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872
603
310
LPL
Abb. 9: Agarose Gelelektrophorese. PDK-4 und LPL cDNA-Fragmente nach PCRAmplifikation. Aus der Auswahl der Primer ergibt sich für PDK-4 eine
Fragmentgröße von 482 bp und für LPL von 498 bp. In der PCR wurde cDNA aus
Skelettmuskelgewebe (Skm) normothermer Hamster und Herzmuskelgewebe von
torpiden und normothermen Hamstern (Herz tor, Herz nor) eingesetzt.
PDK-4
a
Actin
b
28S rRNA
c
18S rRNA
Probe #
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
N/T
T
N
N
N
N
T
T
N
N
T
T
N
Abb. 10: a,b: Autoradiographien eines Northernblots mit 20 µg Herz-RNA nach
Hybridisierung mit PDK-4 und Actin cDNA-Sonden. N: RNA aus Herzmuskelgewebe
normothermer Hamster. T: RNA aus Herzmuskelgewebe torpider Hamster. c: Photo
des denaturierenden Northerngels vor dem Transfer der RNA auf die
Nylonmembran.
1.0
Ratio PDK-4 / Actin mRNA
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
normotherm
torpid
Abb. 11: Densitometrische Auswertung der Autoradiographien aus Abb. 10. Die
dargestellten Mittelwerte ergeben sich aus den Verhältnissen zwischen den PDK-4
und den jeweiligen Actin Signalstärken (SEM). RNA aus normothermen Gewebe
(N): 0,45 0,06 (n = 7). RNA aus torpidem Gewebe (T): 0,57 0,13 (n = 5). T-Test
für nicht verbundenen Stichproben: p= 0,38.
PDK-4
28S rRNA
18S rRNA
Proben#
1 2 3
4 5
6 7
8 9 10 11 1
N/T
Langtag
2 3 4 5 6 7 8
9 10 11
T N N N N T T N N T T
Kurztag
Ratio PDK-4 mRNA / 28S rRNA
Abb. 12: Obere Abbildung: Autoradiographie eines Northernblots mit 20 µg Herz-RNA
pro Bahn von Langtag- und Kurztag-akklimatisierten Hamstern nach Hybridisierung
mit der PDK-4 Sonde. Untere Abbildung: Photo des dazugehörigen Northerngels vor
dem Transfer der RNA auf die Nylonmembran.
3.0
2.8
2.6
2.4
2.2
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
Langtag
Kurztag
Abb. 13: Densitometrische Auswertung der Autoradiographien aus Abb. 12. Die
dargestellten Mittelwerte ergeben sich aus den Verhältnissen zwischen den PDK-4
und den jeweiligen 28S rRNA Signalstärken (SEM). Herz-RNA von LangtagHamstern: 1,6 0,44 (n = 11). Herz-RNA von torpiden und normothermen KurztagHamstern: 1,98 0,79 (n = 11). T-Test für nicht verbundene Stichproben: p= 0,89.
500
T1
400
T2
N1
300
N2
T3
N3
T4
200
Marker
N-DP2
T-DP2
Abb. 14 : Für die Klonierung differentieller Sequenzen ausgeschnittene Banden.
N-DP2: Zweites Differenzprodukt der Analyse mit normotherm-cDNA als Tester. TDP2: Zweites Differenzprodukt der Analyse mit torpid-cDNA als Tester.
N
T
AMP
N
T
DP1
N
T
DP2
Abb. 15: Autoradiographie eines Southernblots nach Hybridisierung mit cDNA des
Klons N2/9. Die N2/9 cDNA wurde aus dem zweiten Normotherm-Differenzprodukt
(N-DP 2) isoliert. Der Unterschied in der Konzentration der N2/9 cDNA in den
Amplicons (AMP) für Normothermie und Torpor (N, T) führte zu einer Anreicherung
der Sequenz im ersten und zweiten N-Differenzprodukt (DP1, DP2).
35000
densitometrische Intensität
30000
N: Normotherm
T: Torpid
25000
20000
15000
10000
5000
0
AMP
DP 1
DP2
Abb. 16: Densitometrische Auswertung der Autoradiographie des Southernblots aus
Abb. 15. Die Anreicherung des im N-Amplicon in höherer Konzentration
vorhandenen N2/9 cDNA ist als Zunahme der Signalintensitäten
nach
densitometrischer Messung dargestellt.
N
N
T
AMP
T
DP1
N
T
DP2
Abb. 17: Autoradiographie eines Southernblots nach Hybridisierung mit cDNA des
Klons T2/6. Die T2/6 cDNA wurde aus dem zweiten Torpid-Differenzprodukt (T-DP
2) isoliert. Der Unterschied in der Konzentration der T2/6 cDNA in den Amplicons
(AMP) für Normothermie und Torpor (N, T) führte zu einer Anreicherung der
Sequenz im ersten und zweiten T-Differenzprodukt (DP1, DP2).
densitometrische Intensität
12000
N: Normotherm
T: Torpid
10000
8000
6000
4000
2000
0
AMP
DP 1
DP2
Abb. 18: Densitometrische Auswertung der Autoradiographie des Southernblots aus
Abb. 17. Klon T2/6 war im T-Amplicon etwa 50% stärker repräsentiert. Eine
deutliche Anreicherung erfolgte im zweiten T-Differenzprodukt.
N
T
T4/6
T2/6
N3/11
Abb. 19: Mittels Phosphor Imager Screen detektierte Dotblot-Signale. Obere Reihe:
Nach Hybridisierung mit dem radioaktiv markierten Amplicon der normotherm-cDNA.
Untere Reihe: Nach Hybridisierung mit dem radioktiv markiertem Amplicon der
torpid-cDNA. Klon T4/6: Signal 20% intensiver nach Hybridisierung mit den TAmplicon. Klon T2/6: Signal 40% intensiver nach Hybridisierung mit dem TAmplicon. Klon N3/11: Ausschließlich nach Hybridisierung mit dem N-Amplicon
detektierbar.
T3/4
a
Actin
b
28S rRNA
c
18S rRNA
Probe #
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
N/T
T
N
N
N
N
T
T
N
N
T
T
N
Abb. 20: a,b: Autoradiographien eines Northernblots mit 30 µg Herz-RNA von
torpiden (T) und normothermen Hamstern (N) nach Hybridisierung mit der Sonde
des Klons T3/4 und Actin. c: Photo des denaturierenden Northerngels vor dem
Transfer der RNA auf die Nylonmembran.
2.0
Ratio T3/4 mRNA / 28S rRNA
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
normotherm
torpid
Abb. 21: Densitometrische Auswertung der Autoradiographie des Northernblots
nach Hybridisierung mit der Sonde des Klons T3/4. Die dargestellten Mittelwerte
ergeben sich aus den Verhältnissen zwischen den T3/4 und den jeweiligen 28S
rRNA (Gelphoto) Signalstärken (SEM). Normotherm: 1,36 0,41 (n=7). Torpid: 1,4
0,14 (n=5). T-Test für nicht verbundene Stichproben: p=0,39.
T2/6
a
Actin
b
28S rRNA
c
18S rRNA
Probe #
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
N/T
T
N
N
N
N
T
T
N
N
T
T
N
Abb. 22: a,b: Autoradiographien eines Northernblots mit 30 µg Herz-RNA von
torpiden (T) und normothermen Hamstern (N) nach Hybridisierung mit der Sonde
des Klons T2/6 und Actin. c: Photo des denaturierenden Northerngels vor Transfer
der RNA auf die Nylonmembran.
2.0
*
1.8
T2-6 mRNA / 28S rRNA
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
normotherm
torpid
Abb. 23: Densitometrische Auswertung der Autoradiographie des Northernblots
nach Hybridisierung mit der Sonde des Klons T2/6. Die dargestellten Mittelwerte
ergeben sich aus den Verhältnissen zwischen den T2/6 und den jeweiligen 28S
rRNA (Gelphoto) Signalstärken (SEM). Normotherm: 1,33 0,02 (n=7). Torpid: 1,8
0,11 (n=5). T-Test für nicht verbundene Stichproben: p=0,0142.
N2/9
Probe #
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
T
N
N
N
N
T
T
N
N
T
T
N
Abb. : 20 µg Herz-RNA Hybrid. mit N2/9
PDK-4
a
Actin
b
28S rRNA
c
18S rRNA
Probe #
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
T
N
N
N
N
T
T
N
N
T
T
N
Ratio PDK-4 mRNA / 28S rRNA
Abb. 10: Autoradiographie eines Northernblots mit 20 µg Herz-RNA nach
Hybridisierung mit PDK-4 und Actin cDNA. N: RNA aus Herzmuskelgewebe
normothermer Hamster . T: RNA aus Herzmuskelgewebe aus Gewebe torpider
Hamster.
1.5
1.4
1.3
1.2
1.1
1.0
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0.0
normotherm
torpid
Abb. 11: Densitometrische Auswertung der Autoradiographie aus Abb. 10. Die
dargestellten Mittelwerte ergeben sich aus den Verhältnissen zwischen den PDK-4
Signalstärken auf der Autoradiographie und den jeweiligen 28S rRNA Signalstärken
des Gelphotos (+/- SEM). RNA aus normothermen Gewebe (N): 0,78 +/- 0,09 (n =
7). RNA aus torpidem Gewebe (T): 0,94 +/- 0,13 (n = 5). T-Test für nicht
verbundenen Stichproben: p= 0,304.
PDK-4
28S rRNA
Proben #
1 2
3
4
5
6
7
8
9 10 11 1
N/T
2
3
T N N
4
5
6
7
N N T T
Langtag
8
9 10 11
N N T T
Kurztag
Abb. 12: Autradiographien eines Northernblots mit 20 µg Herz-RNA pro Bahn von
Langtag- und Kurztag-akklimatisierten Hamstern nach Hybridisierung mit der PDK-4
Sonde und 28S rRNA Sonde.
Ratio PDK-4 mRNA / 28S rRNA
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
Langtag
Kurztag
Abb. 13: Densitometrische Auswertung der Autoradiographien aus Abb. 12. Die
dargestellten Mittelwerte ergeben sich aus den Verhältnissen zwischen den PDK-4
und den jeweiligen 28S rRNA Signalstärken (+/- SEM). Herz-RNA von LangtagHamstern: 0,38 +/- 0,01 (n = 11). Herz-RNA von torpiden und normothermen
Kurztag-Hamstern: 0,39 +/- 0,1 (n = 11). T-Test für nicht verbundenen Stichproben:
p= 0,84.