g
GAPDH
GDP
GEF
GST
GTP
H. sapiens
H. simplex
Deoxyadenosin-5'-phosphat
Abbildung
Ampicillin-Resistenzgen (β-Lactamase)
Ampicillin
Ammoniumpersulfat
Aminosäure
Adenosintriphosphat
3-Amino-1,2,4-triazol
Basenpaare
bovines Serumalbumin
Chloramphenicol
Caenorhabditis elegans
familiaris Canis familiaris
komplementäre DNA
Cytomegalievirus
Carboxyterminus eines Proteins
Dalton, Einheit der relativen Molmasse
Dulbecco's Modified Eagle Medium
Dimethylsulfoxid
Deoxyribonucleinsäure
Deoxynucleotide
Dithiothreitol
Escherichia coli
enhanced chemiluminescence
Ethylendiamintetraessigsäure
Ethylenglycoltetraessigsäure
enzyme-linked immunosorbent assay
enhanced green fluorescent protein
Ethidiumbromid
fötales Kälberserum
Gravitationskonstante
Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase
Guanosindiphosphat
Guaninnukleotidaustauschfaktor (guanine nucleotide
factor)
Glutathion S-Transferase
Guanosintripohsphat
Homo sapiens
Herpes simplex
exchange
91
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
IF
IL-6
IP
Kan
Kanr/Neor
kb
LB
LiCl
mRNA
M. musculus
NH2-Terminus
OD
ONPG
p. a.
PAA
PAGE
PBS
PCR
PFA
pH
PMSF
RNA
RNAi
RNAse
rpm
SDS
siRNA
T
Ta
Taq
TEMED
Tris
TRITC
U
UV-Licht
vgl.
(v/v)
VP16
WB
(w/v)
x nach Zahlen:
Immunfluoreszenz
Interleukin 6
Immunpräzipitation
Kanamycin
Kanamycin/Neomycin-Resistenzgen
Kilobasen
Luria-Broth
Lithiumchlorid
messenger Ribonucleinsäure
Mus musculus
Aminoterminus eines Proteins
optische Dichte
o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid
pro analysi
Polyacrylamid
Polyacrylamidgelelektrophorese
Posphat-gepufferte Salzlösung (phosphate buffered saline)
Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction)
Paraformaldehyd
negativer Logarhitmus der Wasserstoffionenkonzentration [H+]
Phenylmethylsulphonylfluorid
Ribonucleinsäure (ribonucleic acid)
RNA-Interferenz
Ribonuclease
rotations per minute
Natrium-Dodecylsulfat
short interfering RNA
Deoxythymidin-5'-monophosphat
Hybridisierungstemperatur (annealing temperature)
Thermus aquaticus
N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
Tetramethylrhodamin-B-isothiocyanat
Uracil
ultraviolettes Licht
vergleiche
Volumen/Volumen
virales Protein 16 aus H. simplex
Western Blot
Gewicht/Volumen
-fach
92
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
9.2
Aminosäuren
A
C
D
E
F
G
H
I
K
L
M
N
P
Q
R
S
T
V
W
Y
Ala
Cys
Asp
Glu
Phe
Gly
His
Ile
Lys
Leu
Met
Asn
Pro
Gln
Arg
Ser
Thr
Val
Ttp
Tyr
9.3
Dimensionen
k
m
μ
n
p
Alanin
Cystein
Asparaginsäure
Glutaminsäure
Phenylalanin
Glycin
Histidin
Isoleucin
Lysin
Leucin
Methionin
Asparagin
Prolin
Glutamin
Arginin
Serin
Threonin
Valin
Tryptophan
Tyrosin
Kilo (103)
Milli (10-3)
Mikro (10-6)
Nano (10-9)
Piko (10-12)
93
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
9.4
A
°C
Da
g
h
l
m
M
min
sec
Einheiten
Ampère
Grad Celsius
Dalton
Gramm
Stunde
Liter
Meter
mol/l; molar
Minute
Sekunde
94
ANHANG
10 Anhang
10.1
Ergebnisse der DNA-Microarray Analyse im HCT116 (RNAi)System
HCT116 (RNAi): FC: fold change, A vs G: siAPC vs siGFP, Expressionswert vom siAPCChip geteilt durch den entsprechenden Wert (gleiche Probe Set ID) des Kontroll-Chips
(siGFP), A+B vs G: Wert des Chips mit siAPC und siβ-Catenin geteilt durch den Wert vom
Kontroll-Chip; Probe Set ID: Affymetrix Gene ID (www.affymetrix.com).
Gen Symbol
Gen Titel
FC
A vs G
FC
A+B vs G
Probe Set ID
AXIN2
axin 2 (conductin, axil)
8,11
3,42
224176_s_at
KIAA0241
KIAA0241 protein
4,82
5,22
1563452_at
RAB6A
RAB6A
4,47
4,13
201045_s_at
NFKBIB
nuclear factor of kappa light polypeptide gene
3,66
4,30
214062_x_at
SGK
serum/glucocorticoid regulated kinase
3,32
2,41
201739_at
LOC91752
similar to C630007C17Rik protein
2,89
1,84
215767_at
AXIN2
axin 2 (conductin, axil)
2,85
1,64
222696_at
RNASEH1
ribonuclease H1
2,64
1,66
241343_at
FLJ12687
hypothetical protein FLJ12687
2,41
1,31
205238_at
SSR3
signal sequence receptor, gamma
2,20
1,28
217790_s_at
MGC52057
hypothetical protein MGC52057
2,11
2,10
227764_at
TRIP
TRAF interacting protein
2,07
1,15
205598_at
HOOK3
hook homolog 3 (Drosophila)
9,45
23,59
1558315_s_at
PRKAA2
protein kinase, AMP-activated
3,39
3,52
240349_at
COPEB
core promoter elementbinding protein
2,66
2,75
208960_s_at
ADAM19
a disintegrin and metalloproteinase
2,39
2,33
209765_at
NTSR1
neurotensin receptor 1
2,38
2,31
207360_s_at
COPEB
core promoter elementbinding protein
2,31
2,31
208961_s_at
KRT6A
keratin 6A /// keratin 6A
2,17
1,67
209125_at
MAP4
microtubule-associated protein 4
2,01
2,20
33850_at
BMP4
bone morphogenetic protein 4
2,01
1,78
211518_s_at
95
ANHANG
10.2
Ergebnisse der DNA-Microarray Analyse im DLD1-dnTCF4
(-/+dox)-System
DLD1dnTCF(-/+dox) Genregulation > 4-fach: FC: fold change, Expressionswert von nicht
induzierten Zellen (-dox) wurde geteilt durch den entsprechenden Wert (gleiche Probe Set ID)
von induzierten Zellen (+dox); Probe Set ID: Affymetrix Gene ID (www.affymetrix.com).
Gen Symbol
Gen Titel
FC
Probe Set ID
GPR49
G protein-coupled receptor 49
10,7
213880_at
ELK3
ELK3, ETS-domain protein
9,4
221773_at
PTGS2
prostaglandin-endoperoxide synthase 2
8,2
204748_at
KIT
v-kit Hardy-Zuckerman 4 feline
7,9
205051_s_at
CYP1B1
cytochrome P450, family 1, subfamily B
7,7
202437_s_at
ID2
inhibitor of DNA binding 2
6,7
201566_x_at
ANXA1
annexin A1
6,6
201012_at
OAS1
2',5'-oligoadenylate synthetase 1
6,4
205552_s_at
CD24
CD24 antigen
6,4
209772_s_at
TBX3
T-box 3
6,3
219682_s_at
NEDD9
neural precursor cell expressed, developmentally down-regulated 9
6,2
202149_at
IGSF4
immunoglobulin superfamily, member 4
5,9
209031_at
BAG2
BCL2-associated athanogene 2
5,9
209406_at
RORA
RAR-related orphan receptor A
5,9
210426_x_at
SGK
serum/glucocorticoid regulated kinase
5,8
201739_at
RORA
RAR-related orphan receptor A
5,7
210479_s_at
DOCK4
DOCK4
5,7
205003_at
CPO
coproporphyrinogen oxidase
5,6
204172_at
LEF1
lymphoid enhancer-binding factor 1
5,5
221558_s_at
DUSP6
dual specificity phosphatase 6
5,4
208893_s_at
LOC58486
transposon-derived Buster1 transposase-like protein
5,4
218263_s_at
KIAA1199
KIAA1199 protein
5,2
212942_s_at
SPUVE
protease, serine, 23
5,2
202458_at
MARCKS
myristoylated alanine-rich protein kinase C substrate
5,2
201669_s_at
FLJ20315
hypothetical protein FLJ20315
5,2
218704_at
MAP4K5
mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase 5
5,2
211081_s_at
CD24
CD24 antigen
5,2
208650_s_at
KITLG
KIT ligand
5,0
207029_at
OAZIN
ornithine decarboxylase antizyme inhibitor
5,0
201772_at
96
ANHANG
PHLDA1
pleckstrin homology-like domain, family A, member 1
5,0
217999_s_at
RAB27B
RAB27B, member RAS oncogene family
5,0
207017_at
TGFB2
transforming growth factor, beta 2
4,9
209909_s_at
LAMB1
laminin, beta 1
4,9
201505_at
AMACR
alpha-methylacyl-CoA racemase
4,8
209424_s_at
ID2
inhibitor of DNA binding 2
4,8
201565_s_at
CYP1B1
cytochrome P450, family 1, subfamily B, polypeptide 1
4,7
202436_s_at
FLJ11155
hypothetical protein FLJ11155
4,6
219750_at
CXCL5
chemokine (C-X-C motif) ligand 5
4,6
215101_s_at
GLRX
glutaredoxin (thioltransferase)
4,6
209276_s_at
NR2F2
nuclear receptor subfamily 2, group F, member 2
4,5
215073_s_at
PHLDA1
pleckstrin homology-like domain, family A, member 1
4,5
217996_at
AREG
amphiregulin
4,5
205239_at
TGIF
TGFB-induced factor (TALE family homeobox)
4,4
203313_s_at
TM4SF3
transmembrane 4 superfamily member 3
4,3
203824_at
CAD
carbamoyl-phosphate synthetase 2
4,3
202715_at
LAMB1
laminin, beta 1
4,3
211651_s_at
SLC35D1
solute carrier family 35
4,2
209712_at
GNAI1
guanine nucleotide binding protein (G protein)
4,2
209576_at
DUSP6
dual specificity phosphatase 6
4,2
208892_s_at
HMGA2
high mobility group AT-hook 2
4,1
208025_s_at
CXCL5
chemokine (C-X-C motif) ligand 5
4,1
207852_at
ABCC4
ATP-binding cassette, sub-family C (CFTR/MRP), member 4
4,1
203196_at
BUP
BUP protein
4,1
218048_at
SLC12A2
solute carrier family 12, member 2
4,1
204404_at
ANGPT1
angiopoietin 1
4,0
205608_s_at
97
ANHANG
DLD1dnTCF(-/+dox) Genregulation < 4-fach: FC: fold change, Expressionswert von nicht
induzierten Zellen (-dox) wurde geteilt durch den entsprechenden Wert (gleiche Probe Set ID)
von induzierten Zellen (+dox); Probe Set ID: Affymetrix Gene ID (www.affymetrix.com).
Gen Symbol
Gen Titel
FC
Probe Set ID
RRAD
Ras-related associated with diabetes
-86,8
204802_at
MUC5AC
mucin 5, subtypes A and C
-85,6
214303_x_at
GREB1
GREB1 protein
-68,1
205862_at
NK4
natural killer cell transcript 4
-48,8
203828_s_at
FLJ10261
hypothetical protein FLJ10261
-44,6
218804_at
RRAD
Ras-related associated with diabetes
-40,5
204803_s_at
H11
protein kinase H11
-38,1
221667_s_at
C3
complement component 3
-38,1
217767_at
DEPP
decidual protein induced by progesterone
-36,8
209183_s_at
SAA2
serum amyloid A2
-36,3
214456_x_at
SERPINE1
serine (or cysteine) proteinase inhibitor
-35,8
202628_s_at
AQP3
aquaporin 3
-32,2
39248_at
MUC1
mucin 1, transmembrane
-32,2
213693_s_at
EDN2
endothelin 2
-32,0
206758_at
BF
B-factor, properdin
-30,3
202357_s_at
MAOA
monoamine oxidase A
-27,9
204388_s_at
CLIC3
chloride intracellular channel 3
-26,0
219529_at
AQP3
aquaporin 3
-25,1
39249_at
TCEA2
transcription elongation factor A (SII), 2
-24,6
203919_at
S100A3
S100 calcium binding protein A3
-22,8
206027_at
HSPG2
heparan sulfate proteoglycan 2 (perlecan)
-22,8
201655_s_at
S100A9
S100 calcium binding protein A9 (calgranulin B)
-19,3
203535_at
TPSB2
tryptase beta 2
-18,5
207134_x_at
SAA2
serum amyloid A2
-17,9
208607_s_at
PRKCD
protein kinase C, delta
-17,8
202545_at
KRT14
keratin 14 (epidermolysis bullosa simplex)
-17,3
209351_at
LSS
lanosterol synthase (2,3-oxidosqualene-lanosterol cyclase)
-16,7
211018_at
LGALS1
lectin, galactoside-binding, soluble, 1 (galectin 1)
-16,3
201105_at
TPSB2
tryptase beta 2
-16,2
215382_x_at
AMY1A
amylase, alpha 1A; salivary
-15,8
208498_s_at
LPAAT-delta
lysophosphatidic acid acyltransferase-delta
-15,5
219693_at
UPK3B
uroplakin 3B
-15,5
206658_at
PP1665
hypothetical protein PP1665
-15,3
213343_s_at
98
ANHANG
TCF7L2
transcription factor 7-like 2 (T-cell specific, HMG-box)
-15,2
212759_s_at
C14orf78
chromosome 14 open reading frame 78
-14,9
212992_at
SLC9A1
solute carrier family 9 (sodium/hydrogen exchanger), isoform)
-14,9
209453_at
PAEP
progestagen-associated endometrial protein
-14,7
206859_s_at
TFEB
transcription factor EB
-14,6
50221_at
FOSB
FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog B
-14,5
202768_at
DIO3
deiodinase, iodothyronine, type III
-13,5
207154_at
FLJ12921
hypothetical protein FLJ12921
-12,6
219804_at
PRSS1
protease, serine, 1 (trypsin 1)
-12,3
205869_at
SLC2A6
solute carrier family 2, member 6
-12,1
220091_at
AFAP
actin filament associated protein
-11,9
203563_at
C20orf12
chromosome 20 open reading frame 12
-11,7
219951_s_at
CACNA1G
calcium channel, voltage-dependent, alpha 1G subunit
-11,3
210380_s_at
P2RY5
purinergic receptor P2Y, G-protein coupled, 5
-10,6
218589_at
NFKB2
nuclear factor of kappa light polypeptide gene
-10,6
209636_at
FLJ13055
hypothetical protein FLJ13055
-10,4
64899_at
CELSR3
cadherin, EGF LAG seven-pass G-type receptor 3
-10,4
205165_at
ANGPTL4
angiopoietin-like 4
-10,1
221009_s_at
ISG20
interferon stimulated gene 20kDa
-9,7
204698_at
HBS1L
HBS1-like (S. cerevisiae)
-9,5
209315_at
AQP3
aquaporin 3
-9,4
203747_at
HKR3
GLI-Kruppel family member HKR3
-9,3
205025_at
P164RHOGEF Rho-specific guanine-nucleotide exchange factor 164 kDa
-9,3
203756_at
CDKN1A
cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (p21, Cip1)
-8,8
202284_s_at
MAOA
monoamine oxidase A
-8,5
212741_at
MUC5AC
mucin 5, subtypes A and C, tracheobronchial/gastric
-8,4
214385_s_at
SYNGR3
synaptogyrin 3
-8,4
205691_at
ANXA8
annexin A8
-8,4
203074_at
ICAM1
intercellular adhesion molecule 1 (CD54)
-8,3
202638_s_at
SERPINE1
serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade E
-8,1
202627_s_at
FLJ12178
hypothetical protein FLJ12178
-8,1
220586_at
D2S448
Melanoma associated gene
-7,7
212013_at
PTGS1
prostaglandin-endoperoxide synthase 1
-7,7
205127_at
POLR2J2
DNA directed RNA polymerase II polypeptide J-related gene
-7,4
212706_at
C6orf29
chromosome 6 open reading frame 29
-7,4
205597_at
ASMTL
acetylserotonin O-methyltransferase-like
-7,3
209394_at
TGM2
transglutaminase 2
-7,3
201042_at
ISGF3G
interferon-stimulated transcription factor 3, gamma 48kDa
-6,8
203882_at
APOL3
apolipoprotein L, 3
-6,6
221087_s_at
IFIT1
interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1
-6,6
203153_at
FLJ22059
hypothetical protein FLJ22059
-6,6
218762_at
PRODH
proline dehydrogenase (oxidase) 1
-6,6
214203_s_at
KIAA0157
KIAA0157 protein
-6,6
212837_at
LTB
lymphotoxin beta (TNF superfamily, member 3)
-6,4
207339_s_at
99
ANHANG
ASMTL
acetylserotonin O-methyltransferase-like
-6,3
36554_at
EMP3
epithelial membrane protein 3
-6,3
203729_at
CSF1
colony stimulating factor 1 (macrophage)
-6,2
209716_at
PPL
periplakin
-6,2
203407_at
TPSB2
tryptase beta 2
-6,1
216474_x_at
PER1
period homolog 1 (Drosophila)
-5,9
202861_at
VEGF
vascular endothelial growth factor
-5,8
212171_x_at
ISG20
interferon stimulated gene 20kDa
-5,6
33304_at
TRIM29
tripartite motif-containing 29
-5,6
202504_at
ABCC3
ATP-binding cassette, sub-family C (CFTR/MRP), member 3
-5,6
208161_s_at
SLC22A1L
solute carrier family 22 (organic cation transporter), member 1-like
-5,5
204981_at
ABCG1
ATP-binding cassette, sub-family G (WHITE), member 1
-5,5
204567_s_at
COL6A3
collagen, type VI, alpha 3
-5,5
201438_at
MB
myoglobin
-5,5
204179_at
D2S448
Melanoma associated gene
-5,4
212012_at
DEFB1
defensin, beta 1
-5,4
210397_at
MAOA
monoamine oxidase A
-5,4
204389_at
MUC1
mucin 1, transmembrane
-5,3
207847_s_at
MUC4
mucin 4, tracheobronchial
-5,3
217109_at
TENC1
tensin like C1 domain-containing phosphatase
-5,3
212494_at
TMP21
transmembrane trafficking protein
-5,2
212352_s_at
FLJ22671
hypothetical protein FLJ22671
-5,2
220149_at
HMOX1
heme oxygenase (decycling) 1
-5,2
203665_at
TCF7L2
transcription factor 7-like 2 (T-cell specific, HMG-box)
-5,1
212762_s_at
MCAM
melanoma cell adhesion molecule
-5,1
210869_s_at
CTSL
cathepsin L
-5,1
202087_s_at
ELF3
E74-like factor 3 (ets domain transcription factor, epithelial-specific )
-5,0
210827_s_at
TPSB2
tryptase beta 2
-5,0
205683_x_at
ADCY9
adenylate cyclase 9
-5,0
204497_at
JUNB
jun B proto-oncogene
-5,0
201473_at
ALDH3B1
aldehyde dehydrogenase 3 family, member B1
-4,9
205640_at
NF1
neurofibromin 1
-4,9
216115_at
KIAA0982
KIAA0982 protein
-4,8
211383_s_at
KIAA1609
KIAA1609 protein
-4,8
65438_at
ALDH8A1
aldehyde dehydrogenase 8 family, member A1
-4,8
220148_at
S100A4
S100 calcium binding protein A4
-4,8
203186_s_at
KIAA1164
hypothetical protein KIAA1164
-4,7
222111_at
ICAM4
intercellular adhesion molecule 4, Landsteiner-Wiener blood group
-4,7
207194_s_at
ELF3
E74-like factor 3 (ets domain transcription factor, epithelial-specific )
-4,7
201510_at
DMC1
DMC1 dosage suppressor of mck1 homolog
-4,7
208382_s_at
PRKCZ
protein kinase C, zeta
-4,7
202178_at
HCF-2
host cell factor 2
-4,6
219484_at
TSGA10
testis specific, 10
-4,6
220623_s_at
NME7
non-metastatic cells 7, protein expressed in
-4,6
219553_at
100
ANHANG
KCNAB2
potassium voltage-gated channel
-4,5
203402_at
KIAA1609
KIAA1609 protein
-4,5
221843_s_at
PTK6
PTK6 protein tyrosine kinase 6
-4,5
206482_at
VEGF
vascular endothelial growth factor
-4,4
210512_s_at
TJP3
tight junction protein 3 (zona occludens 3)
-4,4
213412_at
TNNT1
troponin T1, skeletal, slow
-4,4
213201_s_at
SQSTM1
sequestosome 1
-4,4
213112_s_at
TNF
tumor necrosis factor (TNF superfamily, member 2)
-4,4
207113_s_at
MAP2K5
mitogen-activated protein kinase kinase 5
-4,3
211371_at
EPS8L1
EPS8-like 1
-4,3
221665_s_at
ZNF297B
zinc finger protein 297B
-4,3
204182_s_at
SSH-3
slingshot 3
-4,3
219919_s_at
KRT7
keratin 7
-4,3
209016_s_at
PP1057
hypothetical protein PP1057
-4,2
220968_s_at
AIM1L
absent in melanoma 1-like
-4,2
220289_s_at
MKNK2
MAP kinase-interacting serine/threonine kinase 2
-4,2
218205_s_at
BDKRB2
bradykinin receptor B2
-4,2
205870_at
FLJ10490
hypothetical protein FLJ10490
-4,2
219760_at
SLC22A1LS
solute carrier family 22 (organic cation transporter)
-4,2
206097_at
COL6A2
collagen, type VI, alpha 2
-4,2
209156_s_at
ARP5
angiopoietin-related protein 5
-4,1
53720_at
FAXDC1
fatty acid hydroxylase domain containing 1
-4,1
219429_at
FLJ23451
hypothetical protein FLJ23451
-4,1
219617_at
HPCAL1
hippocalcin-like 1
-4,1
212552_at
IL1RN
interleukin 1 receptor antagonist
-4,1
212657_s_at
BDKRB1
bradykinin receptor B1
-4,1
207510_at
RTP801
HIF-1 responsive RTP801
-4,1
202887_s_at
VEGF
vascular endothelial growth factor
-4,0
211527_x_at
APOL1
apolipoprotein L, 1
-4,0
209546_s_at
KIAA0876
KIAA0876 protein
-4,0
212492_s_at
SOX30
SRY (sex determining region Y)-box 30
-4,0
207678_s_at
ASS
argininosuccinate synthetase
-4,0
207076_s_at
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111
Lebenslauf
Persönliche Daten:
Name:
Manuel Dehner
Geburtsdatum:
12. Dezember 1976
Geburtsort:
Rothenburg ob der Tauber
Staatsangehörigkeit:
deutsch
Familienstand:
ledig
Schulausbildung:
1983-1987:
Grund- und Volksschule Uffenheim
1987-1997:
Christian-von-Bomhard Gymnasium Uffenheim
Abschluss: Abitur
Hochschulausbildung:
11/1998-03/2003:
Studium der Biologie an der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Hauptfach: Mikrobiologie
Nebenfächer: Virologie, organische Chemie, Botanik
Diplomarbeit am Institut für Mikrobiologie, Biochemie und
Genetik mit dem Thema: „Konstruktion und Charakterisierung von
TetR-Transrepressoren“ (Betreuer. Prof. Dr. W. Hillen)
Abschluss: Diplom-Biologe
Berufstätigkeit:
seit 05/2003:
Beschäftigung am Lehrstuhl für Experimentelle Medizin II
der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
als wissenschaftlicher Mitarbeiter (Doktorand)
112
Vielen Dank an
-Prof. Dr. Jürgen Behrens für die Betreuung dieser Arbeit, die Möglichkeit in seinem Labor
unter sehr guten Bedingungen an einem spannenden Thema arbeiten zu dürfen, sowie seine
Begeisterung für die Wissenschaft und stetige Bereitschaft zu Diskussionen, die mich und
diese Arbeit weit vorangebracht haben.
-PD Dr. Robert Slany für die Übernahme des Zweitgutachtens.
-Prof. Dr. Christian Koch für seine Bemühungen als Zweitprüfer.
-Dr. Ludger Klein-Hitpass und sein Team für die Durchführung der Micro-Arrays, sowie
seine Hilfe bei der Datenanlyse.
-Dr. Bernhard Mayr und Dr. Martin Sachs für Computer-technische Unterstützung, sowie
diverse Plasmide.
-Eva für sehr viele wissenschaftliche und nicht wissenschaftliche Diskussionen, den
gemeinsamen Gängen zur Palmeria und ein sehr angenehmes Nebeneinander an der Bench.
-Martina für sehr viele Tipps und Tricks im Laboralltag, gute Unterhaltungen und ihre
fachkompetenten Sportanalysen, die mir teilweise viel Angst eingejagt haben ;)
„Griechenland wird Europameister!“ – Aussage vor dem Achtelfinale EM 2004.
-Ingrid Wacker und Volker Stemmer für ihre Unterstützung während der ganzen Zeit und ihre
vielen inhaltlichen und technischen Ratschläge beim Verfassen dieser Arbeit, das hat mir sehr
weitergeholfen.
-Michel Hadjihannas, Kristina Tanneberger, Shree Harsha Vijaya, Sandra Mattauch, Astrid
Alzner für ihr wissenschaftliches Feedback und der Hilfe bei so manchen Problemen.
-Gabi Daum, Birgit Saffer, Eugenia Schefler und Martina Brückner für die technische
Assistenz.
-Angela Döbler für ihre Hilfe bei bürokratischen Angelegenheiten und der Organisation von
Dingen, mit denen man sich nicht so auskennt.
-alle ehemaligen Mitarbeiter der Experimentellen Medizin II: Felix Kuphal, Eva Krieghoff,
Dr. Martin Reichel, Annette Grohmann und Katja Bauer.
-meine Eltern und meine Geschwister für ihre fortwährende bedingungslose und nicht
selbstverständliche Unterstützung in jedweder Hinsicht.
Corinna. Für alles was du mir gibst!
113