0,03175 min -1 - Carl von Ossietzky Universität Oldenburg

Versuch 3: Aktivität am Beispiel einer
Proteasereaktion
3.6.2015
Einleitung
Mit dem Versuch soll die Enzymaktivität der Serinprotease Trypsin untersucht werden. Hierfür wird
eine Michaelis-Menten-Kinetik aufgestellt, aus der der Km-Wert abgeleitet wird. Hierfür werden einer
steigenden Menge Substrat eine konstante Menge Enzym zugegeben in einem Zeitintervall von 0,25
min über 4 min und die Extinktion photometrisch gemessen.
Durchführung
Die Durchführung erfolgte nach dem Skript[1] mit dem Pipettierschema aus Tabelle 1.
Küvette
1
2
Reaktionspuffer in
0,85
0,85
ml
L-BAPNA in µl
10
37
Wasser in µl
90
63
Trypsin in ml
0,05
0,05
Konzentration
0,2
0,75
Substrat in mM
Tabelle 1 Pipettierschema für Ektinktionsmessung
3
0,85
4
0,85
5
0,85
50
50
0,05
1
75
25
0,05
1,5
100
0
0,05
2
Ergebnisse
Die Messung der Ergebnisse lieferte die Ergebnisse aus Tabelle 2.
t in min
E410 K1
E410 K2
E410 K3
0
0,139
0,149
0,181
0,25
0,139
0,158
0,191
0,5
0,141
0,162
0,204
0,75
0,144
0,168
0,205
1
0,146
0,175
0,213
1,25
0,149
0,182
0,22
1,5
0,152
0,188
0,228
1,75
0,155
0,195
0,236
2
0,158
0,202
0,244
2,25
0,16
0,208
0,252
2,5
0,164
0,215
0,26
2,75
0,166
0,221
0,267
3
0,169
0,228
0,275
3,25
0,171
0,234
0,283
3,5
0,175
0,241
0,291
3,75
0,178
0,247
0,3
4
0,18
0,254
0,308
Tabelle 2 Ergebnisse der Extinktionsmessung
E410 K4
0,182
0,193
0,203
0,213
0,224
0,233
0,242
0,253
0,263
0,274
0,284
0,294
0,304
0,315
0,325
0,336
0,346
E401 K5
0,22
0,233
0,243
0,254
0,265
276
0,288
0,3
0,312
0,323
0,334
0,347
0,359
0,371
0,384
0,395
0,406
Auswertung
Da es sich um einen linearen Zusammenhang handelt, gilt, dass die Anfangsgeschwindigkeit gleich
der Steigung der Gerade des Zusammenhangs zwischen Extinktion zur Zeit ist.
Es gilt: 𝑣0 =
∆𝐸
∆𝑡
Daher ergibt sich für die Proben:
1. (0,2 mM): v0= 0,011 min-1
2. (0,75 mM): v0= 0,02625 min-1
3. (1 mM): v0= 0,03175 min-1
4. (1,5 mM): v0= 0,041 min-1
5. (2 mM): v0= 0,0465 min-1
Grafisch lässt sich die Anfangsgeschwindigkeit über ein Steigungsdreieck berechnen, wie
exemplarisch an Probe in Abbildung 1.
E410 K1
Extinktion bei 410 nm
0.19
0.18
0,011
0.17
,011
1
0.16
0.15
0.14
0.13
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
t in min
Abbildung 1 Steigungsdreieck/Anfangsgeschwindigkeitsbestimmung Probe 1
Aus den Anfangsgeschwindigkeiten lässt sich eine Michaelis-Menton-Kinetik aufstellen wie in
Abbildung 2.
Michealis-Menten-Kinetik
v0 in min-1
0.05
0.04
0.03
0.02
0.01
0
0
0.5
1
1.5
2
2.5
c in mM
Abbildung 2 Michaelis-Menten-Kinetik
Zur Bestimmung von Km wird die Substratkonzentration und die Anfangsgeschwindigkeit reziprok
aufgetragen in einem Line-Weaver-Burk-Diagramm, siehe Abbildung 3.
1/v0 in min
Line-Weaver-Burk
-2.00
100.00
90.00
80.00
70.00
60.00
50.00
40.00
30.00
20.00
10.00
0.00
-1.00
0.00
1.00
2.00
3.00
4.00
1/c in 1/mM
Abbildung 3 Michaelis-Menton-Kinetik als Line-Weaver-Burk-Diagramm
5.00
6.00
Line-Weaver-Burk
1/v0 in min
100.00
90.00
80.00
70.00
60.00
50.00
40.00
17
30.00
20.00
10.00
0.00
-0.50
0.00
-2.00
-1.50
-1.00
0.50
1.00
1.50
2.00
1/c in 1/mM
-1,2
Abbildung 4 Line-Weaver-Burk II
An der Schnittstelle mit der x-Achse ergibt sich der negative reziproke Km-Wert. Für den Km Wert
ergibt sich daher: Km=0,833 mM
An der Schnittstelle mit der y-Achse ergibt sich der reziproke Wert für vmax. Daher ergibt sich für
vmax: vmax= 0,0588 min-1
Die Enzymaktivität lässt sich folgendermaßen berechnen:
1U= 1µmol p-Nitroanilin/ min
Nach dem Lambert-Behr‘schen Gesetz gilt:
∆𝐸 = 𝜀 ∗ 𝑐 ∗ 𝑑
Es gilt(exemplarisch Küvette 3):
∆𝐸 =0,03175 min-1
ε= 8800 M-1cm-1
d=1 cm
𝑐=
∆𝐸
0,03175 𝑚𝑖𝑛−1
𝑀
µ𝑀
=
= 3,607 ∗ 10−6
= 3,607
−1
−1
ε∗d
8800 M cm ∗ 1𝑐𝑚
𝑚𝑖𝑛
𝑚𝑖𝑛
Bei einem Küvettenvolumen von 1 ml gilt: 0,003607
µ𝑀
𝑚𝑖𝑛
Daher ergeben sich 3,607 mU (da 1U= 1µmol p-Nitroanilin/ min) für die Enzymaktivität. Bezogen auf
die Enzymmenge ergibt sich:
0,5 mg/ml Trypsin von 0,05 ml  10 mg/ml
Das eingesetzte Volumen war ein ml, daher ergeben sich 10 mg
𝑆𝑝𝑒𝑧𝑖𝑓𝑖𝑠𝑐ℎ𝑒 𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡ä𝑡 =
𝑈
𝑚𝑔
=
3,607 𝑚𝑈
10 𝑚𝑔
= 0,3607
𝑈
𝑔
Quellen
1. Praktikumsskript 2015 – AG Biochemie, Carl-von-Ossietzky-Universität Oldenburg (2015)