Yeast-Two-Hybrid: Prinzip
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ProteinInteraktionsanalysen mittels Yeast-Two-Hybrid Assay Grundpraktikum Genetik Analyse von Protein-Protein Interaktionen • • In vitro Methoden: – (Co-)Immunpräzipitation – Affinitätschromatographie – Cross-linking – Protein-probing – Phage-display – Protein-Chip (zwei interagierenden Proteinen im Lysat) (potentieller Interaktionspartner ist immobilisiert) (chemische Verknüpfung von Partnern) (markiertes Protein beweist eine Bindung) (Suche nach Partner in einer Bibliothek) In vivo Methoden: – Fluorescence energy transfer (FRET) – Hefe-Zwei-Hybrid – Hefe-Tribrid-System – Split-YFP Saccharomyces cerevisiae • 1996 Genomsequenz – 1. sequenzierter eukaryotischer Organismus ~ 12 Mb, 16 Chromosomen ~ 6000 Gene • biotechnologische Nutzung • Modellorganismus Genetik, Biochemie, Molekularbiologie Zellbiologie schnelles Wachstum, leicht zu kultivieren leichte Isolierbarkeit, Charakterisierung von Mutanten nicht pathogen stabiler haploider Zyklus transformierbar Yeast-Two-Hybrid: GAL4 Transkriptionsfaktor keine Galaktose im Medium: Galaktose im Medium: GAL80 bindet an AD von GAL4 GAL80/GAL4 Komplex bindet an UAS bindet an den Promtor GAL4 bindet an Promotor Transkription der GAL-Gene unterdrückt Transkription der GAL-Gene aktiviert Yeast-Two-Hybrid: Prinzip X = Bait = Protein für Identifikation von Bindungspartner X = Prey = Target für Bait z.b. Bibliothek !!!! Verwendete Hefe-Stämme haben ein mutiertes (defektes) Gal4 !!!! Yeast-Two-Hybrid: Prinzip β-Galactosidase • ins Hefe-Genom integriert Auxotrophie und Prototrophie • auxotroph: bezeichnet Organismen, die bestimmte essentielle Substanzen nicht selbstständig synthetisieren können • prototroph: bezeichnet Organismen, die alle benötigten organischen Wachstumsfaktoren (Aminosäuren, Nukleotide,…) selbst synthetisieren können Yeast-Two-Hybrid: Hefestämme Klassische(genetische) Nomenklatur: a-Zelle → a-factor, α-Rezeptor α-Zelle → α-factor, a-Rezeptor ARG 2 arg2 arg2-9 arg2-Δ ARG2::LEU2 Arg2p Arg+ Arg- Wildtyp Gen Mutiertes Gen Spezifische Mutation in Gen Deletionsmutante Disruptionsmutante Protein Arg prototroph Arg auxotroph Yeast-Two-Hybrid: Plasmide Yeast-Two-Hybrid: Transformation • Transformation: Hitzeschock bei 42°C • LiAC: erhöht Permeabilität und DNA-Bindekapazität der Zellwand • carrier DNA: bindet an die Zellwand (einzelsträngige DNA bindet effektiver als doppelsträngige DNA) • PEG: vermittelt Anlagerung des Plasmids und der carrier-DNA an Hefezellen Yeast-Two-Hybrid: Transformation Wichtig: Unter der Cleanbench arbeiten Alle Lösungen und Platten nur unter der Bench öffnen Berechnung der Plasmidmenge (1 µg für Trafo) Bsp.: 129 ng/µl = Miniprep 1000 ng 129 ng/µl = 7,75 µl !! SD-Trp für Stamm AH109 und pGBKT7-constructs !! SD-Leu für Stamm Y187 und GADT7-constructs Mating und Selecting 1 5 9 13 2 3 4 6 7 8 10 11 12 14 15 16 Testen auf Protein-Protein Interaktion Testen auf Protein-Protein Interaktion • Mangelmedium – SD-Leu-Trp-His: low stringency medium • Galaktosidase-Assay – α-Galaktosidase (MEL1): wird ins Medium sekretiert MEL1 UAS schwacher Promotor – β-Galaktosidase (lacZ): wird nicht sekretiert GAL1 UAS starker Promotor Testen auf Protein-Protein Interaktion • HIS3 Gen wurde in AH109 und Y187 durch eine spezifische Mutation ausgeschaltet • aber: schwache Hintergrundexpression von HIS3 → falsch Positive • 3AT: 3 Amino-1,2,4 triazol kompetiver Inhibitor des HIS3 Genproduktes (Imidazolglycerol-Phosphat Dehydratase) !!! Selektives Medium ohne Histidin nötig !!! Analyse von Protein-Protein Interaktionen Yeast-Two-Hybrid Analyse in S. cerevisiae Anwendungen: • • • • Interaktion zwischen Protein 1 und Protein 2 Interaktion zwischen Proteindomänen Rolle einzelner Aminosäurereste für Interaktion Identifizierung von neuen Interaktionspartnern Vorteile/Nachteile des Yeast-Two-Hybrid Vorteile • hoch sensitiv • in vivo (keine biochemische Reinigung der Proteine nötig, postranslationale Modifizierungen) • billig, robust • Screening Nachteile • Interaktionsstelle durch AD/BD Domäne verdeckt • kann nur im Zellkern der Hefe stattfinden • richtige Faltung, Stabilität der Proteine in der Hefezelle • abweichende posttranslationale Modifizierungen in Hefe • Protein ist toxisch für Hefe • BD-Fusionprotein zeigen Interaktion (falsch Positive) • zeitliche und räumliche Expression der Proteine MADS-BOX Domain Proteine MADS DNAbinding I K Protein-protein interaction C Transcriptional activation ABC Modell – Arabidopsis thaliana A ABCDE Modell – Arabidopsis thaliana Liriodendron tulipifera (tulip tree) • Family: Magnoliaceae • Flower: – Monoecious – 9 tepals • small genom size • Habitat: Eastern North America (784 Mbp) Amborella trichopoda • most basal angiosperm • Family: Amborellaceae • small, evergreen • unisexual flower : – tiny, typically about 4-8 mm – 5 – 8 tepals – wind and insect pollination • Habitat: New Caledonia A A: female flower B: male flower B zu untersuchende Proteine Amborella trichopoda (AMTR) AMTR-AGL2 AMTR-PI AMTR-AG E function B function (GLO) C function Liriodendron tulipifera (LITU) LITU-DEF1 LITU-AGL2 LITU-PI B function E function B function (GLO) Evolution des ABC-Models in Abhängigkeit von der Speziation der Blütenpflanzen. se-Sepalen, pe-Petalen, st-Stamina, ca-Carpell ProteinInteraktionsanalysen mittels Yeast-Two-Hybrid Assay 2. Tag 2. Tag • Auswertung 1. Tag • ß-Galactosidase Assay • Kolonie-PCR Auswertung 1. Tag Kolonien zählen Wachstum? Wachstum? Wachstum? Was ist auffällig, anders als die Erwartung? Kolonie-PCR Zellaufschluss mit NaOH Primer fwd Primer rv PCR Gel PCR-Produkt Mastermix Mischung enthält alle Komponenten um mehrere Reaktionen anzusetzen. Reduktion der Pipettierarbeit und des Fehlers! Bsp: 5 Reaktionen 1x 5,5 x (oder 6 x) Puffer 10 x 5 µl 27,5 µl dNTPs 2mM 5 µl 27,5 µl ddH2O 34 µl 187 µl Taq 1 µl 5,5 µl 45 µl (final 50 µl) ß-Galactosidase Assay Indigo Farbstoff • wird nicht sekretiert • Zellaufschluss mit Chloroform!! ß-Galactosidase Assay Agarplatte Alufolie Chloroform Chloroform Abdampfen lassen !!! + Agar mit X-Gal 3h – 24 h Organisatorische Infos !!!!! Arbeiten mit Chloroform und EtBr !!!!! • 3 Freiwillige zum Gele gießen • Mittagspause nach dem X-Gal Test • Praktikum Do und Fr • Start pünktlich 8 Uhr • Bitte das Skript runterladen und LESEN!! Fragen beantworten!!! • Klausur am Freitag 15 Uhr – 16 Uhr
