(ODC) durch Cyclooxygenase (COX)-2 in H.

Aktivierung der Ornithindecarboxylase (ODC) durch Cyclooxygenase (COX)-2 in
H.-pylori(Hp)-stimulierten Makrophagen (MØ): Ein Mechanismus für die Dysregulation
der angeborenen Immunantwort
A. Scholz1,3, F.I. Bussiere1,4, M. Asim 1,4, R. Chaturvedi1,4, Y. Cheng1,4, H.X. Xu1,4, M. Schneemilch1,3, F. Meyer3, K.T. Wilson1,2,4.
1Division of Gastroenterology, Department of Medicine, 2Greenebaum Cancer Center, University of Maryland School of Medicine; 3Otto von Guericke University, Magdeburg, Germany;
4Veterans Affairs Maryland Health Care System, Baltimore, MD.
P O S T E R of DISTINCTION – “Digestive Disease Week, May 15-18, 2005 (Chicago, U.S.A.)
**
**
**
**
Design & Methoden Transfektionsstudien
10
10
durch PCR)
6
-596 bp
6
-264 bp
-49 bp4
4
+306 bp
M
CHP
+C
6
6
ODCActivity
Activity
ODC
(nmol CO
/h/mgprotein)
CO/h/mg
protein)
(nmol
22
- HP
0
0
5
5
-596
Zellextrakte
Luc
-49
0
0
2
2
4
4
Ctrl
- HP
6
6
**
**
8
8
10
10
12
12
+ PGE2,
cAMP
Ctrl
+ HP
Ctrl
HPL
+306
**
**
22
§§
§§
**
**
11
0
00
A
DD
2
4
6
8
10
22
Tim
Timee (h)
(h)
44
66 12
12 h
12
10
20
30
40
50
60
A
0
2
4
6
EB
E
44
66
12
12 h
h
F
**
-actin
**
HP
8000
COX-2
60
Ctrl
Zeitverläufe der Aktivierung
von ODC-Promoter-, ODC-mRNA-Expression
& ODCAktivität als Antwort auf H. pylori.
HP
50
RAW 264.7 Zellen wurden
mit H.-pylori[SS1]-Lysat (HPL; MOI 100) für o.g. Zeit
stimuliert. A: RT-PCR-Analyse der ODC-mRNA-Expression.
B: Western-Blot-Analyse
der ODC-Proteinexpression. Die Korrelation der
40
Höhepunkte der mRNA- & Proteinexpression bei 6 h mit den Promoter- &
Enzymaktivitätsassay-Daten der vorherigen Abbildung sind unbedingt zu beachten.
Zeitverläufe der COX-2-mRNAExpression, PGE2-Freisetzung & cAMPErzeugung als Antwort auf H. pylori.
RAW 264.7 Zellen wurden mit H. pylori
SS1 für o.g. Zeiten stimuliert. A: RT-PCRAnalyse der COX-2-mRNA-Expression. B:
PGE2-Freisetzung im Medium; Daten für
Stimulation mit intakten H. pylori (HP) &
„French-press“-Lysaten (HPL) jeweils
MOI 100. C: Detektion von cAMP in MLysaten. For B & C: *p<0,05; **p<0,01 vs.
nichtstimulierte Zellen.
12
10
*
8
6
4
2
C
**
14
**
12
10
8
*
6
4
2
0
2
4
6
8
10
6
**
5
4
3
**
**
2
§§
1
0
12
0
2
4
6
8
10
0
12
2
Time
(h)
Zeit (h)
4
6
8
10
Time
(h)
Zeit (h)
PGE2 & cAMP potenzieren die durch
H. pylori stimulierte ODCPromoteraktivität
Ctrl
6000
5000
**
4000
**
3000
*
0
2
4
6
*
*
12000
10000
8000
Effekt der Zugabe von PGE2
& cAMP auf die Induktion
des ODC-Promoters durch
H. pylori. RAW 264.7 Zellen
wurden mit H.-pylori[SS1]Lysaten (HPL; MOI: 100) für
6 h behandelt, -/+ exogener
Zugabe von PGE2 (0,1 µM)
oder zellpermeablem cAMPAnalogon, 8-bromo-cAMP
(0.1 µM). **p < 0,01 vs.
nichtstimulierte Kontrolle,
§p < 0,05 vs. HPLstimulierte Zellen -/+ PGE2
oder cAMP.
25
6000
20
**
§
** §
+ PGE2
+ cAMP
15
10
5
0
Ctrl
4000
HPL
2000
0
2
4
6
Zeit (h)
20
10
PGE2 & cAMP potenzieren H.-pyloristimulierte ODC-Enzymaktivität
H.-pylori-stimulierte ODC-Aktivität wird
durch COX-2 & PGE2 vermittelt
ODCPromoter Construct
Ctrl
+ cAMP
+ PGE2
40
3500
35
30
ODC-Activität
(pmol CO2/h/mg Protein)
Figure 1
25
20
15
10
5
0
Ctrl
HP
HPL
Urease
Effekt der Zugabe von PGE2 oder cAMP auf die Induktion der ODC-mRNA-Expression („Realtime“-PCR) durch H. pylori. RAW 264.7 Zellen wurden mit H.-pylori[SS1]-intakten Bakterien
(HP; MOI: 100), -Lysaten (HPL; MOI: 100) oder rekombinanter Urease (50 mg/ml) für 6 h
behandelt -/+ exogener Zugabe von PGE2 (0,1 µM) oder zellpermeablem cAMP-Analogon, 8bromo-cAMP (0,1 µM). Hier Daten eines repräsentativen Experiments gezeigt.
H.-pylori-induzierte Bindung von nukleären
Proteinen an ODC-Promoter wird nicht durch
cAMP verstärkt
Effekt der Zugabe von cAMP
auf H.-pylori-stimulierte
Bindung von nukleären
Proteinen an den ODCPromoter. RAW 264.7 Zellen
wurden mit H.-pylori[SS1]Lysaten (HPL; MOI: 100) für
2 h versetzt -/+ exogener Zugabe
von zellpermeablem cAMPAnalogon, 8-bromo-cAMP (0,1
µM). Nukleäre Proteine wurden
extrahiert & inkubiert mit 32P-gATP-markiertem 133 bp-ODCPromoterfragment (nt –264 bis –
131 bp), was wir als bindend an
H.-pylori-stimulierte nukleäre
Proteine identifizierten.
3000
Ctrl
+ PGE2
**
**
§§
2500
+ cAMP
2000
**
1500
1000
500
0
Ctrl
§§
Effekt der Zugabe von PGE2
oder cAMP auf die Induktion
der ODC-Enzymaktivität
durch H. pylori. RAW 264.7
Zellen wurden mit H.-pylori
[SS1]-Lysaten (HPL; MOI:
100) für 6 h stimuliert -/+
exogener Zugabe von PGE2
(0,1 mM) oder zellpermeablem
cAMP-Analogon, 8-bromocAMP (0,1 µM). **p < 0,01 vs.
nichtstimulierte Kontrolle, §p
< 0,01 vs. HPL-stimulierte
Zellen -/+ PGE2 oder cAMP.
HPL
ZUSAMMENFASSUNG der Ergebnisse
- Regulation der H.-pylori-stimulierten
ODC in Makrophagen
• H. pylori induzierte gleiches zeitabhängiges Anstiegsverhalten der ODCPromoteraktivität, -mRNA-Expression, -Proteinexpression & funktioneller
Enzymaktivität mit „Peak“ bei 6 h.
• COX-2-Expression, PGE2-Freisetzung & Erzeugung von cAMP zeigten
signifikante Anstiege 4 h nach Stimulation.
• Zugabe von PGE2 oder cAMP erhöhten die H.-pylori-induzierte ODCPromoteraktivität, -mRNA-Expression & -Enzymaktivität.
• Hemmung von COX-2 oder Neutralisation von PGE2 reduzierten signifikant
die ODC-Aktivität.
• cAMP beeinflusste nicht die Bindung nukleärer Extrakte von H.-pyloristimulierten M an den ODC-Promoter.
• Nukleäre Extrakte von H.-pylori-stimulierten Zellen banden auch nicht an
eine Vergleichsprobe, die die „cAMP response element” Bindungs (CREB)Seite enthielt (Daten nicht gezeigt).
DFU
NS-398
anti-PGE2 Ak
12000
ODC-Activität
(pmol CO2/h/mg protein)
Ctrl
12
Zeitverläufe der Aktivierung von ODC-Promoter-, ODC-mRNA-Expression & ODCAktivität als Antwort auf H. pylori. RAW 264.7 Zellen wurden mit H.-pylori[SS1]-Lysat
(HPL; MOI: 100) für o.g. Zeit versetzt. A: ODC-Promoter-Assays wurden mittels des
–264 bp-Promoterkonstruktes vollzogen. B: Für die ODC-mRNA-Expression wurde die
„Real-time“-PCR verwendet. C: Beim ODC-Assay wurde die Summe des von
L-[14C]Ornithin freigesetzten 14CO2 gemessen. *p < 0.05 vs. nichtstimulierte Kontrolle
**
0
30
PGE2 & cAMP potenzieren H.-pyloriFigure 1
0
stimulierte
ODC-mRNA-Expression
-596
-264
-49
306
ODC-mRNA-Expression
(Anstieg als Vielfaches)
16
B
**
HPL
7000
1000
C
PGE2
ELISA
9000
2000
ODC
70
12 h
-actin
-actin
22
14
Zeitverläufe der COX-2-Expression, PGE2Freisetzung & cAMP-Produktion gleichen
der Induktion von ODC
B
ODC-Promoter
Bindung
EMSA
cAMP-Level
ELISA
70
Identifizierung der für H. pylori verantwortlichen ODC-Promoterregion.
RAW 264.7 Zellen wurden mit einem H.-pylori[SS1]-Lysat (HPL; MOI 100) für
6 h inkubiert. ODC-Promoterkonstrukte wurden mittels PCR eines pODCMusters hergestellt, das von J. Cleveland (St. Jude Children’s Research Hospital)
bereitgestellt wurde. *p < 0,05 vs. nichtstimulierte Kontrolle
ODC
00
16
Time
(h)
Zeit (h)
RLU x 103/mg Protein
33
ODC Luciferase Reporter Assay
A
0
0
44
ODC-Protein
Western Blot
0
Luc
+ PGE2,
cAMP
ODC-Aktivität
Radiochem.
Assay
Parallele Induktion von ODC-Promoteraktivität, -mRNA-Expression & -Enzymaktivität
*
Luc
Überstände
ODC
COX-2
RT-PCR/
„Realtime“- PCR
*
Luc
Nucleäre Extrakte
mRNA
M
Zeitverläufe der ODC-mRNA- &
00
-Proteinexpression
0
2
4
6
8
10 12
ODC Promoter Activity
(RLU x 10 3/mg protein)
ODC-Promoter Assays
Luciferase-Reporter
Der –264 bp-ODC-Promoter ist für die
Transkription erforderlich
-264
2
2
• ODC auf dem Level der
Promoteraktivierung,
der Transkription,
reguliert wird;
• COX-2 exprimiert &
PGE2 sowie „2nd
messenger“ cAMP vor
dem Höhepunkt der
ODC-Induktion
produziert werden;
• PGE2 &/oder cAMP
direkt ODC aktivieren
oder sie die Hpstimulierte ODCAktivierung erhöhen
können;
• die ODC-Aktivierung
COX-2 erfordert.
PGE2 (pg/ml)
ODC-Luc
ODC-Luc
-264bp
**
Stimulation mit H.-pylori[SS1]-intakten Bakterien oder „French-press“-Lysaten &
rekombinanter Urease (0 – 24 h); -/+ PGE2, cAMP, DFU, NS-398, anti-PGE2 Ak
ODC-Enzymaktivität
ODC Activity
Protein)
COCO
(pmol
(nmol
2/h/mg
2/h/mg protein)
*
*
RAW 264.7 M- Zelllinie (106/ml)
Zu bestimmen, ob:
cAMP (pmol/mg Protein)
ODCmRNA
mRNAExpression
Expression
ODC
(FoldIncrease)
Increase)
(Fold
ODCPromoter
PromoterActivity
Activity
ODC
(Fold
Increase)
(Fold
Increase)
**
**
• Werden M mit H. pylori
stimuliert, ist über die
Aktivierung des ODCPromoters ODC stark
induzierbar.
• Vergleichbar mit dem
Effekt auf Zytokine kann
die COX-2-Induktion &
resultierendes PGE2 die
ODC-Expression &
-Aktivität alterieren.
• cAMP, der „down stream
2nd messenger“ & durch
PGE2 aktiviert, kann die
Induktion von ODC
vermitteln.
Design & Methoden
ODC-Promoteraktivität
(RLU x 103/mg Protein)
– Die Ornithindecarboxylase ist hochreguliert in M [Gobert et al. J
16
A 16
Immunol 168:4692-4700,
2002; Chaturvedi et al. J Biol Chem 279:40161A die14daraufhin Polyamine (Spermin u.a.) produzieren.
40173, 2004],
14
– Spermin dysreguliert
die dem Wirt angeborene Immunantwort durch:
12
12
» Hemmung der antimikrobiellen
NO-Produktion
[Bussiere et al. J10
Biol Chem 280:2409-2412, 2005].
10 [Gobert et al. J. Immunol. 168:4692-4700, 2002;
» Induktion von Apoptose
Chaturvedi et al. J Biol Chem 279:40161-40173, 2004].
8
8
– Aktivierung von COX-2 reguliert die Th1-Immunantwort durch die
6
Generation von PGE
6 2 & dem „Second messenger”, zyklisches AMP
(cAMP) [Meyer et4 al. J Immunol 171:3913-3917, 2003].
• PGE2 oder cAMP 4
hemmen die IFN-γ- & IL-12-Freisetzung & Lymphozytenproliferation
2 pylori.
als Antwort auf H.
2 hat den gegenteiligen Effekt.
• Hemmung von COX-2
0
• cAMP agiert über0Aktivierung
0
2
4des ODC-Promoters.
6
8
10 12
B 16 0 2 4 6 8 10 12
B 16
14
14
12
12
Ziele
ODC-Promoteraktivität
ODC Promoter Acti vi ty
(Fold
Vielfaches)
alsIncrease)
(Anstieg
• Folgende Aspekte sind im Zusammenhang mit der Immunantwort auf H.-pylori-Infektion bekannt:
8
pODC Konstrukte
(hergestellt
8
&
Hypothesen
ODC-mRNA-Expression
ODC mRNA Expressi on
als Vielfaches)
(Anstieg(Fold
Increase)
Einleitung
**
**
**
10000
8000
§
6000
§
§
§
4000
§
§
§
§
§
2000
0
Ctrl
HP
HPL
Urease
Effekt der Hemmung von COX-2 oder Neutralisation von PGE2 auf H.-pylori-stimulierte
ODC-Aktivität. RAW 264.7 Zellen wurden mit H.-pylori[SS1]-intakten Bakterien (HP; MOI:
100), H.-pylori-“French-press“-Lysaten (HPL; MOI: 100) oder rekombinanter Urease (50
µg/ml) stimuliert ohne (Ctrl, gelbe Balken) & mit COX-2-Inhibitoren wie z.B. DFU (10 µM),
NS-398 (1 µM) oder neutralisierendem anti-PGE2-Ak 2B5 (135 mg/ml). **p < 0,01 vs.
nichtstimulierte Kontrolle; §p < 0,05 vs. stimulierte Zellen -/+ Inhibitor.
Schlussfolgerungen
• PGE2 & cAMP sind allein nicht in der Lage ODC
signifikant zu erhöhen, sie potenzieren jedoch die
Induktion von ODC durch H. pylori.
• Die Induktion von ODC wird teilweise durch COX-2
& PGE2 vermittelt.
• Die Potenzierung der ODC-Promoteraktivität durch
cAMP lässt sich eher durch erhöhte Bindungsaffinität von Transkriptionsfaktoren als von CREBProteinen begründen.