EP 0967274 B1 - European Patent Office

Europäisches Patentamt
(19)
European Patent Office
*EP000967274B1*
Office européen des brevets
(11)
EP 0 967 274 B1
EUROPÄISCHE PATENTSCHRIFT
(12)
(45) Veröffentlichungstag und Bekanntmachung des
Hinweises auf die Patenterteilung:
04.02.2004 Patentblatt 2004/06
(51) Int Cl.7:
C12N 15/10
(21) Anmeldenummer: 99250187.4
(22) Anmeldetag: 14.06.1999
(54) Verfahren zur Herstellung von hantelförmigen DNA-Molekülen als Expressionskonstrukte
Method for producing dumbbell- shaped DNA molecules as expression constructs
Procédé de production des molécules d’ADN en forme d’haltère et leur utilisation comme vecteurs
d’expression
(84) Benannte Vertragsstaaten:
AT BE CH DE ES FR GB IT LI NL SE
Benannte Erstreckungsstaaten:
LT LV
(30) Priorität: 15.06.1998 DE 19826758
(43) Veröffentlichungstag der Anmeldung:
29.12.1999 Patentblatt 1999/52
• Junghans, Claas
14195 Berlin (DE)
• Schroff, Matthias
14195 Berlin (DE)
(74) Vertreter: Omsels, Hermann-Josef
HERTIN
Anwaltssozietät
Kurfürstendamm 54/55
10707 Berlin (DE)
(73) Patentinhaber: Mologen Forschungs-,
Entwicklungs- und Vertriebs GmbH
14195 Berlin (DE)
(56) Entgegenhaltungen:
EP-A- 0 430 270
WO-A-93/13216
WO-A-92/13963
WO-A-98/21322
(72) Erfinder:
EP 0 967 274 B1
• Wittig, Burghardt
14195 Berlin (DE)
Anmerkung: Innerhalb von neun Monaten nach der Bekanntmachung des Hinweises auf die Erteilung des europäischen
Patents kann jedermann beim Europäischen Patentamt gegen das erteilte europäische Patent Einspruch einlegen.
Der Einspruch ist schriftlich einzureichen und zu begründen. Er gilt erst als eingelegt, wenn die Einspruchsgebühr
entrichtet worden ist. (Art. 99(1) Europäisches Patentübereinkommen).
Printed by Jouve, 75001 PARIS (FR)
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Beschreibung
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[0001] Gentherapie und genetische Vakzinierung sind moderne Methoden der molekularen Medizin, deren Anwendung in der Therapie und Prävention von Erkrankungen erhebliche Konsequenzen für die medizinische Praxis haben
wird. Beide Methoden beruhen grundsätzlich auf der Einbringung von Nukleinsäuren in Zellen oder Gewebe des Patienten, sowie der anschließenden Verarbeitung der auf den eingebrachten Nukleinsäuren beinhalteten Information
("Expression"). Allerdings bedürfen auf Expressionssystemen beruhende medizinische Methoden vor ihrer breiten Anwendung noch der Lösung einiger grundsätzlicher Probleme.
[0002] Eines dieser Probleme ist der sichere, zell- oder gewebespezifische und effiziente Transfer der Nukleinsäuren
ins Zielgewebe; ein anderes betrifft die möglichen Wirkungen von Sequenzen, die herstellungs- oder konstruktionsbedingt als Teil der verabreichten Expressionskonstrukte, aber nicht als Teil der gewünschten zu exprimierenden Information an den Wirkort gelangen. Mögliche Lösungen für diese Probleme wurden in unserer Anmeldung "Designprinzip für die Konstruktion von Expressionskonstrukten für die Gentherapie" (Anmeldung WO 98/21322) skizziert.
Zentraler Aspekt der dort erörterten Erfindung ist ein hantelförmiges, linear doppelsträngiges DNA-Molekül als Expressionskonstrukt.
[0003] Es sind mehrere Methoden zur Herstellung solcher Konstrukte bekannt. Entweder geht man dabei von der
Synthese des das Expressionskonstrukt bildenden Doppelstranges durch Amplifikation per Polymerase-Kettenreaktion
aus, wobei die entstehenden doppelsträngigen, nicht kovalent-geschlossenen Moleküle dann durch anschließenden
Verdau der Enden mit einer Einzetstrang-Überhänge bildenden Restriktionsendonuklease und anschließender Ligation
von auf die entstandenen Überhänge passenden Haamadel-Oligomeren zu hantelförmigen Konstrukten modifiziert
werden. Dieses Vorgehen führt zu einem relativ einfach aufzureinigenden Rohprodukt aus hantelförmigen Expressionskonstrukten, dem gewünschten Produkt, sowie Verunreinigungen durch Oligomere aus eingesetztem Primer sowie
ligierten Haamadel-Dimeren. Allerdings bringt die Synthese durch PCR neben dem ökonomisch ungünstigen Einsatz
der thermostabilen DNA-Polymerasen deren relativ hohe Fehlerrate der Synthese mit sich, was zu für pharmazeutische
Produkte intolerablen Unreinheiten im Produkt führt.
[0004] Alternativ können die Konstrukte als Teil eines in Bakterien replizierbaren Konstruktes biotechnologisch hergestellt werden, anschließend durch Restriktionsverdau von den unerwünschten DNA-Fragmenten, die zur Vermehrung des Konstruktes in den Bakterien dienten, getrennt werden und nach Aufreinigung analog dem für PCR-Produkte
skizzierten Vorgehen in hantelförmige Moleküle umgewandelt werden.
[0005] Aus der WO 92/13962 (Hyman) ist die grundsätzliche Reinigung von kovalent geschlossenen DNA-Molekülen
durch Abbau mit T4- oder T7-Exonukleasen, eine selektive Hydrolyse verunreinigter DNA durch Restriktionsenzyme,
die keine Erkennungssequenzen auf den zu reinigenden DNA-Molekülen aufweisen und die anschließende Abtrennung weiterer Verunreinigungen bekannt Dieses Verfahren ist jedoch auf durch Ligation hergestellte DNA-Moleküle
nicht anwendbar.
[0006] Das Aufreinigen der verschiedenen so aus dem Restriktionsverdau der Plasmide hervorgehenden Fragmente
kann technisch sehr schwierig sein, weil die Mindestgröße eines ein bakterielles Resistenzgen enthaltenden Vektorrückgrates in der gleichen Größenordnung wie die gewöhnlicherweise für gentherapeutische Ansätze verwendeten
Expressionskassetten liegt, also etwa bei einer bis fünf Kilobasen. Die Baslslinientrennung durch chromatographische
Verfahren von Restriktionsfragmenten in der Größenordnung von einem bis fünf Kilobasenpaaren DNA kann, besonders bei größeren Mengen, erhebliche technische Probleme aufwerfen. Eine Methode zur Darstellung der hantelförmigen Expressionskonstrukte, die diese Problematik vermeiden würde, wäre also von erheblichem praktischen Interesse.
[0007] Erfindungsgemäße technische Lösung:
Erfindungsgemäß wird das DNA-Molekül, welches den Hauptteil des herzustellenden (both times !) Expressionskonstruktes bildet, durch fermentative Vermehrung und anschließender Isolierung als Teil eines in Bakterien replizierbaren Plasmids synthetisiert. Besagtes DNA-Molekül wird dann aus dem Plasmid, in dem es in einfacher
oder mehrfacher Kopie vorliegen kann, durch Verdau mit Restriktionsendonukleasen ausgeschnitten, die an den
entstehenden Schnittstellen kurze einzelsträngige Überhänge bilden. In einem anschließenden Schritt wird das
Rohgemisch aus DNA-Molekülen, die den Hauptteil des herzustellenden Expressionskonstruktes bilden, und bakteriellen Restsequenzen wie Antibiotikaresistenzgenen, Replikationsursprüngen u.v.m., der Ligation mit kurzen,
haarnadelförmigen DNA-Oligomeren zugeführt. Besagte Oligomere tragen dabei einen einzelsträngigen Überhang, der auf den oder die einzelsträngigen Überhänge der Expressionskonstrukte passt und so zu einem hantelförmigen Expressionskonstrukt führt.
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[0008] Kern der Erfindung ist nun, daß aus dem entstehenden Rohgemisch aus hantelförmigen Expressionskonstrukten sowie Restsequenzen, die durch die Behandlung mit Haarnadel-Oligomeren und Ligase ebenfalls zum größten
Teil als hantelförmige Moleküle vorliegen, letztere durch zwei enzymatische Schritte vollständig entfernt werden: zuerst
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werden die unerwünschten Moleküle durch Verdau mit einem Restriktionsenzym zerschnitten, dessen Erkennungssequenz nur auf den unerwünschten Fremdmolekülen liegt, so daß die als Produkt gewünschten Expressionskonstrukte kovalent geschlossen bleiben. In einem zweiten Schritt werden dann die geschnittenen Moleküle mit einer
Exonuklease verdaut, so daß nur die gewünschten Moleküle im Reaktionsgemisch als Polymere verbleiben. Dies führt
dazu, daß im Reaktionsgemisch nur eine Spezies langkettiger DNA-Moleküle vorliegt, wodurch diese der Aufreinigung
durch bekannte Methoden der lonenaustauschchromatographie zugänglich ist. Das besagte Verfahren kann durch
festphasengebundene Enzyme durchgeführt werden.
[0009] Werden zum Verdau des Plasmids bakterielle Restriktionsendonukleasen der Klasse I eingesetzt, so entstehen durch den Verdau Überhänge palindromischer Sequenz. Dies bedeutet, daß diese Überhänge einen Strang eines
Doppeistrang-Motivs mit diadischer Symmetrie darstellen; eine andere Form dieser Aussage ist, daß alle von der
betreffenden Endonuklease hergestellten Fragmente mit allen anderen von der betreffenden Endonuklease hergestellten Fragmenten ligieren können. Das führt dazu, daß man zur Vermeidung von Ligationsreaktionen zwischen den
langen Expressionskassetten einen großen Überschuß an kurzen Oligodesoxyribonukleotiden zusetzten muß. Es
mußte in Versuchen zur Ligation in Abhängigkeit von der Länge der zu ligierenden Fragmente und deren Konzentration
ein bis zu 200-facher Überschuß an Oligomeren in Bezug auf die Enden der zu ligierenden Restriktionsfragmente
eingesetzt werden. Dies ist der
[0010] Fall, weil die Restriktionsfragmente intra- und intermolekular mit anderen Restriktionsfragmenten reagieren
können. Der genannte Überschuß an Haarnadel-Oligomeren verschiebt das Gleichgewicht von der intra- oder intermolekularen Reaktion eines polymeren Restriktionsfragmentes mit einem anderen ganz auf die Seite der Reaktion mit
den Oligomeren, führt aber zu einem sehr hohen Anteil der Oligo-Dimere im Reaktionsgemisch. Neben den dadurch
entstehenden Kosten ist daran nachteilig, daß diese Oligomere als teilweise einzelsträngige DNA-Moleküle in einem
so hohen Überschuß enzymatische Reaktionen unspezifisch hemmen können.
[0011] Ein weiterer Aspekt der hier vorgestellten Erfindung ist, daß die Menge der haarnadelförmigen Oligodesoxynukleotide, die zur Ligation an die durch Restriktionsverdau entstandenen Fragmente erheblich vermindert werden
kann, wenn man die Ligation in Anwesenheit von Restriktionsendonukleasen ablaufen läßt, die im Verlaufe der Ligation
entstehenden unerwünschten Verbindungen aus Ligationspartnern in-situ wieder lösen. Ligieren dabei zwei aus Verdau
mit der gleichen Endonuklease entstandene polymere Restriktionsfragmente miteinander, so rekonstituieren sie wieder
die ursprüngliche Schnittstelle. Diese Reaktion läßt sich in-situ durch Verdau mit der betreffenden Endonuklease rückgängig machen.
[0012] Um dabei die Ligation von Oligomeren an die Restriktionsfragmente nicht ebenfalls wieder rückgängig zu
machen, muß die direkt neben dem Überhang liegende Sequenz der Oligomere so gewählt werden, daß sie bei Ligation
an die Restriktionsfragmente die Schnittstelle nicht rekonstituiert. Vorteilhafterweise wird diese Sequenz vielmehr so
gewählt, daß eine nicht palindromische Sequenz bei Ligation des Oligomers an den Überhang des Restriktionsfragmentes entsteht, die vor weiterem Verdau geschützt ist, und ebenfalls so, daß bei Reaktion des Oligomers mit einem
weiteren Exemplar Oligomer passender Sequenz ein Dimer entsteht, so daß eine palindromische Sequenz entsteht,
die durch eine zweite, in der Reaktionslösung enthaltene Endonuklease wieder gespalten werden kann. Auf diese
Weise können in einem Eintopfverfahren durch eine Ligase und zwei Endonukleasen relativ kleine Überschüsse Haamadel-Oligomere (ca. 10- bis 30-fach) ausreichen, zu einem definierten Produkt aus hantelförmigen Monomeren des
Expressionskonstruktes sowie der begleitenden, später abgetrennten Fremdsequenzen zu kommen. Dies kann zum
Beispiel dadurch erreicht werden, daß man zum Verdau in das Plasmid eine die Expressionskassette flankierende
Erkennungssequenz für die Endonuklease EcoRI (G'AATTC; "'" bezeichnet die Schnittstelle, Überhang AATT) einbaut,
die 5'-überhängende Sequenz des Oligos mit AATT beginnen läßt und den sich daran anschließenden Doppelstrangbereich des Haarnadel-Oligos mit G beginnen läßt. Auf diese Weise entsteht bei Ligation zwischen dem HaamadelOligo und der Expressionskassette eine nicht-palindromische Sequenz GAATTG, bei Reaktion einer Expressionskassette mit einer anderen wird die EcoRI-Schnittstelle Wiederhergestellt, und bei Reaktion eines Oligos mit einem anderen kann das entstehende Dimer durch die Endonuklease Munl geschnitten werden (siehe Beispiel 1).
[0013] Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung von sogenannten Klasse-II Endonukleasen, welche im
Gegensatz zu den heute zumeist verwendeten Klasse-I Endonukleasen keine palindromischen Sequenzen erkennen
(Butkus et al., Biochim Biophys Acta 1985 Dec 18;826(4):208-12 A new restriction endonuclease Eco31I recognizing
a non-palindromic sequence). Durch die Entstehung nichtpalindromischer Überhänge können die Enden nicht mehr
mit jedem anderen Ende reagieren. Da bei den Klasse-II-Endonukleasen die Schnittstellen neben den Erkennungssequenzen liegen, können auch die Reaktivitäten von Edukt und Produkt getrennt werden. Durch Platzierung der
Erkennungssequenz auf dem Plasmid jenseits der gewünschten Produktsequenz kann ein religiertes Fragment des
Plasmids durch in der Ligationslösung anwesende Endonuklease immer wieder geschnitten werden, während die mit
Oligonukleotid ligierte Expressionskassette unreaktiv bleibt. Auf diese Weise kann die Menge an Oligodesoxyribonukleotid auf etwa einen fünffachen Überschuß in Enden gesenkt werden.
[0014] Bevorzugt wird zum Primärverdau eine Endonuklease der Gruppe der Klasse-II-Restriktionsendonukleasen,
vorzugsweise ein Enzym aus der Gruppe BbsI, BbvI, BbvII, BpiI; BplI, BsaI, BsmAI, BsmBI, BsmFI, BspMI, Eam1104I,
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EarI, Eco31I, Esp3I, FokI, HgaI, SfaNI oder deren Isoschizomere eingesetzt.
[0015] Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist, daß der Verdau der DNA-Präparation mittels sequenzspezifischer Endonukleasen sowie nachfolgendem Verdau mit sequenzunspezifischen Exönukleasen alle DNA aus der Präparation
zu entfemen vermag, welche der Endonukiease eine Erkennungssequenz liefert und als Verunreinigung in der DNA
enthalten ist. Heute in der medizinischen Anwendung bzw. klinischen Prüfung befindliche DNA-Plasmidpräparationen
weisen einen erheblichen Grad an Verunreinigung mit genomischer DNA der zur Herstellung verwendeten Mikroorganismen auf. So spezifiziert ein führender Hersteller von GMP-zugelassener DNA für klinische Prüfungen den Gehalt
an "Host DNA auf <5% (Quelle: Katalog der Qiagen GmbH auf dem Internet, Eintrag vom 11.06.1999 auf der Seite
http://www.qiagen.com/catalog/chapter 12/chap12b.asp). Es ist anzunehmen, daß im Vergleich mit den Reinheitsstandards herkömmlicher Arzneimittel hier erheblicher Bedarf an Verbesserung besteht.
Beispiel 1:
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[0016] 1 mg des Plasmids pG-EGFP (Sequenz siehe Anhang) wurde mit der Restriktionsendonuklease Eco RI vollständig verdaut. Die entstandenen Fragmente wurden mit 1 mg des 5'-phosphorylierten Desoxyoligoribonukleotids mit
der Sequenz AATTGGCCGGCCGTTTCGGCCGGCC (TIB Molbiol, Berlin) in Anwesenheit von 100 U T4 DNA-Ligase
(MBI-Fermentas, Vilnius, Litauen) sowie 50 u Restriktionsendonukleasen Munl und EcoRI in 5 ml Reaktionspuffer bei
37°C über Nacht umgesetzt. Die Reaktion wurde durch Erhitzen auf 60°C gestoppt.
[0017] Das entstandene Reaktionsgemisch wurde konzentriert und nach Umpuffern mit 100 U Restriktionsendonuklease HindIII sowie 100 U T7-DNA-Polymerase in Abwesenheit von Desoxyribonukleotiden 1 h verdaut. Das entstandene Produkt wurde per Anionen-Austausch-Chromatographie gereinigt und war nach Kontrolle durch Gelelektrophorese sowie PCR-Kontrolle frei von Resten des unerwünschten Fragmentes.
Beispiel 2:
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[0018] 1 mg des Plasmids pMol-EGFP (Sequenz siehe Anhang) wurde mit der Restriktionsendonuklease Eco31I
vollständig verdaut. Die entstandenen Fragmente wurden mit 50 µg des 5'-phosphorylierten Desoxyoligoribonukleotids
mit der Sequenz AGGGGTCCAG TTTTCTGGAC (TIB Molbiol, Berlin) in Anwesenheit von 20 U T4 DNA-Ligase
(MBI-Fermentas, Vilnius, Litauen) sowie 10 u Eco31I in 5 ml Reaktionspuffer bei 37°C über Nacht umgesetzt. Die
Reaktion wurde durch Erhitzen auf 60°C gestoppt.
[0019] Das entstandene Reaktionsgemisch wurde konzentriert und nach Umpuffem mit 100 U Restriktionsendonuklease HindIII sowie 100 U T7-DNA-Polymerase in Abwesenheit von Desoxyribonukleotiden ü.N. verdaut. Das entstandene Produkt wurde per Anionen-Austausch-Chromatographie gereinigt und war nach Kontrolle durch Gelelektrophorese sowie PCR-Kontrolle frei von Resten des unerwünschten Fragmentes.
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SEQUENZPROTOKOLL
[0020]
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<110> Mologen GmbH
<120> Verfahren zur Herstellung von hantelförmigen DNA-Molekülen als Expressionskonstrukte
<130> EP 0 967 274
45
<140> EP 99250187.4
<141> 1999-06-14
50
<150> DE 198 26 758
<151> 1998-06-15
<160> 2
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<170> PatentIn Ver. 2.1
<210> 1
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EP 0 967 274 B1
<211> 4397
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
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<220>
<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz: Sequenz 1: Plasmid (pG-EGFP)
<400> 1
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<210> 2
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<211> 4278
<212> DNA
<213> Künstliche Sequenz
<220>
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<223> Beschreibung der künstlichen Sequenz:Sequenz 2: Plasmid (pMOL-EGFP)
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Patentansprüche
1.
Verfahren zur Herstellung eines hantelförmigen DNA-Moleküls, bestehend aus den folgenden Verfahrensschritten:
a) Vermehrung des das Molekül hauptsächlich bildenden DNA-Doppelstranges als Teil eines bakteriell replizierbaren Konstrukts,
5
b) isolierung des bakteriell replizierbaren Konstrukts,
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c) Ausschneiden des das Molekül hauptsächlich bildenden DNA-Doppelstranges vermittels einer oder mehrerer DNA-Restriktionseridonukleasen zum Primärverdau, deren Schnittstellen die Sequenz des das Molekül
hauptsächlich bildenden DNA-Doppelstranges an beiden Seiten unmittelbar einschließen, und deren Aktivität
an der Schnittstelle kurze überstehende Enden aus einzelsträngiger DNA hinterlässt,
15
d) Ligation der so entstandenen Restriktionsfragmente mit Haarnadel-förmigen Oligodesoxyribonukleotiden,
die kurze, auf die besagten Restriktionsfragmentenden passende Einzelstrangüberhänge aufweisen, so dass
bei der Ligationsreaktion zwischen Oligodesoxyribonukleotid und Restriktionsfragment an beiden Seiten ein
kovalent geschlossener Einzelstrang entsteht,
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e) anschließendem Verdau des entstandenen Reaktionsgemisches vermittels Restriktionsendonuklease zum
Sekundärverdau, die eine auf dem herzustellenden Molekül nicht vorhandene, auf dem Rest des bakteriell
replizierbaren Konstrukts aber mindestens einmal vorhandene Erkennungssequenz erkennt und schneidet,
f) und anschließendem oder gleichzeitigem Verdau der Reaktionsmischung vermittels einer ausschließlich für
freie 3'- oder 5'-DNA-Enden spezifischen Exonuklease.
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2.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem das hantelförmige DNA-Molekül ein Expressionskonstrukt, bestehend
aus Promoter, kodierender Sequenz und Terminatorsequenz, ist
3.
Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei die Haarnadel-förmigen Oligodesoxyribonukleotide eine solche Sequenz in
ihrem Einzelstrangüberhang aufweisen, dass bei der Ligationsreaktion nach Verfahrensschritt d) zwischen Oligodesoxyribonuleotid und polymerem Restriktionsfragment keine palindromische Sequenz entsteht, und wobei während der Ligationsreaktion nach Verfahrensschritt d) solche Restriktionsendonukleasen anwesend sind, dass
durch intraund intermolekulare Ligationsreaktionen der polymeren Restriktionsfragmente oder der Oligomere entstehende Erkennungssequenzen für Restriktionsendonukleasen diese in situ wieder geschnitten werden.
4.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem die besagte Endonuklease zum Primärverdau ein Enzym der Gruppe
der Klasse-II-Restriktionsendonukleasen, vorzugsweise ein Enzym aus der Gruppe BbsI, BbvI, BbvII, BpiI; BplI,
BsaI, BsmAI, BsmBI, BsmFI, BspMI, Eam1104I, EarI, Eco31I, Esp3I, FokI, HgaI, SfaNI oder deren Isoschizomere
ist.
5.
Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, bei dem das Verfahren durch festphasengebundene Enzyme durchgeführt
wird.
6.
Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, wobei Präparationen hantelförmiger DNA-Moleküle
gereinigt werden, indem die DNA-Präparation
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a) einem Endonukleaseabbau der Ligationsprodukte zur Reinigung des gewünschten Ligationsproduktes
(b) einem Verdau der mit Exonukleasen, welche für freie Hydroxy- oder Phosphatgruppen von Desoxyribonukleinsäure spezifisch sind, vorzugsweise die Exonukleaseaktivitäten der DNA-Polymerase der Bakteriophagen T4 oder T7,
c) einer Abtrennung der verwendeten Enzyme, Pufferbestandteile sowie hydrolysierten Nukleotide,
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unterzogen wird.
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7.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Präparationen einem Verdau durch eine oder einer Vielzahl von Restriktionsendonukleasen in einem für die Aktivität der besagten Restriktionsendonukleasen geeigneten Medium ausgesetzt wird, wobei die zu reinigenden DNA-Moleküle keine Erkennungssequenzen für die verwendeten Restrikti-
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onsendonukleasen aufweisen.
8.
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Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei die DNA-Präparation anschließend oder gleichzeitig einem Verdau mit
Exonukleasen, welche für freie Hydroxyoder Phosphatgruppen von Desoxyribonukleinsäure spezifisch sind, vorzugsweise die die Exonukleaseaktivitäten der DNA-Polymerase der Bakteriophagen T4 oder T7, ausgesetzt und
dann einer Abtrennung der verwendeten Enzyme, Pufferbestandteile sowie hydrolysierten Nukleotide unterzogen
wird.
Claims
1.
Method to obtain a dumbbell-shaped DNA molecule, consisting of the following steps:
a) multiplication of the DNA double strand comprising the major part of the molecule, as part of a construct
that can replicate in bacteria,
15
b) isolation of the construct that can replicate in bacteria,
c) excision of the of the DNA double strand comprising the major part of the molecule, by means of one or
several DNA restriction endonucleases for primary digestion, whereby the restriction sites of said endonucleases immediately flank the sequence of the molecule comprising the major part of the molecule on both sides,
and the activity of said endonucleases leaves short, single-stranded protruding ends at the restriction site,
20
d) ligation of the restriction fragments thus formed, with hairpin-shaped oligodesoxyribonucleotides comprising
short, single-stranded protruding ends that pair with said single-stranded protruding ends on said restriction
fragments, so that a covalently closed single strand forms on both sides as a consequence of the ligation
reaction between said oligodesoxynucleotides and said restriction fragments.
25
e) subsequent digestion of the reaction mixture thus obtained, with a restriction endonuclease for secondary
digestion, which recognises and cuts a recognition site not present on the molecule that is to be obtained, but
is present at least once on the remainder of the construct that can replicate in bacteria,
30
f) and subsequent or concurrent digestion of the reaction mixture with a exonuclease exclusively specific for
free 3' or 5' ends of DNA.
35
2.
Method according to claim 1, where the dumbbell-shaped DNA molecule is an expression construct comprising a
promoter sequence, a coding sequence and a terminator sequence.
3.
Method according to claim 1, where the hairpin-shaped oligodesoxyribonucleotides comprise such a sequence in
their single-stranded protruding ends, that upon the ligation reaction according to step d) between oligodeoxyribonucleotide and polymeric restriction fragment, no palindromic sequence forms, and where restriction endonucleases are present in the ligation reaction of step d) so that restriction sites formed as a consequence of intramolecular or intermolecular ligation reactions of the restriction fragments or the oligomers are being digested in-situ.
4.
Method according to claim 1, where said endonuclease for primary digestion is an enzyme being a member of the
group of class II endonucleases, preferably an enzyme of the group BbsI, BbvI, BbvII, BpiI; BplI, BsaI, BsmAI,
BsmBI, BsmFI, BspMI, Eam1104I, EarI, Eco31I, Esp3I, FokI, HgaI, SfaNI or an isoschizomer thereof.
5.
Method according to claim 1, 2 or 3, where the method is being performed by means of enzymes bound to a solid
phase.
6.
Method according to one or several of the claims 1 to 5, where preparations of dumbbell-shaped molecules are
purified by submitting the DNA-preparation to
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a) an endonuclease digestion of the ligation products to purify the desired ligation product,
b) a digestion with exonucleases specific for free hydroxy- or phosphate groups of DNA, preferably the exonuclease activity of the DNA polymerase derived from bacteriophages T4 or T7, and
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c) a separation of the hydrolyzed nucleotides, enzymes and buffer components employed in the reaction.
7.
Method according to claim 6, where the preparations are submitted to a digestion of one or several restriction
endonucleases in a buffer suited to the activity of said endonucleases, where the DNA molecules that are to be
purified do not comprise a recognition sequence for said restriction endonucleases employed in the reaction.
8.
Method according to claim 6 or 7, where the DNA preparation is submitted, subsequently or concurrently, to a
digestion by exonucleases that are specific for free hydroxy- or phosphate groups of DNA, preferably the exonuclease activity of the DNA polymerase derived from bacteriophages T4 or T7, and where the DNA preparation is
subsequently submitted to a separation of the hydrolyzed nucleotides, enzymes and buffer components employed
in the reaction.
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Revendications
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1.
Procédé de production d'une molécule d'ADN en forme d'haltère, comprenant les étapes de procédé suivantes :
a) multiplication du double brin d'ADN formant essentiellement la molécule en tant que partie d'un construct
bactérien réplicable,
b) isolation du construct bactérien réplicable,
c) dissociation ou découpage du double brin d'ADN formant essentiellement la molécule au moyen d'une ou
de plusieurs endonucléases de restriction d'ADN à des fins de digestion primaire, dont les points de coupure
incorporent directement au niveau des deux côtés la séquence du double brin d'ADN formant essentiellement
la molécule, et dont l'activité laisse au niveau du point de coupure de courtes extrémités saillantes d'ADN
simple brin,
d) ligature des fragments de restriction ainsi obtenus avec des oligodésoxyribonucléotides en forme d'épingle
à cheveu qui présentent des prolongements de simple brin adaptés aux dits fragments de restriction, de sorte
que lors de la réaction de ligature se forme entre l'oligodésoxyribonucléotide et le fragment de restriction, des
deux côtés, un simple brin fermé de façon covalente,
e) digestion consécutive du mélange réactionnel obtenu au moyen d'une endonucléase de restriction à des
fins de digestion secondaire, qui reconnaît et coupe une séquence de reconnaissance non présente sur la
molécule à préparer mais existant au moins une fois sur le reste du construct bactérien réplicable,
f) et digestion consécutive ou simultanée du mélange réactionnel au moyen d'une exonucléase exclusivement
spécifique des extrémités d'ADN 3' ou 5'.
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2.
Procédé selon la revendication 1, dans lequel la molécule d'ADN en forme d'haltère est un construct d'expression
composé d'un promoteur, d'une séquence codante et d'une séquence terminateur.
3.
Procédé selon la revendication 1, dans lequel l'oligodésoxyribonucléotide en forme d'épingle à cheveu présente
une séquence dans son prolongement de simple brin telle que lors de la réaction de ligature selon l'étape d), il ne
se forme pas de séquence palindromique entre l'oligodésoxyribonucléotide et le fragment de restriction polymère,
et dans lequel, pendant la réaction de ligature selon l'étape d) sont présentes de telles endonucléases de restriction
de sorte que, par des réactions de ligatures intra- et intermoléculaires des fragments polymères de restriction ou
des oligomères, des séquences de reconnaissance des endonucléases de restriction se formant coupent à nouveau celles-ci in situ.
4.
Procédé selon la revendication 1, dans lequel ladite endonucléase de digestion primaire est une enzyme du groupe
des endonucléases de restriction de type II, de préférence une enzyme du groupe de BbsI, BbvI, BbvII, Bpil, BplI,
BsaI, BsmAI, BsmBI, BsmFI, BspMI, Eam1104I, EarI, Eco31I, Esp3I, Fokl, HgaI, SfaNI ou leurs isoschizomèrcs.
5.
Procédé selon la revendication 1, 2 ou 3, dans lequel le procédé est conduit par des enzymes liées en phase solide.
6.
Procédé selon une ou plusieurs des revendications 1 à 5, dans lequel des préparations de molécules d'ADN en
forme d'haltères sont purifiées en ce que la préparation d'ADN est soumise à
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a) une dégradation par endonucléase des produits de ligature afin de purifier le produit de ligature souhaité,
b) une digestion avec des exonucléases qui sont spécifiques des groupes hydroxy ou phosphate libres des
acides désoxyribonucléiques, de préférence présentant des activités d'exonucléases de l'ADN-polymérase
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EP 0 967 274 B1
des bactériophages T4 ou T7,
c) une séparation des enzymes utilisées, des composants du tampon et des nucléotides hydrolysés.
7.
Procédé selon la revendication 6, dans lequel les préparations sont soumises à une digestion par une ou plusieurs
endonucléases de restriction dans un milieu approprié pour l'activité desdites endonucléases de restriction, où les
molécules d'ADN à purifier ne présentent pas de séquence de reconnaissance des endonucléases de restriction
utilisées.
8.
Procédé selon la revendication 6 ou 7, dans lequel la préparation d'ADN est soumise ensuite ou simultanément
à une digestion avec des exonucléases qui sont spécifiques des groupes hydroxy ou phosphate libres des acides
désoxyribonucléiques, de préférence soumises aux activités d'exonucléases de l'ADN-polymérase des bactériophages T4 ou T7, et ensuite soumise à une séparation des enzymes utilisées, des composants du tampon et des
nucléotides hydrolysés.
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