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Seminar Fortgeschrittene Algorithmische Bioinformatik Oligodesignprobleme von Oliver Arnold & Jan Hendrik Nielsen Gliederung Erster Teil: Einführung in DNA-Chip Design Einleitung DNA-Chips Aufbau von cDNA-Chips Aufbau von Oligo-Chips Beobachtung der Genexpression Synthese der Oligonukleotide Merkmale der Oligo-Chips Kriterien für optimale Oligos Anwendungsgebiete Zweiter Teil: Algorithmen zur Konstruktion von Oligos später ... Seminar „Fortgeschrittene algorithmische Bioinformatik“, SS05 - Vortrag Oligodesignprobleme 2 DNA-Chips werden allgemein benutzt um zu ermitteln ob Gene exprimiert sind (kodieren für Proteine) hauptsächlich 2 Arten von Chips: cDNA Microarrays (Incyte Inc.) Oligonucleotide Microarrays (Affymetrix) Spots auf dem Chip müssen einzigartig für ein Gen sein (Spezifität) Spots müssen dieses Gen entdecken (Sensitivität) alle Spots sollten unter den gleichen Bedingungen funktionieren, z.B. Temperatur (Einheitlichkeit) Seminar „Fortgeschrittene algorithmische Bioinformatik“, SS05 - Vortrag Oligodesignprobleme 3 Aufbau von cDNA-Chips 10000 Gene auf einem Chip Oberfläche ist aus beschichtetem Glas hohe Sensitivität, wegen langer Probe-Sequenzen aber niedrige Spezifität, wegen vieler Fehl-Hybridisierungen Probes können nicht zwischen ähnlichen oder gleichen Subsequenzen unterscheiden dadurch auch nicht zwischen Gen-Familien mehrere cDNAs für ein Gen (Fehl-Hybridisierung!) Seminar „Fortgeschrittene algorithmische Bioinformatik“, SS05 - Vortrag Oligodesignprobleme 4 Aufbau von Oligo-Chips 9000 Gene auf einem Chip Oberfläche für Oligos ist aus beschichtetem Glas oder Silizium Oligos sind in Arrays angeordnet (65000-500000 auf einem Chip) jedes Array (Spot) "erkennt" ein Gen extrahierte Gene (targets) lagern sich an Oligos (probes) an Hybridisierung Seminar „Fortgeschrittene algorithmische Bioinformatik“, SS05 - Vortrag Oligodesignprobleme [2] 5 Beobachtung der Genexpression (1) Extrahieren der Gene (mRNA) aus einem Referenz- und einem Mutationstyp Reverse Transkription um cDNAs zu erzeugen Vervielfältigung der cDNAs durch PCR Markierung der Gene mit unterschiedlich fluoreszierenden Farbstoffen (z.B. rot und grün) "Fluten" des Chips mit markierten cDNAs Seminar „Fortgeschrittene algorithmische Bioinformatik“, SS05 - Vortrag Oligodesignprobleme [2] 6 Beobachtung der Genexpression (2) Temperatur-Erhöhung um Fehl-Hybridisierungen zu denaturieren Waschen des Chips Beseitigung von ungebundener cDNA Auswertung der Daten, bzw. Messen der Intensität der Farbstoffe [2] Seminar „Fortgeschrittene algorithmische Bioinformatik“, SS05 - Vortrag Oligodesignprobleme 7 Synthese der Oligonukleotide benutzte Methode: Photolitographie Oligos können parallel erzeugt werden Maske mit Löchern wird benutzt ultraviolettes Licht tritt nur durch die Löcher beschienene Oligos werden "aktiviert" Basen/Nukleotide können sich anlagern Chip wird mit Nukleotiden einer Art "geflutet" ungebundene Basen werden abgewaschen nächste Maske wird benutzt Wiederholung der einzelnen Schritte (ca. 70 mal) [2] Seminar „Fortgeschrittene algorithmische Bioinformatik“, SS05 - Vortrag Oligodesignprobleme 8 Merkmale der Oligo-Chips (1) Oligos werden nur durch bekannte Sequenz-Informationen produziert jedes Oligo wird mit einem Mismatch-Oligo gepaart, unterscheiden sich nur im Zentrum (durch eine Base) typischerweise werden 20 Paare von Oligonukleotiden zur Erkennung eines Gens verwendet (ein Spot) Fehl-Hybridisierungen können erkannt werden Oligos, die weniger (oder gleich) hybridisieren als MismatchOligos, implizieren geringe Spezifität Seminar „Fortgeschrittene algorithmische Bioinformatik“, SS05 - Vortrag Oligodesignprobleme 9 Merkmale der Oligo-Chips (2) es gibt zwei Typen von Oligo-Chips short Oligo-Chips (Länge: 20-25 bp) long Oligo-Chips (Länge: 50-70 bp) oft wird nur ein Oligonukleotide gebraucht, um ein Gen zu erkennen weniger Fehl-Hybridisierungen mögliche sich wiederholende oder ähnliche Sequenzen vermeidbar dadurch höhere Spezifität Chips noch relativ teuer gute Methoden/Algorithmen werden benötigt, um Oligos zu erzeugen Seminar „Fortgeschrittene algorithmische Bioinformatik“, SS05 - Vortrag Oligodesignprobleme 10 Kriterien für optimale Oligos 6 Kriterien 1. 2. 3. 4. 5. 6. Base Composition Limit: keine der Basen sollte 50% eines Oligos ausmachen Base Distribution Limit: Folge eines Basentypes sollte nicht 25% eines Oligos überschreiten GC-Content: sollte zwischen 30% und 70% liegen Sekundärstruktur: Oligos sollten keine Dimers oder Hairpins ausbilden Länge eines zusammenhängenden, komplementären Match zu non-targets sollte kleiner als 15 bp sein Anteil der komplementären Nukleotide im Verhältnis zu nontargets sollte kleiner als 75% sein Kriterien 1, 2 und 4 sind implizit in den anderen Bedingungen enthalten Seminar „Fortgeschrittene algorithmische Bioinformatik“, SS05 - Vortrag Oligodesignprobleme 11 Anwendungsgebiete (1) Erkennen von SNP‘s (Single Nucleotide Polymorphism) die zusammenhängende Gensequenz wird durch sich überschneidene Oligos der Länge 25 bp repräsentiert drei Permutationen von jedem Oligo werden mit auf den Chip gepackt unterscheiden sich bloß im zentralen Nukleotid dadurch können alle SNP‘s eines Gens durch den Chip erkannt werden Seminar „Fortgeschrittene algorithmische Bioinformatik“, SS05 - Vortrag Oligodesignprobleme 12 Anwendungsgebiete (2) Beobachtung der Effekte, Effizienz und Metabolismus von Medikamenten Leber = Hauptwirkungsstätte bei der Umwandlung von Medikamenten und Hormonen Untersuchung der Gene aus dem Leber-Gewebe daher repräsentativ für den ganzen Organismus Vergleiche der Genexpressionen können helfen die Wirkung von Medikamenten festzustellen Verstehen von Krankheitsverläufen Bestimmen, welche Gene verschiedene Gewebe- und ZellTypen exprimieren Seminar „Fortgeschrittene algorithmische Bioinformatik“, SS05 - Vortrag Oligodesignprobleme 13 Es geht weiter ... Zweiter Teil: Algorithmen zur Konstruktion von Oligos Einleitung Worum geht es? Methoden der DNA-Array-Synthese SADP – Synchronous Array Design Problem der Epitaxial-Algorithmus der Row-Epitaxial-AlgorithmusMatching AADP – Asynchronous Array Design Problem Algorithmen für „in-place Optimierung“: Batched Greedy, Chessboard & der Sequential Algorithmus Seminar „Fortgeschrittene algorithmische Bioinformatik“, SS05 - Vortrag Oligodesignprobleme 14 Einleitung - Worum geht es? (1) Oligodesignproblem (siehe vorheriger Teil) Heute 500.000 Proben pro Chip (Tendenz steigend) Prozess der Beleuchtung zur Verkettung von Nukleotiden fehleranfällig optische Effekte (Beugung, Brechung, etc.) können unbeabsichtigte Beleuchtung verursachen als Folge: unvorhergesehene Synthese (und vieles mehr…) Lösung: Auswahl der Platzierung von Nukleotiden Border Minimization Problem (BMP) Seminar „Fortgeschrittene algorithmische Bioinformatik“, SS05 - Vortrag Oligodesignprobleme 15 Einleitung - Worum geht es? (2) Border: Grenze zwischen zwei benachbarten Proben maskiert / unmaskiert Anzahl wird als conflicts bezeichnet Minimization: Verteilung der Proben mit möglichst kleiner Border Length (Summe der Border über alle Masken) [1] Seminar „Fortgeschrittene algorithmische Bioinformatik“, SS05 - Vortrag Oligodesignprobleme 16 Methoden der DNA-Array-Synthese (1) Synchrone Synthese: Jede Periode der Supersequenz S (= ACGT) synthetisiert ein einzelnes Nukleotid Asynchrone Synthese: Erlaubt willkürliches Einsetzen der Nukleotide [1] Seminar „Fortgeschrittene algorithmische Bioinformatik“, SS05 - Vortrag Oligodesignprobleme 17 Methoden der DNA-Array-Synthese (2) Synchrones, sowie asynchrones Array-Design kann durch Angabe einer mutmaßlichen unteren Grenze errechnet werden. Basierend auf: dem Hammingabstand bei synchroner Synthese dem LCS bei asynchroner Synthese Aber: sehr langsam exakt deshalb nur Verwendung zum Vergleich der später vorgestellten Heuristiken Seminar „Fortgeschrittene algorithmische Bioinformatik“, SS05 - Vortrag Oligodesignprobleme 18 SADP – Synchronous Array Design Problem Ursprüngliche Vorgehensweise: der Konflikt-Distanz: d(p, p‘) = 2h(p, p‘), wobei p ≡ Proben und 2h ≡ zweifacher Hammingabstand danach TSP-Heuristik, um die Nukleotide mit minimiertem Hammingabstand auf einer Site anzuordnen (Hannenhalli et al., 2002; erstes Arraydesign bei Affymetrix) Berechnung Aber: es geht "besser" (dieser Ansatz optimiert nur etwa die Hälfte der benachbarten Paare) … Seminar „Fortgeschrittene algorithmische Bioinformatik“, SS05 - Vortrag Oligodesignprobleme 19 SADP Der "epitaxial placement approach": Ursprung in der VLSI (Very Large Scale Integration) Idee: Zweidimensionale Anordnung von Proben um einen einzelnen (zufällig gewählten und zentralen) Startpunkt (seed) Epitaxial-Algorithmus ist nur bis zu einer Chipgröße von 300 x 300 Proben praktikabel daher: Skalierung durch Aufteilung in K Subsets (chunks) Nachteil: begrenzte Platzierungsmöglichkeit; Probe kann nicht überall auf dem Array angelegt werden (nur in ihrem Subset) keine Optimierung der Grenzen zwischen den chunks Seminar „Fortgeschrittene algorithmische Bioinformatik“, SS05 - Vortrag Oligodesignprobleme 20 SADP Der Epitaxial-Algorithmus [1] Seminar „Fortgeschrittene algorithmische Bioinformatik“, SS05 - Vortrag Oligodesignprobleme 21 SADP Verbesserung (Kahng et al.): row-epitaxial-algorithm Drei Haupteigenschaften: 1. Umstrukturierung einer vorab optimierten, bestehenden Anordnung - erste Platzierung kann durch verschiedene Algorithmen erfolgen (z.B. Gray Code) muss sehr schnell sein - TSP (Hannenhalli et al.) braucht zu lange gute initial-Anordnung: lexikographische Sortierung der Proben (radix sort) Seminar „Fortgeschrittene algorithmische Bioinformatik“, SS05 - Vortrag Oligodesignprobleme 22 SADP 2. Auffüllung der leeren Flächen mit Proben, in einer vordefinierten Reihenfolge (von links nach rechts, Reihe für Reihe) 3. die Proben werden aus den nächsten k0 Reihen gewählt k0 = Lookahead beim Algorithmus dadurch Geschwindigkeit des Algorithmus erhöht je größer k0, desto besser ist das Ergebnis jedoch schlechtere Laufzeit Seminar „Fortgeschrittene algorithmische Bioinformatik“, SS05 - Vortrag Oligodesignprobleme 23 SADP Vergleich der bisher vorgestellten Algorithmen [1] Seminar „Fortgeschrittene algorithmische Bioinformatik“, SS05 - Vortrag Oligodesignprobleme 24 AADP – Asynchronous Array Design Problem Algorithmen für "in-place Optimierung" Der Batched Greedy Algorithmus: sucht die Probe mit höchstem "Gewinn" nach Umsetzung und aktualisiert seine "Gewinnliste" [1] Seminar „Fortgeschrittene algorithmische Bioinformatik“, SS05 - Vortrag Oligodesignprobleme 25 AADP Die Chessboard Optimization Idee: Maximiere Anzahl unabhängiger Nukleotide Ein Nukleotid ist unabhängig, wenn das Vertauschen Eines die optimale Einbettung des Anderen nicht beeinflusst. Zweifärben der Array-site (Schachbrett); alle weißen/schwarzen Felder können untereinander neu angeordnet werden [1] Seminar „Fortgeschrittene algorithmische Bioinformatik“, SS05 - Vortrag Oligodesignprobleme 26 AADP Der Sequential Algorithmus ermöglicht optimale Umsortierung der Nukleotide geht Array Reihe für Reihe durch Nachteil von Batched Greedy, Chessboard: nur unabhängige Nukleotide werden vertauscht Auswirkungen verbreiten sich langsam Das wird durch die sequentielle Abarbeitung gelöst [1] Seminar „Fortgeschrittene algorithmische Bioinformatik“, SS05 - Vortrag Oligodesignprobleme 27 AADP [1] Seminar „Fortgeschrittene algorithmische Bioinformatik“, SS05 - Vortrag Oligodesignprobleme 28 Quellenangabe Paper: Scalable Heuristics for Design of DNA Probe Arrays - Andrew B. Kahng, Ion I. Măndoiu, Pavel A. Pevzner, Sherief Reda and Alexander Z. Zelikovsky DNA chips: promising toys have become powerful tools - David Gerhold, Thomas Rushmore and C. Thomas Caskey Picky: oligo microarray design for large genomes - Hui-Hsien Chou, An-Ping Hsia, Denise L. Mooney and Patrick S. Schnable [1] Links: http://www.affymetrix.com http://www.charite.de/molbiol/bioinf/tumbiol/Microarrayanalysis/Introduction/ http://www.math.tau.ac.il/~rshamir/algmb/00/scribe00/html/lec11/node11.html http://www.stat.berkeley.edu/users/terry/Classes/s260.1998/Week9b/week9b/n ode1.html http://www.lshtm.ac.uk/itd/grf/microarrayoverview.htm http://www.hhmi.org/biointeractive/genomics/microarray.html [2] Seminar „Fortgeschrittene algorithmische Bioinformatik“, SS05 - Vortrag Oligodesignprobleme 29
