AUF-Jena-2011 - Medizinische Fakultät der Martin

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Prospektive Pilotstudie zur Prüfung eines Antikörperbeschichteten Nanodetektors für die Isolierung von
zirkulierenden Tumorzellen (CTC) aus dem Blut von
Nierenzellkarzinom-Patienten
Gerit Theil1, M. Raschid Hoda1, Kersten Fischer1, Klaus Lücke2, Paolo Fornara1
1 Klinik
und Poliklinik für Urologie und Nierentransplantationszentrum, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg,
2 Gilupi Inc., Potsdam
Einleitung
Der Nanodetektor basiert auf einem 16 cm langen Edelstahldraht (Durchmesser
0,5 mm), welcher an einem Ende über einen 2,5 cm langen Bereich mit Gold
und einem Hydrogel beschichtet wurde. Diese Oberfläche ermöglicht eine
kovalente Bindung von Antikörpern, die gegen das humane Oberflächenantigen
EpCAM (Epithelial Cell Adhesions Molecule) gerichtet sind. Die prospektive
Pilotstudie wurde zur Überprüfung der Funktionalität des medizinischen Drahtes
(FSMW) in vitro durchgeführt (Abb.1).
Abb. 1: Aufbau des Antikörper-beschichteten Nanodetektors
Ergebnisse – EpCAM-Expression der
Methode
Primärkulturen von Nierenzellkarzinomen immunzytochemische Untersuchung
Im ersten Teil der Studie wurde die EpCAM-Expression an Primärkulturen
von Nierenzellkarzinomen (RCC) unterschiedlicher Tumorentität und
unterschiedlichen Malignitätsgrades immunzytometrisch untersucht (Abb. 2
und 3). Die folgenden Spiking-Experimente dienten der Evaluierung des
FSMW. Dazu wurden 15 mL EDTA-Blut von gesunden Probanden mit
Primärkulturzellen von Nierenzellkarzinomen angereichert (12 - 660 RCCZellen/mL)
und
der
Nanodetektor
im
hämodynamischen
a)
Modell
(Fließgeschwindigkeit 2,65 cm/s, 30 min) angewendet (Abb. 4, Tab. 1).
Abschließend wurde Blut von 13 RCC-Patienten mit gesicherter Diagnose
Abb. 2: PFA-fixierte Primärkultur; immunzytochemischer Nachweis von EpCAM mit
anti-EpCAM-FITC und Kernlokalisation durch Hoechst 33258
a) hellzellige RCC-45-Zellen (pT3b, G2) ,
b) hellzellige RCC-28 (pT1a, G1)
in unterschiedlichen Tumorstadien eingesetzt. Das Blut von 2 gesunden
35
bzw. der CTC erfolgte mit anti-pan-CK-FITC und die Kernlokalisation mit
Hoechst 33258. EpCAM-positive Leukozyten wurden mit der CD45-APCKontrollfärbung identifiziert.
EpCAM-Expression [%]
Probanden und eines Patienten mit benigner Nierenerkrankung diente als
Kontrolle (Abb. 5, Tab. 2). Die Charakterisierung der isolierten RCC-Zellen
b)
30
25
20
15
10
5
0
Ergebnisse – Ex-vivo-Isolierung von CTC aus Patientenblut (hämodynamisches Modell)
hellzellig
papillär
sarkomatoid
Nierentumorentität
Abb. 3: EpCAM-Expression der Primärkulturen von Nierenzellkarzinomen
a)
b)
Ergebnisse – Spiking-Experimente (hämodynamischen Modell)
a)
b)
Abb. 5: Färbung: Overlay von anti-pan-CK-FITC-, anti-CD45-APC-, Hoechst-Kernfärbung.
Beispiel für CTC aus RCC-Patientenblut am FSMW. a) RCC-Patient 7, b) RCC-Patient 1
c)
d)
Tab. 2: Zusammenfassung- FSMW ex-vivo CTC-Isolierung
Histologie Tumorentität CTC Histologie Tumorentität CTC
lokal begrenzte Nierentumore
metastasierte Nierentumore
pT1aG1
pT1aG2
pT1aG3
pT1bG1
hellzellig
hellzellig
papillär
papillär
2
0
10
5
pT1aG1
pT1G2
pT3aG3
pT1bG2
papillär
0
pT3aG2
pT3aG2
pT3bG2-3
pT3aG2
Histologie
CTC
Kontrollgruppe
papillär
hellzellig
hellzellig
hellzellig
0
5
2
3
hellzellig
hellzellig
hellzellig
chromophil
3
3
7
8
Benigne Erkr.
Gesund
Gesund
a)
1
1
0
b)
Abb. 4: a) FSMW-gebundene, isolierte RCC-45-Zellen (hellzellig, pT3b, G2), Färbung mit
pan CK-FITC und anti-CD45-APC und Kernlokalisation durch Hoechst 33258
b) FSMW-gebundene, isolierte RCC-45-Zellen (Rasterelektronenmikroskopie)
e)
Tab. 1: Zusammenfassung- Spiking-Experimente
Primärkulturzellen von RCC-n
Zellzahl/mL Blut
(n = Nummer der Zelllinie)
Anzahl pan-CK positiver
Zellen am FSMW
RCC-45 (hellzellig pT3b)
660
832
RCC-149 (sarkomatoid)
660
0
RCC-53 (hellzellig pT1a)
30
186
RCC-53 (hellzellig pT1a)
15
82
an
RCC-84 (hellzellig pT1b)
12
2
Befund
RCC-63 (hellzellig pT1b)
12
6
RCC-182 (hellzellig pT1b)
12
2
Schlussfolgerung
Die untersuchten Tumorentitäten weisen eine unterschiedlich starke EpCAMExpression auf, die beim hellzelligen Nierenzellkarzinom tendenziell höher ist.
Es konnte gezeigt werden, daß eine ex-vivo CTC-Isolierung beim RCC mit
Hilfe
des
FSMW
Tumorgewebeproben
untermauern.
möglich
und
ist.
Weiterführende
Patientenblut
sollen
Untersuchungen
die
erhoben
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