Subtraktive Hybridisierung
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C A U Christian-Albrechts-Universität zu Kiel Entwicklung stammspezifischer PCRSysteme mittels subtraktiver Hybridisierung anhand verschiedener Stämme von Milchsäurebakterien Von Christian Stelter Überblick 1. „Subtraktive Hybridisierung“ Ziel der Methode? Welche Vorteile? 2. Prinzipieller Ablauf der Methode 3. Praktische Ergebnisse 4. Ausblick Entwicklung „Subtractive Hybridization“ als Basis, um • genetische Unterschiede zu identifizieren. Identifizierung von Genaktivität für • Embryonalentwicklung • Krebsentstehung Identifizieren von Unterschieden im Genom • verschiedener Stämme von Bakterien • komplexer eukaryotischer Lebewesen Biotechnologie in menschlichen Kulturen Damals Starterkulturen 1. Generation • unkontrollierte Fermentation • 6000 v. Chr. Alkoholische Getränke im Zweistromland Milchwirtschaft durch Nomaden in Zentralasien Heute Ziel: Konservierung und Veredelung von Lebensmitteln Notwendigkeit zur Diagnose Damals Starterkulturen 1. Generation 2. Generation 3. Generation • genetische Identität • Stabilität von Starterkulturen • hygienische Risiken • wirtschaftliche Effizienz routinemäßige Verifikation Heute durch genetische Fingerabdrücke Notwendigkeit zur Diagnose Damals Starterkulturen 1. Generation 2. Generation 3. Generation Heute • Fingerprinting Notwendigkeit zur Diagnose Damals Starterkulturen 1. Generation 2. Generation 3. Generation 4. Generation Heute • Verständnis probiotischer Eigenschaften Anwendbarkeit der SSH Genomische Unterschiede identifizieren/isolieren Um darauf aufbauend a) Funktion der unterschiedlichen DNA zu analysieren b) PCR-basierende Nachweissysteme zu erstellen c) Eigenschaften in weiteren MOs zu detektieren Subtraktive Hybridisierung dominante Quelle der genomischen Variation: Insertionen oder Deletionen großer (10 bis 50 kb) DNA-Regionen = Stamm A Stamm B Subtraktive Hybridisierung gezielte Identifikation von Unterschieden besonders vorteilhaft = Stamm A Stamm B Subtraktive Hybridisierung Stamm A = Stamm B spezifische Fragmente für Stamm A Subtraktive Hybridisierung Stamm B = Stamm A spezifische Fragmente für Stamm B Subtraktive Hybridisierung Ausgangsmaterial Stamm A Stamm B Ablauf der Subtraktiven Hybridisierung Fragmentieren Stamm A Stamm B Ablauf der Subtraktiven Hybridisierung Mischen Stamm A + Stamm B Ablauf der Subtraktiven Hybridisierung Denaturieren Stamm A + Stamm B Ablauf der Subtraktiven Hybridisierung Hybridisieren Stamm A + Stamm B Ablauf der Subtraktiven Hybridisierung Isolieren homologe Bereiche + Anreicherung stammspezifischer Fragmente wichtige Entwicklungsschritte Entwicklungen innerhalb der „Subtraktiven Hybridisierung“ betrafen die Isolierung der stammspezifischen, einzelsträngigen DNA a) Immobilisierung b) Suppression Effekt Isolierung durch Immobilisierung Immobilisierte Subtraktor-DNA Stamm B Isolierung durch Immobilisierung Stamm A Zugegebene, denaturierte Proben-DNA Stamm B Isolierung durch Immobilisierung Stamm A Homologe DNA-Fragmente werden dem Überstand entzogen Stamm B Suppression Subtractive Hybridization stammspezifische Fragmente Fragmente, die in beiden Stämmen vorhanden sind Verwendung von Adaptoren Vorteile: 1) Geringste Mengen 2) Suppression Effekt Suppression Effekt PCR-Amplifikation “Haarnadel”Schleife Vervielfachung Unterdrückung Vorteile der SH/SSH • Geringe Materialanforderungen (PCR) • bis zu 96% der Unterschiede identifizierbar • Verzicht auf die Sequenzierung vollständiger Genome • Reduktion des zeitlichen und finanziellen Aufwandes Bisherige Anwendung Genomanalysen im medizinischen Bereich: • Identifikation von Virulenzgenen • neuartigen Restriktions-Modifikationssystemen • Antibiotikaresistenzen • Oberflächenstrukturen • PAIs: „pathogenicity islands“ Praktische Ergebnisse Anwendung auf Milchsäurebakterien Lactococcus St. 1760-1526 Lactococcus St. 1526-1760 • Isolierung der unterschiedlichen Regionen: • Funktionen der unterschiedlichen Regionen • Stammspezifische PCR-Systeme • Suche nach Eigenschaften in anderen MOs Anreicherung stammspezifischer Fragmente 1526 – 1760 = ? 1760 – 1526 = ? Gefundene Unterschiede Lactococcus Stamm 1760 • A2: Bacteriocin-Produktion • A5: Funktion unbekannt Lactococcus Stamm 1526 • A22: zellwandassoziierte Proteinase • A23: Restriktionsmodifikationssystem [subunit (hsdS) gene] PCR-Systeme auf die verwendeten Stämme Proteinase Nisin hsdS ? 1526 1760 A2: Nisin A5: ? A22: Proteinase A23: hsdS PCR-Systeme auf weitere Stämme 89 bp: ? 166 bp: Proteinase 271 bp: hsdS 322 bp: Nisin Weitergehende Anwendungen Identifizieren von probiotischen Eigenschaften • größere Überlebensrate • dauerhafte Ansiedlung • Reduktion von mutagenen Enzymen • Stimulation von Makrophagen Identifikation von gentechnisch veränderten Organismen ehemalige Systementwicklung: Reaktionen auf Stress Danisco Cultor Niebüll GmbH Dr. Udo Friedrich PD Dr. Winfried Hausner Danke Wir haben einen Überschuss an einfachen Fragen und einen Mangel an einfachen Antworten. Lothar Schmidt Noch Fragen? Gott weiß alles, sagt es aber nicht. Ich weiß nichts und sage alles. unbekannt Immer noch Fragen? Suppression Subtractive Hybridization Tester DNA Driver DNA Ligation von Adaptor 1 Tester DNA mit Adaptor 1 Enzymatischer Verdau Driver DNA (im Überschuss) Erste Hybridisierung mit Denaturierung Ligation von Adaptor 2 Tester DNA mit Adaptor 2 Suppression Subtractive Hybridization A ss-Tester A B Tester-Tester Homohybride B C Tester-Driver Heterohybride C ds-Driver D D ss-Driver Zweite Hybridisierung ohne Denaturierung E Tester-Tester Heterohybride Auffüllen der Enden Suppression Subtractive Hybridization Zugabe der Primer PCR-Amplifikation Tester-Tester Homohybride B ITR C D ITR Zugabe der Primer PCR-Amplifikation Abkühlung E erneuter PCR-Zyklus Aufschmelzen erneuter PCR-Zyklus A Self-Annealing “Haarnadel”Schleife Primer-Annealing Nested PCR Elongation
