Transformation von Arabidopsis mit der „Floral dip“

Transformation von Arabidopsis mit der „Floral dip“-Methode
Agrobacterium dringt durch natürliche Öffnungen in die Pflanze ein. In der Regel erfordert
die Infektion mit Agrobacterium also eine Verwundung. Eine anatomische Besonderheit von
Arabidopsis macht eine direkte Transformation des weiblichen Gametophyten möglich: Der
Fruchtknoten ist bis zum Stadium 8 der Blütenentwicklung offen und über die Narbe
zugänglich (s. „Flower development in Arabidopsis“ im Anhang). Appliziert man
Agrobacterium zum rechten Zeitpunkt, kann es in den Fruchtknoten eindringen und den
weiblichen Gametophyten transformieren. Auf diese Weise können bis maximal 0,7 % der
Samen transformiert werden, und beim Auskeimen dieser Samen können direkt (d.h. ohne
eine Phase der Gewebekultur!) transgene Pflanzen gewonnen werden. In den transgenen
Pflanzen der T1-Generation liegt das Transgen im hemizygoten Zustand vor.
Vorgehensweise:
Pflanzen
Der gewünschte Arabidopsis (12-24 Pflanzen pro Konstrukt) Ökotyp/Genotyp wird in 6,5 cm
Töpfen ausgesät und mit einer 12-Stunden Photoperiode (Kurztag) angezogen bis die
Infloreszenz gebildet wird (Arabidopsis ist eine fakultative Langtagpflanze). Der Blütenstand
wird dann gekappt um das Austreiben sekundärer Infloreszenzen zu fördern. Sobald die
sekundären Blütenstände eine Höhe von etwa 2-10 cm erreicht haben (nach ungefähr einer
Woche) sind die Pflanzen zur Transformation bereit.
Agrobacterium
Von einer Einzelkolonie des das Transformationskonstrukt tragenden Bakterienstammes wird
eine 10-ml Vorkultur in LB Medium angeimpft, das die erforderlichen Antibiotika zur
Selektion des binären Vektors wie auch des Helferplasmids enthält. Die Kultur wird für 48
Stunden bei 30 °C im Orbitalschüttler (ca 200 Upm) angezogen. Die Hauptkultur von 150 ml
Medium mit den entsprechenden Antibiotika wird mit 100 µl der Vorkultur angeimpft.
Sobald eine OD600 von 0,8 erreicht ist (nach 7-8 Stunden) werden die Bakterien sedimentiert
(25 min bei 4° und 4000 rpm im H6000A Rotor) und dann 300 ml einer Lösung von 5%
Saccharose und 0,03 % (300 µl/l) Silwet resuspendiert.
Transformation
Die Pflanzen werden kopfüber in die Agrobacterium-Suspension getaucht und für ca 30 sec
geschwenkt um alle Blüten vollständig zu benetzen. Um eine hohe Luftfeuchtigkeit zu
gewährleisten, werden die Pflanzen anschliessend während 24 Stunden unter einer
abgedichteten Haube auf der Laborbank inkubiert, und erst danach in die Anzuchtkammer
überführt. Sobald die Samen reif sind werden sie geerntet und auf Selektionsmedium
ausplattiert um die transgenen Pflanzen zu gewinnen. Sowohl auf 150 mm Ø Petrischalen als
auch auf 30-50 cm Anzuchtskisten können bis zu 10-15.000 Samen ausplattiert werden.
Selektion der Transformanten mit dem bar Gen für Basta Resistenz
Um die Transformationsrate zu bestimmen müssen Sie die Gesamtzahl der geernteten Samen
kennen. Sie wiegen die geernteten Samen und errechnen daraus die Anzahl (1 Samen wiegt
durchschnittlich 20 µg). Die Samen müssen vor der Aussaat stratifiziert werden um eine
gleichmässige Keimung zu erreichen. Dazu werden sie in einer Lösung von 0,1 % Agar
resuspendiert (15000 Samen in 50 ml 0,1 % Agar) und während 48 Stunden bei 4 °C
inkubiert.
Die Aussaat der Samen erfolgt auf Erde, die zuvor mit einer Lösung von 35 mg/l Basta
durchtränkt wurde (das kommerzielle Produkt enthält 200 g/L Glufosinat =>175 µl /L).
Nicht transformierte Samen sind Basta-sensitiv und werden sich nicht über das
Kotyledonenstadium hinaus entwickeln. Die transgenen Samen sind Basta-resistent und
werden überleben und Frucht tragen.